JP2003061647A - 骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を含む神経再生用医薬組成物 - Google Patents

骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を含む神経再生用医薬組成物

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を含む
神経再生用医薬組成物の提供。 【解決手段】 本願発明は、骨髄間質細胞を、インビト
ロにおいて、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞に分
化・誘導させる方法であって、以下のステップ：骨髄か
ら骨髄間質細胞を採取し、そして標準的な基礎培地に血
清を加えた培地中で培養し；還元剤を上記培養液に添加
し、そしてさらに培養し；分化誘導剤を上記培養液に添
加し、そしてさらに培養し；並びにサイクリックＡＭＰ
上昇作用性薬剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及び
／又はグリア細胞分化生存作用性因子を上記培養液に添
加し、さらに培養して、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎ
ｎ細胞を得る；を含む前記分化・誘導方法を、提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、骨髄間質細胞をイ
ンビトロにおいてＳｃｈｗａｎｎ細胞に誘導する方法、
及び当該骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を含む神
経再生用医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】神経系、特に脳・脊髄に代表される中枢
神経はひとたび障害を受けると不可逆的であり、最終的
には変性という過程を辿ると考えられている。交通外傷
やスポーツ外傷、虚血、腫瘍、長期の炎症、原因不明の
変性疾患を含め、多くの罹患人口を抱える神経疾患への
突破口は社会的急務である。中枢神経の障害が不可逆的
である理由は、組織を構成するグリア環境にあると考え
られている。脳・脊髄と同じグリア環境をもち、かつ、
中枢神経である視神経を例にとって説明する。
【０００３】１）まず神経線維が変性を起こし、消失し
ていく。この過程で神経を被覆していたミエリン鞘も変
性を起こし、細胞残渣となる（図１ｂ参照）。オリゴデ
ンドロサイトの形成するこれらミエリン鞘には神経線維
の再生・伸長を強力に阻害する物質が含まれていること
がわかっている（１）。 ２）アストロサイトが増殖肥大し、グリオーシスｇｌｉ
ｏｓｉｓを形成する（図１ｂ参照）。すなわち神経組織
に置き換わって主要な場所を占拠し、物理的に再生を阻
害するのである（２）。グリオーシスを起こしたアスト
ロサイトは正常時とはかなり形態的に様相が異なり、突
起数が増大し互いに入り組んだ形態を呈する。特に損傷
においては、障害部位は神経線維の走行に対して直角方
向に何層ものアストロサイトが重なり、互いの突起で連
結し合い、あたかも蓋をしてしまったかのようにバリア
ー構造を形成してしまう。 ３）変性によるオリゴデンドロサイトやそのミエリンな
どの細胞残渣の処理が、再生するほかの組織に比べて遅
い。その第一の理由として、末梢性のマクロファージや
単球などの免疫系細胞の侵入がきわめて少なく初期の段
階における残渣の処理が遅れるのであろう。
【０００４】視神経が再生しない理由として以下のもの
が提案されている。 １）先にも述べたが、オリゴデンドロサイトは神経再生
において強力な阻害作用を持っている。具体的には、オ
リゴデンドロサイトから抽出されたＮｏｇｏという分子
が阻害することが示されている（１，９）。培養系を使
った実験では、神経突起が伸長しているときにオリゴデ
ンドロサイト由来のミエリン鞘と接触すると突起は伸長
を止めるだけでなく、突起を退縮させることがわかって
いる（contact inhibition）。またミエリン鞘のあると
ころには神経突起は伸長せず、培養においてはそれらを
避けるように突起が進んでいくことが示されている。 ２）グリオーシスを起こしたアストロサイトはさまざま
な阻害物質を産生することがわかっており、なかでもケ
ラチン硫酸やコンドロイチン硫酸などのプロテオグリカ
ンがあげられている（３）。
【０００５】３）損傷を受けても、視神経に限らず中枢
神経系は非常にサイレントな系である。そもそも免疫の
監視からはずれた系であり、逆にそのことが再生におい
ては不利になっているといわれている。例えば後述する
末梢神経系は、視神経とはグリア構成も異なっており、
また同じ神経組織でありながら再生する系としてこれま
でよく比較・検討されてきた。末梢神経組織では損傷後
速やかに（数時間〜２日以内で）末梢性マクロファージ
などの免疫系細胞が侵入し、細胞残渣が処理される。そ
れと同時に多くのサイトカインを分泌し、神経組織の再
生を促すことがわかっている。このように神経再生とい
うのは、ある反応が次の反応を起こすというようにさま
ざまな現象がカスケードのようにつながって起きている
のであるが、視神経ではマクロファージの初期段階での
侵入がみられない。これは視神経を含め中枢神経系に
は、マクロファージの活性を抑制する作用があることに
よるのではないかと推察されている（４）。複雑に発達
した中枢神経網がマクロファージによって消化されるの
を防ぐために、抑制機能を発達させてきたらしい。この
ように視神経では最初のきっかけ（ｔｒｉｇｇｅｒ）が
ないために再生に向かわず変性に陥るのではないかとい
うことが指摘されている。
【０００６】４）再生するには、神経線維を誘導する構
造的な足場が必要である。しかし、視神経では一度変性
が起こると再生のための道筋が消失してしまう。視神経
では一つのオリゴデンドロサイトが複数の神経線維のミ
エリン鞘を形成し、これらの有髄線維の周囲や、あるい
は無髄線維束をアストロサイトが覆っている（図２下参
照）。基底膜はグリア境界膜を形成しているアストロサ
イトの外側にあるのみで、言い換えると視神経全体がま
とめて一つの基底膜のさやに入っているのと同じであ
る。末梢神経では基底膜が再生の道筋として働いてい
る。したがって視神経においては神経線維が一度変性す
