JPH06511154A - 組換えBorreliaタンパクの製造法 - Google Patents
組換えBorreliaタンパクの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
組換えBorreliaタンパクの製造法技術分野
本発明は、組換えBorreliaリポタンパクの製造法、特にライム病の病原
であるスピロヘータの旦orrelia b土L1土ユエエヱエユの外表タンパ
クA(OspA)の製造法に関する。
関連出願
本出願は、米国特許出願第779,048号の継続出願である米国特許出願第8
88,765号の継続出願である。
背景技術
ライム病は、マダニにより媒介されるスピロヘータBorrelia bur
dorferiによる動物病原性感染症である。このスピロヘータに感染した宿
主は、皮膚、関節、神経その他に重度な病理学的症状を示す。ライム病は、最近
特に北米および世界の各地で深刻な疫学的問題となっている。
この病気に有効なワクチンおよび病原スピロヘータに対する抗体の検出に有効な
免疫診断試薬の開発が試みられている。主要な外表タンパク0spAが注目され
、その抗体は病原スピロヘータの攻撃からマウスを保護することが実証されてい
る(参照文献1,2;参照文献の一覧表は開示の最後に示す)。
出液を精製することによって、Borreliaの可溶性リポタンパクを精製、
単離する試みが行われてきた。しかし、Borreliaの培養およびその後の
粗細胞抽出液からのタンパクの精製は、きわめて煩雑であり、膨大な経費を要し
た。
精製タンパクを多量に製造できる可能性があることから、0spAおよびその誘
導体を製造するために遺伝子組換え技術が提案されている。これらの技術は、E
、coli等の適当な宿主/ベクター表現系中に旦orrelia遺伝子を表現
させるものである。
PTC特許出願番号W0 90104411には、B。
burgdorferiニューヨーク株B51(ATCC35210)のOs
p Aタンパクをコード化し、ospA遺伝子を含むDNAフラグメントが記載
されている。このPTC出願には、完全長野生型Os p Aをコードする。s
pA遺伝子のヌクレオチド配列がそのアミノ酸配列とともに記載されている。
Dunnらは、可溶性ではあるが、野生型B、burgdorferiの0sp
A抗体に対して特異的反応性を保持している修飾型0spAタンパクの製造につ
いて記載している(参照文献3)。この論文には、2種類のプラスミツドとDE
T9−O8pAおよびpET9−pr eo s oAが記載されているが、前
者は組換え裁断Os p Aをコード化するしたポリメラーゼ連鎖反応(PCR
)増幅DNA配列を含み、後者は完全長野生型Os p Aを=−ド化するPC
R増幅DNA配列を含んでいる。両配列とも、バクテリオファージT7φ10プ
ロモーターから表現される。
完全長遺伝子の一次翻訳産物は疎水性のN−末端リーダー配列を含み、これが隣
接するシスティン残基のスルフヒドリル側鎖に脂質部分が結合する場合の基質と
なる。この結合についで、シグナルペプチダーゼHによる解裂および脂質部分の
新しいN−ターミナルへの結合が起こる。一方、裁断遺伝子がら翻訳されたタン
パクは脂質化されず、水溶液中に溶解している。0の表現に関連するいくつかの
問題を解決するといわれている。すなわち、タンパクは表現の過程で宿主外側細
胞膜に結合するために溶解性が低下し、タンパクの分離に界面活性剤を使用さざ
るを得す、精製が困難となる。
コントロール下でT7RNAポリメラーゼ遺伝子のクロモシーム複写と低レベル
のT7リソソームを生産するpACYC184起因プラスミツドpLysSを含
む宿主株)にプラスミツドが挿入されている。誘導しても、プラスミツドpET
9 preospAはプラスミツドp E T 9− Os pAに比較して誘
導タンパクの生成量が少ないことが知られている。後者は界面活性剤が存在しな
くても溶解し、前者は可溶化に界面活性剤のTriton X−100を必要と
することが知られている。Dunnらの報告には、界面活性剤により可溶化した
0spAタンパクのその後の精製、単離については記載されていない。
組換え完全長Os p Aの生産能が可溶性裁断0spAに比較して低く、完全
長タンパクの回収には界面活性剤を使用せざるを得ない(リポタンパクを界面活
性剤で処理すると、反応性が損なわれる場合が多い)に全く同じ方法でペプチド
のN−末端に共有結合している脂質(参照文献7)に上りBリン3球細胞(参照
文献4.5)と細胞毒性を有するTリン8球細胞(参照文献6)の両方が刺激さ
れることにより裁断タンパクに比較して免疫反応性が高いと考えられているため
、組換え野生型タンパクは望ましいと考えられている。
0spAをマウスに免疫投与することによって、スピロヘータ感染に対する長期
の防護免疫が得られている(参照文献1.8)。この試験で使用されている抗原
は、Os p Aのアミノ酸末端にグルタチオン−5−−トランスフェラーゼの
大きなドメインを含む溶融タンパクである。この溶融タンパクは翻訳後の脂質結
ts合の基質になるとは考えられない。この試験で、この抗原の防護反応誘導能
は、フロイントの完全アジュバントおよびその後のフロイントの不完全アジュバ
ント9)で抗原を投与したことによるものであると考えられる。この従来の研究
については、PCTWO92100055も参照のこと。
ここで明かなように、完全長ospA遺伝子により=−ド化された組換えタンパ
クはアジュバントの非存在下またはアルム吸着の形態で、結合脂質を欠く類似の
組換えOs p Aタンパクではみられないような免疫原性を発揮することが、
今回認められた。本発明は、大きなタンパク抗原の免疫原性が細菌リポタンパク
の表現により増大することをはじめて開示するものである。
発明の要約
高度に精製された免疫学的に有効な組換えタンパクおよび相当する遺伝子でコー
ド化されたその他の完全長+1orreliaリポタンパクの新規で、簡単で、
かつ効果的な製造法を提供することである。この組換えタンパクは、天然タンパ
クと同等の免疫原性を示す。
本発明は、特定の界面活性剤を使用して、組換えリポタンパクをその他の細胞成
分から選択的に分離する方法を用いる。本発明のこの手順は、従来の技術では解
決できなかった完全長Os p Aの製造にかかわる問題を解決すると同時に、
