JP3251219B2 - ヒトミトコンドリアdnaを用いた遺伝子検出方法 - Google Patents
ヒトミトコンドリアdnaを用いた遺伝子検出方法Info
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Description
アDNAを用いた遺伝子診断方法に関する。
細胞内小器官であり、その内部にある酸化的リン酸化系
を使って細胞の活動に必要なエネルギーの大部分を供給
している。このミトコンドリア内には、核DNAとは独
立したミトコンドリアDNA(以下には、「mtDN
A」と省略することがある。)が存在することが明らか
にされており、1981年にはヒトmtDNAの16,
569塩基対の全塩基配列が決定されている( Anderso
n.S., Bankier.A.T., Barrell,B.G., de Bruijn,M.H.
L., Coulson,A.R., Drouin,J., Eperon,I.C., Nierlic
h,D.P., Ror,B.A., Sanger,F., Schreier,P.H., Smith,
A.H.H., Staden,R.,& Young,I.G.: Sequence and organ
ization of the human mitochondrial genome. Nature
290,457-465, 1981 )。このヒトmtDNA内には、ミ
トコンドリア独自の遺伝子が存在しており、これまでに
その対応関係が明らかにされてきている(図1を参
照)。
と結びつくことが、分子生物学的研究の成果から明らか
にされつつある(田中 雅嗣、ミトコンドリア電子伝達
系酵素欠損症の分子生物学、生化学、63(3), 169-187,
1991、 Wataru Sato, Kiyoshi Hayasaka, Yutaka Shoj
i, Tsutomu Takahashi, Goro Takada, Masahiro Saito,
Osamu Fukuwa, and Eiko Wachi: A mitochondrial tRN
A mutation at 3,256 associated with mitochondrial
myopathy, encephalopathy, lactic acidesis,and stro
ke-like episodes(MELAS). BIOCHEMISTRY and MOLECULA
R BIOLOGY INTERNATIONAL 33(6), 1055-1061, 1994)。
化傾向に伴い、加齢するにつれて、ガン・心臓病・高血
圧・糖尿病・脳疾患等のいわゆる成人病が増加してい
る。
トmtDNAとの因果関係については、明確にされたも
のはない。もし、ヒトmtDNAの塩基置換に基づい
て、成人病に罹患しやすい人を予め診断することができ
れば、その人が食生活や運動量等の生活態度を改善する
ことによって、成人病の罹患率を減少させることが可能
となる。
で、その目的は成人病に罹患する確率の高いグループを
ヒトmtDNAを用いた遺伝子診断により決定する方法
を提供するところにある。
を解決するため鋭意検討を行った結果、次のことを明ら
かにし、基本的には本発明を完成するに至った。 (1)百寿者(本明細書中において、「百寿者」とは、
満年齢で99.1歳以上の者を表現するのに使用してい
る。)のmtDNAの塩基配列と、アンダーソンら(前
出、Nature 290,457-465, 1981)が発表したmtDNA
の塩基配列との間にはいくつかの塩基置換が確認され
た。 (2)上記の塩基置換のうち、3010位の塩基がグア
ニンからアデニンに、4883位の塩基がシトシンから
チミンに、5178位の塩基がシトシンからアデニン
に、8414位の塩基がシトシンからチミンに、146
68位の塩基がシトシンからチミンに、それぞれ置換さ
れている5ヶ所のものが多く、かつこの5ヶ所の塩基置
換は連鎖している確率が高かった。 (3)百寿者のmtDNAの5178位の塩基は、シト
シン:アデニン=23例:14例であった。 (4)5178位の塩基置換に注目し、患者群を年齢別
にグループ分けしたところ、45歳を越えた患者群のm
tDNAのうち、シトシンのものがアデニンのものに比
べ2倍程度と高かった。 (5)健常人のmtDNAの5178位の塩基は、シト
シン:アデニン=55%:45%であった。 (6)以上より、mtDNAの5178位がシトシン型
であるものは、アデニン型であるものに比べ、成人病に
罹患しやすいことが判明した。
求項1の発明に係るヒトミトコンドリアDNAを用いた
遺伝子検出方法は、ヒトミトコンドリアDNAの塩基配
列のうち、4883位の塩基がシトシンからチミンに、
