JPH06511154A

JPH06511154A - 組換えＢｏｒｒｅｌｉａタンパクの製造法

Info

Publication number: JPH06511154A
Application number: JP5507751A
Authority: JP
Inventors: エーディーレ、ローン、フランクリン; ブラント、マリー−アン
Original assignee: コノート　ラボラトリーズ　インコーポレイテッド
Priority date: 1991-10-18
Filing date: 1992-10-16
Publication date: 1994-12-15
Also published as: AU676140B2; EP0620860A4; NO310417B1; WO1993008299A1; EP0620860A1; FI941749A0; IL103462A0; CA2121121A1; NO941376L; PT100980A; AU2801192A; NO941376D0; PT100980B; CA2121121C; FI941749A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組換えＢｏｒｒｅｌｉａタンパクの製造法技術分野本発明は、組換えＢｏｒｒｅｌｉａリポタンパクの製造法、特にライム病の病原であるスピロヘータの旦ｏｒｒｅｌｉａ　ｂ土Ｌ１土ユエエヱエユの外表タンパクＡ（ＯｓｐＡ）の製造法に関する。

関連出願本出願は、米国特許出願第７７９，０４８号の継続出願である米国特許出願第８８８，７６５号の継続出願である。

背景技術ライム病は、マダニにより媒介されるスピロヘータＢｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉによる動物病原性感染症である。このスピロヘータに感染した宿主は、皮膚、関節、神経その他に重度な病理学的症状を示す。ライム病は、最近特に北米および世界の各地で深刻な疫学的問題となっている。

この病気に有効なワクチンおよび病原スピロヘータに対する抗体の検出に有効な免疫診断試薬の開発が試みられている。主要な外表タンパク０ｓｐＡが注目され、その抗体は病原スピロヘータの攻撃からマウスを保護することが実証されている（参照文献１，２；参照文献の一覧表は開示の最後に示す）。

出液を精製することによって、Ｂｏｒｒｅｌｉａの可溶性リポタンパクを精製、単離する試みが行われてきた。しかし、Ｂｏｒｒｅｌｉａの培養およびその後の粗細胞抽出液からのタンパクの精製は、きわめて煩雑であり、膨大な経費を要した。

精製タンパクを多量に製造できる可能性があることから、０ｓｐＡおよびその誘導体を製造するために遺伝子組換え技術が提案されている。これらの技術は、Ｅ、ｃｏｌｉ等の適当な宿主／ベクター表現系中に旦ｏｒｒｅｌｉａ遺伝子を表現させるものである。

ＰＴＣ特許出願番号Ｗ０　９０１０４４１１には、Ｂ。

ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉニューヨーク株Ｂ５１（ＡＴＣＣ３５２１０）のＯｓ　ｐ　Ａタンパクをコード化し、ｏｓｐＡ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが記載されている。このＰＴＣ出願には、完全長野生型Ｏｓ　ｐ　Ａをコードする。ｓｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列がそのアミノ酸配列とともに記載されている。

Ｄｕｎｎらは、可溶性ではあるが、野生型Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの０ｓｐＡ抗体に対して特異的反応性を保持している修飾型０ｓｐＡタンパクの製造について記載している（参照文献３）。この論文には、２種類のプラスミツドとＤＥＴ９−Ｏ８ｐＡおよびｐＥＴ９−ｐｒ　ｅｏ　ｓ　ｏＡが記載されているが、前者は組換え裁断Ｏｓ　ｐ　Ａをコード化するしたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅ＤＮＡ配列を含み、後者は完全長野生型Ｏｓ　ｐ　Ａを＝−ド化するＰＣＲ増幅ＤＮＡ配列を含んでいる。両配列とも、バクテリオファージＴ７φ１０プロモーターから表現される。

完全長遺伝子の一次翻訳産物は疎水性のＮ−末端リーダー配列を含み、これが隣接するシスティン残基のスルフヒドリル側鎖に脂質部分が結合する場合の基質となる。この結合についで、シグナルペプチダーゼＨによる解裂および脂質部分の新しいＮ−ターミナルへの結合が起こる。一方、裁断遺伝子がら翻訳されたタンパクは脂質化されず、水溶液中に溶解している。０の表現に関連するいくつかの問題を解決するといわれている。すなわち、タンパクは表現の過程で宿主外側細胞膜に結合するために溶解性が低下し、タンパクの分離に界面活性剤を使用さざるを得す、精製が困難となる。

コントロール下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクロモシーム複写と低レベルのＴ７リソソームを生産するｐＡＣＹＣ１８４起因プラスミツドｐＬｙｓＳを含む宿主株）にプラスミツドが挿入されている。誘導しても、プラスミツドｐＥＴ９　ｐｒｅｏｓｐＡはプラスミツドｐ　Ｅ　Ｔ　９−　Ｏｓ　ｐＡに比較して誘導タンパクの生成量が少ないことが知られている。後者は界面活性剤が存在しなくても溶解し、前者は可溶化に界面活性剤のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を必要とすることが知られている。Ｄｕｎｎらの報告には、界面活性剤により可溶化した０ｓｐＡタンパクのその後の精製、単離については記載されていない。

組換え完全長Ｏｓ　ｐ　Ａの生産能が可溶性裁断０ｓｐＡに比較して低く、完全長タンパクの回収には界面活性剤を使用せざるを得ない（リポタンパクを界面活性剤で処理すると、反応性が損なわれる場合が多い）に全く同じ方法でペプチドのＮ−末端に共有結合している脂質（参照文献７）に上りＢリン３球細胞（参照文献４．５）と細胞毒性を有するＴリン８球細胞（参照文献６）の両方が刺激されることにより裁断タンパクに比較して免疫反応性が高いと考えられているため、組換え野生型タンパクは望ましいと考えられている。

０ｓｐＡをマウスに免疫投与することによって、スピロヘータ感染に対する長期の防護免疫が得られている（参照文献１．８）。この試験で使用されている抗原は、Ｏｓ　ｐ　Ａのアミノ酸末端にグルタチオン−５−−トランスフェラーゼの大きなドメインを含む溶融タンパクである。この溶融タンパクは翻訳後の脂質結ｔｓ合の基質になるとは考えられない。この試験で、この抗原の防護反応誘導能は、フロイントの完全アジュバントおよびその後のフロイントの不完全アジュバント９）で抗原を投与したことによるものであると考えられる。この従来の研究については、ＰＣＴＷＯ９２１０００５５も参照のこと。

ここで明かなように、完全長ｏｓｐＡ遺伝子により＝−ド化された組換えタンパクはアジュバントの非存在下またはアルム吸着の形態で、結合脂質を欠く類似の組換えＯｓ　ｐ　Ａタンパクではみられないような免疫原性を発揮することが、今回認められた。本発明は、大きなタンパク抗原の免疫原性が細菌リポタンパクの表現により増大することをはじめて開示するものである。

