KR102499913B1 - 슈반 세포 및 그 조제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포를 경유하지 않고, 직접 (다이렉트ㆍ리프로그래밍에 의해) 슈반 세포를 얻기 위한 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 이러한 과제를 해결하는 수단으로서, 포유 동물의 체세포에, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 도입하는 공정을 포함하는, 슈반 세포를 조제하는 방법을 제공한다.

Description

슈반 세포 및 그 조제 방법{SCHWANN CELLS AND METHOD FOR PREPARING SAME}

본 발명은, 주로 슈반 세포 및 그 조제 방법에 관한 것이고, 상세하게는 다이렉트ㆍ리프로그래밍에 의한 슈반 세포의 조제 방법에 관한 것이다.

슈반 세포는, 신경의 재생에 결정적으로 중요한 역할을 하고 있는 것으로 여겨진다. 신경 결손이나 슈반 세포의 기능 부전에 관련된 질환도 많아, 이들 질병에 대해 자가 슈반 세포를 이식할 수 있으면, 이상적인 재생 의료가 될 것으로 기대된다. 실제로, 외상이나 악성 종양 절제에서 기인하는 신경 손상에 대해서는, 자가 신경 이식이나, 혹은 자가 신경으로부터 슈반 세포를 분리ㆍ배양하여 이식하는 치료가 효과를 거두고 있다. 하지만, 신경의 채취는 환자에 대한 침습이 커, 아무리 해도 2 차적인 신경 손상을 회피할 수 없다. 또, 공급할 수 있는 슈반 세포의 수가 불충분한 경우가 많다.

비특허문헌 1 및 2 에는, 미분화 지방 줄기세포 (ADSC) (지방 유래 간질세포라고도 한다) 를 대표로 하는 간엽계 줄기세포를 재료로 하여, 슈반 세포형 세포 (dADSC) 를 분화시키는 수법이 개시되어 있다. 그러나, 수법의 성질상, 외부로부터의 감염의 위험성이 있기 때문에 품질 관리가 용이하지는 않고, 비용이 들고 손이 많이 간다는 문제가 있다. 또한, 얻어지는 세포는, 진정한 슈반 세포와는 형질이나 기능이 상이한 것도 지적되어 있다. 또, 이 방법 등으로 제작한 슈반 세포는, 미엘린화능이 있다고는 보고되어 있지 않아, 도약 전도에 공헌하지 못할 가능성이 있다.

최근 들어 심근세포나 간(肝)세포 등을 선유아세포로부터 직접 유도할 수 있는 것이 나타났다 (다이렉트ㆍ리프로그래밍 또는 다이렉트ㆍ컨버전). 만일, 환자로부터 저침습으로 채취할 수 있는 선유아세포 (線維芽細胞) 등의 체세포로부터 슈반 세포를 직접 만들어 낼 수 있다면, 침습이 낮고 암화의 위험성도 낮은, 새로운 이식용 자가 슈반 세포를 만들어 내는 기술로 이어질 것으로 기대할 수 있다.

체세포에 조직 특이적인 전사 인자의 유전자군을 도입하여, iPS 세포를 거치지 않고 직접 그 조직 세포로 분화 유도할 수 있는 것 (다이렉트ㆍ리프로그래밍 (다이렉트ㆍ컨버전)) 에 대하여, 예를 들어, 이하의 보고가 있다 :

마우스 선유아세포 → 연골세포 (SOX9 ＋ Klf4 ＋ c-Myc 유전자를 도입)

마우스 선유아세포 → 심근세포 (GATA4 ＋ Mef2c ＋ Tbx5 유전자를 도입)

마우스 선유아세포 → 간세포 (Hnf4α＋ (Foxa1 또는 Foxa2 또는 Foxa3) 유전자를 도입)

마우스 선유아세포 → 신경 줄기세포 (Sox2 ＋ FoxG1 유전자를 도입 등),

마우스, 인간 세포 → 조혈 줄기세포 등.

하지만, 체세포를 슈반 세포로 다이렉트ㆍ컨버전했다는 보고는 없다.

Kingham PJ, DF Kalbermatten, D Mahay, et al : Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Exp Neurol, 2007 ; 207 : 267-274. Liu Y, Zhang Z, Qin Y, Wu H, Lv Q, Chen X, Deng W : A new method for Schwann-like cell differentiation of adipose derived stem cells. Neurosci Lett. 2013 Sep 13 ; 551 : 79-83.

본 발명은, 신경 결손이나 슈반 세포의 기능 부전에 관련된 질환 등에 대한 치료에 응용 가능하고, 암화의 위험성이 적은 슈반 세포를 조제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 포유 동물의 체세포에 특정 유전자를 조합하여 도입함으로써, ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포를 경유하지 않고, 직접 (다이렉트ㆍ리프로그래밍에 의해) 슈반 세포가 얻어지는 것을 알아냈다.

본 발명은, 이하의 발명을 포함한다.

항 1, 포유 동물의 체세포에, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 도입하는 공정을 포함하는, 슈반 세포를 조제하는 방법.

항 2, 상기 유전자가, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자의 조합인, 항 1 에 기재된 방법.

항 3, 상기 체세포가 선유아세포, 혈관 내피 세포 또는 간엽계 줄기세포인, 항 1 또는 2 에 기재된 방법.

항 4, 포유 동물의 체세포에서 유래하고, 외래성의 SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 갖는 슈반 세포.

항 5, 항 1 ∼ 3 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는 세포, 또는, 항 4 에 기재된 슈반 세포를 포함하는, 신경의 결손, 또는, 슈반 세포의 결손, 부족 혹은 기능 저하에 기초하는 질환을 치료하기 위한, 이식 재료.

항 6, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 포함하는, 슈반 세포를 조제하기 위한 조성물.

본 발명에서는, 다이렉트ㆍ리프로그래밍에 의해 체세포로부터 단기간에 슈반 세포를 제공할 수 있다. 이 슈반 세포는, 이식하는 본인의 체세포로부터 용이하게 유도할 수 있기 때문에, 얻어진 슈반 세포를 이식한 경우에도 면역학적인 거절 응답 등의 문제는 발생하지 않는다. 또, iPS 세포나 ES 세포를 경유하지 않고 직접 체세포로부터 슈반 세포를 유도할 수 있기 때문에, 암화 등의 다능성 줄기세포에서 기인하는 문제를 회피할 수 있다.

도 1 은 본 발명의 방법의 일례의 개요를 나타낸다.
도 2 는 대표적인 S100β 의 염색성 이미지를 나타낸다.
도 3 은 S100β 의 염색성에 의한 4 단계의 전형예를 나타낸다.
도 4A 는 세포 형태에 의한 평가 결과를 나타낸다. HDF, cSC 및 dSC 의 세포 형태의 전형예를 나타낸다.
도 4B 는 세포 형태에 의한 평가 결과를 나타낸다.
도 5A 는 슈반 세포 관련 마커 (p75NTR) 의 면역 염색의 일례를 나타낸다.
도 5B 는 슈반 세포 관련 마커 (GFAP) 의 면역 염색의 일례를 나타낸다.
도 5C 는 슈반 세포 관련 마커 (Nestin) 의 면역 염색의 일례를 나타낸다.
도 5D 는 슈반 세포 관련 마커 (NG2) 의 면역 염색의 일례를 나타낸다.
도 6 은 S100β 와 p75NTR 유전자의 mRNA 발현량의 측정 결과를 나타낸다.
도 7A 는 신경 세포에 대한 신경 돌기 신장 효과의 평가 결과를 나타낸다. 선유아세포 HDF, 정상 슈반 세포 (cSC, 양성 컨트롤) 및 dSC 의 각각과 공배양한, 형광 라벨을 한 NG108-15 신경 세포의 일례를 나타낸다. 화살표는, 신장된 신경 돌기를 나타낸다.
도 7B 는 신경 세포에 대한 신경 돌기 신장 효과의 평가 결과를 나타낸다.
도 8 은 플라스미드 (Plasmid) 도입 (일렉트로포레이션) 에 의한 컨버전에 있어서의, 슈반 세포 관련 마커 (S100β, p75NTR, GAP43) 의 면역 염색의 일례를 나타낸다.
도 9A 는 유도 전의 인간 정상 지방 유래 줄기세포 (ADSC) 의 위상차 이미지, 그리고 슈반 세포로의 유도 (Induction) 후의 위상차 이미지 및 S100β 의 염색성 이미지를 나타낸다. 200 배 확대.
도 9B 는 슈반 세포 관련 마커 (S100β, GAP43, p75NTR, 프로테인 제로 (Protein Zero, PO)) 의 면역 염색의 일례를 나타낸다. 100 배 확대.
도 10A 는 유도 전의 제대 혈관 내피 세포 (Huvec) 의 위상차 이미지, 그리고 슈반 세포로의 유도 (Induction) 후의 위상차 이미지 및 S100β 의 염색성 이미지를 나타낸다. 200 배.
도 10B 는 슈반 세포 관련 마커 (S100β, GAP43, p75NTR) 의 면역 염색 이미지의 일례를 나타낸다. 100 배 확대.
도 11A 는 미엘린 마커 (프로테인 제로 (Protein Zero, P0)) 의 면역 염색 이미지의 일례를 나타낸다.
도 11B 는 미엘린 마커 (Myelin basic protein (MBP)) 의 면역 염색 이미지의 일례를 나타낸다.
도 12A 는 좌골 신경 크러쉬 (crush) 모델을 사용한 평가 시험의 개요를 나타낸다.
도 12B 는 슈반 세포 관련 마커를 사용한 면역 염색 이미지의 일례를 나타낸다.
도 12C 는 슈반 세포 관련 마커를 사용한 면역 염색 이미지의 일례를 나타낸다.
도 13A 는 면역 부전 마우스 좌골 결손 모델에 대한 dSC 의 이식 시험의 개요를 나타낸다.
도 13B 는 가교된 신경의 매크로 이미지를 나타낸다.
도 13C 는 재생 신경 조직 횡축 절편의 미엘린 염색 이미지를 나타낸다.
도 13D 는 좌골 신경 기능 인덱스 (SFI) 의 평가 결과를 나타낸다.
도 13E 는 신경 지배 근육 (Innervated muscle) 의 위축 및 선유화의 평가 결과를 나타낸다.
도 14 는 신경 영양 인자 (neurotrophic factors : BDNF, GDNF, NGF) 의 산생을 나타낸다. ELISA 법에 의해 측정하였다. *p ＜ 0.05 vs. 컨트롤 ; **p ＜ 0.01 vs. 컨트롤 ; #p ＜ 0.05 vs. cSC.
또한, 도 2, 도 3, 도 4A, 도 5A ∼ D, 도 7A, 도 8, 도 9A 및 B, 도 10A 및 B, 도 11A 및 B, 그리고 도 12B ∼ C 는, 색 반전 화상을 함께 나타내고 있다.

