JPH10182688A

JPH10182688A - ヒドロキシアルキルピリジン誘導体

Info

Publication number: JPH10182688A
Application number: JP35790396A
Authority: JP
Inventors: Mutsuhiro Date; 睦廣伊達; Takumi Tanaka; 巧田中
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1996-12-27
Publication date: 1998-07-07
Anticipated expiration: 2016-12-27
Also published as: JP3994461B2

Abstract

(57)【要約】【課題】感度及び安定性に優れたＮ−アセチルグルコサ
ミニダーゼ（以下、ＮＡＧと略記する。）活性測定用基
質として有用なヒドロキシアルキルピリジン誘導体とこ
れを基質として用いたＮＡＧ活性測定方法及びそのため
の試薬の提供。【解決手段】一般式［１］【化１】（式中、Ｇは還元性末端でβ結合している、アミノ基に
アシル基が結合しているヘキソサミン残基を表し、Ｒは
ヒドロキシアルキル基を表す。）で示されるヒドロキシ
アルキルピリジン誘導体、及びそれを用いたＮＡＧ活性
測定方法、並びにそれを含んでなるＮＡＧ活性測定用試
薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以下ＮＡＧと略記す
る。）、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニダー
ゼ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ等の活
性測定用基質として有用な新規なヒドロキシアルキルピ
リジン誘導体及びそれを用いたＮＡＧ活性測定方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】ＮＡＧは、種々の細胞のリソソーム内に
存在する糖質分解酵素の１つであり、特に腎の近位尿細
管上皮細胞に多く含まれ、腎尿細管の障害により尿中へ
放出される事から、尿中のその活性は腎疾患の重要な指
標となっている。尿中ＮＡＧ活性は、急性腎不全、慢性
腎不全、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、更に糖尿病性
腎症や薬剤による腎障害により上昇する事が知られてお
り、これら腎疾患の早期診断指標となる。また、腎移植
後の拒絶反応の早期診断の指標としても、尿中ＮＡＧ活
性は重要な役割を果たしている。即ち、ＮＡＧ活性を測
定することには、臨床的見地から極めて重要な意義があ
る。

【０００３】従来、ＮＡＧ活性測定法として様々な方法
が開発されているが、基本的にはＮＡＧの作用により遊
離する化合物を蛍光検出計、或いは紫外−可視吸光度計
を用いて検出し、これに基づいてＮＡＧ活性を求める方
法が一般に採用されている。現在の臨床検査分野に於け
る測定法は、合成基質を用いた初速度測定法が主流とな
っている。

【０００４】以下に、従来のＮＡＧ活性測定方法の代表
的な例を挙げる。４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応
によって遊離した４−メチルウンベリフェロンの蛍光強
度を測定する方法〔特開平１−２６５８９７号公報〕。ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって
遊離したｐ−ニトロフェノールをアルカリ性にすること
で発色させ、それを比色定量する方法〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｅｍ．，２７，１１８０（１９８１）〕。ソジオ−ｍ−クレゾールスルホフタレイニル−Ｎ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧ
による酵素反応によって遊離したｍ−クレゾールスルホ
フタレインをアルカリ性にすることで発色させ、それを
比色定量する方法〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２９，１７
１３（１９８３）、特公昭６３−７１９６号公報〕。ソジオ−３，３’−ジクロロフェノールスルホフタレ
イニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質
として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離したクロロ
フェノールレッドを直接比色定量する方法〔特開昭６３
−３０９１９９号公報〕。２−クロロ−４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素
反応によって遊離した２−クロロ−４−ニトロフェノー
ルを直接比色定量する方法〔特開昭６２−４８３９９号
公報等〕。２−フルオロ−４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−
β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵
素反応によって遊離した２−フルオロ−４−ニトロフェ
ノールを直接比色定量する方法〔特公平５−７３３９８
号公報、特公平５−５５５１７号公報等〕。ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって
遊離したＮ−アセチルグルコサミンに、酸化酵素（Ｎ−
アセチルグルコサミンオキシダーゼ：ＮＡＧＯＤ）を作
用させ、発生する過酸化水素をパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）存在下で発色剤と反応させ比色定量する方法〔機器
・試薬，１３，８８７（１９９０）〕。６−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ
−β−Ｄ−グルコサミニド（６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳ）を
基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離する６
−メチル−２−ピリジンチオールを特定波長に於けるそ
の吸光度を求めることにより定量する方法〔特開平５−
５９０８３号公報〕

【０００５】しかしながら、これらの方法は各々に基質
の水溶性、測定感度、溶液の安定性等の面で多くの問題
を抱えている。即ち、例えば上述した測定方法のうち、
の測定法では蛍光強度計の様な特殊な測定装置を必要
とするという問題点を有している。及びの測定法
は、酵素反応により遊離する色原体のｐＫａが高く、Ｎ
ＡＧの至適ｐＨでは比色定量を行うに足る測定感度が得
られないため、反応停止後アルカリ性として比色定量を
行わなければならず、現在主流を占めているレートアッ
セイには使用できない。即ち、迅速な多数検体処理には
不向きな測定法である。

【０００６】そこでレートアッセイに適用可能な測定法
として、色原体部分のｐＫａを低下させた基質を用いた
、及びの測定法も開発されているが、これらは、
ＮＡＧの至適ｐＨである４.５〜５.０において、酵素反
応により生成した色原体の解離（即ち、発色）が不十分
であるため、溶液中の僅かなｐＨ変動によっても吸光度
が変動し、測定誤差を生じやすく、しかも基質溶解後の
液状での長期安定性が悪いという問題点を有している。

【０００７】また、、及びの測定法では、遊離す
る色原体の極大吸収波長が４００ｎｍ前後であるため、
ビリルビン等生体成分の影響を受けやすいという問題点
も有している。に示される測定法はレートアッセイ
に適用可能であるが、酸化酵素を使用して過酸化水素を
発生させる測定系であるため、生体成分に含まれるビリ
ルビン等の還元性物質やその他の共存物質の影響を受け
やすく、また、上記、及びの基質と同様、基質の
溶解後の安定性が悪いという問題点を有している。