免疫原性の高い製品を提供するものである。
プラスミツドにより形質転換させた宿主生物から遺伝T工学的に形成させた高度
に精製され、免疫学的に有効な組換えタンパクを最初に提供するものである。本
発明の第2の目的は、このような新規なタンノ(りである。また、本発明はこの
ような形質転換に有用ないくつかの新規プラスミツドも提供する。
れたタンパクからなるワクチンは、本発明の目的を構成する。
さらに、本発明の目的は、免疫学的有効量のタン/くすることである。
る宿主における抗体を検出し、感染の有無を診断するための免疫診断試薬として
使用することができる。
−ド化され、精製され、免疫学的に有効な組換えタンパクを製造した。また、特
定の遺伝子とはほとんどの場合ヌクレオチドの配列がいくつかの核酸で異なり、
実際の831、ACAIおよびIp90株のosoA遺伝子によって生産される
ものとはほとんどの場合いくつかのアミノ酸で異なる遺伝子生産物が得られる完
全長08pA遺伝子も存在する。このような遺伝子および遺伝子生産物は、ここ
ではBa1.ACAIおよびE D90株の一族とみなした。
図面の簡単な説明
T9a表現ベクター中にクローニングする場合に用いたPCRオリゴヌクレオチ
ドを示す。
図2は、Ba1遺伝子からpOAlを形成させ、ACAI遺伝子からpOA9を
形成させ、Ip90遺伝子からpOA I Oを形成させるために、完全長os
pA遺伝子をp E T 9 a表現ベクター中に挿入し、0SpA遺伝子を7
7dlOプロモーターの=ントロール下に置くためのクローニング手順を示す。
図3は、プラスミツドpOA1の予想制限マツプを示す。
図4は、全ての千!1位(M!¥−カー(HasIIIで消化した。l、X+7
4のDNA);B−BamHl;E=Eco RIiH−Hind III;N
=Nde I)の存在を実証しているプラスミツドpOAIの各種制限消化の結
果を示す。
図5は、旦、burgdorferiのBa1、 ACALおよびID90の完
全長08DA遺伝子をDcMBI表現ベクター中にクローニングする場合に使用
しj’−PCRヌクレオチドを示す。
図6は、Ba ill伝子からp05を形成させ、ACAI遺伝子からpOA7
を形成させ、Ip90遺伝子からp OA 8を形成させるために、完全長os
pA遺遺伝子をT r cプロモーターのコントロール下に置くためのクローニ
ング手順を示す。
図7A、7Bおよび7Cは、o OA 1を含む2種類の宿主(図7A)および
pOA5 (図7B)およびpOA6 (図7G)を含む1種類の宿主における
O s pAのITPGによる誘導時間経過を示す。
図8A、8Bおよび8Cは、本発明の実施例にしたがってE、coliから組換
え完全長0spAの製造および精製に使用したそれぞれ細胞培養およびその溶融
、界面活性剤による抽出ならびに精製工程を示すフローチャートである。
図9は、各種界面活性剤CDeo÷デオキシー−ル酸ナトリウム+ E tn
p ”エンピゲン;5nrc=ラウリルサルコシンナトリウム;5DS−ドデシ
ル硫酸ナトリウム;TX114=TritonX−114)による完全細胞溶融
液中へのタンパク溶出を示す、ただし、レーンのM = v−カー(Bio−R
ad製低分子量標準物質);W−全溶融液;S=溶解性画分;P=ペレット;A
=水溶性画分;D=m界面活性剤。
図10は、抗0spAモノクロナール抗体H5332によるウェスターンプロッ
トである。ここで、界面活性剤相の31にダルトンの物質は0spA、Wh−全
細胞溶融液、Ag=Triton X−114抽出後の水相、Dt=界面活性剤
相、Bx=TritonX−114で再度抽出した水相、PI=不溶性ペレット
。
図11は、Os p Aリポタンパクを表現するpOAlまたは0spA非リポ
タンパクを表現するpOA2を含む細1&***最盛期まで培養し、I T P
G T o OAlを2時間、DOA2を4時間誘導したりボタンバクおよび非
リポタンパクをTr i t on X−1+ 4で相分配したpOAIおよび
DOA2を示す。遠心分離後、細胞を再度懸濁させ、凍結/融解によって溶融し
た6 Tri+on X 114を添加し、37℃に加温して相分配を行った。
各両分から等量を採り、4〜20%のSDS−Pageゲル上で電気泳動を行っ
た。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。
両分は、表示したようにo OA 1およびoOA2とも分子量マーカー(M)
、全溶融液(W)、水相(A)、界面活性剤相〔1〕)、および不溶性ペレット
である。
図12A、+213および12Cは、pOAl(図12A)、oOA9およびp
OAIo(図12B)ならびにpOA5、pOA7およびpOA8(図12G)
から製造した05DAリポタンパクの精製法を示す。
ここでは、各両分の一部を採り、4〜20%のSDS−Pageゲル上で電気泳
動を行い、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。図12Aのレーン1
は低分子量マーカー、レーン2は全溶融液、レーン3は界面活性剤相、レーン4
はDEAEセファロース、レーン5はS−セファロース溶出液である。図128
のP=あらかじめ染色した低分子量マーカー(106kDa、80kDa、49
.5kDa、32.5kDa、27.5kDa、18.5kDa)、CL=全細
胞溶融液、D=Triton X=114界面活性剤相、D e = D E
A Eセファロース通過画分、S−セファロースpH5,7溶出液(精製Os
p A −2)である。図12CのP−あらかじめ染色1−だ低分子量マーカー
(106k D a、80kDa、49.5kDa、32.5kDa、27.5
kDa、18.5kDa)、0=S−セファロースで精製したpOA1由来B
310spA−L(図12A)、CL=全細胞溶融液、D=T r i t o
n X= + 14界面活性剤相、De=DEAEセファロース通過画分である
。
図13は、精製完全長Os p Aの免疫原性をB o rrelia bur
gdorferiのタンノ(りの免疫原性を比較する試験に用いた3種類の試験
ワクチンの銀染色ゲルである(M=ママ−−:OA−精製組換えOs pA ;
E =旦、burgdorferiの画分E;SA=仔牛血清アルブミン)。
図14は、精製完全長Os pAおよび図13に示したI3.burgdorf