ると、各神経線維にとってのかつての道筋が消失してし
まうことになるのである。
【０００７】一方、末梢神経は、中枢神経と異なり再生
することができる。
【０００８】中枢神経とは異なり、末梢神経を構成する
主要な細胞はＳｃｈｗａｎｎ細胞である。また神経線維
は有髄・無髄のいずれの形態をとっていても、Ｓｃｈｗ
ａｎｎ細胞によって被覆されている（図２上参照）。Ｓ
ｃｈｗａｎｎ細胞は神経堤細胞（neural crest cell)に
由来し、神経再生に阻害的に作用する中枢性グリア（オ
リゴデンドロサイト、アストロサイト）は神経管（neur
al tube)に由来するというように、それぞれ発生起源を
異にしている。
【０００９】末梢神経は以下のように再生すると考えら
れる。 １）末梢神経では、切断などの損傷を受けると損傷部位
よりも末梢側ではＷａｌｌｅｒ変性（Wallerian degene
ration）が起きる（図３参照）。これはＳｃｈｗａｎｎ
細胞が、髄鞘を形成し分化した形態から未分化な状態に
逆戻りし、活性化され***増殖し、索状を呈することを
指す。末梢神経では個々の神経線維は独立してＳｃｈｗ
ａｎｎ細胞に包まれており、その外側は基底膜に覆われ
ている（図２参照）。すなわち各神経が別々の基底膜の
さやに入っている。したがって変性を起こしても基底膜
のさやの中で活性化されたＳｃｈｗａｎｎ細胞が増殖
し、索状構造を形成するのでこれを手がかりに元の神経
回路を再建することができるのである。Ｗａｌｌｅｒ変
性とはいいながら、変性ではなく実はこれが再生への第
一歩なのである。
【００１０】２）Ｗａｌｌｅｒ変性の一連の過程におい
て大きくかかわっているのが末梢性マクロファージであ
る。マクロファージは損傷部位よりも末梢側に素早く侵
入し、変性した神経線維やミエリンの残骸などを処理す
る（図３参照）と同時にＩＬ−１などのサイトカインを
出すことによってＳｃｈｗａｎｎ細胞を活性化する。何
がマクロファージの侵入を誘導するのかに関しては未だ
はっきりとした結論は出ていないが、Ｓｃｈｗａｎｎ細
胞自身ではないだろうかともいわれている。とにかくマ
クロファージのシグナルで活性化されたＳｃｈｗａｎｎ
細胞は、これから述べる神経成長因子など再生にとって
不可欠な種々の因子を合成し、神経再生を導くと考えら
れているのである。
【００１１】３）同じミエリン鞘でもＳｃｈｗａｎｎ細
胞のものであれば阻害作用は少ないらしい（５）。これ
はオリゴデンドロサイトのミエリン鞘が阻害作用を示す
のと大きく異なる点である。また、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞
とオリゴデンドロサイトでは、ミエリンを構成する蛋白
の組成に違いがあることもわかっている。このように中
枢のグリアは障害を受けても、末梢神経におけるＳｃｈ
ｗａｎｎ細胞のように未分化な形に先祖返りをして***
増殖したり、形態を大きく変えていくようなことをせ
ず、比較的分化したままの表現型を維持するのである。
その点、末梢神経は受けた障害に対して柔軟性に富んだ
素早い反応を示すのが特徴である。
【００１２】神経再生におけるＳｃｈｗａｎｎ細胞は、
以下の役割をもつと考えられている。
【００１３】Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は多くの因子を産生
し、拡散性に放出する。また自らの細胞膜表面には基底
膜が被っており、ここには細胞外基質成分（extracellu
lar matrix）が含まれる。さらにＳｃｈｗａｎｎ細胞膜
には、細胞接着分子が発現されていることがわかってお
り、これらのファクターが総合的に働いて神経再生が誘
導されていると考えられている（図４参照）。 １．拡散性因子 Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は多くの神経栄養因子を産生するこ
とがわかっているが、なかでも再生に関係ある主だった
ものを以下にあげる：１）ニューロトロフィンファミリ
ー、例えば、nerve growth factor、brain-derived neu
rotrophic factor、neurotrophin-3、neurotrophin-4/
5；２）毛様体神経栄養因子（ciliary neurotrophic fa
ctor）；３）ＦＧＦファミリー、例えば、acidic and b
asic fibroblast growth factor；４）インスリンファ
ミリー、例えば、insulin-like growth factor-Ｉ，I
I；５）腫瘍化促進因子（transforming growth factor-
β２，β３）。上記ニューロトロフィンは神経細胞に対
する生存のほか、突起伸長などの強力な作用がある。ほ
かの因子も神経に対する栄養因子としての作用や突起伸
長の作用もあるが、同時にＳｃｈｗａｎｎ細胞自身に対
する活性化作用も有するため、ａｕｔｏｃｒｉｎｅとし
ての作用機序も考えられている。
【００１４】２．細胞外基質成分 fibronectin、laminin、type IV collagen、tenascinな
どが含まれる。なかでも培養系などの実験ではfibronec
tin やlaminin が神経再生において支持的に働くといわ
れている。 ３．細胞接着分子 細胞接着分子は数多くのものが同定されてきている。こ
こではＳｃｈｗａｎｎ細胞と神経再生において関連のあ
るものに焦点を当てる。 １）免疫グロブリンスーパーファミリー ＮＣＡＭ（neural cell adhesion molecule)やＬ１は特
にＳｃｈｗａｎｎ細胞の膜上に発現され、神経線維がＳ
ｃｈｗａｎｎ細胞上を足場とし接触しながら伸長してい
くときに接着分子として大きな役割を果たす。両者と
も、細胞骨格とつながり細胞の形態維持に働くと同時
に、イノシトールリン酸系やカルシウムチャンネル活性
化を通じて細胞内活性化を図っている。また、神経の伸
長がある程度行われ、神経線維の再ミエリン化が始まる
ときにＭＡＧ（myelin associated glycoprotein）がＳ
ｃｈｗａｎｎ細胞との間に発現する。
【００１５】２）カドヘリンスーパーファミリー カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）はカルシウム依存性の
細胞接着分子で多くの種類が同定されているが、神経再