5178位の塩基がシトシンからアデニンに、8414
位の塩基がシトシンからチミンに、14668位の塩基
がシトシンからチミンに、置換されていることに基づ
き、前記4ヶ所の塩基置換のうちの少なくとも1ヶ所の
塩基置換を検出することを特徴とする。
であって、前記4ヶ所の塩基置換のうち5178位の塩
基がシトシンからアデニンに置換したものであり、前記
遺伝子検出方法がPCR−RFLP法であり、DNAを
分解する制限酵素がAluIであることを特徴とする。
は、「PCR法」と記載する。)によるmtDNAの塩
基配列の決定は、Masashi Tanaka, Mika Hayakawa, and
Takayuki Ozawa, Automated Sequencing of Mitochond
rial DNA, Methods in Enzymology, Volume 264, 407-4
21 ,1996 に示されている方法に従った。この方法は、
図2に示したように二度のPCR法を行った後に、二度
目のPCR産物を直接にPCR法によりシークエンスす
るものである。
プレートとしてL1及びH1の二種類のプライマーを用
い、約3000bpを増幅させた。次に、一度目のPC
R産物をテンプレートとしてFL2及びH2の二種類の
プライマーを用い、二度目のPCR法を行い約500〜
1000bpを増幅させた。最後に、二度目のPCR産
物をテンプレートとして塩基配列を決定するためのPC
R法を行った。なお、PCR法を行ったときのプライマ
ーの組合せ、及びプライマーDNAの塩基配列について
は、後述する実施例中にて示した。
比較解析した。その結果、百寿者のmtDNAの塩基配
列には、複数の塩基置換が確認された。これらの塩基置
換から、百寿者のみに特有のものを抽出するために、患
者群のmtDNAの塩基配列を解析した。この結果、特
に5ヶ所の塩基置換と、長寿者との間に強い相関関係が
確認された。
がシトシンからアデニンに置換していることに基づきP
CR−RFLP法を確立した。これは、野生型のmtD
NAでは5178位が制限酵素AluIの認識部位であ
ることを利用したものである。PCR法に使用するため
のプライマーとしては、本発明に記載のものだけでな
く、5178位を挟むところであれば使用可能である。
なお、そのときにAluIによって切断されたフラグメ
ントDNAの長さが等しくなるように設計しておくと、
判別のさいに便利である。また、長寿者に特に関係の深
いその他の4ヶ所(3010,4883,8414,1
4668位)の塩基置換のうち、いずれの置換に基づい
てもmtDNAのタイプを確認することが可能である。
もの、例えばサザンブロット法、FISH法、RIGS
法、CGH法、LOH法、直接シークエンス法、PCR
−SSCP法、MASA法、ASOプローブ法、PCR
法、OPA法等を使用することができる(BIOCLinica 1
0(9),1995,18-23)。遺伝子診断方法として、PCR法
を応用したTaqMan(アプライドシステムズ社登録
商標)法を用いる場合には、塩基置換点を中心として
5’末端側及び3’末端側にそれぞれ10〜30塩基対
を合成してプローブ用DNAとする。このとき、ほぼ中
央の一つの塩基対の置換によりアニーリング温度が数度
変化すること、及びTaq DNAポリメラーゼの5’
ヌクレアーゼ活性により、標的DNAに結合しているプ
ローブの蛍光色素を選択的に解離させることができる。
また、PCR法を応用するに際して、プライマーDNA
の位置は本実施形態により限定されるものではない。
本発明はこれら実施例により限定されるものではない。 実施例1:全DNAサンプルの抽出 全DNAは宝酒造株式会社の「Genとるくん」を使用
した。その方法について簡単に記載すると、次のようで
ある。1.5mlのマイクロチューブに、500μlのキット中
GenTLE溶液Iと100μlの血液を加え、直ちに数秒
間攪拌した。室温で10分間以上静置後、室温にて12,000
xg以上で5分間遠心した。上清を取り除き、沈殿に1ml
のキット中GenTLE溶液IIを加えた。マイクロチ
ューブを転倒混和した後、室温にて12,000xg以上で2分
間遠心し、上清を取り除いた。沈殿に500μlのキット中
GenTLE溶液IIIを加え、10秒間攪拌した。室温に
て12,000xg以上で5分間遠心し、上清を新たなマイクロ
チューブに移した。500μlのイソプロパノールを加え、
転倒混和した後、4℃、12,000xgで5分間遠心した。上
清を取り除いた後、70%エタノールで沈殿を洗浄し、真
空乾燥機で乾燥させた。全DNAを50μlのTE緩衝液(1
0mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA)に溶解した。
