JP3836791B2 - リガンドの迅速な同定のための拡張されたテザー化アプローチ - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、一般に、標的分子に対する結合パートナーの迅速な同定および特徴付けのための、および改善された結合親和性を有する結合パートナーを提供するための方法に関する。より詳細には、本発明は、標的分子上で互いに近くで結合する低分子フラグメントの迅速な同定のための、改善されたテザー化（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）方法に関する。この方法は、より高い親和性の化合物を生成するために、標的生物学的分子（ＴＢＭ）（例えば、ポリペプチドまたは他の高分子）上に予め形成されたリンカーを介して、目的の部位付近に弱く結合する低分子リガンドの迅速な同定に特に適切である。
【０００２】
（関連分野の説明）
薬物発見プロセスは、通常、適度な親和性のリード（Ｋ_ｄ 約１〜１０μＭ）を同定するための化合物ライブラリー（代表的には、数十万のメンバー）の大量のスクリーニングから開始する。いくつかの標的は、このスクリーニングプロセスに十分に適切であるが、ほとんどは、適度な親和性のリードが得るのが困難であることから、問題となる。より弱い結合化合物を同定およびその後に最適化することは、この成功率を改善するが、高い濃度でのスクリーニングは、一般に、化合物の不溶性およびアッセイの人為的結果に起因して、実用的でない。さらに、代表的なスクリーニングプロセスは、薬物設計のための特定の部位を標的とせず、高スループットアッセイが利用可能である部位のみを標的とする。最後に、多くの従来のスクリーニング方法は、阻害アッセイに依存し、これは、しばしば、反応性化学種または変性剤によって生じる人為的結果を受けやすい。
【０００３】
Ｅｒｌａｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：９３６７−９３７２（２０００）は、「テザー化（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）」と呼ばれる、新しいストラテジーを最近報告した。これは、中間のジスルフィド「テザー」を使用して、タンパク質または他の高分子上の特異的に標的化された部位に低い親和性で結合する小さい（約２５０Ｄａ）可溶性薬物フラグメントを、迅速かつ確実に同定する。このアプローチに従って、ジスルフィド含有分子のライブラリーを、迅速なチオール交換を促進する部分的な還元条件下で、システイン含有標的タンパク質と反応させる。分子が、たとえ、その標的タンパク質に対して弱い親和性を有する場合であっても、その分子を標的タンパク質に連結するジスルフィド結合（「テザー」）は、エントロピー的に安定化される。次いで、このジスルフィドテザー化フラグメントを、種々の方法（質量分析法（ＭＳ）を含む）によって同定し得、そしてそれらの親和性が、ジスルフィドテザーの除去の際に従来のアプローチによって改善され得る。ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／００８２３（２０００年１月６日公開）もまた参照のこと。
【０００４】
Ｅｒｌａｎｓｏｎらのテザー化アプローチは、小さい低親和性リガンドの迅速な同定において有意な利点を提示し、そして薬物リードを生成するための強力なツールであるが、薬物候補の理論的設計を容易にするためのさらなる改善された方法の必要性が存在する。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、拡張されたテザー化アプローチを使用することによる、標的分子上の異なる部位に対して固有の結合親和性を有するリガンドを迅速かつ確実に同定するためのストラテジーを記載する。このアプローチは、低分子エキステンダー（ＳＭＥ）の設計に基づき、このＳＭＥは、可逆的または不可逆的な共有結合を介して、目的の第１の部位または第１の部位付近で標的分子（ＴＭ）にテザー化（繋がれ）され、そしてＴＭ上の目的の第２の部位に対する親和性についてスクリーニングされる有機低分子と反応性である、化学反応基を有する。従って、ＳＭＥは、複数のリガンド候補をスクリーニングして、ＴＭ上の目的の第２の部位に対する固有の結合親和性を有するリガンドを同定するために使用される。所望の場合、さらなるＳＭＥは、目的の第２の部位に対する結合親和性を有するリガンドの正体に基づいて設計され、そしてスクリーニングを繰り返して、同じＴＭまたは関連するＴＭ上の目的の同じ部位または他の部位に対する固有の結合親和性を有するさらなるリガンドを同定し得る。
【０００６】
本発明の１つの局面は、低分子エキステンダー（ＳＭＥ）の設計に関する。この局面に置いて、本発明は、以下の工程を包含するプロセスに関する：
（ｉ）目的の第１の部位および第２の部位を有する標的分子（ＴＭ）を、複数の第１の小さい有機リガンド候補と接触させる工程であって、このＴＭは、目的の第１の部位または第１の部位付近で反応性の求核剤または求電子剤を含むかまたは含むように改変されており、この候補は、この求核剤または求電子剤と反応性の官能基を有し、この工程は、この求核剤または求電子剤と目的の第１の部位に対する親和性を有する候補との間で、可逆的な共有結合が形成されて、ＴＭ−第１のリガンド複合体を形成するような条件下で行われる、工程；
（ｉｉ）（ｉ）の複合体由来の第１のリガンドを同定する工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で同定された第１のリガンドの誘導体を設計して、ＴＭ上の求核剤または求電子剤と反応性の第１の官能基、および目的の第２の部位に対する親和性を有する第２のリガンドと反応性の第２の官能基を有する、ＳＭＥを提供する工程。
【０００７】
本発明のこの局面の１つの実施形態において、上記工程（ｉｉｉ）のＳＭＥは、それがＴＭの求核剤または求電子剤と不可逆的な共有結合を形成し得るように、設計される。好ましい実施形態において、ＴＭ上の反応基は、求核剤であり、好ましくは、チオール基、保護化チオール基、可逆的ジスルフィド基、ヒドロキシル基、保護化ヒドロキシル基、アミノ基、保護化アミノ基、カルボキシル基、または保護化カルボキシル基であり、そしてＳＭＥ上の好ましい第１の官能基は、ＳＮ２様の付加を受け得るかまたはその求核剤とマイケル型の付加物を形成し得る基である。次いで、この様式で設計されたＳＭＥをＴＭと接触させて、可逆的なＴＭ−ＳＭＥ複合体を形成する。次いで、この複合体を、複数の第２の小さい有機リガンド候補と接触させ、ここで、このようか候補は、ＴＭ−ＳＭＥ複合体中のＳＭＥと反応性の官能基を有する。結果として、ＴＭ上の目的の第２の部位に対する親和性を有する候補物は、ＴＭ−ＳＭＥ複合体と可逆的な共有結合を形成し、それによって、目的の第２の部位に対する固有の結合親和性を有するリガンドが、同定される。
【０００８】
本発明の代替的な実施形態において、上記工程（ｉｉｉ）のＳＭＥは、ＴＭの求核剤または求電子剤と第１の可逆的な共有結合を形成する、第１の官能基を含むように設計される。このＴＭ上の反応基は、好ましくは、求核剤である。好ましくは、この可逆的な共有結合は、ＴＭ上のチオール、保護化チオールまたは可逆的ジスルフィド結合で形成される、ジスルフィド結合である。次いで、この様式で設計されたＳＭＥを、チオール交換条件下で、ＴＭと接触させ、その後かまたはそれと同時かのいずれかで、ＴＭを複数の第２の小さい有機リガンド候補と接触させ、各々の小さい有機リガンド候補は、遊離チオール、保護化チオールまたは可逆的ジスルフィド基を有し、ここで、ＴＭ上の目的の第２の部位に対する親和性を有するリガンド候補が、ＴＭ−ＳＭＥ複合体とジスルフィド結合を形成し、それによって、第２のリガンドが同定される。このプロセスは、ジスルフィド還元剤（例えば、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスレイトール（ＤＴＥ）、メルカプトプロパン酸、グルタチオン、システアミン、システイン、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびトリス（シアノエチル）ホスフィン）の存在下で行われ得る。
【０００９】
特定の実施形態において、ＳＭＥは、目的の部位または目的の部位付近にチオールを有する標的生物学的分子（ＴＢＭ）によって、チオールまたは保護化チオール（ジスルフィドモノフォア（ｍｏｎｏｐｈｏｒｅ））を有する有機低分子をこのような分子のライブラリーから選択に基づいて設計される。この場合、本発明の豊富尾は、以下の工程を包含するプロセスである：
（ｉ）チオール交換条件下で、ＴＢＭを有機低分子のライブラリーと接触させる工程であって、このＴＢＭは、このＴＢＭ上の目的の第１の部位または第１の部位付近でチオール、保護化チオールまたは可逆的ジスルフィド基を含むかまたは含むように改変されており、各々の有機低分子は、遊離チオールまたは可逆的ジスルフィド基（ジスルフィドモノフォア（ｍｏｎｏｐｈｏｒｅ））を有し、ここで、目的の第１の部位に対して親和性を有するライブラリーのメンバーは、このＴＢＭとジスルフィド結合を形成する、工程；
（ｉｉ）（ｉ）由来のライブラリーのメンバー（選択されたジスルフィドモノフォア）を同定する工程；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来のライブラリーのメンバーの誘導体を設計する工程であって、この誘導体は、第１の官能基および第２の官能基を有するＳＭＥであり、第１の官能基は、ＴＢＭ上のチオールと反応性であり、そして第２の官能基は、チオール、保護化チオールまたは可逆的ジスルフィド基である、工程。
【００１０】
先のように、ＳＭＥは、ＴＢＭと不可逆的または可逆的な共有結合を形成する第１の官能基を含むように設計され得、そして第２のリガンドを同定するために、上記のように、低分子の特定のライブラリーにおいて、低分子リガンド候補をスクリーニングするために使用され得る。
【００１１】
従って、１つの実施形態において、工程（ｉｉｉ）のＳＭＥは、ＴＢＭ上のチオールと不可逆的な共有結合を形成する第１の官能基を含むように設計される。この実施形態の好ましい第１の官能基は、ＳＮ２様の付加を受け得るかまたはチオールとマイケル型の付加物を形成し得る基である。次いで、この様式で設計されたＳＭＥをＴＢＭと接触させて、不可逆的なＴＢＭ−ＳＭＥ複合体を形成する。次いで、この複合体を、チオール交換条件下で、有機低分子の第２のライブラリーと接触させ、各有機低分子は、遊離チオールまたは可逆的ジスルフィド基を有し、ここで、ＴＢＭ上の目的の第２の部位に対する親和性（好ましくは、最も高い親和性）を有するライブラリーのメンバー（第２のリガンド）が、ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体とジスルフィド結合を形成する。
【００１２】
代替的な実施形態において、工程（ｉｉｉ）の低分子エキステンダー（ＳＭＥ）は、ＴＢＭのチオールと第１の可逆的な共有結合を形成する、第１の官能基を含むように設計される。次いで、この様式で設計されたＳＭＥを、チオール交換条件下で、ＴＢＭと接触させ、その後かまたはそれと同時かのいずれかで、ＴＢＭを第２の有機低分子のライブラリーと接触させ、各々の有機低分子は、遊離チオールまたは可逆的ジスルフィド基を有し、ここで、ＴＢＭ上の目的の第２の部位に対する親和性（好ましくは、最も高い親和性）を有するライブラリーのメンバー（第２のリガンド）が、ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体とジスルフィド結合を形成する。
【００１３】
このプロセスは、ジスルフィド還元剤（例えば、上記に列挙されるジスルフィド還元剤）の存在下で行われ得る。
【００１４】
ＴＭまたはＴＢＭ上の目的の第１の部位または第２の部位に対するリガンド候補（ライブラリーのメンバー）の親和性の決定は、プール中の異なるライブラリーメンバー間の競合によってか、または還元剤（例えば、上記に列挙される還元剤）との比較（すなわち、力価測定）によって行われ得る。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明は、以下の工程を包含するプロセスに関する：
（ｉ）標的生物学的分子（ＴＢＭ）を、低分子エキステンダーと接触させる工程であって、このＴＢＭは、そのＴＢＭ上の目的の第１の部位または第１の部位付近で求核剤を含むかまたは含むように改変されており、この低分子エキステンダーは、この求核剤と反応性の第１の官能基、およびチオール、保護化チオールまたは可逆的ジスルフィド基である第２の官能基を有し、それによって、ＴＢＭ−低分子エキステンダー（ＴＢＭ−ＳＭＥ）複合体を形成する、工程；
（ｉｉ）チオール交換条件下で、このＴＢＭ−ＳＭＥ複合体を、有機低分子のライブラリーと接触させる工程であって、各々の有機低分子（リガンド）は、遊離チオール、保護化チオールまたは可逆的ジスルフィド基を有し、ここで、目的の部位に対する親和性を有するライブラリーのメンバーは、ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体とジスルフィド結合を形成し、それによって、ＴＢＭ−ＳＭＥ−リガンド複合体を形成する、工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来のリガンドを同定する工程。
【００１６】
別の特定の実施形態において、本発明は、以下を包含するプロセスに関する：
（ｉ）標的生物学的分子（ＴＢＭ）を提供する工程であって、このＴＢＭは、このＴＢＭ上の目的の第１の部位付近に反応性の求核剤を含むかまたは含むように改変されている、工程；
（ｉｉ）（ｉ）由来のＴＢＭを、低分子エキステンダーと接触させる工程であって、この低分子エキステンダーは、ＴＢＭ上の求核剤と反応性である基を有し、そして遊離チオールまたは保護化チオールを有する、工程；
（ｉｉｉ）ＴＢＭ上の求核剤と低分子エキステンダー上の基との間で共有結合が形成されるように条件を調整する工程であって、それによって、ＴＢＭと低分子エキステンダーとを含む共有結合複合体を形成し、この複合体は、ＴＢＭ上の目的の第２の部位付近に遊離チオールまたは保護化チオールを提示する、工程；
（ｉｖ）チオール交換条件下で、（ｉｉｉ）由来の複合体を、有機低分子のライブラリーと接触させる工程であって、各々の分子は、遊離チオールまたは交換可能なジスルフィド連結基を有し、ここで、ＴＢＭ上の目的の第２の部位に対する最も高い親和性を有するライブラリーのメンバーが、この複合体とジスルフィド結合を形成する、工程；および
（ｖ）（ｉｖ）由来のライブラリーのメンバーを同定する工程。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明のプロセスは、各メンバーがジスルフィド結合を形成するライブラリーで行われ得る。このようなライブラリーの１例は、各メンバーがシステアミンジスルフィドを形成するライブラリーである。ライブラリーのメンバーがジスルフィドを形成する場合、還元剤対総ジスルフィドの好ましいモル比は、約１：１００〜約１００：１であり、そしてより好ましくは、約１：１〜約５０：１である。
【００１８】
テザー化（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）プロセスは、ジスルフィドライブラリーのメンバーを、ＴＢＭとまたは２以上のプール中のＴＢＭと一度に接触させることにより、行われ得る。プールが用いられる場合、１プールにつき５〜１５のライブラリーメンバーを用いることが好ましい。
【００１９】
全ての実施形態において、ＳＭＥおよび／またはＴＭもしくはＴＢＭ上の目的の部位に結合する低分子のライブラリーの正体は、例えば、質量分析法（ＭＳ）によって、または検出可能なタグによって、決定され得る。ＴＢＭに結合するライブラリーメンバーを検出するために質量分析が用いられ、プールが用いられる場合、プールの各々のメンバーは、分子量が異なり、好ましくは、約１０ダルトン異なることが好ましい。ＴＢＭ−ライブラリーメンバーの複合体の質量を測定することにより、または最初にこの複合体からライブラリーメンバーを遊離するか、もしくは機能的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、酵素アッセイなど）を用いることにより同定が行われ得る。
【００２０】
異なる局面において、本発明は、上記で議論された方法のいずれかにより同定された第１のリガンドおよび／または第２のリガンドを含む分子に関する。特定の実施形態において、この分子は、互いに共有結合された第１および第２のリガンドを含む。共有結合は、任意の共有結合（ジスルフィド結合が挙げられるが、これに限定されない）により提供され得る。
【００２１】
さらなる局面において、本発明は、このような分子を合成するための方法に関する。得られた分子は、当然のことながら、例えば、改善された特性（例えば、溶解性、バイオアベイラビリティー、親和性、および半減期）を付与するためにさらに改変され得る。例えば、ジスルフィド結合は、標準的な生物学的条件下でより大きな安定性を有するリンカーにより置換され得る。可能なリンカーとしては、アルカン、アルケン、芳香族、ヘテロ芳香族、エーテルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
（１．定義）
他に規定されない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）、およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第４版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９２）は、本出願において用いられる用語の多くに対する一般的ガイドを当業者に提供する。
【００２３】
当業者は、本発明の実施において用いられ得る、本明細書中に記載の方法および材料と類似のまたはこれと等価な多くの方法および材料を認識する。実際に、本発明は、記載の方法および材料にはいかようにも限定されない。本発明の目的に関しては、以下の用語が、以下に記載される。
【００２４】
用語「標的」、「標的分子」、および「ＴＭ」は、交換可能にかつその最も広い意味で用いられ、リガンドが固有の結合親和性を有する化学的実体または生物学的実体をいう。この標的は、分子、分子の一部分、または分子の凝集物であり得る。この標的は、可逆的共有結合を介してリガンドに可逆的に共有結合し得るか、または不可逆的に共有結合（テザー（ｔｅｔｈｅｒ））し得る。標的分子の特定の例としては、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、酵素（プロテアーゼ（例えば、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、およびアスパルチルプロテアーゼ）が挙げられる））、レセプター、転写因子、レセプターに対するリガンド、増殖因子、サイトカイン、免疫グロブリン、核タンパク質、シグナル伝達成分（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ）、アロステリック酵素調節因子など、ポリヌクレオチド、ペプチド、糖質、糖タンパク質、糖脂質、および他の巨大分子（例えば、核酸−タンパク質複合体、クロマチンもしくはリボソーム）、脂質二重層含有構造（例えば、膜）または膜に由来する構造（例えば、小胞）が挙げられる。この規定は、具体的には、以下に規定される標的生物学的分子（ＴＢＭ）を含む。
【００２５】
本明細書中で記載される場合、「標的生物学的分子」または「ＴＢＭ」は、互いに生物学的に関連する複合体を形成し得る単一の生物学的分子または複数の生物学的分子をいい、これらの分子に対して、低分子アゴニストもしくは低分子アンタゴニストが治療的重要性を有する。好ましい実施形態において、ＴＢＭは、２以上のアミノ酸を含み、有機低分子のライブラリーのメンバーに結合するための反応基を有するか、またはこの反応基を有するように改変され得るポリペプチドである。
【００２６】
単数形もしくは複数形で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、一般に、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたは任意のポリデオキシリボヌクレオチドをいう。従って、例えば、本明細書中で定義される場合、ポリヌクレオチドとしては、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域を含むＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子（これらは、一本鎖、もしくはより代表的には、二本鎖であり得、または一本鎖領域および二本鎖領域を含み得る）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本明細書中で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。このような領域における鎖は、同じ分子に由来してもよいし、異なる分子に由来してもよい。この領域は、これらの分子の１以上の全てを含み得、より代表的には、これらの分子のいくつかのうちの領域のみを含み得る。三重らせん領域の分子のうちの１つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は、具体的には、１以上の改変塩基を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。従って、安定性または他の理由のために骨格が改変されたＤＮＡまたはＲＮＡは、この用語が、本明細書中で意図される限り「ポリヌクレオチド」である。さらに、異常塩基（例えば、イノシン）もしくは改変塩基（例えば、トリチル化塩基）を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で規定される場合、用語「ポリヌクレオチド」内に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、改変されていないポリヌクレオチドの化学的に改変された形態、酵素的に改変された形態および／または代謝的に改変された形態、ならびにウイルスおよび細胞（単細胞および多細胞を含む）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態の全てを含む。
【００２７】