【０００８】一方、これらの問題点を解決すべくの測
定法が開発されたが、この方法で用いられる基質の安定
性は、短期的には向上しているもの、基質溶解後の長期
安定性を考慮した場合、酸性からアルカリ性の領域で分
解する傾向がみられるため、必ずしも満足できるもので
はなかった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した如
き状況に鑑みなされたもので、感度及び安定性に優れた
ＮＡＧ活性測定用基質として有用なヒドロキシアルキル
ピリジン誘導体とこれを基質として用いたＮＡＧ活性測
定方法及びそのための試薬を提供することを目的とす
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、一般式［１］

【００１１】

【化２】

【００１２】（式中、Ｇは還元性末端でβ結合してい
る、アミノ基にアシル基が結合しているヘキソサミン残
基を表し、Ｒはヒドロキシアルキル基を表す。）で示さ
れるヒドロキシアルキルピリジン誘導体、及びこの誘導
体を基質として用いることを特徴とするＮＡＧ活性測定
方法、の発明である。即ち本発明者等は、ＮＡＧ活性測
定に於いて有効に使用し得る合成基質について鋭意研究
を重ねた結果、一般式［１］で示されるヒドロキシアル
キルピリジン誘導体を基質として用いれば、上記した如
き問題点を解決できることを見出し、本発明を完成する
に到った。

【００１３】一般式［１］に於いて、Ｇで示される、ア
ミノ基にアシル基が結合しているヘキソサミン残基に於
けるアシル基としては、脂肪族カルボン酸由来、脂肪族
ヒドロキシカルボン酸由来、脂肪族アミノカルボン酸由
来、芳香族カルボン酸由来等のアシル基が挙げられる。
ここで脂肪族カルボン酸としては、例えば炭素数が２〜
８、好ましくは炭素数２〜４のものが挙げられ、具体的
には例えば酢酸，プロピオン酸，酪酸，イソ酪酸等が挙
げられる。脂肪族ヒドロキシカルボン酸としては、水酸
基を有しているカルボン酸であれば何れのものでも良い
が、好ましくは例えば炭素数１〜７、より好ましくは炭
素数１〜４のヒドロキシアルキル基を有するカルボン酸
が挙げられ、具体的には例えばヒドロキシメチル基，ヒ
ドロキシエチル基，ヒドロキシプロピル基，ヒドロキシ
ブチル基等を有するカルボン酸が挙げられる。また、脂
肪族アミノカルボン酸としては、アミノ基を有している
カルボン酸であれば如何なるものでも良いが、好ましく
は所謂アミノ酸が挙げられ、より好ましくは例えばメチ
オニン，ロイシン，グリシン，アラニン等の必須アミノ
酸が挙げられる。更に、芳香族カルボン酸としては、例
えば安息香酸等が挙げられる。

【００１４】Ｇで示される、アミノ基にアシル基が結合
しているヘキソサミン残基に於けるヘキソサミン残基と
しては、例えばグルコサミン残基，ガラクトサミン残基
等が挙げられる。アミノ基にアシル基が結合しているヘ
キソサミン残基の好ましい具体例としては、例えばＮ−
アセチルグルコサミン，Ｎ−アセチルガラクトサミン，
Ｎ−プロピオニルグルコサミン，Ｎ−プロピオニルガラ
クトサミン，Ｎ−ベンゾイルグルコサミン，Ｎ−ベンゾ
イルガラクトサミン等のＮ−アシルヘキソサミンの１位
の水酸基が脱離したしたもの（残基）が挙げられる。

【００１５】Ｒで示されるヒドロキシアルキル基として
は、直鎖状でも分枝状でも何れにても良く、好ましくは
炭素数１〜７、より好ましくは１〜３のヒドロキシアル
キル基が挙げられ、具体的には例えばヒドロキシメチル
基，１−ヒドロキシエチル基，２−ヒドロキシエチル
基，１−ヒドロキシプロピル基，２−ヒドロキシプロピ
ル基，３−ヒドロキシプロピル基，１−メチル−１−ヒ
ドロキシエチル基，１−メチル−２−ヒドロキシエチル
基等が挙げられる。

【００１６】一般式［１］に於けるピリジン環は更に置
換基を有していても良く、好ましい置換基としては、例
えばハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基等が挙げ
られる。ここでハロゲン原子としては、例えば塩素，臭
素，ヨウ素等が挙げられる。アルキル基としては直鎖状
でも分枝状でも良く例えば炭素数１〜３のものが好まし
く挙げられ、具体的には例えばメチル基，エチル基，ｎ
−プロピル基，イソプロピル基等が挙げられる。アルコ
キシ基としては直鎖状でも分枝状でも良く例えば炭素数
１〜３のものが挙げられ、具体的には、メトキシ基，エ
トキシ基，ｎ−プロポキシ基，イソプロポキシ基等が挙
げられる。

【００１７】本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導
体の好ましい具体例としては、例えば以下の化合物等が
挙げられる。３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ
−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，４−
ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−
チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，５−ヒドロキシメチル
−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グ
ルコサミニド，６−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−
Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，５
−（１−ヒドロキシエチル）−２−ピリジル−Ｎ−アセ
チル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，５−ヒドロ
キシメチル−４−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル
−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，５−ヒドロキシ
メチル−３−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１
−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド及び、上記化合物のグ
ルコサミニドをガラクトサミニドに置き換えた化合物又
は／及びアミノ基に結合しているアセチル基を例えばプ
ロピオニル基，ブチリル基，ベンゾイル基，メチオニン
残基，ロイシン残基，アラニン残基，グリシン残基等に
置き換えた化合物等が挙げられる。