본 발명은, 슈반 세포의 조제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조제 방법은, ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포를 경유하지 않고, 슈반 세포를 조제하기 위한 방법이다.

슈반 세포

슈반 세포는, 말초신경계에 있어서의 글리아 세포이다. 생리 조건하에서는, 신경 조직의 지지, 미엘린 (수초) 을 형성하여 도약 전도의 실현 등에 기여한다. 말초신경에서의 손상시에는, 신경 영양 인자의 산출 및 방출, 재생 축색에 대한 족장 (足場), 미엘린 형성 등의 말초신경 재생에 있어서의 많은 중요한 역할을 한다.

천연의 슈반 세포는, 외배엽에서 직접 유래하는 신경 세포와는 달리, 신경능에서 유래한다. 성숙한 슈반 세포는, 슈반 전구 세포, 미성숙 슈반 세포를 거쳐 형성된다. 본 명세서에서는, 간단하게 하기 위해, 이들 분화 과정 도중의 모든 세포는 「슈반 세포」에 포함된다.

또, 슈반 세포에는, 미엘린을 형성하는 슈반 세포, 미엘린을 형성하지 않는 유주성의 슈반 세포 (미분화 슈반 세포) 등이 있으며, 본 명세서에서는 이들 모두가 「슈반 세포」에 포함된다.

본 명세서에서는, 천연의 슈반 세포와 동일한 세포뿐만 아니라, 세포의 기능의 일부 또는 전부를 천연의 슈반 세포와 동일시할 수 있는 세포 (「슈반 세포형의 세포」라고 부를 수도 있다.) 를 포함하여 「슈반 세포」라고 부른다.

체세포

체세포는, 포유 동물 유래이면 된다. 특히, 포유 동물 유래로서, 슈반 세포 그 자체 및 생체 내에서 슈반 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포가 아닌 세포가 바람직하다. 슈반 세포를 생체에 이식하는 경우에는, 이식되는 피험체 유래의 체세포 (자가 세포) 를 사용하는 것이, 감염이나 거절 응답 등의 위험을 저감시키기 위해 바람직하다. 하지만, 갑작스런 신경의 손상 등에 대해서 이식하는 등의 목적의 경우, 자가 세포가 아니라, 타인이나 다른 동물의 체세포로부터 미리 준비해 둔 슈반 세포를 이식에 사용할 수 있다. 또는 미리 준비해 둔 타인이나 다른 동물의 체세포로부터 슈반 세포를 만들어 이식에 사용할 수 있다. 즉, 슈반 세포 뱅크 (슈반 세포 전구 세포의 뱅크를 포함한다.) 를 만들어 두고 이식 목적에 제공할 수 있다. 이와 같은 경우, 거절 응답 등의 위험을 저감시키기 위해, 미리 MHC 를 타이핑해 둘 수 있다. 또, 미리 슈반 세포의 세포 특성이나 조종양성 (造腫瘍性) 등을 확인해 둘 수 있다.

본 명세서에 있어서, 포유 동물로는, 마우스, 래트, 햄스터, 인간, 개, 고양이, 원숭이, 토끼, 소, 말, 돼지 등을 들 수 있으며, 특히 인간을 들 수 있다.

본 발명의 방법 (다이렉트ㆍ리프로그래밍) 의 대상이 되는 체세포로는, 특별히 한정되는 것은 아니다.

체세포는, 용이하게 생체로부터 채취할 수 있는 체세포를 사용할 수 있다. 예를 들어 선유아세포, 케라티노사이트, 구강 점막 상피 세포, 비강 점막 상피 세포, 기도 점막 상피 세포, 위점막 상피 세포, 장관 점막 상피 세포, 혈관 내피 세포, 평활근 세포, 지방 세포, 잇몸 세포 (잇몸 선유아세포, 잇몸 상피 세포), 치수 세포, 치근막 세포, 골수 세포, 골수 유래 간질 세포, 백혈구, 림프구, 근세포, 결막 상피 세포, 파골 세포 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 선유아세포, 케라티노사이트, 구강 점막 상피 세포, 잇몸 세포, 백혈구, 림프구 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 생체로부터 채취한 상기 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

「생체」란, 배 (태아), 유생, 유체, 성체뿐만 아니라, 모체와 태아를 연결하는 태반, 탯줄도 포함한다. 제대 혈관 내피 세포 등의 탯줄 유래 세포나 태반 유래 세포는, 엄밀하게는 체세포는 아니지만, 이들도 본 발명의 「체세포」에 포함된다 (그 때에는 「체세포」를 「제대 혈관 내피 세포」, 「탯줄 유래 세포」, 「태반 유래 세포」등으로 바꾸어 읽기로 한다. 이들 세포는, 채취 용이성의 관점에서, 바람직한 체세포의 일례이다.

또, 간엽계 줄기세포 (Mesenchymal stem cell : MSC), 신경 줄기세포 (Neural stem cell), 간 줄기세포 (hepatic stem cell), 장 줄기세포, 피부 줄기세포, 모포 (毛包) 줄기세포, 색소 세포 줄기세포 등의 체성 줄기세포로부터 분화 유도하거나, 혹은 탈분화시키거나, 혹은 리프로그래밍시켜 제작한 체세포도 들 수 있다. 또, 다양한 체세포로부터 분화 유도하거나, 혹은 탈분화시키거나, 혹은 리프로그래밍시켜 다른 체세포로 유도한 세포도 들 수 있다. 또, 생식 계열의 세포로부터 분화 유도하거나, 혹은 탈분화시키거나, 혹은 리프로그래밍시켜 유도한 체세포도 들 수 있다.

또, 태성 줄기세포 (Embryonic stem cell : ES 세포) 나 인공 다능성 줄기세포 (induced pluripotent stem cell : iPS 세포) 로부터 분화 유도하거나, 혹은 리프로그래밍시켜 유도한 체세포도 들 수 있다.

또, 상기의 분화를 한 체세포 이외에, 체성 줄기세포를 사용할 수도 있다. 여기에서, 줄기세포란, 자기 복제능 및 다른 종류의 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포이다. 구체적으로는, 간엽계 줄기세포 (Mesenchymal stem cell : MSC) (예를 들어, 지방 유래 간질세포 (ADSC : adipose derived stromal cell)), 신경 줄기세포 (Neural stem cell), 간 줄기세포 (hepatic stem cell), 장 줄기세포, 피부 줄기세포, 모포 줄기세포, 색소 세포 줄기세포 등의 체성 줄기세포가 예시된다.

또, 엄밀하게는 체세포는 아니지만, ES 세포, iPS 세포, 혹은 생식 계열의 세포도 본 발명의 「체세포」에 포함된다 (그 때에는 「체세포」를 「ES 세포」, 「iPS 세포」 혹은 「생식 계열의 세포」라고 바꾸어 읽기로 한다).

또, 배양 세포도 들 수 있으며, 배양 세포로부터 분화 유도하거나, 혹은 탈분화시키거나, 혹은 리프로그래밍시켜 유도한 체세포도 들 수 있다. 또, ES 세포, iPS 세포, 혹은 생식 계열의 세포로부터 분화 유도하거나, 혹은 탈분화시키거나, 혹은 리프로그래밍시켜 유도한 체세포도 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 하나의 양태에 있어서, 체세포는 선유아세포, 혈관 내피 세포 (특히, 제대 혈관 내피 세포) 또는 간엽계 줄기세포 (특히, 지방 유래 간질세포) 이다.

유전자 혹은 그 발현 산물

본 발명의 방법에서는, 체세포에 SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 도입한다. 여기에서, 「발현 산물」로는, SOX10 유전자 및/또는 KROX20 유전자의 mRNA 또는 단백질을 들 수 있다.

사용할 수 있는 유전자의 조합으로는, SOX10 유전자만, KROX20 유전자만, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자의 조합이 포함된다. 슈반 세포를 얻을 수 있는 효율의 관점에서, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자의 조합이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서, SOX10 유전자 및/또는 KROX20 유전자의 1 종 혹은 2 종 이외의 유전자를 아울러 사용할 수도 있다. 또, 마이크로 RNA, siRNA, shRNA 나 그것들을 발현시키는 DNA 를 아울러 사용할 수도 있다. 또, 여러 가지 단백질을 아울러 사용할 수도 있다. 또, 여러 가지의 다른 유전자와 함께 도입할 수도 있다. 슈반 세포를 얻을 수 있는 효율의 관점 및 간편성 면에서, 1 종 또는 2 종, 특히 SOX10 유전자 및 KROX20 유전자의 2 유전자만을 사용하는 것이 바람직하다.

