JP4285582B2 - L−グルタミン酸生産菌及びl−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
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Description
<1>本発明の微生物本発明の腸内細菌群に属する微生物は、腸内細菌群に属し、かつ、コリネ型細菌由来のCS遺伝子の導入によってL−グルタミン酸生産能が付与されるか、又はL−グルタミン酸生産能が向上するものであれば特に制限されないが、例えば、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、パントエア属又はエシェリヒア属に属する細菌が挙げられる。これらの中では、エンテロバクター属またはクレブシエラ属に属する細菌が好ましい。以下に、これらの細菌の具体的な例を示すが、本発明の微生物はこれらに限定されない。
エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)
エンテロバクター・アムニゲナス(Enterobacter amnigenus)
エンテロバクター・アスブリア(Enterobacter asburiae)
エンテロバクター・クロエッケ(Enterobacter cloacae)
エンテロバクター・ディソルベンス(Enterobacter dissolvens)
エンテロバクター・ジェルゴビア(Enterobacter gergoviae)
エンテロバクター・ホルマエッケ(Enterobacter hormaechei)
エンテロバクター・インターメディウス(Enterobacter intermedius)
エンテロバクター・ニミプレスラリス(Enterobacter nimipressuralis)
エンテロバクター・サカザキ(Enterobacter sakazakii)
エンテロバクター・テイロレ(Enterobacter taylorae)
エンテロバクター・アグロメランス ATCC12287エンテロバクター・アグロメランス AJ13355エンテロバクター・アグロメランス AJ13355は、平成10年2月19日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERM P−16644として寄託され、平成11年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP−6614が付与されている。また、エンテロバクター・アグロメランス ATCC12287は、ATCCより分譲を受けることができる。
(2)酸素に対する挙動:通性嫌気性
(3)カタラーゼ:ポジティブ
(4)オキシダーゼ:ネガティブ
(5)硝酸還元能:ネガティブ
(6)フォゲス−プロスカウエル試験:ポジティブ
(7)メチルレッド試験:ネガティブ
(8)ウレアーゼ:ネガティブ
(9)インドール生成:ポジティブ
(10)運動性:有り
(11)TSI培地での硫化水素生成:微弱な活性あり
(12)β−ガラクトシダーゼ:ポジティブ
(15)有機酸資化性:クエン酸:ポジティブ酒石酸:ネガティブグルコン酸:ポジティブ酢酸:ポジティブマロン酸:ネガティブ
(16)アルギニンデヒドラターゼ:ネガティブ
(17)オルチンデカルボキシラーゼ:ネガティブ
(18)リジンデカルボキシラーゼ:ネガティブ
(19)フェニルアラニンデアミナーゼ:ネガティブ
(20)色素形成 黄色
(21)ゼラチン液化能:ポジティブ
(22)生育pH pH4生育不良、pH4.5〜7生育良好
(23)生育温度 25℃生育良好、30℃生育良好、37℃生育良好、42℃生育可、45℃生育不可
クレブシエラ・プランティコーラ(Klebsiella planticola)
クレブシエラ・テリゲナ(K. terrigena)
さらに好ましくは、クレブシエラ・プランティコーラ AJ13399が挙げられる。クレブシエラ・プランティコーラ AJ13399は、平成10年2月19日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERMP−16646として寄託され、平成11年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM
BP−6616が付与されている。
(2)運動性:なし
(3)胞子:なし
(4)LabM栄養寒天培地でのコロニー形態:円形、表面は平滑、クリーム色、なめらか、***状、光沢有り。
(5)グルコースOFテスト:発酵能ポジティブ
(6)グラム染色性:陰性
(7)酸素に対する挙動:通性嫌気性
(8)カタラーゼ:ポジティブ
(9)オキシダーゼ:ネガティブ
(10)ウレアーゼ:ポジティブ
(12)β−ガラクトシダーゼ:ポジティブ
(13)アルギニンデヒドラターゼ:ネガティブ
(14)オルニチンデカルボキシラーゼ:ネガティブ
