MXPA03004435A - Procedimiento de traba extendida para identificacion rapida de ligandos. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un metodo para la identificacion y caracterizacion rapidas de socios de enlace para una molecula objetivo, y para la provision de socios de enlace con afinidad de enlace mejorada. Mas especificamente, la invencion se refiere a un metodo mejorada de traba para la identificacion rapida de al menos dos socios de enlace que se enlazan uno cerca del otro a una molecula objetivo.

Description

PROCEDIMIENTO DE TRABA EXTENDIDA PARA IDENTIFICACIÓN RÁPIDA DE LIGANDOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La presente invención se refiere en general a un método para la identificación y caracterización rápida de patrones de enlace para una molécula objetivo, y para la provisión de patrones de enlace modificados con afinidad de enlace mejorada. Más específicamente, la invención se refiere a un método de traba (tethering) mejorado para la identificación rápida de fragmentos moleculares pequeños que se enlazan uno cerca del otro sobre una molécula objetivo. El método es particularmente adecuado para la identificación rápida de ligandos de molécula pequeña que se enlazan débilmente cerca de sitios de interés a través de un enlazador preformado sobre una molécula biológica objetivo (TBM por su acepción en inglés) , tal como un polipéptido u otra macromolécula, para producir compuestos de afinidad más alta.

REF : 147313 DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA El proceso de descubrimiento de fármacos usualmente comienza con la selección masiva de bibliotecas de compuesto (típicamente cientos de miles de miembros) para identificar guías de afinidad modesta (2¾~1 a 10 µ?) . Aunque algunos objetivos son muy adecuados para este proceso de selección, la mayoría son problemáticos debido a que las guías de afinidad moderada son difíciles de obtener. La identificación y subsecuentemente la optimización de compuestos de enlace más débiles podría mejorar la proporción de éxito, pero la selección a altas concentraciones es en general no práctica debido a la insolubilidad del compuesto y a los problemas de ensayo. Además, el proceso de selección típico no se dirige a sitios específicos para el diseño de fármacos, únicamente aquellos sitios para los cuales es disponible un ensayo de alto rendimiento. Finalmente, muchos métodos de selección tradicionales confían en los ensayos de inhibición que son frecuentemente sujetos a problemas provocados por especies químicas reactivas o desnaturalizadores . Erlanson et al., Proc . Nat . Acad. Sci . EUA 97: 9367-9372 (2000) , han reportado recientemente una nueva estrategia, llamada "traba" ( tether ing) , para identificar rápida y confiablemente fragmentos de fármacos solubles pequeños (de ~250 Da) que se enlazan con baja afinidad a un sitio específicamente dirigido sobre una proteína u otra macromolécula , utilizando un "trabador" (tether) de disulfuro intermediario. De acuerdo a este procedimiento, es permitida que una biblioteca de moléculas que contienen enlaces disulfuro reaccionen con una proteína objetivo que contiene cisteína, bajo condiciones parcialmente reductoras que promueven el intercambio rápido del tiol. Si una molécula tiene incluso afinidad débil por la proteína objetivo, el enlace disulfuro ("trabador") que enlaza la molécula a la proteína objetivo será entrópicamente estabilizado. Los fragmentos con traba disulfuro pueden ser identificados luego mediante una variedad de métodos, incluyendo espectrometría de masa (MS) , y su afinidad mejorada por procedimientos tradicionales después de la eliminación de la traba o puente disulfuro. Ver también la Publicación PCT No. O 00/00823, publicada el 6 de enero del 2000. Aunque el procedimiento de traba de Erlanson et al. representa un avance significativo en la identificación rápida de ligandos pequeños de baja afinidad, y es una herramienta poderosa para generar guías de fármaco, existe una necesidad para métodos mejorados adicionales para facilitar el diseño racional de fármacos candidatos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe una estrategia para identificar rápida y confiablemente ligandos que tienen afinidad de enlace intrínseca para diferentes sitios sobre una molécula objetivo, mediante el uso de un procedimiento de traba extendida. El procedimiento está basado en el diseño de un Extensor de Molécula Pequeña (SME por su acepción en Inglés) , que está trabado, vía un enlace covalente reversible o irreversible, a una Molécula Objetivo (TM por su acepción en inglés) en o cerca de un primer sitio de interés, y tiene un grupo que reacciona químicamente, reactivo con moléculas orgánicas pequeñas que van a ser seleccionadas por afinidad a un segundo sitio de interés sobre la TM. En consecuencia, el SME es utilizado para seleccionar una pluralidad de ligandos candidatos para identificar un ligando que tenga afinidad de enlace intrínseca para un segundo sitio de interés sobre la TM. Si se desea, pueden ser diseñados SME's adicionales con base en la identificación del ligando con afinidad de enlace para el segundo sitio de interés, y la selección puede ser repetida para identificar ligandos adicionales que tengan afinidad de enlace intrínseca para el mismo u otros sitios de interés sobre la misma o TM' s relacionadas. Un aspecto de la invención se refiere al diseño de un Extensor de Molécula Pequeña (SME) . En este aspecto, la invención se refiere a un proceso que comprende: (i) poner en contacto una Molécula Objetivo (TM) que tenga un primero y segundo sitios de interés, y que contenga o que esté modificada para contener un nucleófilo o electrófilo reactivo en o cerca del primer sitio de interés con una pluralidad de primeros ligandos candidatos orgánicos, pequeños, teniendo los candidatos un grupo funcional reactivo con el nucleófilo o electrófilo, bajo condiciones tales que se forma un enlace covalente reversible entre el nucleófilo o el electrófilo y un candidato que tenga afinidad para el primer sitio ' de interés, para formar un complejo TM-primer ligando; (ii) la identificación del primer ligando a partir del complejo de (i) ; y (iii) el diseño de un derivado del primer ligando identificado en (ii) para proporcionar un SME que tiene un primer grupo funcional reactivo con el nucleófilo o el electrófilo sobre la TM, y un segundo grupo funcional reactivo con un segundo ligando que tiene afinidad por el segundo sitio de interés. En una modalidad de este aspecto de la invención, el SME del paso (iii) anterior es diseñado tal que éste es capaz de formar un enlace covalente irreversible con el nucleófilo o el electrófilo de la TM. En una modalidad preferida, el grupo reactivo sobre la TM es un nucleófilo, preferentemente un tiol, tiol protegido, disulfuro reversible, hidroxilo, hidroxilo protegido, amino, amino protegido, carboxilo, o grupo carboxilo protegido, y los primeros grupos funcionales preferidos sobre el SME son grupos capaces de sufrir adiciones similares a SN2 o formación de aductos tipo ichael con el nucleófilo. Los SME's diseñados de esta manera son luego puestos en contacto con la TM para formar un complejo TM-SME irreversible. Este complejo es luego puesto en contacto con una pluralidad de segundos ligandos candidatos orgánicos pequeños, donde tales candidatos tienen un grupo funcional reactivo con el SME en el complejo TM-SME. Como resultado, un candidato que tenga una afinidad por el segundo sitio de interés sobre la TM forma un enlace covalente reversible con el complejo TM-SME, con lo cual es identificado un ligando que tiene afinidad de enlace intrínseca por el segundo sitio de interés. En una modalidad alternativa de la invención el SME del paso (iii) anterior es diseñado para contener un primer grupo funcional que forma un primer enlace covalente reversible con el nucleófilo o electrófilo sobre la TM. El grupo reactivo sobre la TM es preferentemente un nucleófilo. El enlace covalente reversible es preferentemente un enlace disulfuro que es formado con un tiol, tiol protegido, o enlace disulfuro reversible sobre la TM. Los SME's diseñados de esta manera son luego puestos en contacto con la TM ya sea antes de o simultáneamente con la puesta en contacto de la TM con una pluralidad de segundos ligandos candidatos orgánicos, pequeños, cada ligando candidato orgánico, pequeño, tiene un tiol libre, tiol protegido o un grupo disulfuro reversible, bajo condiciones de intercambio de tiol, en donde un ligando candidato que tiene afinidad por el segundo sitio de interés sobre la TM, forma un enlace disulfuro con el complejo TM-SME, con lo cual es identificado un segundo ligando. El proceso puede ser realizado en presencia de un agente reductor de disulfuro, tal como mercaptoetanol , ditiotreitol (DTT), ditioeritreitol (DTE), ácido mercaptopropanoico , glutatión, cisteamina, cisterna, tri ( carboxietil ) fosfina (TCEP) , y tris (cianoetil) fosfina. En una modalidad particular, la SME es diseñada con base en la selección de una molécula orgánica pequeña que tiene un tiol o tiol protegido (monóforo de disulfuro) proveniente de una biblioteca de tales moléculas por una Molécula Biológica Objetivo (Target Biological Molecule (TBM) por su acepción en inglés) que tiene un tiol en o cerca de un sitio de interés. En este caso, el método de esta invención es un proceso que comprende: (i) poner en contacto una TBM que contiene o que está modificada para contener un tiol, tiol protegido o grupo disulfuro reversible en o cerca de un primer sitio de interés sobre la TBM, con una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas, cada molécula orgánica pequeña tiene un tiol libre o un grupo disulfuro reversible (monóforos disulfuro), bajo condiciones de intercambio de tiol, en donde un miembro de la biblioteca tiene afinidad por un primer sitio de interés, forma un enlace disulfuro con la TBM; (ii) la identificación del miembro de la biblioteca (monóforo de disulfuro seleccionado) de (i); y (iii) el diseño de un derivado del miembro de la biblioteca en (ii) que es el ??? que tiene un primer grupo funcional reactivo con el tiol sobre la TBM, y que tiene un segundo grupo funcional que es un tiol, tiol protegido o grupo disulfuro reversible. Como se acaba de mencionar, el SME puede ser diseñado para contener un primer grupo funcional que forma un enlace covalente irreversible o reversible con la TBM, y puede ser utilizado para seleccionar ligandos candidatos de molécula pequeña, en particular bibliotecas de moléculas pequeñas, como se describe anteriormente, para identificar un segundo ligando. De este modo, en una modalidad, el SME del paso (iii) es diseñado para contener un primer grupo funcional que forma un enlace covalente irreversible con el tiol sobre la TBM. Los primeros grupos funcionales preferidos de esta modalidad son grupos capaces de sufrir adiciones tipo SN2 o formar aductos tipo Michael con el tiol. Los SME's diseñados de esta manera son luego puestos en contacto con la TBM para formar un complejo TMB-SME irreversible. Este complejo es luego puesto en contacto con la segunda biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas, teniendo cada molécula orgánica pequeña un grupo tiol libre o un grupo disulfuro reversible, bajo condiciones de intercambio de tiol en donde el miembro de la biblioteca que tiene afinidad, preferentemente la más alta afinidad, por un segundo sitio de interés sobre la TBM (segundo ligando) forma un enlace disulfuro con el complejo TBM-SME. En una modalidad alternativa, el extensor de molécula pequeña (SME) del paso (iii) es diseñado para contener un primer grupo funcional que forma un primer enlace disulfuro reversible con el tiol sobre la TBM. Los SME's diseñados de esta manera son luego puestos en contacto con la TBM ya sea antes de o simultáneamente con la puesta en contacto de la TBM con una segunda biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas, teniendo cada molécula orgánica pequeña un tiol libre o un grupo disulfuro reversible, bajo condiciones de intercambio de tiol, bajo condiciones en donde el miembro de la segunda biblioteca que tiene afinidad, preferentemente la más alta afinidad, por un segundo sitio de interés sobre la TBM (segundo ligando) forma un enlace disulfuro con el complejo TBM-SME. El proceso puede ser realizado en presencia de un agente reductor de disulfuro, tales como aquellos listados anteriormente . Determinando la afinidad de un ligando candidato (miembro de la biblioteca) por un primero o segundo sitio de interés sobre la TM o TBM, puede ser llevado a cabo mediante la terminación entre diferentes miembros de la biblioteca en un combinado, o mediante comparación (por ejemplo titulación) con un agente reductor, tales como aquellos listados anteriormente. En una modalidad particular, la invención se refiere a un proceso que comprende: (i) poner en contacto una Molécula Biológica Objetivo (TBM) que contiene o que está modificada para contener un nucleófilo en o cerca de un sitio de interés sobre la TBM con un extensor de molécula pequeña que tiene un primer grupo funcional reactivo con el nucleófilo, y que tiene un segundo grupo funcional que es un tiol, tiol protegido o grupo disulfuro reversible, con lo cual se forma un complejo TBM-Extensor de Molécula Pequeña (TBM-SME) ; (ii) poner en contacto el complejo TBM-S E con una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas, cada molécula orgánica pequeña (ligando) tiene un tiol libre, tiol protegido, o un grupo disulfuro reversible, bajo condiciones de intercambio de tiol en donde un miembro de la biblioteca que tiene afinidad sobre el sitio de interés, forma un enlace disulfuro con el complejo TBM-SME, con lo cual se forma un complejo TBM-SME-ligando y (iii) se determina el ligando de (ii) . En otra modalidad particular, la invención se refiere a un proceso que comprende: (i) la provisión de una Molécula Biológica Objetivo (TBM) que contiene o que está modificada para contener un nucleófilo reactivo cerca de un primer sitio de interés sobre la TBM; (ii) poner en contacto la TBM de (i) con un extensor de molécula pequeña que tiene un grupo reactivo con el nucleófilo sobre la TBM y que tiene un tiol libre o tiol protegido; (iii) ajusfar las condiciones para provocar que se forme un enlace covalente entre el nucleófilo sobre la TBM y el grupo sobre el extensor de la molécula pequeña, con lo cual se forma un complejo covalente que comprende la TBM y el extensor de molécula pequeña, mostrando el complejo un tiol libre o tiol protegido cerca de un segundo sitio de interés sobre la TBM; (iv) poner en contacto el complejo de (iii) con una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas, cada molécula tiene un tiol libre o un grupo de enlace al disulfuro intercambiable, bajo condiciones de intercambio de tiol en donde el miembro de biblioteca que tiene la más alta afinidad por el segundo sitio de interés sobre la TBM forma un enlace disulfuro con el complejo; y (v) la identificación del miembro de biblioteca de (iv) . En una modalidad particular, los procesos de la presente invención pueden ser realizados con una biblioteca en la cual cada miembro forma un enlace disulfuro. Un ejemplo de tal biblioteca es uno en el cual cada miembro forma un disulfuro de cisteamina. Cuando los miembros de la biblioteca forman disulfuros, una proporción molar preferida del agente reductor a los disulfuros totales es de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 100:1 y más preferentemente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 50:1. El proceso de traba puede ser realizado mediante la puesta en contacto de los miembros de la biblioteca de disulfuros uno a la vez con la TBM, o en combinados de 2 o más. Cuando se utilizan combinados se prefiere utilizar de 5 a 15 miembros de la biblioteca por combinado.