SOX10 유전자는, SOX (SRY-유사 HMG-box) 패밀리에 속하는, 배성기의 발생에 있어서의 세포 운명의 결정의 제어에 관여하는 전사 인자를 코드한다.

KROX20 유전자 (별명 EGR2, AT591, CMT1D, CMT4E) 는, 3 개의 C2H2 형 징크 핑거 (zinc fingers) 를 갖는 단백질을 코드한다.

상기 유전자는 모두 척추 동물에서 고도로 보존되어 있는 유전자로, 본 명세서에서는, 특별히 동물명을 나타내지 않는 한 호모로그를 포함한 유전자를 나타내는 것으로 한다. 또, 다형 (polymorphism) 을 포함하여, 변이를 갖는 유전자라 하더라도, 야생형의 유전자 산물과 동등한 기능을 갖는 유전자도 또한 포함되는 것으로 한다.

예를 들어, 인간 (Homo sapiens) 및 마우스 (Mus musculus) 의 SOX10 유전자 및 KROX20 유전자의 cDNA 염기 배열 및 이것이 코드하는 단백질의 아미노산 배열은, 미국 생물공학정보센터 (NCBI ; National Center for Biotechnology Information) 가 제공하는 GenBank 에, 하기의 액세션 번호로 등록되어 있다 (복수의 리비전 (revision) 이 등록되어 있는 경우, 최신의 리비전을 가리키는 것으로 이해된다.) :

인간 SOX10 유전자 cDNA 배열 : NM_006941 (예를 들어, NM_006941.3),

인간 SOX10 단백질 아미노산 배위열 : NP_008872 (예를 들어, NP_008872.1) ;

마우스 Sox10 유전자 cDNA 배열 : NM_011437 (예를 들어, NM_011437.1),

마우스 SOX10 단백질 아미노산 배위열 : NP_035567 (예를 들어, NP_035567.1) ;

인간 KROX20 유전자 cDNA 배열 : NM_000399, NM_001136177, NM_001136178, NM_001136179 (예를 들어, NM_000399.3, NM_001136177.1, NM_001136178.1, NM_001136179.1),

인간 KROX20 단백질 아미노산 배위열 : NP_000390, NP_001129649, NP_001129650, NP_001129651 (예를 들어, NP_000390.2, NP_001129649.1, NP_001129650.1, NP_001129651.1) ;

마우스 Krox20 유전자 cDNA 배열 : NM_010118 (예를 들어, NM_010118.3)

마우스 KROX20 단백질 아미노산 배위열 : NP_034248 (예를 들어, NP_034248.2).

도입

본 발명의 방법은, 특정 유전자를 선택하는 것과, 슈반 세포에 적합한 배지를 사용하는 것 이외에는, 공지된 다이렉트ㆍ리프로그래밍의 수법에 준하여 실시할 수 있으며, 예를 들어 이하 중 어느 문헌의 방법에 준하여 실시할 수 있다 :

1 : Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytes by Defined Factors ; Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau, and Deepak Srivastava Cell 142 : 375-386, 2010.

2 : Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C. Sudhof & Marius Wernig. Nature 463 : 1035-1041, 2010

3 : Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M. Nature 476 : 220-223, 2011.

4 : Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors Kunihiko Hiramatsu, Satoru Sasagawa, Hidetatsu Outani, Kanako Nakagawa, Hideki Yoshikawa, and Noriyuki Tsumaki, Journal of Clinical Investigation, 121 : 640-657, 2011.

5 : Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Pengyu Huang, Zhiying He, Shuyi Ji, Huawang Sun, Dao Xiang, Changcheng Liu, Yiping Hu, XinWang & Lijian Hui,. Nature 475 : 386-389, 2011.

6 : Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Sayaka Sekiya & Atsushi Suzuki. Nature 475 : 390-393, 2011.

7 : 국제공개공보 WO2014/010746호

상기 문헌 1 ∼ 7 의 내용은, 본 명세서에 참고로서 원용된다.

구체적으로는, 목적 유전자를, 1 또는 복수의 발현 벡터에 삽입하고, 대상으로 하는 체세포에 발현 벡터를 도입하여 세포 내에서 발현시키는 것이 바람직하다.

유전자를 도입하는 방법으로는, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노수반바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터 등의 바이러스성 벡터를 감염시키는 방법을 들 수 있다. 그 밖에, 유전자와 그 발현 산물의 도입의 경우에는, 카티오닉ㆍ리포솜, 카티오닉ㆍ폴리머, 전기 천공법 등의 비바이러스 벡터로, 플라스미드 벡터나 에피소말 벡터, 유전자의 발현 산물 (mRNA, 단백질) 을 트랜스펙션하는 방법도 사용할 수 있다. 또, mRNA 를 도입할 수도 있다. 이들 유전자 도입에 사용하는 수단을 모두 포괄하여 본 명세서에서는 벡터라고 부른다.

도입 효율과 도입 유전자의 안정 유지의 관점에서는 바이러스 벡터가 바람직하고, 암화의 리스크를 억제하기 위해서는 플라스미드가 바람직하다.

또, 목적의 유전자와 함께 약제 선택 마커가 되는 유전자 (퓨로마이신 내성, 블라스티시딘 S 내성, 네오마이신 내성, 하이그로마이신 내성 등) 를 도입하고, 그 후 약제 선택을 실시함으로써, 목적 유전자를 발현하는 세포를 선택하고 나서 사용할 수 있다.

본 발명의 유전자의 도입은, 플라스미드로 실시해도 되고, 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터를 사용해도 된다. 도입 효율과 도입 유전자의 안정 유지의 관점에서는 바이러스 벡터가 바람직하고, 암화의 리스크를 억제하기 위해서는 플라스미드가 바람직하다.

체세포에 도입되는 유전자는 LTR 프로모터에 의해 전사시킬 수도 있고, 벡터 내부의 다른 프로모터로부터 발현시켜도 된다. 예를 들어, CMV 프로모터, EF-1α 프로모터, CAG 프로모터 등의 구성적 발현 프로모터, 또는 원하는 유도성 프로모터를 이용할 수 있다. 또, LTR 의 일부를 다른 프로모터로 치환한 키메라 프로모터를 이용해도 된다.

또, 도입 인자가 유전자의 발현 산물 (예를 들어, 단백질) 인 경우에는, 단백 전달 도메인 (Protein Transduction Domain, PTD) 이라고 불리는 펩티드 등을 발현 산물인 단백질에 결합시켜, 배지에 첨가함으로써, 체세포 내에 도입해도 된다.

본 발명의 방법의 양태 중 하나에 있어서, 체세포에 유전자 등을 도입 후, 도입이 된 세포를 슈반 세포의 배양에 적합한 배지 중에서 배양할 수 있다. 슈반 세포의 배양에 적합한 배지로는 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 10 ％ FBS (소태아혈청) 를 첨가한 DMEM 배지 (둘베코 개변 이글 배지 (Dulbecco's Modied Eagle's Medium)) 등의 통상 배지에, 1 ∼ 20 μM 정도 (특히, 5 μM 정도) 의 포스콜린 (forskolin) ; 2 ∼ 50 ng/㎖ 정도 (특히, 10 ng/㎖ 정도) 의 bFGF (염기성 선유아세포 증식 인자, basic fibroblast growth factor) ; 2 ∼ 50 ng/㎖ 정도 (특히, 10 ng/㎖ 정도) 의 PDGF (혈소판 유래 성장 인자, Platelet-Derived Growth Factor) ; 50 ∼ 1000 ng/㎖ 정도 (특히, 200 ng/㎖ 정도) 의 인간 뉴레귤린-β1 (human neuregulin-β1) (별명, 헤레굴린, heregulin), 글리아 성장 인자 (Glial growth factor, GGF)) 등의 성분의 1 종 또는 2 종 이상 (바람직하게는 전부) 을 포함하는 배지 (슈반 세포 유도 배지) 를 사용할 수 있다 (이상의 농도는 모두 종농도이다). 일례로서, 비특허문헌 1 또는 2 에 기재된 배지 (미분화 지방 줄기세포로부터 슈반 세포를 유도할 수 있는 배지) 를 사용할 수 있다.

배양 기간은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 12 시간 ∼ 1 개월 정도, 1 일 ∼ 3 주간 정도, 3 일간 ∼ 2 주간 정도로 할 수 있다. 필요에 따라 배지 교환을 실시할 수 있다. 배양 조건은, 통상적인 방법에 준하는 것이 바람직하다.

조제

이렇게 하여 체세포로부터 슈반 세포가 유도되어, 슈반 세포가 조제된다.

조제된 슈반 세포는, 어느 양태에 있어서는, 외래성의 SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 갖는다. 여기에서, 「외래성」이란, 주로 상기 도입 수단의 결과 도입된 유전자 또는 그 발현 산물의 양태로서, 천연의 양태와는 상이한 양태를 가리킨다. 예를 들어, 천연의 프로모터 이외의 프로모터로 발현이 제어되는 유전자, 천연 이외의 염색체 상의 위치, 혹은 염색체 외에 존재하는 유전자의 양태 등을 들 수 있다.