塩基配列の確認 百寿者のmtDNAに特異的な塩基置換が確認されるか
否かを明らかにするため、百寿者(11例)及び患者
(最大43例、部位によっては43例に満たないところ
もある。)のmtDNAの全塩基配列を確認した。百寿
者として99歳以上の者から、頬粘膜細胞を歯ブラシを
用いて採取し、プロテイナーゼKとSDS処理を行い、
フェノール/クロロホルム抽出した後、全DNAを得
た。一方、百寿者の試料を得た地域の基幹病院において
全血球計算検査を受けた患者を無作為に抽出し、その検
査終了後の全血を試料として用い、実施例1に記載した
方法により全DNAを抽出後、mtDNAの塩基配列を
確認した。DNAシークエンスは、前出の Methods in
Enzymology, Volume 264, 407-421, 1996 に報告されて
いる方法に基づき、次のようにして行った。また、一度
目および二度目のPCR法に使用したプライマーDNA
の組合せは、表1〜表3に示した。
トとし、L1及びH1(各プライマーの塩基配列は表4
〜表6に記載した。)をプライマーとして使用した。反
応溶液の組成は次の通りである。1μlの全DNA(10 n
g/μl)、5μlのL1(10μM)、5μlのH1(10μ
M)、4μlの2.5 mM dNTP、0.25μlの5 units/μl Taq
DNAポリメラーゼ、5μlの10x PCR緩衝液(100 mM Tr
is-HCl pH8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2)に29.75μl
の精製水を加えて全量を50μlとして 0.2-ml MicroAmp
チューブ中で混和した。この反応溶液をパーキンエルマ
ー社製の GeneAm PCRsystem Model 9600 によりPCR
法を行った。反応条件は、94℃で15秒間の変性、60℃で
15秒間のアニーリング、72℃で185秒間の伸長反応を1
サイクルとして、40サイクル繰り返した。反応溶液に
5μlの3 M酢酸ナトリウム(pH 7.4)と100μlのエタノー
ルを添加後、氷上に10分間静置し、4℃にて13,000xgで1
0分間遠心した。沈殿を150μlの70%エタノールで洗浄
後、4℃にて13,000xgで5分間遠心した。沈殿を10分間乾
燥した後、50μlの精製水又はTE(10 mM Tris-HCl pH
8.0, 1 mM EDTA)に溶解した。
R産物をテンプレートとし、FL2及びH2(FL2プ
ライマーの塩基配列は表7〜表10に記載した。)をプ
ライマーとして使用した。反応溶液の組成は次の通りで
ある。0.4μlの一度目のPCR産物溶液、5μlのFL2
(0.04μM)、5μlのH2(4μM)、0.16μlの2.5 mMdN
TP、0.1μlの5 units/μl Taq DNAポリメラーゼ、2
μlの10x PCR緩衝液に7.34μlの精製水を加えて全量を2
0μlとして 0.2-ml MicroAmp チューブ中で混和した。
PCR法の反応条件は一度目のPCR法のものと同様な
ので記載を省略する。反応溶液に1.5μlの3 M酢酸ナト
リウム(pH7.4)と30μlのエタノールを添加後、氷上に10
分間静置し、4℃にて13,000xgで10分間遠心した。沈殿
を45μlの70%エタノールで洗浄後、4℃にて13,000xgで5
分間遠心した。沈殿を10分間乾燥した後、10μlの精製
水に溶解した。
は、Molecular Biology LabStationCatalyst 800(アプ
ライドバイオシステム社)を用いて次のようにして行っ
た。反応溶液としてアデニン又はシトシンの位置確認用
には、2μlのA mix[375μM ddATP(ダイデオキシアデノ
シン3リン酸), 15.6μM dATP, 62.5μM dCTP, 93.8μM
c7dGTP(7-デアザ-2'-デオキシグアノシン 5'-3リン
酸), 62.5μM dTTP, 0.1 pmol/μl JOE染色プライマー,
100 mM Tris-HCl pH 8.9, 25 mM (NH4)2SO4,6.3 mM Mg
Cl2, 0.18 units/μl AmpliTaq DNA ポリメラーゼ]また
は、2μlのCmix[187.5μM ddCTP, 62.5μM dATP, 15.6
μM dCTP, 93.8 μM c7dGTP, 62.5μMdTTP, 0.1 pmol/
μl FAM染色プライマー, 100 mM Tris-HCl pH 8.9, 25
mM (NH 4)2SO4, 6.3 mM MgCl2, 0.18 units/μl AmpliTa
q DNA ポリメラーゼ]に0.6μlの二度目のPCR溶液を
添加した。また、グアニン又はチミンの位置確認用に