En todas las modalidades, la identidad de las moléculas pequeñas que se enlazan a la S E y/o a un sitio de interés sobre una TM o TBM puede ser determinada, por ejemplo, por espectrometría de masa (MS), o por medio de un marcador detectable. Cuando la espectrometría de masa es utilizada para detectar el miembro de la biblioteca que se enlaza a una TBM y se utilizan combinados, se prefiere que cada miembro del combinado difiera en peso molecular, preferentemente por aproximadamente 10 Daltones. La identificación puede ser realizada mediante la medición de la masa del complejo TBM-miembro de la biblioteca, o mediante la liberación del miembro de la biblioteca del primer complejo o mediante el uso de un ensayo funcional, por ejemplo, ELISA, ensayo enzimático, etc. En un aspecto diferente, la invención se refiere a una molécula que comprende un primero y/o segundo ligando identificado mediante cualquiera de los métodos discutidos anteriormente. En una modalidad particular, la molécula comprende un primero y un segundo ligandos covalentemente enlazados uno al otro. El enlace covalente puede ser proporcionado mediante cualquier unión covalente, incluyendo pero no limitadas a uniones o puentes disulfuro. En un aspecto adicional, la invención se refiere a los métodos para sintetizar tales moléculas. Las moléculas obtenidas pueden, por supuesto ser adicionalmente modificadas, por ejemplo para impartir propiedades mejoradas, tales como solubilidad, biodisponibilidad, afinidad, y vida media. Por ejemplo, el enlace disulfuro puede ser reemplazado por un ligador que tiene mayor estabilidad bajo condiciones biológicas estándares. Los posibles ligadores incluyen, sin limitación, alcanos, alquenos, aromáticos, heteroaromáticos , éteres y similares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una ilustración esquemática del procedimiento de traba básico para el descubrimiento del ligando dirigido al sitio. Una molécula objetivo, que contiene o está modificada para contener un grupo tiol libre (tal como una proteina que contiene cisteína) es equilibrada con una biblioteca que contiene disulfuro en presencia de un agente reductor, tal como 2-mercaptoetanol . La mayoría de los miembros de la biblioteca tendrán poca o ninguna afinidad intrínseca por la molécula objetivo, y de este modo mediante la acción en masa el equilibrio tenderá hacia la molécula objetivo no modificada. No obstante, si un miembro de la biblioteca no muestra afinidad intrínseca por la molécula objetivo, el equilibrio se desplazará hacia la molécula objetivo modificada, teniendo acoplado a ésta el miembro de la biblioteca con una traba o puente disulfuro . La Figura 2 es una ilustración esquemática del procedimiento de traba extendida estática. En el primer paso, una molécula objetivo que contiene o está modificada para contener un grupo tiol libre (tal como una proteina que contiene cisteina) es modificada por un extensor que contiene tiol, que comprende un grupo reactivo capaz de formar un enlace covalente irreversible con el grupo tiol sobre la molécula objetivo, una porción que tiene afinidad intrínseca por la molécula objetivo, y un grupo tiol. El complejo formado entre la molécula objetivo y el extensor que contiene tiol es luego utilizado para seleccionar una biblioteca de monóforos que contienen disulfuro, para identificar un miembro de la biblioteca que tiene la más alta afinidad de enlace intrínseco por un segundo sitio de enlace sobre la molécula objetivo. LG=ligando; PG-grupo protector; R=grupo reactivo. La Figura 3 ilustra la estrategia traba extendida dinámica, donde el extensor es bifuncional y contiene dos grupos funcionales (usualmente disulfuro) , cada uno capaz de formar enlaces covalentes reversibles. R=grupo reactivo . La Figura 4 ilustra la síntesis química de un extensor específico (éster 3- (2-acetilsulfanil-acetilamino) -4-carboxi-2-oxo-butílico) del ácido 2,6-dicloro-benzoico, como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 5 muestra la comparación estructural entre un inhibidor tetrapeptidico conocido de la Caspasa 3 y un extensor genérico sintetizado con base en el inhibidor. Las Figuras 6A y 6B muestran los espectros de masa de dos experimentos de traba extendida, representativa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN finiciones A no ser que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el que es comúnmente comprendido por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed. , J. Wiley & Sons (New York, NY 1994) , y Marzo, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4a ed. , John Wiley & Sons (New York, NY 1992), le proporcionan a los expertos en la técnica una guía general para muchos de los términos utilizados en la presente solicitud. Una persona de experiencia en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente, los cuales podrían ser utilizados en la práctica de la presente invención. Por supuesto, la presente invención no está de ningún modo limitada a los métodos y materiales descritos. Para fines de la presente invención, los siguientes términos son definidos enseguida. Los términos "objetivo", "Molécula Objetivo", y "TM" son utilizados intercambiablemente y en el sentido más amplio, y se refieren a una entidad química o biológica para la cual un ligando tiene afinidad de enlace intrínseca. El objetivo puede ser una molécula, una porción de una molécula, o un agregado de moléculas. El objetivo es capaz de realizar el enlace reversible a un ligando vía un enlace covalente reversible o irreversible (traba) . Ejemplos específicos de moléculas objetivo incluyen polipéptidos o proteínas (por ejemplo, enzimas, incluyendo proteasas, por ejemplo proteasas de cisteína, serina y aspartilo), receptores, factores de transcripción, ligandos para receptores, factores de crecimiento, cítocinas, inmunoglobulinas , proteínas nucleares, componentes de transducción de señal (por ejemplo, cinasas, fosfatasas), reguladores de enzimas alostéricas, y similares, polinucleótidos , péptidos, carbohidratos, glucoproteíñas , glucolípidos , y otras macromoléculas , tales como complejos ácido nucleico-proteína , cromatina o ribosomas, estructuras que contienen bicapa lipídica, tales como membranas, o estructuras derivadas de membranas, tales como vesículas. La definición incluye específicamente las Moléculas Biológicas Objetivo (TBMs) como se definen más adelante. Una "Molécula Biológica Objetivo" o "TBM" como se utiliza en la presente se refiere a una molécula biológica simple, o una pluralidad de moléculas biológicas capaces de formar un complejo biológicamente relevante con otro más para el cual un agonista o antagonista de molécula pequeña podría tener importancia terapéutica. En una modalidad preferida, la TBM es un polipéptido que comprende dos o más aminoácidos, y que posee o es capaz de ser modificada para poseer un grupo reactivo para enlazarse a miembros de una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas. El término "polinucleótido" , cuando se utiliza en singular o plural, se refiere en general a cual pol irríbonucleótido o polidesoxirribonucleótido, el cual puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. De este modo, por ejemplo, los polinucleót idos como se definen en la presente incluyen, sin limitación, ADN de una sola hebra y de doble hebra, ADN que incluye regiones de una sola hebra y de doble hebra, ARN de una sola hebra y de doble hebra, y ARN que incluye regiones de una sola hebra y de doble hebra, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser de una sola hebra o, más típicamente, de doble hebra o incluyen regiones de una sola hebra y de doble hebra. Además, el término "polinucleótido" como se utiliza en la presente se refiere a las regiones de triple hebra que comprenden ARN o ADN o ARN y ADN. Las hebras en tales regiones pueden ser provenientes de la misma molécula o de diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero pueden involucrar más típicamente .únicamente una región de alguna de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice frecuentemente es un oligonucleótido . El término "polinucleótido" incluye específicamente ADNs y ARNs que contienen una o más bases modificadas. De este modo, los ADNs o ARNs con cadenas principales modificadas para la estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" como ese término es entendido en la presente. Además, los ADNs o ARNs que comprenden bases no usuales tales como inosina, o bases modificadas tales como bases tritiladas, son incluidas dentro del término "polinucleótidos" como se definen en la presente. En general, el término "polinucleótido" abarca todas las formas química, enzimática y/o metabólicamente modificadas de los polinucleótidos no modificados, así como las formas químicas de ADN y ARN características de los virus y células, incluyendo células simples y complejas.