eri画分10ugをあらかじめ注射した後4週間追加免疫を行ったマウスのI
gG血清価を示す。IgG血清価は、第1抗体としてマウス血清、第2抗体とし
てアルカリホスファターゼに共役させたヤギの抗マウスIgG、精製Os p
A I OOμgを含む固相を用い、EL I SA法で測定した。
図15A〜151には、リポタンパクに対するマウスの用量反応を示すグラフで
ある。図15Aは、非吸着リポタンパクに対するC 3 H/ He系マウスの
用量反応を示す。図15Bは、非吸着リポタンパクに対するB A L B /
e系マウスの用量反応を示す。図15Cは、アルム吸着リポタンパクに対する
C 3 H/ He系マウスの用量反応を示す。図+5Dは、非吸着リポタンパ
クに対するC H3/ He系マウスの用量反応を示す。
図15Bは、非脂質化タンパクに対するC H3/ He系マウスの用量反応を
示す。マウスは、0週日に表示量のタンパク(特記しない限りPBSに懸濁)を
免疫投与し、3週時に同じワクチンで追加免疫を行った。
4週時の血清IgG価は抗原として0spAリポタンパクを用い、ELrSA法
で測定した。
図16はりボタンバクおよび非リポタンパクの抗原性を示すグラフである。
図17は、DCMBIおよびpCMB2プラスミツドの生産を示す。
プラスミツドを含むospA遺伝子の識別名 の系統
p OA I B 31 pE T 9 aDOA2マ B31 pET9a
DOA5 B31 DCMBI
DOA6 B31 DCMB2
oOA7 ACAI DCMBI
pOA 8 1 p 90 D CM B Io OA 9 A CA 1 p
E T 90 apOA 10 1 o 90 p E T 90 a発明に
ついての記述
B、burgdorferiB31株のクローン化ospA遺伝子(前記のWO
90104411を参照)(N−末端領域、配列識別番号l;C−末端領域:配
列識別番号2;その他の配列はWO90104411と同じ)を鋳型(pTRH
44) として使用し、図1に示したように、ポリメラーゼ連鎖反応において野
生型ospA遺伝子全体を増幅するために、特別に設計したオリゴヌクレオチド
プライマー(PET−IN[CO1] (配列識別番号3)およびPET−2
73C[CO3] (配列識別番号4)を使用した。
同様に、それぞれN−およびC−末端におけるオリゴヌクレオチド プライマ一
対(a)OspN2(配列識別番号7)およびBZI (配列識別番号8)なら
びに(b)Osc+N2(配列識別番号7)およびDK4(配列識別番号9)と
のPCR反応には、B、burgdorferiのACA IおよびIp90株
のクローン化ospA遺伝子(参照文献10参照; ACAlおよびI p90
のN−末端領域;配列識別番号l:ACAI(7)C−末端領域:配列識別番号
5;Ip90のC−末端領域:配列識別番号6)を用い、図1に示すように適当
な増幅フラグメントを形成させた。
一般に、オリゴヌクレオチド プライマーを用いた標的核酸の基本的増幅法は従
来知られており、米国特許第4.683,202号および第4. 800. 1
59号に記載されているので、使用すべき技術の記載は省略する。
得られたフラグメントをプラスミツドベクターDET9のNde+および13a
mH1部位にクローン化し、図2に示すように、T7プロモーターのコントロー
ル下のospA遺伝子およびバクテリオファージT7からの効果的な翻訳開始シ
グナルを導入した。pET9およびpLysSプラスミツド、コローン化のため
の宿主細菌、T7 RNAポリメラーゼによるクローン化遺伝子の表現に使用す
る培地および方法は、すでに米国特許第4,952.496号に記載されている
ので、ここでは詳細な記載は省略する。T7プロモーター系は本発明における好
ましい表現系ではあるが、完全長ospA遺伝子の表現は、以下に記載するよう
に、宿主生物と相客性のあるその他の表現系を用いても達成することができる。
DET9はその選択的マーカーとしてbla遺伝子よりもむしろkan遺伝子を
持っているので、これを使用した。したがって、細胞培養にアンピシリンを使用
する必要がなかったので、免疫性を有するアンピシリールと0spA標的タンパ
クの共役結合が形成される可能性がない。このような共役結合は、ペニシリンア
レルギーにおける主要な抗原決定基であると考えられ、免疫学的試験を複雑にす
る。
得られたプラスミツドはB、burgdorferlのBa1.ACAlおよび
I E)90株からのospA遺伝子を含み、それぞれpOAl、pOA9およ
びpOA 10と表示した。pOA1プラスミツドは、Dunnら(前出)によ
って記載されているpET9−p r e Os p Aプラスミツドとほとん
ど同じであるが、両者はPCR反応に用いたオリゴヌクレオチドが異なる。プラ
スミツドDOA 1の予想制限マツプを図3に示した。その各種制限消化の結果
は図4から明がなように、全ての予想部位が存在していることを示している。
タンパクを生産させるため、プラスミツドpOA I、p OA 9およびDO
AIOはE、coliまたはその他の適当な宿主生物の表現株に形質転換させた
。E。
coli株は、前記の米国特許第4,952,496号に記載されているように
、E、coliのT7表現株が好ましい。特に、当該菌株としては、前記のよう
にE、coliのBL21 (DE3)(pLysS)表現株であってもよいし
、E、Co11の0MS174 (DE3)(pLyss)株であってもよい。
形質転換した宿主を培養し、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(I P
TG)でタンパクを誘導した。 ■PTG添加後のpOA 1プラスミツドから
のOs p Aの誘導時間を図7Aに示す。pOA9およびpOAloを用いた
場合にも、c+OAIの場合と同様な結果が得られた。DOAIプラスミツドか
らのOs p Aタンパクの合成は誘導倹約1時間で停止し、E、coliに対
しである程度タンパクの毒性があることを示している。それにもかかわらず、タ
ンパクの生産は培地あたり約10 m g / Lであり、許容レベルにあった
。
プラスミツドpOA1.pOA9およびpOA 10、ならびにT7プロモータ
ーを用いたE、coliにおける0spAリポタンパクの表現のほかに、異なっ
