JP3124444B2 - エキソ型糖加水分解酵素活性の測定法及び測定試薬 - Google Patents
エキソ型糖加水分解酵素活性の測定法及び測定試薬Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、エキソ型糖加水分解酵
素活性の測定法に関するものである。さらに詳しくいえ
ば、本発明は、β‐マルトシド誘導体を基質とし、エキ
ソ型糖加水分解酵素のうち、α‐１，４‐グルコシド鎖
を非還元末端から加水分解する酵素の活性を迅速に、か
つ正確に測定する方法と、試薬及びエキソ型糖加水分解
酵素であるグルコアミラーゼ及びα‐グルコシダーゼの
混合物を酵素試料とした場合、β‐マルトシド誘導体と
α‐グルコシド誘導体を基質としてそれぞれ酵素活性の
測定を行うことにより、これらを分別して定量する方法
に関するものである。
素活性の測定法に関するものである。さらに詳しくいえ
ば、本発明は、β‐マルトシド誘導体を基質とし、エキ
ソ型糖加水分解酵素のうち、α‐１，４‐グルコシド鎖
を非還元末端から加水分解する酵素の活性を迅速に、か
つ正確に測定する方法と、試薬及びエキソ型糖加水分解
酵素であるグルコアミラーゼ及びα‐グルコシダーゼの
混合物を酵素試料とした場合、β‐マルトシド誘導体と
α‐グルコシド誘導体を基質としてそれぞれ酵素活性の
測定を行うことにより、これらを分別して定量する方法
に関するものである。
【０００２】したがって、本発明は、醸造分野のみなら
ず広く食品、デンプン工業、臨床診断などの分野におい
ても非常に重要な役割を果たすものである。
ず広く食品、デンプン工業、臨床診断などの分野におい
ても非常に重要な役割を果たすものである。
【０００３】
【従来の技術】エキソ型糖加水分解酵素の中でも、α‐
１，４‐グルコシド鎖を非還元末端から加水分解してグ
ルコースを生成する酵素であるグルコアミラーゼ、α‐
グルコシダーゼは、醸造、食品、デンプン工業などにお
いて重要な役割を担っている。
１，４‐グルコシド鎖を非還元末端から加水分解してグ
ルコースを生成する酵素であるグルコアミラーゼ、α‐
グルコシダーゼは、醸造、食品、デンプン工業などにお
いて重要な役割を担っている。
【０００４】従来、グルコアミラーゼ活性の測定では、
可溶性デンプンを基質として、生成するグルコース量を
測定し、活性値を求める方法［注釈編集委員会編「第四
回改正国税庁所定分析法注解」第２１３ページ、日本醸
造協会（１９９３年）］が一般的である。しかしなが
ら、この方法においては、（１）例えば麹の抽出液中の
ようにグルコースを多く含む試料では、そのまま測定す
ることが困難であり、試料は必ず透析しなければならな
い、（２）基質に作用させてグルコースを生成させる反
応、次いで生成したグルコースを定量する反応と、２段
階に分けて測定を行うために、操作が煩雑であって、測
定に要する時間が長い、（３）試料中にα‐アミラーゼ
が混在すると測定値に影響を与える、などの欠点があ
る。
可溶性デンプンを基質として、生成するグルコース量を
測定し、活性値を求める方法［注釈編集委員会編「第四
回改正国税庁所定分析法注解」第２１３ページ、日本醸
造協会（１９９３年）］が一般的である。しかしなが
ら、この方法においては、（１）例えば麹の抽出液中の
ようにグルコースを多く含む試料では、そのまま測定す
ることが困難であり、試料は必ず透析しなければならな
い、（２）基質に作用させてグルコースを生成させる反
応、次いで生成したグルコースを定量する反応と、２段
階に分けて測定を行うために、操作が煩雑であって、測
定に要する時間が長い、（３）試料中にα‐アミラーゼ
が混在すると測定値に影響を与える、などの欠点があ
る。
【０００５】これに対し、可溶性デンプンの分解と、生
成するグルコースの定量を同じ反応液中で行う方法
［「生物工学会誌」第７１巻、第９３ページ（１９９３
年）］、及びフェニル‐α‐グルコシド又は２，４‐ジ
ニトロフェニル‐α‐グルコシドをグルコアミラーゼ活
性測定用基質として用いる方法（特開昭５１−８５７９
０号公報）が知られている。しかしながら、前者の方法
は、簡便で、かつα‐アミラーゼの影響を受けないとい
う長所があるものの、試料中にグルコースが含まれると
測定が困難であるという欠点を有しており、一方、後者
の方法においては、試料中のグルコースの影響を受け
ず、測定操作も簡便であるという利点をもつが、この基
質に対するグルコアミラーゼの反応性が悪く、実用的で
はない。
成するグルコースの定量を同じ反応液中で行う方法
［「生物工学会誌」第７１巻、第９３ページ（１９９３
年）］、及びフェニル‐α‐グルコシド又は２，４‐ジ
ニトロフェニル‐α‐グルコシドをグルコアミラーゼ活
性測定用基質として用いる方法（特開昭５１−８５７９
０号公報）が知られている。しかしながら、前者の方法
は、簡便で、かつα‐アミラーゼの影響を受けないとい
う長所があるものの、試料中にグルコースが含まれると
測定が困難であるという欠点を有しており、一方、後者
の方法においては、試料中のグルコースの影響を受け
ず、測定操作も簡便であるという利点をもつが、この基
質に対するグルコアミラーゼの反応性が悪く、実用的で
はない。
【０００６】さらに、例えば米麹中にはエキソ型糖加水
分解酵素として、グルコアミラーゼとα‐グルコシダー
ゼの両酵素を含むが、これを分別して定量しようとする
試みは、これまでなされていなかった。
分解酵素として、グルコアミラーゼとα‐グルコシダー
ゼの両酵素を含むが、これを分別して定量しようとする
試みは、これまでなされていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のエキソ型糖加水分解酵素活性の測定法が有する欠
点を克服し、試料中にグルコースが存在しても透析する
必要がなく、また試料中にα‐アミラーゼが混在してい
ても影響を受けることなく、迅速かつ高感度に試料中の
エキソ型糖加水分解酵素活性を測定しうる新規なエキソ
型糖加水分解酵素活性の測定法及びそれに用いる測定試
薬を提供するとともに、試料中にグルコアミラーゼとα
‐グルコシダーゼが含まれる場合、それらを効率よく分
別定量する方法を提供することを目的としてなされたも
のである。
従来のエキソ型糖加水分解酵素活性の測定法が有する欠
点を克服し、試料中にグルコースが存在しても透析する
必要がなく、また試料中にα‐アミラーゼが混在してい
ても影響を受けることなく、迅速かつ高感度に試料中の
エキソ型糖加水分解酵素活性を測定しうる新規なエキソ
型糖加水分解酵素活性の測定法及びそれに用いる測定試
薬を提供するとともに、試料中にグルコアミラーゼとα
‐グルコシダーゼが含まれる場合、それらを効率よく分
別定量する方法を提供することを目的としてなされたも
のである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために種々研究を重ねた結果、β‐マルトオリ
ゴシド誘導体のうち、グルコースが２つ結合したものを
基質とした場合、２種のエキソ型糖加水分解酵素は、β
‐マルトオリゴシド誘導体のα‐１，４‐グルコシド鎖
を非還元末端より選択的に加水分解し、しかも反応性が
非常に高いが、α‐アミラーゼには作用しないことを確
認した。したがって、グルコースが２つ結合したβ‐マ
ルトシド誘導体は２種のエキソ型糖加水分解酵素活性の
測定に最も適した基質であることを見出すとともに、さ
らに試料中にグルコアミラーゼとα‐グルコシダーゼが
含まれる場合、第一の基質として前記β‐マルトシド誘
導体を、第二の基質として特定のα‐グルコシド誘導体
を用いることにより、それぞれの活性を効率よく分別定
量しうることを見出し、この知見に基づいて本発明を完
成するに至った。
達成するために種々研究を重ねた結果、β‐マルトオリ
ゴシド誘導体のうち、グルコースが２つ結合したものを
基質とした場合、２種のエキソ型糖加水分解酵素は、β
‐マルトオリゴシド誘導体のα‐１，４‐グルコシド鎖
を非還元末端より選択的に加水分解し、しかも反応性が
非常に高いが、α‐アミラーゼには作用しないことを確
認した。したがって、グルコースが２つ結合したβ‐マ
ルトシド誘導体は２種のエキソ型糖加水分解酵素活性の
測定に最も適した基質であることを見出すとともに、さ
らに試料中にグルコアミラーゼとα‐グルコシダーゼが
含まれる場合、第一の基質として前記β‐マルトシド誘
導体を、第二の基質として特定のα‐グルコシド誘導体
を用いることにより、それぞれの活性を効率よく分別定
量しうることを見出し、この知見に基づいて本発明を完
成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明は、エキソ型糖加水分解
酵素含有試料に、基質として、一般式
酵素含有試料に、基質として、一般式
【化９】 （式中のＲは発色性有機基である）で表わされるβ‐マ
ルトシド誘導体及びβ‐グルコシダーゼを用いて酵素反
応を行わせ、遊離する発色性物質を定量することを特徴
とするエキソ型糖加水分解酵素活性の測定方法を提供す
るものである。
ルトシド誘導体及びβ‐グルコシダーゼを用いて酵素反
応を行わせ、遊離する発色性物質を定量することを特徴
とするエキソ型糖加水分解酵素活性の測定方法を提供す
るものである。
【００１０】さらに、本発明は、グルコアミラーゼ及び
α‐グルコシダーゼの少なくとも一方を含有する試料
に、第一の基質として、一般式
α‐グルコシダーゼの少なくとも一方を含有する試料
に、第一の基質として、一般式
【化１０】 （式中のＲは発色性有機基である）で表わされるβ‐マ
ルトシド誘導体をβ‐グルコシダーゼの存在下で用い、
第二の基質として、グルコアミラーゼとα‐グルコシダ
ーゼの反応速度比が、第一の基質と異なる性質を有する
一般式
ルトシド誘導体をβ‐グルコシダーゼの存在下で用い、
第二の基質として、グルコアミラーゼとα‐グルコシダ
ーゼの反応速度比が、第一の基質と異なる性質を有する
一般式
【化１１】 （式中のＲ′は発色性有機基である）で表わされるα‐
グルコシド誘導体を用いて、それぞれ酵素反応を行わ
せ、遊離した発色性物質を定量することを特徴とするグ
ルコアミラーゼとα‐グルコシダーゼ活性の分別測定方
法をも提供するものである。ここで、発色性有機基と
は、酵素を作用させたときに光学的に検知しうる発色性
有機化合物となって脱離しうる基を意味する。
グルコシド誘導体を用いて、それぞれ酵素反応を行わ
せ、遊離した発色性物質を定量することを特徴とするグ
ルコアミラーゼとα‐グルコシダーゼ活性の分別測定方
法をも提供するものである。ここで、発色性有機基と
は、酵素を作用させたときに光学的に検知しうる発色性
有機化合物となって脱離しうる基を意味する。
【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。エキソ型
糖加水分解酵素活性を測定するための有利な系として
は、例えば前記一般式（Ｉ）で表わされるβ‐マルトシ
ド誘導体０．２〜２０ｍＭ及び緩衝液２〜３００ｍＭを
含有し、かつ共役酵素としてβ‐グルコシダーゼを０．
５〜３０単位／ｍｌを含有するｐＨ３〜１０の系が挙げ
られる。前記β‐グルコシダーゼは、微生物、植物等い
かなる起源のものを用いてもよく、例えばアーモンドの
種子から得られたものが用いられる。