本明細書中で規定される場合「リガンド」は、標的に対する固有の結合親和性を有する実体である。このリガンドは、この標的に結合する分子、またはこの標的に結合する分子の一部分であり得、このリガンドは、代表的には、有機低分子であり、この有機低分子は、標的分子に対する固有の結合親和性を有するが、他の配列特異的結合分子でもあり得る。これらの配列特異的結合分子としては、ペプチド（Ｄ−、Ｌ−、またはＤ−およびＬ−の混合物）、ペプチド模倣物、複雑な糖質、または個々のユニットもしくはモノマーの他のオリゴマー（これらは、標的に特異的に結合する）が挙げられる。用語「モノフォア（ｍｏｎｏｐｈｏｒｅ）」は、用語「リガンド」と交換可能に本明細書中で用いられ、リガンドのモノマーユニットをいう。用語「ダイアフォア（ｄｉａｐｈｏｒｅ）」は、ユニットを形成するように共有結合した２つのモノフォアを示し、このユニットは、標的上の２つの別個であるが、近くにある部位に結合する２つの構成的モノフォアユニットもしくはリガンドが原因で標的に対してより高い親和性を有する。個々の成分の親和性の積より大きなダイアフォアの結合親和性は、「アビディティー」といわれる。用語ダイアフォアは、ユニットが標的に共有結合されているか、標的から遊離した後に別々に存在しているか否かにかかわらず、用いられる。この用語はまた、種々の誘導体もしくは標的に対する結合を増強するために導入された改変を含む。
【００２８】
本明細書中で用いられる場合、標的上の「目的の部位」は、特定のリガンドが結合する部位であり、この部位は、モノマーサブユニットの特定配列（例えば、アミノ酸残基、またはヌクレオチド）を含み得、３次元構造を有し得る。代表的には、リガンドと標的分子上の目的の部位との間の分子相互作用は、非共有結合であり、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および静電相互作用が挙げられる。ポリペプチド（例えば、タンパク質標的）の場合、目的の部位は、広範に、標的の、インビボもしくはインビトロで天然の複合体を形成する分子に対する結合に関与するアミノ酸残基を含む。
【００２９】
「低分子」は、通常は１０ｋＤａ未満の分子量であり、合成の有機化合物もしくは合成の無機化合物、ペプチド、（ポリ）ヌクレオチド、（オリゴ）糖などが挙げられるが、これらに限定されない。低分子としては、具体的には、低分子の非ポリマー性（例えば、非ペプチドもしくは非ポリペプチド）有機分子または無機分子が挙げられる。多くの製薬会社は、このような分子の広範なライブラリーを有し、このライブラリーは、本発明の拡大結合アプローチを用いることにより簡便にスクリーニングされ得る。好ましい低分子としては、約３００Ｄａ未満の分子量を有し、より好ましくは、約６５０Ｄａ未満の分子量を有する。
【００３０】
本明細書中で用いられる場合、用語「テザー（ｔｅｔｈｅｒ）」は、目的の部位の近辺において標的（本明細書中上記で規定される標的生物学的分子を含む）と可逆性または不可逆性の共有結合し得る部分を含む構造をいう。
【００３１】
本明細書中で用いられる場合、句「低分子エキステンダー（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ）（ＳＭＥ）」とは、約７５ダルトンから約１，５００ダルトンの分子量を有し、かつＴＭ上の求核基または求電子基と反応性の第１の官能基、およびリガンド候補物またはリガンド候補物のライブラリーのメンバーと反応性の第２の官能基を有する有機低分子をいう。好ましくは、第１の官能基は、ＴＢＭ上の求核基と反応性であり（このような求核基と不可逆性もしくは可逆性の共有結合を形成し得る）、ＳＭＥの他の末端における反応基は、遊離チオール基もしくは保護されたチオール基であるか、または遊離チオール基もしくは保護されたチオールの基の前駆体の基である。１つの実施形態において、低分子エキステンダーの少なくとも一部分は、ＴＢＭ上の目的の第１の部位と非共有結合を形成し得る（すなわち、このような目的の第１の部位に対して固有の親和性を有する）。この定義内には、Ｃｄ、Ｈｇ、およびＡｓのような、求核基（例えば、ＴＢＭのＳＨ）と結合を形成し得る金属を含む有機低分子（非ポリマー性分子を含む）が含まれる。
【００３２】
本明細書中で用いられる場合、句「可逆性共有結合」とは、好ましくは、標的を変性させない条件下で切断され得る共有結合をいう。例としては、ジスルフィド、シッフ塩基、チオエステルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
リガンドを参照する場合の用語「反応基」は、リガンド候補物（例えば、ライブラリーのメンバーまたは有機低分子化合物）との共有結合が形成され得る部位を提供する化学基または部分を記載するために用いられる。従って、反応基は、ライブラリーのメンバーと共有結合を形成して、これに対してスクリーニングされるように選択される。
【００３４】
用語「アンタゴニスト」は、最も広範な意味で用いられ、ＴＢＭのような標的により示される生物学的活性を部分的にまたは完全にブロックするか、阻害するか、または中和する任意のリガンドを含む。類似の様式で、用語「アゴニスト」は、最も広い意味で用いられ、ＴＢＭのような標的により示される生物学的活性を（例えば、このようなＴＢＭの機能もしくは発現、またはこのようなＴＢＭを介するシグナル伝達の効率を特異的に変化させ、それにより、既に存在する生物学的活性を改変する（増加または阻害する）か、または新たな生物学的活性を誘発することにより）模倣する任意のリガンドを含む。
【００３５】
句「含むように改変される」または「有するように改変される」は、交換可能に用いられ、標的の変異体、改変体もしくは誘導体、または反応性求核基もしくは反応性求電子基を作製することをいい、化学的改変が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、タンパク質において、当業者は、野生型残基の代わりに、求核基もしくは求電子基を含む側鎖を有するアミノ酸残基を用いて置換し得る。別の例は、システイン残基のチオール基をアミノ基に変換することである。
【００３６】
本明細書中で用いられる場合、用語「反応性求核基」とは、標的（例えば、ＴＢＭ）を変性または損傷させない条件下で別の分子上の適合性官能基と共有結合を形成し得る求核基をいう。最も関連する求核基は、チオール、アルコール、活性化カルボニル、エポキシド、アジリジン、芳香族スルホネート、ヘミアセタール、およびアミンである。同様に、本明細書中で用いられる場合、用語「反応性求電子基」とは、好ましくは、標的（例えば、ＴＢＭ）を変性させない、そうでなければ損傷させない条件下で、別の分子上の適合性官能基と共有結合を形成し得る求電子基をいう。最も関連する求電子基は、イミン、カルボニル、エポキシド、アジリジン、スルホネート、およびヘミアセタールである。
【００３７】
標的（例えば、ＴＢＭ）上の「目的の第１の部位」とは、ＳＭＥの少なくとも一部分が反応性求核基もしくは反応性求電子基に共有結合した場合、ＳＭＥの少なくとも一部分により接触され得る部位をいう。目的の第１の部位は、ＳＭＥと非共有結合を形成する能力を有してもよいし、このような能力を有さなくてもよい。
【００３８】
本明細書中で用いられる場合、句「求核基と反応性の基」、「求核反応基」、「求電子基と反応性の基」、および「求電子反応基」とは、ＴＭ（例えば、ＴＢＭ）上の求核基／求電子基と、ＴＭ（例えば、ＴＢＭ）を変性させないか、そうでなければ損傷させない条件下で共有結合を形成し得るＳＭＥ上の官能基をいう。
【００３９】
本明細書中で用いられる場合、用語「保護されたチオール」とは、共有結合を形成する基もしくは分子と既に反応しているチオールをいい、この共有結合により、チオール基が反応性でなくなり、保護されたチオールを脱保護して、遊離のチオールを再生し得る。
【００４０】
本明細書中で用いられる場合、句「条件を調節する」とは、標的（例えば、ＴＢＭ）を、リガンドと標的との間で共有結合を形成させるために必要な、任意の個々の反応条件、一連の反応条件の組み合わせ、または試薬（例えば、求核基およびＳＭＥ上の求核基と反応性の基）、あるいは既に形成された共有結合を切断させるために必要な、任意の個々の反応条件、一連の反応条件の組み合わせ、または試薬に供することをいう。
【００４１】
本明細書中で用いられる場合、用語「共有結合複合体」とは、ＳＭＥとＴＭ（例えば、ＴＢＭ）の結合をいい、この結合は、ＴＭ（例えば、ＴＢＭ）上の求核基／求電子基を介してＳＭＥ上の求核基／求電子基と反応性の基と共有結合されている複合体、および低分子エキステンダーの一部分とＴＭ（例えば、ＴＢＭ）上の目的の第１の部位を介して非共有結合されている複合体の両方である結合をいう。
【００４２】
本明細書中で用いられる場合、句「交換可能なジスルフィド連結基」とは、チオール含有低分子エキステンダーを提示する共有結合複合体を用いてスクリーニングされる分子のライブラリーをいう。ここで、このライブラリーの各メンバーは、反応条件がこのようなチオール交換に好ましいように調節されている場合、共有結合複合体上に提示されたチオール基または保護されたチオール基と反応して、新たなジスルフィド結合を形成し得るジスルフィド基を含む。
【００４３】
本明細書中で用いられる場合、句「目的の第２の部位に対する最高の親和性」とは、ＴＭ（例えば、ＴＢＭ）上の目的の第２の部位に対してより高いの熱力学的安定性を有する分子をいう。この分子は、ジスルフィド含有ライブラリーメンバーのライブラリーから優先的に選択される。
【００４４】
本明細書中の分子の「機能的改変体」は、参照分子と共通した活性を有する改変体である。
【００４５】
「活性な」または「活性」は、定量的な生物学的特性および／または免疫学的特性を意味する。
【００４６】
（２．標的）
本発明における使用が見出される標的（例えば、標的生物学的分子（ＴＢＭ））としては、リガンド候補が結合し得る、分子、分子の一部、および分子の凝集体、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、酵素、レセプター、転写因子、レセプターに対するリガンド、増殖因子、免疫グロブリン、核タンパク質、シグナル伝達成分、アロステリック酵素調節因子など）、ポリヌクレオチド、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、糖脂質、および他の高分子（例えば、核酸−タンパク質複合体、クロマチン、またはリボソーム）、脂質二重層を含む構造（例えば、膜）、または膜に由来する構造（例えば、小胞）が挙げられるが、これらに限定されない。この標的は、種々の様式で入手され得、この様式としては、天然供給源からの単離および精製、化学合成、組換え生成、ならびにこれらの方法および類似する方法の任意の組み合わせが挙げられる。
【００４７】
好ましい酵素標的ファミリーは、システインプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼおよびインテグラーゼである。好ましいタンパク質：タンパク質標的は、４−ヘリカルサイトカイン、三量体サイトカイン、シグナル伝達分子、転写因子、およびケモカインである。
【００４８】
特に好ましい実施形態において、その標的は、ＴＢＭであり、なおより好ましいのは、ポリペプチド（特に、タンパク質）である。リガンド（好ましくは、低分子有機リガンド）に結合するための標的として本明細書中で用途を見出されるポリペプチド（タンパク質を含む）としては、目的の２つ以上の結合部位を含み、かつ有機低分子または他のリガンド（例えば、ペプチド）に結合するための反応基を保有するかまたは保有するように改変され得る、事実上すべてのポリペプチド（ペプチドとも呼ばれる短いポリペプチドを含む）またはタンパク質が、挙げられる。目的のポリペプチドは、商業的にか、組換えによってか、化学合成によってか、天然供給源からの精製によってか、または他の方法によって、入手され得、そして大部分は、タンパク質（特に、特定のヒト疾患またはヒトの状態に関係するタンパク質（例えば、細胞表面可溶性レセプタータンパク質（例えば、リンパ球細胞表面レセプター）、酵素（例えば、プロテアーゼ（例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびアスパラチルプロテアーゼ）およびチミジレートシンテターゼ）、ステロイドレセプター、核タンパク質、アロステリック酵素、凝固因子、キナーゼ（セリンキナーゼおよびスレオニンキナーゼの両方）、およびデホスホリラーゼ（またはホスファターゼ（セリン／スレオニンホスファターゼまたはタンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ、特にＰＴＰ１Ｂ）のいずれか）、細菌酵素、真菌酵素、およびウイルス酵素（特に、ＨＩＶに関係する酵素、インフルエンザに関係する酵素、ライノウイルスに関係する酵素、およびＲＳＶに関係する酵素）、シグナル伝達分子、転写因子、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡの合成または分解に関係するタンパク質、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡの合成または分解に関係する酵素、免疫グロブリン、ホルモン、種々のサイトカイン（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ））のレセプター、顆粒球コロニー刺激（Ｇ−ＣＳＦ）レセプター、顆粒球マクロファージコロニー刺激（ＧＭ−ＣＳＦ）レセプター、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２を含む）、成長ホルモン、プロラクチン、ヒト胎盤ラクトゲン（ＬＰＬ）、ＣＮＴＦ，オンコスタチン、種々のケモカインおよびそのレセプター（例えば、ＲＮＡＴＥＳ、ＭＩＰβ、ＩＬ−８）、チロシンキナーゼの種々のリガンドおよびレセプター（例えば、インスリン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘレグリン−αおよびヘレグリン−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）、組織成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、神経成長因子（ＮＧＦ））、種々のニューロトロフィンおよびそのリガンド、他のホルモンおよびレセプター（例えば、骨形成因子、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ））、三量体ホルモン（組織壊死因子（ＴＮＦ）を含む）、およびＣＤ４０リガンド、アポトーシス因子−１（ＡＰ−１）およびアポトーシス因子−２（ＡＰ−２）、ｐ５３、ｂａｘ／ｂｃｌ２、ｍｄｍ２、カスパーゼ、ならびにこれらと２０％以上の配列同一性を共有するタンパク質およびレセプターである。
【００４９】
ヒトの炎症標的および免疫標的の重要な群としては、ＩｇＥ／ＩｇＥＲ、ＺＡＰ−７０、ｌｃｋ、ｓｙｋ、ＩＴＫ／ＢＴＫ、ＴＡＣＥ、カテプシンＳおよびカテプシンＦ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ／ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、ＣＤ２８／Ｂ７、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ、（ならびにｐ５５ ＴＮＦレセプターおよびｐ７５ ＴＮＦレセプター）、ＣＤ４０Ｌ、ｐ３８ ｍａｐキナーゼ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、Ｒａｃ ２、ＰＫＣθ、ＩＬ−８、ＴＡＫ−１、ｊｎｋ、ＩＫＫ２およびＩＬ−１８が、挙げられる。
【００５０】
なお他の重要な特定の標的としては、カスパーゼ１、カスパーゼ３、カスパーゼ８およびカスパーゼ９、ＩＬ−１／ＩＬ−１レセプター、ＢＡＣＥ、ＨＩＶインテグラーゼ、ＰＤＥ ＩＶ、Ｃ型肝炎ヘリカーゼ、Ｃ型肝炎プロテアーゼ、ライノウイルスプロテアーゼ、トリプターゼ、ｃＰＬＡ（細胞質ゾルホルホリパーゼＡ２）、ＣＤＫ４、ｃ−ｊｕｎキナーゼ、アダプター（例えば、Ｇｒｂ２）、ＧＳＫ−３、ＡＫＴ、ＭＥＫＫ−１、ＰＡＫ−１、ｒａｆ、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、Ｔｉｅ２、ＥｒｂＢ １およびＥｒｂＢ ２、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＡＲＰ、ＣＤ２、Ｃ５ａレセプター、ＣＤ４、ＣＤ２６、ＣＤ３、ＴＧＦ−α、ＮＦ−κＢ、ＩＫＫβ、ＳＴＡＴ ６、ニューロキニン−１、ＰＴＰ−１Ｂ、ＣＤ４５、Ｃｄｃ２５Ａ、ＳＨＩＰ−２、ＴＣ−ＰＴＰ、ＰＴＰ−α、ＬＡＲおよびヒトｐ５３、ｂａｘ／ｂｃｌ２およびｍｄｍ２が、挙げられる。
【００５１】
目的の標的（例えば、ＴＢＭ）は、その標的上の目的の部位に対する固有の親和性を有するリガンドと可逆的または不可逆的な共有結合を形成することができる反応性基をその標的が保有するかまたは保有するように改変されるように、選択される。例えば、多くの標的が、リガンド（例えば、有機低分子ライブラリーのメンバー）が共有結合され得る反応性基（例えば、アミン基、チオール基、アルデヒド基、ケトン基、ヒドロキシル基など）を天然に保有する。例えば、ポリペプチドは、しばしば、化学的反応性側鎖を有するアミノ酸（例えば、システイン、リジン、アルギニンなど）を有する。さらに、合成技術により、現在では、例えば、自動ペプチド合成機または自動核酸合成機を使用して、目的の所定部位に化学的反応性基を保有する生物学的標的分子を合成することが、可能である。このように、化学的反応基が、自動合成の間に、標的（例えば、ＴＢＭ）中に合成により導入され得る。
【００５２】
１つの特定の実施形態において、その標的は、少なくとも１つの第１反応性基を含み、この第１反応性基は、その標的がポリペプチドである場合は、そのポリペプチドのシステイン残基と結合されても結合されなくてもよく、そして好ましくは、選択されるテザー（ｔｅｔｈｅｒ）が遊離チオール基または保護されたチオール基（下記を参照のこと）である場合に、そのポリペプチドのシステイン残基と結合される。その標的は、好ましくは、限定数のみの遊離チオール基または保護されたチオール基（好ましくは、約５個以下のチオール基、より好ましくは、約２個以下のチオール基、より好ましくは、１個以下のチオール基）を含むかまたは含むように改変されるが、より多くの遊離チオール基を有するポリペプチドもまた、用途を見出される。目的の標的（例えば、ＴＢＭ）はまず、所望の数のチオール基をその標的がすでに保有しているかまたは保有するように改変され得るように、入手または選択され得る。
【００５３】
その標的がポリヌクレオチドである場合、テザーは、例えば、そのポリヌクレオチドに、任意の環外アミンまたは任意のビニル炭素の塩基（例えば、ピリミジンの５位または６位、プリンの８位または２位）、５’炭素または３’炭素、糖リン酸骨格、またはヌクレオチド間リン原子にて、結合され得る。しかし、テザーはまた、他の位置（例えば、チミジンまたはウラシルの５位）にも導入され得る。二本鎖ＤＮＡの場合、例えば、テザーは、目的部位の近くではあるが立体障害を生じるほどには近くなく、主溝または副溝に位置され得る。上記立体障害は、目的部位での標的へのリガンドの結合を妨げ得る。
【００５４】
当業者は、標的（例えば、目的のポリペプチド）を改変して、遊離チオール基を含むリガンド酵素への共有結合に利用可能な所望の数の遊離チオール基をその標的が保有するようにするために慣用的に使用され得る、種々の組換え技術、化学技術、合成技術、および／または他の技術に十分に気付く。そのような技術としては、例えば、標的ポリペプチドをコードする核酸配列を部位特異的変異誘発して、その核酸配列が異なる数のシステイン残基を含むポリペプチドをコードするようにすることが、挙げられる。特に好ましいのは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用する部位特異的変異誘発である（例えば、１９８７年７月２８日発行の米国特許第４，６８３，１９５号；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５章（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９１）を参照のこと）。他の部位特異的変異誘発技術もまた、当該分野で周知であり、そして例えば、以下の刊行物中に記載される：Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）第８章；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；Ｚｏｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，ＤＮＡ ３：４７９−４８８（１９８４）；Ｚｏｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）；Ｂｒａｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：４６４２−４６４６（１９８４）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−８２（１９８７），Ａｄｅｌｍａｎら，ＤＮＡ ２：１８３（１９８３）；ならびにＣａｒｔｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３：４３３１（１９８６）。カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５［１９８５］）および制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５［１９８６］）もまた、使用され得る。
【００５５】
１つより多くのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列改変体が、１つの様式またはいくつかの様式で生成され得る。それらのアミノ酸がそのポリペプチド鎖中でともに近くに位置する場合、それらのアミノ酸は、所望のアミノ酸置換すべてをコードする１つのオリゴヌクレオチドを使用して、同時に変異され得る。しかし、それらのアミノ酸が互いからいくらかの距離に位置する（例えば、１０アミノ酸より大きく隔てられている）場合、所望の変化すべてをコードする単一オリゴヌクレオチドを生成することが、より困難である。代わりに、２つの代替法のうちの１つが、使用され得る。第１の方法において、置換されるべきアミノ酸各々について、別個のオリゴヌクレオチドが生成される。その後、それらのオリゴヌクレオチドが、一本鎖テンプレートＤＮＡに同時にアニールされ、そのテンプレートから合成される第２鎖ＤＮＡが、所望のアミノ酸置換すべてをコードする。別の方法は、所望の変異体を生成するために２回以上の突然変異を包含する。
【００５６】
新しい反応性基の供給源（例えば、システイン）が、その標的内のいずれの場所にも配置され得る。例えば、タンパク質−タンパク質相互作用に重要であることが公知である領域中のタンパク質の表面上にシステインが導入される場合、この表面に結合してその表面をブロックする、低分子が選択され得る。
【００５７】
以下の表は、本発明に従って使用され得る、標的生物学的分子（ＴＢＭ）を例証する。
【００５８】
【表１】