たプロモーター下で完全長B31.ACAIおよびIp90 0SDA遺伝子を
含むプラスミツドを構成し、リポタンパクを表現させた。これに関し、Ba1か
らのospAのPCR増幅フラグメントをプラスミツド表現ベクターpcMnt
およびp CM B 2のNcolおよびBamH1部位にクローニングしてプ
ラスミツドDOA5およびpOA6を調製し、一方プラスミツドDOA7および
poAaはACA 1株(pOA7)および1p90株(pOA8)からのos
pAのpcR増幅フラグメントを表現ベクターpCMBIのNcofおよびBa
mHI部位にクローニングして調製した(pOA5、pOA7およびpOA8に
ついては図6を参照)。
図5から明かなように、B、burgdorferiのBa1、ACAlおよび
I C90株のクローン化08OA遺伝子は、オリゴヌクレオチドプライマ一対
(a)PX3 (配列識別番号to)およびC03(配列識別番号3)、 (b
)PX3 (配列識別番号10)およびBZI (配列識別番号8)および(c
)PX3(配列識別番号10)およびPX4 (配列識別番号9)を用いたPC
R反応によって、それぞれ相当する遺伝子のN−末端およびC−末端で増幅され
、相当する増幅フラグメントを形成した。
プラスミツドDCMBIおよびpCMB2は、プラスミツドpTrc99a (
Pharmaciaカタログ番号27−5007−01)およびカナマイシン抵
抗性遺伝子(Pharmaciaカタログ番号27−4897−01)を消化し
、遺伝子浄化法によってフラグメントを分離し、フラグメントを相互に結紮する
ことにより構成した(図17)。プラスミツドp T rc99a (4197
bp)は多重コローニング部位に隣接して強いプロモーターを有し、その隣には
強い転写集結シグナル(rrnB)を有する。標的形質の表現には宿り細胞のR
NAポリメラーゼを使用するので、広い範囲のE、coli株に使用することが
できる。
表現は、ベクターに含まれるラクトースサプレッサー遺伝子(lac[g)によ
って制御される。ラクトースレプレッサータンパクは、インデューサー[PTG
の非存在Fでは標的遺伝fの転写を阻害する。カナマイシン抵抗性遺伝子は、制
限酵素部位により側面を保護されたトランスポゾンTn903がらの遺伝子を含
む直線状の2本鎖DNAフラグメント(12a2bp)であり、カナマイシンお
よびネオマイシンに対する抵抗性に関して連合作用を有するアミノグリコシド3
゛−ホスフォトランスフェラーゼ酵素をコード化する。
DCMBI (5,5kb)は、その転写がTrcプロモーターに由来するもの
と同じ方向にあるように定位したカナマイシン抵抗性遺伝子を含み、一方DCM
B2は反対方向に定位したカナマイシン抵抗性遺伝子を含んでいるため、抵抗性
遺伝子およびT ’r cプロモーターのコントロール下にある特定の遺伝子の
転写により幅輪転写が得られる。3ma 1. Hi nd T I Iおよび
Bam1ll+Ncolによりo CM B Iおよびp CM B 2を制限
酵素消化すると、予想したと全く同じ大きさのフラグメントが得られた。
プラスミツドpOA5およびoOA6をE、co+1またはその他の適当な生物
、好ましくはD H5αフンボーネント細胞の表現株に形質転換させた。形質転
換した宿主を培養し、[PTGでタンパクを誘導した。
o OA 5による誘導時間経過(図7B)はDOA 1(図7A)と同様であ
ったが、DOA6により生産されたO s p Aのレヘルは数倍も低がった(
図70)。
oOA 7およびDOA8を用いた場合にも、p OA 5と同様な結果が得ら
れた。
組換え完全長Os p Aの製造および精製工程を図8Aおよび8Cに模式的に
示す。工程の特異的条件は、後に述べる実施例で規定したが、以下に要約する。
細胞の培養およびタンパクの誘導(図8A)についで、細胞を凍結、解凍により
溶融させた。溶融液中に存在するその他の細菌タンパクよりも0spAタンパク
を選択的に可溶化させる界面活性剤で溶融液を処理する。各種の界面活性剤を用
いて一連の実験を行い、Os pAタンパクに対していずれの界面活性剤の選択
性が高いか検討した。試験した界面活性剤のうちTriton X−114は3
1にダルトンのタンパクを選択的に可溶化させ(図9)、このタンパクは免疫プ
ロッティングによりOs p Aであることを確認した(図10)。
本発明は、Triton X−114の使用に限るものではなく、Os p A
に対して同様な選択的溶解性を示すとともに、以下に述べるように穏和な条件下
で相分離性を有するものであれば別の材料であってもかまわない。
選択的界面活性剤の添加についで、約35℃〜40℃まで徐々に温度を上げて混
合物を加温する。 この間に相分離が起こり、溶液が混濁する。本発明の精製手
順では、タンパクの変性または免疫学的性質の損傷を避けるため、この相分離は
穏和な条件下で行う。 (例えば、Dunnらが記載しているTritonX−
100(参照文献3)を界面活性剤として使用すると、0spAタンパクの選択
的分離には有効であるが、相分離を起こさせるためには約60〜65℃に加温す
る必要があり、製品の利用に関してはきわめて不利である)。
混濁した混合物を遠心分離すると、混合物は3相、すなわち50%またはそれ以
上の0spAタンパクと少量(約5重量%)の細菌タンパクを含む界面活性開用
、残りのJllIl菌タンパクを含む水相と細胞残渣の固形ペレットに分かれる
。界面活性開用を水相および固形ペレットから分離する。
0spAに選択的な界面活性剤による処理およびその後の界面活性開用の相分離
の工程で、IIa閑タンパクからOs p Aをほぼ完全に分離することができ
る(図12)。最後の精製工程により、界面活性開用に存在する*Sタンパクか
らOs p Aを分離する。
最後のタンパク精製は、S+@タンパクを選択的に吸着し、05DAは吸着しな
いクロマトグラフィーカラム、特にDEAE−セファセル、DEAE−セファロ
ースまたはその地回等のクロマトグラフィー用材料を用いて行う。界面活性開用
なカラムに載せ、精製されたO s p Aタンパクの全てを含む通過液を集め
る。吸着画分は、界面活性開用に含まれていたmmタンパクの全てを含む。S−
セファロースまたは相当するクロマトグラフィー用カラムを用いてさらに精製す
ると、混在するタンパクのみならず、リムラス細胞分解物(LAL)試験でパイ