糖加水分解酵素活性を測定するための有利な系として
は、例えば前記一般式（Ｉ）で表わされるβ‐マルトシ
ド誘導体０．２〜２０ｍＭ及び緩衝液２〜３００ｍＭを
含有し、かつ共役酵素としてβ‐グルコシダーゼを０．
５〜３０単位／ｍｌを含有するｐＨ３〜１０の系が挙げ
られる。前記β‐グルコシダーゼは、微生物、植物等い
かなる起源のものを用いてもよく、例えばアーモンドの
種子から得られたものが用いられる。
【００１２】次に、本発明方法のうち、エキソ型糖加水
分解酵素活性を測定するのに好適な実施態様を説明す
る。まず、エキソ型糖加水分解酵素を含む試料に、共役
酵素としてβ‐グルコシダーゼを０．５〜３０単位／ｍ
ｌ、好ましくは１〜１５単位／ｍｌ加え、これと同時に
又はこれらの後に、前記一般式（Ｉ）で表わされるβ‐
マルトシド誘導体０．２〜２０ｍＭ、好ましくは０．５
〜１０ｍＭを緩衝剤とともに添加したのち、温度２５〜
４５℃、好ましくは３５〜４０℃、ｐＨ３〜１０、好ま
しくは４〜７の条件下で少なくとも１分間、好ましくは
２〜１０分間酵素反応させ、生成した発色性物質の量
を、常法に従いそのままで、あるいは必要に応じ、さら
なる縮合反応、あるいはｐＨを調整したのち、適当な吸
光波長で連続的に又は断続的に吸光度変化量を測定し、
用いた発色性物質の分子吸光係数から酵素活性を算出す
る。
分解酵素活性を測定するのに好適な実施態様を説明す
る。まず、エキソ型糖加水分解酵素を含む試料に、共役
酵素としてβ‐グルコシダーゼを０．５〜３０単位／ｍ
ｌ、好ましくは１〜１５単位／ｍｌ加え、これと同時に
又はこれらの後に、前記一般式（Ｉ）で表わされるβ‐
マルトシド誘導体０．２〜２０ｍＭ、好ましくは０．５
〜１０ｍＭを緩衝剤とともに添加したのち、温度２５〜
４５℃、好ましくは３５〜４０℃、ｐＨ３〜１０、好ま
しくは４〜７の条件下で少なくとも１分間、好ましくは
２〜１０分間酵素反応させ、生成した発色性物質の量
を、常法に従いそのままで、あるいは必要に応じ、さら
なる縮合反応、あるいはｐＨを調整したのち、適当な吸
光波長で連続的に又は断続的に吸光度変化量を測定し、
用いた発色性物質の分子吸光係数から酵素活性を算出す
る。
【００１３】この系に用いられる緩衝剤としては、例え
ばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、グッド緩衝液、ホウ酸
塩、クエン酸塩、β‐グリセロリン酸塩、ジメチルグル
タル酸塩などが挙げられる。
ばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、グッド緩衝液、ホウ酸
塩、クエン酸塩、β‐グリセロリン酸塩、ジメチルグル
タル酸塩などが挙げられる。
【００１４】このような系に、前記成分以外に、本発明
の目的をそこなわない範囲で、さらに必要に応じて慣用
の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定化剤とし
て、グリセリン、牛血清アルブミン、α‐又はβ‐シク
ロデキストリン、トリトンＸ−１００などを加えること
ができる。これらの添加成分は単独で用いてもよいし、
２種以上組み合わせて用いてもよい。これらの成分は前
記系調整の段階で加えることができる。
の目的をそこなわない範囲で、さらに必要に応じて慣用
の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定化剤とし
て、グリセリン、牛血清アルブミン、α‐又はβ‐シク
ロデキストリン、トリトンＸ−１００などを加えること
ができる。これらの添加成分は単独で用いてもよいし、
２種以上組み合わせて用いてもよい。これらの成分は前
記系調整の段階で加えることができる。
【００１５】本発明に用いられるエキソ型糖加水分解酵
素含有試料については、エキソ型糖加水分解酵素活性を
含有するものであればよく、特に制限はないが、具体的
には微生物の固体培養の抽出液及び液体培養液、植物の
抽出液、あるいは動物の体液や組織及びそれらの抽出液
などを用いることができる。含有試料が固体の場合に
は、いったん精製水又は前記したような緩衝液に溶解又
は懸濁させるのがよい。また必要により、不溶物をろ過
などの操作で除去してもよい。
素含有試料については、エキソ型糖加水分解酵素活性を
含有するものであればよく、特に制限はないが、具体的
には微生物の固体培養の抽出液及び液体培養液、植物の
抽出液、あるいは動物の体液や組織及びそれらの抽出液
などを用いることができる。含有試料が固体の場合に
は、いったん精製水又は前記したような緩衝液に溶解又
は懸濁させるのがよい。また必要により、不溶物をろ過
などの操作で除去してもよい。
【００１６】米麹、大豆麹などの抽出液のように、グル
コアミラーゼとα‐グルコシダーゼの両酵素を含む場
合、本発明のうちβ‐マルトシド誘導体のみを基質に用
いた測定では、グルコアミラーゼとα‐グルコシダーゼ
の両酵素の活性値の和が測定値として得られる。このよ
うな場合は、測定結果をそのまま麹の糖化能力（グルコ
ース生成能力）としてもよい。すなわち可溶性デンプン
を基質とする従来のグルコアミラーゼ活性測定法におい
てもα‐グルコシダーゼが混在する場合には、α‐グル
コシダーゼ活性が測定値に含まれていること（平成５年
度日本醸造学会大会講演要旨集、第７ページ）、また、
醸造工程においては麹の糖化能力（グルコース生成能
力）が重要な指標となるからである。さらに、エキソ型
糖加水分解酵素のうち、グルコアミラーゼ活性とα‐グ
ルコシダーゼ活性を分別して定量する場合には、本発明
のうちβ‐マルトシド誘導体とα‐グルコシド誘導体と
を用いた分別定量法を用いてそれぞれの活性を求めれば
よい。
コアミラーゼとα‐グルコシダーゼの両酵素を含む場
合、本発明のうちβ‐マルトシド誘導体のみを基質に用
いた測定では、グルコアミラーゼとα‐グルコシダーゼ
の両酵素の活性値の和が測定値として得られる。このよ
うな場合は、測定結果をそのまま麹の糖化能力（グルコ
ース生成能力）としてもよい。すなわち可溶性デンプン
を基質とする従来のグルコアミラーゼ活性測定法におい
てもα‐グルコシダーゼが混在する場合には、α‐グル
コシダーゼ活性が測定値に含まれていること（平成５年
度日本醸造学会大会講演要旨集、第７ページ）、また、
醸造工程においては麹の糖化能力（グルコース生成能
力）が重要な指標となるからである。さらに、エキソ型
糖加水分解酵素のうち、グルコアミラーゼ活性とα‐グ
ルコシダーゼ活性を分別して定量する場合には、本発明
のうちβ‐マルトシド誘導体とα‐グルコシド誘導体と
を用いた分別定量法を用いてそれぞれの活性を求めれば
よい。
【００１７】次にエキソ型糖加水分解酵素のうちグルコ
アミラーゼとα‐グルコシダーゼの両酵素活性を分別し
て定量する方法について具体的に説明する。まず、活性
既知のグルコアミラーゼとα‐グルコシダーゼを用い
て、あらかじめ先に述べた測定法により第一の基質に対
する反応速度を求める。次いで第二の基質に対する反応
速度を次のように求める。
アミラーゼとα‐グルコシダーゼの両酵素活性を分別し
て定量する方法について具体的に説明する。まず、活性
既知のグルコアミラーゼとα‐グルコシダーゼを用い
て、あらかじめ先に述べた測定法により第一の基質に対
する反応速度を求める。次いで第二の基質に対する反応
速度を次のように求める。
【００１８】すなわち、前記一般式（ＩＩ）で表わされ
るα‐グルコシド誘導体を０．２〜３０ｍＭ、好ましく
は５〜２０ｍＭを緩衝剤とともに添加したのち、温度２
５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、ｐＨ３〜１０、
好ましくは４〜７の条件下で少なくとも１分間、好まし
くは１０〜２０分間酵素反応させ、生成した発色性物質
の量を、常法に従いそのままで、あるいは必要に応じ、
さらなる縮合反応、あるいはｐＨを調整したのち、適当
な吸光波長で連続的に又は断続的に吸光度変化量を測定
し、用いた発色性物質の分子吸光係数から算出する。
るα‐グルコシド誘導体を０．２〜３０ｍＭ、好ましく
は５〜２０ｍＭを緩衝剤とともに添加したのち、温度２
５〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、ｐＨ３〜１０、
好ましくは４〜７の条件下で少なくとも１分間、好まし
くは１０〜２０分間酵素反応させ、生成した発色性物質
の量を、常法に従いそのままで、あるいは必要に応じ、
さらなる縮合反応、あるいはｐＨを調整したのち、適当
な吸光波長で連続的に又は断続的に吸光度変化量を測定
し、用いた発色性物質の分子吸光係数から算出する。
【００１９】第一の基質に対するグルコアミラーゼの反
応速度定数をｋ1、α‐グルコシダーゼの反応速度定数
をｋ2、吸光度の変化量をＡ1、第二の基質に対するグル
コアミラーゼの反応速度定数をｋ3、α‐グルコシダー
ゼの反応速度定数をｋ4、吸光度の変化量をＡ2、試料中
のグルコアミラーゼ活性をＧＬＡ、α‐グルコシダーゼ
活性をＧＬＳとすると、次の関係が成り立つ。
応速度定数をｋ1、α‐グルコシダーゼの反応速度定数
をｋ2、吸光度の変化量をＡ1、第二の基質に対するグル
コアミラーゼの反応速度定数をｋ3、α‐グルコシダー
ゼの反応速度定数をｋ4、吸光度の変化量をＡ2、試料中
のグルコアミラーゼ活性をＧＬＡ、α‐グルコシダーゼ
活性をＧＬＳとすると、次の関係が成り立つ。
【００２０】 Ａ1＝ｋ1・ＧＬＡ＋ｋ2・ＧＬＳ （式１） Ａ2＝ｋ3・ＧＬＡ＋ｋ4・ＧＬＳ （式２） そして、これらの式から、次の式が得られる。
【００２１】
【数１】
【００２２】すなわち、ｋ1、ｋ2、ｋ3及びｋ4をあらか
じめ測定しておけば、式３及び４を用いることにより、
２種の基質を用いて酵素反応を行って測定した吸光度変
化量を代入するだけで、試料中のグルコアミラーゼ活性
及びα‐グルコシダーゼ活性を分別定量することができ
る。
じめ測定しておけば、式３及び４を用いることにより、
２種の基質を用いて酵素反応を行って測定した吸光度変
化量を代入するだけで、試料中のグルコアミラーゼ活性
及びα‐グルコシダーゼ活性を分別定量することができ
る。
【００２３】次に、前記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表
わされるβ‐マルトシド誘導体及びα‐グルコシド誘導
体において、配糖体として還元末端グルコースの１位に
導入されるＲ及びＲ′の芳香族発色基は、分光学的に検
出できればどのようなものでもよいが、例えば次のもの
が挙げられる。
わされるβ‐マルトシド誘導体及びα‐グルコシド誘導
体において、配糖体として還元末端グルコースの１位に
導入されるＲ及びＲ′の芳香族発色基は、分光学的に検
出できればどのようなものでもよいが、例えば次のもの
が挙げられる。
【００２４】
【化１２】
【００２５】（式中のＲ1〜Ｒ5は、それぞれ水素原子、
ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、アリ
ール基、アリル基、スルホン基又はカルボキシル基であ
り、それらはたがいに同一であってもよいし、異なって
いてもよく、またＲ1とＲ2又はＲ2とＲ3とが結合して縮
合芳香環を形成してもよい）
ハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、アリ
ール基、アリル基、スルホン基又はカルボキシル基であ
り、それらはたがいに同一であってもよいし、異なって
いてもよく、またＲ1とＲ2又はＲ2とＲ3とが結合して縮
合芳香環を形成してもよい）
【００２６】
【化１３】 （式中のＲ6は水素原子又はアルキル基である）
【００２７】
【化１４】 （式中のＲ7は水素原子又はハロゲン原子である）
【００２８】
【化１５】 （式中のＲ8〜Ｒ15は、それぞれ水素原子、ハロゲン原
子、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、アリール基、ア
リル基、スルホン基又はカルボキシル基であり、それら
はたがいに同一であってもよいし、異なっていてもよ
く、また、Ｒ8とＲ9又はＲ10とＲ11とが結合して縮合芳
香環を形成してもよく、さらにＲ9とＲ10及び／又はＲ
13とＲ14とが共通の酸素原子となって縮合エーテル環を
形成してもよく、Ｚは窒素原子又はＮ→Ｏである）
子、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、アリール基、ア
リル基、スルホン基又はカルボキシル基であり、それら
はたがいに同一であってもよいし、異なっていてもよ
く、また、Ｒ8とＲ9又はＲ10とＲ11とが結合して縮合芳
香環を形成してもよく、さらにＲ9とＲ10及び／又はＲ
13とＲ14とが共通の酸素原子となって縮合エーテル環を
形成してもよく、Ｚは窒素原子又はＮ→Ｏである）
【００２９】したがって、前記一般式（１）で表わされ
る化合物としては、例えば２‐クロロ‐４‐ニトロフェ
ニル＝β‐マルトシド、４‐ニトロフェニル＝β‐マル
トシド、２‐フルオロ‐４‐ニトロフェニル＝β‐マル
トシド、フェノールインド‐３′‐クロロフェニル＝β
‐マルトシド、レザズリニル＝β‐マルトシド、４‐ア
ミノフェニル＝β‐マルトシド、４‐メチルウンベリフ
ェロニル＝β‐マルトシド、ルシフェリニル＝β‐マル
トシド、一般式（ＩＶ）で表わされる化合物としては４
‐ニトロフェニル＝α‐Ｄ‐グルコシド、２‐クロロ‐
４‐ニトロフェニル＝α‐Ｄ‐グルコシド、４‐アミノ
フェニル＝α‐Ｄ‐グルコシド、４‐メチルウンベリフ
ェロニル＝α‐Ｄ‐グルコシド、フェノールインドフェ
ニル＝α‐Ｄ‐グルコシドなどが挙げられる。
る化合物としては、例えば２‐クロロ‐４‐ニトロフェ
ニル＝β‐マルトシド、４‐ニトロフェニル＝β‐マル
トシド、２‐フルオロ‐４‐ニトロフェニル＝β‐マル
トシド、フェノールインド‐３′‐クロロフェニル＝β
‐マルトシド、レザズリニル＝β‐マルトシド、４‐ア
ミノフェニル＝β‐マルトシド、４‐メチルウンベリフ
ェロニル＝β‐マルトシド、ルシフェリニル＝β‐マル
トシド、一般式（ＩＶ）で表わされる化合物としては４
‐ニトロフェニル＝α‐Ｄ‐グルコシド、２‐クロロ‐
４‐ニトロフェニル＝α‐Ｄ‐グルコシド、４‐アミノ
フェニル＝α‐Ｄ‐グルコシド、４‐メチルウンベリフ
ェロニル＝α‐Ｄ‐グルコシド、フェノールインドフェ
ニル＝α‐Ｄ‐グルコシドなどが挙げられる。
【００３０】本発明の前記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で
表わされるβ‐マルトシド誘導体やα‐グルコシド誘導
体を製造するためには、どのような方法を用いてもよい
が、例えば酸化銀を用いたフェノール類のグリコシル化
反応（特開昭６２−２８３９８９号公報）や、「Ｃｈｅ
ｍ．Ｂｅｒ．」第６６巻、第３７８ページ（１９３３
年）に記載の方法によって製造することができる。
表わされるβ‐マルトシド誘導体やα‐グルコシド誘導
体を製造するためには、どのような方法を用いてもよい
が、例えば酸化銀を用いたフェノール類のグリコシル化
反応（特開昭６２−２８３９８９号公報）や、「Ｃｈｅ
ｍ．Ｂｅｒ．」第６６巻、第３７８ページ（１９３３
年）に記載の方法によって製造することができる。
【００３１】本発明においては、前記一般式（Ｉ）で表
わされるβ‐マルトシド誘導体として、一般式
わされるβ‐マルトシド誘導体として、一般式
【化１６】 （式中のＸ1及びＸ2は、それぞれ水素原子、ハロゲン原
子、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、スルホン基又は
カルボキシル基であり、それらはたがいに同一であって
もよいし、異なっていてもよい）で表わされるものを用
いるのが、水に対する溶解性が大きい点から好ましく、
特に一般式
子、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、スルホン基又は
カルボキシル基であり、それらはたがいに同一であって
もよいし、異なっていてもよい）で表わされるものを用
いるのが、水に対する溶解性が大きい点から好ましく、
特に一般式
【化１７】 （式中のＸ1は前記と同じ意味をもつ）で表わされるも
のは、大きな分子吸光係数が得られるので、好適であ
る。また、前記一般式（ＩＩ）で表わされるα‐グルコ
シド誘導体としては、前記と同様に水に対する溶解度が
大きいという理由により、一般式
のは、大きな分子吸光係数が得られるので、好適であ
る。また、前記一般式（ＩＩ）で表わされるα‐グルコ
シド誘導体としては、前記と同様に水に対する溶解度が
大きいという理由により、一般式
【化１８】 （式中のＸ3及びＸ4は、それぞれ水素原子、ハロゲン原
子、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、スルホン基又は
カルボキシル基であり、それらはたがいに同一であって
もよいし、異なっていてもよい）で表わされるものが好
適であり、特に一般式
子、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、スルホン基又は
カルボキシル基であり、それらはたがいに同一であって
もよいし、異なっていてもよい）で表わされるものが好
適であり、特に一般式
【化１９】 （式中のＸ3は前記と同じ意味をもつ）で表わされるも
のは大きな分子吸光係数が得られるので好ましい。
のは大きな分子吸光係数が得られるので好ましい。
【００３２】
【発明の効果】本発明において用いられるβ‐マルトシ
ド誘導体は水解速度が速く、エキソ型糖加水分解酵素に
よって切断される部位が１カ所であるという特徴をも
ち、エキソ型糖加水分解酵素活性測定用基質として極め
て有用であり、このものを用いることにより、試料中に
含まれるグルコース、α‐アミラーゼの影響を受けるこ
となく、エキソ型糖加水分解酵素活性を自動分析法、用
手法などにより、精度よく短時間で容易に測定すること
ができる。
ド誘導体は水解速度が速く、エキソ型糖加水分解酵素に
よって切断される部位が１カ所であるという特徴をも
ち、エキソ型糖加水分解酵素活性測定用基質として極め
て有用であり、このものを用いることにより、試料中に
含まれるグルコース、α‐アミラーゼの影響を受けるこ
となく、エキソ型糖加水分解酵素活性を自動分析法、用
手法などにより、精度よく短時間で容易に測定すること
ができる。
【００３３】また、試料中にグルコアミラーゼとα‐グ
ルコシダーゼの両酵素が含まれる場合、前記β‐マルト
シド誘導体、及びグルコアミラーゼとα‐グルコシダー
ゼの反応速度比が、該β‐マルトシド誘導体と異なる性
質を有するα‐グルコシド誘導体を用いることにより、
両酵素活性を効率よく分別定量することができる。
ルコシダーゼの両酵素が含まれる場合、前記β‐マルト
シド誘導体、及びグルコアミラーゼとα‐グルコシダー
ゼの反応速度比が、該β‐マルトシド誘導体と異なる性
質を有するα‐グルコシド誘導体を用いることにより、
両酵素活性を効率よく分別定量することができる。
【００３４】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定さ
れるものではない。
明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定さ
れるものではない。
【００３５】実施例１ エキソ型糖加水分解酵素活性の
測定試薬の調製 （１）β‐マルトシド誘導体基質液の調製 ２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル Ｏ‐α‐Ｄ‐グルコ
ピラノシル‐（１→４）‐β‐Ｄ‐グルコピラノシド
（以下、Ｇ２‐Ｎと略記する）を１０ｍＭの濃度になる
ように、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）に溶解
した。
測定試薬の調製 （１）β‐マルトシド誘導体基質液の調製 ２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル Ｏ‐α‐Ｄ‐グルコ
ピラノシル‐（１→４）‐β‐Ｄ‐グルコピラノシド
（以下、Ｇ２‐Ｎと略記する）を１０ｍＭの濃度になる
ように、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）に溶解
した。
【００３６】（２）共役酵素液の調製 アーモンド由来のβ‐グルコシダーゼを１４Ｕ／ｍｌの
濃度になるように１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．
０）に混合して溶解した。なお、これら市販のβ‐グル
コシダーゼは東洋紡績（株）製を使用した。
濃度になるように１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．
０）に混合して溶解した。なお、これら市販のβ‐グル
コシダーゼは東洋紡績（株）製を使用した。
【００３７】実施例２ グルコアミラーゼ活性の測定 （１）β‐マルトシド誘導体基質液の調製 Ｇ２‐Ｎを１０ｍＭの濃度になるように、１００ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）に溶解した。
酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）に溶解した。
【００３８】（２）共役酵素液の調製 アーモンド由来のβ‐グルコシダーゼを１４Ｕ／ｍｌの
濃度になるように１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．
０）に混合して溶解した。なお、これら市販のβ‐グル
コシダーゼは東洋紡績（株）製を使用した。
濃度になるように１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．
０）に混合して溶解した。なお、これら市販のβ‐グル
コシダーゼは東洋紡績（株）製を使用した。
【００３９】（３）標品グルコアミラーゼ液の調製 アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅ）の液体培養液からイオン交換クロマトグ
ラフィー及びゲルろ過を用いて得られた精製グルコアミ
ラーゼを１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）にて適
