JP2008099696A - 生存運動ニューロン(smn)遺伝子;脊髄筋萎縮 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】染色体5−SMA(脊髄筋萎縮)決定遺伝子であるヒト生存運動ニューロン遺伝子又はSMN遺伝子。SMN遺伝子をコードするヌクレオチド配列及び対応のアミノ酸配列、SMNタンパク質をコードする遺伝子又はこの遺伝子に対応するDNA配列を含むベクター、並びにSMN遺伝子又はこの遺伝子に対応するDNA配列を含む形質転換体。
【選択図】なし
Description
T−BCD541遺伝子において、
−図4及び5の配列のヌクレオチド921〜1469を含んで成る配列の中に含まれるプライマーのペアー及び/又は
−以下の配列を含んで成るプライマーのペアー:
−以下の配列を有するプライマーのペアー:
−上記のプライマーのセット;
−増幅反応のための試薬;及び
−増幅生成物の検出のためのプローブ;
を含んで成る。
(a)患者の試料からDNAを抽出する;
(b)前記DNAを前記のプライマーにより増幅させる;
(c)この増幅したDNAをSCCPにかける;
(d)このゲルをオートラジオグラフィーにかける;そして
(e)運動ニューロン障害の有無を検出する;
工程を含んで成る方法に関する。
(a)患者の試料からDNAを抽出する;
(b)前記DNAを、ストリンジェンシー条件において図4及び5又は図2及び3のDNA配列全体又はその一部を含んで成るDNAプローブとハイブリダイズさせる;そして
(c)形成された可能性のあるハイブリドを検出する;
ことを含んで成る方法に関する。
(a)患者の試料からDNAを抽出する;
(b)前記DNAをSMN遺伝子のエクソン7又はエクソン8由来の未ラベルプライマーを用いるPCRを介して増幅させる;
(c)この増幅させたDNAをSCCPにかける;
(d)このゲルをオートラジオグラフィーにかける;そして
(e)先天性多発性関節拘縮症の有無を検出する;
工程を含んで成る方法に関する。
1)種間保存配列についてのサーチを行う;
2)エクソン・トラッピング法を行う;及び
3)直接cDNA選択を行う。マーカーC272を含むファージに由来するゲノムプローブ132SE11は、ハムスターDNAと陽性ハイブリダイゼーションシグナルを供し、種間保存配列の存在を示唆した。プローブ132SE11によるλgt10ヒト胎児脳cDNAライブラリーのスクリーニングは、1.6kbp にわたって広がる7つの重複λクローンの選択をもたらした。クローンの配列分析は、882bpのオープンリーディングフレーム(ORF)及び580bpの非コード領域を示した。1.5kbp のクローン(BCD541)はコード配列全体及び3′非コード領域のほとんどを含んでいた。cDNAの3′末端とそのポリ(A) + テールをリンホブラストイド細胞系cDNAライブラリーのPCR増幅により獲得した。
(1)身体の少なくとも2箇所の領域の先天的関節拘縮(Stern , JAMA, 81:1507-1510 (1923)参照のこと);
(2)筋肉萎縮及び眼球外振幅のない反射消失を伴う全身筋肉虚弱化;
(3)筋電図が脱神経及び低下した運動活動電位振幅を示す;並びに
(4)貯蔵物質又はその他の構造的異常の徴候のない脱神経を一貫して伴う筋肉生検(Munstat, Neuromuscular Disorders , 1 : 81 (1991))。
121B8,595C11及び903D1 YACクローンからのファージライブラリーの構築。
C212,C272及びC161により検出されるテロマー遺伝子座を含むYACクローン595C11、又はこれらのマーカーにより検出されるセントロマー遺伝子座を含むYACクローン121B8、又は両遺伝子座を含む903D1 YACクローンからの全酵母DNAを精製し、そしてSau3Aで部分消化した。12〜23kbのサイズ範囲のDNAを0.5%のSeaplaque GTGアガロースゲル電気泳動後に切り出し、そしてβ−アガロース消化後にエタノールで沈殿させた。Sau3A部位の部分フィル・インの後、DNAをバクテリオファージFIX III(Stratagene)の部分的に補完したXhoI部位において、サブクローニングした。マイクロサテライトDNAマーカーC212(L−51),C272(L−51,L−132),C171(L−5,L−13),C161(595B1)、11M1(L−11),AFM57xd10(L−131)を含むλクローンをEcsRIもしくはHindIII のいづれか又はその両者で消化し、そしてpUC18プラスミドベクターの中にサブクローニングした。マーカーC212(p322),C272(132SE11),C161(He3),AFM57xd10(131xb4)及びCMS1(p11M1)を含むファージ由来のサブクローンをプローブとして用いた。