【００１８】本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導
体は、水に２００ｍＭ以上溶解する為、ＮＡＧ活性測定
用基質として十分な水溶性を有している。また、水溶液
とした場合、広いｐＨ範囲、例えばｐＨ４.５〜ｐＨ１
０の範囲で長期間安定であり、特にｐＨ７〜ｐＨ１０の
範囲では長期間極めて安定に存在し得る。更にこの誘導
体は、３２０ｎｍ以上に吸収波長が無いため、この誘導
体から遊離するヒドロキシアルキルピリジンチオール誘
導体（極大吸収波長：３２０〜３６０ｎｍ）に由来する
吸光度変化測定に影響を与えないという特性を有してい
る。尚、上記一般式［１］で示される化合物のうち、Ｎ
ＡＧ活性測定のための基質として好適なものは、ＮＡＧ
に対してのＫｍ値が、好ましくは０.５〜５.０ｍＭ、よ
り好ましくは１.０〜３.５ｍＭ、更に好ましくは１.５
〜１.７ｍＭ程度のものが良い。

【００１９】本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導
体は、一般式［２］

【００２０】

【化３】

【００２１】（式中、Ｒはヒドロキシアルキル基を表
す。）で示されるヒドロキシアルキルピリジンチオール
誘導体より容易に合成することができる。即ち、一般式
［２］で示される化合物と、１位にＳＨ基と反応し得る
基（例えば−Ｃｌ，−Ｂｒ，−Ｉ等のハロゲンなど）を
有し、アミノ基が目的物に対応するアシル基で修飾され
たものであって且つ水酸基が必要に応じて保護されてい
ても良いヘキソサミン残基、例えば２−アセタミド−
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−
Ｄ−グルコピラノシルクロリド（例えば、Ｏｒｇ．Ｓ
ｙｎｔｈ．４６，１(１９６６)に記載の方法により合成
したもの等）等とを、例えば臭化テトラ−ｎ−ブチルア
ンモニウム等の相間移動触媒の存在下、アルカリ水溶液
と適当な有機溶剤（例えばクロロホルム，ジクロロメタ
ン等）との混合溶媒中でグリコシル化反応させ、得られ
たＳ−グリコシル化体を例えばナトリウムメトキシド等
の金属アルコキシドで水酸基の脱アシル化をすることに
より、本発明化合物を得ることができる。又、上記のグ
リコシル化反応の代わりに、直接的或いは間接的な通常
のグリコシド結合形成反応により本発明化合物を合成し
ても良い。

【００２２】本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導
体の合成原料である一般式［２］で示されるヒドロキシ
アルキルピリジンチオール誘導体は、例えば以下の方法
により合成できる。即ち、先ず、一般式［３］

【００２３】

【化４】

【００２４】（式中、Ｒ¹はカルボニル基を有する置換
基を表し、ＸはＣｌ，Ｂｒ，Ｉなどのハロゲン原子を表
す。）で示される化合物を、例えばＬｉＡｌＨ₄又はＮ
ａＢＨ₄等の還元剤を用いる常法により還元し、２−ハ
ロゲノ−ヒドロキシアルキルピリジン誘導体とする。

【００２５】次に、得られた２−ハロゲノ−ヒドロキシ
アルキルピリジン誘導体を例えばＮａＳＨ等の一般的な
チオール化剤を用いる常法により、チオール化すること
で一般式［２］で表されるヒドロキシアルキルピリジン
チオール誘導体が得られる。一般式［１］で示される化
合物を基質として、活性を測定できる酵素としては、例
えばＮＡＧ，Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニダ
ーゼ，Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ等が
挙げられるが、好ましくはＮＡＧ，Ｎ−アセチル−β−
Ｄ−ヘキソサミニダーゼ、更に好ましくはＮＡＧであ
る。

【００２６】ＮＡＧと一般式［１］で示されるヒドロキ
シアルキルピリジン誘導体とを反応させることで、下記
一般式［２］で示されるヒドロキシアルキルピリジンチ
オール誘導体が遊離する。一般式［２］

【００２７】

【化５】

【００２８】（式中、Ｒは前記に同じ。）ＮＡＧなどの酵素反応によって本発明のヒドロキシアル
キルピリジン誘導体から遊離するヒドロキシアルキルピ
リジンチオール誘導体は、３２０ｎｍ〜３６０ｎｍに極
大吸収を示すため、生体成分中の例えばビリルビンやヘ
モグロビン等の影響を受けない紫外領域（３２０ｎｍ〜
３８０ｎｍ）での測定が可能である。特にピリジン環の
３位或いは４位にヒドロキシアルキル基が置換した例え
ば３−ヒドロキシメチル−２−ピリジンチオール（極大
吸収波長３４１ｎｍ）や４−ヒドロキメチル−２−ピリ
ジンチオール（極大吸収波長３３９ｎｍ）等は、極大吸
収波長が現在臨床検査分野で主流となっている自動分析
機の設定波長（３４０ｎｍ）とほぼ同じであるため測定
波長を極大吸収波長のピークに設定できる。即ち本発明
のヒドロキシアルキル誘導体をＮＡＧ等の活性測定用基
質として用いれば、ＮＡＧ等の活性の測定に於ける分析
機種間や測定条件により生じる測定値の誤差やばらつき
を極力押さえることができる。

【００２９】本発明の化合物であるヒドロキシアルキル
ピリジン誘導体は、全ｐＨ領域に於いて試薬ブランク上
昇が低く、特にｐＨ７以上の溶液中で保存すれば少なく
とも３カ月以上の長期に渡って試薬ブランクの上昇が抑
えられることから、ＮＡＧ活性測定用基質として非常に
有用である。又、二液法によるＮＡＧ活性測定用試薬に
本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を基質とし
て用いれば、特にその溶液状態での保存性が増すので望
ましい。

【００３０】一般式［１］で示されるヒドロキシアルキ
ルピリジン誘導体を用いた本発明のＮＡＧ活性測定法
は、基質として一般式［１］で示されるヒドロキシアル
キルピリジン誘導体を用いる以外、自体公知の初速度法
に準じて測定を行えば足りる。具体的には、例えば以下
の方法が挙げられる。