発明の要約高度に精製された免疫学的に有効な組換えタンパクおよび相当する遺伝子でコード化されたその他の完全長＋１ｏｒｒｅｌｉａリポタンパクの新規で、簡単で、かつ効果的な製造法を提供することである。この組換えタンパクは、天然タンパクと同等の免疫原性を示す。

本発明は、特定の界面活性剤を使用して、組換えリポタンパクをその他の細胞成分から選択的に分離する方法を用いる。本発明のこの手順は、従来の技術では解決できなかった完全長Ｏｓ　ｐ　Ａの製造にかかわる問題を解決すると同時に、免疫原性の高い製品を提供するものである。

プラスミツドにより形質転換させた宿主生物から遺伝Ｔ工学的に形成させた高度に精製され、免疫学的に有効な組換えタンパクを最初に提供するものである。本発明の第２の目的は、このような新規なタンノ（りである。また、本発明はこのような形質転換に有用ないくつかの新規プラスミツドも提供する。

れたタンパクからなるワクチンは、本発明の目的を構成する。

さらに、本発明の目的は、免疫学的有効量のタン／くすることである。

る宿主における抗体を検出し、感染の有無を診断するための免疫診断試薬として使用することができる。

−ド化され、精製され、免疫学的に有効な組換えタンパクを製造した。また、特定の遺伝子とはほとんどの場合ヌクレオチドの配列がいくつかの核酸で異なり、実際の８３１、ＡＣＡＩおよびＩｐ９０株のｏｓｏＡ遺伝子によって生産されるものとはほとんどの場合いくつかのアミノ酸で異なる遺伝子生産物が得られる完全長０８ｐＡ遺伝子も存在する。このような遺伝子および遺伝子生産物は、ここではＢａ１．ＡＣＡＩおよびＥ　Ｄ９０株の一族とみなした。

図面の簡単な説明Ｔ９ａ表現ベクター中にクローニングする場合に用いたＰＣＲオリゴヌクレオチドを示す。

図２は、Ｂａ１遺伝子からｐＯＡｌを形成させ、ＡＣＡＩ遺伝子からｐＯＡ９を形成させ、Ｉｐ９０遺伝子からｐＯＡ　Ｉ　Ｏを形成させるために、完全長ｏｓｐＡ遺伝子をｐ　Ｅ　Ｔ　９　ａ表現ベクター中に挿入し、０ＳｐＡ遺伝子を７７ｄｌＯプロモーターの＝ントロール下に置くためのクローニング手順を示す。

図３は、プラスミツドｐＯＡ１の予想制限マツプを示す。

図４は、全ての千！１位（Ｍ！￥−カー（ＨａｓＩＩＩで消化した。ｌ、Ｘ＋７４のＤＮＡ）；Ｂ−ＢａｍＨｌ；Ｅ＝Ｅｃｏ　ＲＩｉＨ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ；Ｎ＝Ｎｄｅ　Ｉ）の存在を実証しているプラスミツドｐＯＡＩの各種制限消化の結果を示す。

図５は、旦、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのＢａ１、　ＡＣＡＬおよびＩＤ９０の完全長０８ＤＡ遺伝子をＤｃＭＢＩ表現ベクター中にクローニングする場合に使用しｊ’−ＰＣＲヌクレオチドを示す。

図６は、Ｂａ　ｉｌｌ伝子からｐ０５を形成させ、ＡＣＡＩ遺伝子からｐＯＡ７を形成させ、Ｉｐ９０遺伝子からｐ　ＯＡ　８を形成させるために、完全長ｏｓｐＡ遺遺伝子をＴ　ｒ　ｃプロモーターのコントロール下に置くためのクローニング手順を示す。

図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、ｏ　ＯＡ　１を含む２種類の宿主（図７Ａ）およびｐＯＡ５　（図７Ｂ）およびｐＯＡ６　（図７Ｇ）を含む１種類の宿主におけるＯ　ｓ　ｐＡのＩＴＰＧによる誘導時間経過を示す。

図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、本発明の実施例にしたがってＥ、ｃｏｌｉから組換え完全長０ｓｐＡの製造および精製に使用したそれぞれ細胞培養およびその溶融、界面活性剤による抽出ならびに精製工程を示すフローチャートである。

図９は、各種界面活性剤ＣＤｅｏ÷デオキシー−ル酸ナトリウム＋　Ｅ　ｔｎ　ｐ　”エンピゲン；５ｎｒｃ＝ラウリルサルコシンナトリウム；５ＤＳ−ドデシル硫酸ナトリウム；ＴＸ１１４＝ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４）による完全細胞溶融液中へのタンパク溶出を示す、ただし、レーンのＭ　＝　ｖ−カー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製低分子量標準物質）；Ｗ−全溶融液；Ｓ＝溶解性画分；Ｐ＝ペレット；Ａ＝水溶性画分；Ｄ＝ｍ界面活性剤。

図１０は、抗０ｓｐＡモノクロナール抗体Ｈ５３３２によるウェスターンプロットである。ここで、界面活性剤相の３１にダルトンの物質は０ｓｐＡ、Ｗｈ−全細胞溶融液、Ａｇ＝Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４抽出後の水相、Ｄｔ＝界面活性剤相、Ｂｘ＝ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４で再度抽出した水相、ＰＩ＝不溶性ペレット。

図１１は、Ｏｓ　ｐ　Ａリポタンパクを表現するｐＯＡｌまたは０ｓｐＡ非リポタンパクを表現するｐＯＡ２を含む細１＆***最盛期まで培養し、Ｉ　Ｔ　Ｐ　Ｇ　Ｔ　ｏ　ＯＡｌを２時間、ＤＯＡ２を４時間誘導したりボタンバクおよび非リポタンパクをＴｒ　ｉ　ｔ　ｏｎ　Ｘ−１＋　４で相分配したｐＯＡＩおよびＤＯＡ２を示す。遠心分離後、細胞を再度懸濁させ、凍結／融解によって溶融した６　Ｔｒｉ＋ｏｎ　Ｘ　１１４を添加し、３７℃に加温して相分配を行った。

各両分から等量を採り、４〜２０％のＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル上で電気泳動を行った。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。

両分は、表示したようにｏ　ＯＡ　１およびｏＯＡ２とも分子量マーカー（Ｍ）、全溶融液（Ｗ）、水相（Ａ）、界面活性剤相〔１〕）、および不溶性ペレットである。

図１２Ａ、＋２１３および１２Ｃは、ｐＯＡｌ（図１２Ａ）、ｏＯＡ９およびｐＯＡＩｏ（図１２Ｂ）ならびにｐＯＡ５、ｐＯＡ７およびｐＯＡ８（図１２Ｇ）から製造した０５ＤＡリポタンパクの精製法を示す。