宜希釈して用いた。また、グルコアミラーゼの活性は、
４０℃、６０分間に１ｍｇのグルコースを遊離する酵素
量を１単位（Ｕ）として定義した。測定法は、注釈編集
委員会編「第四回改正国税庁所定分析法注解」第２１３
ページ、日本醸造協会（１９９３年）に従った。
ｏｒｙｚａｅ）の液体培養液からイオン交換クロマトグ
ラフィー及びゲルろ過を用いて得られた精製グルコアミ
ラーゼを１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）にて適
宜希釈して用いた。また、グルコアミラーゼの活性は、
４０℃、６０分間に１ｍｇのグルコースを遊離する酵素
量を１単位（Ｕ）として定義した。測定法は、注釈編集
委員会編「第四回改正国税庁所定分析法注解」第２１３
ページ、日本醸造協会（１９９３年）に従った。
【００４０】（４）反応操作 基質液５００μｌと共役酵素液５００μｌを混合し、３
７℃で５分間予備加温する。ここに標品グルコアミラー
ゼ液５０μｌを加えて反応を開始する。３７℃で正確に
１０分間反応させたのち、０．２Ｍ−Ｎａ2ＣＯ3溶液を
５００μｌ加え反応を停止する。この液の４００ｎｍに
おける吸光度を測定した。ブランクは基質と共役酵素の
混合液を３７℃で１０分放置後、０．２Ｍ‐Ｎａ2ＣＯ3
溶液を５００μｌ加えて混合し、次いで標品グルコアミ
ラーゼ液を加えた。以下同様に吸光度を測定した。
７℃で５分間予備加温する。ここに標品グルコアミラー
ゼ液５０μｌを加えて反応を開始する。３７℃で正確に
１０分間反応させたのち、０．２Ｍ−Ｎａ2ＣＯ3溶液を
５００μｌ加え反応を停止する。この液の４００ｎｍに
おける吸光度を測定した。ブランクは基質と共役酵素の
混合液を３７℃で１０分放置後、０．２Ｍ‐Ｎａ2ＣＯ3
溶液を５００μｌ加えて混合し、次いで標品グルコアミ
ラーゼ液を加えた。以下同様に吸光度を測定した。
【００４１】（５）活性の計算 得られた吸光度から、この基質における活性を以下のよ
うに求めた。
うに求めた。
【００４２】
【数２】
【００４３】ただし、Ｕは３７℃で１分間に１μｍｏｌ
の２‐クロロ‐４‐ニトロフェノールを遊離する酵素
量、ΔＡは酵素試料の吸光度からブランクの吸光度を引
いた値、Ｖｔは反応液量、ｄｆは試料の希釈倍、εは２
‐クロロ‐４‐ニトロフェノールの分子吸光係数（１
７．３ｃｍ2／μｍｏｌ）、Ｖｓは酵素試料の液量、ｔ
は反応時間（分）とした。
の２‐クロロ‐４‐ニトロフェノールを遊離する酵素
量、ΔＡは酵素試料の吸光度からブランクの吸光度を引
いた値、Ｖｔは反応液量、ｄｆは試料の希釈倍、εは２
‐クロロ‐４‐ニトロフェノールの分子吸光係数（１
７．３ｃｍ2／μｍｏｌ）、Ｖｓは酵素試料の液量、ｔ
は反応時間（分）とした。
【００４４】（６）反応のタイムコース 標品グルコアミラーゼを用いて反応を行わせ、吸光度を
測定したものを図１に示す。この図から、この条件にお
いて少なくとも１５分間は直線性が保たれることが分
る。
測定したものを図１に示す。この図から、この条件にお
いて少なくとも１５分間は直線性が保たれることが分
る。
【００４５】（７）反応の直線性 各濃度の標品グルコアミラーゼを用いて反応を行わせ、
吸光度の増加量（ΔＯＤ）を測定したものを図２に示
す。この図からグルコアミラーゼの濃度と吸光度の増加
量は良好な直線関係を示すことが分る。
吸光度の増加量（ΔＯＤ）を測定したものを図２に示
す。この図からグルコアミラーゼの濃度と吸光度の増加
量は良好な直線関係を示すことが分る。
【００４６】（８）グルコアミラーゼ活性の測定 標品グルコアミラーゼを本発明方法と従来法で測定した
結果を図３に示す。図中の本法とはＧ２‐Ｎを基質とし
た測定法を示し、従来法とは可溶性デンプンを基質と
し、前記「第四回改正国税庁所定分析法注解」の方法で
測定した結果である。この図から、本発明方法と従来法
との間には高い相関関係が認められる。
結果を図３に示す。図中の本法とはＧ２‐Ｎを基質とし
た測定法を示し、従来法とは可溶性デンプンを基質と
し、前記「第四回改正国税庁所定分析法注解」の方法で
測定した結果である。この図から、本発明方法と従来法
との間には高い相関関係が認められる。
【００４７】（９）グルコース濃度の影響 標品グルコアミラーゼにグルコースを添加し、グルコー
ス濃度が０〜２２ｇ／リットルとなったものを酵素試料
として、反応を行った。結果を図４に示す。この図から
少なくとも試料中のグルコース濃度が２２ｇ／ｌまでは
測定値に影響を与えないことが分る。
ス濃度が０〜２２ｇ／リットルとなったものを酵素試料
として、反応を行った。結果を図４に示す。この図から
少なくとも試料中のグルコース濃度が２２ｇ／ｌまでは
測定値に影響を与えないことが分る。
【００４８】（１０）Ｋｍ値の測定 標品グルコアミラーゼを用いて、Ｇ２‐Ｎに対するＫｍ
値を測定したところ、０．０４２９ｍＭであった。
値を測定したところ、０．０４２９ｍＭであった。
【００４９】実施例３ エキソ型糖加水分解酵素活性の
測定試薬の調製 （１）β‐マルトシド誘導体基質液の調製 実施例１の（１）と同様にＧ２‐Ｎを１ｍＭの濃度にな
るように溶解した。 （２）共役酵素液の調製 実施例１の（２）と同様に調製した。
測定試薬の調製 （１）β‐マルトシド誘導体基質液の調製 実施例１の（１）と同様にＧ２‐Ｎを１ｍＭの濃度にな
るように溶解した。 （２）共役酵素液の調製 実施例１の（２）と同様に調製した。
【００５０】実施例４ α‐グルコシダーゼ液の測定 （１）β‐マルトシド誘導体基質液の調製 実施例１の（１）と同様にＧ２‐Ｎを１ｍＭの濃度にな
るように溶解した。 （２）共役酵素液の調製 実施例１の（２）と同様に調製した。 （３）標品α‐グルコシダーゼ液の調製 アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅ）の固体培養抽出液からイオン交換クロマ
トグラフィーを用いて得られた精製α‐グルコシダーゼ
を１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）にて適宜希釈
して用いた。
るように溶解した。 （２）共役酵素液の調製 実施例１の（２）と同様に調製した。 （３）標品α‐グルコシダーゼ液の調製 アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅ）の固体培養抽出液からイオン交換クロマ
トグラフィーを用いて得られた精製α‐グルコシダーゼ
を１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）にて適宜希釈
して用いた。
【００５１】（４）反応操作 （イ）Ｇ２‐Ｎを基質とした反応 実施例２の（４）と同様に行った。 （ロ）４‐ニトロフェニル＝α‐Ｄ‐グルコシド（以
下、ＰＮＰ‐Ｇとする）を基質とした反応 ＰＮＰ‐Ｇを基質として、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＶＩＩＩ」第５５９ページ、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９６６年）の測定法に従
い、α‐グルコシダーゼ活性を測定した。なお、ＰＮＰ
‐Ｇはナカライテスク社製のものを用いた。 （５）活性の計算 （イ）Ｇ２‐Ｎを基質とした場合の活性 実施例２の（５）と同様にして、この基質における活性
を求めた。 （ロ）ＰＮＰ‐Ｇを基質とした場合の活性 活性の定義は、３７℃、１分間に１μｍｏｌのパラニト
ロフェノールを遊離する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
下、ＰＮＰ‐Ｇとする）を基質とした反応 ＰＮＰ‐Ｇを基質として、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＶＩＩＩ」第５５９ページ、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９６６年）の測定法に従
い、α‐グルコシダーゼ活性を測定した。なお、ＰＮＰ
‐Ｇはナカライテスク社製のものを用いた。 （５）活性の計算 （イ）Ｇ２‐Ｎを基質とした場合の活性 実施例２の（５）と同様にして、この基質における活性
を求めた。 （ロ）ＰＮＰ‐Ｇを基質とした場合の活性 活性の定義は、３７℃、１分間に１μｍｏｌのパラニト
ロフェノールを遊離する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００５２】（６）反応の直線性 Ｇ２‐Ｎを基質として標品α‐グルコシダーゼを用いて
反応を行わせ、吸光度を測定したものを図５に示す。こ
の図からα‐グルコシダーゼ濃度と吸光度は良好な直線
関係を示すことが分る。 （７）α‐グルコシダーゼ活性の測定 標品α‐グルコシダーゼを本発明方法と従来法で測定し
た結果を図６に示す。図中の本法（本発明法）とはＧ２
‐Ｎを基質とした測定法を示し、従来法とはＰＮＰ‐Ｇ
を基質とし、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，ＶＩＩＩ」第５５９ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ（１９６６年）の方法で測定した結果であ
る。 （８）Ｋｍ値の測定 標品α‐グルコシダーゼを用いて、Ｇ２‐Ｎに対するＫ
ｍ値を測定したところ、０．０９５９ｍＭであった。
反応を行わせ、吸光度を測定したものを図５に示す。こ
の図からα‐グルコシダーゼ濃度と吸光度は良好な直線
関係を示すことが分る。 （７）α‐グルコシダーゼ活性の測定 標品α‐グルコシダーゼを本発明方法と従来法で測定し
た結果を図６に示す。図中の本法（本発明法）とはＧ２
‐Ｎを基質とした測定法を示し、従来法とはＰＮＰ‐Ｇ
を基質とし、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ，ＶＩＩＩ」第５５９ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ（１９６６年）の方法で測定した結果であ
る。 （８）Ｋｍ値の測定 標品α‐グルコシダーゼを用いて、Ｇ２‐Ｎに対するＫ
ｍ値を測定したところ、０．０９５９ｍＭであった。
【００５３】実施例５ グルコアミラーゼ活性の測定 （１）基質液の調製 ４‐ニトロフェニル Ｏ‐α‐Ｄ‐グルコピラノシル‐
β‐Ｄ‐グルコピラノシド(以下、Ｇ２‐ＰＮＰと略記
する）を１０ｍＭの濃度になるように、１００ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ＝４．０）に溶解した。 （２）共役酵素液の調製 実施例２の（２）と同様にして共役酵素液を調製した。 （３）試料の調製 実施例２の（３）と同様の標品グルコアミラーゼを用い
た。試料は１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を用
いて、適宜希釈した。 （４）反応操作 実施例２の（４）と同様にして反応を行った。 （５）測定結果 測定結果を図７に示す。この図からグルコアミラーゼ濃
度と吸光度の増加量は良好な直線関係を示すことが分
る。
β‐Ｄ‐グルコピラノシド(以下、Ｇ２‐ＰＮＰと略記