は、4μlのG mix[31.3μM ddGTP, 62.5μM dATP, 62.5
μM dCTP, 23.5μM c7dGTP, 62.5μM dTTP, 0.1 pmol/
μl TAMRA染色プライマー, 100 mM Tris-HCl pH 8.9, 2
5 mM (NH4)2SO4, 6.3 mM MgCl2, 0.18 units/μl Ampli
Taq DNA ポリメラーゼ]または、4μlのT mix[312.5μM
ddTTP, 62.5μM dATP, 62.5μM dCTP, 93.8μM c7dGT
P, 15.6μM dTTP, 0.1 pmol/μl ROX染色プライマー, 1
00 mM Tris-HCl pH 8.9, 25mM (NH4)2SO4, 6.3mM MgC
l2, 0.18 units/μl AmpliTaq DNA ポリメラーゼ]に1.2
μlの二度目のPCR溶液を添加した。シークエンス反
応条件は、3ステップ反応(96℃で20秒間の変性、60℃
で20秒間のアニーリング、70℃で30秒間の伸長反応)を
25サイクル繰り返した後、さらに2ステップ反応(96
℃で10秒間の変性、70℃で60秒間の伸長反応)を15サ
イクル繰り返した。各反応溶液に4.5μlの3 M酢酸ナト
リウム(pH 5.2)と150μlのエタノールを添加後、氷上に
10分間静置し、4℃にて13,000xgで15分間遠心した。沈
殿を150μlのエタノールで洗浄後、4℃にて13,000xgで5
分間遠心した。沈殿を10分間乾燥した後、5μlの電気泳
動用溶液(脱イオン処理済ホルムアルデヒドと30 mg/ml
のBlue dextran 2000(ファルマシア社)含有50 mM EDT
A pH 8.0を5対1の割合で混合した溶液)に溶解し、90
℃で2分間の変性処理後、氷上に静置したものを Model
373A(アプライドバイオシステムズ社)を使用して電気
泳動処理した。
析 実施例2に記載の方法により、mtDNAの塩基配列を
決定した後、その塩基配列の解析を行った。表11に
は、確認された14ヶ所の塩基置換を二つのグループに
分けて示した。
する9ヶ所(8701,10398,9540,104
00,10873,12705,14783,1504
3,15301位)のものは、百寿者に多く確認されて
いる(11例中8例以上)。しかしながら、この塩基置
換は患者中にも比較的多く確認されていることから(2
4例以上)、グループIに示す位置の塩基置換と成人病
との関連性は高くないと考えられた。
78,8414,4883,14668,3010位)
の塩基置換は、百寿者に多く確認されている(11例中
6例以上)が、このグループIIに属する塩基置換は患
者群の中にはそれほど多くの例数が見られなかった(4
2〜43例中、10〜12例)。表12には、グループ
IIの5ヶ所の塩基置換が、各百寿者に確認された様子
を示した。
の5ヶ所の塩基置換は連鎖していることが多く、日本人
集団の中でこれらの塩基置換を有するmtDNAを持っ
ていた祖先に由来する系統の人と、これらの塩基置換を
持っていなかった祖先に由来する系統の人との2群に、
日本人集団を大別することができることを示している。
また、これらのデータは、グループIIの一連の塩基置
換を有するmtDNAを細胞内に持つ人が、百寿者とし
て生存する可能性の高いことを示唆するものである。
FLP(restriction fragment length polymorphism
を省略したもの)と記載する。)によるmtDNAのグ
ループ分け さらに多くの百寿者について、上記したグループIIの
mtDNAを持つ人と、そうでないmtDNAを持つ人
との割合を確認するために、PCR−RFLP法による
グルーピングを行った。実施例2に示すように、各人の
mtDNAの塩基配列を確認すれば、何れのグループの
mtDNAを有するかは明らかとなるが、多数のサンプ
ルを処理するためには、より簡易かつ迅速な検査方法が
要求される。そこで、本発明者はグループIIに属する
5ヶ所の塩基置換のうち、5178位の塩基置換(野生
型C→置換型A)に注目してPCR−RFLP法を開発
した。これは、グループIIの5ヶ所の塩基置換が連鎖
していること、及び、5178位は野生型において制限
酵素AluIの認識部位となっていることとに基づくも
のである。
述の方法により全DNAを抽出した。次に、この全DN
Aサンプルを用いて、配列表の配列番号:1及び配列番
号:2に示すDNAをプライマーとして、5178位を
含む領域をPCR法により増幅した。配列番号:1に示
す塩基配列はmtDNAの4949位から4968位ま
でのものであり、配列番号:2に示す塩基配列はmtD
NAの5365位から5346位までのものである。こ