슈반 세포가 얻어진 것은, 형태 (예를 들어, 세포 폭과 세포 길이의 비) 의 관찰과 평가 ; S100β, p75NTR, GFAP, Nestin, NG2 등의 슈반 세포 특이적 마커의 발현의 검출 (예를 들어, RT-PCR 법 등에 의한 마커의 유전자 발현의 검출, 면역 염색 등에 의한 마커 단백질의 발현의 검출 등을 들 수 있다.) ; 신경 영양 인자의 산생 ; 공배양한 신경 세포에 대한 신경 돌기 신장의 효과나 미엘린 형성능 등의 슈반 세포로서의 기능의 평가 등이 예시된다.

슈반 세포는, 전형적으로는, 비교적 소형의 핵을 갖는 쌍극, 혹은 다극성의 세포 형태를 갖는다.

슈반 세포 특이적 마커 중, p75NTR 은 미분화 슈반 세포의 마커이다.

미엘린이 형성된 것은, 미엘린 프로테인 제로 (Myelin Protein Zero, MPZ, P0), 미엘린 염기성 단백질 (MBP : Myelin Basic protein) 등의 미엘린 세포의 마커의 검출, 미엘린의 형태의 관찰 등에 의해 확인을 할 수 있다.

슈반 세포는, 슈반 세포 이외의 세포 (예를 들어, 원래의 체세포) 와의 혼합물로서 얻어지는 경우가 있다. 이와 같은 경우, 슈반 세포와 슈반 세포 이외의 세포를 필요에 따라 분리할 수 있다. 분리를 하기 위한 수단은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 얻어진 슈반 세포와 원래 세포인 선유아세포를 분리하는 경우, 족장 (예를 들어, 콜라겐 등) 에 대한 세포의 접착성의 차이에 기초하여 분리를 할 수 있다. 일반적으로, 슈반 세포는 선유아세포에 비해 족장에 대한 접착성이 약하다. 또, 소팅에 의해 슈반 세포와 슈반 세포 이외의 세포를 분리할 수도 있다.

본 발명에 의해 조제된 슈반 세포는, 예를 들어, 후술하는 이식 재료로서 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에 의해 조제된 슈반 세포는 또한, 슈반 세포를 사용한 다양한 연구나 기술 개발 등에 사용할 수 있다. 예를 들어, 슈반 세포의 발생, 분화, 형태 형성의 기구, 이들에 대한 역학적 스트레스, 영양, 호르몬 등의 영향의 해석 등의 기초 연구에 유용하다.

본 발명에 의해 조제된 슈반 세포를 사용하면, 다양한 질환이나 유전적 배경을 갖는 인간이나 동물로부터 간편, 신속, 저렴하게 슈반 세포를 수립할 수 있기 때문에, 질환이나 유전적 배경에 관련된 슈반 세포의 이상 (異常) 을 생화학적, 분자 생물학적, 면역학적 등의 수법에 의해 해석하는 것이 가능하고, 이로써 질환의 발증 기전의 해명 등의 연구나 진단법의 개발에 도움이 될 수 있다. 또, 이와 같은 슈반 세포를 사용하여 약제의 개발, 약제의 독성 시험 등을 실시하면, 여러 가지 질환에 대한 신규 치료법의 개발에 도움이 될 수 있다.

이식 재료

본 발명에 의해 얻어지는 슈반 세포는, 여러 가지 질환을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 이 경우, 슈반 세포는 이식 재료의 형태로 제공될 수 있다.

이식 재료란, 신경 선유(線維)의 수복, 재건을 위해 생체 내에 도입하는, 슈반 세포를 함유하는 재료를 말한다. 본 발명에서 얻어진 슈반 세포는, 이식 재료의 제작에 사용할 수 있다. 슈반 세포 자체도 이식 재료가 된다. 따라서, 슈반 세포를 세포 제제로서 환자에게 이식할 수도 있고, 인공 재료로 이루어지는 기재 (스캐폴드) 와 함께 이식하거나, 스캐폴드와 함께 배양하고 나서 이식할 수 있다. 기재 (스캐폴드) 는, 예를 들어, 신경 가교로서 기능한다. 이들의 경우, 스캐폴드는 이식 목적에 따라 여러 가지 3 차원적인 형상을 만들게 할 수 있다.

본 발명의 이식 재료는, 전술한 슈반 세포의 조제 방법을 공정으로서 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다.

기재 (스캐폴드) 의 구체예로서, 폴리글리콜산 (PGA) 튜브, 콜라겐 튜브, 피브린 글루 (Fibrin glue), 폴리머 폼 튜브, 젤라틴 튜브, 폴리글리콜산 (PGA) 과 콜라겐을 조합한 튜브 등을 들 수 있다. 폴리글리콜산 (PGA) 과 콜라겐을 조합한 튜브로서, 「너브릿지」(토요보 주식회사 제조) 등의 시판품을 사용할 수도 있다.

이식 재료는, 자가 신경 이식, 또는 자가 신경으로부터 슈반 세포를 분리 배양하여 이식하는 치료에 준하여 사용할 수 있다. 이와 같은 방법은, 하기의 문헌에 기재되어 있다 :

1 : Hadlock T, Sundback C, Hunter D, Cheney M, Vacanti JP. A polymer foam conduit seeded with Schwann cells promotes guided peripheral nerve regeneration. Tissue Eng 2000 ; 6 : 119-127.

2 : Jesuraj NJ, Santosa KB, Macewan MR, Moore AM, Kasukurthi R, Ray WZ, Flagg ER, Hunter DA, Borschel GH, Johnson PJ, Mackinnon SE, Sakiyama-Elbert SE. Schwann cells seeded in acellular nerve grafts improve functional recovery. Muscle Nerve. 2014 Feb ; 49(2) : 267-76.

3 : Tabesh H, Amoabediny G, Nik NS, Heydari M, Yosefifard M, Siadat SO, Mottaghy K. The role of biodegradable engineered scaffolds seeded with Schwann cells for spinal cord regeneration. Neurochem Int. 2009 Feb ; 54(2) : 73-83.

4 : Novikova LN, Pettersson J, Brohlin M, Wiberg M, Novikov LN. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 2008 Mar ; 29(9) : 1198-206.

5 : Guest J, Santamaria AJ, Benavides FD. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 2013 Dec ; 18(6) : 682-9.

6 : Brook GA, Lawrence JM, Shah B, Raisman G. Extrusion transplantation of Schwann cells into the adult rat thalamus induces directional host axon growth. Exp Neurol. 1994 Mar ; 126(1) : 31-43.

7 : Vaudano E, Campbell G, Hunt SP. Change in the molecular phenotype of Schwann cells upon transplantation into the central nervous system : down-regulation of c-jun. Neuroscience. 1996 Sep ; 74(2) : 553-65.

8 : Keirstead HS, Ben-Hur T, Rogister B, O'Leary MT, Dubois-Dalcq M, Blakemore WF. Polysialylated neural cell adhesion molecule-positive CNS precursors generate both oligodendrocytes and Schwann cells to remyelinate the CNS after transplantation. J Neurosci. 1999 Sep 1 ; 19(17) : 7529-36.

9 : Wan H, An YH, Sun MZ, Zhang YZ, Wang ZC. Schwann cells transplantation promoted and the repair of brain stem injury in rats. Biomed Environ Sci. 2003 Sep ; 16(3) : 212-8.

10 : Chen L, Fan X, Jin G, Wan X, Qiu R, Yi G, You Y, Xu Q. Treatment of rat with traumatic brain injury and MR tracing in vivo via combined transplantation of bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic iron oxide and Schwann cells. J Biomed Nanotechnol. 2014 Feb ; 10(2) : 205-15.

11 : Shields SA, Blakemore WF, Franklin RJ. Schwann cell remyelination is restricted to astrocyte-deficient areas after transplantation into demyelinated adult rat brain. J Neurosci Res. 2000 Jun 1 ; 60(5) : 571-8.

상기 문헌 1 ∼ 11 의 내용은, 본 명세서에 참고로서 원용된다.

상기의 치료하는 대상이 되는 질환으로는, 뇌경색, 척추 손상 등에 의한 중추 신경의 결손 혹은 손상, 외상이나 신경염이나 종양의 절제 등에 수반하는 말초신경의 결손 혹은 손상 ; 다발성 경화증 시신경 척수염 (Devic 증후군), 동심원 경화증 (Balo 병), 급성 산재성 뇌척수염 (acute disseminated encephalomyelitis, ADEM), 염증성 광범성 경화증 (Schilder 병), 감염성 아급성 경화증 전뇌염 (subacute sclerosing panencephalitis, SSPE), 진행성 다소성 백질뇌증 (progressive multifocal leukoencephalopathy, PML) 등의 중추 신경계의 질환 ; 길랑ㆍ바레 증후군, 피셔 증후군, 만성 염증성 탈골성 다발근 신경염 등의 말초신경계의 질환 ; 샤르코 마리 투스병 (Charcot-Marie-Tooth disease, CMT) 등의 슈반 세포 결손, 부족 혹은 기능 저하에 기초하는 질환 등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서, 특별히 명시하지 않는 한, 「치료」라는 용어는, 환자가 특정한 질환 또는 장애를 가지고 있는 동안에 실시하는 처치를 의도하고, 이로써 질환 혹은 장애의 중증도, 또는 하나 혹은 복수의 그 증상이 경감되거나, 또는 질환 혹은 장애의 진행이 지연 또는 감속되는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서, 「치료」에는 「예방」을 포함하는 것으로 한다.