【００３１】(ｉ)方法１例えば、血清、血液、尿等の生体由来試料と、予め２０
〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃でインキュベートし
た、一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジ
ン誘導体と適当な緩衝剤とを含有した試薬溶液（ｐＨは
通常３.０〜７.０、好ましくは４.０〜６.５）とを２０
〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で反応させる。ＮＡ
Ｇの作用により生成するヒドロキシアルキルピリジンチ
オール誘導体の増加量を、例えば分光光度計等の適当な
測定装置を用いて３２０〜３８０ｎｍに於ける単位時間
当たりの吸光度変化量として測定する。得られた吸光度
変化量をヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体の
分子吸光係数を用いて単位換算することで、試料中のＮ
ＡＧ活性を求めることができる。尚、ここで用いられる
試料溶液は一般式［１］で示されるヒドロキシアルキル
ピリジン誘導体と適当な緩衝剤とを含有するｐＨ７〜１
１好ましくはｐＨ７〜９の試薬溶液と適当な緩衝剤を含
有した試薬溶液（ｐＨは通常３.０〜７.０、好ましくは
４.０〜６.５程度）とを混合して調製されたものでも良
い。

【００３２】(ｉｉ)方法２生体由来試料と、適当な緩衝剤を含有する第一試薬溶液
（ｐＨは通常３.０〜７.０、好ましくは４.０〜６.５程
度）とを混合し、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０
℃で適当な時間インキュベートした後、これと予め２０
〜５０℃好ましくは３０〜４０℃でインキュベートし
た、一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジ
ン誘導体と適当な緩衝剤を含有する第２試薬溶液とを混
合し、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で反応さ
せる。ＮＡＧの作用により生成するヒドロキシアルキル
ピリジンチオール誘導体の増加量を、例えば分光光度計
等の適当な測定装置を用いて３２０〜３８０ｎｍにおけ
る単位時間当たりの吸光度変化量として測定する。得ら
れた吸光度変化量をヒドロキシアルキルピリジンチオー
ル誘導体の分子吸光係数を用いて単位換算することで試
料中のＮＡＧ活性を求めることができる。

【００３３】尚、上記の方法に於いて、第２試薬溶液の
ｐＨ及び緩衝剤の濃度は、第１試薬溶液と混合した場合
のｐＨが３.０〜７.０好ましくは４.０〜６.５となるよ
うに設定されていれば良く、特に限定されないが、本発
明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体の水溶液中の安
定性を考慮すれば、そのｐＨは７〜１１、好ましくは７
〜９の範囲で設定しておくことが望ましい。

【００３４】又、上記(ｉ)及び(ｉｉ)の方法に於いて、
基質として用いられる本発明のヒドロキシアルキルピリ
ジン誘導体の使用濃度としては、ＮＡＧの活性測定を実
施し得る濃度であれば良く、特に限定されないが、ＮＡ
Ｇとの反応時の濃度として０.１〜５００ｍＭ、好まし
くは１〜５０ｍＭの範囲から適宜選択すれば良い。

【００３５】上記(ｉ)及び(ｉｉ)の方法における試薬溶
液に用いられる緩衝剤としては、通常この分野で用いら
れるものであれば特に限定されないが、例えばグッド
（Ｇｏｏｄ’ｓ）緩衝剤、クエン酸塩、ほう酸塩、リン
酸塩が好ましく挙げられる。また、これら緩衝剤の使用
濃度としては、ＮＡＧの活性測定を実施し得る濃度であ
れば良く特に限定されないが、ＮＡＧ活性測定時の濃度
として１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜５００ｍＭ
の範囲から適宜選択すれば良い。また、上記(ｉ)及び
(ｉｉ)で用いた試薬溶液中には、必要に応じて、通常こ
の分野で用いられる溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、界
面活性剤等を適宜選択して含有させても良く、これらの
使用量は通常この分野で用いられる範囲から適宜選択す
れば良い。

【００３６】本発明のＮＡＧ活性測定用試薬は、本発明
のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を基質として含ん
で成るものである。より具体的には、ヒドロキシアル
キルピリジン誘導体と緩衝剤とを含んで成る一液法用試
薬、緩衝剤を含んで成る第一試薬と、ヒドロキシアル
キルピリジン誘導体と緩衝剤とを含んで成る第二試薬と
を含んで成る、二液法用試薬等が挙げられる。また、こ
れら本発明試薬の構成要素の好ましい態様と具体例は上
で述べた通りである。以下に実施例を挙げて本発明を更
に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら
限定されるものではない。

【００３７】

【実施例】

実施例１３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−
１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：３
−ヒドロキシメチル−２−ピリジニル２−（アセチル
アミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド以下化合物［１］と略記する。〕の合成

【００３８】(1)２−クロロニコチン酸（和光純薬工業
(株)品）１５.７６ｇ（１００ｍｍｏｌ）とトリエチル
アミン１５.３２ｍｌ（１１０ｍｍｏｌ）を溶解したト
ルエン溶液（１Ｌ）にクロロ炭酸エチル１０.５２ｍｌ
を加え、室温で１時間攪拌反応させた。析出した結晶を
濾去し、トルエンを減圧留去して得られた褐色オイルを
テトラヒドロフランに溶解し、これを予めテトラヒドロ
フランに水素化リチウムアルミニウム４.１７ｇ（１１
０ｍｍｏｌ）を加え窒素置換し−７８℃に冷却しておい
た溶液に滴下した。滴下後同温度で２時間攪拌反応さ
せ、水（３０ｍｌ）で反応を停止させた後室温とし、１
Ｎ−ＮａＯＨ（２００ｍｌ）を加え、ジエチルエーテル
で抽出処理を行った。抽出液から溶媒を減圧留去し得ら
れた褐色オイルをヘキサンから結晶化することにより、
２−クロロ−３−ヒドロキシメチルピリジン１１.９１
ｇ（収率７５％）を得た。融点：５８〜５９℃。元素分析値Ｃ₆Ｈ₆ＣｌＮＯ実測値（％）；Ｃ：５０.２４，Ｈ：４.１１，Ｎ：９.７４。計算値（％）；Ｃ：５０.１９，Ｈ：４.２１，Ｎ：９.７６。