ここでは、各両分の一部を採り、４〜２０％のＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル上で電気泳動を行い、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。図１２Ａのレーン１は低分子量マーカー、レーン２は全溶融液、レーン３は界面活性剤相、レーン４はＤＥＡＥセファロース、レーン５はＳ−セファロース溶出液である。図１２８のＰ＝あらかじめ染色した低分子量マーカー（１０６ｋＤａ、８０ｋＤａ、４９．５ｋＤａ、３２．５ｋＤａ、２７．５ｋＤａ、１８．５ｋＤａ）、ＣＬ＝全細胞溶融液、Ｄ＝Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ＝１１４界面活性剤相、Ｄ　ｅ　＝　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅセファロース通過画分、Ｓ−セファロースｐＨ５，７溶出液（精製Ｏｓ　ｐ　Ａ　−２）である。図１２ＣのＰ−あらかじめ染色１−だ低分子量マーカー（１０６ｋ　Ｄ　ａ、８０ｋＤａ、４９．５ｋＤａ、３２．５ｋＤａ、２７．５ｋＤａ、１８．５ｋＤａ）、０＝Ｓ−セファロースで精製したｐＯＡ１由来Ｂ　３１０ｓｐＡ−Ｌ（図１２Ａ）、ＣＬ＝全細胞溶融液、Ｄ＝Ｔ　ｒ　ｉ　ｔ　ｏｎ　Ｘ＝　＋　１４界面活性剤相、Ｄｅ＝ＤＥＡＥセファロース通過画分である。

図１３は、精製完全長Ｏｓ　ｐ　Ａの免疫原性をＢ　ｏ　ｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのタンノ（りの免疫原性を比較する試験に用いた３種類の試験ワクチンの銀染色ゲルである（Ｍ＝ママ−−：ＯＡ−精製組換えＯｓ　ｐＡ　；　Ｅ　＝旦、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの画分Ｅ；ＳＡ＝仔牛血清アルブミン）。

図１４は、精製完全長Ｏｓ　ｐＡおよび図１３に示したＩ３．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ画分１０ｕｇをあらかじめ注射した後４週間追加免疫を行ったマウスのＩｇＧ血清価を示す。ＩｇＧ血清価は、第１抗体としてマウス血清、第２抗体としてアルカリホスファターゼに共役させたヤギの抗マウスＩｇＧ、精製Ｏｓ　ｐ　Ａ　Ｉ　ＯＯμｇを含む固相を用い、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で測定した。

図１５Ａ〜１５１には、リポタンパクに対するマウスの用量反応を示すグラフである。図１５Ａは、非吸着リポタンパクに対するＣ　３　Ｈ／　Ｈｅ系マウスの用量反応を示す。図１５Ｂは、非吸着リポタンパクに対するＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｅ系マウスの用量反応を示す。図１５Ｃは、アルム吸着リポタンパクに対するＣ　３　Ｈ／　Ｈｅ系マウスの用量反応を示す。図＋５Ｄは、非吸着リポタンパクに対するＣ　Ｈ３／　Ｈｅ系マウスの用量反応を示す。

図１５Ｂは、非脂質化タンパクに対するＣ　Ｈ３／　Ｈｅ系マウスの用量反応を示す。マウスは、０週日に表示量のタンパク（特記しない限りＰＢＳに懸濁）を免疫投与し、３週時に同じワクチンで追加免疫を行った。

４週時の血清ＩｇＧ価は抗原として０ｓｐＡリポタンパクを用い、ＥＬｒＳＡ法で測定した。

図１６はりボタンバクおよび非リポタンパクの抗原性を示すグラフである。

図１７は、ＤＣＭＢＩおよびｐＣＭＢ２プラスミツドの生産を示す。

プラスミツドを含むｏｓｐＡ遺伝子の識別名　の系統ｐ　ＯＡ　Ｉ　Ｂ　３１　ｐＥ　Ｔ　９　ａＤＯＡ２マ　Ｂ３１　ｐＥＴ９ａＤＯＡ５　Ｂ３１　ＤＣＭＢＩＤＯＡ６　Ｂ３１　ＤＣＭＢ２ｏＯＡ７　ＡＣＡＩ　ＤＣＭＢＩｐＯＡ　８　１　ｐ　９０　Ｄ　ＣＭ　Ｂ　Ｉｏ　ＯＡ　９　Ａ　ＣＡ　１　ｐ　Ｅ　Ｔ　９０　ａｐＯＡ　１０　１　ｏ　９０　ｐ　Ｅ　Ｔ　９０　ａ発明についての記述Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉＢ３１株のクローン化ｏｓｐＡ遺伝子（前記のＷＯ９０１０４４１１を参照）（Ｎ−末端領域、配列識別番号ｌ；Ｃ−末端領域：配列識別番号２；その他の配列はＷＯ９０１０４４１１と同じ）を鋳型（ｐＴＲＨ４４）　として使用し、図１に示したように、ポリメラーゼ連鎖反応において野生型ｏｓｐＡ遺伝子全体を増幅するために、特別に設計したオリゴヌクレオチド　プライマー（ＰＥＴ−ＩＮ［ＣＯ１］　（配列識別番号３）およびＰＥＴ−２７３Ｃ［ＣＯ３］　（配列識別番号４）を使用した。

同様に、それぞれＮ−およびＣ−末端におけるオリゴヌクレオチド　プライマ一対（ａ）ＯｓｐＮ２（配列識別番号７）およびＢＺＩ　（配列識別番号８）ならびに（ｂ）Ｏｓｃ＋Ｎ２（配列識別番号７）およびＤＫ４（配列識別番号９）とのＰＣＲ反応には、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのＡＣＡ　ＩおよびＩｐ９０株のクローン化ｏｓｐＡ遺伝子（参照文献１０参照；　ＡＣＡｌおよびＩ　ｐ９０のＮ−末端領域；配列識別番号ｌ：ＡＣＡＩ（７）Ｃ−末端領域：配列識別番号５；Ｉｐ９０のＣ−末端領域：配列識別番号６）を用い、図１に示すように適当な増幅フラグメントを形成させた。

一般に、オリゴヌクレオチド　プライマーを用いた標的核酸の基本的増幅法は従来知られており、米国特許第４．６８３，２０２号および第４．　８００．　１５９号に記載されているので、使用すべき技術の記載は省略する。

得られたフラグメントをプラスミツドベクターＤＥＴ９のＮｄｅ＋および１３ａｍＨ１部位にクローン化し、図２に示すように、Ｔ７プロモーターのコントロール下のｏｓｐＡ遺伝子およびバクテリオファージＴ７からの効果的な翻訳開始シグナルを導入した。ｐＥＴ９およびｐＬｙｓＳプラスミツド、コローン化のための宿主細菌、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによるクローン化遺伝子の表現に使用する培地および方法は、すでに米国特許第４，９５２．４９６号に記載されているので、ここでは詳細な記載は省略する。Ｔ７プロモーター系は本発明における好ましい表現系ではあるが、完全長ｏｓｐＡ遺伝子の表現は、以下に記載するように、宿主生物と相客性のあるその他の表現系を用いても達成することができる。