する）を１０ｍＭの濃度になるように、１００ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ＝４．０）に溶解した。 （２）共役酵素液の調製 実施例２の（２）と同様にして共役酵素液を調製した。 （３）試料の調製 実施例２の（３）と同様の標品グルコアミラーゼを用い
た。試料は１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）を用
いて、適宜希釈した。 （４）反応操作 実施例２の（４）と同様にして反応を行った。 （５）測定結果 測定結果を図７に示す。この図からグルコアミラーゼ濃
度と吸光度の増加量は良好な直線関係を示すことが分
る。
【００５４】実施例６ 麹抽出液中のエキソ型糖加水分
解酵素活性の測定 （１）基質液の調製 実施例２の（１）と同様にして基質液を調製した。基質
濃度は１０ｍＭとした。 （２）共役酵素の調製 実施例２の（２）と同様にして共役酵素を調製した。 （３）試料の調製 １２種類の米麹を１０ｇずつ秤量し、０．５重量％‐Ｎ
ａＣｌを含有する１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）
を５０ｍｌ加えて、室温で３時間ときどき振りまぜなが
ら浸出したのちろ過する。これを透析前の抽出液とし
た。さらにろ過液１０ｍｌを透析膜に入れ、１０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）に対して５℃で一晩透析した
のち、水にて２０ｍｌとした。これを透析後の抽出液と
した。 （４）反応操作 実施例２の（４）と同様にして反応を行った。 （５）活性の計算 実施例２の（５）と同様にして活性の計算を実施した。 （６）測定結果 麹抽出液の透析前と透析後のものを、それぞれ酵素試料
として測定した結果を、図８に示す。この図から本発明
方法によると透析処理を行うことなく試料に含まれるエ
キソ型糖加水分解酵素活性を測定しうることが分る。
解酵素活性の測定 （１）基質液の調製 実施例２の（１）と同様にして基質液を調製した。基質
濃度は１０ｍＭとした。 （２）共役酵素の調製 実施例２の（２）と同様にして共役酵素を調製した。 （３）試料の調製 １２種類の米麹を１０ｇずつ秤量し、０．５重量％‐Ｎ
ａＣｌを含有する１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）
を５０ｍｌ加えて、室温で３時間ときどき振りまぜなが
ら浸出したのちろ過する。これを透析前の抽出液とし
た。さらにろ過液１０ｍｌを透析膜に入れ、１０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）に対して５℃で一晩透析した
のち、水にて２０ｍｌとした。これを透析後の抽出液と
した。 （４）反応操作 実施例２の（４）と同様にして反応を行った。 （５）活性の計算 実施例２の（５）と同様にして活性の計算を実施した。 （６）測定結果 麹抽出液の透析前と透析後のものを、それぞれ酵素試料
として測定した結果を、図８に示す。この図から本発明
方法によると透析処理を行うことなく試料に含まれるエ
キソ型糖加水分解酵素活性を測定しうることが分る。
【００５５】実施例７ 分別定量試験 活性既知のグルコアミラーゼ標品及びα‐グルコシダー
ゼ標品を種々の割合で混合し、Ｇ２‐Ｎを第一の基質、
ＰＮＰ‐Ｇを第二の基質とした場合について、混合割合
に基づいて得られた理論値と、式３及び４から算出され
る計算値との適合性を調べた。
ゼ標品を種々の割合で混合し、Ｇ２‐Ｎを第一の基質、
ＰＮＰ‐Ｇを第二の基質とした場合について、混合割合
に基づいて得られた理論値と、式３及び４から算出され
る計算値との適合性を調べた。
【００５６】（１）Ｇ２‐Ｎを用いた測定 実施例２と同様にして、基質液、共役酵素を調製し、測
定を行った。ただし、反応停止の際に添加する０．２Ｍ
‐Ｎａ2ＣＯ3溶液は１０００μｌとした。これにより、
活性は次のようにして計算した。 Ｕ／ｍｌ＝ΔＡ×０．２３７×ｄｆ （２）ＰＮＰ‐Ｇを用いた測定 実施例４と同様にして、基質液を調製し、測定を行っ
た。 （３）測定結果 （イ）反応速度定数の算出 標品グルコアミラーゼを用いてＧ２‐Ｎ及びＰＮＰ‐Ｇ
を基質としたときの吸光度増加量と酵素活性から、 ｋ1＝４．２２（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） ｋ3＝０（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） が得られた。ここでのグルコアミラーゼ活性値はＧ２‐
Ｎを基質としたときの活性を用いた。
定を行った。ただし、反応停止の際に添加する０．２Ｍ
‐Ｎａ2ＣＯ3溶液は１０００μｌとした。これにより、
活性は次のようにして計算した。 Ｕ／ｍｌ＝ΔＡ×０．２３７×ｄｆ （２）ＰＮＰ‐Ｇを用いた測定 実施例４と同様にして、基質液を調製し、測定を行っ
た。 （３）測定結果 （イ）反応速度定数の算出 標品グルコアミラーゼを用いてＧ２‐Ｎ及びＰＮＰ‐Ｇ
を基質としたときの吸光度増加量と酵素活性から、 ｋ1＝４．２２（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） ｋ3＝０（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） が得られた。ここでのグルコアミラーゼ活性値はＧ２‐
Ｎを基質としたときの活性を用いた。
【００５７】次に、標品α‐グルコシダーゼを用いてＧ
２‐Ｎ及びＰＮＰ‐Ｇを基質としたときの吸光度増加量
と酵素活性を測定したところ、 ｋ2＝２０．５１（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） ｋ4＝３３．９（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） が得られた。ここでのα‐グルコシダーゼ活性値はＰＮ
Ｐ‐Ｇを基質としたときの活性を用いた。
２‐Ｎ及びＰＮＰ‐Ｇを基質としたときの吸光度増加量
と酵素活性を測定したところ、 ｋ2＝２０．５１（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） ｋ4＝３３．９（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） が得られた。ここでのα‐グルコシダーゼ活性値はＰＮ
Ｐ‐Ｇを基質としたときの活性を用いた。
【００５８】（ロ）グルコアミラーゼ活性 混合前のグルコアミラーゼ活性から求めた値を理論活性
値とし、（イ）で得られた反応速度定数を（式３）に代
入して算出される値を計算活性値として求めた。これら
の値の関係を図９に示す。この図から理論活性値と計算
活性値がよく一致していることが分る。 （ハ）α‐グルコシダーゼ活性 ＰＮＰ‐Ｇを基質とした場合、グルコアミラーゼは全く
作用しなかった（ｋ3＝０）。すなわちＰＮＰ‐Ｇを用
いて測定した結果がα‐グルコシダーゼ活性を示した。
値とし、（イ）で得られた反応速度定数を（式３）に代
入して算出される値を計算活性値として求めた。これら
の値の関係を図９に示す。この図から理論活性値と計算
活性値がよく一致していることが分る。 （ハ）α‐グルコシダーゼ活性 ＰＮＰ‐Ｇを基質とした場合、グルコアミラーゼは全く
作用しなかった（ｋ3＝０）。すなわちＰＮＰ‐Ｇを用
いて測定した結果がα‐グルコシダーゼ活性を示した。
【００５９】実施例８ 分別定量試験 グルコアミラーゼ標品及びα‐グルコシダーゼ標品を適
宜希釈し、Ｇ２‐Ｎを第一の基質、２‐クロロ‐４‐ニ
トロフェニル＝α‐Ｄ‐グルコピラノシド（以下、Ｎ‐
Ｇと略記する）を第二の基質とした場合について、それ
ぞれの反応速度を調べた。 （１）Ｇ２‐Ｎを用いた測定 実施例２と同様にして、基質液、共役酵素を調製し、測
定を行った。 （２）Ｎ‐Ｇを用いた測定 （イ）基質液の調製 Ｎ‐Ｇを１０ｍＭの濃度になるように、１００ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ＝４．０）に溶解した。
宜希釈し、Ｇ２‐Ｎを第一の基質、２‐クロロ‐４‐ニ
トロフェニル＝α‐Ｄ‐グルコピラノシド（以下、Ｎ‐
Ｇと略記する）を第二の基質とした場合について、それ
ぞれの反応速度を調べた。 （１）Ｇ２‐Ｎを用いた測定 実施例２と同様にして、基質液、共役酵素を調製し、測
定を行った。 （２）Ｎ‐Ｇを用いた測定 （イ）基質液の調製 Ｎ‐Ｇを１０ｍＭの濃度になるように、１００ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ＝４．０）に溶解した。
【００６０】（ロ）反応操作 基質液５００μｌを３７℃で５分間予備加温する。ここ
に標品グルコアミラーゼ液又は標品α‐グルコシダーゼ
液２５μｌを加えて反応を開始する。３７℃で正確に１
０分間反応させたのち、０．２Ｍ‐Ｎａ2ＣＯ3溶液を５
００μｌ加え反応を停止する。この液の４００ｎｍにお
ける吸光度を測定した。ブランクは基質と共役酵素の混
合液を３７℃で１０分放置後、０．２Ｍ‐Ｎａ2ＣＯ3溶
液を５００μｌ加えて混合し、次いで標品グルコアミラ
ーゼ液又は標品α‐グルコシダーゼ液を加えた。以下同
様に吸光度を測定した。 （３）活性の計算 得られた吸光度から、この基質における活性を以下のよ
うに求めた。
に標品グルコアミラーゼ液又は標品α‐グルコシダーゼ
液２５μｌを加えて反応を開始する。３７℃で正確に１
０分間反応させたのち、０．２Ｍ‐Ｎａ2ＣＯ3溶液を５
００μｌ加え反応を停止する。この液の４００ｎｍにお
ける吸光度を測定した。ブランクは基質と共役酵素の混
合液を３７℃で１０分放置後、０．２Ｍ‐Ｎａ2ＣＯ3溶
液を５００μｌ加えて混合し、次いで標品グルコアミラ
ーゼ液又は標品α‐グルコシダーゼ液を加えた。以下同
様に吸光度を測定した。 （３）活性の計算 得られた吸光度から、この基質における活性を以下のよ
うに求めた。
【数３】 ただし、Ｕは３７℃で１分間に１μｍｏｌの２‐クロロ
‐４‐ニトロフェノールを遊離する酵素量、ΔＡは酵素
試料の吸光度からブランクの吸光度を引いた値、Ｖｔは
反応液量、ｄｆは試料の希釈倍、εは２‐クロロ‐４‐
ニトロフェノールの分子吸光係数（１７．３ｃｍ2／μ
ｍｏｌ）、Ｖｓは酵素試料の液量、ｔは反応時間（分）
とした。
‐４‐ニトロフェノールを遊離する酵素量、ΔＡは酵素
試料の吸光度からブランクの吸光度を引いた値、Ｖｔは
反応液量、ｄｆは試料の希釈倍、εは２‐クロロ‐４‐
ニトロフェノールの分子吸光係数（１７．３ｃｍ2／μ
ｍｏｌ）、Ｖｓは酵素試料の液量、ｔは反応時間（分）
とした。
【００６１】（４）測定結果 標品グルコアミラーゼを用いてＧ２‐Ｎ及びＮ‐Ｇを基
質としたときの吸光度増加量と酵素活性から、 ｋ1＝４．２２（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） ｋ3＝０．５１４（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） が得られた。ここでのグルコアミラーゼ活性値はＧ２‐