【００３９】(2)(1)で得られた２−クロロ−３−ヒドロ
キシメチルピリジン８.６１ｇ（６０ｍｍｏｌ）と硫化
水素ナトリウム３.３６ｇ（６０ｍｍｏｌ）とを１−メ
チル−２−ピロリドン中に加え１４０℃で２時間攪拌反
応させた。攪拌後溶媒を減圧留去し、水（２００ｍｌ）
を加え、酢酸でｐＨ４.０とした後、クロロホルムによ
り抽出処理を行った。抽出液から溶媒を減圧留去後、残
渣をエタノールで再結晶し、黄色針状晶の３−ヒドロキ
シメチル−２−ピリジンチオール６.４ｇ（収率６７
％）を得た。融点：１７４〜１７５℃。元素分析値Ｃ₆Ｈ₇ＮＯＳ実測値（％）；Ｃ：５１.１４，Ｈ：４.９７，Ｎ：９.９８。計算値（％）；Ｃ：５１.０４，Ｈ：５.００，Ｎ：９.９２。

【００４０】(3)(2)で得られた３−ヒドロキシメチル−
２−ピリジンチオール４.２４ｇ（３０ｍｍｏｌ）、１
−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラアセ
チル−α−Ｄ−グルコサミン１０.９７ｇ（３０ｍｍｏ
ｌ）及びテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムブロミド９.
６７ｇ（３０ｍｍｏｌ）を１Ｎ−ＮａＯＨ５０ｍｌとジ
クロロメタン５０ｍｌとの混合溶媒中、室温で１時間攪
拌反応させた。反応終了後反応液に水１００ｍｌとジク
ロロメタン１００ｍｌを加えて攪拌分液し、有機層を無
水硫酸マグネシウムで乾燥後溶媒を減圧留去した。得ら
れた淡黄色の結晶をエタノールで再結晶することにより
白色綿状結晶の３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−
２，３，４，６−テトラアセチル−１−チオ−β−Ｄ−
グルコサミニド５.１４ｇ（収率３６.４％）を得た。融点：１７２〜１７３℃。元素分析値Ｃ₂₀Ｈ₂₆Ｎ₂Ｏ₉Ｓ実測値（％）；Ｃ：５１.１４，Ｈ：５.４４，Ｎ：５.９８。計算値（％）；Ｃ：５１.０１，Ｈ：５.５６，Ｎ：５.９５。

【００４１】(4)(3)で得られた３−ヒドロキシメチル−
２−ピリジル−２，３，４，６−テトラアセチル−１−
チオ−β−Ｄ−グルコサミニド５.１４ｇ（１１ｍｍｏ
ｌ）にメタノール１００ｍｌを加え、同溶液にナトリウ
ムメトキシドの２８％メタノール溶液を１０滴添加した
後、室温で１時間撹拌反応させた。反応終了後、反応液
を酢酸で中和し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣
を、エタノールで再結晶することにより、白色針状結晶
の３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル
−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド３.５０ｇ（収率
９３％）を得た（通算収率１７％）。融点：１９０〜１９３℃。元素分析値Ｃ₁₄Ｈ₂₀Ｎ₂Ｏ₆Ｓ実測値（％）；Ｃ：４８.８１，Ｈ：５.９７，Ｎ：８.２０。計算値（％）；Ｃ：４８.８３，Ｈ：５.８５，Ｎ：８.１３。ＩＲ：１６４３ｃｍ^-1（Ｃ＝Ｏ）

【００４２】実施例２４−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−
１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：４
−ヒドロキシメチル−２−ピリジニル２−（アセチル
アミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド以下化合物［２］と略記する。〕の合成

【００４３】２−クロロニコチン酸１５０ｍｍｏｌの代
わりに２−クロロイソニコチン酸（東京化成(株)品）２
３.６３ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例
１と同じ試薬を用い、実施例１と同様にして反応及び後
処理を行って、４−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−
Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド１.
６５ｇを得た（通算収率８％）。融点：１９８〜１９９℃。元素分析値Ｃ₁₄Ｈ₂₀Ｎ₂Ｏ₆Ｓ実測値（％）；Ｃ：４８.７７，Ｈ：５.６７，Ｎ：８.２４。計算値（％）；Ｃ：４８.８３，Ｈ：５.８５，Ｎ：８.１３。ＩＲ：１６４１ｃｍ^-1。

【００４４】実施例３５−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−
１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：５
−ヒドロキシメチル−２−ピリジニル２−（アセチル
アミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド以下化合物［３］と略記する。〕の合成

【００４５】２−クロロニコチン酸１５０ｍｍｏｌの代
わりに６−クロロニコチン酸（和光純薬工業(株)品）２
３.６３ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例
１と同じ試薬を用い、実施例１と同様にして反応及び後
処理行って、５−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ
−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド５.１
５ｇを得た（通算収率２５％）。融点：２１３〜２１４℃。元素分析値Ｃ₁₄Ｈ₂₀Ｎ₂Ｏ₆Ｓ実測値（％）；Ｃ：４８.８０，Ｈ：５.７８，Ｎ：８.１７。計算値（％）；Ｃ：４８.８３，Ｈ：５.８５，Ｎ：８.１３。ＩＲ：１６４３ｃｍ^-1。

【００４６】実施例４６−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−
１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：６
−ヒドロキシメチル−２−ピリジニル２−（アセチル
アミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド以下化合物［４］と略記する。〕の合成