ＤＥＴ９はその選択的マーカーとしてｂｌａ遺伝子よりもむしろｋａｎ遺伝子を持っているので、これを使用した。したがって、細胞培養にアンピシリンを使用する必要がなかったので、免疫性を有するアンピシリールと０ｓｐＡ標的タンパクの共役結合が形成される可能性がない。このような共役結合は、ペニシリンアレルギーにおける主要な抗原決定基であると考えられ、免疫学的試験を複雑にする。

得られたプラスミツドはＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｌのＢａ１．ＡＣＡｌおよびＩ　Ｅ）９０株からのｏｓｐＡ遺伝子を含み、それぞれｐＯＡｌ、ｐＯＡ９およびｐＯＡ　１０と表示した。ｐＯＡ１プラスミツドは、Ｄｕｎｎら（前出）によって記載されているｐＥＴ９−ｐ　ｒ　ｅ　Ｏｓ　ｐ　Ａプラスミツドとほとんど同じであるが、両者はＰＣＲ反応に用いたオリゴヌクレオチドが異なる。プラスミツドＤＯＡ　１の予想制限マツプを図３に示した。その各種制限消化の結果は図４から明がなように、全ての予想部位が存在していることを示している。

タンパクを生産させるため、プラスミツドｐＯＡ　Ｉ、ｐ　ＯＡ　９およびＤＯＡＩＯはＥ、ｃｏｌｉまたはその他の適当な宿主生物の表現株に形質転換させた。Ｅ。

ｃｏｌｉ株は、前記の米国特許第４，９５２，４９６号に記載されているように、Ｅ、ｃｏｌｉのＴ７表現株が好ましい。特に、当該菌株としては、前記のようにＥ、ｃｏｌｉのＢＬ２１　（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）表現株であってもよいし、Ｅ、Ｃｏ１１の０ＭＳ１７４　（ＤＥ３）（ｐＬｙｓｓ）株であってもよい。

形質転換した宿主を培養し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（Ｉ　ＰＴＧ）でタンパクを誘導した。　■ＰＴＧ添加後のｐＯＡ　１プラスミツドからのＯｓ　ｐ　Ａの誘導時間を図７Ａに示す。ｐＯＡ９およびｐＯＡｌｏを用いた場合にも、ｃ＋ＯＡＩの場合と同様な結果が得られた。ＤＯＡＩプラスミツドからのＯｓ　ｐ　Ａタンパクの合成は誘導倹約１時間で停止し、Ｅ、ｃｏｌｉに対しである程度タンパクの毒性があることを示している。それにもかかわらず、タンパクの生産は培地あたり約１０　ｍ　ｇ　／　Ｌであり、許容レベルにあった。

プラスミツドｐＯＡ１．ｐＯＡ９およびｐＯＡ　１０、ならびにＴ７プロモーターを用いたＥ、ｃｏｌｉにおける０ｓｐＡリポタンパクの表現のほかに、異なったプロモーター下で完全長Ｂ３１．ＡＣＡＩおよびＩｐ９０　０ＳＤＡ遺伝子を含むプラスミツドを構成し、リポタンパクを表現させた。これに関し、Ｂａ１からのｏｓｐＡのＰＣＲ増幅フラグメントをプラスミツド表現ベクターｐｃＭｎｔおよびｐ　ＣＭ　Ｂ　２のＮｃｏｌおよびＢａｍＨ１部位にクローニングしてプラスミツドＤＯＡ５およびｐＯＡ６を調製し、一方プラスミツドＤＯＡ７およびｐｏＡａはＡＣＡ　１株（ｐＯＡ７）および１ｐ９０株（ｐＯＡ８）からのｏｓｐＡのｐｃＲ増幅フラグメントを表現ベクターｐＣＭＢＩのＮｃｏｆおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングして調製した（ｐＯＡ５、ｐＯＡ７およびｐＯＡ８については図６を参照）。

図５から明かなように、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのＢａ１、ＡＣＡｌおよびＩ　Ｃ９０株のクローン化０８ＯＡ遺伝子は、オリゴヌクレオチドプライマ一対（ａ）ＰＸ３　（配列識別番号ｔｏ）およびＣ０３（配列識別番号３）、　（ｂ）ＰＸ３　（配列識別番号１０）およびＢＺＩ　（配列識別番号８）および（ｃ）ＰＸ３（配列識別番号１０）およびＰＸ４　（配列識別番号９）を用いたＰＣＲ反応によって、それぞれ相当する遺伝子のＮ−末端およびＣ−末端で増幅され、相当する増幅フラグメントを形成した。

プラスミツドＤＣＭＢＩおよびｐＣＭＢ２は、プラスミツドｐＴｒｃ９９ａ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａカタログ番号２７−５００７−０１）およびカナマイシン抵抗性遺伝子（Ｐｈａｒｍａｃｉａカタログ番号２７−４８９７−０１）を消化し、遺伝子浄化法によってフラグメントを分離し、フラグメントを相互に結紮することにより構成した（図１７）。プラスミツドｐ　Ｔ　ｒｃ９９ａ　（４１９７ｂｐ）は多重コローニング部位に隣接して強いプロモーターを有し、その隣には強い転写集結シグナル（ｒｒｎＢ）を有する。標的形質の表現には宿り細胞のＲＮＡポリメラーゼを使用するので、広い範囲のＥ、ｃｏｌｉ株に使用することができる。

表現は、ベクターに含まれるラクトースサプレッサー遺伝子（ｌａｃ［ｇ）によって制御される。ラクトースレプレッサータンパクは、インデューサー［ＰＴＧの非存在Ｆでは標的遺伝ｆの転写を阻害する。カナマイシン抵抗性遺伝子は、制限酵素部位により側面を保護されたトランスポゾンＴｎ９０３がらの遺伝子を含む直線状の２本鎖ＤＮＡフラグメント（１２ａ２ｂｐ）であり、カナマイシンおよびネオマイシンに対する抵抗性に関して連合作用を有するアミノグリコシド３゛−ホスフォトランスフェラーゼ酵素をコード化する。

ＤＣＭＢＩ　（５，５ｋｂ）は、その転写がＴｒｃプロモーターに由来するものと同じ方向にあるように定位したカナマイシン抵抗性遺伝子を含み、一方ＤＣＭＢ２は反対方向に定位したカナマイシン抵抗性遺伝子を含んでいるため、抵抗性遺伝子およびＴ　’ｒ　ｃプロモーターのコントロール下にある特定の遺伝子の転写により幅輪転写が得られる。３ｍａ　１．　Ｈｉ　ｎｄ　Ｔ　Ｉ　ＩおよびＢａｍ１ｌｌ＋Ｎｃｏｌによりｏ　ＣＭ　Ｂ　Ｉおよびｐ　ＣＭ　Ｂ　２を制限酵素消化すると、予想したと全く同じ大きさのフラグメントが得られた。