の2つの合成DNAをプライマーとしてPCR反応を行
うことにより、mtDNAの4949位から5365位
までの417塩基対のDNA産物が合成される。
は、4992位と5178位との二ヶ所にあり得る。こ
のうち、4992位の認識部位は全てのmtDNAに存
在し、5178位の認識部位は野生型のmtDNAにの
み存在する。このため、PCR法によるDNA産物をA
luIにより処理したときに、野生型のmtDNAでは
186及び188塩基対(4992位から5365位ま
での374塩基対が5178位で切断される)と43塩
基対との二つのバンドが確認される。また、置換型のm
tDNAでは374塩基対と43塩基対との二つのバン
ドが見られることになる。
である。1μlの全DNA、5μlの配列番号:1(10μ
M)、5μlの配列番号:2(10μM)、4μlの2.5 mM dNT
P、0.25μlの5 units/μl Taq DNAポリメラーゼ、5
μlの10xPCR緩衝液(100 mM Tris-HCl pH8.3, 500 mM K
Cl, 15 mM MgCl2)に29.75μlの精製水を加えて全量を5
0μlとして 0.2-ml MicroAmp チューブ中で混和した。
反応条件は、94℃で30秒間の変性、51℃で30秒間のアニ
ーリング、72℃で90秒間の伸長反応を1サイクルとし
て、30サイクル繰り返した。さらに、その後に72℃で
10分間の伸長反応を行った。
た。AluI反応の詳細は、次の通りである。反応溶液
の組成は、10μlのPCR溶液、1μlのAluI(宝酒
造株式会社製)、2μlの10x T緩衝液(AluIに添
付)、2μlの10x BSA溶液(AluIに添付)に5μlの
精製水を加えて全量を20μlである。この反応溶液を37
℃にて3時間反応させた後、アガロースゲル電気泳動に
より、そのパターンを確認した。
示した。この図において、上側のバンド(374bp)
はPCR法により増幅されたDNAがAluIにより切
断されなかったものであり、5178位がA(アデニ
ン)であることを示し、これは上記したグループIIの
mtDNAのタイプであることを示唆している。以下に
おいては、このグループを「グループA」と記載する。
また、下側のバンド(186及び188bp)はPCR
法による増幅DNAがAluIにより切断されたもので
あり、5178位がC(シトシン)であることを示して
いる。以降では、このグループを「グループC」と記載
する。
りグループ分けした26例の百寿者と、前記したDNA
シークエンスにより5178位の塩基を確認した11例
の百寿者とについてのグループ分けの結果を併せまとめ
た。この結果より、37例の百寿者のうち、23例(6
2.2%)がグループAに属することが判明した。一
方、本発明者は、健常人の血液サンプルに基づき、グル
ープCとグループAとの割合を確認した。その結果、健
常人のmtDNAのグループ比は、グループC(野生
型):グループA(置換型)=55:45であった。
験 次に、病院に来院した患者群について、年齢別にグルー
プAまたはCに関してグループ分けを行った。来院した
患者の血液サンプルから、既述の方法により全DNAを
抽出し、AluIを用いたPCR−RFLP法によりグ
ループ分けをした。図4は、患者の年齢とグループAま
たはCの計数をプロットしたものである。この図より明
らかなように、年齢が45歳を越えるまではグループA
とグループCとの比率はほぼ1:1で推移している。し
かし、年齢が45歳を越えると、グループCはグループ
Aに比べてほぼ二倍の割合で増加している。一般に年齢
が45歳を越えると、高血圧・糖尿病・心臓病・ガン等
のいわゆる成人病に罹患する割合が増加してくる。実施
例4に記載したように、一般人のmtDNAのタイプ
は、グループCとグループAとでは、ほぼ1:1程度で
ある。これと本図の結果とを合わせると、グループCと
グループAとにおいて、成人病に罹患する人の割合は、
グループCがグループAに比べて二倍の高率であること
を示している。
mtDNAのタイプがグループAまたはグループCのい
ずれに属するかを同定しておくことにより、成人病に罹
りやすいか否かを予め知ることができる。これにより、
グループCに属する人は、通常の生活態度によく注意を
払うことで成人病の予防に資し、もって国民生活の向上
と医療費の軽減化等に寄与することができる。
めの試験方法 実施例4に示したように、5178位の塩基置換に基づ
いたPCR−RFLP法によりグループAまたはグルー
プCの分類を行うことができる。しかしながら、多数の
検体を処理するためには、より迅速かつ簡便な各種の方
法が期待される。このため、グループ分けのためのその
他の診断方法を検討・確立した。