【００４７】２−クロロニコチン酸１５０ｍｍｏｌの代
わりに６−クロロピコリン酸（和光純薬工業(株)品）２
３.６３ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例
１と同じ試薬を用い、実施例１と同様にして反応及び後
処理を行って、６−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−
Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド２.
６８ｇを得た（通算収率１３％）。融点：１６４〜１６５℃。元素分析値Ｃ₁₄Ｈ₂₀Ｎ₂Ｏ₆Ｓ実測値（％）；Ｃ：４８.６５，Ｈ：５.８３，Ｎ：８.２４。計算値（％）；Ｃ：４８.８３，Ｈ：５.８５，Ｎ：８.１３。ＩＲ：１６４４ｃｍ^-1（Ｃ＝Ｏ）

【００４８】実施例５５−（１−ヒドロキシエチル）−２−ピリジル−Ｎ−ア
セチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡ
Ｃ名：５−（１−ヒドロキシエチル）−２−ピリジニル
２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−１−チオ−
β−Ｄ−グルコピラノシド以下化合物［５］と略記す
る。〕の合成

【００４９】６−クロロニコチン酸（和光純薬工業(株)
品）３９.３９ｇ（２５０ｍｍｏｌ）をトルエン（０.５
Ｌ）に懸濁し塩化チオニル（３６ｍｌ）とＮ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド（１ｍｌ）とを加え、室温で１８時間
撹拌反応させた。次に反応溶媒を減圧留去し、残渣をク
ロロホルム（１.５Ｌ）に溶解後、ジエチルアミン（２
５.８ｍｌ）のクロロホルム溶液（１００ｍｌ）とトリ
エチルアミン（７０ｍｌ）のクロロホルム溶液（１５０
ｍｌ）を添加した。添加終了後室温で２時間撹拌し、反
応終了後精製水（１Ｌ）を加え有機層を分液洗浄した。
有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧
留去した。得られた粗Ｎ，Ｎ−ジエチル−６−クロロニ
コチンアミド（４９.１６ｇ）をテトラヒドロフラン
（２Ｌ）に溶解し、窒素置換後、−７８℃でメチルリチ
ウム（１６５ｍｌ：１.４Ｍジエチルエーテル溶液）を
滴下した。滴下終了後同温度で１時間撹拌反応させ、飽
和塩化アンモニウム溶液で反応を停止後室温とし、溶媒
を留去した。得られた残渣に精製水（０.５Ｌ）とクロ
ロホルム（０.５Ｌ）を加えて分液し、有機層を無水硫
酸マグネシウムで乾燥後溶媒を留去した。得られた残渣
をエタノールで再結晶することにより精製し、３−アセ
チル−６−クロロピリジン２４.５７ｇを得た（収率６
３％）。融点：９８〜９９℃。元素分析値Ｃ₇Ｈ₆ＣｌＮＯ実測値（％）；Ｃ：５５.１５，Ｈ：３.８３，Ｎ：８.２４。計算値（％）；Ｃ：５４.９１，Ｈ：３.８１，Ｎ：８.８３。

【００５０】得られた３−アセチル−６−クロロピリジ
ン２３.７９ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフ
ランに溶解し、これを予めテトラヒドロフランに水素化
リチウムアルミニウム６.２５ｇ（１６５ｍｍｏｌ）を
加え窒素置換し−７８℃に冷却しておいた溶液に滴下し
た。滴下後同温度で２時間攪拌反応させ、水（３０ｍ
ｌ）で反応を停止した後室温とし、１Ｎ−ＮａＯＨ（２
００ｍｌ）を加え、ジエチルエーテルで抽出処理を行っ
た。抽出液から溶媒を減圧留去し得られた褐色オイルを
ヘキサンから結晶化することにより、３−（１−ヒドロ
キシエチル）−６−クロロピリジン２０.４８ｇ（収率
８５％）を得た。次に２−クロロ−３−ヒドロキシメチ
ルピリジン８.６１ｇ（６０ｍｍｏｌ）の代わりに、上
で得られた３−（１−ヒドロキシエチル）−６−クロロ
ピリジン２０.４８ｇ（１２７.５ｍｍｏｌ）を用いた以
外は実施例１の(2)〜(3)と同じ試薬を用い、実施例１の
(2)〜(3)と同様にして反応及び後処理を行って、５−
（１−ヒドロキシエチル）−２−ピリジル−Ｎ−アセチ
ル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド５.９３ｇを得
た（全収率１３％）。融点：２０１〜２０２℃。元素分析値Ｃ₁₅Ｈ₂₂Ｎ₂Ｏ₆Ｓ実測値（％）；Ｃ：５０.５５，Ｈ：６.０８，Ｎ：７.６９。計算値（％）；Ｃ：５０.２７，Ｈ：６.１９，Ｎ：７.８２。ＩＲ：１６５１ｃｍ^-1（Ｃ＝Ｏ）

【００５１】実験例１本発明のヒドロキシアルキルピ
リジン誘導体のｐＨ安定性の検討従来品中、水溶液状態で最も長期間安定な６−メチル−
２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グル
コサミニド〔Ｎ−アッセイＮＡＧニットーボー（ニット
ーボーメディカル（株）商品名）で用いられている基
質〕（以下６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳと略記する。）と、本
発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体のうち従来品
と同じ位置に置換基を持つ６−ヒドロキシメチル−２−
ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサ
ミニド（化合物［４］）との水溶液状態での安定性をｐ
Ｈ４.５〜１０の範囲で比較した。

【００５２】（操作法）６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳと化合物
［４］を夫々精製水に溶解し、２０ｍＭの基質原液を調
製した。同原液と、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４.
５，５.０，５.５，６.０）、５０ｍＭＮ,Ｎ−ビス
（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン
酸緩衝液（ｐＨ７.０）又は５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８.０，９.０，１０.０）とを各々１：１で混合し
て、各ｐＨの基質溶液を調製し、１０℃で１６日間保存
した。同基質溶液について、調製直後と１６日目の３４
０ｎｍのＯＤ値（吸光度）を測定した。（結果）各基質溶液の調製直後のＯＤ値、１６日目のＯ
Ｄ値、及び１６日目のＯＤ値から調製直後のＯＤ値を差
し引いたＯＤ値変化量（ΔＯＤ値）を表１に併せて示
す。