プラスミツドｐＯＡ５およびｏＯＡ６をＥ、ｃｏ＋１またはその他の適当な生物、好ましくはＤ　Ｈ５αフンボーネント細胞の表現株に形質転換させた。形質転換した宿主を培養し、［ＰＴＧでタンパクを誘導した。

ｏ　ＯＡ　５による誘導時間経過（図７Ｂ）はＤＯＡ　１（図７Ａ）と同様であったが、ＤＯＡ６により生産されたＯ　ｓ　ｐ　Ａのレヘルは数倍も低がった（図７０）。

ｏＯＡ　７およびＤＯＡ８を用いた場合にも、ｐ　ＯＡ　５と同様な結果が得られた。

組換え完全長Ｏｓ　ｐ　Ａの製造および精製工程を図８Ａおよび８Ｃに模式的に示す。工程の特異的条件は、後に述べる実施例で規定したが、以下に要約する。

細胞の培養およびタンパクの誘導（図８Ａ）についで、細胞を凍結、解凍により溶融させた。溶融液中に存在するその他の細菌タンパクよりも０ｓｐＡタンパクを選択的に可溶化させる界面活性剤で溶融液を処理する。各種の界面活性剤を用いて一連の実験を行い、Ｏｓ　ｐＡタンパクに対していずれの界面活性剤の選択性が高いか検討した。試験した界面活性剤のうちＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４は３１にダルトンのタンパクを選択的に可溶化させ（図９）、このタンパクは免疫プロッティングによりＯｓ　ｐ　Ａであることを確認した（図１０）。

本発明は、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４の使用に限るものではなく、Ｏｓ　ｐ　Ａに対して同様な選択的溶解性を示すとともに、以下に述べるように穏和な条件下で相分離性を有するものであれば別の材料であってもかまわない。

選択的界面活性剤の添加についで、約３５℃〜４０℃まで徐々に温度を上げて混合物を加温する。　この間に相分離が起こり、溶液が混濁する。本発明の精製手順では、タンパクの変性または免疫学的性質の損傷を避けるため、この相分離は穏和な条件下で行う。　（例えば、Ｄｕｎｎらが記載しているＴｒｉｔｏｎＸ− １００（参照文献３）を界面活性剤として使用すると、０ｓｐＡタンパクの選択的分離には有効であるが、相分離を起こさせるためには約６０〜６５℃に加温する必要があり、製品の利用に関してはきわめて不利である）。

混濁した混合物を遠心分離すると、混合物は３相、すなわち５０％またはそれ以上の０ｓｐＡタンパクと少量（約５重量％）の細菌タンパクを含む界面活性開用、残りのＪｌｌＩｌ菌タンパクを含む水相と細胞残渣の固形ペレットに分かれる。界面活性開用を水相および固形ペレットから分離する。

０ｓｐＡに選択的な界面活性剤による処理およびその後の界面活性開用の相分離の工程で、ＩＩａ閑タンパクからＯｓ　ｐ　Ａをほぼ完全に分離することができる（図１２）。最後の精製工程により、界面活性開用に存在する＊ＳタンパクからＯｓ　ｐ　Ａを分離する。

最後のタンパク精製は、Ｓ＋＠タンパクを選択的に吸着し、０５ＤＡは吸着しないクロマトグラフィーカラム、特にＤＥＡＥ−セファセル、ＤＥＡＥ−セファロースまたはその地回等のクロマトグラフィー用材料を用いて行う。界面活性開用なカラムに載せ、精製されたＯ　ｓ　ｐ　Ａタンパクの全てを含む通過液を集める。吸着画分は、界面活性開用に含まれていたｍｍタンパクの全てを含む。Ｓ− セファロースまたは相当するクロマトグラフィー用カラムを用いてさらに精製すると、混在するタンパクのみならず、リムラス細胞分解物（ＬＡＬ）試験でパイロジエン性が認められなかったことから、リボ多糖類（ＬＰＳ）も含有量がかなり低い通過液が得られる。高度に精製された０ｓｐＡ溶液は凍結乾燥するか、さもなくば加工する。

上記の手順は、特に高度に精製された組換えＯｓ　ｐＡタンパクに製造について述べたが、この手順および技術は、適当な遺伝子の適切なりローニング、当該遺伝子を含む適切なプラスミツドベクターの構成、当該プラスミツドベクターによる適切な宿主の形質転換ならびにリポタンパクの製造および精製によって、また選択的界面活性剤を適切に選択することによって、その他の高度に精製された組換えＢｏｒｒｅｌｉａリポタンパクの製造にも容易に適用することができる。

実施例実施例１上記のように調製したプラスミツドＤＯＡ　１を用いて、　Ｅ、ｃｏｌｉ　のＢＬ２１　（ＤＥ３）　（ｐＬｙｓｓ）（ｐＯＡ　＋）株およびＩＩＭＳ　１７４　（ＤＥ３）ＣｏＬｙｓｓ）（ｐＯＡＩ）株の形質転換を行った。形質転換Ｅ、ｃｏｌｉを、本格培養培地ＩＬ当り１２ｍ１の前培養液が得られるように、硫酸カナマイシン２５μｇ　／　ｍ　Ｉ、クロラムフェニコール２５μｇ　／　ｍ　ｌを含むＬＤ培地に接種した。約３７℃で１夜振とうして前培養した。

翌朝、１夜培養した培地１０ｍ１を、硫酸カナマイシン２５μｇ　／　ｍ　Ｉを含むＬＢ培地ＩＬに接種し、０Ｄ＝０．　６　（０１）＝１．　５まで培養してもよい）に成るまで約３７℃で約３時聞損とう培養した。インプロピルチオガラクトシド（Ｉ　ＰＴＧ）を最終濃度が０゜５ｍＭになるように培地に添加し、さらに３７℃で２時間培養した。培養終了後、培地を約４℃まで冷却し、１００００　ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを１０倍量のＰＢＳに懸濁させた。

細胞懸濁液を液体窒素中で凍結した。この凍結細胞は、必要であれば、−７０℃ で無期限に保存することができる。

細胞懸濁液の凍結についで、室温（約２０〜２５℃）で細胞を解凍した。この過程で、細胞溶融が起こる。

解凍した細胞懸濁液に、濃度がｌμｇ　／　ｍ　ＩとなるようにＤＮａｓｅ　Ｉを添加し、室温で３０分間インキュベーションした。この間に溶液の粘性が低下する。

インキュベーション終了後、細胞懸濁液を氷上で１０℃以下まで冷却し、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４の１０重量％原液を最終濃度が０．３〜１重量％となるように添加した。この混合物を氷上に２０分間保った。