【００５９】
【表２】

（３．目的の部位）
広く、特定の標的（例えば、標的生物学的分子（ＴＢＭ））上の「目的の部位」は、インビボまたはインビトロでその標的が自然な複合体を形成する分子にその標的が結合することに関与する残基によって、規定される。その標的が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である場合、目的の部位は、その標的のリガンドへの結合（通常は、非共有結合による結合）に関与するアミノ酸残基によって、規定される。
【００６０】
例えば、その標的生物学的分子が、別のタンパク質（例えば、ホルモン、サイトカイン、またはシグナル伝達に関与する他のタンパク質）への結合を介してその生物学的効果を発揮するタンパク質である場合、その標的分子は、１つ以上の他のタンパク質と、インビボで自然な複合体を形成し得る。この場合、目的の部位は、特定のタンパク質：タンパク質結合境界面に関係する重大な接触残基として規定される。重大な接触残基は、タンパク質Ｂ上のアミノ酸と直接接触するタンパク質Ａ上のアミノ酸として規定され、かつ、アラニンに変異された場合には、直接結合アッセイまたは競合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ）を用いて測定すると、結合親和性が少なくとも１０分の１、好ましくは少なくとも２０分の１に減少する、アミノ酸として規定される。ＣｌａｃｋｓｔｏｎおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：３８３−３８６（１９９５）による、Ａ Ｈｏｔ Ｓｐｏｔ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙ ｉｎ ａ Ｈｏｒｍｏｎｅ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩｎｔｅｒｆａｃｅならびにＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：５５４−５６３（１９９３）を参照のこと。タンパク質Ａ中にて同定された重大な接触残基の約４Å内にあるタンパク質Ｂのアミノ酸残基もまた、目的の部位の定義に含まれる。
【００６１】
スキャニングアミノ酸分析が、連続する配列に沿って１つ以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。好ましいスキャニングアミノ酸に含まれるのは、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンは、代表的には、この群に含まれる好ましいスキャニングアミノ酸である。なぜなら、アラニンは、β炭素を越える側鎖を排除し、そして改変体の主鎖立体構造を変化する可能性が小さいからである（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｎｅｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。アラニンはまた、代表的に好ましい。なぜなら、アラニンは、最も一般的なアミノ酸であるからである。さらに、アラニンは、埋もれた位置および露出した位置の両方において頻繁に見出される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９７６））。アラニン置換が十分な量の改変体を生じない場合、等比体積（ｉｓｔｅｒｉｃ）アミノ酸が、使用され得る。
【００６２】
その標的生物学的分子が酵素である場合、目的の部位としては、その酵素の結合した基質、インヒビター、アクチベーター、補因子、またはアロステリックモジュレーターと接触するかまたはこれらの約４Å内に存在する、アミノ酸が挙げられ得る。例として、その酵素がプロテアーゼである場合、目的の部位としては、Ｐ４からＰ４’までの基質結合チャネル、触媒機能に関与する残基（例えば、触媒性３つ組（ｔｒｉａｄ）および任意の補因子（例えば、Ｚｎ）結合部位が、挙げられる。プロテインキナーゼについて、目的の部位としては、そのＡＴＰ結合部位に加えて、（上記のような）基質結合チャネルが、挙げられる。デヒドロゲナーゼについて、目的の部位としては、その基質結合領域、ならびにＮＡＤ／ＮＡＤＨにより占められる部位が、挙げられる。ヒドロラーゼ（例えば、ＰＤＥ４）においては、目的の部位としては、そのｃＡＭＰ基質と接触するすべての残基、ならびにその触媒性二価カチオンとの結合に関与する残基が、挙げられる（Ｘｕ，Ｒ．Ｘ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１８２２−１８２５（２０００））。
【００６３】
アロステリック調節される酵素（例えば、グリコーゲンホスホリラーゼＢ）について、目的の部位としては、その基質結合領域中のすべての残基、天然のアロステリックインヒビターであるグルコース−６−リン酸と接触する残基、ならびに新規なアロステリック部位中の残基（例えば、他のインヒビター（例えば、ＣＰ３２０６２６）との結合の際に同定される残基）が挙げられる（Ｏｉｋｏｎｏｍａｋｏｓ ＮＧら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ ８：５７５−５８４（２０００））。
【００６４】
このＴＢＭは、目的の部位にかまたはその付近に、反応性残基を含むかまたは含むように改変されるかの、いずれかである。好ましくは、このＴＢＭは、目的の部位にかまたはその付近に、チオール含有アミノ酸残基を含むかまたは含むように改変される。この場合、ＴＢＭが選択された後、目的の部位が算出される。一旦目的の部位が既知になると、目的の部位内またはその付近にあるどのアミノ酸残基を改変するかを決定するプロセスが、行われる。例えば、１つの好ましい改変は、目的の部位付近に位置する別のアミノ酸残基をシステイン残基に代える置換を生じる。
【００６５】
目的の部位内またはその付近にあるどの残基を改変するかの選択は、以下の選択基準に基づいて決定される。まず、そのＴＢＭの３次元の説明が、周知のいくつかの供給源のうちの１つから得られる。例えば、多くのＴＢＭの３次構造が、Ｘ線結晶学実験を介して決定されている。これらのＸ線構造は、広範な供給源（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇにてインターネット上で見出され得る、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ（ＰＤＢ））から入手可能である。３次構造はまた、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｃｏｍでＰｉｔｔｓｂｕｒｇ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｃｅｎｔｅｒに位置する、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＰＳｄｂ）にて見出され得る。
【００６６】
さらに、多くのタンパク質およびタンパク質複合体の３次構造が、コンピューターベースのモデリングアプローチを介して決定されている。従って、タンパク質３次元立体構造のモデルが、現在、広範に入手可能である。
【００６７】
一旦そのＴＢＭの３次元構造が既知になると、野生型または改変形態のその標的生物学的分子の構造モデルに基づく測定が、目的の部位内のアミノ酸の任意の原子からそのタンパク質表面に全体にわたり距離約１０Åについてなされる。所望の反応性基（例えば、チオール基またはチオール含有残基）を含むように改変された改変体は、目的の部位から半径約１０Å内にある、その標的生物学的分子の表面上の１つ以上の野生型アミノ酸の同定に基づく。この測定のために、目的の部位内にあるアミノ酸の任意の原子から半径約１０Å内にある少なくとも１つの原子を有する任意のアミノ酸は、チオール含有残基へと改変されることが可能な残基である。
【００６８】
改変に好ましい残基は、溶媒接近可能な残基である。溶媒接近性は、標準的数値法（Ｌｅｅ，Ｂ．およびＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ５５：３７９−４００（１９７１）；Ｓｈｒａｋｅ，Ａ．およびＲｕｐｌｅｙ，Ｊ．Ａ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７９：３５１−３７１（１９７３））または標準的分析法（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｍ．Ｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７０９−７１３（１９８３）；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｔ．Ｊ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：６３−８９（１９８４））を使用する構造モデルより算出され得る。例えば、潜在的システイン改変体は、ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓの方法（Ｌｅｅ，Ｂ．およびＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ５５：３７９−４００（１９７１））によって計算される場合に炭素−β（ＣＢ）または硫黄−γ（ＳＧ）の結合した表面面積が２１Å^２より大きい場合、溶媒接近可能であるとみなされる。この値は、Ｃｒｅａｍｅｒら（Ｃｒｅａｍｅｒ，Ｔ．Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１６２４５−１６２５０（１９９５））によって記載されるようなシステイン側鎖に接近可能な理論的表面面積の約３３％に相当する。
【００６９】
システイン、または別のチオール含有アミノ酸残基へと変異されるが骨格原子との水素結合に関係しない残基、あるいは、せいぜい１つの水素結合のみを介して骨格と相互作用する残基もまた、好ましい。その側鎖が、他の側鎖との複数（＞１）の水素結合に関係する野生型残基はまた、より好ましくない。標準的回転異性体（−６０°、６０°または１８０°のｃｈｉ１角）の全てが任意の他の残基のＮ原子、ＣＡ原子、Ｃ原子、Ｏ原子またはＣＢ原子との好ましくない立体的接触を導入し得る改変体もまた、より好ましくない。好ましくない接触は、関係する原子のファンデルワールス半径の合計の８０％未満の原子間距離として規定される。
【００７０】
タンパク質の高度に可撓性の領域内にある野生型残基もまた、より好ましくない。Ｘ線データから得た構造において、高度に可撓性の領域は、骨格原子が弱い電子密度因子または高温因子（この構造についての平均温度因子よりも４より大きい標準偏差）を有するセグメントとして規定され得る。ＮＭＲデータから得た構造において、高度に可撓性の領域は、１残基当たり５未満の実験的拘束（距離、二面性結合およびＨ結合データ由来）を有するセグメントとしてか、またはこの集団におけるモデルの中で高度な可変性（＞２．０Ａ^２ＲＭＳ偏差）を示す領域として、規定され得る。さらに凹表面に隣接する凸面「ヒンジ」領域上に見出される残基はより好ましいが、凹面領域内の残基は、改変されるべきシステイン残基として好ましくない。凸面および凹面は、表面ベクター（Ｄｕｎｃａｎ，Ｂ．Ｓ．およびＯｌｓｏｎ，Ａ． Ｊ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３３：２１９−２２９（１９９３））に基づいてか、または分子表面に沿って位置する水プローブの接近性（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１：２８１−２９６（１９９１）；Ｂｒａｄｙ，Ｇ．Ｐ．，Ｊｒ．およびＳｔｏｕｔｅｎ，Ｐ．Ｆ． Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１４：３８３−４０１（２０００））を測定することによって、計算され得る。Ｌ−アミノ酸に対してわずかに妨害される骨格コンフォーメーションを有する残基（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｇ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：９５−９９（１９６３）；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｇ．Ｎ．およびＳａｓｉｓｅｋｈａｒａｈｎ，Ｖ．Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２３：２８３−４３７（１９６８））は、システインに対する改変に好ましい標的ではない。妨害コンフォーメーションは、一般にｐｈｉ角の陽性値を特色とする。
【００７１】
他の好ましい改変体は、システインへと変異されそしてジスルフィド結合を介してアルキルテザーに結合される場合、このテザーの原子を目的の部位に指向させるコンフォーメーションを有する、改変体である。一般的な２つの手順を使用して、これらの好ましい改変体を同定し得る。第１の手順では、検索は、ジスルフィド結合したシステインを位置ｊに含む構造フラグメントを同定するためのＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ（Ｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２３５−２４２（２０００））中の独特な構造（Ｈｏｂｏｈｍ，Ｕ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １：４０９−４１７（１９９２））から構成される。ここで、フラグメントの残基ｊ−１、ｊおよびｊ＋１の骨格原子は、０．７５Ａ^２未満のＲＭＳＤを有する標的分子の残基ｊ−１、ｊおよびｊ＋１の骨格原子上に重ねあわされ得る。残基ｉのＣＢ原子よりも目的の部位の任意の原子に近接する位置ｊのシステイン（システインに変異された場合）にジスルフィド結合した残基のＣＢ原子を配置するフラグメントが同定された場合、位置ｉは、好ましいとみなされる。代替の手順では、位置ｉの残基は、コンピュータ上でシステインに「変異され」、そしてジスルフィド結合を介してＳ−メチル基でキャップされる。
【００７２】
本発明の標的上の目的の部位を同定するためのさらなる詳細は、同時係属出願番号６０／３１０，７２５号（２００１年８月７日出願）（この開示全体が本明細書中に明示的に参考として援用される）に提供される。
【００７３】
（４．低分子エキステンダー（ＳＭＥ））
（Ａ）静的ＳＭＥ
本発明の１つの実施形態において、ＳＭＥは、ＴＢＭ上の求核剤または求電子体（好ましくは、求核剤）を介して「静的」共有結合または不可逆的共有結合を形成し、これにより、不可逆的ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体を形成する。この方法は、図２に例示される。必要に応じて、ＳＭＥはまた、ＴＢＭ上の目的の第１の部位と非共有結合を形成する。さらに、ＳＭＥは、有機低分子のライブラリーのライブラリーメンバーと可逆的結合を形成し得る第２の官能基を含み、このライブラリーの各分子は、ＳＭＥの第２の官能基と可逆的結合を形成し得る官能基を有する。ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体およびライブラリーは、ＴＢＭ上の目的の第２の部位に対して親和性（好ましくは、最高の親和性）を有するライブラリーメンバーが、ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体と可逆的結合を形成する条件に供される。
【００７４】
好ましいＴＢＭは、タンパク質であり、そして不可逆的ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体を形成するに適切なＴＢＭ上の好ましい求核剤としては、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨ_２および−ＣＯＯＨ（それぞれｃｙｓ、ｓｅｒもしくはｔｈｒ、ｌｙｓおよびａｓｐもしくはｇｌｕの側鎖から通常生じる）が挙げられる。ＴＢＭは、これらの求核剤を含むように改変され得る（例えば、変異体または誘導体）か、または天然にこれらを含み得る。例えば、システインプロテアーゼ（例えば、カスパーゼ（特に、カスパーゼ１、３、８および９）；カテプシン（特に、ＳカテプシンおよびＫカテプシン）など）およびホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ ＰＴＰ１Ｂ、ＬＡＲ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２ ＰＴＰおよびＣＤ４５）は、天然に存在するシステインチオール求核剤を含む適切なタンパク質の例示である。静的ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体を生成するようにこのようなＴＢＭをＳＭＥにより誘導体化することおよびライブラリーメンバーとのその反応を、以下に例示する。
【００７５】
【化１】

ここで、ＴＢＭ上の求核剤は、チオール（通常は、システイン）の硫黄であり、これは、（標的を変性しない条件下で）不可逆的共有結合置換基を形成し得るＧ、および遊離チオール、保護チオールまたは誘導体化チオールＳＲ’を含む、ＳＭＥである２と反応させられる。好ましいＧは、チオールによるＳＮ２様アタックを受けるかまたはチオールを有するＭｉｃｈａｅｌ型付加物を形成して、新たな共有結合−ＳＧ’−を有するこのアタックの不可逆的反応生成物３を生成させ得る基である。以下は、ＳＮ２様付加またはＭｉｃｈａｅｌ型付加を受け得るＧ基の代表的な例である。
【００７６】
１）−ハロ酸：ＳＭＥの一部である酸ＣＯＯＨ、ＰＯ_３Ｈ_２またはＰ（ＯＲ）Ｏ_２Ｈに置換されたＦ、ＣｌおよびＢｒは、ＴＢＭのチオールとチオエーテルを形成し得る。このようなＧ−ＳＭＥ−ＳＲ’の単純な例は；
【００７７】
【化２】

であり、ここで、Ｘは、ハロゲンであり、そしてＲ’は、Ｈ、ＳＣＨ_３、Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＡであり、ここで、Ａは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ_３Ｈ、ＣＯＮＨ_２またはＮＨ_２であり、そしてｎは、２または３である。
【００７８】
２）フルオロホスフェート（フルオロホスホネート）：これらは、ＳＨ求核剤およびＯＨ求核剤の両方と容易に反応するＳａｒｉｎ様化合物であり得る。例えば、ＰＴＰ１Ｂのｃｙｓ２１５は、以下：
【００７９】
【化３】

によって示される単純なＧ−ＳＭＥ−ＳＲ’と反応させられ得、ここで、フェニル環は、単純化したＳＭＥを示し、Ｒは、置換または非置換の低級アルキルであり、そしてＲ’は、上記で規定されるようなものである。これらの化合物は、チオール求核剤を有するチオホスフェート（チオホスホネート）ＳＭＥを形成する。これらの化合物はまた、セリンもしくはトレオニンのホスファターゼまたはセリンもしくはトレオニンのラクタマーゼ由来の天然に存在する−ＯＨと静的ＴＢＭ−ＳＭＥを形成し得る。
【００８０】
３）エポキシド、アジリジンおよびチイラン（ｔｈｉｉｒａｎｅ）：これらの反応性官能基を含有するＳＭＥは、求核剤−ＳＨ、−ＯＨおよび−ＣＯＯＨとのＳＮ２環開裂反応を受け得る。後者の好ましい例は、アスパルチルプロテアーゼ様 −セクレターゼ（ＢＡＳＥ）である。エポキシド、アジリジンおよびチイランの好ましい一般例を、以下に示す：
【００８１】
【化４】

ここで、Ｒ’は、上記に規定されるものであり、Ｒは、通常Ｈまたは低級アルキルであり、そしてＲ’’は、低級アルキル、低級アルコキシ、ＯＨ、ＮＨ_２またはＳＲ’である。チイランの場合、基ＳＲ’は、必要に応じて存在する。なぜなら、求核剤アタックおよび環開裂に際して、後の拡張されたテザリング反応において使用され得る遊離チオールが、生成されるからである。
【００８２】
４）ハロ−メチルケトン／アミド：これらの化合物は、−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ_２−Ｘを有する。ここで、Ｘは、形態のハロゲン、Ｎ_２、Ｏ−Ｒ（ここで、Ｒは、置換または非置換のヘテロアリール、アリール、アルキル、−（Ｐ＝Ｏ）Ａｒ_２、−Ｎ＝Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）アリール／アルキル、−（Ｃ＝Ｏ）アリール／アルキル／アルキルアリールなどである）、Ｓ−アリール、Ｓ−ヘテロアリールおよびビニルスルホンのような、多くの良好な脱離基であり得る。
【００８３】
【化５】

フルオロメチルケトンは、チオール含有タンパク質と反応した場合にチオエーテルの形成を生じる、このクラスの活性化ケトンの単純な例である。他の周知の例としては、ベンゾイルオキシメチルケトンのようなアシルオキシメチルケトン、フェニルメチルアミノメチルケトンおよびスルホニルアミノメチルケトンのようなアミノメチルケトンが挙げられる。これらおよび他の型の適切な化合物は、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３（１８）ｐ３３５１−７１（２０００年９月７日）に総説される。
【００８４】
５）求電子体芳香族系：これらの例としては、７−ハロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾルおよびオルソ／パラニトロ置換ハロベンゼンが挙げられる。
【００８５】
【化６】

この型の化合物は、チオール含有ＴＢＭを有するアリールアルキルチオエーテルを形成する。
【００８６】
６）ＴＢＭ求核剤との静的共有結合の形成に適切な、他の適切なＳＮ２様反応は、アルデヒドと、ＤＮＡ修復タンパク質様の酵素のリジンのアミン基との間のＳｃｈｉｆｆ塩基の形成、その後の例えば、ＮａＣＮＢＨ_４との還元を含む。
【００８７】
【化７】

７）Ｍｉｃｈａｅｌ型付加：形態−ＲＣ＝ＣＲ−Ｑまたは−Ｃ≡Ｃ−Ｑの化合物（ここで、Ｑは、Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ（キニンを含む）、ＣＯＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、ＣＮ，ＮＯ_２、ＳＯＲ、ＳＯ_２Ｒ（ここで、各Ｒは独立して、置換または非置換の、アルキル、アリール、水素、ハロゲンである）であるか、あるいは別のＱは、ＴＢＭ上のＳＲ（ここで、ＲはＨ、グルタチオンまたはＮＨ_２またはＯＨで置換されたＳ−低級アルキルである）、ＯＨおよびＮＨ_２とＭｉｃｈａｅｌ付加物を形成し得る。
【００８８】
８）ボロン酸（ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）：これらの化合物を使用して、ｓｅｒまたはｔｈｒのヒドロキシルを標識して、以下：
【００８９】
【化８】

に示される形態のＴＢＭ−ＳＭＥ複合体を形成し得、ここで、Ｒ’は、上記で規定されるものである。
【００９０】
前述の場合の各々において、「静的」または不可逆的な共有結合は、ＴＢＭ上の求核剤を介して形成され。チオールまたは保護チオールを含有する不可逆的ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体を生成する。次いで、これらの複合体は、ＴＢＭ上の第２の結合部位を結合し得る低分子リガンドの選択のための還元剤（例えば、メルカプトエタノール）の存在下で、チオールまたはジスルフィドを含有する有機化合物のライブラリーに曝露される。
【００９１】
上記したように、この静的アプローチにおいて、ＳＭＥは、ＴＢＭ上の第１の部位に対する結合親和性を有する（すなわち、結合し得る）部分を含み得るが、含む必要はない。ＳＭＥがこのような部分を含まない場合でさえ、リガンド候補は標的の目的の第２の部位に対する自由接近を有することを保障するために、適切な長さおよび可撓性であらねばならない。
【００９２】
（Ｂ）動的ＳＭＥ
本発明の別の実施形態において、ＳＭＥは、二重の可逆的共有結合ＳＭＥ（「二重ジスルフィド」エキステンダー）であり、すなわち、このＳＭＥは、二官能性であり、そして可逆的供給結合を形成し得る２つの官能基（通常は、ジスルフィド）を含む。このＳＭＥは、ＳＭＥ上の第１の官能基を介してＴＢＭ上の求核剤と「動的」共有結合または第１の可逆的共有結合を形成する。これにより、可逆的ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体（以下の７）を形成する。必要に応じて、ＳＭＥはまた、ＴＢＭ上の目的の第１の部位と非共有結合を形成する（ＴＢＭと非共有結合を形成するＳＭＥ上の部分は、本明細書中でＳＭＥといわれる）。さらに、ＳＭＥは、有機低分子の第２のライブラリーのライブラリーメンバーと第２の可逆的結合を形成し得る第２の官能基を含むか、または含むように改変され、各分子は、ＳＭＥの第１の官能基または第２の官能基と可逆的結合を形成し得る官能基を有する。ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体および第２のライブラリーは、ＴＢＭ上の目的の第２の部位に対して最高の親和性を有するライブラリーメンバーがＴＢＭ−ＳＭＥ複合体（以下の８）と可逆的結合を形成する条件に、供される。好ましくは、共有結合は、ジスルフィドであり、これは、還元剤の存在下で可逆的であり得る。
【００９３】
【化９】