【００５３】

【表１】

【００５４】表１の結果に基づいて作成したｐＨとΔＯ
Ｄ値の関係を表すグラフを図１に示す。尚、図中、−●
−は、従来品の６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳについて得られた
グラフを、また、−◆−は化合物［４］について得られ
たグラフをそれぞれ示す。表１及び図１の結果から、本
発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、従来のＮ
ＡＧの基質である６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳに比べて、水溶
液中で良好な安定性を有していることが判る。特に、Ｎ
ＡＧの至適ｐＨ付近での安定性は、従来品に比べて著し
く向上しているので、本発明のヒドロキシアルキルピリ
ジン誘導体がＮＡＧの基質として好ましいものであるこ
とが判る。実験例２本発明化合物の水溶液状態での長期保存安定
性の検討従来品中、水溶液状態で最も長期間安定な６−ＭＰＴ−
ＮＡＧＳと、本発明の化合物［１］〜［４］とのｐＨ
８.０の溶液中で安定性を比較した。実験例１と同様に
して調製した、従来品と化合物［１］〜［４］の基質溶
液（２５ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８.０）を１０℃で保
存し、各々の調製直後、保存後８日目、保存後１６日
目、保存後６０日目、保存後９０日目の３４０ｎｍのＯ
Ｄ値を測定した。

【００５５】（結果）結果を表２に示す。

【００５６】

【表２】

【００５７】また、表２の結果に基づいて作成した、保
存日数とＯＤ値の関係を表すグラフを図２に示す。尚、
図２に於いて、−○−は従来品について得られた結果
を、−◆−は化合物［１］について得られた結果を、−
●−は化合物［２］について得られた結果を、−△−は
化合物［３］について得られた結果を、−×−は化合物
［４］について得られた結果をそれぞれ示す。表２及び
図２の結果から明らかな如く、本発明のヒドロキシアル
キルピリジン誘導体は、従来品の６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳ
に比較して水溶液中での長期保存安定性が著しく向上し
ていることが判る。言い換えれば、本発明のヒドロキシ
アルキルピリジン誘導体は、所謂液状試薬用のＮＡＧ活
性測定用基質として好適なものであることが判る。

【００５８】実施例６３−ヒドロキシメチル−２−ピ
リジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミ
ニド（化合物［１］）を基質として用いたＮ−アセチル
グルコサミニダーゼ活性の測定（検体）ヒト胎盤由来ＮＡＧ（シグマ社品）を生理食塩
水で適宜希釈して調製したもの３４検体を用いた。（試薬）第１試薬溶液１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４.４０、ａｔ２５
℃）。第２試薬溶液化合物［１］を４１.７ｍＭ含有するホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８.０）。

【００５９】（操作法）第１試薬溶液１.８ｍｌと検体
０.１ｍｌとを混合し、３７℃で５分間インキュベート
した後、これに第２試薬溶液０.６ｍｌを加えると同時
に３４０ｎｍにおける吸光度の測定を開始し、吸光度を
１分毎に５分間測定した。得られた測定値から１分間当
たりの吸光度変化量（ΔＡ）を求めた。又、試薬ブラン
ク（ΔＢ）は、検体の代わりに生理食塩水を用いた以
外、同じ試薬を用い、同様の操作を行って測定した。得
られたΔＡ及びΔＢを下記の式に代入し、Ｎ−アセチル
グルコサミニダーゼ活性値を算出した。検体のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性（ｕ／Ｌ）
＝（ΔＡ−ΔＢ）×反応時の総液量×１０⁶／分子吸光
係数×検体液量 ΔＡ：検体の３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化
量 ΔＢ：試薬ブランクの３４０ｎｍの１分間当たりの吸
光度変化量反応時の総液量：２.５（ｍｌ）分子吸光係数：８３５４検体液量：０.１（ｍｌ）

【００６０】実施例７４−ヒドロキシメチル−２−ピ
リジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミ
ニド（化合物［２］）を基質として用いたＮ−アセチル
グルコサミニダーゼ活性の測定（検体）実施例６と同じ（試薬）第１試薬溶液実施例６と同じ第２試薬溶液化合物［２］を４１.７ｍＭ含有するホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８.０）

【００６１】（操作法）上記の試薬を用いた以外は実施
例６の測定方法と同じ操作方法により測定を行い、得ら
れたΔＡとΔＢとを下記の式に代入し、Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ活性値を算出した。検体のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性（ｕ／Ｌ）
＝（ΔＡ−ΔＢ）×反応時の総液量×１０⁶／分子吸光
係数×検体液量 ΔＡ：検体の３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化
量 ΔＢ：試薬ブランクの３４０ｎｍの１分間当たりの吸
光度変化量反応時の総液量：２.５（ｍｌ）分子吸光係数：８３９７検体液量：０.１（ｍｌ）

【００６２】実施例８５−ヒドロキシメチル−２−ピ
リジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミ
ニド（化合物［３］）を用いたＮ−アセチルグルコサミ
ニダーゼ活性の測定（検体）実施例６と同じ（試薬）第１試薬溶液実施例６と同じ第２試薬溶液化合物［３］を４１.７ｍＭ含有するホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８.０）

【００６３】（操作法）上記の試薬を用いた以外は実施
例６の測定方法と同じ操作方法により測定を行い、得ら
れたΔＡとΔＢとを下記の式に代入し、Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ活性値を算出した。検体のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性（ｕ／Ｌ）
＝（ΔＡ−ΔＢ）×反応時の総液量×１０⁶／分子吸光
係数×検体液量 ΔＡ：検体の３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化
量 ΔＢ：試薬ブランクの３４０ｎｍの１分間当たりの吸
光度変化量反応時の総液量：２.５（ｍｌ）分子吸光係数：８０４９検体液量：０.１（ｍｌ）