生において特に関与しているのがＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ
である。これも免疫グロブリンスーパーファミリーであ
るＮＣＡＭやＬ１と同様、神経線維がＳｃｈｗａｎｎ細
胞上を接触し、認識しながら伸長していくときに大きな
役割を果たす。 ３）インテグリンスーパーファミリー インテグリンは上述の細胞外基質に対する細胞側の受容
体である。α、βの２つのサブユニットからなるｈｅｔ
ｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃな分子である。またカドヘリン同
様細胞骨格と連結しており、細胞間の情報伝達において
も直接的に働いていると考えられている。Ｓｃｈｗａｎ
ｎ細胞においてはα6 β4 というサブタイプが発現して
おり、再生中の再ミエリン化の過程において役割を果た
している。
【００１６】中枢神経再生の試みは過去何十年にもわた
り多くの研究者により試みられてきた。それらを総括す
ると、 １）手や足などの末梢神経を一部切り出し、中枢神経に
自家移植することによって再生が認められている。した
がって、末梢神経は中枢神経の再生を促す環境をもって
いるといえる。これは、１９８３年のカナダのＡｇｕａ
ｙｏらによる研究が発端になっている（８）。 ２）上述のように、中枢神経そのものに神経が再生する
ことを抑える働きがある。これは２０００年にNatureに
より掲載されたNogo因子をはじめ、以前より分かってい
るミエリン関連タンパク質などが抑制作用を有すること
が報告されている。そこでこれらに対する抗体を注入し
てこれらの因子を中和してしまうと多少なりとも中枢神
経は再生するということが報告されている。
【００１７】３）細胞を移植することによって再生を促
す。これには以下の２タイプがある： −ａ）変性して失われた神経細胞を供給して、神経回路
を再建する。神経幹細胞、胎児由来の神経細胞を用いた
アプローチである。 −ｂ）神経そのものを供給するのではなく、神経の再生
能力を誘導することができる細胞（グリア細胞）を移植
し、再建する。このような細胞として、末梢神経由来の
Ｓｃｈｗａｎｎ細胞、神経栄養因子を導入した中枢神経
由来のグリア細胞、同じく中枢神経由来の上衣細胞、臭
神経由来の支持細胞、神経幹細胞などが試みられてい
る。しかしながら、上記いずれの方法も一長一短であ
り、未だ画期的な方法は開発されていない。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】発明者らはこれまで神
経再生並びに機能再建法の開発に長らく取り組んでき
た。特に、上記３）−ｂ）に記載した末梢神経の組織構
成を担っているＳｃｈｗａｎｎ細胞を用いた方法であ
る。Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は末梢神経に存在するが、自ら
の組織である末梢神経はもとより中枢神経系も含めて再
生誘導能を有し、損傷部位への移植によって再生線維の
足場を提供して有効な神経再生を導くこと、また神経が
正常に機能する上で不可欠な要素である神経跳躍伝導を
担うミエリンもＳｃｈｗａｎｎ細胞の移植によって再建
可能であることを解明した。動物実験レベルでもＳｃｈ
ｗａｎｎ細胞を移植することによって中枢神経である視
神経が切断状態から再生することを確認している。しか
しながら、動物実験レベルでは比較的容易なＳｃｈｗａ
ｎｎ細胞の採取・培養もヒトとなると、様々な困難があ
る。例えば、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は末梢神経に存在する
ため、手や足の神経片を採取し、そこから単離しなくて
はならないので、採取後ドナーに障害が残ることにな
る。さらに成人由来のＳｃｈｗａｎｎ細胞の増殖能には
限界があり、大量培養には時間がかかり難しい、という
点も挙げられる。また、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞に分化する
と考えられている神経堤細胞(neural crest cell)は、
胎児の末梢神経からしか採取できない。したがって、神
経再生治療に用いることができる、培養により多量に入
手することができる天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞代替物を提
供する必要性が存在する。
【００１９】神経系においては、成人になっても脳のご
く一部に神経幹細胞(neuronal stemcell)が存在するこ
とが判っている。これらは神経系を構成するニューロ
ン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトなどに分化
する（図５参照）。しかしながら、幹細胞といってもご
く僅かしか存在せず、しかも採取するには開頭しなけれ
ばならない。また、最近の研究により、胚葉の概念を超
えて、ある種の細胞は全く別種の細胞にtransdifferent
iateする可能性があるということが判ってきた（図６参
照）。例えば、血液細胞が神経細胞になったり、逆に神
経細胞が血液になったりする可能性があるということで
ある。しかしながら、本願出願当時、骨髄間質細胞は、
造血支持機能のみならず、それ自体が骨芽細胞、血管内
皮細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞等に分化で
きる間葉系の幹細胞又は前駆細胞であることが判ってい
たが（１０）、骨髄間質細胞を、実際に、神経堤細胞(n
eural crest cell)由来のＳｃｈｗａｎｎ細胞に分化さ
せることができるかどうかについては、その可能性を示
唆する文献すら存在せず、かつ、その分化・誘導方法も
全く確立されていなかった。
【００２０】以上の現状を鑑み、本願発明者らは、上述
のように入手困難である神経堤細胞(neural crest cel
l)の代わりに骨髄間質細胞を用いてＳｃｈｗａｎｎ細胞
への分化・誘導の実験・研究を試みた。なぜなら、骨髄
間質細胞であれば骨髄穿刺によって病院の外来レベルで
の採取が容易であり、非常に旺盛な増殖能を持つので大
量培養が比較的短い時間で可能であるからである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】今般、本願発明者らは、