Un "ligando" como se define en la presente, es una entidad que tiene una afinidad de enlace intrínseca para el objetivo. El ligando puede ser una molécula, o una porción de una molécula que se enlaza ai objetivo. Los ligandos son típicamente moléculas orgánicas pequeñas que tienen una afinidad de enlace intrínseca para la molécula objetivo, pero pueden también ser otras moléculas de enlace específico a la secuencia, tales como péptidos (D-, L- o una mezcla de D- y L-), peptidomiméticos , carbohidratos complejos u otros oligómeros de unidades individuales o monómeros que se enlazan específicamente al objetivo. El término "monóforo" se utiliza en la presente intercambiablemente con el término "ligando" y se refiere a una unidad monomérica de un ligando. El término "diáforo" denota dos monóforos covalentemente enlazados para formar una unidad que tiene mayor afinidad por el objetivo debido a las dos unidades de monóforo constituyentes o ligandos que se enlazan a dos sitios separados pero cercanos sobre el objetivo. La afinidad de enlace de un diáforo que es más alta que el producto de las afinidades de los componentes individuales, es denominada como "avidez". El término diáforo es utilizado independientemente de si la unidad está covalentemente enlazada o no al objetivo, o existente separadamente después de su liberación desde el objetivo. El término también incluye diversos derivados y modificaciones que son introducidas con el fin de aumentar el enlace al objetivo. Un "sitio de interés" sobre un objetivo como se utiliza en la presente, es un sitio al cual se enlaza un ligando especifico, el cual puede incluir una secuencia especifica de subunidades monoméricas , por ejemplo residuos de aminoácidos o nucleotidos, y pueden tener una estructura t idimensional. Típicamente, las interacciones moleculares entre el ligando y el sitio de interés sobre el objetivo son no covalentes, e incluyen enlaces de hidrógeno, interacciones de van der aals e interacciones electrostáticas. En el caso del polipéptido, por ejemplo, los objetivos proteicos, el sitio de interés incluye ampliamente los residuos de aminoácidos involucrados en el enlace al objetivo a una molécula con la cual ésta forma un complejo natural in vivo o in vítro. "Moléculas pequeñas" son usualmente menores de peso molecular de 10 kDa, e incluyen pero no están limitadas a compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos, péptidos, (poli ) nucleotidos , ( oligo ) sacáridos y similares. Las moléculas pequeñas incluyen específicamente moléculas orgánicas o inorgánicas no poliméricas, pequeñas (por ejemplo no peptídicas o polipeptídicas ) . Muchas compañías farmacéuticas tienen bibliotecas extensas de tales moléculas, que pueden ser convenientemente seleccionadas mediante el uso del procedimiento de traba extendido de la presente invención. Las moléculas pequeñas preferidas tienen pesos moleculares menores de aproximadamente 300 DA y más preferentemente menores de aproximadamente 650 DA. El término "traba o trabador" como se utiliza en la presente, se refiere a una estructura que incluye una porción capaz de formar un enlace covalente reversible o irreversible con un objetivo (incluyendo Moléculas Biológicas Objetivo como se definió anteriormente en la presente), cerca de un sitio de interés. La frase "Extensor de Molécula Pequeña" (???) como se utiliza en la presente se refiere a una molécula orgánica pequeña que tiene un peso molecular de aproximadamente 75 a aproximadamente 1,500 daltones y que tiene un primer grupo funcional reactivo con un nucleófilo o electrófilo sobre una TM y un segundo grupo funcional reactivo con un ligando candidato o miembro de una biblioteca de ligandos candidatos. Preferentemente, el primer grupo funcional es reactivo con un nucleófilo sobre una TBM (capaz de formar un enlace covalente irreversible o reversible con tal nucleófilo) , y el otro grupo reactivo en el otro extremo del SME es un tiol libre protegido o un grupo que es un precursor de un tiol libre o protegido. En una modalidad, al menos una porción del extensor de molécula pequeña es capaz de formar un enlace no covalente con un primer sitio de interés sobre la TBM (por ejemplo tiene una afinidad inherente por tal primer sitio de interés) . Incluidas dentro de esta definición están las moléculas orgánicas pequeñas (incluyendo no poliméricas) contienen metales tales como cadmio, mercurio y arsénico que pueden formar un enlace con el nucleófilo por ejemplo SH de la TBM. La frase "enlace covalente reversible" como se utiliza en la presente, se refiere a un enlace covalente el cual puede ser roto, preferentemente bajo condiciones que no desnaturalizan el objetivo. Los ejemplos incluyen, sin limitación, disulfuros, bases de Schiff, tioésteres y similares . El término "grupo reactivo" con referencia a un ligando, es utilizado para describir un grupo químico o porción química que proporciona un sitio en el cual puede ser formado el enlace covalente con los ligandos candidatos (por ejemplo, miembros de una biblioteca o compuestos orgánicos pequeños). De este modo, el grupo reactivo es elegido tal que éste es capaz de formar un enlace covalente con los miembros de la biblioteca contra la cual éste es seleccionado . El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier ligando que parcial o completamente bloquea, inhibe o neutraliza una actividad biológica mostrada por un objetivo, tal como una TBM. De una manera similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier ligando que imita una actividad biológica mostrada por un objetivo, tal como una TBM, por ejemplo, mediante el cambio específicamente de la función o expresión de tal TBM, o la eficiencia de señalización a través de tal TBM, con lo cual se altera (incrementa o se inhibe) una actividad biológica existente o se dispara una nueva actividad biológica. Las frases "modificado (a) para contener" y "modi ficado ( ) para poseer" se utilizan intercambiablemente, y se refieren a la elaboración de un mutante, variante o derivado del objetivo, o el nucleófilo o electrófilo reactivo, incluyendo pero no limitadas a las modificaciones químicas. Por ejemplo, en una proteína se puede sustituir un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un nucleófilo o electrófilo por un residuo de tipo silvestre. Otro ejemplo es la conversión del grupo tiol de un residuo de cisteína a un grupo amina. El término "nucleófilo reactivo" como se utiliza en la presente se refiere a un nucleófilo que es capaz de formar un enlace covalente con un grupo funcional compatible sobre otra molécula bajo condiciones que no desnaturalizan o dañan el objetivo, por ejemplo TBM. Los nucleófilos más relevantes son tioles, alcoholes, carbonilos activados, epóxidos, aziridinas, sulfonatos aromáticos, hemiacetales, y aminas. Similarmente, el término "electrófilo reactivo" como se utiliza en la presente se refiere a un electrófilo que es capaz de formar un enlace covalente con un grupo funcional compatible sobre otra molécula, preferentemente bajo condiciones que no desnaturalizan o de otro modo dañan el objetivo, por ejemplo TMB . Los electrófilos más relevantes son iminas, carbonilos, epóxidos, aziridinas, sulfonatos y hemiacetales . Un "primer sitio de interés" sobre un objetivo, por ejemplo TBM se refiere a un sitio que puede ser puesto en contacto con al menos una porción del SME cuando éste está covalentemente enlazado al nucleófilo o electrófilo reactivo. El primer sitio de interés puede, pero no tiene que poseer la habilidad para formar un enlace no covalente con el SME . Las frases "grupo reactivo con el nucleófilo", "grupo que reacciona con el nucleófilo", "grupo reactivo con un electrófilo" y "grupo que reacciona con electrófilo" como se utilizan en la presente, se refieren a un grupo funcional sobre el SME que puede formar un enlace covalente con el nucleófilo/electrófilo sobre la TM, por ejemplo TBM bajo condiciones que no desnaturalizan o de otro modo dañan la TM, por ejemplo TB . El término "tiol protegido" como se utiliza en la presente se refiere a un tiol que se ha hecho reaccionar con un grupo o molécula para formar un enlace covalente que lo hace menos reactivo y el cual puede ser desprotegido para regenerar un tiol libre. La frase "ajuste de las condiciones" como se utiliza en la presente, se refiere a someter un objetivo, tal como una TBM a cualesquiera condiciones de reacción o reactivos individuales, en combinación o en serie necesarios para provocar que se forme un enlace covalente entre el ligando y el objetivo, tal como un nucleófilo y el grupo reactivo con el nucleófilo sobre el SME, o para romper un enlace covalente ya formado. El término "complejo covalente" como se utiliza en la presente, se refiere a la combinación del SME y la TM, por ejemplo, TBM que está covalentemente enlazado a través del nucleófilo/electrófilo sobre la TM, por ejemplo TBM con el grupo reactivo con el nucleófilo/electrófilo sobre el SME, y no covalentemente enlazado a través de una porción del extensor de molécula pequeña y el primer sitio de interés sobre la TM, por ejemplo TBM. La frase "grupo de enlace disulfuro intercambiable" como se utiliza en la presente, se refiere a la biblioteca de moléculas seleccionadas con el complejo covalente que muestra el extensor de molécula pequeña que contiene tiol, donde cada miembro de la biblioteca contiene un grupo disulfuro que puede reaccionar con el tiol o con el tiol protegido mostrado sobre el complejo covalente, para formar un nuevo enlace disulfuro cuando las condiciones de reacción son ajustadas para favorecer tal intercambio de tiol. La frase "la más alta afinidad por el segundo sitio de interés" como se utiliza en la presente, se refiere a la molécula que tiene la mayor estabilidad termodinámica hacia el segundo sitio de interés sobre la TM, por ejemplo TBM que se selecciona preferentemente de la biblioteca de miembros de la biblioteca que contiene disulfuro . "Variantes funcionales" de una molécula en la presente, son variantes que tienen una actividad en común con la molécula de referencia. "Activo" o "actividad" significa una propiedad biológica y/o inmunológica cualitativa. 2. Objetivos Los objetivos, tales como las moléculas biológicas objetivo (TBMs) que encuentran uso en la presente invención incluyen, sin limitación, moléculas, porciones de moléculas y agregados de moléculas a las cuales puede enlazarse un ligando candidato, tales como los polipéptidos o proteínas (por ejemplo, enzimas, receptores, factores de la transcripción, ligandos para los receptores, factores de crecimiento, inmunoglobulinas , proteínas nucleares, componentes de transducción de señales, reguladores de enzimas alostéricas, y similares), polinucleótidos , péptidos, carbohidratos, glucoproteíñas , glucolípidos , y otras macromoléculas , tales como complejos de ácido nucleico-proteína , cromatina o ribosomas, estructuras que contienen capas lipídicas, tales como membranas, o estructuras derivadas de las membranas, tales como vesículas. El objetivo puede ser obtenido en una variedad de formas, incluyendo aislamiento y purificación a partir de una fuente natural, síntesis química, producción recombinante y cualquier combinación de éstos y métodos similares . Las familias objetivo de enzimas, preferidas son proteasas de cisteína, aspartil-proteasas , proteasas de serina, metaloproteasas , cinasas, fosfatasas, polimerasas e integrasas. Los objetivos proteína : proteína preferidos son citocinas tetrahelicoidales , citocinas triméricas, módulos de señalización, factores de t anscripción y quimiocinas . En una modalidad particularmente preferida, el objetivo es una TBM, y aún más preferentemente es un polipéptido, especialmente una proteína. Los polipéptidos , incluyendo proteínas, que encuentran uso en la presente como objetivos para enlazarse a los ligandos, preferentemente ligandos de molécula orgánica pequeña, incluyen virtualmente cualquier polipéptido (incluyendo polipéptidos cortos también denominados como péptidos) o proteína que comprende dos o más sitios de enlace de interés, y que posee o es capaz de ser modificada para poseer un grupo reactivo para enlazarse a una molécula orgánica pequeña o a otro ligando (por ejemplo péptido) . Los polipéptidos de interés pueden ser obtenidos comercíalmente , recombinantemente , mediante síntesis química, mediante purificación a partir de una fuente natural, o de otro modo y, para la mayoría de las partes son proteínas, particularmente proteínas asociadas con una enfermedad o condición humana específica, tales como las proteínas de la superficie celular y de los receptores solubles, tales como receptores de linfocitos de la superficie celular, enzimas, tales como proteasas (por ejemplo, serina, cisterna, y aspartil-proteasas) y timidilato-sintetasa, receptores de esteroides, proteínas nucleares, enzimas alostéricas, factores de la coagulación, cinasas (de serina y treonina) y desfosforilasas (o fosfatasas, ya sea fosfatasas de serina/t reonina o de proteína tirosina, por ejemplo PTP's, especialmente PTP1B), enzimas bacterianas, enzimas fúngicas y enzimas virales (especialmente aquellas asociadas con VIH, influenza, el rinovirus y RSV) , moléculas de transducción de señales, factores de transcripción, proteínas o enzimas asociadas con la síntesis o degradación de ADN y/o ARN, inmunoglobulinas , hormonas, receptores para diversas citocmas incluyendo, por ejemplo, eritropoyetina (EPO) , receptor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , receptor de estimulación de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF) , trombopoyetina (TPO) , interleucinas , por ejemplo IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-11, IL-12, hormona del crecimiento, prolactina, lactógeno placentario humano (LPL) , CNTF, oncostatina, diversas quimiocinas y sus receptores, tales como RANTES ???ß? IL-8, diversos ligandos y receptores para la tirosina-cinasa , tales como insulina, factor de crecimiento 1 similar a insulina (IGF-1), factor de crecimiento epidérmico (EGF) , herregulina-a y herregulina- , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento placentario (PLGF), factores de crecimiento tisular (TGF-a y TGF-ß) , factor de crecimiento nervioso (NGF) , diversas neurotrof inas y sus ligandos, otras hormonas y receptores tales como, factores morfogénicos óseos, hormona estimulante del folículo (FSH), y hormona luteinizante (LH), hormonas triméricas incluyendo factor de necrosis tisular (TNF) y el ligando CD40, factor 1 y 2 de la apoptosis (AP-1 y AP-2), p53, bax/bcl2, mdm2, caspasas, y proteínas y receptores que comparten 20% o más de identidad secuencial a éstas. Un grupo importante de objetivos de la inflamación humana y de inmunologia incluye: IgE/IgER, ZAP-70, lck, syk, ITK/BTK, TACE, Cathepsin S y F, CDlla, LFA/ICAM, VLA-4, CD28/B7, CTLA4, TNF alfa y beta, (y los receptores de TNF p55 y p75), CD40L, p38 map cinasa, IL-2, IL-4, IL-13, IL-15, Rae 2, PKC theta, IL-8, TAK-1, jnk, IKK2 e IL-18. Otros objetivos específicos importantes incluyen: las caspasas 1, 3, 8 y 9, IL- 1 /receptor de IL-1, BACE, integrasa del VIH, PDE IV, helicasa de la Hepatitis C, proteasa de la Hepatitis C, proteasa de rinovirus, triptasa, cPLA (fosfolipasa citosólica A2 ) , CDK4, cinasa c-jun, adaptadores tales como Grb2, GSK-3, A T, MEKK-1, PAK-1, raf, TRAF's 1-6, Tie2, ErbB 1 y 2, FGF, PDGF, PARP, CD2 , receptor C5a, CD4, CD26, CD3, TGF-alfa, NF-kB, IKK beta, STAT 6, Neurocinina-l, PTP-1B, CD45, Cdc25A, SHIP-2, TC-PTP, PTP-alf , LAR y p53 humano, bax/bcl2 y mdm2. El objetivo, por ejemplo una TBM de interés será elegido tal que posea o sea modificada para poseer un grupo reactivo capaz de formar un enlace covalente reversible o irreversible con un ligando que tiene afinidad intrínseca por un sitio de interés sobre el objetivo. Por ejemplo, muchos objetivos poseen de manera natural grupos reactivos (por ejemplo grupos amina, tiol, aldehido, cetona, hidroxilo, y similares) a cuyos ligandos, tales como los miembros de una biblioteca de molécula orgánica pequeña, pueden enlazarse covalentemente. Por ejemplo, los polipéptidos a menudo tienen aminoácidos con cadenas laterales químicamente reactivas (por ejemplo, cisteína, lisina, arginina y similares). Adicionalmente , la tecnología sintética actualmente permite la síntesis de moléculas biológicas objetivo utilizando, por ejemplo, sintetizadores automáticos de péptido o ácido nucleico, que poseen grupos químicamente reactivos en sitios predeterminados de interés. Como tal, un grupo químicamente reactivo puede ser sintéticamente introducido dentro del objetivo, por ejemplo una TBM, durante la síntesis automatizada. En una modalidad particular, el objetivo comprende al menos un primer grupo reactivo el cual, si el objetivo es un polipéptido puede o no ser asociado con un residuo de cisteína de ese polipéptido, y preferentemente está asociado con un residuo de cisteína del polipéptido, si el trabador elegido es un grupo tiol libre o protegido (ver más adelante) . El objetivo contiene preferentemente, o está modificado para contener, únicamente un número limitado de grupos tiol libres o protegidos, preferentemente no más de aproximadamente 5 grupos tiol, más preferentemente no más de aproximadamente 2 grupos tiol, más preferentemente no más de un grupo tiol, aunque los polipéptidos que tienen más grupos tiol libres encontrarán también uso. El objetivo, tal como TB , de interés puede ser inicialmente obtenido o seleccionado tal que éste posea ya el número deseado de grupos tiol, o pueda ser modificado para poseer el número deseado de grupos tiol . Cuando el objetivo es un polinucleótido, una traba o trabador puede, por ejemplo, estar acoplado a los polinucleótidos sobre una base en cualquier amina exociclica o cualquier carbono vinilico, tal como la posición 5 ó 6 de las pirimidinas, las posiciones 8 ó 2 de las purinas, en los carbonos 5' ó 3', en la cadena principal de fosfato de azúcar, o en los átomos de fósforo internucleótidos . No obstante, un trabador puede ser introducido también en otras posiciones, tal como en la posición 5 de la tímidina o el uracilo. En el caso de un ADN de doble hebra, por ejemplo, un trabador puede estar localizado en una muesca o ranura mayor o menor, cercana al sitio de interés, pero no tan cercana como para dar como resultado impedimento esférico, el cual puede interferir con el enlace del ligando al objetivo en el sitio de interés.