パルス・フィールド・ゲル電気泳動分析
高分子量のDNAを、上記の通りコントロール及び患者から樹立したEpstein-Barrウィルス形質転換リンホブラストイド細胞系又はYACクローンから、アガロースプラグにおいて単離した。プラグを10〜20min.vol.づつのTEで30分、2回すすいだ。このプラグを、0.1mg/mlのBSA(Pharmacia) を含む0.3mlの適当な制限酵素バッファーで4℃で30分平衡にした。次いで過剰のバッファーを除き、そしてプラグを一回の反応当り40Uの制限酵素で16h適温でインキュベートした。DNAを制限酵素BssHII,EagI,SfiI,SacI,KpnI,SacII,SpeIで消化した。DNAフラグメントの分離はCHEF− III−DR PGFE装置(Biorad) を用いて行った。50〜1200kbのフラグメントを1%のアガロースSeakemを通じて、200V、24h、14℃で、30〜70分のランピングパルス時間を用い、0.5×TBEランニングバッファーで電気泳動させることにより分離した。5〜100kbのフラグメントの分離は200V、19h、14℃で、5−20分のランピングパルス時間を用い、0.5×TBEバッファーで電気泳動させることにより行った。0.25NのHClで20分処理した後、パルスにかけたフィールドゲルを0.4MのNaOH、0.4MのNaClの中で20hかけて Hybond N+ Nylon膜 (Amersham) にブロットした。プローブを順に同じフィルターにハイブリダイズして正確なデーターを確実なものとした。ハイブリダイゼーションは上記の通りに実施した。
YACライブラリースクリーニング
CEPHからのYACライブラリーをマイクロサテライトC212,C272,C171,CMS1及びC161によるPCRによりスクリーニングした。YACゲノタイプを変性ポリアクリルアミドゲル上でのPCR生成物の電気泳動により樹立した。YACのサイズはパルス・フィールド・ゲル電気泳動により推定した。
サザンブロット分析
DNAサンプルを末梢血液白血球又はリンホブラストイド細胞系のいづれかから抽出した。DNAを制限酵素EcoRI,HindIII ,BglII,XbaI,PvuII,XmnI,RsaI,PstI,BamHIにより消化し、サザンブロッティングのために0.8%のアガロースゲルで電気泳動することにより分離し、そして放射性ラベルプローブとハイブリダイズさせた。
ジヌクレオチド・リピート・多形性
ゲノタイプデーターをC212(D5F149S1,−S2),C272(DF5150S1,−S2)及びC161(DF5153S1,−S2)ジヌクレオチドリピートのために獲得した。増幅条件は下記の通りとした:94℃での変性、55℃でのアニーリング、及び72℃での伸長(1min づつ、30サイクル)。ジヌクレオチドリピート多形性の検出のために用いた手順は公知である。
cDNAクローン及びDNA配列決定
λgt10ヒト胎児脳ライブラリーの2百万個の組換体を製造者(Clontech) に従ってプレート培養した。プリハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは10%の硫酸デキストランナトリウム、1MのNaCl、0.05MのTris−HCl pH7.5、0.005MのEDTA及び1%のSDSと、200mg/mlの剪断ヒト胎盤DNA(Sigma)との中で65℃で16時間行った。このフィルターを0.1×SSEP−0.1%のSDSの中で65℃で洗い、そしてオートラジオグラフィーを24時間行った。陽性cDNAクローンのDNAを精製し、EcoRIで消化し、そしてM13バクテリオファージの中にサブクローニングした。一本鎖DNAをDye Deoxy(商標)ターミネーター・サイクル・シーケンシング・キットを用い、Applied Biosystems, Inc.より供給のプロトコールに従って配列決定し、そしてABIモデル373A DNA自動シーケンサーで分析した。cDNAの3′末端とそのポリ(A)+ テールとを獲得するため、リンホブラストイド細胞系cDNAライブラリーのPCR増幅をこのクローンの3′末端に相補性の特異的なプライマー及びcDNAライブラリーのベクターアームに特異的なプライマーを用い、従来記載の通りに行った(Fouriner B., Saudubray, J.M., Benichou B.ら、1994 J.Clin.Invest. 94 : 526-531)。特異的なPCR生成物をDye Deoxy(商標)ターミネーター・サイクル・シーケンシング・キットを用い、Applied Biosystems, Inc.により供給されたプロトコールに従い直接配列決定し、そしてABIモデル373A DNA自動シーケンサーで分析した。
RNAの単離及びノーザンブロット分析