上記実験を繰返した結果、複数段階の操作により、骨髄
間質細胞をＳｃｈｗａｎｎ細胞に、高効率で分化・誘導
させることに初めて成功した。さらに、かかる分化・誘
導方法により得られた骨髄間質細胞由来のＳｃｈｗａｎ
ｎ細胞を損傷視神経（中枢神経）に移植することにより
実際に神経が再生・伸長することを確認し、ここに本願
発明を完成するに至った。
【００２２】本願発明の１の態様においては、骨髄間質
細胞を、インビトロにおいて、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈ
ｗａｎｎ細胞に分化・誘導させる方法であって、以下の
ステップ： （１） 骨髄から骨髄間質細胞を採取し、そして標準的
な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し； （２） 還元剤を上記培養液に添加し、そしてさらに培
養し； （３） 分化誘導剤を上記培養液に添加し、そしてさら
に培養し；並びに （４） サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイク
リックＡＭＰアナログ、及び／又はグリア細胞分化生存
作用性因子を上記培養液に添加し、さらに培養して、骨
髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を得る；を含む前記
分化・誘導方法が、提供される。
【００２３】前記ステップ（１）における細胞の密度
は、５０％のコンフルエントの時点であることができ、
好ましくは４代まで継代培養された時点であることがで
きる。前記標準的な基礎培地がＥａｇｌｅ’ｓアルファ
修飾最小必須培地(Minimum Essential Medium Eagle Al
pha Modification)（ＳＩＧＭＡ社、Ｍ４５２６）であ
り、そして前記血清はウシ胎児血清(fetus carf serum)
（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社、１４−５０１Ｆ、Ｌｏ
ｔ＃６１−１０１２）であることができる。前記血清
は、２０％の濃度であることができる。前記還元剤がＳ
Ｈ試薬であり、好ましくは、前記ＳＨ試薬はβ−メルカ
プトエタノール(beta-mercaptoethanol)（ナカライテス
ク社 ２１４−１８ Ｌｏｔ＃ＭＯＭ７５８２）である
ことができる。前記還元剤の濃度は、１ｎＭ〜１０ｍ
Ｍ、好ましくは１０ｎＭ〜５ｍＭ、そしてさらに好まし
くは１００μＭ〜２ｍＭであることができる。前記ステ
ップ（２）における培養時間は、１時間〜５日間、好ま
しくは１２時間〜４８時間、そしてさらに好ましくは１
８時間〜３０時間であることができる。上記試薬の濃度
は細胞が直接触れる培地中の濃度を示す（以下の試薬に
おいても同様である）。
【００２４】前記分化誘導剤はレチノイン酸(retinoic
acid, All Trans)（ＳＩＧＭＡ社、Ｒ−２６２５）であ
ることができる。前記分化誘導剤の濃度は、０．００１
ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜
２００ｎｇ／ｍｌ、そしてさらに好ましくは１０ｎｇ／
ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌであることができる。前記ステッ
プ（３）においては、ステップ（２）の終了後、ステッ
プ（２）において用いた培地を、前記分化誘導剤含有培
地に交換することができる。この新たな培地は、前記分
化誘導剤を含有することを除きステップ（１）において
用いた培地と同一であることができる。前記ステップ
（３）における培養時間は、１時間〜３０日間、好まし
くは１２時間〜７日間、さらに好ましくは２日間〜４日
間であることができる。
【００２５】前記サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤又は
サイクリックＡＭＰアナログが、フォルスコリン（Ｆｏ
ｒｓｋｏｌｉｎ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、３４４２
７３）であることができる。前記サイクリックＡＭＰ上
昇作用性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度は、
０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは
１００ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは
１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌであることができる。
【００２６】前記グリア細胞分化生存作用性因子は、Ｎ
ｅｕｒｅｇｕｌｉｎ、血小板由来成長因子ＡＡ(platele
t-derived growth factor-alpha,alpha)(Ｐｅｐｒｏｔ
ｅｃｈ ＥＣ，ＬＴＤ．，３９６−ＨＢ)、塩基性線維
芽細胞成長因子(basic-fibroblast growth factor)（Ｐ
ｅｐｒｏｔｅｃｈ ＥＣ，ＬＴＤ．，１００−１８
Ｂ）、及びそれらの混合物から成る群から選ばれること
ができ、前記Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎは、Ｈｅｒｅｇｕｌ
ｉｎ（商標）（Ｒ＆Ｄ社、３９６−ＨＢ）であることが
できる。前記グリア細胞分化生存作用性因子の濃度は、
０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、前記血小板
由来成長因子ＡＡに関しては、この濃度は、好ましくは
０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましく
は１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌであり、そして前記塩
基性線維芽細胞成長因子に関しては、この濃度は、好ま
しくは１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、さらに好ましく
は１００ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌであることがで
きる。前記ステップ（４）における培養時間は、１時間
〜３０日間、好ましくは４日間から１０日間であること
ができる。
【００２７】本願発明の他の態様においては、前記分化
・誘導方法により得られた骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａ
ｎｎ細胞が提供される。本願発明のさらに他の態様にお
いては、骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を含む神
経再生用医薬組成物が提供される。
【００２８】本願明細書中、用語「骨髄間質細胞」と
は、骨髄中に存在する造血系以外の細胞をいい、骨、軟
骨等の細胞に分化できると考えられている。骨髄間質細
胞は、図７の免疫蛍光写真に示すように、Ｔｈｙ１．２
が＋、β１−インテグリンが＋、かつ、ＣＤ３４が−で
ある。Ｓ−１００（カルシウム結合タンパク質）は＋の
ものと−のものがある。上記Ｔｈｙ１．２、β１−イン
テグリン、及びＣＤ３４に対する抗体を、それぞれ、用
いた。本願明細書中、用語「天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞」
とは、生物の体内に存在する末梢神経から採取したＳｃ
ｈｗａｎｎ細胞をいう。図８上段の免疫蛍光写真に示す
ように、Ｓ−１００＋である。
【００２９】本願明細書中、用語「骨髄間質細胞由来Ｓ
ｃｈｗａｎｎ細胞」とは、（１）形態学的に天然Ｓｃｈ
ｗａｎｎ細胞に酷似し、かつ、継代培養によって骨髄間
質細胞の形態に復帰せず、（２）図８下段の免疫蛍光写
真に示すように、免疫染色においてＰ７５（nerve grow
th factor (NGF) receptor、神経成長因子受容体、低親
和性）、Ｓ−１００、ＧＦＡＰ（glial fibrillary aci
dic protein、中間径フィラメントの一種）、Ｎｅｓｔ
ｉｎ（中間径フィラメントの一種）、及びＯ４（Ｓｃｈ
ｗａｎｎ細胞やオリゴデンドロサイトなどミエリンを作
る細胞のマーカー）との反応において天然Ｓｃｈｗａｎ
ｎ細胞と同様の反応を示し、そして（３）神経再生能力
に関して天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と同様の形質を有する
が、分化・誘導履歴の違いにより、天然Ｓｃｈｗａｎｎ
細胞と区別され得るＳｃｈｗａｎｎ細胞をいう。Ｐ７
５、Ｓ−１００、ＧＦＡＰ、Ｎｅｓｔｉｎ、及びＯ４に
対する抗体を、それぞれ以下から得た：Anti-nerve gro
wth factor-receptor, Boehringer Mannheim社、119864
5 ; Anti-S-100, DAKO社、z-311 ; Anti-Glial fibrill
ary acidic protein, DAKO社、L-1812 ; Anti-Nestin,
Bioproducts社、BMS4353 ; Anti-O4, Boehringer Mannh
eim社、1518925。
【００３０】図９の顕微鏡写真に示すように、本願発明
に係る複数段階の処理を行った後の骨髄間質細胞（図９
の右側上下の写真）は、天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞（図９
の左側の写真）と同様の形態を示す。図１０に、本願発
明に係る骨髄間質細胞の分化・誘導方法において、上記
ステップ（２）〜（４）又はその一部の試薬を欠いた場
合に得られる骨髄間質細胞の形態を示す。図１０の顕微
鏡写真中、上段左端の写真は、天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞
のものである。下段右端の写真は、処理前の骨髄間質細
胞のものである。ここで、上段中央は、本願発明に係る
分化・誘導方法におけるステップ（２）〜（４）を省略
せずに行ったものであり、本願発明に係る処理により天
然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と同様の形態を呈する細胞を生じ
ていることがわかる。上段右端の写真は、上記ステップ
（４）を省略したものであり、下段左端及び下段中央の
写真は、それぞれ、上記ステップ（３）及び上記ステッ
プ（４）における分化誘導剤レチノイン酸及びフォルス
コリンを省略したものである。
【００３１】したがって、上記ステップ（２）〜（４）
に記載する複数段階の処理が、骨髄間質細胞を、骨髄間
質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞に、高効率で、分化・誘
導することがわかる。本願明細書中に使用するとき、用
語「高効率」とは、本願発明に係る分化・誘導方法によ
り、出発骨髄間質細胞が、最終骨髄間質細胞由来Ｓｃｈ
ｗａｎｎ細胞に変換される割合が高いことをいう。本願
発明に係る分化・誘導方法においては、この高効率は、
５０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは
９０％以上、そして最も好ましくは９５％以上である。
上記個々のステップは、いずれも、周知であったけれど
も、本願発明における上記ステップの選択及び最適な組
み合わせは、本願発明者らにより初めて発見された意義
はひじょうに高いといえる。なぜなら、上述のように、
骨髄間質細胞が、骨芽細胞、血管内皮細胞、骨格筋細
胞、脂肪細胞、平滑筋細胞等に分化・誘導される可能性
がある間葉系の幹細胞又は前駆細胞であることは判って
いたとしても、骨髄間質細胞を、実際に、神経堤細胞(n
eural crest cell)由来のＳｃｈｗａｎｎ細胞に分化さ
せることができるかどうかについては知られておらず、
かつ、切望されていたにも拘らず未だかつて誰も実際に
これに成功した者はいなかったからである。いずれの理
論に拘束されることを望まないが、本願発明者らは、上
記ステップ（２）における還元剤による処理が、細胞に
ショックを与え、上記ステップ（３）におけるレチノイ
ン酸による処理が、細胞をリセットさせ、そして上記ス
テップ（４）における、サイクリックＡＭＰ上昇作用性
薬剤又はサイクリックＡＭＰアナログ、及びグリア細胞
分化生存作用性因子による処理が、細胞の分化・誘導を
もたらすと推定する。
【００３２】本願発明により、骨髄間質細胞を採取し、
複数ステップから成る処理をこれに施すことによって、