본 발명에서 얻어지는 슈반 세포는 또한, 질환의 치료에 한정되지 않고, 미용이나 기능 증강의 목적으로 사용할 수도 있다. 그 때, 인간에 대한 처치도 본 명세서에서는 편의상 치료라고 부르며, 「환자」는 「정상인」 혹은 「인간」, 「질환」은 「미용」 혹은 「기능」이라고 바꾸어 읽을 수 있다.

본 발명은 또한, 인간뿐만 아니라 개, 고양이 등의 애완동물이나 소, 말, 돼지, 양, 닭 등의 가축을 포함하는 포유 동물의 질환의 치료에도 사용하는 것이 가능하다. 그 경우, 「환자」를 「환축 (患畜)」혹은 「포유 동물」이라고 바꾸어 읽기로 한다.

조성물

상기 서술한 바와 같이, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 체세포에 도입함으로써, 슈반 세포를 조제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 포함하는, 슈반 세포를 조제하기 위한 조성물을 제공한다. 당해 슈반 세포를 조제하기 위한 조성물은, 체세포로부터 슈반 세포를 유도하기 위해 사용되는 인자를 포함하는 것으로, 상기 유전자 또는 그 발현 산물이 체세포에 도입할 수 있는 형태로 포함되어 있는 것이 바람직하다. 상기 유전자가 체세포에 도입할 수 있는 형태로서, 구체적으로는, 상기 유전자가 주입된 벡터가 예시된다. 여기에서, 상기 유전자는, 각각 다른 벡터에 주입되어 있어도 되고, 1 개의 벡터에 2 종 이상의 유전자가 동시에 주입되어 있어도 된다.

사용할 수 있는 벡터의 종류 등에 대해서는, 상기 서술한 바와 같다.

인비보 (in vivo) 에서의 다이렉트 ㆍ 리프로그래밍

상기 서술한 바와 같이, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 체세포에 도입함으로써, 슈반 세포를 조제할 수 있다.

여기에서, 신경의 손상시에는, 손상부에는 선유아세포가 집적된다. 집적된 선유아세포는, 그 후 선유성의 반흔을 형성한다.

따라서, 본 발명의 조제 방법을 응용하여, 신경의 손상부의 선유아세포에, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 도입함으로써, 당해 손상부에 있어서 슈반 세포를 다이렉트ㆍ리프로그래밍에 의해 유도하고, 따라서 신경 손상의 치료나 신경의 재생에 기여할 수 있다. SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물의 도입에 있어서는, 상기 본 발명의 조성물을 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명의 조제 방법은, 인비트로 (in vitro) 에서의 다이렉트ㆍ리프로그래밍에 추가하여, 상기와 같은 인비보 (in vivo) 에서의 다이렉트ㆍ리프로그래밍도 포함하는 것으로 이해된다.

인비보 (in vivo) 에서의 다이렉트ㆍ리프로그래밍은, 신경의 손상부의 선유아세포에, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 도입하는 것 이외에는, 예를 들어 하기의 문헌에 기재된 인비보 (in vivo) 에서의 심근 세포에 대한 다이렉트ㆍ리프로그래밍에 준하여 실시할 수 있다.

1 : Ieda M. Heart regeneration using reprogrmming technology. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2013 ; 89(3) : 118-28. Review.

2 : Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, Vedantham V, Hayashi Y, Bruneau BG, Srivastava D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 2010 Aug 6 ; 142(3) : 375-86.

3 : Qian L, Huang Y, Spencer CI, Foley A, Vedantham V, Liu L, Conway SJ, Fu JD, Srivastava D. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 2012 May 31 ; 485(7400) : 593-8.

상기 문헌 1 ∼ 3 의 내용은, 본 명세서에 참고로서 원용된다.

실시예

이하에 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 중, HDF 는 인간 피부 선유아세포 (Human Dermal Fibroblast) 를 나타낸다. cSC 는, 대조가 되는 생체로부터 채취한 배양 슈반 세포 (cultured Schwann cells) 를 나타낸다. dSC 는, 본 발명의 방법에 의해 얻은 슈반 세포 (directly reprogrammed Schwann cells) 를 나타낸다.

Cont 는, 대조 (컨트롤, Control) 를 나타낸다.

실시예 1 방법의 개략 (도 1)

도 1 에, 본 발명의 슈반 세포 (도면 중, 「다이렉트 리프로그램된 슈반 세포 (directly reprogrammed Schwann cell) : dSC」) 를 조제하기 위한 방법의 개략을 나타낸다.

레트로바이러스 벡터 플라스미드 pMXs.puro 에, SOX10 등의 여러 가지 유전자의 cDNA 코딩 배열을 Gene art 시스템을 사용하여 주입하였다. 패키징 세포 Plat GP 세포를, 100 U/㎖ 페니실린 (Penicillin) 과 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (Streptomycin) 을 포함한 1 ％ NEAA 10 ％ FBS DMEM (통상 배지) 에 현탁시키고, 젤라틴 코트한 10 ㎝ 배양 디시에 디시당 5 × 10⁶ 개의 농도로 파종하였다 (제 -3 일). 24 시간 배양 후, 여러 가지 유전자를 포함하는 pMXs 벡터를, 여러 가지의 조합으로 pCMV VSV 벡터와 함께 X-tremeGENE 9 를 사용하여 이하의 비로 도입하였다. 즉, 도입 유전자 5 ㎍, pCMV.VSV 2.5 ㎍, Opti-MEM 500 ㎕, X-tremeGENE 9 22.5 ㎕ 의 혼화액을 10 ㎖ 의 배지가 들어 있는 10 ㎝ 디시에 첨가하였다 (제 -2 일). 24 시간 후, 항생제를 포함하지 않는 통상 배지로 교환하였다 (제 -1 일). 같은 날 (제 -1 일) 에, 인간 정상 피부 선유아세포주 (aHDF) (도면 중 「선유아세포 (fibroblast)」) 를, 1.5 × 10⁴ ∼ 2 × 10⁴ 세포/㎖ 로 배양 디시 또는 12 웰 플레이트에 파종하였다. 24 시간 후 (제 0 일), Plat GP 배양 상청을, 포어의 직경이 0.45 ㎛ 인 시린지 필터를 통과시킨 후, 폴리브렌 (최종 농도 4 ㎍/㎖) 과 혼화하였다 (바이러스액). aHDF 의 배양 상청을 흡인 제거한 후, 빠르게 상기 바이러스액을 1 ㎖ 첨가하고 24 시간 배양하였다 (감염 ; 도면 중 「트랜스펙션 (transfection)」). 컨트롤군으로서, 바이러스 감염을 실시하지 않는 세포도 준비하였다. 1 일 후 (제 1 일), 배양 상청을 흡인 제거하고, 슈반 세포 유도 배지 (통상 배지에 5 mM 포스콜린, 10 ng/㎖ 재조합 인간 염기성 섬유아세포 증식인자 (recombinant human basic fibroblast growthfactor, bFGF), 5 ng/㎖ 재조합 인간 혈소판 유래 증식 인자 (recombinant human platelet-derived growth factor, PDGF) and 200 ng/㎖ 재조합 인간 히레귤린1-b1 (recombinant human heregulin1-b1, GGF) (모두 최종 농도) 을 첨가한 것) 를 첨가하고, 그 후 2 일 간격으로 동일한 조성의 새로운 배양액으로 교환하였다. 제 12 ∼ 22 일에, 얻어진 세포에 대하여, 슈반 세포의 대표적인 마커인 S100β 염색을 실시하였다. 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않고, 동일한 배양을 실시한 세포를 컨트롤로 하였다.

실시예 2 인간 정상 피부 선유아세포에서 슈반 세포로의 컨버전 , S100β 형광 면역 염색 이미지 (표 1) (도 2)

인간 정상 피부 선유아세포 (aHDF) 를, 12 웰 플레이트에 배양하고, 실시예 1 에 기재된 조작을 실시하였다. 제 14 일에 각 웰로부터 배양액을 흡인 제거하고, PBS 로 1 회 세정을 실시한 후, 4 ％ PFA 로 고정하였다. 블로킹 용액을 첨가하고, 37 ℃ 에서 15 분간 정치 (靜置) 하였다. 항 S100β 항체 (1 차 항체) 와 알렉사플루오르566 (AlexaFluor566) 표지 항토끼 IgG 항체 (2 차 항체) 로 염색한 세포이다. 플레이트의 각 웰에는 상이한 유전자의 조합이 도입되어 있으며, 어느 넘버의 웰에 어느 유전자의 조합이 도입되었는지는, 표 1 에 기재한다 (표 중에서, 각 유전자의 란에 「1」이라고 기재가 있는 것은, 그 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 것을, 공란은, 그 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 것을 나타낸다). 도입한 유전자 후보는, 슈반 세포 관련 유전자로서 SOX10, Krox20, Oct6 을, 리프로그래밍 관련 유전자로서 SOX2, C-myc, KLF4, Oct3/4 의 7 인자이다. 예를 들어, 표 1 의 No.43 은, SOX10, Krox20, Oct6, KLF4 의 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 세포이다.

대표적인 S100β 의 염색성 이미지로서, Sox10 과 Krox20 의 2 인자의 유전자를 도입한 세포를 도 2 에 나타낸다. 도 2 는, DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌) 에 의한 핵 염색과의 공염색이다.