コントロール及びSMA患者のリンホブラスト細胞系由来のmRNAを Quick Prep mRNA精製キット(Pharmacia) により、供給者の手順に従って単離した。全DNAはChomczynski and Sacchi (Analytic Biochemistry , 162 :156-159 (1987)) に記載の一段RNA単離法に従って調製した。全RNA調製品をRQ1−DNAse(Promega) で処理して全ての夾雑ゲノムDNAを除去した。ノーザンブロットをmRNA及び全RNAから、メチル水酸化水銀を含む1.5%のSeakemアガロースゲルを通じる電気泳動により作り、そして20×SSC中の正帯電膜に移し、そして80℃で2時間加熱した。32P−ラジオラベルDNAプローブを製造者(Boehringer) に従うランダムプライミング法により合成し、そして5×SSEP、1%のSDS、5×のDenhardtの中で65℃で16時間かけてハイブリダイズさせた。その膜を0.1×SSEP、0.1%のSDSの最終ストリンジェンシーで65℃で10分かけて洗った。オートラジオグラフィーは−80℃で、増強スクリーン及びKodak XARフィルムを用いて2〜10日かけて行った。mRNAの量をb−アクチンcDNAプローブで標準化した。オートラジオグラフをコンピューター化デンシトメーター(Hoeffer Scientific Insturments, San Francisco) で600nmでスキャンした。複数のヒト組織由来のポリA+RNAをもつノーザンブロットをClontechから購入した。
逆転写酵素ベースPCR増幅及びスクリーニング
各PCR増幅をランダムヘキサマープライムした逆転写酵素(Promega) から合成した一本鎖cDNAに基づき20mlの最終容量で行った。このPCR反応は2ピコモルの前進及び逆行プライマー並びに1unitのTaqポリメラーゼを、Perkin Elmer/Cetur により推奨の反応バッファーの中に含む。PCR増幅のためのパラメーターは、94℃で1min 、55℃で1min 、72℃で1min の30サイクル、それに続く72℃で10min の最終伸長時間より成る。PCR生成物をアクリルアミドゲルから切り出し、そして100mlのTEバッファーの中で溶出させた。希釈フラグメントを、直接配列決定の前に同じプライマーで再増幅させた。このPCR増幅生成物をアクリルアミドゲルから切り出し、そして100mlのTEバッファーの中で溶出させた。この希釈フラグメントを再増幅させ、次いでDye Deoxy(商標)ターミネーター・サイクル・シーケンシング・キットを用い、Applied Biosystems, Inc.より供給のプロトコールに従って直接配列決定した。そしてABIモデル373A DNA自動シーケンサーで分析した。cDNA配列の中の6セットのプライマーを配列分析のためのDNA生成物を増幅するために用いた。
コンピューター補助分析
541C由来のヌクレオチド及びタンパク質配列の両者との配列相同性分析を、FASTA及びBLASTを用い、CITI2 French ネットワークを介して行った(Dessen P., Fondrat C., Velencien C., Mugnoer C., 1990, CABIOS ; 6 : 355-356)。
SSCP分析
一本鎖コンホメーション多形性(SSCP)分析のため、末梢白血球(200ng)由来のDNAを、200μMのdNTP、1unitのTaqポリメラーゼ(Gibco-BRL) 及び0.1μlの32P dCTP(10mCi /ml、NEN)を含む25μlの増幅混合物中の未ラベルプライマー(20μM)を用いるPCR増幅にかけた。増幅させたDNAを等容量のポリアミド添加色素(95%のポリアミド、20mMのEDTA、0.05%のブロモフェノールブルー、0.05%のキシレンシアノール)と混合した。このサンプル(5μl)を95℃で10分変性させ、そしてポリアクリルアミドゲル(Hydroling MED, Bioprobe) に載せ、そして4℃で18〜24h、4Wで電気泳動させた。ゲルを3MM Whatman紙に移し、乾かし、そしてKodak X−OMATフィルムで24時間かけてオートラジオグラフィーにかけた。エクソン7オリゴヌクレオチドR111
ヒトSMN遺伝子のクローニング
YACクローン595C11由来の全酵母DNAをSambrookら前掲の方法を介して精製し、そして制限酵素Sau3Aにより部分消化した。12〜23kDのサイズ範囲のDNAを0.5%のSeaplaque GTGアガロースゲル電気泳動後に切り出し、そしてβ−アガロース消化の後にエタノールで沈殿させた。Sau3A部の部分的フィル・インの後、DNAをバクテリオファージFIXII(Stratagene)の部分補完XhoI部位でサブクローニングした。
マウスSMN遺伝子のクローニング