Aquellos expertos en la técnica están bien enterados de diversas técnicas recombinantes , químicas, de síntesis y/u otras técnicas que pueden ser rutinariamente empleadas para modificar un objetivo, por ejemplo un polipéptido de interés tal que éste posea un número deseado de grupos tiol libres que estén disponibles para el enlace covalente a un ligando candidato que comprende un grupo tiol libre. Tales técnicas incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio de la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido objetivo, tal que éste codifica para un polipéptido con un número diferente de residuos de cisteína. Particularmente preferida es la mutagénesis dirigida al sitio utilizando la amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,683,195 expedida el 28 de julio de 1987; y Current Protocols In Molecular Biology, Capítulo 15 (Ausubel et al., ed., 1991). Otras técnicas de mutagénesis dirigida al sitio son también bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en las siguientes publicaciones: Ausubel et al., supra, Capítulo 8; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición (Sambrook et al., 1989); Zoller et al., Methods Enzymol . 100: 468-500 (1983); Zoller & Smith, ADN 3: 479-488 (1984); Zoller et al., Nucí. Acids Res., 10: 6487 (1987); Brake et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 81: 4642- 4646 (1984); Botstein et al., Science 229: 1193 (1985); Kunkel ete al., Methods Enzymol. 154: 367-82 (1987), Adelman et al . , DNA 2: 183 (1983); y Cárter et al., Nucí . Acids Res. 13: 4331 (1986) . Mutagénesis de cásete (Wells et al., Gene 34: 315