これを神経再生能力に関する限り天然Ｓｃｈｗａｎｎ細
胞と同様の形質に、高効率で誘導することができる。こ
の骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を末梢及び中枢
神経系に移植することによって障害を受けた神経系の再
生・伸長を誘導することが可能となった。
【００３３】上述のように、天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は
末梢神経から採取しなくてはならないので人への適応と
なると困難な面がある。一方、骨髄間質細胞であれば採
取が容易であり、人体に障害を残さないで済む。さらに
細胞の増殖速度が早いので、大量にしかも迅速に細胞を
供給することができるため、本願発明によって、骨髄間
質細胞は、種々の神経系の疾患への適応性を広げられた
といえる。さらに、骨髄間質細胞は自家移植が可能であ
り、これは大変大きな利点であると思われる。自分の骨
髄間質細胞を採取して分化・誘導をかけ、神経に移植す
るのであれば拒絶反応が起きないので免疫抑制剤等の投
与が不必要であり、安定した再生が得られるはずであ
る。また、骨髄バンクからも骨髄間質細胞を得ることが
可能であるため、供給面からは現実的な対応が可能であ
る。
【００３４】以下の実施例から明らかなように、本願発
明に係る骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は、末梢
神経又は中枢神経の再生に広く応用可能であると思われ
る。従って、１の態様において、本願発明は、骨髄間質
細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞自体を提供する。上述のよ
うに、これは、分化・誘導の履歴の違いから天然Ｓｃｈ
ｗａｎｎ細胞とは異なる、人為的に改変された物であ
る。他の態様においては、本願発明は、骨髄間質細胞由
来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を含む神経再生用医薬組成物とし
て提供される。上述のように、本願発明に係る骨髄間質
細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞は自家移植可能であるが、
他人に移植することもできる。なぜなら、神経系は免疫
系による攻撃を受けにくい細胞であり、また、骨髄バン
クなどから組織適合抗原の一致したドナーを見つけるこ
とができれば、拒絶反応を受けないようにすることがで
きるからである。上記医薬組成物は、慣用の医薬として
許容される担体、緩衝液、塩、賦形剤などを含むことも
できる。上記組成物は、そのまま罹患部位に注射される
こともできるし、中空管に充填された後、中枢神経及び
末梢神経切断部位を繋ぐように移植されることができ
る。
【００３５】末梢神経はもともと再生するが、数センチ
のギャップが存在すると再生出来ないことが判っている
ので、そのようなケースを含めて末梢神経への応用も実
用的であると思われる。再建が不可能とされている中枢
神経疾患は、外傷による脊髄損傷や脳血管障害、失明に
至る緑内症からパーキンソン氏病などの変性疾患まで実
に多種多様の疾患が含まれ、罹患人口は多いものと思わ
れる。本願発明に係る医薬組成物は、多種多様な中枢神
経再生のために使用されることができる。上記疾患に対
する神経再生法の研究は社会的急務であり、本願発明
は、実際の人体への応用に確実に繋がるものと思われ
る。
【００３６】以下の実施例により、本願発明をさらに詳
細に説明する。但し、本願発明の範囲を何ら限定するも
のと解してはならない。
【００３７】
【実施例】実施例１：骨髄間質細胞の、骨髄間質細胞由
来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞への分化・誘導 図１１に、上記分化・誘導処理手順を示す。成体ラット
(Ｗｉｓｔａｒ種)の骨髄より間質細胞を採取し培養す
る。培地は修飾Ｅａｇｌｅ’ｓ最小必須培地アルファ
（Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modificatio
n）に２０％のウシ胎児血清（fetus carf serum）を加
えたものを用いた。４代まで継代培養し、５０％のコン
フルエント（集密confluent）に達した時点で、β−メ
ルカプトエタノール（β-mercaptoethanol） を１ｍＭ
の濃度で２４時間培養液に添加した。その後レチノイン
酸 ３５ｎｇ／ｍｌを加えた培地に切り替えた。培地は
Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification
に２０％のfetus carf serumを加えたものを用いた。３
日後、Forskolin ５μＭ、Platelet-derived growth fa
ctor-ＡＡ ５ｎｇ／ｍｌ、basic- Fibroblast growth f
actor １０ｎｇ／ｍｌ、Heregulin （商標）２００ｎｇ
／ｍｌを培地に添加したものにさらに切り替えた。７日
後に細胞の免疫染色を行った。P75、O4、S-100、GFAP、
及びNestin抗体とで反応させたところ、天然Ｓｃｈｗａ
ｎｎ細胞と同様の反応を示した（図８参照）。上記骨髄
間質細胞は、天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と形態学的に同様
の形態に誘導された（図９参照）。
【００３８】実施例２：中枢神経（切断視神経）の再生 実施例１において得られた細胞をTrypsin処理によって
回収し、マウスＥＨＳ腫瘍由来の細胞外基質Ｍａｔｒｉ
ｇｅｌ（Collaborative Biomedical Products社、40234
A）と混合後、人工的なチューブ（Amicon社、Hellow fi
ber Cartridge, HIP10-43）に充填し、成体ラット（Ｗ
ｉｓｔａｒ種）の切断視神経（中枢神経）と縫合し、移
植した。
【００３９】図１２に、移植１０日後のＧＡＰ４３（gr
owth associated protein-43、神経線維が成長・伸長す
るときに発現するタンパク質）標識の結果を示す。青色
矢印は、移植片起始部、そして赤色矢印は、再生線維先
端部を示す。無処理骨髄間質細胞（左側）に比較して、