拡張された動的テザリングプロセスは、図３に例示され、ここで、チオールまたは保護チオールを含むかまたは含むように改変されたＴＭＢは、ある条件下で（例えば、還元剤とともに）、チオールまたは保護チオール（ジスルフィド含有モノフォア）を含む有機低分子の第１のライブラリーとインキュベートされる。この条件において、ライブラリーの少なくとも１つのメンバーは、ＴＢＭと選択されたライブラリーメンバーとを連結するジスルフィド結合を形成する。必要に応じて、このプロセスは、チオールまたは保護チオールの位置によって互いに異なるＴＢＭのライブラリー（すなわち、同一のタンパク質の異なるシステイン変異体）を用いて反復される。好ましくは、低分子ライブラリーの各メンバーは、分子量において他のライブラリーメンバーの各々と異なる。好ましくは、低分子ライブラリーは、１〜１００メンバーを含み、より好ましくは、５〜１５メンバー、そして最も好ましくは、約１０メンバーを含む。必要に応じて、選択された低分子ライブラリーメンバー（選択されたモノフォア）はまた、ＴＢＭ上の目的の第１の部位と非共有結合を形成する。次いで、選択されたモノフォアまたはその誘導体は、第２のチオールまたは保護チオールを含むように改変され、これにより、「二重ジスルフィド」エキステンダーを形成する。次いで、この合成二重ジスルフィドエキステンダーは、ある条件下で（例えば、メルカプトエタノールのような還元剤と）チオールまたは保護チオールを含む有機低分子分子の第２のライブラリー（このライブラリーは、第１のライブラリーと同じであっても異なってもよい）の存在下で、ＴＢＭとインキュベートされる。この条件において、この第２のライブラリーの少なくとも１つのメンバーは、上記８に示されるような二重ジスルフィドエキステンダーを介して選択されたライブラリーメンバーをＴＢＭと連結させる、ジスルフィド結合を形成する。必要に応じて、この後、ジアフォア（ｄｉａｐｈｏｒｅ）が、この選択された２つのライブラリーメンバー（モノフォア）に基づいて、合成される。
【００９４】
２つの基本ストラテジーが、「二重ジスルフィド」エキステンダーを合成するために存在する。第１のストラテジーにおいて、動的エキステンダーの合成が、一般的に行われ、これは、ＴＢＭと非共有結合を形成するモノフォアの部分のいかなる改変も伴わない、モノフォアリンカーの改変による。例示の目的で、エキステンダーは、通常、図３に示されるようなジスルフィドモノフォアライブラリーのスクリーニングから生じる。ライブラリーまたはプールから選択される代表的なモノフォアは、そのモノフォアをＴＢＭシステインに連結させるジスルフィドと、ＴＢＭ上の目的の第１の部位に非共有結合的に結合するそのモノフォアの部分との間に、２個または３個のメチレン単位のリンカーを含む。このモノフォアリンカーを以下に示されるように誘導体化して、二重ジスルフィドエキステンダーを生成し得、ここで、モノフォアの「Ｒ」または可変基は、不変であり続け、そしてＴＢＭ上の目的の第１の部位と非共有結合的に結合するエキステンダー（ＳＭＥ）の部分になる。
【００９５】
【化１０】

ここで、モノフォアは、システアミン窒素に最も近接するメチレンで誘導体化されて動的二重ジスルフィドエキステンダー１を生成するか、またはシステアミン窒素自体で誘導体化されて対称的な動的二重ジスルフィドエキステンダー２を生成するかのいずれかである。
【００９６】
あるいは、モノフォアが３−メルカプトプロピオン酸誘導体である場合、α炭素が、以下の３に示されるような形態の一般的動的二重ジスルフィドエキステンダーを生成するように誘導体化され得る。
【００９７】
【化１１】

必要に応じて、アミド窒素は、上記４に示されるような形態のエキステンダーを精製するように、アシルまたはスルフォニルで誘導体化され得る。
【００９８】
第二のストラテジーは、ＴＢＭ上の目的の第一部位に非共有結合的に結合するモノフォア部分を誘導体化することを含む。この誘導体化は好ましくは、以下に例示するように、目的の第一部位へのモノフォアの結合を最小に変更する部位において実施される。
【００９９】
【化１２】

ここで、動的テザーは、ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体を形成するＴＢＭチオールに結合して示されており、ここで、Ｒ’はシステアミン基である。次いで、この複合体をジスルフィドモノフォアまたはジスルフィドモノフォアのライブラリーと接触させて、ＳＭＥまたは選択されたモノフォア単独のいずれよりも高いＴＢＭ親和性を有する、連結した化合物が入手され得る。
【０１００】
ＴＢＭに結合するジスルフィドモノフォアを形成するように設計されたＳＭＥの第二の例を以下に示す。この動的ＳＭＥを、１以上のジスルフィドモノフォアの存在下でＴＢＭと接触させて、ＴＢＭ−ＳＭＥ−モノフォアの共有結合複合体を形成し得、ここで、このＳＭＥは、目的の第一部位に対する親和性を有し、そしてこのモノフォアは、ＴＢＭ上の目的の第二部位に対する親和性を有する。
【０１０１】
【化１３】

ＴＢＭ−ＳＭＥ−モノフォア複合体の構造の検出および同定は、質量分析法または機能的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、酵素アッセイなど）における阻害によって実施され得る。
【０１０２】
ＳＭＥはしばしば、特定のＴＢＭまたはＴＢＭのファミリーに応じて作製される。例えば、キナゾリン誘導体は、ＥＧＦレセプターまたは「ＲＤ」キナーゼと静的エキステンダーまたは動的エキステンダーを形成し得る。ＥＧＦレセプターの場合、ｃｙｓ ７７３は、以下に示すような静的キナゾリンエキステンダーまたは動的キナゾリンエキステンダーのいずれかについての適切な求核剤である；
【０１０３】
【化１４】

ここで、Ｒ^１は、Ｍｉｃｈａｅｌ受容体またはジスルフィドを介してｃｙｓ ７７３へと連結され、Ｒ^１は、
【０１０４】
【化１５】

から選択され；
Ｒ^２は、−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＲ’および−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＲ’であり；
Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＲ’および−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＲ’であり；
Ｒ^６は、−（ＣＨ_２）_ｎ−ＳＲ’であり；ここで、ｎは、１、２または３であり、そして
Ｒ’は、Ｈ、ジスルフィドまたはチオール保護基である。
【０１０５】
ホスホチロシン（Ｐ−ｔｙｒ）、ホスホセリン（Ｐ−ｓｅｒ）およびホスホトレオニン（Ｐ−ｔｈｒ）の模倣物または代理物は、本発明においてエキステンダーとして用いられて、近傍のサブ部位と相互作用して標的ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ）に対する特異性または親和性を改善するフラグメントが同定され得る。従って、エキステンダーを用いた標準的共有結合テザリングによって近傍のフラグメントを見出すための、既知の基材またはインヒビターを「アンカー」として用いる、拡張されたテザリングは、本発明の１つの好ましい実施形態である。
【０１０６】
ホスホチロシン（Ｐ−ｔｙｒ）模倣物は、ＰＴＰ−１Ｂ、ＬＡＲなどのようなホスファターゼに応じて作製され得るＳＭＥの例である。以下に示す、メルカプト−プロパン酸および／もしくはシステアミン（ｃｙｓｔａｅａｍｉｎｅ）またはそれらの保護形態を用いて誘導体化された既知のＰＴＰ−１Ｂ Ｐ−ｔｙｒ模倣物は、ＰＴＰ−１Ｂ ｃｙｓ変異体の活性部位に結合する。
【０１０７】
【化１６】

このような化合物を動的エキステンダーとして用いて、上記のような共有結合テザリングによって第二フラグメントを選択し得る。上記の化合物は、標的に結合し、そして−メルカプトエタノールに対してテザーされた場合（）、約２．５ｍＭのＢＭＥ_５０（平衡時の、５０％の結合化合物を標的から交換し得る −メルカプトエタノールの濃度）を示す。動的エキステンダーを用いる場合、動的エキステンダーについてのＢＭＥ_５０を測定し、そして動的エキステンダーのＢＭＥ_５０以下の総チオール濃度（ＢＭＥ＋ライブラリーチオール）で、共有結合テザリングによって第二フラグメントについてスクリーニングすることが好ましい。例えば、２．５ｍＭのＢＭＥ_５０を有する上記の動的エキステンダーに関して、第二フラグメントスクリーニング工程における総チオール濃度は、２．５ｍＭ以下、そしてより好ましくは約２倍低い（例えば、約１ｍＭ以下）であるべきである。あるいは、動的エキステンダーは、静的エキステンダーへと変換され得、これによって、第二フラグメントスクリーニングにおける総チオール濃度の問題が取り除かれる。動的エキステンダーを静的エキステンダーへと変換する場合、標的への静的エキステンダーの非共有結合が破壊されないように、同じ原子数を維持することが重要である。同様の理由から、嵩高い他の原子または基の導入を最小にすることが重要である。これらの要因を心に留めて、上記の動的エキステンダーは、以下に規定される静的エキステンダーへと変換され得る。
【０１０８】
【化１７】