マウスの胎児cDNAライブラリーをSambrookら、前掲に従い、プローブとしてヒトSMN cDNAのコード配列を用いてスクリーニングにかけた。
遺伝子導入マウス
複数の正常SMN遺伝子又はエクソン7を欠くSMN遺伝子を含む遺伝子導入マウスを Leeら、Neuron, 13;978-988 (1994)に従う方法により製造した。この遺伝子導入マウスを、本発明に記載のプローブを用いてサザン及び/又はノーザンブロットを介して、又は本発明に記載の抗体によるウェスタンブロットでのスクリーニングを介して、SMN遺伝子又はエクソン7を欠くSMN遺伝子の過剰発現について試験し、そして選択した。
ポリクローナル抗体
以下の配列
遺伝子療法
Ragotら、Nature, Vol.361 (1993)に記載のアデノウィルス構築体を用い、正常SMN遺伝子をその中に挿入し、そしてこの遺伝子を欠く患者に筋肉内注射した。その患者を上記の実施例10記載のSSCP分析を利用してモニターした。
Claims (39)
- 図4及び5の配列に対応するcDNA配列を有するヒトSMN遺伝子T−BCD541。
- 下記の配列に対応するイントロン配列を含んで成る請求項1記載のSMN遺伝子:
−イントロンn°6に関する
5′AATTTTTAAATTTTTTGTAGAGACAGGGTCTCATTATGTTGCCCAGGGTGGTGTCAAGCTCCAGGTCTCAAGTGATCCCCCTACCTCCGCCTCCCAAAGTTGTGGGATTGTAGGCATGAGCCACTGCAAGAAAACCTTAACTGCAGCCTAATAATTGTTTTCTTTGGGATAACTTTTAAAGTACATTAAAAGACTATCAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTGAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTTATTTTCCTTACAG 3′
−イントロンn°7に関する
5′GTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACAGTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAAGAATTTTGATGCCAAAACTATTAGATAAAAGGTTAATCTACATCCCTACTAGAATTCTCATACTTAACTGGTTGGTTATGTGGAAGAAACATACTTTCACAATAAAGAGCTTTAGGATATGATGCCATTTTATATCACTAGTAGGCAGACCAGCAGACTTTTTTTTATTGTGATATGGGATAACCTAGGCATACTGCACTGTACACTCTGACATATGAAGTGCTCTAGTCAAGTTTAACTGGTGTCCACAGAGGACATGGTTTAACTGGAATTCGTCAAGCCTCTGGTTCTAATTTCTCATTTGCAG 3′。 - プローブとして使用する図4及び5の配列と、ストリンジェンシー条件においてハイブリダイズ可能である、請求項1又は2のいづれか1項記載のSMN遺伝子。
- SMN遺伝子の変異体であって、図2及び3の配列に対応するcDNA配列を有するC−BCD541遺伝子である、変異体。
- 図4及び5の配列に対応するcDNAである、請求項1〜3のいづれか1項記載のSMN遺伝子のcDNA配列であるヌクレオチド配列。
- 図4及び5の配列のうちのヌクレオチド34〜915を含んで成る、請求項1〜3のいづれか1項記載のSMN遺伝子をコードする配列。
- 図2及び3の配列のヌクレオチド34〜915を含んで成る、請求項4記載のSMN遺伝子の変異体をコードする配列。
- 以下の配列のいづれかに含まれている、又は以下の配列のいづれかに対応する、請求項1〜3のいづれか1項記載のSMN遺伝子のイントロン配列、
−イントロン6
5′AATTTTTAAATTTTTTGTAGAGACAGGGTCTCATTATGTTGCCCAGGGTGGTGTCAAGCTCCAGGTCTCAAGTGATCCCCCTACCTCCGCCTCCCAAAGTTGTGGGATTGTAGGCATGAGCCACTGCAAGAAAACCTTAACTGCAGCCTAATAATTGTTTTCTTTGGGATAACTTTTAAAGTACATTAAAAGACTATCAACTTAATTTCTGATCATATTTTGTTGAATAAAATAAGTAAAATGTCTTGTGAACAAAATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTATGTCTATATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTTATTTTCCTTACAG 3′
−イントロン7