(15)リジンデカルボキシラーゼ:ポジティブ
(16)トリプトファンデアミナーゼ:ネガティブ
(17)フォゲス−プロスカウエル試験:ポジティブ
(18)インドール生成:ポジティブ
(19)TSI培地での硫化水素生成:ネガティブ
(20)クエン酸資化性:ポジティブ
(22)ゼラチン液化能:ネガティブ
(23)糖からの酸の生成グルコース:ポジティブマンニトール:ポジティブラムノース:ポジティブアラビノース:ポジティブシュークロース:ポジティブソルビトール:ポジティブイノシトール:ポジティブメリビオース:ポジティブアミグダリン:ポジティブア
ドニトール−ペプトン−水:ポジティブセロビオース−ペプトン−水:ポジティブデュルシトール−ペプトン−水:ネガティブラフィノース−ペプトン−水:ポジティブ
(24)生育温度 37℃生育良好、45℃生育不可
セラチア・リクエファシエンス(Serratia liquefacience)
セラチア・エントモフィラ(Serratia entomophila)
セラチア・フィカリア(Serratia ficaria)
セラチア・フォンティコーラ(Serratia fonticola)
セラチア・グリメシ(Serratia grimesii)
セラチア・プロテアマキュランス(Serratia proteamaculans)
セラチア・オドリフェラ(Serratia odorifera)
セラチア・プリムシカ(Serratia plymuthica)
セラチア・ルビダエ(Serratia rubidaea )
セラチア・リクエファシエンス ATCC14460セラチア・リクエファシエンス ATCC14460は、ATCCより分譲を受けることができる。
エルビニア・ヘルビコーラ(Erwinia herbicola)(現在はパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)として分類されている)
エルビニア・アナナス(E. ananas)
エルビニア・カクティシダ(E. cacticida)
エルビニア・クリサンテミ(E. chrysanthemi)
エルビニア・マロティボラ(E. mallotivora)
エルビニア・ペルシシナス(E. persicinus)
エルビニア・プシディ(E. psidii)
エルビニア・ケルシナ(E. quercina)
エルビニア・ラポンティシ(E. rhapontici)
エルビニア・ルブリファシエンス(E. rubrifaciens)
エルビニア・サリシス(E. salicis)
エルビニア・ウレドボラ(E. uredovora)
Bacteriology)第9版には、エルビニア・ヘルビコーラは記載されておらず、エルビニア・ヘルビコーラとして分類されていた微生物は、パントエア・アグロメランスに分類されている。このように、エルビニア属に属する微生物及びパントエア属に属する微生物は、互いに近縁である。したがって、パントエア属に属する微生物は、エルビニア属に属する微生物と同様に使用することができる。そのようなパントエア属に属する微生物として、パントエア・アグロメランス及びパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)が挙げられる。エルビニア・ヘルビコーラ IAM1595は、パントエア・アグロメランス AJ2666と命名され、平成11年2月25日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERMBP−6660としてブダペスト条約に基づき国際寄託され
ている。
エシェリヒア・コリB11エシェリヒア・コリK−12(ATCC10798)
エシェリヒア・コリB(ATCC11303)
エシェリヒア・コリW(ATCC9637)
エシェリヒア・コリK−12(ATCC10798)、エシェリヒア・コリB(ATCC11303)、エシェリヒア・コリW(ATCC9637)は、ATCCより分譲を受けることができる。
ブレビバクテリウム・フラバム(コリネバクテリウム・グルタミカム)
ブレビバクテリウム・インマリオフィラムブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)
ブレビバクテリウム・ロゼウムブレビバクテリウム・サッカロリティカムブレビバクテリウム・チオゲニタリスブレビバクテリウム・アルバムブレビバクテリウム・セリヌムミクロバクテリウム・アンモニアフィラム具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868ブレビバクテリウム・ディバリカタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)ATCC14020ブレビバクテリウム・フラバム(コリネバクテリウム・グルタミカム) ATCC13826、ATCC14067ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム) ATCC13665、ATCC13869、ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