オシステムズ社登録商標)法と呼ばれるPCR法を応用
した診断方法について記載する。TaqMan法の原理
は、図5に示す通りである。図5には、グループCのm
tDNAを持つものが、図示Tの蛍光色素に特有の蛍光
を発することを示している。なお、図示はしないが、グ
ループAのmtDNAを持つものでは、同様の反応様式
を示して、図示Fの蛍光色素に特有の蛍光を発すること
で区別される。この方法ではPCR法に用いる二つのプ
ライマーDNAの他に、二種類のプローブ用DNAが使
用される。プローブ用DNAは増幅されるDNAの塩基
配列の一部分に相補的な塩基配列を有しており、その部
分にアニールすることができる。また、プローブ用DN
Aの5’末端には蛍光色素であるリポーター(図示Tま
たはF)が共有結合される一方、3’末端には消光剤で
あるクエンチャー(図示Q)が共有結合されている。プ
ローブ用DNAが分解されずに、そのままの形で存在す
る場合には、蛍光色素が発する蛍光は同一分子内の消光
剤により消光作用を受ける。ところが、プローブ用DN
Aに相補的な塩基配列が存在する場合には、そこにアニ
ールした後、PCR法による伸長反応の途中にプローブ
用DNAの5’末端の蛍光色素がTaq DNAポリメ
ラーゼが持つ5’−3’ヌクレアーゼ活性により分解反
応を受け、溶液中に解離される。このように解離された
蛍光色素は、もはや消光剤の影響を受け難いため、特有
の蛍光を発する。
配列番号:4のものを使用する。このものは、それぞれ
mtDNAの5131位から5149位までの塩基配列
のもの(配列番号:3、以下「5178−F」と記載す
る。)と、5369位から5349位までの塩基配列の
もの(配列番号:4、以下「5178−R」と記載す
る。)とである。
5及び配列番号:6に示す二種類のものを作成した。配
列番号:5のものは、mtDNAの5165位から51
92位までの塩基配列を有し、5178位がアデニン
(A)となっている(以下、このプローブ用DNAを
「5178−A」と記載する。)。一方、配列番号:6
のものは、mtDNAの5165位から5191位まで
の塩基配列を有し、5178位がシトシン(C)となっ
ている(以下、このプローブ用DNAを「5178−
C」と記載する。)。また、プローブ用DNA5178
−Aの5’末端には蛍光色素としてFAM(6−カルボ
キシフルオレセイン)が結合され、プローブ用DNA5
178−Cの5’末端には蛍光色素としてTET(6−
カルボキシ−4,7,2’,7’−テトラクロロフルオ
レセイン)が結合される。なお、消光剤としては、両方
のプローブ用DNAともに、TAMRA(6−カルボキ
シ−N,N,N’,N’−テトラメチルローダミン)が
使用される。FAM、TET及びTAMRAは、すべて
488nmの波長で励起させ、それぞれ518、538
及び582nmの波長で蛍光強度を観測し、蛍光強度比
を採ることにより、グループCまたはAの分類を行うこ
とができる。
である。まず、114μlの10x TaqMan緩衝液(TaqManシス
テムに添付のもの)、287.5μlの25 mM MgCl2、29μlの
10mM dATP、29μlの10 mM dCTP、29μlの10 mM dGTP、2
9μlの20 mM dUTP、14.5μlの5 U/μl AmpliTaq Gold D
NA Polymerase に590μlの精製水を加えて1152μlとし
たものをマスターミックスとした。次に、8μlのマスタ
ーミックス、0.25μlの8μM 5178−Fプライマー、
0.25μlの8μM 5178−Rプライマー、0.25μlの4μ
M 5178−Aプローブ、0.25μlの4μM 5178−C
プローブに 1μl の全DNA(前記した方法により、血
液から調製したもの。)を加えて全量を10μlとして 9
6穴プレート内にて反応させた。反応条件は、95℃で10
分間反応させた後、3ステップサイクル(95℃で15秒間
の変性、56℃で5秒間のアニーリング、62℃で60秒間の
伸長反応を1サイクルとした。)を50サイクル繰り返
した。
7200 シークエンスディテクター(アプライドバイオシ
ステムズ社)により、518,538及び582nmの
三種類の波長で蛍光強度を測定した。その結果、グルー
プC及びグループAのタイプ分けを行うことができた。
中の4ヶ所(4883位、5178位、8414位、ま
たは、14668位)の塩基置換のいずれかを確認する
ことができる。
確認したときのゲル電気泳動結果
年齢別推移図
Claims (2)
- 【請求項1】 ヒトミトコンドリアDNAの塩基配列の
うち、4883位の塩基がシトシンからチミンに、51
78位の塩基がシトシンからアデニンに、8414位の
塩基がシトシンからチミンに、14668位の塩基がシ