ロジエン性が認められなかったことから、リボ多糖類(LPS)も含有量がかな
り低い通過液が得られる。高度に精製された0spA溶液は凍結乾燥するか、さ
もなくば加工する。
上記の手順は、特に高度に精製された組換えOs pAタンパクに製造について
述べたが、この手順および技術は、適当な遺伝子の適切なりローニング、当該遺
伝子を含む適切なプラスミツドベクターの構成、当該プラスミツドベクターによ
る適切な宿主の形質転換ならびにリポタンパクの製造および精製によって、また
選択的界面活性剤を適切に選択することによって、その他の高度に精製された組
換えBorreliaリポタンパクの製造にも容易に適用することができる。
実施例
実施例1
上記のように調製したプラスミツドDOA 1を用いて、 E、coli のB
L21 (DE3) (pLyss)(pOA +)株およびIIMS 174
(DE3)CoLyss)(pOAI)株の形質転換を行った。形質転換E、
coliを、本格培養培地IL当り12m1の前培養液が得られるように、硫酸
カナマイシン25μg / m I、クロラムフェニコール25μg / m
lを含むLD培地に接種した。約37℃で1夜振とうして前培養した。
翌朝、1夜培養した培地10m1を、硫酸カナマイシン25μg / m Iを
含むLB培地ILに接種し、0D=0. 6 (01)=1. 5まで培養して
もよい)に成るまで約37℃で約3時聞損とう培養した。インプロピルチオガラ
クトシド(I PTG)を最終濃度が0゜5mMになるように培地に添加し、さ
らに37℃で2時間培養した。培養終了後、培地を約4℃まで冷却し、1000
0 xgで10分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを10倍量のPB
Sに懸濁させた。
細胞懸濁液を液体窒素中で凍結した。この凍結細胞は、必要であれば、−70℃
で無期限に保存することができる。
細胞懸濁液の凍結についで、室温(約20〜25℃)で細胞を解凍した。この過
程で、細胞溶融が起こる。
解凍した細胞懸濁液に、濃度がlμg / m IとなるようにDNase I
を添加し、室温で30分間インキュベーションした。この間に溶液の粘性が低下
する。
インキュベーション終了後、細胞懸濁液を氷上で10℃以下まで冷却し、Tri
ton X−114の10重量%原液を最終濃度が0.3〜1重量%となるよう
に添加した。この混合物を氷上に20分間保った。
冷却した混合物を、つぎに約37℃まで加温□し、その温度に10分間保った。
相分離が起こるにつれ、液は混濁する。この混濁液を、約20℃、12.ooo
Xgで10分間遠心分離すると、界面活性開用の低層、その上の透明な水相、
および固形のベレットに分かれる。ペレットを乱さないように、界面活性開用を
その他の相から分取し、4℃に冷却した。緩衝液A、すなわち50mMTris
(pH7,5)、2mMEDTAおよび10mMNac+を冷却した界面活性開
用に添加し、もとの容量の1/3量とした。得らえた溶液は、凍結し、保存した
後、以下に記載するように加工してもよいし、直ちにそのような加工を行っても
よい。
界面活性開用10m1あたり1mlのDEAE−セファロースCL−6Bカラム
を用意し、2倍量の緩衝液C1すなわち50mMのTr i s (DH7,5
)、2mMのEDTA、IM NaC1,0,3重量%のTriton X−1
00で洗い、さらに緩衝液B1 すなわち50mMのTr i s (pH7,
5)、2mMのEDTA、0.3tlL%のTriLon X−100で洗った
。
つぎに界面活性開用をカラムに載せ、Os o Aを含む通過液を集めた。さら
に等量の緩衝液Bでカラムを洗い、この通過液も集めた。精製されたO s p
Aを含む通過液を一緒にし、凍結保存する。
カラムは2倍量の緩衝液Cで溶出することによって、細菌のタンパクを除去し、
再使用することができる。
さらにDEAE−セファロースカラムからの通過液は、S−セファロースクロマ
トグラフィーにより最後の精製を行なった。まず、DEAE−セファロースカラ
ム通過液を0.1Mのクエン酸でI)H4,2とした。
S−セファロースカラムは緩衝液Cで繰り返し洗った後、クエン酸でpHを4.
2とした。
緩衝液Cを用いて、高度に精製されたO S OAを溶出した。溶出液のp 1
1はクエン酸のため、5.7であった。直ちに2MのTris塩基でpH7,6
に調整した。
両クロマトグラフィー手順で得られた高度に精製された0spAの水溶液をコマ
シー染色ゲルで分析した(図12A)、高度に精製された0soAが含まれてい
ることを確認した。後者のクロマトグラフィー手順で得られた製品の純度は、前
者のクロマトグラフィー手順により得られたものに比較して高く、エンドトキシ
ンのレベルはきわめて低いことが確認された。
実施例2
実施例1の手順を繰り返した。ただし、Trit。
nX−114のみならずその他の界面活性剤も使用して界面活性開用を得た。得
られた結果を図9に示す。
図9から明らかなように、そのままカラムクロマトグラフィーで精製できるほど
の0spAを選択的に可溶化したのは、使用した界面活性剤のうちTr i t
onX−114のみであった。
実施例3
プラスミツドpOA 5およびDOA6を前記のように調製し、E、coli
DH5α株の形質転換に用いた、実施例1と同じ手順を用いてタンパクを表現さ
せた。DOA5によるO S pAリポタンパクの経時的表現は、o OA l
で認められたものと同じであった。
一方、pOA6による0spAの表現はpOA5に比較して数倍も低いことが認
められた(図7Bおよび7C)。0spAタンパクの精製は、pOA 5で表現
させた細胞のみについて行なった。
このようにしてTrc表現系により生産されたB31 0spAリポタンパクを
、実施例1と同じ手順で精製した。ただし、収穫した細胞ベレットには0. 1
m g / m +のりゾチームを添加し、細胞を凍結する前に、室温で30分
間懸濁させた。
DEAR−セファロースカラムの通AT&には、高度に精製されたO s p
Aリポタンパクが含まれていた(図9G)。
実施例4
B、burgdorferiのアジア株(Ip90)(ATCC)のクローン化
した。soA遺伝子を月い、前記と同様な手順でプラスミツドDOAI(oET
プロモーター)およびpOA5 (TRCプロモーター)を調製し、当該遺伝子