分化誘導骨髄間質細胞（右側）では、神経線維が有意に
伸びていることがわかる。神経線維の伸長距離と線維数
は週数と共に増加していた。移植３週間後の結果を図１
３に示す。図中、緑色のＦＩＴＣは、視神経線維のみを
特異的に標識するために硝子体内にCholeratoxin B Sub
unitを注入し、順行性に標識したものを免疫組織化学で
検出したものであり、人工的チューブ内に再生した神経
線維を示す。赤色のＴｅｘＲｅｄは、培養下において骨
髄間質細胞を予めＢｒｄ−Ｕを用いて標識したものを表
す。そして青色のＡｌｅｘａ６６３は、ＭＡＧ（myelin
-associated glycoprotein）を表す。骨髄細胞を充填し
た人工的チューブ内への視神経の再生が見られ、かつ、
それらはＢｒｄ−Ｕで標識された骨髄間質細胞と接触
し、ミエリン形成も起きていることが確認された。
【００４０】実施例３：末梢神経（坐骨神経）の再生 成体ラット（Ｗｉｓｔａｒ種）の坐骨神経を切断し、人
工的チューブに分化誘導をかけた。骨髄間質細胞を充填
し、吻合した。
【００４１】図１４に、移植７日後のＧＡＰ４３（grow
th-associated protein-43）標識の結果を示す。青色矢
印は、移植片起始部、そして赤色矢印は、再生線維先端
部を示す。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（細胞外基質）のみ（左
側）に比較して、分化誘導骨髄間質細胞（右側）では、
神経線維が伸びていることがわかる。神経線維の伸長距
離と線維数は週数と共に増加していた。移植後４週間目
の結果を図１５に示す。図中、緑色のＧＦＰ（green fl
uorescent protein）は、骨髄間質細胞を緑色の蛍光の
遺伝子（ＧＦＰ）をレトロウイルスを用いて光らせたも
のであり；青色のＭＡＧは、ミエリン・タンパク質であ
り；そして赤色のＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔは、再生
した神経線維である。図１５から、移植から４週間後に
坐骨神経が見事に再生されていることがわかる。
【００４２】図１６、図１７、及び図１８に移植から４
週間後の坐骨神経の再生結果を示す。緑色のＧＦＰは、
骨髄間質細胞を緑色の蛍光の遺伝子を導入して光らせた
ものであり；青色のＭＡＧは、Ａｌｅｘａ６３３という
蛍光標識を用いてミエリン・タンパク質ＭＡＧを検出し
たものであり；そして赤色のＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎ
ｔは、Ａｌｅｘａ５４６という赤い蛍光標識を用いて検
出した再生神経線維である。図１６〜１８から、移植か
ら４週間後に坐骨神経（末梢神経）が完全に再生されて
いることがわかる。即ち、再生した線維（ｎｅｕｒｏｆ
ｉｌａｍｅｎｔ）はＧＦＰで緑色に光る骨髄間質細胞と
接触し、さらに骨髄間質細胞がミエリン・タンパク質Ｍ
ＡＧを発現し、ミエリンを形成していることがわかる。
【００４３】参考文献一覧 １．Schwab, ME et al : Rat CNS myelin and a subtyp
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2000 10. NEDO H11年度提案公募事業成果報告予稿集９提案公
募：97S09-003 「分化機保持細胞株の樹立とこれを用い
た生体組織機能の再構築に関する研究」帯刀益夫 東北
大学教授
【図面の簡単な説明】
【図１】修復時の視神経グリア細胞の変化を説明する。
【図２】末梢神経と中枢神経（視神経を含む）構造的相
違を説明する。
【図３】末梢神経におけるＷａｌｌｅｒ変性を説明す
る。
【図４】Ｓｃｈｗａｎｎ細胞の関与する神経再生因子を
説明する。
【図５】神経細胞の分化・系統図を表す。
【図６】胚葉の概念を超えて細胞が全く別の細胞になる
可能性があるＴｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏ
ｎを説明する。
【図７】分化・誘導前の骨髄間質細胞の形質を示す、図
面に代わる免疫蛍光写真である。
【図８】天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と比較した、骨髄間質
細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞の形質を示す、図面に代わ
る免疫蛍光写真である。
【図９】天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と比較した、本願発明
に係る分化・誘導方法により得られた骨髄間質細胞由来
Ｓｃｈｗａｎｎ細胞の形態を示す、図面に代わる顕微鏡
写真である。
【図１０】天然Ｓｃｈｗａｎｎ細胞と天然骨髄間質細胞
に比較した、本願発明に係る分化・誘導方法により得ら
れた骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞、及び上記方
法におけるステップを一部省略した方法により得られた
細胞の形態を示す、図面に代わる顕微鏡写真（位相差顕
微鏡像）である。
【図１１】本願発明に係る分化・誘導方法の概要を説明
する図である。
【図１２】ＧＡＰ４３を指標とした視神経の再生を示
す、図面に代わる免疫組織化学の共焦点レーザー顕微鏡
写真である。
【図１３】ＦＩＴＣ、ＴｅｘＲｅｄ、及びＡｌｅｘａ６
３３を指標とした視神経の再生を示す、図面に代わる免
疫組織化学の共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１４】ＧＡＰ４３を指標とした坐骨神経の再生を示
す、図面に代わる免疫組織化学の共焦点レーザー顕微鏡
写真である。
【図１５】坐骨神経のＭＳＣ、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅ
ｎｔ、及びＭＡＧの再生を示す、図面に代わる免疫組織
化学の共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１６】坐骨神経のＭＳＣ、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅ
ｎｔ、及びＭＡＧの再生を示す、図面に代わる免疫組織