5′GTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAACTTTATGGTTTGTGGAAAACAAATGTTTTTGAACAGTTAAAAAGTTCAGATGTTAAAAAGTTGAAAGGTTAATGTAAAACAATCAATATTAAAGAATTTTGATGCCAAAACTATTAGATAAAAGGTTAATCTACATCCCTACTAGAATTCTCATACTTAACTGGTTGGTTATGTGGAAGAAACATACTTTCACAATAAAGAGCTTTAGGATATGATGCCATTTTATATCACTAGTAGGCAGACCAGCAGACTTTTTTTTATTGTGATATGGGATAACCTAGGCATACTGCACTGTACACTCTGACATATGAAGTGCTCTAGTCAAGTTTAACTGGTGTCCACAGAGGACATGGTTTAACTGGAATTCGTCAAGCCTCTGGTTCTAATTTCTCATTTGCAG 3′。 - 図1又は図10の生存運動ニューロン(SMN)タンパク質をコードする単離されたDNA配列。
- 少なくとも約9個のヌクレオチドを含んで成り、そして請求項1〜9のいづれか1項記載の配列内を構成しているか、又は請求項1〜9のいづれか1項記載の配列と所定の条件においてハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列。
- 図15の配列に対応するcDNA配列を有するマウスSMN遺伝子。
- プローブであることを特徴とする、請求項10又は11に記載のヌクレオチド配列。
- 第二のプライマーと共に使用したときに、請求項1〜9のいづれか1項記載の配列を増幅することのできるプライマーであることを特徴とする、請求項10記載のヌクレオチド配列。
- 下記の配列から選ばれる、請求項13記載のヌクレオチド配列:
5′AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA 3′
5′TAAGGAATGTGAGCACCTTCCTTC 3′
5′GTAATAACCAAATGCAATGTGAA 3′
5′CTACAACACCCTTCTCACAG 3′。 - −図4及び5の配列のうちのヌクレオチド921〜1469を構成する配列の中に含まれているプライマーのペアー及び/又は
−下記の配列を含んで成るプライマーのペアー
5′AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA 3′
5′TAAGGAATGTGAGCACCTTCCTTC 3′
を含んで成ることを特徴とする、請求項13記載のプライマーのセット。 - −以下の配列を有するプライマーのペアー:
5′AGACTATCAACTTAATTTCTGATCA 3′
5′TAAGGAATGTGAGCACCTTCCTTC 3′
−以下の配列を含んで成るプライマーのペアー:
5′GTAATAACCAAATGCAATGTGAA 3′
5′CTACAACACCCTTCTCACAG 3′
−以下の配列のいづれかを有するプライマーのペアー:
5′AGG GCG AGG CTC TGT CTC A 3′
5′CGG GAG GAC CGC TTG TAG T 3′;
5′GCC GGA AGT CGT CAC TCT T 3′
5′GGG TGC TGA GAG CGC TAA TA 3′;
5′TGT GTG GAT TAA GAT GAC TC 3′
5′CAC TTT ATC GTA TGT TAT C 3′;
5′CTG TGC ACC ACC CTG TAA CAT G 3′
5′AAG GAC TAA TGA GAC ATC C 3′;
5′CGA GAT GAT AGT TTG CCC TC 3′
5′AG CTA CTT CAC AGA TTG GGG AAA G 3′;
5′CTC ATC TAG TCT CTG CTT CC 3′
5′TGG ATA TGG AAA TAG AGA GGG AGC 3′;
5′CAC CCT TAT AAC AAA AAC CTG C 3′
5′GAG AAA GGA GTT CCA TGG AGC AG 3′;
5′GAG AGG TTA AAT GTC CCG AC 3′
5′GTG AGA ACT CCA GGT CTC CTG G 3′;
5′TGA GTC TGT TTG ACT TCA GG 3′
5′GAA GGA AAT GGA GGC AGC CAG C 3′;
5′TTT CTA CCC ATT AGA ATC TGG 3′
5′CCC CAC TTA CTA TCA TGC TGG CTG 3′;
5′CCA GAC TTT ACT TTT TGT TTA CTG 3′
5′ATA GCC ACT CAT GTA CCA TGA 3′;