トシンからチミンに、置換されていることに基づき、前
記4ヶ所の塩基置換のうちの少なくとも1ヶ所の塩基置
換を検出することを特徴とするヒトミトコンドリアDN
Aを用いた遺伝子検出方法。 - 【請求項2】 前記4ヶ所の塩基置換のうち、5178
位の塩基がシトシンからアデニンに置換したものであ
り、前記遺伝子検出方法がPCR−RFLP法であり、
DNAを分解する制限酵素がAluIであることを特徴
とする請求項1記載のヒトミトコンドリアDNAを用い
た遺伝子検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27912797A JP3251219B2 (ja) | 1997-10-13 | 1997-10-13 | ヒトミトコンドリアdnaを用いた遺伝子検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27912797A JP3251219B2 (ja) | 1997-10-13 | 1997-10-13 | ヒトミトコンドリアdnaを用いた遺伝子検出方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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JPH11113597A JPH11113597A (ja) | 1999-04-27 |
JP3251219B2 true JP3251219B2 (ja) | 2002-01-28 |
Family
ID=17606816
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP27912797A Expired - Lifetime JP3251219B2 (ja) | 1997-10-13 | 1997-10-13 | ヒトミトコンドリアdnaを用いた遺伝子検出方法 |
Country Status (1)
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JP (1) | JP3251219B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
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---|---|---|---|---|
ATE506437T1 (de) | 2003-05-21 | 2011-05-15 | Andes Biotechnologies S A | Marker für präkanzeröse und kanzeröse zellen sowie verfahren zur störung der zellproliferation darin |
EP1694695A4 (en) * | 2003-12-11 | 2007-10-31 | 1304854 Ontario Ltd | COMPLETE MITOCHONDRIAL GENOME SEQUENCES AS A DIAGNOSTIC TOOL FOR MEDICAL SCIENCES |
US20130022979A1 (en) | 2005-04-18 | 2013-01-24 | Genesis Genomics Inc. | 3.4kb MITOCHONDRIAL DNA DELETION FOR USE IN THE DETECTION OF CANCER |
SG2014011837A (en) | 2005-04-18 | 2014-04-28 | Mitomics Inc | Mitochondrial mutations and rearrangements as a diagnostic tool for the detection of sun exposure, prostate cancer and other cancers |
-
1997
- 1997-10-13 JP JP27912797A patent/JP3251219B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Ann.Hum.Genet.,Vol.53(1989)p.303−310 |
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Publication number | Publication date |
---|---|
JPH11113597A (ja) | 1999-04-27 |
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