冷却した混合物を、つぎに約３７℃まで加温□し、その温度に１０分間保った。

相分離が起こるにつれ、液は混濁する。この混濁液を、約２０℃、１２．ｏｏｏ　Ｘｇで１０分間遠心分離すると、界面活性開用の低層、その上の透明な水相、および固形のベレットに分かれる。ペレットを乱さないように、界面活性開用をその他の相から分取し、４℃に冷却した。緩衝液Ａ、すなわち５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７，５）、２ｍＭＥＤＴＡおよび１０ｍＭＮａｃ＋を冷却した界面活性開用に添加し、もとの容量の１／３量とした。得らえた溶液は、凍結し、保存した後、以下に記載するように加工してもよいし、直ちにそのような加工を行ってもよい。

界面活性開用１０ｍ１あたり１ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムを用意し、２倍量の緩衝液Ｃ１すなわち５０ｍＭのＴｒ　ｉ　ｓ　（ＤＨ７，５）、２ｍＭのＥＤＴＡ、ＩＭ　ＮａＣ１，０，３重量％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で洗い、さらに緩衝液Ｂ１　すなわち５０ｍＭのＴｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ７，５）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ｔｌＬ％のＴｒｉＬｏｎ　Ｘ−１００で洗った。

つぎに界面活性開用をカラムに載せ、Ｏｓ　ｏ　Ａを含む通過液を集めた。さらに等量の緩衝液Ｂでカラムを洗い、この通過液も集めた。精製されたＯ　ｓ　ｐＡを含む通過液を一緒にし、凍結保存する。

カラムは２倍量の緩衝液Ｃで溶出することによって、細菌のタンパクを除去し、再使用することができる。

さらにＤＥＡＥ−セファロースカラムからの通過液は、Ｓ−セファロースクロマトグラフィーにより最後の精製を行なった。まず、ＤＥＡＥ−セファロースカラム通過液を０．１Ｍのクエン酸でＩ）Ｈ４，２とした。

Ｓ−セファロースカラムは緩衝液Ｃで繰り返し洗った後、クエン酸でｐＨを４．２とした。

緩衝液Ｃを用いて、高度に精製されたＯ　Ｓ　ＯＡを溶出した。溶出液のｐ　１１はクエン酸のため、５．７であった。直ちに２ＭのＴｒｉｓ塩基でｐＨ７，６に調整した。

両クロマトグラフィー手順で得られた高度に精製された０ｓｐＡの水溶液をコマシー染色ゲルで分析した（図１２Ａ）、高度に精製された０ｓｏＡが含まれていることを確認した。後者のクロマトグラフィー手順で得られた製品の純度は、前者のクロマトグラフィー手順により得られたものに比較して高く、エンドトキシンのレベルはきわめて低いことが確認された。

実施例２実施例１の手順を繰り返した。ただし、Ｔｒｉｔ。

ｎＸ−１１４のみならずその他の界面活性剤も使用して界面活性開用を得た。得られた結果を図９に示す。

図９から明らかなように、そのままカラムクロマトグラフィーで精製できるほどの０ｓｐＡを選択的に可溶化したのは、使用した界面活性剤のうちＴｒ　ｉ　ｔ　ｏｎＸ−１１４のみであった。

実施例３プラスミツドｐＯＡ　５およびＤＯＡ６を前記のように調製し、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株の形質転換に用いた、実施例１と同じ手順を用いてタンパクを表現させた。ＤＯＡ５によるＯ　Ｓ　ｐＡリポタンパクの経時的表現は、ｏ　ＯＡ　ｌで認められたものと同じであった。

一方、ｐＯＡ６による０ｓｐＡの表現はｐＯＡ５に比較して数倍も低いことが認められた（図７Ｂおよび７Ｃ）。０ｓｐＡタンパクの精製は、ｐＯＡ　５で表現させた細胞のみについて行なった。

このようにしてＴｒｃ表現系により生産されたＢ３１　０ｓｐＡリポタンパクを、実施例１と同じ手順で精製した。ただし、収穫した細胞ベレットには０．　１ｍ　ｇ　／　ｍ　＋のりゾチームを添加し、細胞を凍結する前に、室温で３０分間懸濁させた。

ＤＥＡＲ−セファロースカラムの通ＡＴ＆には、高度に精製されたＯ　ｓ　ｐ　Ａリポタンパクが含まれていた（図９Ｇ）。

実施例４Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのアジア株（Ｉｐ９０）（ＡＴＣＣ）のクローン化した。ｓｏＡ遺伝子を月い、前記と同様な手順でプラスミツドＤＯＡＩ（ｏＥＴプロモーター）およびｐＯＡ５　（ＴＲＣプロモーター）を調製し、当該遺伝子を含むプラスミツドｐＯＡ８（Ｔｒｃプロモーター）およびｏ　ＯＡ　１０（ｐＥＴプロモーター）を形成させた。これらのプラスミツドについて制限消化を行なったところ、予想部位が全て存在している二とが認められた。

また〜　旦、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのヨーｔ２ツバ株ｓｐＡ遺伝子を囲い、当該遺伝子を含むプラスミツドＥＴプロモーター）を形成させた。これらのプラスミツドについて制限消化を行なったところ、予想部位が全て存在していることが認められた。

ＤＯＡＳ株（実施例３）と全く同じ手順でｐＯＡ７およびｐＯＡ８表現株の培養および誘導を行なった。

一方、ＤＯＡ９およびｐＯＡ１０表現株の培養および誘導は、ｐＯＡ１株（実施例１）と同様に行なった。

これらの操作で得られたＡＣＡ　ＩおよびＩ　ｐ９０の０ｓｐＡリポタンパクは、実施例１に記載したＢ５１（ｐ　ＯＡ　ｌ　）の０ｓｏＡリポタンパクと同じ手順で精製した。ＤＥＡＥ−セファロースカラム通過液は、高度に精製されたＯ　ｓ　ｐ　Ａリポタンパクな含んでいた（図１２Ｂ、１２Ｃ）。

実施例５実施例１に記載した手順にしたがってＥ、ｃｏｌｉから精製した完全長組換えＯｓ　ｐ　Ａのマウスに対する免疫原性を、Ｏｓ　ｐ　Ａの含有量の高いＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ画分Ｅ（前記のＰＣＴ　Ｎｏ、ＷＯ９０１０４４１１に記載されているように調製した）および仔牛血清アルブミンと比較した。Ｃ３ｆ（／　Ｈｅ系マウスに、アジュバントを含まないワクチンをそれぞれ１０μｇ注射した。最初の注射から４週間後に、最初に注射したものと同じ抗原をブースター注射した。