[1985]), y mutagénesis de selección de restricción (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415

[1986]) pueden también ser utilizadas. Las variantes de la secuencia de aminoácidos con más de una sustitución de aminoácidos pueden ser generadas en una de varias formas. Si los aminoácidos están localizados muy juntos en la cadena polipeptidica , éstos pueden ser mutados simultáneamente, utilizando un oligonucleótido que codifica para todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. No obstante, si los aminoácidos están localizados a cierta distancia uno del otro (por ejemplo separados por más de diez aminoácidos), es más difícil general un oligonucleótido simple que codifique para todos los cambios deseados. En vez de esto, puede ser empleado uno de los dos métodos alternativos. En el primer método, es generado un oligonucleótido separado para cada aminoácido que va a ser sustituido. Los oligonucleótidos son luego recocidos al ADN plantilla de una sola hebra simultáneamente, y la segunda hebra de ADN que es sintetizada a partir de la plantilla codificará para todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. El método alternativo involucra dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. Las fuentes de nuevos grupos reactivos, por ejemplo cisteinas pueden ser colocadas en cualquier sitio dentro del objetivo. Por ejemplo, si una cisteína es introducida sobre de la superficie de la proteina en un área que se sabe es importante para las interacciones proteina-proteina, pueden ser seleccionadas moléculas pequeñas que se enlazan a y bloquean esta superficie. Las siguientes tablas ejemplifican las moléculas biológicas objetivo (TBM's) que pueden ser utilizadas de acuerdo con la presente invención.

Tablas de Objetivos Inmunología Indicaciones IL-6 Inflamación B7/CD28 Rechazo de injerto CD4 Inmunosupres ión CD3 Inmunosupresión CD2 Transplante Renal c-maf Inflamación/ Inmunosupresión CDlla/LFAl (ICAM) Inmunosupres ión/ Inflamación Enzimas Indicaciones Fosfolipasa A2 Inflamación ZAP-70 Inmunosupres ión Fos fodiesterasa IV Asma Enzima de conversión de Inflamación interleucina (ICE) Deshidrogenasa del Enfermedades autoinmunes monofosfato de inosina Triptasa Psoriasis /asma CDK4 Cáncer mTOR Inmunosupres ión PARP (vía de muerte celular) Apople ia Fosfatasas Cáncer Raf Cáncer JNK3 Neurodegeneración MEK Cáncer GSK-3 Diabetes FABI (biosintesis de ácidos Bacterianas grasos ) FABH (biosintesis de ácidos Bacterianas grasos ) BACE Alzheimer ' s Ligasa de I kB-ubiquitina Inflamación/diabetes Acetiltransferasa del ácido lisofosfatidico CD26 (dipeptidil-peptidasa IV) Akt Enzima de conversión de TNF Inflamación Objetivos Proteina-Proteina Indicaciones Receptores de ErbB Cáncer Neurocinina 1 Inflamación, Migraña IL-9 Asma FGF Angiogénesis PDGF Angiogénesis TIE2 Angiogénesis Dimerización de NFB Inflamación Factor tisular/Factor VII Enfermedad Cardiovascular Selectinas Inflamación TGF-a Angiogénesis Angiopoyetina I Angiogénesis APAF-l/Caspasa 9 CARD Apople ía Bcl-2 Cáncer 7 -Transmembranal Indicaciones IL-8 Apoplejía, inflamación Rantes Inflamación, Migraña Receptores de Quimiocina CC Asma GPR14 /Urotensina Angiogénesis Orexina/Receptor Apetito Receptor de C5a Sepsis/enfermedad de Crohn Receptor H3 de Histamina Alergia CCR5 Acoplamiento del VIH Ob etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina BACE 1F N GB Hong, L. Et al., Science. AAF13715 290 (5489) : 150-3 (2000) Caspasa 1 1BMQ SWS Okamoto, Y., et al., Chem P29466 Pharm Buil (Tokio), 47(1) :11- 21 (1999) . Caspasa 4 ninguna SWS NA P49662 Caspasa 5 ninguna SWS NA P51878 Caspasa 3 ICP3 SWS Mittl, PR., et al., J. Biol. P42574 Chem, 272(10) ; 6539-47(1997) Caspasa 8 1I4E, SWS Xu, G. , et al . , Nature, 1QTN P08160; 410 (6827) : 494-7 (2001) . GB BAB32555 Caspasa 9 3YGS SWS Qin, H.r et al., Nature, P55211 399 (6736) : 549-57 (1999) . RHV Prot 1CQQ SWS Matthews, D. , et al., 96(20) : P04936 11000-7 (1999) . Catepsina 1MEM SWS McGrath, ME, et al., Nat K P43235 Struct Biol, 4(2) : 105-(1997) Ob etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina Catepsina 1BXF SWS Fengler, A., et al., Protein ? (modelo ) P25774 Engl. 11(11): 1007-13 (1998) Triptasa 1A0L SWS Pereira, P. J. et al., Nature, P20231 392 (6673) : 306-11 (1998) . HCV Prot 1A1R, SWS Di Marco, et al . , J Biol . 1DY9 Q81755 Chem. 275(10): 7152-7 (2000).