5′AAG AGT AAT TTA AGC CTC AGA CAG 3′
5′CTC CCA TAT GTC CAG ATT CTC TTG 3′;
5′AGA CTA TCA ACT TAA TTT CTG ATC A 3′
5′TAA GGA ATG TGA GCA CCT TCC TTC 3′;
5′AGA CTA TCA ACT TAA TTT CTG ATC A 3′
5′GTA AGA TTC ACT TTC ATA ATG CTG 3′;
5′CTT TAT GGT TTG TGG AAA ACA 3′
5′GGC ATC ATA TCC TAA AGC TC 3′;
5′GTA ATA ACC AAA TGC AAT GTG AA 3′
5′CTA CAA CAC CCT TCT CAC AG 3′;and
5′GGT GTC CAC AGA GGA CAT GG 3′
5′AAG AGT TAA CCC ATT CCA GCT TCC 3′
を含んで成るプライマーのセット。 - 請求項1〜11のいづれか1項記載の配列と反転相補性の配列であるアンチセンスヌクレオチド配列。
- 図1のアミノ酸配列を含んで成る単離されたヒト生存運動ニューロン(SMN)タンパク質。
- トランケートされ、且つ図10及び11のアミノ酸配列を含んで成る請求項18記載のタンパク質。
- 図15のアミノ酸配列を含んで成る、単離されたマウス生存運動ニューロン(SMN)タンパク質。
- 運動ニューロン障害のインビトロ検査のためのキットであって:
−請求項15又は16のいづれか1項記載のプライマーのセット;
−増幅反応のための試薬;及び
−増幅生成物の検出のためのプローブ;
を含んで成るキット。 - 請求項12記載のプローブを含んで成る、運動ニューロン障害のインビトロ検査のためのキット。
- SMAの検査のための請求項21又は22記載のキット。
- 請求項1〜11のいづれか1項記載の配列を含んで成ることを特徴とする、クローニング又は発現ベクター。
- 運動ニューロン向性を有することを特徴とする請求項24記載のベクター。
- 例えばポリオウィルス、アデノウィルス又はヘルペスウィルスであることを特徴とする、請求項25記載のベクター。
- レトロウィルスベクターであることを特徴とする、請求項24記載のベクター。
- 請求項24〜27のいづれか1項記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする、宿主細胞、例えば骨髄細胞、繊維芽細胞、上皮細胞。
- 請求項1〜11のいづれか1項記載の配列、及び運動ニューロンに対する向性を有するポリペプチドをコードすることのできる配列を含んで成ることを特徴とする、組換ヌクレオチド配列。
- 脊髄筋萎縮、任意の栄養性外側硬化症及び一次外側硬化症を含む運動ニューロン障害の検査のための方法であって:
(a)患者の試料からDNAを抽出する;
(b)前記DNAを請求項15又は16のいづれか1項記載のプライマーにより増幅させる;
(c)この増幅したDNAをSCCPにかける;
(d)このゲルをオートラジオグラフィーにかける;そして
(e)運動ニューロン障害の有無を検出する;
工程を含んで成る方法。 - 前記運動ニューロン障害が脊髄筋萎縮である、請求項30記載の方法。
- 前記工程(c)及び(d)を、BsrI酵素による消化の工程に置き換える、請求項30記載の方法。
- 脊髄筋萎縮を検査するための方法であって、
(a)患者の試料からDNAを抽出する;
(b)前記DNAを、ストリンジェンシー条件において図4及び5のDNA配列全体又はその一部を含んで成るDNAプローブとハイブリダイズさせる;そして
(c)形成された可能性のあるハイブリドを検出する;
ことを含んで成る方法。 - 前記プローブが放射性ラベルされている、請求項33記載の方法。
- 図1のSMNタンパク質に対して、又は図10のタンパク質に対して、又は図15のタンパク質に対して誘導したモノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清。
- 先天性多発性関節拘縮症(AMC)を検査するための方法であって:
(a)患者の試料からDNAを抽出する;
(b)前記DNAをSMN遺伝子のエクソン7又はエクソン8由来の未ラベルプライマーを用いるPCRを介して増幅させる;
(c)この増幅させたDNAをSCCPにかける;
(d)このゲルをオートラジオグラフィーにかける;そして
(e)先天性多発性関節拘縮症の有無を検出する;
工程を含んで成る方法。 - 図13の単離されたヌクレオチド配列。
- 図1のヒトSMNタンパク質又は図10のトランケートタンパク質のみを発現する遺伝子導入マウス。
- 図1の突然変異したSMNタンパク質を発現する遺伝子導入マウス。
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