ここで、Ｒ^１は、
【０１０９】
【化１８】

から選択され、そしてここでＲ^２は、
【０１１０】
【化１９】

から選択される。
【０１１１】
本発明のなお別の実施形態では、エキステンダーは、ＴＢＭに可逆的または非可逆的のいずれかで結合したペプチドであり得る。この実施形態では、ペプチドは、約２〜１５残基長、好ましくは５〜１０残基であり、そして天然および／または人工のαアミノ酸から構成され得る。このようなペプチドエキステンダーの一例は、深い疎水性裂溝中のＭＤＭ２のＮ末端ドメインにｎＭの親和性で結合し得るαヘリックスｐ５３フラグメントペプチド（またはより小さな既知の非天然ペプチド）である。ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−ｘＬもまた、ＭＤＭ２と類似した深いペプチド結合溝を含むことが公知である。これらの標的に結合するペプチドはまた、本発明に従って有用なペプチドエキステンダーであり得る。例えば、ｐ５３のフラグメントペプチドは、ＴＢＭ上の既存のチオールまたは導入されたチオールと、このペプチド上の既存の（例えば、ｃｙｓ）チオールまたは導入されたチオール（導入されたｃｙｓ、カルボキシル末端で誘導体化されたシステアミンまたはアミノ末端を通したメルカプト−プロパン酸）を通して、可逆的な（例えば、ジスルフィド）結合を形成し得る。この場合、その後の共有結合テザースクリーニングから、チオールまたはジスルフィドフラグメントを選択するために用いられ得るＴＢＭ−ペプチドエキステンダー複合体が形成される。この動的ペプチドエキステンダーは、１つの他の遊離のチオールまたは保護されたチオール（例えば、ＴＢＭ−ペプチドエキステンダー複合体を形成するために用いられていない、上記のうちの１つ）を有し、これらは、ＴＢＭに対する親和性を有するフラグメントとの共有結合ジスルフィド結合を形成するに適切な条件下で、チオールまたは保護されたチオールフラグメントのライブラリーと接触させられる。必要に応じて、ペプチドエキステンダーは、上記のようにＴＢＭ上の求核剤または求電子体との不可逆的共有結合が形成される、静的ペプチドエキステンダーであり得る。必要に応じて、この実施形態では、光親和性標識を用いて、ペプチドエキステンダーをＴＢＭへと結合させ得る。上記のように、遊離のチオールまたは保護されたチオール（既存であるかまたは導入された）を用いて、その後のスクリーニングにおいてジスルフィドを形成して、ＴＢＭに対する親和性を有する低分子フラグメントを見出す。
【０１１２】
このようなペプチドエキステンダーはまた、「Ｚ−ＷＱＰＹ」ペプチドのような合成ペプチドであり得、ここで、ＴＢＭはＩＬ−１レセプターである。ここで、ペプチドＦＥＷＴＰＧＹＷＱＰＹＡＬＰＬまたはそのフラグメント、変異体もしくはアナログは、上記のように静的エキステンダーまたは動的エキステンダーとして用いられて、共有結合テザリングを介してフラグメントが見出され得、ここで、ジスルフィドテザーは、エキステンダーに対してまたはエキステンダーとであり、そして非共有結合は、選択されたフラグメントとＴＢＭとの間に存在する。
【０１１３】
ＳＭＥ上の反応性基と標的もしくはリガンドとの間でそれぞれ、または２つのリガンドの間で、可逆的または非可逆的な共有結合を形成するために利用可能な他の化学は当該分野で周知であり、そして基本書（例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第４版，１９９２）に記載されている。アルデヒドとケトンとアミンとの間での還元的アミノ化は、例えば、Ｍａｒｃｈら，前出，８９８−９００頁に；アミンを調製するための代替方法は１２７６頁に；ヒドラゾンおよびヒドラゾン誘導体（例えば、セミカルバゾン）を得るためのアルデヒドとケトンとヒドラジド誘導体との間の反応は９０４−９０６頁に；アミド結合形成は１２７５頁に；尿素の形成は１２９９頁に；チオカルバメートの形成は８９２頁に；カルバメートの形成は１２８０頁に；スルホンアミドの形成は１２９６頁に；チオエーテルの形成は１２９７頁に；ジスルフィドの形成は１２８４頁に；エーテルの形成は１２８５頁に；エステルの形成は１２８１頁に；エポキシドへの付加は３６８頁に；アジリジンへの付加は３６８頁に；アセタールおよびケタールの形成は１２６９頁に；カルボネートの形成は３９２頁に；デアミンの形成は１２６４頁に；アルケンの転移は１１４６−１１４８頁に（Ｇｒｕｂｂｓら，Ａｃｃ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２８：４４６−４５３［１９９５］もまた参照のこと）；ハロゲン化アリールおよびアリールスルホネートと、アルカンおよびアセチレンとの遷移金属触媒カップリング（例えば、Ｈｅｃｋ反応）は７１７−１７８頁に；ハロゲン化アリールおよびアリールスルホネートと、有機金属試薬（例えば、有機ホウ素試薬）との反応は６６２頁に（Ｍｉｙａｕｒａら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５：２４５７［１９９５］もまた参照のこと）；有機錫試薬および有機亜鉛試薬、オキサゾリジンの形成（Ｅｄｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．２８：７１１９−７１２２［１９９７］）；チアゾリジンの形成（Ｐａｔｅｋら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．３６：２２２７−２２３０［１９９５］）；イミドエステルを介してアミンをカップリングすることによって、アミジン基を介して連結されたアミン（Ｄａｖｉｅｓら，Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｃ５０：４１６−４２２［１９７２］）などに記載されている。特に、ジスルフィド含有低分子ライブラリーは、Ｐａｒｌｏｗら，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ １：２６６−２６９（１９９５）の方法を適用することによって、市販のカルボン酸および保護されたシステアミン（例えば、ｍｏｎｏ−ＢＯＣ−ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）から作製され得、そして反応性システインを含むかまたは含むように改変されている、ポリペプチドへの結合についてスクリーニングされ得る。この節において引用された全ての文献は、本明細書中に明らかに参考として援用される。
【０１１４】
ＳＭＥの結合が標的を変性させないことが通常好ましいが、ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体はまた、変性条件下で形成され得、続いて当該分野で公知の方法によってこの複合体は再折畳みされ得る。さらに、リガンドが標的上の目的の部位を有用な部位特異性で認識して結合するように、ＳＭＥおよび共有結合は標的の三次元構造を実質的に変更するべきではない。最終的に、ＳＭＥは、反応条件下およびアッセイ条件下で、標的上の他の部位と実質的に非反応性であるべきである。
【０１１５】
（５．標的に結合したリガンドの検出および同定）
標的に結合したリガンドは、質量分析法（ＭＳ）によって容易に検出および同定され得る。ＭＳは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて分子を検出し、従って、それらのサイズに基づいて分子を分離し得る（Ｙａｔｅｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：５−８［２０００］に概説される）。質量分析計（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）は最初に、分子を気相イオンに変換し、次いで個々のイオンがｍ／ｚ比に基づいて分離され、そして最終的に検出される。質量分析器（ｍａｓｓ ａｎａｌｙｚｅｒ）は、質量分析計の不可欠の部分であり、物理的特性（例えば、電場もしくは磁場、または飛行時間型［ＴＯＦ］）を使用して、特定のｍ／ｚ値のイオンを分離し、次いでこのイオン検出器に衝突する。質量分析計は、データを迅速に作製し得、従って高処理能力の分析についての大きな可能性を有する。ＭＳは、薬物の発見に用いられ得る、非常に汎用性の高いツールを提供する。質量分析法は、単独で、または標的に結合した有機化合物リガンドの検出もしくは同定のための他の手段との組み合わせのいずれかで用いられ得る。質量分析法を用いる技術は、当該分野で周知であり、そして種々の適用のために用いられている（例えば、ＦｉｔｚｇｅｒａｌｄおよびＳｉｕｚｄａｋ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：７０７−７１５［１９９６］；Ｃｈｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：７８２７−７８３５［１９９６］；Ｓｉｕｄｚａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１２９０−１１２９７［１９９４］；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：５９９Ｒ−６５１Ｒ［１９９６］；Ｗｕら，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：６５３−６５７［１９９７］；ならびにＬｏｏら，Ａｍ．Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３１：３１９−３２５［１９９６］を参照のこと）。
【０１１６】
しかし、本発明の範囲は、ＭＳの使用に限定されない。実際、生物学的標的分子とライブラリーメンバーとの間で形成された付加物の検出のための任意の他の適切な技術が用いられ得る。例えば、種々のクロマトグラフィー技術（例えば、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなど）を、反応混合物から成分を分離して、共有結合した有機分子を同定する能力を増強するために用い得る。このようなクロマトグラフィー技術は、質量分析法と組み合わせてまたは質量分析法とは別々に用いられ得る。必要に応じて、（蛍光、放射性などで）標識したプローブを遊離の有機化合物にカップリングして、上記の技術のいずれかを用いるその同定を容易にし得る。なお別の実施形態では、新たな結合の形成は、標識したプローブを遊離させ、次いで、このプローブがモニタリングされ得る。簡便な機能的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたは酵素アッセイ）をまた用いて、標的へのエキステンダーまたは第二フラグメントの結合が、アッセイによって測定されるに必須の領域（例えば、タンパク質：タンパク質ＥＬＩＳＡにおける「ホットスポット」への結合または酵素アッセイについての基質結合ポケットにおける結合）において生じた場合、結合を検出し得る。標的分子に結合した有機化合物を同定するために用途を見出し得る他の技術としては、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、キャピラリー電気泳動、Ｘ線結晶学などが挙げられる。これらの全ては、当業者に周知である。
【０１１７】
（６．結合体分子（例えば、ダイアフォア（ｄｉａｐｈｏｒｅ）の調製）
２以上の有機分子リガンドを連結して結合体分子を生成するための用途が見出されるリンカーエレメントは、少なくとも２つの有機分子を、これらの分子によって保有される反応性官能基を介して一緒に共有結合するように機能し得る、多官能性（好ましくは二官能性）架橋分子である。リンカーエレメントは、少なくとも２つの有機分子を結合するために利用可能である少なくとも２つ（好ましくは２つのみ）の反応性官能基を有し、ここで、これらの官能基は、このリンカー上のどこにでも（好ましくはリンカーの各末端に）出現し得、そしてこれらの官能基は、連結されるべき有機分子が同じ反応性官能基を有するかまたは異なる反応性官能基を有するかに依存して、同じであっても異なっていてもよい。本明細書中で用途が見出されるリンカーエレメントは、直鎖、分岐鎖、芳香族など（好ましくは直鎖）であり得、そして一般に少なくとも約２原子長であり、より一般的には約４原子長よりも長く、そしてしばしば、約１２原子長以上もの長さである。リンカーエレメントは一般的に、水素飽和または水素不飽和のいずれかの炭素原子を含み、それゆえアルカン、アルケンもしくはアルキンおよび／または他のヘテロ原子（窒素、硫黄、酸素などを含む）を含み得、これらは（好ましくはアルキル基、アルコキシル基、ヒドロキシアルキル基またはヒドロキシアルキル基で）置換されていなくても置換されていてもよい。用途が見出されるリンカーエレメントは、種々の長さであり得、それによって、それらから調製される結合体リガンド化合物の結合特性を最適化するための手段を提供する。標的生体分子に共有結合する第一の有機化合物は、それ自体、第二の有機化合物に対する結合部位を提供する化学反応性基を保有し得る。あるいは、第一の有機分子は、（化学的に、それに対する化学的反応基を含む化合物を結合することによって、または他の方法でのいずれかで）改変された後、有機化合物の第二のライブラリーに対してスクリーニングされ得る。
【０１１８】
（７．本発明の化合物）
本発明の化合物は、少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）のリガンド（このうちの少なくとも１つは、本明細書中に開示される拡張テザリングアプローチによって同定されている）およびこのような化合物のアナログを包含することによって特徴付けられる。従って、本発明の化合物は、有機低分子、ペプチド、（ポリ）ヌクレオチド、（オリゴ）糖などを含むがこれらに限定されない、多数の化学的クラスを包含する。本発明の方法によって同定されるリガンドは代表的に、以下の周知の技術によって設計されるさらなる改変体および誘導体の開発のためのリード化合物として役立つ。特に、同定されるリガンド（モノフォア、ダイアフォア、およびより複雑な構造体を含む）は、医薬品化学および親和性成熟に従い、そして構造補助設計を用いて容易に最適化され得る。本発明の拡張テザリングアプローチは、標的（例えば、ＴＢＭ）上の異なる部位に結合することがすでに示されたリガンドに焦点を当てたさらなる化学的改変を可能にするという点で、他の公知の技術（コンビナトリアル化学を含む）よりも優れている。
【０１１９】
（８．同定された化合物の用途）
本発明の方法は、薬物リードを作製するための強力な技術であり、互いに近い部位で標的に弱くまたは中程度の結合性で結合する２以上のフラグメントの同定を可能にし、そしてより高い親和性の化合物を生成する、互いに共有結合的に連結された、同定されたフラグメント（モノフォア）を含むダイアフォアまたはより大きな分子の合成を可能にする。さらなるリガンド化合物を含む、ダイアフォアまたは同様のマルチマー化合物は、合理的薬物設計における貴重なツールであり、これらは、医薬品化学アプローチおよび構造補助設計を用いてさらに改変および最適化され得る。
【０１２０】
本発明に従って同定されたダイアフォア、ならびにそれらから設計された、改変された薬物リードおよび薬物を用いて、例えば、２つの分子の部位特異的相互作用を必要とするかまたはそれに依存する、種々のインビトロおよびインビボでの生物学的プロセスを調節し得る。ポリヌクレオチドに結合する分子を用いて、例えば、標的遺伝子の活性化に必要な因子の接近をブロックすることによって、遺伝子の活性化を阻害もしくは妨害し得るか、または二重鎖ＤＮＡを安定化することもしくは転写機構を妨害することによって転写を抑制し得る。
【０１２１】
（９．薬学的組成物）
本発明に従って同定されたリガンド、およびこのようなリガンドを含む化合物、ならびにこのような化合物の類似体は、標的の疾患または状態を予防および／または処置するために、薬学的組成物において使用され得る。標的の疾患または状態は、リガンドまたは化合物がそのリガンドの結合に基づいて設計される標的（例えば、ＴＢＭ）の生物学的／生理学的な機能に依存する。このような疾患および状態の例を、上記のＴＢＭの表において列挙する。
【０１２２】
薬学的組成物の適切な形態は、一部、その用途または進入経路（例えば、経口、経皮、吸入、または注射による）に依存する。このような形態は、標的細胞が多細胞宿主中に存在しようと培養物中に存在しようと、その薬剤または組成物を標的細胞に到達させるのを可能とすべきである。例えば、血流中に注入される薬理学的薬剤または組成物は、可溶性であるべきである。他の要因は、当該分野で公知であり、そして毒性およびその薬剤または組成物がその効果を発揮するのを妨げる形態のような考慮事項を含む。
【０１２３】
適切な場合には、活性成分もまた、薬学的に受容可能な塩（例えば、酸付加塩）および／または錯体として処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、それらが投与される濃度において非毒性である。薬学的に受容可能な塩としては、硫酸塩、塩酸塩、リン酸塩、スルホン酸塩、スルファミン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、およびキナ酸塩を含む塩のような、酸付加塩が挙げられる。
【０１２４】