を含むプラスミツドpOA8(Trcプロモーター)およびo OA 10(p
ETプロモーター)を形成させた。これらのプラスミツドについて制限消化を行
なったところ、予想部位が全て存在している二とが認められた。
また〜 旦、burgdorferiのヨーt2ツバ株spA遺伝子を囲い、当
該遺伝子を含むプラスミツドETプロモーター)を形成させた。これらのプラス
ミツドについて制限消化を行なったところ、予想部位が全て存在していることが
認められた。
DOAS株(実施例3)と全く同じ手順でpOA7およびpOA8表現株の培養
および誘導を行なった。
一方、DOA9およびpOA10表現株の培養および誘導は、pOA1株(実施
例1)と同様に行なった。
これらの操作で得られたACA IおよびI p90の0spAリポタンパクは
、実施例1に記載したB51(p OA l )の0soAリポタンパクと同じ
手順で精製した。DEAE−セファロースカラム通過液は、高度に精製されたO
s p Aリポタンパクな含んでいた(図12B、12C)。
実施例5
実施例1に記載した手順にしたがってE、coliから精製した完全長組換えO
s p Aのマウスに対する免疫原性を、Os p Aの含有量の高いB、bu
rgdorferi画分E(前記のPCT No、WO90104411に記載
されているように調製した)および仔牛血清アルブミンと比較した。C3f(/
He系マウスに、アジュバントを含まないワクチンをそれぞれ10μg注射し
た。最初の注射から4週間後に、最初に注射したものと同じ抗原をブースター注
射した。
直情価は、精製した組換え0spAリポタンパクを用いてEL I SA法で測
定した(図14)。
図から明らかなように、両抗原はきわめてよく似た反応、すなわち弱いが検出可
能な一次血清IgG反応を示し、追加抗原刺激後血清価は100倍増加した。
両免疫原とも、血清1gG価は少なくとも6週間安定であった。いずれの場合も
、顕著な血清1gM反応は認められなかった。
性を有することを示している。
M換えOsc+Aリポタンパクの免疫学的信頼性は、次表から明らかなように、
組換えリボタンノ(りで免疫を与えたマウスの血清がin vitroで旦・
burgdorferi [331スピロヘータの生育を完全に阻害することか
らも実証される。
表1からも明らかなように、血清の阻害活性はマウスに投与したりボタンバクの
用量に比例し、ELISA法による抗0spA IgG検定の結果とよく一致し
た。検出できるほどの抗0spA抗体を含まなし\0spA非リポタンパクを免
疫投与したマウスの血清では、スピロヘータの生育に対する影響が認められなか
った。
2.5μgの0spAリポタンパクをPBSで免疫投与したマウスで得られた生
育阻害価は、B、burgdorferiの全タンパク20μgをフロイントの
完全アジュバントで免疫投与した後全タンパクをPBSで追加免疫投与したマウ
スで得られた結果と同等か、それ以上であった。組換えOs o Aリポタンパ
クがスピロヘータの生育を阻害するほどの血清反応を起こす能力を持っているこ
とは、E、coliにおける表現およびその後の精製過程で、タンパク上の重要
な防護エピトープが保存されることを実証するものである。
実施例6
前記のプラスミツドDOA+と同様にプラスミツドo OA 2を調製した。た
だし、PCR反応では、リポタンパクのシグナルペプチドを欠く裁断ospA遺
伝子を増幅させるため、C−末端プライマーPET−273Cとともに、以下の
配列を有するプライマーPET−18N(配列識別番号11)を使用した。
5’CAT CAT ATG GCT AAG CAA AAT GTT AG
C3’
PET−18Nの下線で表示した部分は、Os pA這伝子のコーディングスト
ランドの51〜67ヌクレオチドと同一である。プラスミツドpOA2を用いて
旦。
colif)BL21 (DE3)(pLyss)(p。
A2)およびHMS174 (DE3)(DLYSS)(DOA2)株を形質転
換させ、実施例1に記載したように、形質転換させたE、coliから裁断Os
。
Aタンパクを表現させた。実施例1の細胞溶融および界面活性剤抽出を行なった
ところ、非リポタンパクは期待したように水相に存在することが明らかとなった
。
実施例7
0spAタンパクに脂質が結合した場合の免疫原性に及ぼす影響を検討した。実
施例1に記載したように形成させ、精製したりボタンバク型の0soAまたはD
unnら(参照文献3)により調製された非リポタンパク型Os DAをC3H
/ HeおよびBALB系マウスに免疫投与し、3週間後に追加免疫投与した。
追加免疫投与1〜2週間後に血清を採取し、抗原として精製0soAリポタンパ
クを用い、EL I SA法で検定した。
図15Aおよび15Bは、PBSで投与した0spAリポタンパクがC3H/H
e(図15A)およびBA L B / c系マウス(図15B)のいずれに対
しても、強い、用量に依存した二次1gG反応を誘導することを示している。図
15Cから明らかなように、タンノ(りを水酸化アルミニラにタンパク:アルミ
ニラ比で1:5(重量)の割合で吸着させて投与した場合、免疫原性の増加は、
認められたとしても僅かであった。
0spAリポタンパクでは反応が認められたのに対して、非リポタンパクでは図
15Bに示すように最高用量の2.5μg/マウスでも検出できるほどの抗0s
oA抗体の誘導は認められなかった。アルム吸収非リポタンパクも免疫反応を誘
導するとは思えない。
0spAのリポタンパクと非リポタンパクの推論アミノ酸配列は、アミノ酸末端
残基を除き、同じである。
リポタンパクのアミノ酸末端残基は修飾システィンであり、非リポタンパクのア
ミノ酸末端残基はメチオニン−アラニンである。したがって、前記の免疫原性の
差は脂質部分の存在によることを強く示唆している。
実施例8
実施例7で認められた免疫原性の差が本質的な抗原性の差によるのか、免疫系に
よる2種類のタンパクの識別およびそれに対する反応の差によるのかを明らかに
するため、Os o Aのりボタンバクと非リポタンパクについて、本質的な抗
原性を検討した。
リポタンパクを免疫投与したマウスの血清は11図16に示したように、いずれ
の0spAを試験抗原として用いた場合にも、ELISA法で陽性シグナルを示
した。一方、非リポタンパクを免疫投与したマウスの血清は、いずれの抗原にも
反応しなかった。したがって、両0spAの抗原性には差はなく、リボタン/<