化学の共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１７】坐骨神経のＭＳＣ、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅ
ｎｔ、及びＭＡＧの再生を示す、図面に代わる免疫組織
化学の共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１８】坐骨神経のＭＳＣ、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅ
ｎｔ、及びＭＡＧの再生を示す、図面に代わる免疫組織
化学の共焦点レーザー顕微鏡写真である。
フロントページの続き (72)発明者 高野 雅彦 神奈川県横浜市青葉区奈良町2864−３−３ −702 Ｆターム(参考） 4B065 AA91X BB08 BB11 BB19 BB25 4C087 AA01 AA02 AA03 BB64 NA14 ZA02

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 骨髄間質細胞を、インビトロにおいて、
    骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞に分化・誘導させ
    る方法であって、以下のステップ： （１） 骨髄から骨髄間質細胞を採取し、そして標準的
    な基礎培地に血清を加えた培地中で培養し； （２） 還元剤を上記培養液に添加し、そしてさらに培
    養し； （３） 分化誘導剤を上記培養液に添加し、そしてさら
    に培養し；並びに （４） サイクリックＡＭＰ上昇作用性薬剤又はサイク
    リックＡＭＰアナログ、及び／又は神経とグリア細胞に
    作用する分化・生存・増殖因子を上記培養液に添加し、
    さらに培養して骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を
    得る；を含む前記分化・誘導方法。
  2. 【請求項２】 前記標準的な基礎培地がＥａｇｌｅ’ｓ
    アルファ修飾最小必須培地である、請求項１に記載の分
    化・誘導方法。
  3. 【請求項３】 前記血清がウシ胎児血清である、請求項
    １又は２に記載の分化・誘導方法。
  4. 【請求項４】 前記還元剤がＳＨ試薬である、請求項１
    〜３のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。
  5. 【請求項５】 前記ＳＨ試薬がβ−メルカプトエタノー
    ルである、請求項４に記載の分化・誘導方法。
  6. 【請求項６】 前記還元剤の濃度が、１ｎＭ〜１０ｍＭ
    である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分化・誘
    導方法。
  7. 【請求項７】 前記ステップ（２）における培養時間
    が、１時間〜５日間である、請求項１〜６のいずれか１
    項に記載の分化・誘導方法。
  8. 【請求項８】 前記分化誘導剤がレチノイン酸である、
    請求項１〜７のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。
  9. 【請求項９】 前記分化誘導剤の濃度が、０．００１ｎ
    ｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌである、請求項１〜８のいずれ
    か１項に記載の分化・誘導方法。
  10. 【請求項１０】 前記ステップ（３）における培養時間
    が、３０日以内である、請求項１〜９のいずれか１項に
    記載の分化・誘導方法。
  11. 【請求項１１】 前記サイクリックＡＭＰ上昇作用性剤
    又はサイクリックＡＭＰアナログが、Ｆｏｒｓｋｏｌｉ
    ｎである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の分化
    ・誘導方法。
  12. 【請求項１２】 前記前記サイクリックＡＭＰ上昇作用
    性剤又はサイクリックＡＭＰアナログの濃度が、０．０
    ０１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである、請求項１〜
    １１のいずれか１項に記載の分化・誘導方法。
  13. 【請求項１３】 前記グリア細胞分化生存作用性因子
    が、Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ、血小板由来成長因子ＡＡ、
    塩基性線維芽細胞成長因子、及びそれらの混合物から成
    る群から選ばれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記
    載の分化・誘導方法。
  14. 【請求項１４】 前記Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎが、Ｓｕｂ
    ｔｙｐｅの１つであるＨｅｒｅｇｕｌｉｎである、請求
    項１３に記載の分化・誘導方法。
  15. 【請求項１５】 前記グリア細胞分化生存作用性因子の
    濃度が、０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであ
    る、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の分化・誘導
    方法。
  16. 【請求項１６】 前記ステップ（４）における培養時間
    が、３０日以内である、請求項１〜１５のいずれか１項
    に記載の分化・誘導方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１〜１６のいずれか１項に記載
    の分化・誘導方法により得られた骨髄間質細胞由来Ｓｃ
    ｈｗａｎｎ細胞。
  18. 【請求項１８】 骨髄間質細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細
    胞。
  19. 【請求項１９】 請求項１７又は１８に記載の骨髄間質
    細胞由来Ｓｃｈｗａｎｎ細胞を含む神経再生用医薬組成
    物。
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