薬学的に受容可能な塩は、塩酸、硫酸、リン酸、スルホン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、およびキナ酸のような酸から得られ得る。このような塩は、例えば、遊離の酸または塩基の形態の生成物と、適切な塩基または酸の１つ以上の等価物とを、塩が不溶性の溶媒中もしくは媒体中または水のような溶媒中において反応させ、次いで、この溶媒または媒体を、真空中または凍結乾燥によって除去することによってか、あるいは、既存の塩のイオンを、適切なイオン交換樹脂上の別のイオンと交換することによって、調製され得る。
【０１２５】
キャリアまたは賦形剤もまた、化合物の投与を容易にするために使用され得る。キャリアおよび賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類（例えば、ラクトース、グルコースもしくはスクロース、または様々な種類のデンプン）、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および生理的に適合性の溶媒が挙げられる。組成物または薬学的組成物は、異なる経路によって投与され得る。この経路としては、静脈内、動脈内、腹腔内、心膜内、歯冠内、皮下、筋内、経口、局所、または経粘膜が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウムまたは他の薬学的に受容可能な薬剤（例えば、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、ポリオール（例えば、マンニトールおよびソルビトール））、または他の無機溶質もしくは有機溶質を使用して、達成され得る。
【０１２７】
薬学的処方物を製造するための技術および成分は、一般的に、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ １９９０において見出され得る。ＷａｎｇおよびＨａｎｓｏｎ、「Ｐａｒｅｎｔａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ、第１０号、補遺４２−２Ｓ（１９８８）もまた参照のこと。適切な投与形式は、医療従事者によって、各疾患または状態について個々に、そしてまた患者の状態を考慮して、最良に決定され得る。
【０１２８】
薬学的組成物は、一般的に認められている手順に従って、成分を混合することによって調製される。例えば、選択された成分を、単純にブレンダーまたは他の標準的デバイス中において混合して、濃縮混合物を生成し得、次いで、この濃縮混合物は、水または粘稠化剤、そしておそらくｐＨを制御するための緩衝剤または張度を制御するためのさらなる溶質の添加によって、最終の濃度および粘度に調整され得る。
【０１２９】
投与される本発明の組成物において使用するための種々の化合物の量は、標準的な手順によって決定され得る。一般的に、治療的有効量は、患者の年齢およびサイズ、ならびに患者に関連した疾患または障害に依存して、約１００ｍｇ／ｋｇと１０^−１２ｍｇ／ｋｇとの間である。一般的に、治療的有効量は、処置される個体の１ｋｇあたり、約０．０５ｍｇと５０ｍｇとの間の量である。実際の用量の決定は、十分に当業者の技術の範囲内である。
【０１３０】
（１０．好ましい実施形態の説明）
好ましい実施形態において、本発明の方法を用いて、第１リガンドとタンパク質との間で形成される中間のジスルフィドのテザー化を介して標的タンパク質上の少なくとも２つの異なる目的の部位に結合する低分子量リガンド、ならびに第１リガンドおよび第２リガンドの各々の反応基を、同定する。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態においてスクリーニングされる低分子量リガンドは、大部分が、約２０００ダルトン未満のサイズ、通常は約１５００ダルトン未満のサイズ、より通常は約７５０ダルトン未満のサイズ、好ましくは約５００ダルトン未満のサイズ、しばしば約２５０ダルトン未満のサイズ、よりしばしば約２００ダルトン以下のサイズである、低分子化学分子である。しかし、サイズが２０００ダルトンより大きい有機分子もまた本明細書中で用途を見い出す。１つの好ましい実施形態において、このような低分子化学分子は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド以外の、低分子有機分子である。別の好ましい実施形態において、この低分子有機分子は、非重合体である、すなわち、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチドなどではない。
【０１３２】
有機分子は、市販原料または非市販原料から取得され得る。例えば、莫大な数の低分子有機化合物は、市販業者（例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩおよびＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｒ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から容易に取得可能であり、または化学合成によって取得され得る。好ましくは本発明の方法を用いて、適切な反応基（好ましくは、チオール基または保護チオール基）を有する低分子有機化合物のライブラリーを、スクリーニングする。
【０１３３】
近年、典型的に数ダースから数十万のメンバーを有する、コンビナトリアルライブラリーが、リガンドの発見および薬物の開発ための主要な手段となっている。一般に、本明細書中で用途を見い出す有機化合物のライブラリーは、少なくとも２つの有機化合物、しばしば少なくとも約２５個の異なる有機化合物、よりしばしば少なくとも約１００個の異なる有機化合物、通常少なくとも約３００個の異なる有機化合物、好ましくは少なくとも約２５００個の異なる有機化合物、および最も好ましくは少なくとも５０００個以上の異なる有機化合物を含む。集団が選択または構築され得、その結果、この集団の各々の個別分子が、この集団の他の分子から（例えば、別々のマイクロタイターウェルに）空間的に分離され得るか、または、デコンヴォルーション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）のための方法が容易に利用可能である場合、この集団の２つ以上のメンバーが組み合され得る。通常、有機分子ライブラリーの各メンバーは同じ化学クラスである（すなわち、全ライブラリーメンバーがアルデヒドであり、全てのライブラリーメンバーが第１級アミンである、など）、しかし、有機化合物のライブラリーはまた、２つ以上の異なる化学クラス由来の分子を含み得る。
【０１３４】
好ましい実施形態において、標的生体分子（ＴＢＭ）は、チオール基、保護チオール基または可逆的ジスルフィド結合を含むか、またはこれらを含むように改変された、ポリペプチドである。次いで、このＴＢＭは低分子エキステンダー（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｘｔｅｎｄｅｒ）（ＳＭＥ）と反応され、この低分子エキステンダーは、ＴＢＭ上の第１の目的部位に対して親和性を有する部分、およびＴＢＭ上のチオール、保護チオールまたは可逆的ジスルフィド結合と反応する基を含む。上記で議論されるように、ＴＢＭとＳＭＥとの間の結合は、ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体を形成するために、不可逆的共有結合（「静的な」拡張テザー化（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ））、または可逆的共有結合（「動的な」拡張テザー化）のいずれかであり得る。静的なアプローチまたは動的なアプローチのどちらが使用されていても、次いで、ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体を用いてジスルフィド含有モノフォア（ｍｏｎｏｐｈｏｒｅ）のライブラリーをスクリーニングして、標的分子上の第２結合部位（目的の部位）に対して、固有の親和性、最も好ましくは最も高い固有の親和性を有するライブラリーメンバーを同定する。好ましい実施形態において、改変されたＴＢＭ上の反応基は、エキステンダーによって提供される遊離チオール基であり、そして、このライブラリーは反応性チオール基を含む低分子量化合物から構成される。最も安定なリガンドを捕捉するためのジスルフィドのテザー化のために、反応は、平衡を可能にするための迅速な交換下になければならない。好ましい実施形態において、この反応は、還元剤（例えば、２−メルカプトエタノール）の触媒作用的な量の存在下において、実施される。還元剤存在下で到達した熱力学的平衡は、改変されたＴＢＭ上のエキステンダーのチオール基と、このＴＢＭに対して固有の親和性を有するライブラリーのメンバーのチオール基との間で、ジスルフィド結合の形成を容易にする。従って、同一のＴＢＭ上の２つの異なる部位に対して固有の親和性を有する２つの異なるリガンドは、ダイアフォア（ｄｉａｐｈｏｒｅ）を形成するために、共有結合的に連結される。このダイアフォアは、いずれの成分のモノフォアユニットよりも、より高い親和性でＴＢＭに結合する。ダイアフォア中のモノフォアユニットは、同一の化学クラスまたは異なる化学クラス由来であり得る。「同一化学クラス」は、各モノフォア成分が同一の化学型（すなわち、両方がアルデヒドまたはアミンなどである）であること意味する。
【０１３５】
特定の実施形態において、標的は、リガンド候補と接触したチップ上に、存在し得る。この場合、第１リガンドが標的に連結している共有結合はチップと形成され得、このような場合、このチップは「低分子エキステンダー（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｅｘｔｅｎｄｅｒ）」の特別なクラスを表す共有結合の一部となる。
【０１３６】
リガンド候補物のライブラリー（例えば、低分子有機分子リガンド）は、固体表面に結合され得（例えば、ビーズ上に提示される）、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１１４３６号（１９９８年３月１９日発行）に記載される。特定の実施形態において、ビーズは反応基（例えば、低レベルのスルフィドリル基）を導入するように、改変される。次いで、リガンド候補物のライブラリーは改変されたビーズ上で、合成される。続いて、このライブラリーは、酸化条件下で、反応基（例えば、ジスルフィド結合が標的とビーズ上のスルフィドリルとの間で形成され得るような、スルフィドリル基）を含む、または含むように改変された標的とインキュベーションされる。次いで、このビーズは還元剤の存在下で洗浄され、続いてスルフィドリル失活剤（例えば、ヨード酢酸）の存在下でインキュベーションされる。次いで、このビーズは、全ての非共有結合標的を除去するために、変性条件下で洗浄され得る。
【０１３７】
（実施例）
本発明を、引続いての非制限的な実施例によってさらに例示する。他に記載しない限り、標準的分子生体学的手順の全てを、以下において記載されるプロトコルに従って実施する：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ １巻〜３巻、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻〜２巻、Ａｕｓｂｕｂｅｌ，Ｆ．、Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．、Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．、Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．およびＳｔｒｕｈｌ，Ｋ．編、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８７。
【０１３８】
基本的なテザー化アプローチの概念は、Ｅｒｉａｎｓｏｎら（前述）によって、およびＰＣＴ公開ＷＯ００／００８２３号中に記載されている。「拡張テザー化（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）」アプローチを、この適用において、標的生体学的分子（ＴＢＭ）としてカスパーゼ−３を使用して、説明する。カスパーゼはシステインプロテアーゼのファミリーであり、このシステインプロテアーゼは、プログラム細胞死（アポトーシス）の開始および実行に関与することが既知である。第１カスパーゼ（ここで、カスパーゼ−１をいう）は、当初、インターロイキン−１β−転換酵素（ＩＣＥ）として命名されていた（Ｔｈｏｒｎｂｕｒｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３５６：７６８〜７７４（１９９２）；Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６：９７〜１００（１９９２））。続いて、莫大な数のカスパーゼが、カスパーゼファミリーを形成することを同定および特性付けられた。現在、このファミリー（カスパーゼ１〜カスパーゼ１０）には、少なくとも１０のメンバーが存在する。カスパーゼは、酵素的に不活性な形態で細胞中で発現され、そして、アポトーシスの刺激に応答しタンパク質分解切断によって活性化される。不活性酵素前駆体は、阻害性Ｎ末端ドメインに加えて、大型ドメインおよび小型ドメイン（大型サブユニットおよび小型サブユニット）の構成をなす。カスパーゼの活性化は、大型サブユニットおよび小型サブユニットへのプロ酵素のプロセッシングに関与し、これは、分子内で内部的に起こる。カスパーゼを、自己凝集およびオートプロセッシングによってか（アポトーシス初期の場合）、または活性化した上流カスパーゼによる切断を介して（アポトーシスの実行段階の場合）のいずれかで、活性化する。総説として、例えばＣｏｈｅｎ Ｇ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：１〜１６（１９９７）を参照のこと。
【０１３９】
公知の、カスパーゼのテトラペプチドインヒビターに基づいて（ＡｔｏｒおよびＤｏｌｌｅ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ １：１９１〜２１０（１９９５））、エキステンダーを合成した：２，６−ジクロロ−安息香酸 ３−（２−アセチルスルファニル−アセチルアミノ）−４−カルボキシル−２−オキソ−ブチルエステル（図４中の化合物５として示す）、この合成を、以下の実施例２に記載する。エキステンダーの遺伝子構造を、図４に示す。カスパーゼをエキステンダーと反応させることで改変し（実施例３）、続いて、拡張テザー化アプローチを使用して、実施例１中に記載されるように調製したジスルフィドライブラリーのスクリーニングのための生体学的標的分子として、使用した。
【０１４０】
市販の材料全てを、受け取ったまま使用した。合成した化合物の全てを^１Ｈ ＮＭＲ［Ｂｒｕｋｅｒ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）ＤＭＸ４００ ＭＨｚ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ］およびＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｅｒｉｅｓ １１００ ＭＳＤ）によって、特徴付けた。
【０１４１】
（実施例１）
（ジスルフィドライブラリー）
ジスルフィドライブラリーを、以下の化合物クラスからの標準的な化学を使用して、合成した：アルデヒド、ケトン、カルボン酸、アミン、塩化スルホニル、イソシアネート、およびイソチオシアネート。例えば、ジスルフィド含有ライブラリーメンバーを、Ｐａｒｌｏｗおよび共同研究者らの方法（ＰａｒｌｏｗおよびＮｏｒｍａｎｓｅｌｌ、Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ １：２６６〜２６９（１９９５））を適用することによって、市販のカルボン酸およびモノ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）保護システイン（モノ−ＢＯＣ−システイン）から、作製した。簡単に述べると、２６０μｍｏｌの各カルボン酸を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を使用して、ポリスチレン樹脂上の１３０μｍｏｌ当量の４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゾフェノンに、固定化した。室温で４時間後、ＤＭＦ（×２）、ジクロロメタン（ＤＣＭ、×３）、およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、×１）を用いて樹脂をリンスし、カップリングしていない酸およびＤＩＣを除去した。酸を、ＴＨＦ中の６６μｍｏｌのモノ−ＢＯＣ保護システインを用いるアミド形成を介して、樹脂から切断した。外界温度にて１２時間反応後、溶媒をエバポレートし、そして、ＢＯＣ基を、ＤＣＭ中で８０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用することによって、各ジスルフィドのカップリングしていない半分から、除去した。生成物をＨＰＬＣ−ＭＳによって特徴付け、そして、実質的に純粋であるこれらの生成物を、さらなる精製なしで使用した。総計５３０の化合物を、この方法論を使用することによって、作製した。
【０１４２】