りは免疫系によってよく識別されるのに対して、非リポタンパクは識別されない
。
実施例9
0spAタンパクの起源による免疫原性の差を検討した。それぞれI)OAl、
DOA9およびpOA I Oに由来する精製0spAリポタンパクB31.A
CA1およびIp90をマウスに免疫投与した。0週時に2.5μgのタンパク
を免疫投与し、3週時に同じ用量を追加免疫投与し、4週時にマウスから採血し
た。
抗原として精製Os o AリポタンパクB31.ACAlまたはl990を用
い、ELISA法で4週時の血m T g G価を測定した。力価はヤギの抗マ
ウスIgG二次抗体を用いて測定した。
これらの実験で得られた結果を図15Dに示す。このデータから明らかなように
、試験したいずれの系統の組換えOs pAもマウスに免疫原性を有し、ポリク
ロナール血清は部分的交差反応性を示した。
開示の要約
本開示を要約すると、本発明は宿主からリボタンノ(りを選択的に抽出すること
のできる界面活性剤を用し1、ついで界面活性剤溶液をカラムクロマトグラフィ
ーでェ1リポタンパク遺伝子、特にB、burgdorferiの05DA遺伝
子で=−F化され、高度に精製され、免疫学的に有効な組換えタンパクの新規で
、阜純な製造法を提供する。本発明の範囲内で、改良が可能である。
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0spAリポタンパクおよび非すポタンパク針免疫投与したマウス血清のC3H
/He 0spA O<8
リポタンパク 0.1 32
0.5 256
2.5 1024
0spA 0.1 <8
非リポタンパク 0.5 <8
2.5 <8
BALB/c 0spA O’ <8
リポタンパク 0.1 4
0spA O,1<8
非リポタンパク 0.5 <8
配列の謁1j
1 B31、ACAIおよびIp90株かちの一免且PΔ 1.5のN−末端領
域のコーディングストランド3 オ’)fヌ’yLt+ド プライマーPET−
IN[CO3] 14 オリゴヌクレオチド プライマーPET−273C1,
5[CO3]
5 ACAIからのmのC−末端領域のコーディング 1.5ストランド
7 オリゴヌクレオチド プライマー0spN2 18 オリゴヌクレオチド
プライマーBZI 1.59 オリゴヌクレオチド プライマーPK4 1,5
1Oオリゴヌクレオチド プライマーPK3 511 オリゴヌクレオチド プ
ライマーpET−18N −八〇〇のリスト
(1)^171Je播号lの情報
(i)^J1荊性
(A)長さ 27塩ブタ士
(B)型1w
(C)ストランド:」
(D)形態:直線
(i i)分子型:DNA(ゲノム)
(xi)!gりの説明 配列識別番号IATATATTATG AAAAAAT
ATT TATTGGG(2) itlVIMとii+)8号2(7)tf¥I
a(i)配列特性
(A)長さ、Z7塩鼻1
(B)型:W
(C)ストランド:」
(D)形態:直線
(ii)分子型:DNA(ゲノム)
(xi)酎1りの説明 翫j1迦U帽号2GAGGAATAAA ATTTCG
CAAA AATTAAA(3) icV1m+)8号3m
(i)西Jl塔牲
(A)長さ:26塩基吋
CB)型、PJ
(C)ストランド°」
CD) 形態二屁1靜糺
(i i)分子型:DNA(ゲノム)
(xi)!5りの説明:配ダwI:lJ幡号3GCACATATGA AAAA
ATATTT ATTGGG(4)配4躯III号4の情報
(i)配列時性
(A)長さ°26塩基対
(B)型 鳴
(C)ストランド二二重
(D)形態 直線
(ii)分子型:DNA(ゲノム)
(xi)配列の説明:1713m1播号4CGGGGATCCCTCCTTAT
TTT AAAGCG(5)西J1摺蛎1播号5の情報
(i)翫11荊性
(A)長さ゛31塩基対
(B)型 植
(C)ストランド:」
(D)形態 直線
(i i)分子型 DNA (ゲノム)(xi)断1すの説明 翫表1w31播
号5GAGGAATAAA TAAAGTTTCG CAAAAATTCA A
(6) !!iw3!播号6の情報
(A)長さ゛27塩基対
(B)型:w
(C)ストランド:」
(D)形態゛直線
(ii)分子型:DNA(ゲノム)
(xi)配列の説明°酊万1周四g号6GAGGGATAAA ATTTCGT
AGA AATTCAA(7)iBIJ[t)1号7(7)1m(i)^故1荊
性
(A)長さ 30塩基吋
(B)型:樵
(C)ストランド 」
(D)形態:直線
(ii)分子型:DNA(ゲノム)
(xi)配列の説明、配列識別番号7
GGCCGCACAT ATGAAAAAAT ATTTATTGG(8)西己
夕°すJ錨シg1播号8σ)ヤーX灸(i)配列時性
(A)長さ:28塩」ルナ
(B)型 債
(C)ストランド 二重
(D)形態 直線
(i i)分子型:DNA(ゲノム)
(xi)配列の説明:!!#1m帽号8CGGGGATCCCCTTATTTA
TT TCAAAGCG(9)配4遍別番号9の情報
(i)九11肺
(A)長さ:24塩基対
(B)型:樵
(C)ストランド:」
(D)形態:直線
(ii)分子型:DNA(ゲノム)
(xi)西故りの説明:酊1濡U1播号9CGGGGATCCCTATTTTA
AAG CATC(10)翫W暗11iZIJ番号IOの情報(i)配列時性
(A)長さ=25塩基対
G (B)型 攪
(C)ストランド:」
CD)形態゛直線
(ii)分子型:DNA(ゲノム)
(xi)翫ソリの説明、翫万叩蛎帽号10CGGCCATGGA AAAATA
TTTA TTGGG(11)配列識別番号11の情報
(i)配列時性
(A)長さ°27塩A汐士
(B)型;鳴
(C)ストランド゛」
(D)形態、直線
(ii)分子型:DNA(ゲノム)
(xi)配列の説明:翫ソ唱四幡号11CAGCATATGG ATAAGCA
AAA TGTTAGC−N
V CO
emHI
FIG、2゜
T3図
γφ出
68mHI
FIG、6゜
OS、A僧情稠雀の
承lotヨ
弔13図
E、 coli 0spA Borrelia FracVACCINE
FIG、14−
SERLIM DIL
SERUM DIL
SERUM 0IL
FIGj5C。
FIG、17゜
手続補正書