直情価は、精製した組換え０ｓｐＡリポタンパクを用いてＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で測定した（図１４）。

図から明らかなように、両抗原はきわめてよく似た反応、すなわち弱いが検出可能な一次血清ＩｇＧ反応を示し、追加抗原刺激後血清価は１００倍増加した。

両免疫原とも、血清１ｇＧ価は少なくとも６週間安定であった。いずれの場合も、顕著な血清１ｇＭ反応は認められなかった。

性を有することを示している。

Ｍ換えＯｓｃ＋Ａリポタンパクの免疫学的信頼性は、次表から明らかなように、組換えリボタンノ（りで免疫を与えたマウスの血清がｉｎ　ｖｉｔｒｏで旦・　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ　［３３１スピロヘータの生育を完全に阻害することからも実証される。

表１からも明らかなように、血清の阻害活性はマウスに投与したりボタンバクの用量に比例し、ＥＬＩＳＡ法による抗０ｓｐＡ　ＩｇＧ検定の結果とよく一致した。検出できるほどの抗０ｓｐＡ抗体を含まなし＼０ｓｐＡ非リポタンパクを免疫投与したマウスの血清では、スピロヘータの生育に対する影響が認められなかった。

２．５μｇの０ｓｐＡリポタンパクをＰＢＳで免疫投与したマウスで得られた生育阻害価は、Ｂ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの全タンパク２０μｇをフロイントの完全アジュバントで免疫投与した後全タンパクをＰＢＳで追加免疫投与したマウスで得られた結果と同等か、それ以上であった。組換えＯｓ　ｏ　Ａリポタンパクがスピロヘータの生育を阻害するほどの血清反応を起こす能力を持っていることは、Ｅ、ｃｏｌｉにおける表現およびその後の精製過程で、タンパク上の重要な防護エピトープが保存されることを実証するものである。

実施例６前記のプラスミツドＤＯＡ＋と同様にプラスミツドｏ　ＯＡ　２を調製した。ただし、ＰＣＲ反応では、リポタンパクのシグナルペプチドを欠く裁断ｏｓｐＡ遺伝子を増幅させるため、Ｃ−末端プライマーＰＥＴ−２７３Ｃとともに、以下の配列を有するプライマーＰＥＴ−１８Ｎ（配列識別番号１１）を使用した。

５’ＣＡＴ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＡＧＣ３’ ＰＥＴ−１８Ｎの下線で表示した部分は、Ｏｓ　ｐＡ這伝子のコーディングストランドの５１〜６７ヌクレオチドと同一である。プラスミツドｐＯＡ２を用いて旦。

ｃｏｌｉｆ）ＢＬ２１　（ＤＥ３）（ｐＬｙｓｓ）（ｐ。

Ａ２）およびＨＭＳ１７４　（ＤＥ３）（ＤＬＹＳＳ）（ＤＯＡ２）株を形質転換させ、実施例１に記載したように、形質転換させたＥ、ｃｏｌｉから裁断Ｏｓ。

Ａタンパクを表現させた。実施例１の細胞溶融および界面活性剤抽出を行なったところ、非リポタンパクは期待したように水相に存在することが明らかとなった。

実施例７０ｓｐＡタンパクに脂質が結合した場合の免疫原性に及ぼす影響を検討した。実施例１に記載したように形成させ、精製したりボタンバク型の０ｓｏＡまたはＤｕｎｎら（参照文献３）により調製された非リポタンパク型Ｏｓ　ＤＡをＣ３Ｈ／　ＨｅおよびＢＡＬＢ系マウスに免疫投与し、３週間後に追加免疫投与した。

追加免疫投与１〜２週間後に血清を採取し、抗原として精製０ｓｏＡリポタンパクを用い、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で検定した。

図１５Ａおよび１５Ｂは、ＰＢＳで投与した０ｓｐＡリポタンパクがＣ３Ｈ／Ｈｅ（図１５Ａ）およびＢＡ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系マウス（図１５Ｂ）のいずれに対しても、強い、用量に依存した二次１ｇＧ反応を誘導することを示している。図１５Ｃから明らかなように、タンノ（りを水酸化アルミニラにタンパク：アルミニラ比で１：５（重量）の割合で吸着させて投与した場合、免疫原性の増加は、認められたとしても僅かであった。

０ｓｐＡリポタンパクでは反応が認められたのに対して、非リポタンパクでは図１５Ｂに示すように最高用量の２．５μｇ／マウスでも検出できるほどの抗０ｓｏＡ抗体の誘導は認められなかった。アルム吸収非リポタンパクも免疫反応を誘導するとは思えない。

０ｓｐＡのリポタンパクと非リポタンパクの推論アミノ酸配列は、アミノ酸末端残基を除き、同じである。

リポタンパクのアミノ酸末端残基は修飾システィンであり、非リポタンパクのアミノ酸末端残基はメチオニン−アラニンである。したがって、前記の免疫原性の差は脂質部分の存在によることを強く示唆している。

実施例８実施例７で認められた免疫原性の差が本質的な抗原性の差によるのか、免疫系による２種類のタンパクの識別およびそれに対する反応の差によるのかを明らかにするため、Ｏｓ　ｏ　Ａのりボタンバクと非リポタンパクについて、本質的な抗原性を検討した。

リポタンパクを免疫投与したマウスの血清は１１図１６に示したように、いずれの０ｓｐＡを試験抗原として用いた場合にも、ＥＬＩＳＡ法で陽性シグナルを示した。一方、非リポタンパクを免疫投与したマウスの血清は、いずれの抗原にも反応しなかった。したがって、両０ｓｐＡの抗原性には差はなく、リボタン／＜りは免疫系によってよく識別されるのに対して、非リポタンパクは識別されない。

実施例９０ｓｐＡタンパクの起源による免疫原性の差を検討した。それぞれＩ）ＯＡｌ、ＤＯＡ９およびｐＯＡ　Ｉ　Ｏに由来する精製０ｓｐＡリポタンパクＢ３１．ＡＣＡ１およびＩｐ９０をマウスに免疫投与した。０週時に２．５μｇのタンパクを免疫投与し、３週時に同じ用量を追加免疫投与し、４週時にマウスから採血した。

抗原として精製Ｏｓ　ｏ　ＡリポタンパクＢ３１．ＡＣＡｌまたはｌ９９０を用い、ＥＬＩＳＡ法で４週時の血ｍ　Ｔ　ｇ　Ｇ価を測定した。力価はヤギの抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いて測定した。

これらの実験で得られた結果を図１５Ｄに示す。このデータから明らかなように、試験したいずれの系統の組換えＯｓ　ｐＡもマウスに免疫原性を有し、ポリクロナール血清は部分的交差反応性を示した。