ライブラリーをまた、モノ−ＢＯＣ−保護システインならびに種々の塩化スルホニル、イソシアネートおよびイソチオシアネートから、構築した。塩化スルホニルの場合、１０μｍｏｌの各塩化スルホニルを、１５ｍｇのポリ（４−ビニル ピリジン）存在下で、ＴＨＦ（２％ジイソプロピルエチルアミンを用いて）中で、１０．５μｍｏｌのモノ−ＢＯＣ−保護システインと結合させた。４８時間後、ポリ（４−ビニルピリジン）を、ろ過を介して除去し、そして、溶媒をエバポレートした。ＢＯＣ基を、ＤＣＭ中で５０％ＴＦＡを使用することで除去した。イソチオシアネートの場合、１０μｍｏｌの各イソシアネートまたはイソチオシアネートを、ＴＨＦ中で１０．５μｍｏｌのモノ−ＢＯＣ−保護システインとカップリングさせた。外界温度にて１２時間反応させた後、溶媒をエバポレートし、そして、ＢＯＣ基を、ＤＣＭ中で５０％ＴＦＡを使用することによって、除去した。総計２１２の化合物を、この方法論を使用することによって、作製した。
【０１４３】
最後に、オキシムベースライブラリーを、１：１のメタノール／クロロホルム（２％酢酸を添加）中で、１０μｍｏｌの特定のアルデヒドまたはケトンと１０．５μｍｏｌのＨＯ（ＣＨ_２）_２Ｓ−Ｓ（ＣＨ_２）_２ＯＮＨ_２を外界温度にて１２時間反応させることで構築し、オキシム生成物を得た。総計４４８の化合物を、この方法論を使用することによって作製した。
【０１４４】
個別のライブラリーメンバーを、５０ｍＭまたは１００ｍＭの最終濃度まで、アセトニトリルまたはジメチルスルホキシドのいずれか中に、溶解した。次いで、これらの各々のアリコートを、８個〜１５個の別個の化合物群中へプールした（このプールの各メンバーは、固有の分子量を有する）。
【０１４５】
（実施例２）
（エキステンダー（ＳＭＥ）合成）
拡張テザー化アプローチのために、エキステンダー（２，６−ジクロロ−安息香酸３−（２−アセチルスルファニル−アセチルアミノ）−４−カルボキシル−２−オキソ−ブチルエステル、図４中の化合物５として示す）を、図４中に示すような一連の化学反応を使用して合成し、そして、以下に記載する。
【０１４６】
（２−（２−アセチルスルファニル−アセチルアミノ）−コハク酸４−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物２、図４）の合成）
アセチルスルファニル酢酸ペンタフルオロフェニルエステル（１．６ｇ、５．３ｍｍｏｌ）およびＨ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）（２０ｍｌ）中で混合した。次いで、１．６ｍｌのトリエチルアミン（１１．５ｍｍｏｌ）を添加し、そして、反応を、外界温度にて３．５時間進行させた。次いで、有機層を１５ｍｌの１Ｍカルボン酸ナトリウムを用いて抽出し（×３）、合わせた水性画分を、１００ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウムを用いて酸性化し、そして３０ｍｌのエチルアセテートを用いて抽出した（×３）。次いで、結合した有機性画分を、３０ｍｌの１Ｍヒドロゲンスルホン酸ナトリウム、３０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを用いてリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、そして減圧下でエバポレートして、１．９７ｇのほぼ無色のシロップを得、さらなる精製なしに使用した。分子量＝３０５（実測値３０６、Ｍ＋１）。
【０１４７】
（３−（２−アセチルスルファニル−アセチルアミノ）−５−クロロ−４−オキソ−ペンタン酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物３、図４）の合成）
遊離酸（化合物２）を１０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解し、０℃に冷却し、そして、０．５８ｍｌ Ｎ−メチルモルフォリン（５．３ｍｍｏｌ）および０．６９イソブチルクロロギ酸を用いて処理した。濃密な白色沈澱を、直ちに形成し、そして３０分後、反応物をガラスフリットを介してろ過し、そして、更なる１０ｍｌのＴＨＦを有する新しいフラスコに移した。一方、ジアゾメタンを、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（２．３ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）と７．４ｍｌの４０％水性ＫＯＨおよび２５ｍｌジエチルエーテルとを、０℃にて４５分間反応させることによって、調製した。次いで、黄色エーテル層を、混合アルデヒドを含有する反応物へデカントし、そしてこの反応を１６５分間にわたりゆっくり外界温度まで暖める間、進行させた。この反応物を、８℃に冷却し、そしてジオキサン中の１．５ｍｌの４Ｎ ＨＣｌ（総計６ｍｍｏｌ）を滴下した。これは、多くの気泡を生じ、そして黄色溶液は無色となった。この反応を、徐々に外界温度まで暖める間、２時間進行させ、次いで、１ｍｌの氷酢酸を用いてクエンチした。溶媒を減圧下で除去し、そして、残渣を７５ｍｌのエチルアセテート中に再溶解し、５０ｍｌの飽和ジカルボン酸ナトリウム、５０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌでリンスし（×２）、硫酸酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、そして、９０：１０のクロロホルム：エチルアセテートを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製する前にエバポレートして乾燥させて、０．７４７ｇの淡黄色油（２．２ｍｍｏｌ、（１）から４２％）を得た。推定分子量＝３３７．７、実測値３３８（Ｍ＋１）。
【０１４８】
（２，６−ジクロロ−安息香酸３−（２−アセチルスルファニル−アセチルアミノ）−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−オキソ−ブチルエステル（化合物４、図４）の合成）
クロロメチルケトン（化合物３）（０．２５ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を、５ｍｌの乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（これは、０．１７ｇの２，６−ジクロロ安息香酸（０．８９ｍｍｏｌ）および０．１０７ｇのＫＦ（１．８４ｍｍｏｌ）を添加されている）中に溶解した。反応を、１９時間、外界温度にて進行させた。１９時間の時点で、７５ｍｌのエチルアセテートで希釈し、５０ｍｌの飽和炭酸水素酸ナトリウム、５０ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、５０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを用いてリンスし（×２）、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、そして、減圧下で乾燥させて、黄色シロップを得た。ＨＰＬＣ−ＭＳは約７５％生成物および２５％未反応物（３）であることを示した。これを、さらなる精製なしに使用した。推定分子量４９２．３７、実測値４９３（Ｍ＋１）。
【０１４９】
（２，６−ジクロロ−安息香酸３−（２−アセチルスルファニル−アセチルアミノ）−４−カルボキシ−２−オキソ−ブチルエステル（化合物５、図４）の合成）
以前の工程の生成物（化合物４）を、１０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中に溶解し、０℃に冷却し、そして、９ｍｌのトリフロロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて処理した。次いで、この反応物を氷浴から取り出し、そして、１時間にわたり外界温度まで暖めた。溶媒を減圧下で除去し、そして、残渣をＤＣＭ中に２回溶解し、そして、残存するＴＦＡを除去するためにエバポレートした。粗生成物を、逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製し、１０１．９ｍｇ（０．２３４ｍｍｏｌ、（３）から３２％）の白色吸湿性粉末を得た。推定分子量＝４３６．３７、実測値４３７（Ｍ＋１）。これをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、５０ｍＭのストック溶液を得た。
【０１５０】
（実施例３）
（エキステンダーを用いたカスパーゼ３の改変）
カスパーゼ３を、標準的な技術（Ｒｏｔｏｎｄａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３（７）：６１９〜６２５（１９９６））を使用してクローニングし、大量発現し、そして精製した。２ｍｌの０．２ｍｇ／ｍｌカスパーゼ３溶液に、実施例２において記載されたように合成した１０ｍｌの５０ｍＭ ２，６−ジクロロ−安息香酸３−（２−アセチルスルファニル−アセチルアミノ）−４−カルボキシ−２−オキソ−ブチルエステル（化合物５、図３）を添加し、そして、反応を３．５時間、外界温度にて進行させた。３．５時間の時点で、質量分析は、カスパーゼ３大型サブユニットの完全な改変（分子量１６８６１Ｄａ、計算分子量１６８６０Ｄａ）を示した。チオエステルを、ＰＢＳ緩衝液中で緩衝化された０．２ｍｌの０．５Ｍヒドロキシルアミンを加えることによって脱保護し、反応を１８時間進行させた。１８時間の時点で、この巨大なサブユニットは、１６８１９Ｄａ（計算１６８１８Ｄａ）の質量を有した。このタンパク質を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ ５ ＭＷＣＯユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で濃縮し、そして、緩衝液を、Ｎａｐ−５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、０．１Ｍ ＴＥＳ（ｐＨ７．５）に交換した。得られた「拡張された」カスパーゼ−３の構造を、図６に示す。
【０１５１】
次いでこのタンパク質を、上記（実施例１中）のように調製したジスルフィドライブラリーに対して、以下の実施例４に記載される方法論を使用して、スクリーニングした。
【０１５２】
（実施例４）
（ジスルフィドライブラリーのスクリーニング）
典型的な実験において、８個〜１５個のジスルフィド含有化合物のライブラリーを含む１μｌのＤＭＳＯ溶液を、４９μｌのエキステンダー改変タンパク質含有緩衝液に添加した。質量分析を結合リガンドの同定に用いた場合、化合物を各々が固有の分子量を有するように選択した。例えば、これらの分子量は、少なくとも１０の原子質量単位まで異なり、その結果、デコンヴォル−ションは明白である。デコンヴォル−ションの簡便さに起因して、８個〜１５個のジスルフィド含有化合物のプールを、スクリーニングのために典型的に選んだが、より巨大なプールもまた、使用され得る。タンパクは約１５μＭの濃度で存在し、ジスルフィドライブラリーのメンバー各々は約０．２ｍＭで存在し、従って、全ジスルフィドライブラリーメンバーの総濃度は、約２ｍＭであった。反応を、２５ｍＭリン酸カルシウム（ｐＨ７．５）および１ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含有する緩衝液中で行ったが、他の緩衝液および還元剤も使用し得る。この反応を少なくとも３０分間、外界温度にて、平衡化した。これらの条件は、タンパク質が質量分析においてイオン化する容易さ、特定のシステイン（単数または複数）の反応性などに依存して、かなり変化し得る。
【０１５３】
アスパルチル結合体化カスパーゼ−３（実施例３）およびライブラリー（実施例１）の平衡化の後、反応物を、ＨＰ１１００ ＨＰＬＣに注入し、質量分析器に装置したＣ_１８カラム（Ｆｉｎｎｉｇａｎ−ＭＡＴ ＬＣＱ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でクロマトグラフした。タンパク質から生じる複数の荷電イオンを、利用可能なソフトウェア（ＸＣＡＬＩＢＵＲ）を用いてデコンヴォルートして、タンパク質の質量を得た。次いで、ジスルフィド結合を介してタンパク質に結合される任意のライブラリーメンバーの同定を、観察された質量から、改変されていないタンパク質の既知の質量を引くことによって、容易に決定した。このプロセスは、ライブラリーメンバーの付着がタンパク質自身に特有なイオン化を劇的に変化しないということ（伝統的仮説）を、仮定する。なぜならば、多くの場合、タンパク質は、任意の所定のライブラリーメンバーよりも、少なくとも２０倍大きいからである。この仮定を、１つのタンパク質によって選択された小型分子が、他のタンパク質によって選択されないことを立証することによって、確認した。
【０１５４】
代表的な実験の結果を、図６に示す。図６の右側のスペクトルは、「拡張」カスパーゼ−３（実施例３で記載したように合成した）が、拡張カスパーゼ３を改変するプールから同定されたジスルフィド含有分子と反応した結果を示す。得られた優意なピーク（１７，０９４の質量）は、カスパーゼ３上の第２の目的部位に対して固有の親和性を有する低分子リガンドに、共有結合的に連結されたカスパーゼ３に対応し、結果として上記のピークに示されるダイアフォア化合物を生じる。
【０１５５】
左側に示される質量スペクトルは、改変されていないカスパーゼ３（システイン含有ポリペプチド標的）のデコンヴォリューター（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｒ）質量スペクトルであり、そして、上記で使用された同じジスルフィド含有低分子リガンドである。このスペクトルは、改変されていないカスパーゼ３の質量（１６，６１４ＤＡ）に対応する優意なピークを、示す。有意により小さいピークは、２−アミノエタンチオールにジスルフィド結合されたカスパーゼ−３（合わせた質量：１６，６９１Ｄａ）を表す。ここで、低分子リガンドの結合部位が反応性システインから非常に遠く、そして、エキステンダーが導入されていないことに起因して、この低分子リガンドが選択されないことに注意する。
【０１５６】
次いで、上記のように同定された初期リード化合物を、カスパーゼ−３への特異的結合における、種々の置換基の相対的な重要性を評価するために改変した。
【０１５７】
本明細書を通して引用された全ての参考文献を、参考として明白に援用する。
【０１５８】
本発明を、これらの特定の実施形態の参考とともに記載してきたが、種々の変更がなされ得、そして、当価物が、本発明の概念および範囲から逸脱することなく置換され得るということを、当業者は理解するべきである。多くの改変が、目的に対して、特定の、状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス工程を採用するようになされ得る。このような改変の全ては、本明細書に添付の特許請求項の範囲内にあることが、意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、側鎖特異的リガンドの発見のための基本的結合アプローチの模式図である。遊離チオール基を含むか、または遊離チオール基を含むように改変された標的分子（例えば、システイン含有タンパク質）は、還元剤（例えば、２−メルカプトエタノール）の存在下でジスルフィド含有ライブラリーと平衡化される。大部分のライブラリーのメンバーは、標的分子に対してほとんどまたは全く固有の親和性を有さないので、質量作用により、非改変標的分子に向かって平衡になる。しかし、ライブラリーメンバーが、標的分子に対して固有の親和性を実際に示す場合、平衡が、改変された標的分子に向かってシフトし、この標的分子がライブラリーメンバーとジスルフィド結合により結合される。
【図２】 図２は、静止状態の拡大結合アプローチの模式図である。第１の工程において、遊離チオール基を含むか、または遊離チオール基を含むように改変された標的分子（例えば、システイン含有タンパク質）は、チオール含有エキステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）（標的分子上のチオール基と不可逆性共有結合を形成し得る反応基を含む）、標的分子に対する固有の親和性を有する部分、およびチオール基により改変される。次いで、標的分子とチオール含有エキステンダーとの間で形成された複合体は、ジスルフィド含有モノフォア（ｍｏｎｏｐｈｏｒｅ）のライブラリーをスクリーニングして、標的分子上の第２の結合部位に対する最高の固有の結合親和性を有するライブラリーメンバーを同定するために用いられる。ＬＧ＝リガンド；ＰＧ＝保護基；Ｒ＝反応基。
【図３】 図３は、動力学的な拡大結合ストラテジーを示し、ここでエキステンダーは、二官能性であり、２つの官能基（通常は、ジスルフィド）を含み、各々が、可逆性共有結合を形成し得る。Ｒ＝反応基。
【図４】 図４は、実施例２に記載される、特定のエキステンダー（２，６−ジクロロ−安息香酸３−（２−アセチルスルファニル−アセチルアミノ）−４−カルボキシ−２−オキソ−ブチルエステル）の化学合成を示す。
【図５】 図５は、カスパーゼ３の公知のテトラペプチドインヒビターと、このインヒビターに基づいて合成された包括的エキステンダーとの間の構造比較を示す。
【図６Ａ】 図６Ａは、２つの代表的な拡大結合実験の質量スペクトルを示す。
【図６Ｂ】 図６Ｂは、２つの代表的な拡大結合実験の質量スペクトルを示す。