CD26 ninguna SWS NA P27487 TACE 1BKC GB U69612 Maskos, K., et al., ?NAS, 95 (7) : 3408-12 (1998) . ZAP-70 Ninguna SWS 43403 NA p38 MAP 1P38 SWS Wang, Z., et al., PNAS, 94(6): P47811 2327-32 (1997) . CDK-4 ninguna SWS NA Q9XTB6 c- un NA SWS NA cinasa P45983 (C-Jun Cinasa-1 ) Objetivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina NA SWS NA P45984 (C-Jun Cinasa-2 ) 1JNK SWS NA P53779 (C-Jun Cinasa-3) GSK-3 NA SWS NA P49840 (GSK-3A) NA SWS NA P49841 (GSK-3B) A T ninguna SWS NA P31749 MEK ninguna SWS NA Q02750 Raf ninguna SWS NA P04049 TIE-2 ninguna SWS NA Q02763 O j etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina ILK ninguna SWS NA Q13418 IkB NA SWS NA 015111 ( IKappaB Cinasa ) NA SWS NA 014920 (IKappB Beta) Jakl ninguna SWS NA P23458 Jak2 ninguna SWS NA 060674 Jak3 Ninguna SWS NA P52333 Tyk2 Ninguna SWS NA P29597 EGF Ver Vasc. NA cinasa Cbj etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina Endo, Receptor de factor de desarrollo (VEGFR) y EGRF ambos con actividad de tirosina- c iñasa ( siguiente ) VEGFR2 / NA SWS NA KDR P35968 cinasa EGFR NA SWS NA P00533 TC-PTP NA SWS NA; proteina de tirosina- P17706 fosfatasa de células T CDC25A NA SWS NA P30304 Obj etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina CDC25A NA GB 014757 NA CDK (CHK1) CD45 NA SWS NA P08575 PTP alfa NA SWS NA P18433 pol III NA SWS NA; polimerasa III de ARN (PolRIIIA) P014802 dirigido al ADN Ligasa NA GB 014802 NA mur-D (E. coli) NA SWS NA P14900 ( E . Coli) SHP NA SWS NA Q15466 PTP-IB 1PTP SWS Finer-Moore ; JS, et al., P00760 Proteins, 12(3) :203-22 (1992) . ????-2 ninguna SWS NA Q9R1V2 MEKK-1 NA SWS NA 013233 Obj etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina PAK-1 NA SWS NA Q13153 ICAM-1 NA SWS Bella, J., et al., Proc Nati P05362 Acad Sci EUA, 95(8) : 4140-5 (1998) . CD11A/ NA S S Qu, A., et al . , Proc natl Acad LFA-1 P20701 Sci EUA, 99 (22) : 10277-81 (1995) . TAF-1 NO SEGURO NO SEGURO NO SEGURO (ver más adelante ) 1JNK SWS NA; Factor de Activación Q99142 tumoral del tabaco (¿? Prot. Tobaco) NA GB NA; Factor de adhesión AAB30018 derivado del tumor NA GB D45198 NA; Factor de activación templado HIV- 1BL3 SWS Maignan, S., et al., J Mol integrasa (2.0) P12497 Biol., 282(2) : 359-68 (1998) O etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina 1EXQ S S Chen, J. C-H., et al., PNAS P04585 EUA, 97 (15) : 8233-8 (2000) . NA SWS NA 056380 1HYZ S S Molteni, V., et al., Acta C56381; Crystallogr GB AAC37875 D Bio Crystallog., 57: 536-44 (2001) 1HYV GB Molteni, V., et al., Acta AAC37875 Crystallogr D Biol. Crystallogr, 57 (Pt 4): 536-44 (2001) . NA. S S NA 056382 NA SWS NA 056383 NA SWS NA 056384 NA SWS NA 056385 Objetivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina HCV- 1N13, SWS Q81755 Di Marco, S., et al., J Helicasa 1DY9, (1DY9) Biol. Chem., 275(10): 7152- otros (Integrasa) 7 (2000) 1HEI SWS P2664 Yao, N . , et al., Nat Struct (Helicasa ) Biol. , 4(6): 463-7 (1997) .

Inf1. 1A4G; SWS P27907 Taylor, . , et al., J Med Neuraminidasa muchos Chem, 41(6) : 798-807 (1998) .

PDE-IV 1FOJ SWS Q07343 Xu, R. X., et al., Science., (PDE4B2B) 288 (5472) : 1822-5 (2000) . cPLA-2 1CJY SWS P47712 Dessen. A., et al., Cell., 97 (3) : 349-60 (1999) . IL-2 NA (en SWS P01585 NA casa ) IL-4 IHIK SWS P05112 Muí1er, T., et al., J Mol (apo) (2.60) Biol. 247 (2) : 360-72 (1995) . 1IAR SWS P05112 Hage, T . , et al . , Cell . , ( complej o ) (2.30) ** 97 (2) : 271-81 (1999) IL-4R 1IAR SWS P24394 Hage, T . , et al . , Cell . , 97 (2) : 271-81 (1999) .

Obj et ivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina IL-5 1HUL SWS P05113 Milburn, M.V., et al., Nature, 363 (6425): 172-6 (1993) . IL-6 1I1R GB Chow, D., et al., Science, (viral AAB62676 291 (5511) : 2150-5 (2001) IL6) (2.6) IALU SWS P05231 Somers, W., et al., EMBO J, (1.9) 16(5) : 989-97 (1997) . IL-7 1IL7 SWS P13232 Cosenza, L., et al., Protein (modelo ) Sci. , 9(5) : 916-26 (2000) IL-9 ninguna SWS P15248 NA IL-13 1GA3 SWS P35225 NA (NMR) TNF 1TNF SWS P01375 Eck, MJ, et al . , J Biol (TNF-alfa) Chem, 264(29)17595-605 (1989) . CD-40L 1ALY SWS P29965 Karpusas, M. , t al., Structure, 3 (12) : 1426 (1995) OPGL ninguna SWS 014788 NA BAFF ninguna SWS Q9Y275 NA O etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina TRAIL 1DG6 GB Hymowitz, S.G., et al., (1.30) AAC50332 Biochemistry, 39(4) : 633-40 (2000) IDU3 SWS Cha SS, et al . , J Biol . (2.2) P50591; GB Chem, 275(40) : 31171-7 AAC50332 (2000) 1D2Q GB Cha y Oh, Immunity, 11(2) : AAC50332 253-61 (1999) . IL-1 NA SWS P01584 NA (IL-1 B citocina ) IL-1 1G0Y SWS P14778 Vigers, GPA, et al., J Biol. Chem. , 275(47) ; 36927-33 (2000) IL-8 1QE6 SWS P10145 Gerber , N . , et al . , Proteins, 38(4) : 361-7 (2000) RANTES-R NA SWS P32246 NA RANTES NA GB NA XP_035842 NA SWS P13501 NA; (proteina RANTES específica de células T) O j etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina MCP-1 NA SWS Q14805 NA; (proteina cromosomal de metafase ) MCP-1 1D0K SWS P13500 Lubowski, J. , et al., Nat Struct Biol. , 41(1): 64-9 (1997) . MCP-3 NA SWS P80098 Nat Struct Biol. 4(1): 64-9 (1997) TRAF-A NA SWS Q13077 NA (TRAF-1?) (TRAF-1) TRAF-B NA SWS Q12933 NA ( TRAF-2 ? ) (TRAF-2) 1D00 GB S56163 Ye, H., et al., Mol Cell, (TRAF-2) (TRAF-2) 4(3): 321-30 (1999) . (2.0) TRAF-C NA SWS Q13114 NA ( TRAF-3 ? ) (TRAF-3) TRAF-D NA GB NA (TRAF-4?) XP_008483 (TRAF-4) TRAF-E NA GB NA (TRAF-5?) XP_010656 (TRAF-5) Obj etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina VEGF 1FLT SWS P15692 Wiesmann, C, et al., Cell. 91 (5) : 695-704 (1997) Mineral NA S S P08235 NA Corticoide R. Receptor 3ERD SWS P03372 Shiau, A. K. , Barstad, D., de Loria, P.M., Cheng, L., Estrógeno Kushner, P. J. , Agard, D.A., Greene, G.L. , Cell, 95(7) : 927-37 (1998) Rec . 1A28 SWS P06401 Williams, S.P., Sigier, progeste- P.B. , Nature, 393 (6683) : rona 392-6 (1998) NF-kappa- SWS P19838 B-l p53 NA SWS P04637 Y1CQ GB Kussie, P.H., et al., AAA59989 Science, 74(5289) : 948-53 (2.3) (1996) . MDM2 1YCR SWS Q00987 Kussie, P.H., et al., Science, 74(5289) : 948-53 (1996) .

Obj etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina STAT6 NA SWS P42226 NA IL4R-alfa NA SWS P24394 NA IL6R-alfa NA SWS P08887 NA Cadena de IBQU SWS P40189 Bravo, J., Staunton, D., IL6R-beta Health, J.K., Jones, E.Y., EMBO J, 17 (6) : 1665-74 (1998) . IL5R-alfa NA SWS Q01344 NA IL7R NA SWS P16871 NA IL2R-alfa NA SWS P01589 NA IL2R-beta NA SWS P14784 NA HIV GP41 1AIK SWS P19551 Chan, D.C. , Fass, D. , Berger, J.M., Kim, P.S., Cell, 89(2) : 263-73 (1997) .