[표 1]

실시예 3 인간 정상 피부 선유아세포에서 슈반 세포로의 컨버전, S100 β 염색의 반(半) 정량 (도 3)

도 2 와 동일한 실험에 있어서, 그 밖의 조합의 염색성을 확인하기 위해, 플레이트를 형광 현미경 (올림푸스 제조) 으로 관찰하고, S100β 의 염색성을 4 단계로 평가하였다 (S100β 양성 세포가 많은 것부터 순서대로 +++, ++, +, -).

각각의 평가의 전형 이미지를 도 3 에서 나타낸다. 또, 그 평가 결과를 표 1 중에 함께 나타낸다. 예를 들어, No.4 의 SOX10 과 KROX20 의 2 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 세포는 +++ 의 평가가 되어, 가장 많은 S100β 양성 세포를 포함하는 것을 알 수 있다. SOX10 단독 또는 KROX20 단독의 도입으로도 낮은 효율로 슈반 세포를 유도할 수 있지만, SOX10 과 KROX20 의 공(共)도입이 보다 효율적으로 유도할 수 있다. 또, Oct6 은, 슈반 세포의 유도에 거의 효과가 없는 것을 알 수 있다.

실시예 4 인간 정상 피부 선유아세포에서 슈반 세포로의 컨버전, 세포 형태 평가 (도 4)

실시예 1 에 있어서, Sox10 과 Krox20 의 2 인자의 유전자를 도입한 세포에 대하여, 인간 정상 피부 선유아세포에서 슈반 세포로의 컨버전에 있어서의 세포 형태 변화를 슈반 세포에 특징적인 바이폴러형의 세포 길이의 증가를 세포 길이/세포 폭의 비로 평가하였다.

평가의 결과를 도 4 에 나타낸다. 컨버전함으로써 세포 길이/세포 폭의 비의 증대, 요컨대 슈반 세포에 특징적인 세포 형태로 변화하는 것이 나타났다.

실시예 5 인간 정상 피부 선유아세포에서 슈반 세 포로의 컨버전, 그 밖의 슈반 세포 관련 마커를 사용한 면역 세포 형광 염색 이미지 (도 5)

인간 정상 피부 선유아세포 aHDF 를, 12 웰 플레이트에 배양하고, 실시예 1 의 조작을 실시하였다. SOX10 및 Krox20 의 2 개의 유전자를 도입한 군의 결과를 나타낸다. 유전자 도입으로부터 12 일 후, 면역 염색을 실시하였다.

결과를 도 5 에 나타낸다. 항 p75NTR 항체 (1 차 항체), 항 GFAP 항체 (1 차 항체), 항 NG2 항체 (1 차 항체) 는 숙주가 토끼이고, 항 네스틴 (Nestin) 항체 (1 차 항체) 는 숙주가 마우스이다. 2 차 항체는, 알렉사플루오르488, 566 표지 항토끼 IgG 항체 또는 알렉사플루오르488 표지 항마우스 IgG 항체를 사용하였다. S100β 에 비해 양성률은 떨어지지만 각각의 발현이 확인된다.

실시예 6

A. 인간 정상 피부 선유아세포에서 슈반 세포로의 컨버전, S100β 와 p75NTR 유전자의 mRNA 발현량의 측정 (도 6)

인간 정상 피부 선유아세포 (aHDF) 를, 12 웰 플레이트에 배양하고, 실시예 1 의 조작을 하였다. 웰 No.1 ∼ 6 의 세포에는 Sox10 과 Krox20 의 2 인자의 유전자를 도입하고, 웰 No.7 ∼ 12 의 세포에는 컨트롤로서 유전자는 도입하지 않았다. 유전자 도입 12 일 후, 각 웰로부터 ISOGEN II 로 총 RNA 를 회수하고, ReverTra Ace qPCR RT 마스터 믹tm (Master Mix) 를 사용하여 cDNA 를 합성하였다. UCP1 과 β 액틴 유전자의 mRNA 레벨을 정량할 목적으로, 리얼-타임 PCR 마스터 믹스 (Master Mix), Taqman 프로브, 특이적 프라이머 (Specific Primer) 및 cDNA 를 혼화하고, AB7300 리얼-타임 PCR 시스템을 사용하여 리얼-타임 RT-PCR 을 실시하였다. 각 세포의 β 액틴 mRNA 레벨에 대한 목적 유전자의 mRNA 레벨의 값을 계산하였다.

결과를 도 6 에 나타낸다. 그래프의 세로축은, 웰 No.1 의 값을 「1」 로 하고, 각 웰의 값을 산출한 상대값을 상대적 mRNA 레벨로서 나타낸다. SOX10 과 KROX20 의 2 개의 유전자를 도입한 세포 (No.1 ∼ 6) 는, 컨트롤 (No.7 ∼ 12) 과 비교하여, 슈반 세포 특이적 마커인 S100β 와 p75NTR 유전자의 강력한 발현이 인정되었다.

B. RT-PCR 산물의 아가로오스 겔을 사용한 전기 영동

A 에서 얻어진 리얼-타임 RT-PCR 산물을 아가로오스 겔을 사용한 전기 영동을 실시하였다. 결과, SOX10 과 Krox20 의 2 인자의 유전자를 도입한 세포군에 있어서, S100β 와 p75NTR 유전자의 mRNA 의 강한 발현이 확인되었다.

C. 인자 도입 없음, SOX10 만, Krox20 만, SOX10+Krox20 의 각각의 조합에 의한 인간 선유아세포에서 슈반 세포로의 다이렉트ㆍ리프로그래밍 효율의 RT-PCR 을 사용한 검토.

인간 정상 피부 선유아세포인 aHDF 를, 12 웰 플레이트에 배양하고, 실시예 1 의 조작을 실시하였다. 유전자를 도입하지 않은 세포 (컨트롤), SOX10 유전자만 도입, Krox20 유전자만 도입, SOX10 유전자+Krox20 유전자를 도입한 세포 각각의, S100β 와 p75NTR 의 mRNA 의 발현을, A 와 동일한 방법으로 비교하였다. mRNA 의 상대값을 상대적 mRNA 레벨로서 나타낸다. 각 군의 β 액틴 mRNA 레벨에 대한 목적 유전자의 mRNA 레벨의 값을 계산하였다. 비도입 세포 중 1 군의 값을 「1」로 하여, 각 군의 값을 산출한 상대값의 평균을 상대적 mRNA 레벨로서 나타낸다. 그 결과, SOX10+Krox20 의 2 인자를 도입한 군에서는, S100β 와 p75NTR 의 mRNA 의 발현량이 크게 상승해 있었다. 또, Sox10 만을 도입한 세포에서도, Sox10 과 Krox20 의 양방을 도입한 세포에 비하면 낮지만, S100β 와 p75NTR 의 mRNA 발현량이 상승해 있었다. 또, Krox20 만을 도입한 세포에서도, Sox10 과 Krox20 의 양방을 도입한 세포에 비하면 낮지만, S100β 의 mRNA 발현량이 상승해 있었다. S100β 의 상대적 mRNA 레벨은, 비도입 세포에서는 4.4, Sox10 단독 도입 세포에서는 1712.3, Krox20 단독 도입 세포에서는 25.1, Sox10+Krox20 을 도입한 세포에서는 127615.0 이었다. p75NTR 의 상대적 mRNA 레벨은, 비도입 세포에서는 3.1, Sox10 단독 도입 세포에서는 74.3, Krox20 단독 도입 세포에서는 0.4, Sox10+Krox20 을 도입한 세포에서는 35397.6 이었다. 따라서, SOX10 단독이나 Krox20 단독에서도, 효율이 낮으면서, 인간 선유아세포에서 슈반 세포로의 다이렉트ㆍ리프로그래밍이 발생했을 가능성이 있다.

이상으로부터, 인간 선유아세포에서 슈반 세포로의 다이렉트ㆍ리프로그래밍은, SOX10 과 Krox20 의 2 인자를 사용하는 경우에 효율이 높은 것이 확인되었다. 또, SOX10 또는 Krox20 중 어느 1 인자여도 효율은 낮지만 인간 선유아세포에서 슈반 세포로의 다이렉트ㆍ리프로그래밍이 가능하다는 것이 나타났다.

실시예 7 dSC 의 신경 세포에 대한 신경 돌기 신장 효과에 대 한 검토 (도 7)

NG108-15 를 12 시간 배양하고, 그 후 36 시간, HDF, cSC, 또는, dSC (Sox10 과 Krox20 의 2 인자의 유전자를 도입하여 유도한 dSC) 와 공배양을 실시하였다. 컨트롤로서, NG108-15 를 1 ％ FBS 첨가 DMEM 만으로 배양하였다. Ⅰ. 신경 돌기를 갖는 세포 (neurite-bearing cell) 의 비율 (percent of neurite-bearing-cells), Ⅱ. 세포체로부터 직접 신장하는 1 차 신경 돌기수 (number of primary neurites), Ⅲ. 최장 신경 돌기의 길이 (Longest neurite length) 를 문헌 : Tomita K, Madura T, Sakai Y, et al : Glial differentiation of human adipose-derived stem cells : implications for cell-based transplantation therapy. Neuroscience. 2013 ; 236 : 55-65. 의 방법에 의해 비교 검토하였다. NG108-15 만을 항 Tuj-1 항체 (1 차 항체) 와 2 차 항체는 알렉사플루오르566 표지 항 토끼 IgG 항체를 사용하여 형광 염색하였다.

도 7 에 결과를 나타낸다. 컨트롤군과의 비교에서는 cSC, dSC 의 양자 모두 검토한 파라미터 (Ⅰ ∼ Ⅲ) 전부에서 높은 신경 돌기 신장 촉진 효과를 나타내어, dSC 의 성적은 cSC 에 필적하는 것이었다. 이상으로부터 dSC 배양 상청은 신경 세포에 대해 돌기 신장을 촉진시키는 것이 확인되었다.