Claims (27)

1. プロセスであって、以下：
   （ｉ）目的の第１の部位および目的の第２の部位を有し、該目的の第１の部位またはその付近に求核基を含むかまたは含むように改変された標的生物学的分子（ＴＢＭ）を、複数の第１の有機リガンド候補と、可逆的な共有結合が該求核基と目的の第１の部位に対する親和性を有する候補との間で形成されてＴＭＢ第 1 リンガンド複合体を形成する条件下で接触させる工程であって、該求核基は、チオール基、保護チオール基、可逆的ジスルフィド基、ヒドロキシル基、保護ヒドロキシル基、アミノ基、保護アミノ基、カルボキシル基および保護カルボキシル基からなる群より選択され、該候補は、該求核基と反応性である官能基を有する、工程；
   （ｉｉ）ＴＢＭ−第 1 のリガンド複合体から第 1 リガンドを同定する工程；
   （ｉｉｉ）該ＴＢＭ上の求核基と反応性の第 1 の官能基および該目的の第２の部位に対して親和性を有する第 2 の官能基を有する低分子エキステンダー（ＳＭＥ）を提供するような、（ｉｉ）において同定された第１のリガンドの誘導体を設計する工程であって、該第１の官能基が、該ＴＢＭ上の、チオール基、保護チオール基、可逆的ジスルフィド結合、ヒドロキシル基、保護ヒドロキシル基、アミノ基、保護アミノ基、カルボキシル基または保護カルボキシル基と不可逆的な共有結合基を形成し得る、工程；
   （ｉｖ）該ＴＢＭとＳＭＥとを接触させて、ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体を形成する工程、および
   （ｖ）該ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体を複数の第２の低分子有機リガンド候補と接触させる工程であって、該候補は、該ＴＢＭ−ＳＭＥ中のＳＭＥと反応性である官能基を有し、該ＴＢＭ上の目的の第２の部位に対する親和性を有する候補が、該ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体と共有結合を形成して、それによって、第 2 のリガンドが同定される、工程
   を包含する、プロセス。
2. 請求項１に記載のプロセスであって、前記工程（ｖ）における、前記ＴＢＭ上の前記第２の官能基および前記第 2 のリガンド候補上の官能基が、チオール基、保護チオール基または可逆的ジスルフィド基である、プロセス。
3. 請求項２に記載のプロセスであって、前記工程（ｖ）がチオール交換条件の下で実施される、プロセス。
4. 請求項３に記載のプロセスであって、前記条件が、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスレイトール（ＤＴＥ）、メルカプトプロパン酸、グルタチオン、システアミン、システイン、トリ（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびトリス（シアノエチル）ホスフィンからなる群より選択される還元剤の添加から生じる、プロセス。
5. 請求項 4 に記載のプロセスであって、工程（ｖ）における前記第 2 のリガンド候補が、ライブラリーのメンバーである、プロセス。
6. 請求項 5 に記載のプロセスであって、前記ＴＢＭ上の目的の第２の部位に対して最も高い親和性を有するライブラリーのメンバーが、前記ＴＢＭ−ＳＭＥ複合体とジスルフィド結合を形成する、プロセス。
7. 請求項１に記載のプロセスであって、前記ＴＢＭ上の目的の第２の部位に対する親和性を有する第 2 のリガンドを同定する工程を包含する、プロセス。
8. 請求項７に記載のプロセスであって、前記第 2 のリガンドが、質量分析法（ＭＳ）によって同定される、プロセス。
9. 請求項９に記載のプロセスであって、前記第 2 のリガンドが、検出可能なタグを利用して同定される、プロセス。
10. 請求項７に記載のプロセスであって、互いに共有結合した前記第１のリガンドと第 2 のリガンドを含む分子を合成する工程をさらに包含する、プロセス。
11. 請求項１０に記載のプロセスであって、ここで、前記共有結合が、ジスルフィド結合によって提供される、プロセス。
12. 請求項１１に記載のプロセスであって、前記第 2 の分子が、本質的 に、ジスルフィド結合を介して共有結合する第 1 のリガンドおよび第 2 のリガンドからなる、プロセス。
13. 請求項１２に記載のプロセスであって、前記分子の誘導体を合成する工程をさらに包含する、プロセス。
14. 請求項１３に記載のプロセスであって、前記第 1 のリガンドと第 2 のリガンドを共有結合するジスルフィド結合が、異なる共有結合で置換される、プロセス。
15. プロセスであって、以下：
    （ｉ）標的生物学的分子（ＴＢＭ）を提供する工程であって、該ＴＢＭは、該ＴＢＭ上の目的の第１の部位付近に反応性の求核基を含むかまたは含むように改変されている、工程；
    （ｉｉ）（ｉ）由来のＴＢＭを、低分子エキステンダーと接触させる工程であって、該低分子エキステンダーは、ＴＢＭ上の求核基と反応性である基を有し、そして遊離チオールまたは保護チオールを有する、工程；
    （ｉｉｉ）該ＴＢＭ上の求核基と該低分子エキステンダー上の基との間で共有結合が形成されるように（ｉｉ）における接触条件を調整して、それによって、該ＴＢＭと該低分子エキステンダーとを含む共有結合複合体を形成し、該複合体は、該ＴＢＭ上の目的の第２の部位付近に遊離チオールまたは保護チオールを提示する、工程；
    （ｉｖ）チオール交換条件下で、（ｉｉｉ）由来の複合体を、有機低分子のライブラリーと接触させる工程であって、該分子の各々は、遊離チオールまたは交換可能なジスルフィド連結基を有し、ここで、ＴＢＭ上の目的の第２の部位に対する最も高い親和性を有するライブラリーのメンバーが、該複合体とジスルフィド結合を形成する、工程；および
    （ｖ）（ｉｖ）由来のライブラリーのメンバーを同定する工程
    を包含する、プロセス。
16. 請求項１５に記載のプロセスであって、前記工程（ｉ）において同定され、ライブラリーメンバーとジスルフィド結合を介して共有結合している、工程（ｉｉ）に由来する求電子基を有する低分子エキステンダーから本質的になる、分子を合成する工程を包含する。プロセス。
17. 請求項１６に記載のプロセスであって、前記分子の誘導体を合成する工程をさらに包含する、プロセス。
18. 請求項１８に記載のプロセスであって、前記誘導体が、前記求核基と反応性である異なる基を含む、プロセス。
19. 請求項１７に記載のプロセスであって、前記低分子エキステンダーと前記工程（ｉ）において同定されたライブラリーメンバーとを共有結合させるジスルフィド基が、異なる基で置換される、プロセス。
20. 請求項１５に記載のプロセスであって、前記工程（ｖ）において同定されたライブラリーメンバーとジスルフィド結合を介して共有結合された求核基と反応性である基を有していない低分子エキステンダーから本質的になる、プロセス。
21. 請求項２０に記載のプロセスであって、前記工程（ｃ）において同定されたライブラリーメンバーとジスルフィド結合を介して共有結合された求核基と反応性である基を有していない低分子エキステンダーを共有結合しているジスルフィドを、異なる基と置換する工程をさらに包含する、プロセス。
22. 請求項１５に記載のプロセスであって、前記反応性である求核基が、チオールである、プ ロセス。
23. 請求項２２に記載のプロセスであって、工程（ｉ）の後に、以下：
    （ａ）チオール交換条件下で、前記ＴＢＭを有機低分子のライブラリーと接触させる工程であって、各々の分子が、交換可能なジスルフィド連結基を有し、ここで、前記目的の第１の部位に対して最も高い親和性を有するライブラリーのメンバーが、該ＴＢＭとジスルフィド結合を形成する、工程；
    （ｂ）（ｉ）由来の該ライブラリーのメンバーを同定する工程；および
    （ｃ）（ｉｉ）における該ライブラリーのメンバーの誘導体を形成する工程であって、該誘導体は、前記求核基と反応性であり、工程（ｂ）のチオールまたは保護チオールを有する低分子エキステンダーである、工程
    をさらに包含する、プロセス。
24. 請求項２３に記載のプロセスであって、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスレイトール（ＤＴＥ）、メルカプトプロパン酸、グルタチオン、システアミン、システイン、トリ（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびトリス（シアノエチル）ホスフィンからなる群より選択されるジスルフィド還元剤を添加する工程をさらに包含する、プロセス。
25. 前記同定する工程が、質量スペクトル分析を含む、請求項１５に記載のプロセス。
26. 前記同定する工程が、質量スペクトル分析を含む、請求項２３に記載のプロセス。
27. 請求項２３に記載のプロセスであって、交換可能なジスルフィド連結基を有している有機低分子のライブラリーの分子の各々は、システアミン部分を含む、プロセス。

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