Ｎを基質としたときの活性を用いた。次に、標品α‐グ
ルコシダーゼを用いてＧ２‐Ｎ及びＮ‐Ｇを基質とした
ときの吸光度増加量と酵素活性を測定したところ、 ｋ2＝２０．５１（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） ｋ4＝１１９．４９（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） が得られた。ここでのα‐グルコシダーゼ活性値はＰＮ
Ｐ‐Ｇを基質としたときの活性を用いた。以下に参考例
を示す。
質としたときの吸光度増加量と酵素活性から、 ｋ1＝４．２２（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） ｋ3＝０．５１４（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） が得られた。ここでのグルコアミラーゼ活性値はＧ２‐
Ｎを基質としたときの活性を用いた。次に、標品α‐グ
ルコシダーゼを用いてＧ２‐Ｎ及びＮ‐Ｇを基質とした
ときの吸光度増加量と酵素活性を測定したところ、 ｋ2＝２０．５１（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） ｋ4＝１１９．４９（ΔＯＤ・ｍｌ／Ｕ） が得られた。ここでのα‐グルコシダーゼ活性値はＰＮ
Ｐ‐Ｇを基質としたときの活性を用いた。以下に参考例
を示す。
【００６２】参考例１ Ｇ２‐Ｎの製造 市販のマルトース・１水和物［和光純薬（株）製］１
０．０ｇ（２７．８ｍｍｏｌ）をピリジン２００ｍｌに
溶解し、無水酢酸１００ｍｌ（１．０６ｍｏｌ）を加
え、室温で２日間反応させたのち、反応液のピリジン、
無水酢酸、酢酸を留去した。次いでクロマトグラフィー
などの精製を行うことなく、この残渣をジクロロメタン
１００ｍｌに溶解し、三臭化リン２．６４ｍｌ（２７．
８ｍｍｏｌ）、及び水１．００ｍｌ（５５．５ｍｍｏ
ｌ）を加え、室温で１０時間かきまぜながら反応させ
た。次いで反応液に無水炭酸カリウム２６．９ｇ（１９
５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間かきまぜながら反
応させた。不溶物をグラスフィルターでろ別し、これを
ジクロロメタン３００ｍｌで３回洗った。ろ液と洗液を
合わせてここに含まれるジクロロメタンを留去した。次
いでクロマトグラフィーなどの精製を行うことなく、得
られた残渣をアセトニトリル１００ｍｌに溶解し、２‐
クロロ‐４‐ニトロフェノール１４．５ｇ（８３．６ｍ
ｍｏｌ）を加えたのち、さらに酸化銀（Ａｇ2Ｏ）１
９．４ｇ（８３．６ｍｍｏｌ）を加え、３５℃で１７時
間かきまぜながら反応させた。次いで反応液をグラスフ
ィルターでろ別し、これをジクロロメタン２００ｍｌで
３回洗った。ろ液と洗液を合わせて減圧下濃縮し、この
ろ液に含まれるアセトニトリルとジクロロメタンを留去
した。その残渣にジクロロメタン１．０リットルを加
え、綿栓ろ過したのち、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶
液５００ｍｌで１回、飽和食塩水でそれぞれ５００ｍｌ
で３回洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウム２０ｇを加え
て乾燥し、綿栓ろ過したのち減圧下濃縮し、ここに含ま
れるジクロロメタンを留去した。精製することなくその
残渣をメタノール２００ｍｌ、２８重量％アンモニア水
１００ｍｌ、水５０ｍｌの混液に懸濁し、３５℃で２０
時間かきまぜながら反応させた。次いで反応液を減圧下
濃縮し、ここに含まれる水、及びメタノールを留去し
た。得られた残渣をＯＤＳゲルカラムクロマトグラフィ
ーにより精製し、アセトニトリル‐水混液（容量比１：
４）で溶出した目的区分を濃縮し、水から再結晶して目
的のＧ２‐Ｎを５．８１ｇ（１１．７ｍｍｏｌ、４工程
通算収率４２％）得た。
０．０ｇ（２７．８ｍｍｏｌ）をピリジン２００ｍｌに
溶解し、無水酢酸１００ｍｌ（１．０６ｍｏｌ）を加
え、室温で２日間反応させたのち、反応液のピリジン、
無水酢酸、酢酸を留去した。次いでクロマトグラフィー
などの精製を行うことなく、この残渣をジクロロメタン
１００ｍｌに溶解し、三臭化リン２．６４ｍｌ（２７．
８ｍｍｏｌ）、及び水１．００ｍｌ（５５．５ｍｍｏ
ｌ）を加え、室温で１０時間かきまぜながら反応させ
た。次いで反応液に無水炭酸カリウム２６．９ｇ（１９
５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間かきまぜながら反
応させた。不溶物をグラスフィルターでろ別し、これを
ジクロロメタン３００ｍｌで３回洗った。ろ液と洗液を
合わせてここに含まれるジクロロメタンを留去した。次
いでクロマトグラフィーなどの精製を行うことなく、得
られた残渣をアセトニトリル１００ｍｌに溶解し、２‐
クロロ‐４‐ニトロフェノール１４．５ｇ（８３．６ｍ
ｍｏｌ）を加えたのち、さらに酸化銀（Ａｇ2Ｏ）１
９．４ｇ（８３．６ｍｍｏｌ）を加え、３５℃で１７時
間かきまぜながら反応させた。次いで反応液をグラスフ
ィルターでろ別し、これをジクロロメタン２００ｍｌで
３回洗った。ろ液と洗液を合わせて減圧下濃縮し、この
ろ液に含まれるアセトニトリルとジクロロメタンを留去
した。その残渣にジクロロメタン１．０リットルを加
え、綿栓ろ過したのち、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶
液５００ｍｌで１回、飽和食塩水でそれぞれ５００ｍｌ
で３回洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウム２０ｇを加え
て乾燥し、綿栓ろ過したのち減圧下濃縮し、ここに含ま
れるジクロロメタンを留去した。精製することなくその
残渣をメタノール２００ｍｌ、２８重量％アンモニア水
１００ｍｌ、水５０ｍｌの混液に懸濁し、３５℃で２０
時間かきまぜながら反応させた。次いで反応液を減圧下
濃縮し、ここに含まれる水、及びメタノールを留去し
た。得られた残渣をＯＤＳゲルカラムクロマトグラフィ
ーにより精製し、アセトニトリル‐水混液（容量比１：
４）で溶出した目的区分を濃縮し、水から再結晶して目
的のＧ２‐Ｎを５．８１ｇ（１１．７ｍｍｏｌ、４工程
通算収率４２％）得た。
【００６３】融点（℃）：１８５〜１８７ 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［メタノ
ール中極大値］（ｎｍ）＝２８９（ｌｏｇε＝３．９
２）、２２７（ｌｏｇε＝３．９２）、２０９（ｌｏｇ
ε＝４．１１） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ-1）：３３６３、２９３２、
１５８７、１５１０、１４８８、１３４９、１２７４、
１０８２、１０４２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ‐ｄ6／Ｄ2Ｏ＝１０：１、ｖ／ｖ）：３．０５〜３．
８０（ｍ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．７Ｈｚ）、
５．２６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．４８（１
Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ）、８．１９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ
＝９．３Ｈｚ、２．７Ｈｚ）、８．３１（１Ｈ、ｄ、Ｊ
＝２．７Ｈｚ）
ール中極大値］（ｎｍ）＝２８９（ｌｏｇε＝３．９
２）、２２７（ｌｏｇε＝３．９２）、２０９（ｌｏｇ
ε＝４．１１） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ-1）：３３６３、２９３２、
１５８７、１５１０、１４８８、１３４９、１２７４、
１０８２、１０４２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ‐ｄ6／Ｄ2Ｏ＝１０：１、ｖ／ｖ）：３．０５〜３．
８０（ｍ）、５．１１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．７Ｈｚ）、
５．２６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．４８（１
Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ）、８．１９（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ
＝９．３Ｈｚ、２．７Ｈｚ）、８．３１（１Ｈ、ｄ、Ｊ
＝２．７Ｈｚ）
【００６４】高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）
製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍ
ＩＤ×２５０ｍｍ）、ＲＩ検出、溶離液：アセトニトリ
ル／水＝８５：１５ｖ／ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ］：ｔR＝８．６ｍｉｎ 比旋光度（［α］25 D)：（ｃ ０．５００、Ｈ2Ｏ）：
＋４．５° 元素分析：Ｃ18Ｈ24ＣｌＮＯ13として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４３．４３ ４．８６ ２．８１ 実測値（％） ４３．２９ ４．９５ ２．６８
製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍ
ＩＤ×２５０ｍｍ）、ＲＩ検出、溶離液：アセトニトリ
ル／水＝８５：１５ｖ／ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉ
ｎ］：ｔR＝８．６ｍｉｎ 比旋光度（［α］25 D)：（ｃ ０．５００、Ｈ2Ｏ）：
＋４．５° 元素分析：Ｃ18Ｈ24ＣｌＮＯ13として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４３．４３ ４．８６ ２．８１ 実測値（％） ４３．２９ ４．９５ ２．６８
【００６５】参考例２ Ｇ２‐ＰＮＰの製造 ２‐クロロ‐４‐ニトロフェノールの代わりに４‐ニト
ロフェノール１１．６ｇ（８３．６ｍｍｏｌ）を用いた
以外、参考例１と同様の操作を行い、得られた残渣をＯ
ＤＳゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、アセ
トニトリル‐水混液（容量比１５：８５）で溶出した目
的区分を濃縮し、水から再結晶して目的のＧ２‐ＰＮＰ
を４．９１ｇ（１０．６ｍｍｏｌ、４工程通算収率３８
％）得た。 融点（℃）：１３３〜１３５（分解） 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［メタノ
ール中極大値］（ｎｍ）＝２９５（ｌｏｇε＝４．２