内のgltA遺伝子のコピー数が上昇し、その結果CS活性が高められる。
る方法がある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子(欠失型遺伝子)を作製する。次いで、この欠失型遺伝子をエンテロバクター属またはセラチア属に属する微生物の細胞に導入し、相同組み換えを利用して染色体上の目的遺伝子を前記欠失型遺伝子に置換する(遺伝子破壊)。
要である。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のgltA遺伝子を有するプラスミドは、以下のようにして構築した。コリネバクテリウム・グルタミカムのgltA遺伝子の塩基配列(Microbiology, 1994, 140, 1817-1828)をもとに、配列番号1及び2に示す塩基配列を有するプライマーDNAを用い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、約3kbのgltA遺伝子断片を得た。この断片をSmaI消化したプラスミドpHSG399(宝酒造(株)より購入)に挿入し、プラスミドpHSGCBを得た(図1)。次に、pHSGCBをHindIIIで切断し切り出された約3kbのgltA遺伝子断片をHindIII消化したプラスミドpMW218(ニッポンジーン(株)より購入)に挿入し、プラスミドpMWCBを得た(図1)。得られたプラスミドpMWCBがgltA遺伝子を発現していることは、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355株中での酵素活性の測定によって確認した。
対象として、エシェリヒア・コリ由来のgltA遺伝子を有するプラスミドを、以下のようにして構築した。gltA遺伝子を有するプラスミドpTWVC(WO97/08294号)をHindIII、EcoRI消化して得られたgltA遺伝子を有するDNA断片を精製回収後、プラスミドpMW219(ニッポンジーン(株)より購入)のHindIII、EcoRIサイトに導入することによって、プラスミドpMWCを得た(図2)。得られたプラスミドpMWCがgltA遺伝子を発現していることは、エシェリヒア・コリのgltA遺伝子欠損株の栄養要求性の相補と酵素活性の測定によって確認した。
エンテロバクター・アグロメランスAJ13355株及びクレブシエラ・プランティコーラAJ13399株を、pMWCあるいはpMWCBを用いて形質転換した。得られた形質転換株、AJ13355/pMWC、AJ13355/pMWCB、AJ13399/pMWC、AJ13399/pMWCBを、それぞれグルコース40g/L、硫酸アンモニウム20g/L、硫酸マグネシウム7水塩0.5g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、塩化ナトリウム0.5g/L、塩化カルシウム7水塩0.25g/L、硫酸第一鉄7水塩0.02g/L、硫酸マンガン4水塩0.02g/L、硫酸亜鉛2水塩0.72mg/L、硫酸銅5水塩0.64mg/L、塩化コバルト6水塩0.72mg/L、ホウ酸0.4mg/L、モリブデン酸ナトリウム2水塩1.2mg/L、酵母エキス2g/L、炭酸カルシウム30g/Lを含有する培地20mlを注入した500ml容フラスコに接種して、37℃で15時間振とう培養した。培養終了後
、培養液中に蓄積したL−グルタミン酸及び残存したグルコースを測定した結果を表1に示した。
Claims (4)
- コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属するコリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子が導入され、L−グルタミン酸生産能を有する、パントエア・アグロメランスに属する微生物。
- 配列番号1および2のプライマーを用いて増幅されるコリネ型細菌由来のクエン酸シンターゼ遺伝子が導入され、L−グルタミン酸生産能を有する、パントエア・アグロメランスに属する微生物。
- 前記クエン酸シンターゼ遺伝子が、コリネバクテリウム・グルタミカムまたはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに由来する請求項1または2記載の微生物。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の微生物を液体培地に培養し、培地中にL−グルタミン酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするL−グルタミン酸の製造法。
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