실시예 8 인간 정상 피부 선유아세포에서 슈반 세포로의 바이러스 프리 플라스미드 (Plasmid) 도입 (일렉트로포레이션) 에 의한 컨버전 (도 8)

인간 정상 피부 선유아세포 aHDF 를, 12 웰 플레이트에 배양하고, 실시예 1 의 조작을 실시하였다. SOX10 및 Krox20 의 2 개의 유전자를 도입한 군의 결과를 나타낸다. 유전자 도입으로부터 14 일 후, 면역 염색을 실시하였다.

결과를 도 8 에 나타낸다. 항 S100β 항체 (1 차 항체), 항 p75NTR 항체 (1 차 항체), 항 GAP43 항체 (1 차 항체) 는 숙주가 토끼이고, 2 차 항체는, 알렉사플루오르566 표지 항토끼 IgG 항체를 사용하였다. 레트로바이러스 벡터를 사용한 경우와 비교하여 양성률은 떨어지지만, S100β, p75NTR 및 GAP43 각각의 발현을 확인할 수 있어, 선유아세포 aHDF 에서 슈반 세포로의 컨버전을 확인할 수 있었다.

실시예 9 인간 정상 지방 유래 줄기세포 에서 슈반 세 포로의 컨버전, 그 밖의 슈반 세포 관련 마커를 사용한 면역 세포 형광 염색 이미지 (도 9)

지방 유래 간질세포에서 dSC 로의 컨버전을 검증하였다.

〈방법〉

인간 정상 지방 유래 간질세포 (ADSC : adipose rerived stromal cell) 를, 12 웰 플레이트에 배양하고, 실시예 1 의 조작을 실시하였다. SOX10 및 Krox20 의 2 개의 유전자를 도입한 군의 결과를 나타낸다. 유전자 도입으로부터 14 일 후, 면역 염색을 실시하였다.

〈결과〉

결과를 도 9 에 나타낸다. 항 S100β 항체 (1 차 항체), 항 p75NTR 항체 (1 차 항체), 항 GAP43 항체 (1 차 항체), 항 프로테인 제로 (Protein Zero) 항체 (1 차 항체) 는 숙주가 토끼이고, 2 차 항체는, 알렉사플루오르566 표지 항토끼 IgG 항체를 사용하였다. S100β 에 의한 염색에서는, 약 40 ％ 의 세포가 양성을 나타냈다. 다른 슈반 세포 마커에 대해서도 S100β 에 비해 양성률은 떨어지지만 각각의 발현이 확인된다. 미엘린 마커인 프로테인 제로 (Protein Zero) 도 양성을 나타냈다.

구체적으로는, 선유아세포 (Fibroblast) 와 동일한 방법으로 슈반 세포 유도를 실시한 결과, 세포의 형태가, 인간 정상 지방 유래 간질세포의 형태에서, 슈반 세포로 전형적인 비교적 소형의 핵을 갖는 쌍극, 혹은 다극성의 세포 형태로 변화하였다. 또한, 슈반 세포로 전형적인 세포 형태로 변화한 세포는, 슈반 세포 마커 (S100β) 양성이었다 (약 40 ∼ 50 ％) (도 9A).

또, 유도 후의 세포는 슈반 세포 마커 (S100β, GAP43), 미분화 슈반 세포 마커 (p75NTR), 미엘린 마커 (P0) 가 양성이었다 (도 9B).

실시예 10 제대 혈관 내피 세포에서 슈 반 세 포로의 컨버전, 그 밖의 슈반 세포 관련 마커를 사용한 면역 세포 형광 염색 이미지 (도 10)

혈관 내피 세포에서 dSC 로의 컨버전을 검증하였다.

〈방법〉

제대 혈관 내피 세포 (Huvec : Human Umbilical Vein Endothelial Cells) 를, 12 웰 플레이트에 배양하고, 실시예 1 의 조작을 실시하였다. SOX10 및 Krox20 의 2 개의 유전자를 도입한 군의 결과를 나타낸다. 유전자 도입으로부터 14 일 후, 면역 염색을 실시하였다.

〈결과〉

결과를 도 10 에 나타낸다. 항 S100β 항체 (1 차 항체), 항 p75NTR 항체 (1 차 항체), 항 GAP43 항체 (1 차 항체), 항 프로테인 제로 (Protein Zero) 항체 (1 차 항체) 는 숙주가 토끼이고, 2 차 항체는, 알렉사플루오르566 표지 항토끼 IgG 항체를 사용하였다. S100β 에 의한 염색에서는, 약 30 ％ 의 세포가 양성을 나타냈다. 다른 슈반 세포 마커에 대해서도 S100β 에 비해 양성률은 떨어지지만 각각의 발현이 확인된다. 미엘린 마커인 프로테인 제로 (Protein Zero) 도 양성을 나타냈다.

구체적으로는, 선유아세포 (Fibroblast) 와 동일한 방법으로 슈반 세포 유도를 실시한 결과, 세포의 형태가, 제대 혈관 내피 세포의 형태에서, 슈반 세포로 전형적인 비교적 소형의 핵을 갖는 쌍극, 혹은 다극성의 세포 형태로 변화하였다. 또한, 슈반 세포로 전형적인 세포 형태로 변화한 세포는, 슈반 세포 마커 (S100β) 양성이었다 (약 50 ∼ 60 ％) (도 10A).

또, 유도 후의 세포는 슈반 세포 마커 (S100β, GAP43), 미분화 슈반 세포 마커 (p75NTR) 가 양성이었다 (도 10B).

실시예 11 GFP 로 마킹한 dSC (Sox10 과 Krox20 의 2 인자의 유전자를 도입하여 유도한 dSC) 와 DRGn 의 공배 양에 의 한 dSC 의 인비트로 ( in vitro) 에서의 미엘린화 형성. 슈반 세포 관련 마커를 사용한 면역 세포 형광 염색 이미지 (도 11)

GFP 로 마킹한 dSC 와 DRGn 의 공배양에 의한 dSC 의 인비트로 (in vitro) 에서의 미엘린화능을 평가하였다.

〈방법〉

dSC 를 레트로바이러스 벡터를 사용하여 GFP 로 세포 마킹하였다.

구체적인 수법은, 문헌 : Yoshioka T, Ageyama N, Shibata H, Yasu T, Misawa Y, Takeuchi K, Matsui K, Yamamoto K, Terao K, Shimada K, Ikeda U, Ozawa K, Hanazono Y. Repair of infarcted myocardium mediated by transplanted bone marrow-derived CD34+ stem cells in anonhuman primate model. Stem Cells. 2005 Mar ; 23(3) : 355-64. 및 문헌 : Hirschmann F, Verhoeyen E, Wirth D, Bauwens S, Hauser H, Rudert M. Vital marking of articular chondrocytes by retroviral infection using green fluorescence protein. Osteoarthritis Cartilage. 2002 Feb ; 10(2) : 109-18. 에 기재된 방법에 준하였다.

생후 5 일째의 마우스로부터 채취한 후근신경절 세포 (DRGn : dorsal root ganglion neuron) 를 2 일간 12 웰에서 배양하고, GFP 로 마킹한 dSC 와 신경 성장 인자 (Nerve Growth Factors) 와 아스코르브산과 cAMP 를 포함하는 미엘린 분화 유도 배지에서 공배양하였다. 공배양 유전자 개시로부터 14 일 후, 면역 염색을 실시하였다.

사용한 배지의 조성은 이하와 같다 :

N2 보조제를 함유하는 DMEM (Invitrogen), 50 ng/㎖ 아스코르브산 (ascorbic acid, Wako, Osaka, Japan), 및 50 ng/㎖ 재조합 래트 b-신경 증식인자 (recombinant rat b-nerve growth factorn, NGF) (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA), 0.5 μM cAMP (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA).

배지는, 문헌 : Sango K, Kawakami E, Yanagisawa H, Takaku S, Tsukamoto M, Utsunomiya K, Watabe K. Myelination in coculture of established neuronal and Schwann cell lines. Histochem Cell Biol. 2012 Jun ; 137(6) : 829-39. 의 기재에 준하여 제작하였다.

항 신경미세섬유 (Neurofilament) 항체 (1 차 항체), 항 MBP (Myelin Basic Protein) 항체 (1 차 항체) 는 숙주가 마우스이고, 항 Tuj-1 항체 (1 차 항체), 항 프로테인 제로 (Protein Zero) 항체 (1 차 항체) 는 숙주가 토끼이고, 2 차 항체는, AlexaFluor566 표지 항마우스와 토끼의 IgG 항체를, Cy5 표지 표지 항마우스와 토끼의 IgG 항체를 사용하였다. 미엘린 마커 항체인 항 MBP 항체와 항 프로테인 제로 (Protein Zero) 항체는 적색으로 표지하고, 신경 축색 마커인 항 신경미세섬유 (Neurofilament) 항체와 항 Tuj-1 항체는 그레이 (Gray) 로 표지하고 있다.

〈결과〉

결과를 도 11 에 나타낸다. DRG 의 신경 돌기를 따라 미엘린화한 슈반 세포가 보이는데, 일부의 미엘린화 슈반 세포와 GFP 로 마킹된 dSC 세포가 Overlap 되어 있다.