HIV GP41 1AIK SWS P04582 Chan, D.C, Fass, D. Berger, J.M. , Kim, P.S. , Cell, 89 () : 263-73 (1997) . IV GP41 SWS P03378 IV GP41 SWS P03375 IV GP41 SWS P04582 IV GP41 SWS P12488 IV GP41 SWS P03377 O j etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina V GP41 SWS P05879 V GP41 SWS P04581 V GP41 SWS P04578 V GP41 SWS P04624 V GP41 SWS P12489 V GP41 SWS P20871 V GP41 SWS P31819 V GP41 SWS Q70626 V GP41 SWS P04583 V GP 41 SWS P19551 V GP41 SWS P05577 V GP41 SWS P18799 V GP41 SWS P20888 V GP41 SWS P03376 V GP41 SWS P04579 V GP41 SWS P19550 V GP41 SWS P19549 V GP41 SWS P05878 V GP41 SWS P31872 V GP41 SWS P05880 V GP41 SWS P35961 V GP41 SWS P12487 Ob et ivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina HIV GP41 SWS P04580 HIV GP41 SWS P05882 HIV GP41 SWS P05881 HIV GP41 SWS P18094 HIV GP 41 SWS P24105 HIV GP41 SWS P17755 HIV GP41 SWS P15831 HIV GP41 SWS P18040 HIV GP41 SWS Q74126 HIV GP41 SWS P05883 HIV GP41 SWS P04577 HIV GP41 SWS P32536 HIV GP41 SWS P12449 HIV GP41 SWS P20872 c-mal NA GB NA; proteina de NP 071884 diferenciación de células T NA GB NA CAA54102 NA GB NA XP 017128 Mal NA SWS P21145 NA; PROTEÍNA DE ASOCIACIÓN DE MADURACIÓN DE T-LINFOCITO Obj etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina NA SWS P01732 NA; ANTÍGENO T8/CD8(¿) DE DIFERENCIACIÓN DE T- LINFOCITO Her-1 NA S S P34704 NA; Cell Signaling in C. elegans Sex Determination Her-2 NA SWS Q04626 NA; RECEPTOR DE LA PROTEÍNA TIROSINA-CINASA ERBB-2 E2F-1 NA SWS Q01094 NA E2F-2 NA SWS Q14209 NA E2F-3 NA SWS 000716 NA E2F-4 NA SWS Q16254 NA E2F-5 NA SWS Q15329 NA E2F-6 A SWS 075461 NA Ciclina A 1QMZ SWS P20248 Brown, N.R., et al., Nat Cell Biol. , 1(7): 438-43 (1999) . mTOR/ FRAP 1NSG SWS P42345 Liang, J., et al . , Acta Crystal D Biol. Crystall, 55 (Pt4); 736-44 (1995) Survivina 1F3H SWS 015392 Verdecía, M.A., et al., Nat Struct Biol. , 7(7): 602-8 (2000) Obj etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina FGF-1 1EV2 SWS P05230 Plotnikov, A.N., et al., Cell. , 101 (4) : 413-24 (2000) . (Heparin Bmding Gro th Factor) . Basic FGF 1 GK S S P11362 Mohammadi, M., et al., Rec . 1 Cell. , 86(4) : 577-87 (1996) . (Basic FGF Rec. 1) FGF-2 ICVS SWS P09038 Plotnikov, A.N. et al., Cell, 98(5) : 641-50 (1999) .

FGF-3 NA SWS P11487 NA FGF-4 NA SWS P08620 NA FGF-5 NA SWS P12034 NA FGF-6 NA SWS P10767 NA FGF-7 NA SWS P21781 NA FGF-8 NA SWS P55075 NA FGF-9 1IHK SWS P31371 Plotnikov, A.N., et al . , J Biol. C em., 276(6) : 4322-9 (2001) PARP NA SWS P09874 NA PDGF-alfa NA SWS P04085 NA PDGF-beta NA SWS P01127 NA Receptor C5a NA SWS P21730 NA Ob etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina CCR5 NA S S P51681 NA (CC Cherno R-V) GPR14 / NA SWS Q9UKP6 NA Urotensina IIR) Factor 2HFT SWS P13726 Muller, Y. A., et al., J Mol tisular Biol. , 256(1) : 144-59 (1996) Factor VII 1JBU SWS P08709 Eigenbrot, C, et al., Structure, 9:627 (2001) Histamina H3 NA GB NA rec . CAC39434 Keurocinina- NA GB SPHUB NA 1 Receptor 1 NA SWS 043613 NA de orexina Receptor 2 NA SWW 043614 NA de orexina Cadena delta NA SWS P04234 NA de CD-3 O etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina Cadena NA SWS P07766 NA epsilon de CD-3 Cadena gamma NA SWS P09693 NA CD-3 Cadena zeta NA SWS P20963 NA de CD-3 CD-4 1CDJ SWS P01730 Wu, H., et al., proc natl Acad Sci EUA, 93(26): 15030- 5 (1996) . TGF-alfa NA SWS P01135 NA TGF-beta-1 NA SWS P01137 NA TFG-beta-2 NA SWS P08112 NA TFG-beta-3 NA SWS P10600 NA TGF-beta-4 NA SWS 000292 NA GRB-2 1GRI SWS P29354 aignan S. et al., Science, (3.1) 268 (5208) : 291-3 (1995) . IZFP SWS P29354 Rahuel, J., et al., J Mol (1.8) Biol, 279 (4) : 1013-22 1BMB SWS P29354 Ettmayer, P., et al., J Med (1.8) Chem 42(6): 971-80 (1999) Obj etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina LCK ILKK SWS Tong, L. , et al., J Mol P06239; Biol, 256(3) : 601-10 (1996) . (2nd = P07100) S C 2SRC SWS P12931 Xu, W., et al., Mol Cell., 3(5) : 629-38 (1999) . T AFs? NA SWS Q13077 NA (TRAF-1 ) (2.7) 1CZZ GB S56163 Ye, H. , et al . , Mol Cell, ( TRAF- (TRAF-2) 4(3) : 321-30 (1999) 2) (2.7) 1CZY GB S56163 Ye, H. , et al . , Mol Cell, (TRAF- (TRAF-2) 4(3) : 321-30 (1999) 2) (2.0) 1D00 GB S56163 Ye, H. , et al . , Mol Cell, (TRAF- (TRAF-2) (3) : 321-30 (1999) 2) (2.0) NA SWS Q12933 NA (TRAF-2) Objetivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina 1FLK GB Q13114 Ni, C.Z., et al., Proc Nati (TRAF- (TRAF-3) Acad SCi EUA, 97(19): 10395- 3) (2.8) 9 (2000) BAX/BCL-2 NA SWS Q07812 NA (BAX alfa) NA SWS Q07814 NA (BAX beta) NA SWS Q07815 NA (BAX gamma) NA SWS P55269 NA (BAX delta) NA SWS P10415 NA (BCL-2) IgE IF6A SWS P01854 Garman, S.C., et al., T.S., (3.5) (cadena C Nature., 406(6793): 259-66 de IgE) (2000) . IgER NA SWS P06734 NA (Receptor Fe de IgE) Obj etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina 1F6A SWS P12319 Garman, S.C., et al., T.S., (3.5) (Rec. FC Nature., 406(6793): 259-66 alfa de (2000) . igE) 1F2Q SWS P12319 Garman, S.C., Kinet, J.P., (2.4) (Rec. FC Jardetzky, T . ? . , Cell, alfa de 95 (7) : 951-61 (1998) . igE) NA SWS Q01362 NA (Rec. FC beta de IgE) NA SWS P30273 NA (Rec. FC gamma de IgE) Proteasa de NA SWS P03303 NA Rhinovirus (HRV-14 polyprot . ) NA SWS P12916 NA (HRV-1B) Obj etivo Códigos No . de Ref. de la Estructura PDB Acceso Cristalina ICQQ S S P04936 Matthews, D., et al . , Proc (HRV-2 ) Nati Acad Sci EUA, 96(20): (1.85) 11000-7 (1999) . NA SWS P07210 NA (HRV-89) IC8M SWS Q8122 C akravarty, S., et al . , (HRV-16) para ser publicada B7/ CD28LG 1DR9 SWS P33681 Ikemizu, S . , et al . , /CD80 Immunity, 2000 Jan; 12(1): 51-60. CD28 NA SWS P10747 NA APAF1 NA SWS 014727 NA 3. Sitio(s) de Interés Ampliamente, el "sitio de interés" sobre un objetivo particular, tal como una Molécula Biológica Objetivo (TBM) es definido por los residuos que están involucrados en el enlace del objetivo a una molécula con la cual ésta forma un complejo natural in vivo o in vitro. Si el objetivo es un péptido, polipéptido o proteina, el sitio de interés es definido por los residuos de aminoácidos que participan en el enlace a (usualmente mediante asociación no covalente) a un ligando del obj et ivo . Cuando, por ejemplo, la molécula biológica objetivo es una proteina que ejerce su efecto biológico a través del enlace a otra proteina, tal como con hormonas, citocínas u otras proteínas involucradas en la señalización, ésta puede formar un complejo natural in vivo con una o más de otras proteínas. En este caso, el sitio de interés es definido como los residuos de contacto críticos involucrados en una interfase particular de enlace proteína : proteína . Los residuos de contacto críticos son definidos como aquellos aminoácidos sobre la proteína A que hace contacto directo con los aminoácidos sobre la proteína B, y cuando son mutados a alanina disminuyen la afinidad de enlace por al menos 10 veces y preferentemente por al menos 20 veces, como es medido con un ensayo de enlace directo o ensayo de competencia (por ejemplo ELISA o RIA) . Ver (A Hot Spot of Binding Energy en a Hormone-Receptor Interface by Clackston and Wells Science 267: 383-386 (1995) y Cunningham and Wells J. Mol. Biol. 234: 554-563 (1993)) . También incluidos en la definición de un sitio de interés están los residuos de aminoácidos provenientes de la proteína B, que están dentro de aproximadamente 4 ángstroms de los residuos de contacto crítico identificados en la proteína A. El análisis de exploración de aminoácidos puede ser empleado para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración preferidos están los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo, debido a que ésta elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)) . La alanina es también típicamente preferida debido a que ésta es el aminoácido más común. Además, ésta es encontrada frecuentemente en posiciones enterradas y expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N . Y . ) ; Chothía, J. Mol. Biol . 150:1 (1976)). Si la sustitución de la alanina no produce cantidades adecuadas de la variante, se puede utilizar un aminoácido isostérico. Cuando la molécula biológica objetivo es una enzima, el sitio de interés puede incluir aminoácidos que hacen contacto con, o yacen dentro de, aproximadamente 4 ángstroms de un sustrato enlazado, inhibidor, activador, cofactor o modulador alostérico de la enzima. A manera de ilustración, cuando la enzima es una proteasa, el sitio de interés podría incluir el canal de enlace al sustrato desde P4 a P4', los residuos involucrados en la función catalítica (por ejemplo la tríada catalítica) y cualquier sitio de enlace al cofactor (por ejemplo Zinc) . Para las cinasas de proteína, el sitio de interés podría incluir el canal de enlace al sustrato (como se explicó anteriormente) además del sitio de enlace al ATP. Para las deshidrogenasas, el sitio de interés podría incluir la región de enlace al sustrato así como el sitio ocupado por la NAD/NADH. En hidrolasas tales como PDE4 , el sitio de interés podría incluir todos los residuos que hacen contacto con el sustrato de cAMP, así como los residuos involucrados en el enlace de los cationes divalentes catalíticos (Xu, R. X. et al. Science 288: 1822-1825 (2000) ) . Para una enzima alostéricamente regulada, tal como la glucógeno-fosforilasa B, el sitio de interés incluye todos los residuos en la región de enlace al sustrato, los residuos en contacto con el inhibidor alostérico natural glucosa-6-fosfato, y residuos en nuevos sitios alostéricos, tales como aquellos identificados en el enlace de otros inhibidores tales como CP320626 (Oikonomakos NG, et al. Structure Fold Des 8: 575-584 (2000)) . Las TBM' s contienen, o son modificadas para contener, un residuo reactivo en o cerca de un sitio de interés. Preferentemente, las TBM' s contienen o son modificadas para contener un residuo de aminoácido que contiene tiol, en o cerca de un sitio de interés. En este caso, después de que se selecciona una TBM, el sitio de interés es calculado. Una vez que es conocido el sitio de interés, se emprende un proceso para determinar cuál residuo de aminoácido dentro, o cerca del sitio de interés hay que modificar. Por ejemplo, una modificación preferida da como resultado la sustitución de un residuo de cisteina por otro residuo de aminoácido localizado cerca del sitio de interés . La elección de cuál residuo dentro, o cerca del sitio de interés hay que modificar, es determinada con base en los siguientes criterios de selección. Primeramente, una descripción tridimensional de la TBM es obtenida a partir de una de las diversas fuentes bien conocidas. Por ejemplo, la estructura terciaria de muchas TBMs ha sido determinada a través de experimentos de cristalografía de rayos X. Estas estructuras de rayos X son disponibles a partir de una amplia variedad de fuentes, tales como Protein Databank (PDB) que puede ser encontrada en la Internet en http://www.rcsb.org. Las estructuras terciarias pueden también ser encontradas en la Base de Datos Protein Structure Datábase (PSdb) que está localizada en el Centro de Supercomputadoras de Pittsburg (Pittsburg Supercomputer Center) en http://www.psc.com. Además, la estructura terciaria de muchas proteínas, y complejos de proteínas, ha sido determinada a través de procedimientos de modelación basados en computadora. De este modo, los modelos de las conformaciones tridimensionales de las proteínas son ahora ampliamente disponibles. Una vez que se conoce la estructura tridimensional de la TBM, se realiza una medición con base en el modelo estructural del tipo silvestre, o una forma variante, de la molécula biológica objetivo proveniente de cualquier átomo de un aminoácido dentro del sitio de interés a través de la superficie de la proteína, por una distancia de aproximadamente 10 ángstroms. La variante, la cual ha sido modificada para contener los grupos reactivos deseados (por ejemplo grupos tiol, o residuos que contienen tiol) está basada en la identificación de uno o más aminoácidos de tipo silvestre sobre la superficie de la molécula biológica oojetivo que caen dentro de un radio aproximado de 10 ángstrom del sito de interés. Para los propósitos de esta medición, cualquier aminoácido que tenga al menos un átomo que caiga dentro de un radio de aproximadamente 10 ángstroms desde cualquier átomo de un aminoácido dentro del sitio de interés, es un residuo potencial que va a ser modificado a un residuo que contiene tiol.