【００６４】参考例１市販品によるＮ−アセチルグル
コサミニダーぜ活性の測定市販のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性測定試薬
（Ｎ−アッセイＮＡＧニットーボー：ニットーボーメデ
ィカル(株)商品名）を用いて実施例６、７、８でＮ−ア
セチルグルコサミニダーゼ活性測定を行った３４検体に
ついてＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の測定を行
った。尚、測定操作は、商品に添付の現品説明書に記載
の標準操作法に従って行った。

【００６５】又、実施例６、７及び８で得られた各検体
の活性測定値と参考例１で得られた活性測定値との相関
図を図３〜５に夫々示す。また、これら測定値を統計的
処理して得られた回帰直線及び相関係数（ｒ）は以下の
如くであった。１．Ｘ：参考例１で得られたＮＡＧ活性値、Ｙ：実施例
６で得られたＮＡＧ活性値。回帰直線式：Ｙ＝０.９３Ｘ−０.２４相関係数（ｒ）：０.９９３２．Ｘ：参考例１で得られたＮＡＧ活性値、Ｙ：実施例
７で得られたＮＡＧ活性値。回帰直線式：Ｙ＝０.９０Ｘ＋０.４７相関係数（ｒ）：０.９９３３．Ｘ：参考例１で得られたＮＡＧ活性値、Ｙ：実施例
８で得られたＮＡＧ活性値。回帰直線式：Ｙ＝０.８４Ｘ＋０.８１相関係数（ｒ）：０.９９３以上の結果並びに図３〜５の結果から、本発明のヒドロ
キシアルキルピリジン誘導体を基質として用いるＮＡＧ
活性測定法により、市販品と良好な相関関係を有するＮ
ＡＧ活性値が得られることが判る。

【００６６】実施例９、直線性の検討ヒト胎盤由来ＮＡＧ（シグマ社品）を生理食塩水で１０
段階に希釈したもの（希釈率1/10〜１）を検体とし、実
施例６〜８の試薬を夫々用い、同様の操作を行って、本
発明のＮＡＧ活性測定方法の検量線の直線性の検討を行
った。実施例６の試薬を用いて得られた結果を図６に、
実施例７の試薬を用いて得られた結果を図７に、また、
実施例８の試薬を用いて得られた結果を図８に夫々示
す。図６〜図８の結果から明らかな如く、本発明のＮＡ
Ｇ活性測定方法の検量線は原点を通る良好な直線性を示
していることが判る。

【００６７】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、新規ヒドロ
キシアルキルピリジン誘導体、この誘導体を基質として
用いるＮＡＧ活性測定方法及びＮＡＧ活性測定試薬を提
供するものである。本発明のヒドロキシアルキルピリジ
ン誘導体は、水溶性に優れていると共に、非酵素的分解
が少ないため、酸性からアルカリ性の広い領域に渡っ
て、水溶液中に於ける安定性が極めて高く、特に本発明
のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を含む溶液のｐＨ
を７以上に設定すれば（好ましくはｐＨ７〜１０）、水
溶液状態で少なくとも３ヶ月以上の長期に渡って安定で
あるというＮＡＧ活性測定用基質として極めて優れた性
質を有している。また、本発明のヒドロキシアルキルピ
リジン誘導体は、ＮＡＧ等の作用によりヒドロキシアル
キルピリジンチオール誘導体を遊離するが、この誘導体
はビリルビン等の生体成分による影響を回避できる紫外
領域波長での測定が可能であると共に、極大吸収波長が
自動分析機の設定波長と殆ど同じであるため、これを基
質として用いるＮＡＧ活性測定法及び試薬は、用手法の
みならず汎用の自動分析機へも容易に応用できるという
効果を奏する。従って、本発明は斯業に貢献するところ
極めて大なる発明である。

【００６８】

【図面の簡単な説明】

【図１】実験例１で得られた、ｐＨとＯＤ値変化量（Δ
ＯＤ値）との関係を表すグラフである。

【図２】実験例２で得られた保存日数とＯＤ値との関係
を表すグラフである。

【図３】実施例６で得られた
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以下、Ｎ
ＡＧと略記する。）活性測定値と、参考例１で得られた
ＮＡＧ活性測定値との相関図である。

【図４】実施例７で得られたＮＡＧ活性測定値と、参考
例１で得られたＮＡＧ活性測定値との相関図である。

【図５】実施例８で得られたＮＡＧ活性測定値と、参考
例１で得られたＮＡＧ活性測定値との相関図である。

【図６】実施例９で得られた、本発明のＮＡＧ活性測定
法の検量線の直線性を示す図である。

【図７】実施例９で得られた、本発明のＮＡＧ活性測定
法の検量線の直線性を示す図である。

【図８】実施例９で得られた、本発明のＮＡＧ活性測定
法の検量線の直線性を示す図である。

【００６９】

【符号の簡単な説明】

図１に於いて、−●−は従来品の６−メチル−２−ピリ
ジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニ
ド（以下６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳと略記する。）を用いて
得られた結果を、−◆−は化合物［４］を用いて得られ
た結果を夫々示す。図２に於いて、−○−は従来品の６
−ＭＰＴ−ＮＡＧＳを用いて得られた結果を、−◆−は
化合物［１］を用いて得られた結果を、−●−は化合物
［２］を用いて得られた結果を、−△−は化合物［３］
を用いて得られた結果を、−×−は化合物［４］を用い
て得られた結果を夫々示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式［１］【化１】（式中、Ｇは還元性末端でβ結合している、アミノ基に
アシル基が結合しているヘキソサミン残基を表し、Ｒは
ヒドロキシアルキル基を表す。）で示されるヒドロキシ
アルキルピリジン誘導体。
【請求項２】ＧがＮ−アセチルグルコサミン残基である
請求項１のヒドロキシアルキルピリジン誘導体。
【請求項３】請求項１に記載のヒドロキシアルキルピリ
ジン誘導体を基質として用いることを特徴とする、Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼの活性測定方
法。
【請求項４】請求項１に記載のヒドロキシアルキルピリ
ジン誘導体を含んでなる、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニダーゼの活性測定用試薬。