실시예 12 좌골 신경 크러쉬 ( crush) 모델에 대한 GFP 로 마킹한 dSC (Sox10 과 Krox20 의 2 인자의 유전자를 도입하여 유도한 dSC ) 이식에 의 한 인비트로 ( in vitro) 에 서의 미엘린화 형성. 미엘린 관련 마커를 사용한 면역 세포 형광 염색 이미지 (도 12)

dSC 의 인비트로 (in vivo) 에서의 미엘린화능의 검토를 하였다.

〈방법〉

dSC 를 바이러스 벡터를 사용하여 GFP 로 세포 마킹하였다.

면역 부전 마우스의 좌골 신경을 노출시키고, 중앙 부분을 수술용 페안으로 약 1 분간 파지하고, 약 5 ㎜ 의 범위에서 신경을 좌멸시켰다. 그 말초측에 GFP 로 마킹한 dSC 를 약 5 만개 주입하였다. 이식 개시로부터 1 개월 후, 좌멸시킨 부위의 수복 신경을 채취하여 면역 염색을 실시하였다. 방법의 개요를 도 12 에 나타낸다.

항 신경미세섬유 (Neurofilament) 항체 (1 차 항체), 항 MBP 항체 (1 차 항체) 는 숙주가 마우스이고, 항 Tuj-1 항체 (1 차 항체), 항 프로테인 제로 (Protein Zero) 항체 (1 차 항체) 는 숙주가 토끼이고, 2 차 항체는, AlexaFluor566 표지 항마우스와 토끼의 IgG 항체를, Cy5 표지 항 마우스와 토끼의 IgG 항체를 사용하였다. 미엘린 마커 항체인 항 MBP 항체와 항 프로테인 제로 (Protein Zero) 항체는 적색으로 표지하고, 신경 축색 마커인 항 신경미세섬유 (Neurofilament) 항체와 항 Tuj-1 항체는 그레이 (Gray) 로 표지하고 있다.

〈결과〉

결과를 도 12 에 나타낸다. 재생 신경을 따르도록 GFP+ 세포가 나열되어 있으며, 이들은 미엘린 마커+ 세포와 오버랩 (Overlap) 되어 있다 (도 12B 및 C).

재생 신경에 미입 (迷入) 한 GFP+ 세포는 미엘린 마커도 발현하고 있다 (도 12B 및 C, 화살표).

실시예 13 면역 부전 마우스 좌골 결손 (5 ㎜ ) 모델로의 dSC 의 이식 (도 13)

〈방법〉

배양 슈반 세포 (SC : 비교 대조군) 을 좌골 신경으로부터 분리 배양하였다. 이들 세포를 미리 젤라틴 튜브에 파종시켜, 마우스의 좌골 신경줄기에 약 5 ㎜ 의 겝 (gap) 을 만들었다. 얻어진 하이브리드형 튜브를 신경 결손부에 이식하였다. Sham 마우스 및 PBS 만을 함유시킨 튜브 이식군 (Cont) 을 컨트롤로 하여 신경 재생 촉진 효과를 평가하였다 (도 13A).

가교 신경은 매크로 이미지와 재생 신경 조직 횡축 절편의 룩솔ㆍ패스트 블루에 의한 미엘린 염색 이미지를 나타낸다. 좌골 신경 기능은 이식 후 6 주 (6W) 와 12 주 (12W) 후의 결과를 나타내고, 지배 관계의 위축은 습근 (濕筋) 중량으로 평가를 실시하였다.

좌골 신경 기능 인덱스 (SFI : Sciatic functional Index) 는, 문헌 : Inserra MM, Bloch DA, Terris DJ. Functional indices for sciatic, peroneal, and posteriortibial nerve lesions in the mouse. Microsurgery. 1998 ; 18 : 119-124. 의 기재에 준하여 구하였다.

신경 지배 근육 (Innervated muscle) 의 위축 및 선유화는, 문헌 : Clavijo-Alvarez JA, Nguyen VT, Santiago LY, Doctor JS, Lee WP, Marra KG. Comparison of biodegradable conduits within aged rat sciatic nerve defects. Plast Reconstr Surg. 2007 ; 119 : 1839-1851. 의 기재에 준하여 평가하였다.

〈결과〉

가교된 신경의 매크로 이미지에서는, cSC 군과 dSC 의 양자 모두 컨트롤과 비교하여 우수하여, 양자 사이에서 분명한 차이는 보이지 않았다 (도 13B).

재생 신경 조직 횡축 절편의 미엘린 염색 이미지에서는 dSC 군은 cSC 군에 필적하고 있다 (도 13C).

좌골 신경 기능 인덱스 (SFI : Sciatic functional Index) 에서는, 12W 의 시점에서 dSC 군은 cSC 에 필적하는 좌골 신경 기능의 회복이 보였다 (도 13D).

신경 지배 근육 (Innervated muscle) 의 위축 및 선유화에서도, 양 군에 대해서도 컨트롤과의 유의차는 보였지만, cSC 와 dSC 사이에서의 유의차는 보이지 않았다 (도 13E).

실시예 14 슈반 세포로의 컨버전 (표 2)

표 2 에 나타내는 유전자의 조합에 대하여, 실시예 2 와 동일한 실험을 실시하였다.

어느 넘버의 웰에 어느 유전자의 조합이 도입되었는지는, 표 2 에 기재한다 (표 중에서, 각 유전자의 란에 「1」이라고 기재가 있는 것은, 그 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 것을, 공란은, 그 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 것을 나타낸다).

실시예 3 과 마찬가지로, 플레이트를 형광 현미경 (올림푸스 제조) 으로 관찰하여, S100β 의 염색성을 4 단계로 평가하였다 (S100β 양성 세포가 많은 것부터 순서대로 +++, ++, +, -).

평가 결과를 표 2 중에 함께 나타낸다.

이 결과로부터, Oct6 은 슈반 세포의 분화에 있어서 중요한 기능을 하는 것이 알려져 있는 인자이지만, 체세포에서 슈반 세포로의 다이렉트ㆍ리프로그래밍은 거의 유도할 수 없는 것을 알 수 있다. 또, Oct6 은, Sox10 단독, Krox20 단독, 또는 Sox10+Krox20 에 의한 체세포에서 슈반 세포로의 다이렉트ㆍ리프로그래밍의 효율을 높이지 않는 것을 알 수 있다.

[표 2-1]

[표 2-2]

실시예 15 신경 영양 인자의 산생 (도 14)

HDF, cSC 및 dSC 를 4 × 10⁴ 세포/㎠ 의 조건에서 세포 배양용 디시에 파종하고, 80 ％ 컨플루언트를 확인 후, 48 시간 세포 상청 채취용 배지에서 배양하였다. 그 후, 각 군의 배양 상청을 40 ㎛ 필터에 통과시킨 후, 채취하였다. 뇌 유래 신경 성장 인자 (Brain-derived Neurotrophic Factor, BDNF), 신경 아교 세포계 유도 신경 영양 인자 (glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF), 신경 성장 인자 (Nerve Growth Factor, NGF) 에 대하여, 각각의 배양 세포의 배양 상청 중에 포함되는 단백량을 ELISA kits human BDNF, GDNF, NGF (Promega, Madison, WI) 를 사용하여 측정하였다.

그 결과, cSC 와 dSC 는 모두 BDNF, GDNF, NGF 의 전부를 컨트롤 (HDF) 에 비해 강하게 산생하고 있었다. 또, BDNF 의 산생이 가장 높은 점에서도 cSC 와 dSC 는 유사하였다.

Claims (7)

1. SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 포함하는, 포유 동물의 체세포를, 다능성 줄기세포를 경유하지 않고 슈반 세포로 컨버트하기 위한 제제로서,
   상기 유전자가, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자의 조합이고,
   상기 체세포가 선유아세포, 혈관 내피 세포 또는 인간 정상 지방 유래 간질세포인, 제제.
2. 제 1 항에 있어서,
   포유 동물의 신경의 결손, 또는, 슈반 세포의 결손, 부족 혹은 기능 저하에 기초하는 질환을 치료하기 위한 제제인, 제제.
3. SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 포함하는, 포유 동물의 체세포를, 다능성 줄기세포를 경유하지 않고 슈반 세포로 컨버트하기 위한 벡터로서,
   상기 유전자가, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자의 조합이고,
   상기 체세포가 선유아세포, 혈관 내피 세포 또는 인간 정상 지방 유래 간질세포인, 벡터.
4. 제 3 항에 있어서,
   포유 동물의 신경의 결손, 또는, 슈반 세포의 결손, 부족 혹은 기능 저하에 기초하는 질환을 치료하기 위한 벡터인, 벡터.
5. 포유 동물의 체세포에, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 도입하는 공정을 포함하는, 다능성 줄기세포를 경유하지 않고 체세포로부터 슈반 세포를 조제하는 방법으로서,
   상기 유전자가, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자의 조합이고,
   상기 체세포가 선유아세포, 혈관 내피 세포 또는 인간 정상 지방 유래 간질세포인, 방법.
6. 제 5 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 세포를 포함하는, 신경의 결손, 또는, 슈반 세포의 결손, 부족 혹은 기능 저하에 기초하는 질환을 치료하기 위한, 이식 재료.
7. SOX10 유전자 및 KROX20 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유전자 또는 그 발현 산물을 포함하는, 다능성 줄기세포를 경유하지 않고 체세포로부터 슈반 세포를 조제하기 위한 조성물로서,
   상기 유전자가, SOX10 유전자 및 KROX20 유전자의 조합이고,
   상기 체세포가 선유아세포, 혈관 내피 세포 또는 인간 정상 지방 유래 간질세포인, 조성물.

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