平成6年6月21日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 請求項1. 完全長の野性型Borreliaリボタンパク遺伝子をコード化し、前記の遺伝 子を含むプラスミッドで形質転換させた宿主生物から組換え形成させた、高度に 精製され、免疫学的に有効なタンパク。 請求項2. 完全長の野性型B.burgdorferiospA遺伝子でコード化された請 求項1に記載のタンパク。 請求項3. 前記のプラスミッドがプラスミッドpOA1であることを特徴とする請求項2に 記載のタンパク。 請求項4. 前記のプラスミッドがプラスミッドpOA5であることを特徴とする請求項2に 記載のタンパク。 請求項5. 前記のプラスミッドがプラスミッドpOA6であることを特徴とする請求項2に 記載のタンパク。 請求項6. 前記のプラスミッドがプラスミッドpOA7であることを特徴とする請求項2に 記載のタンパク。 請求項7. 前記のプラスミッドがプラスミッドpOA8であることを特徴とする請求項2に 記載のタンパク。 請求項8. 前記のプラスミッドがプラスミッドpOA9であることを特徴とする請求項2に 記載のタンパク。 請求埴9. 前記のプラスミッドがプラスミッドpOA10であることを特徴とする請求項2 に記載のタンパク。 請求項10. 前記のospA遺伝子がB.burgdorferiのB31系から単離された 遺伝子であることを特徴とする請求項2に記載のタンパク。 請求項11. 前記のospA遺伝子がB.burgdorferiのIp90系から単離され た遺伝子であることを特徴とする請求項2に記載のタンパク。 請求項12. 前記のospA遺伝子がB.burgdorferiのACA1系から単離され た遺伝子であることを特徴とする請求項2に記載のタンパク。 請求項13. 前記の宿主生物がE.coliであることを特徴とする請求項1に記載のタンパ ク。 請求項14. 前記のプラスミッドがプラスミッドベクタ−pET9からなり、その遺伝子がT 7プロモーターおよびバクテリオファージT7からの効果的な翻訳開始シグナル のコントロール下にあることを特徴とする請求項2に記載のタンパク。 請求項15. 前記の宿主生物がE.coliのT7表現株であることを特徴とする請求項14 に記載のタンパク。 請求項16. 前記の宿主生物がE.coliのBL21(DE3)(pLysS)またはHM S174(DE3)(pしysS)表現株であることを特徴とする請求項15に 記載のタンパク。 請求項17. 前記のプラスミッドがプラスミッドベクタ−pCMB1またはpCMB2からな り、その遺伝子がTrcプロモーターのコントロール下にあることを特徴とする 請求項2に記載のタンパク。 請求項18. 細菌のタンパクおよびリポポリサッカライドをほとんど含まない請求項1に記載 のタンパク。 請求項19. 完全長の野性型Borreliaリボタンパク遺伝子でコード化されたタンパク の製造法であって、前記の遺伝子を含むプラスミッドにより形質転換した宿主生 物からBorreliaリボタンパクを誘導し、 前記の宿主生物の細胞を溶融し、 細菌またはその他のタンパクからBorreliaリボタンパクを選択的に溶解 し、かつ温和な条件下で界面活性剤相の相分離が可能な界面活性剤で溶融細胞を 処理し、 溶解したBorreliaリボタンパクを含む界面活性剤相と、細菌およびその 他のタンパクを含む水相と、細胞残渣を含む固体相に相分離を行い、前記の固体 相および前記の水相から前記の界面活性剤相を回収し、 前記の界面活性剤相からBorreliaリポクンパク以外のタンパクを除去、 精製することからなる製造法。 請求項20. タンパクがB.burgdorferiのospA遺伝子によりコード化されて いるOspAタンパクであることを特徴とする請求項19に記載の製造法。 請求項21. 前記の界面活性剤がTritonX−114であることを特徴とする請求項20 に記載の製造法。 請求項22. 前記の溶融細胞の前記の処理を約0°〜10°の温度で行い、得られた混合物を 約35°〜40°の温度まで徐々に加温して前記の界面活性剤相を分離させ、遠 心分離により前記の界面活性剤相を前記の水相および固体相から分離することを 特徴とする請求項21に記載の製造法。 請求項23. Borreliaリボタンパク以外のタンパクを吸着し、Borreliaリボ タンパクを通過液から回収できるような条件下で前記の界面活性剤相をクロマト グラフィーカラムに接触させることにより前記の界面活性剤相の前記の精製を行 なうことを特徴とする請求項22に記載の製造法。 請求項24. さらに前記のカラムを緩衝液と接触させて、前記のカラムからBorrelia リボタンパクを溶出させ、一方その他のタンパクは前記のカラムに保持させ、前 記の溶出液を採集することを特徴とする請求項23に記載の製造法。 請求項25. 前記の宿主生物の溶融を宿主生物の凍結および解凍により行なうことを特徴とす る請求項19に記載の製造法。 請求項26. 前記の宿主生物がE.coliの1株であることを特徴とする請求項25に記載 の製造法。 請求項27. 前記のプラスミッドがブラスミッドpOA1、pOA5、pOA7、pOA8、 pOA9またはpOA10であることを特徴とする請求項26に記載の製造法。 請求項28. 免疫学的有効量の請求項1に記載のタンパクからなり、Borreliaスピロ ヘータの感染に有効なワクチン。 請求項29. 免疫学的有効量の請求項1に記載のタンパクからなり、ライム病の感染に有効な ワクチン。 請求項30. 免疫学的有効量の請求項1に記載のタンパクからなり、Borreliaスピロ ヘータによる宿主の感染に対する抗体の検出に使用される免疫診断試薬。 請求項31. 免疫学的有効量の請求項2に記載のタンパクからなり、ライム病による宿主の感 染に対する抗体の検出に使用される免疫診断試薬。 請求項32. 免疫学的有効量の請求項1に記載のタンパクを宿主に投与することからなる、宿 主哺乳類にBorreliaスピロヘータに対する免疫を賦与する方法。 請求項33. 前記のBorreliaスピロヘータがライム病の病原であり、前記のタンパク が請求項2に記載のタンパクであることを特徴とする請求項32に記載の方法。 請求項34. 前記の宿主哺乳類が人間であり、前記のタンパクを免疫原性増強アジュバントの 存在下で投与することからなる請求項33に記載の方法。
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