開示の要約本開示を要約すると、本発明は宿主からリボタンノ（りを選択的に抽出することのできる界面活性剤を用し１、ついで界面活性剤溶液をカラムクロマトグラフィーでェ１リポタンパク遺伝子、特にＢ、ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの０５ＤＡ遺伝子で＝−Ｆ化され、高度に精製され、免疫学的に有効な組換えタンパクの新規で、阜純な製造法を提供する。本発明の範囲内で、改良が可能である。

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ＦＩＧ、１７゜手続補正書平成６年６月２１日

Claims

【特許請求の範囲】請求項１．完全長の野性型Ｂｏｒｒｅｌｉａリボタンパク遺伝子をコード化し、前記の遺伝子を含むプラスミッドで形質転換させた宿主生物から組換え形成させた、高度に精製され、免疫学的に有効なタンパク。請求項２．完全長の野性型Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉｏｓｐＡ遺伝子でコード化された請求項１に記載のタンパク。請求項３．前記のプラスミッドがプラスミッドｐＯＡ１であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク。請求項４．前記のプラスミッドがプラスミッドｐＯＡ５であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク。請求項５．前記のプラスミッドがプラスミッドｐＯＡ６であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク。請求項６．前記のプラスミッドがプラスミッドｐＯＡ７であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク。請求項７．前記のプラスミッドがプラスミッドｐＯＡ８であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク。請求項８．前記のプラスミッドがプラスミッドｐＯＡ９であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク。請求埴９．前記のプラスミッドがプラスミッドｐＯＡ１０であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク。請求項１０．前記のｏｓｐＡ遺伝子がＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのＢ３１系から単離された遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク。請求項１１．前記のｏｓｐＡ遺伝子がＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのＩｐ９０系から単離された遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク。請求項１２．前記のｏｓｐＡ遺伝子がＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのＡＣＡ１系から単離された遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク。請求項１３．前記の宿主生物がＥ．ｃｏｌｉであることを特徴とする請求項１に記載のタンパク。請求項１４．前記のプラスミッドがプラスミッドベクタ−ｐＥＴ９からなり、その遺伝子がＴ７プロモーターおよびバクテリオファージＴ７からの効果的な翻訳開始シグナルのコントロール下にあることを特徴とする請求項２に記載のタンパク。請求項１５．前記の宿主生物がＥ．ｃｏｌｉのＴ７表現株であることを特徴とする請求項１４に記載のタンパク。請求項１６．前記の宿主生物がＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＳ）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐしｙｓＳ）表現株であることを特徴とする請求項１５に記載のタンパク。請求項１７．前記のプラスミッドがプラスミッドベクタ−ｐＣＭＢ１またはｐＣＭＢ２からなり、その遺伝子がＴｒｃプロモーターのコントロール下にあることを特徴とする請求項２に記載のタンパク。請求項１８．細菌のタンパクおよびリポポリサッカライドをほとんど含まない請求項１に記載のタンパク。請求項１９．完全長の野性型Ｂｏｒｒｅｌｉａリボタンパク遺伝子でコード化されたタンパクの製造法であって、前記の遺伝子を含むプラスミッドにより形質転換した宿主生物からＢｏｒｒｅｌｉａリボタンパクを誘導し、前記の宿主生物の細胞を溶融し、細菌またはその他のタンパクからＢｏｒｒｅｌｉａリボタンパクを選択的に溶解し、かつ温和な条件下で界面活性剤相の相分離が可能な界面活性剤で溶融細胞を処理し、溶解したＢｏｒｒｅｌｉａリボタンパクを含む界面活性剤相と、細菌およびその他のタンパクを含む水相と、細胞残渣を含む固体相に相分離を行い、前記の固体相および前記の水相から前記の界面活性剤相を回収し、前記の界面活性剤相からＢｏｒｒｅｌｉａリポクンパク以外のタンパクを除去、精製することからなる製造法。請求項２０．タンパクがＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのｏｓｐＡ遺伝子によりコード化されているＯｓｐＡタンパクであることを特徴とする請求項１９に記載の製造法。請求項２１．前記の界面活性剤がＴｒｉｔｏｎＸ−１１４であることを特徴とする請求項２０に記載の製造法。請求項２２．前記の溶融細胞の前記の処理を約０°〜１０°の温度で行い、得られた混合物を約３５°〜４０°の温度まで徐々に加温して前記の界面活性剤相を分離させ、遠心分離により前記の界面活性剤相を前記の水相および固体相から分離することを特徴とする請求項２１に記載の製造法。請求項２３．Ｂｏｒｒｅｌｉａリボタンパク以外のタンパクを吸着し、Ｂｏｒｒｅｌｉａリボタンパクを通過液から回収できるような条件下で前記の界面活性剤相をクロマトグラフィーカラムに接触させることにより前記の界面活性剤相の前記の精製を行なうことを特徴とする請求項２２に記載の製造法。請求項２４．さらに前記のカラムを緩衝液と接触させて、前記のカラムからＢｏｒｒｅｌｉａリボタンパクを溶出させ、一方その他のタンパクは前記のカラムに保持させ、前記の溶出液を採集することを特徴とする請求項２３に記載の製造法。請求項２５．前記の宿主生物の溶融を宿主生物の凍結および解凍により行なうことを特徴とする請求項１９に記載の製造法。請求項２６．前記の宿主生物がＥ．ｃｏｌｉの１株であることを特徴とする請求項２５に記載の製造法。請求項２７．前記のプラスミッドがブラスミッドｐＯＡ１、ｐＯＡ５、ｐＯＡ７、ｐＯＡ８、ｐＯＡ９またはｐＯＡ１０であることを特徴とする請求項２６に記載の製造法。請求項２８．免疫学的有効量の請求項１に記載のタンパクからなり、Ｂｏｒｒｅｌｉａスピロヘータの感染に有効なワクチン。請求項２９．免疫学的有効量の請求項１に記載のタンパクからなり、ライム病の感染に有効なワクチン。請求項３０．免疫学的有効量の請求項１に記載のタンパクからなり、Ｂｏｒｒｅｌｉａスピロヘータによる宿主の感染に対する抗体の検出に使用される免疫診断試薬。請求項３１．免疫学的有効量の請求項２に記載のタンパクからなり、ライム病による宿主の感染に対する抗体の検出に使用される免疫診断試薬。請求項３２．免疫学的有効量の請求項１に記載のタンパクを宿主に投与することからなる、宿主哺乳類にＢｏｒｒｅｌｉａスピロヘータに対する免疫を賦与する方法。請求項３３．前記のＢｏｒｒｅｌｉａスピロヘータがライム病の病原であり、前記のタンパクが請求項２に記載のタンパクであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。請求項３４．前記の宿主哺乳類が人間であり、前記のタンパクを免疫原性増強アジュバントの存在下で投与することからなる請求項３３に記載の方法。