３）、２１９（ｌｏｇε＝４．０６）、２０３（ｌｏｇ
ε＝４．１２） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ-1）：３３９４、２９２７、
１６１０、１５９３、１５０９、１４９７、１３４７、
１２５１、１１４７、１０７３、１０５１ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ‐ｄ6／Ｄ2Ｏ＝１０：１、ｖ／ｖ）：３．０５〜３．
８０（ｍ）、５．０８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．７Ｈｚ）、
５．１４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、７．２４（２
Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ）、８．２０（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝
９．３Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０
ｍｍ）、ＲＩ検出、溶離液：アセトニトリル／水＝７
５：２５ｖ／ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：ｔR＝
４．９ｍｉｎ 比旋光度（［α］25 D)：（ｃ ０．５００、Ｈ2Ｏ）：
＋３．１° 元素分析：Ｃ18Ｈ25ＮＯ13として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４６．６６ ５．４４ ３．０２ 実測値（％） ４６．４５ ５．２７ ２．８８
ロフェノール１１．６ｇ（８３．６ｍｍｏｌ）を用いた
以外、参考例１と同様の操作を行い、得られた残渣をＯ
ＤＳゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、アセ
トニトリル‐水混液（容量比１５：８５）で溶出した目
的区分を濃縮し、水から再結晶して目的のＧ２‐ＰＮＰ
を４．９１ｇ（１０．６ｍｍｏｌ、４工程通算収率３８
％）得た。 融点（℃）：１３３〜１３５（分解） 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［メタノ
ール中極大値］（ｎｍ）＝２９５（ｌｏｇε＝４．２
３）、２１９（ｌｏｇε＝４．０６）、２０３（ｌｏｇ
ε＝４．１２） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ-1）：３３９４、２９２７、
１６１０、１５９３、１５０９、１４９７、１３４７、
１２５１、１１４７、１０７３、１０５１ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ‐ｄ6／Ｄ2Ｏ＝１０：１、ｖ／ｖ）：３．０５〜３．
８０（ｍ）、５．０８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．７Ｈｚ）、
５．１４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、７．２４（２
Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ）、８．２０（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝
９．３Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０
ｍｍ）、ＲＩ検出、溶離液：アセトニトリル／水＝７
５：２５ｖ／ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：ｔR＝
４．９ｍｉｎ 比旋光度（［α］25 D)：（ｃ ０．５００、Ｈ2Ｏ）：
＋３．１° 元素分析：Ｃ18Ｈ25ＮＯ13として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４６．６６ ５．４４ ３．０２ 実測値（％） ４６．４５ ５．２７ ２．８８
【００６６】参考例３ Ｎ‐Ｇの製造 市販のペンタアセチル‐β‐Ｄ‐グルコース［東京化成
（株）製］２０．０ｇ（５１．３ｍｍｏｌ）をピリジン
酢酸２８ｍｌ‐無水酢酸２．０ｍｌの混合液に溶解し、
２‐クロロ‐４‐ニトロフェノール８９ｇ（５１３ｍｍ
ｏｌ）及び塩化亜鉛（ＺｎＣｌ2)７．０ｇ（５１．４ｍ
ｍｏｌ）を加え、減圧下（２０ｍｍＨｇ）１１０℃で３
０分間かきまぜながら反応させたのち、ＤＭＳＯ５０ｍ
ｌ及びジクロロメタン１．０リットルをかきまぜながら
加え、０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液１．０リットルで３
回、３重量％ＮａＣｌ水溶液１．０リットルで３回洗浄
した。次いで無水硫酸ナトリウム１０ｇを加えて乾燥
し、綿栓ろ過したのち減圧下濃縮し、ここに含まれるジ
クロロメタンを留去した。カラムクロマトグラフィーな
どの精製を行うことなく、その残渣を濃塩酸‐メタノー
ル‐クロロホルム（１：１０：４、ｖ／ｖ／ｖ）混液９
３０ｍｌに懸濁し、２５℃で２日間かきまぜながら反応
させた。反応液に２Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ
５．５としたのち、減圧下濃縮してメタノールとクロロ
ホルムを留去した。得られた濃縮液へ水１．０リットル
を加え、ジクロロメタン０．５リットルで３回洗浄し、
次いで微量含まれるジクロロメタンを留去した。ここへ
β‐グルコシダーゼ３０００Ｕを加え、４０℃で２日間
かきまぜながら反応させた。酵素反応液に濃塩酸を加え
てｐＨ３．０とし、８０℃で１時間かきまぜながら反応
させたのち、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ６．０
とし、これをセライトベッドでろ過した。得られたろ液
をＯＤＳゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、
アセトニトリル‐水混液（容量比１：４）で溶出した目
的区分を濃縮し、水から再結晶して目的のＮ‐Ｇを３．
７６ｇ（１１．２ｍｍｏｌ、２工程通算収率２２％）得
た。
（株）製］２０．０ｇ（５１．３ｍｍｏｌ）をピリジン
酢酸２８ｍｌ‐無水酢酸２．０ｍｌの混合液に溶解し、
２‐クロロ‐４‐ニトロフェノール８９ｇ（５１３ｍｍ
ｏｌ）及び塩化亜鉛（ＺｎＣｌ2)７．０ｇ（５１．４ｍ
ｍｏｌ）を加え、減圧下（２０ｍｍＨｇ）１１０℃で３
０分間かきまぜながら反応させたのち、ＤＭＳＯ５０ｍ
ｌ及びジクロロメタン１．０リットルをかきまぜながら
加え、０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液１．０リットルで３
回、３重量％ＮａＣｌ水溶液１．０リットルで３回洗浄
した。次いで無水硫酸ナトリウム１０ｇを加えて乾燥
し、綿栓ろ過したのち減圧下濃縮し、ここに含まれるジ
クロロメタンを留去した。カラムクロマトグラフィーな
どの精製を行うことなく、その残渣を濃塩酸‐メタノー
ル‐クロロホルム（１：１０：４、ｖ／ｖ／ｖ）混液９
３０ｍｌに懸濁し、２５℃で２日間かきまぜながら反応
させた。反応液に２Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ
５．５としたのち、減圧下濃縮してメタノールとクロロ
ホルムを留去した。得られた濃縮液へ水１．０リットル
を加え、ジクロロメタン０．５リットルで３回洗浄し、
次いで微量含まれるジクロロメタンを留去した。ここへ
β‐グルコシダーゼ３０００Ｕを加え、４０℃で２日間
かきまぜながら反応させた。酵素反応液に濃塩酸を加え
てｐＨ３．０とし、８０℃で１時間かきまぜながら反応
させたのち、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ６．０
とし、これをセライトベッドでろ過した。得られたろ液
をＯＤＳゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、
アセトニトリル‐水混液（容量比１：４）で溶出した目
的区分を濃縮し、水から再結晶して目的のＮ‐Ｇを３．
７６ｇ（１１．２ｍｍｏｌ、２工程通算収率２２％）得
た。
【００６７】融点（℃）：１６０〜１６２ 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［メタノ
ール中極大値］（ｎｍ）＝２９１（ｌｏｇε＝３．９
１）、２２７（ｌｏｇε＝３．９１）、２０９（ｌｏｇ
ε＝４．０８） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ-1)：３３９４、２９５４、
１５８５、１５１７、１４８８、１３５１、１２７０、
１１３３、１０９６、１０５４ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤ3
ＯＤ）：３．０５〜４．１５（ｍ）、４．４３（１Ｈ、
ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、５．７３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．
７Ｈｚ）、７．４２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ）、
８．１０（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、２．７Ｈ
ｚ）、８．２１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．７Ｈｚ）高速液体
クロマトグラフィ［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍ
ｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ）、
ＲＩ検出、溶離液：アセトニトリル／水＝１０：１ｖ／
ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：ｔR＝９．７ｍｉｎ 比旋光度（［α］25 D)：（ｃ ０．５００、Ｈ2Ｏ）：
＋１３４° 元素分析：Ｃ12Ｈ14ＣｌＮＯ8として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４２．９４ ４．２０ ４．１７ 実測値（％） ４２．６９ ４．３５ ４．０４ 以下に比較例を示す。
ール中極大値］（ｎｍ）＝２９１（ｌｏｇε＝３．９
１）、２２７（ｌｏｇε＝３．９１）、２０９（ｌｏｇ
ε＝４．０８） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ-1)：３３９４、２９５４、
１５８５、１５１７、１４８８、１３５１、１２７０、
１１３３、１０９６、１０５４ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤ3
ＯＤ）：３．０５〜４．１５（ｍ）、４．４３（１Ｈ、
ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、５．７３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．
７Ｈｚ）、７．４２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ）、
８．１０（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、２．７Ｈ
ｚ）、８．２１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．７Ｈｚ）高速液体
クロマトグラフィ［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍ
ｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ）、
ＲＩ検出、溶離液：アセトニトリル／水＝１０：１ｖ／
ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：ｔR＝９．７ｍｉｎ 比旋光度（［α］25 D)：（ｃ ０．５００、Ｈ2Ｏ）：
＋１３４° 元素分析：Ｃ12Ｈ14ＣｌＮＯ8として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４２．９４ ４．２０ ４．１７ 実測値（％） ４２．６９ ４．３５ ４．０４ 以下に比較例を示す。
【００６８】比較例１ フェニル‐α‐Ｄ‐グルコシド
を用いた方法との比較 （１）基質液の調製 フェニル‐α‐Ｄ‐グルコシドを１０ｍＭの濃度になる
ように、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）に溶解
した。 （２）試料の調製 東洋紡製グルコアミラーゼ４ｍｇを、１００ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ＝５．０）に溶解した。 （３）反応操作 基質液３．５ｍｌに酵素試料３．５ｍｌを混合し、３７
℃でインキュベーションし、一定時間ごとにサンプリン
グして２７０ｎｍにおける吸光度を測定した。 （４）本法での測定操作 実施例１と同様に測定を行った。試料は、（２）と同じ
ものを使用した。 （５）測定結果 測定結果を図１０に示す。結果は、それぞれの方法によ
る吸光度の増加量にて比較した。これよりフェニル‐α
‐Ｄ‐グルコシドでは測定不可能であることが分る。
を用いた方法との比較 （１）基質液の調製 フェニル‐α‐Ｄ‐グルコシドを１０ｍＭの濃度になる
ように、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）に溶解
した。 （２）試料の調製 東洋紡製グルコアミラーゼ４ｍｇを、１００ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ＝５．０）に溶解した。 （３）反応操作 基質液３．５ｍｌに酵素試料３．５ｍｌを混合し、３７
℃でインキュベーションし、一定時間ごとにサンプリン
グして２７０ｎｍにおける吸光度を測定した。 （４）本法での測定操作 実施例１と同様に測定を行った。試料は、（２）と同じ
ものを使用した。 （５）測定結果 測定結果を図１０に示す。結果は、それぞれの方法によ
る吸光度の増加量にて比較した。これよりフェニル‐α
‐Ｄ‐グルコシドでは測定不可能であることが分る。
【図１】 実施例１における反応のタイムコースを示す
グラフ
グラフ
【図２】 実施例１における反応の直線性を示すグラフ
【図３】 実施例１における本発明による測定結果と、
従来法による測定結果との比較のグラフ
従来法による測定結果との比較のグラフ
【図４】 実施例１における反応へのグルコース濃度の
影響を示すグラフ
影響を示すグラフ
【図５】 実施例２における反応の直線性を示すグラフ
【図６】 実施例２における本発明による測定結果と、
従来法による測定結果との比較のグラフ
従来法による測定結果との比較のグラフ
【図７】 実施例３における反応のタイムコースを示す
グラフ
グラフ
【図８】 実施例４における麹抽出液の透析前の試料と
透析後の試料の測定結果を示すグラフ
透析後の試料の測定結果を示すグラフ
【図９】 実施例５におけるグルコアミラーゼ活性の理
論値と計算値の関係を示すグラフ
論値と計算値の関係を示すグラフ
【図１０】 比較例１における本発明による測定結果
と、比較例による測定結果の吸光度の増加量を比較した
グラフ
と、比較例による測定結果の吸光度の増加量を比較した
グラフ
フロントページの続き (72)発明者 山次 信幸 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/34
Claims (7)
- 【請求項１】 エキソ型糖加水分解酵素含有試料に、基
質として、一般式 【化１】 （式中のＲは発色性有機基である）で表わされるβ‐マ
ルトシド誘導体及びβ‐グルコシダーゼを用いて酵素反
応を行わせ、遊離する発色性物質を定量することを特徴
とするエキソ型糖加水分解酵素活性の測定方法。 - 【請求項２】 基質として、一般式 【化２】 （式中のＸ1及びＸ2は、それぞれ水素原子、ハロゲン原
子、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、スルホン基又は
カルボキシル基であり、それらはたがいに同一であって
もよいし、異なっていてもよい）で表わされるβ‐マル
トシド誘導体を用いる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 基質として、一般式 【化３】 （式中のＸ1は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ア
ミノ基、アルキル基、スルホン基又はカルボキシル基で
ある）で表わされるβ‐マルトシド誘導体を用いる請求
項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 グルコアミラーゼ及びα‐グルコシダー
ゼの少なくとも一方を含有する試料に、第一の基質とし
て、一般式 【化４】 （式中のＲは発色性有機基である）で表わされるβ‐マ
ルトシド誘導体をβ‐グルコシダーゼの存在下で用い、
第二の基質として、グルコアミラーゼとα‐グルコシダ
ーゼの反応速度比が、第一の基質と異なる性質を有する
一般式 【化５】 （式中のＲ′は発色性有機基である）で表わされるα‐
グルコシド誘導体を用いて、それぞれ酵素反応を行わ
せ、遊離した発色性物質を定量することを特徴とするグ
ルコアミラーゼとα‐グルコシダーゼ活性の分別測定方
法。 - 【請求項５】 第二の基質として、一般式 【化６】 （式中のＸ3及びＸ4は、それぞれ水素原子、ハロゲン原
子、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、スルホン基又は
カルボキシル基であり、それらはたがいに同一であって
もよいし、異なっていてもよい）で表わされるα‐グル
コシド誘導体を用いる請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 第二の基質として、一般式 【化７】 （式中のＸ3は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ア
ミノ基、アルキル基、スルホン基又はカルボキシル基で
ある）で表わされるα‐グルコシド誘導体を用いる請求
項４又は５記載の方法。 - 【請求項７】 一般式 【化８】 （式中のＲは発色性有機基である）で表わされるβ‐マ
ルトシド誘導体及びβ‐グルコシダーゼを含有すること
を特徴とするエキソ型糖加水分解酵素測定試薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06165608A JP3124444B2 (ja) | 1994-07-18 | 1994-07-18 | エキソ型糖加水分解酵素活性の測定法及び測定試薬 |
| US08/501,870 US5693480A (en) | 1994-07-18 | 1995-07-13 | Method and reagent for determinng exo-type saccharide hydrolase activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06165608A JP3124444B2 (ja) | 1994-07-18 | 1994-07-18 | エキソ型糖加水分解酵素活性の測定法及び測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0823999A JPH0823999A (ja) | 1996-01-30 |
| JP3124444B2 true JP3124444B2 (ja) | 2001-01-15 |
Family
ID=15815598
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06165608A Expired - Fee Related JP3124444B2 (ja) | 1994-07-18 | 1994-07-18 | エキソ型糖加水分解酵素活性の測定法及び測定試薬 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5693480A (ja) |
| JP (1) | JP3124444B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101835607B1 (ko) | 2012-12-28 | 2018-03-08 | 호야 칸데오 옵트로닉스 가부시키가이샤 | 광원 장치 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0646895A (ja) * | 1992-07-29 | 1994-02-22 | Kikkoman Corp | α‐アミラーゼ活性の測定方法 |
-
1994
- 1994-07-18 JP JP06165608A patent/JP3124444B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-07-13 US US08/501,870 patent/US5693480A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101835607B1 (ko) | 2012-12-28 | 2018-03-08 | 호야 칸데오 옵트로닉스 가부시키가이샤 | 광원 장치 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5693480A (en) | 1997-12-02 |
| JPH0823999A (ja) | 1996-01-30 |
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