Los residuos preferidos para la modificación son aquellos que son accesibles al solvente. La accesibilidad al solvente puede ser calculada a partir de modelos estructurales utilizando métodos estándares numéricos (Lee, B. & Richards, F.M. J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971); Shrake, A. & Rupley, J.A. J. Mol. Biol. 79: 351-371 (1973)) o analíticos (Connolly, .L. Science 221: 709-713 (1983); Richmond, T.J. J. Mol. Biol. 178: 63-89 (1984)) . Por ejemplo, una variante de cisteína potencial es considerada accesible al solvente si el área superficial combinada del carbono beta (CB), o el azufre gamma (SG) es mayor de 21 Á2 cuando se calcula mediante el método de Lee y Richards (Lee, B & Richards, F.M. J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971)) . Este valor representa aproximadamente 33% del área superficial teórica accesible a una cadena lateral de cisteína como se describe por Creamer et al. (Creamer, T.P. et al. Biochemistry 34 : 16245-16250 (1995)) . Se prefiere también que el residuo sea mutado a cisteína, o a otro residuo de aminoácido que contenga tiol, que no participe en el puente de hidrógeno con los átomos de la cadena principal o, que a lo más, interactúe con la cadena principal únicamente a través de un puente de hidrógeno. Los residuos tipo silvestre donde la cadena lateral participa en múltiples puentes de hidrógeno (>1) con otras cadenas laterales, son también menos preferidos.

Las variantes para las cuales todos los rotámeros estándares (ángulo chil de -60°, 60° ó 180°) pueden introducir contactos estéricos desfavorables con los átomos N, CA, C, O o CB de cualquier otro residuo, son también menos preferidas. Los contactos desfavorables son definidos como las distancias interatómicas que son menores de 80% de la suma de los radios de van der aals de los átomos que participan. Los residuos de tipo silvestre que caen dentro de las regiones altamente flexibles de la proteina son menos preferidos. Dentro de las estructuras derivadas de los datos de rayos X, las regiones altamente flexibles pueden ser definidas como segmentos donde el átomo de la cadena principal posee densidad electrónica débil o factores de alta temperatura (>4 desviaciones estándares por arriba del factor de temperatura media para la estructura) . Dentro de las estructuras derivadas de los datos de RMN, las regiones altamente flexibles pueden ser definidas como segmentos que poseen <5 restricciones experimentales (derivadas de la distancia, acoplamiento dihédrico y datos de enlace al hidrógeno) por residuo, o regiones que muestran una alta variabilidad (desviación RMS >2.0 A2) entre los modelos en el conjunto. Adicionalmente , los residuos encontrados sobre las regiones de "reborde" convexas adyacentes a las superficies cóncavas, son más preferidos mientras que aquellos dentro de las regiones cóncavas son los residuos de cisteína menos preferidos que van a ser modificados. La convexidad y la concavidad pueden ser calculadas con base en los vectores de superficie (Duncan, B. S. & Olson, A. J. Bíopolymers 33: 219-229 (1993)) o mediante la determinación de la accesibilidad de las sondas de agua colocadas a lo largo de la superficie molecular (Nicholls, A. et al. Proteins 11: 281-296 (1991); Brady, G.P., Jr . & Stouten, P.F. J. Comput. Aided Mol. Des. 14: 383-401 (20C0)) . Los residuos que poseen una conformación de cadena principal que es nominalmente prohibida para los L-aminoácidos (Ramachandran, G.N. et al. J. Mol. Biol. 7: 95-99 (1963); Ramachandran, G.N. & Sasisekharahn, V. Adv . Prot. Chem. 23: 283-437 (1968)) son objetivos menos preferidos para la modificación a una cisteína. Las conformaciones prohibidas caracterizan comúnmente un valor positivo del ángulo phi . Otras variantes preferidas son aquellas que, cuando son mutadas a cisteína y ligadas vía un enlace disulfuro a un trabador de alquilo, podrían poseer una conformación que dirige los átomos de ese trabador hacía el sitio de interés. Pueden ser utilizados dos procedimientos generales para identificar estas variantes preferidas. En el primer procedimiento, se realiza una búsqueda de las estructuras únicas (Hobohm, U. et al. Proteín Science 1: 409-417 (1992)) en el Banco de Datos de Proteínas Protein Databank (Berman, H.M. et al . Nucl eic Acids Rss&3rch 23: 235-242 (2000)) para identificar los fragmentos estructurales que contienen una cisteina enlazada por puente disulfuro en la posición j en la cual los átomos de la cadena principal de los residuos j y j+1 del fragmento, pueden ser superpuestos sobre los átomos de la cadena principal de los residuos i e i+1 de la molécula objetivo con un RMSD menor de 0.75 A2. Si solo identificamos los fragmentos que colocan el átomo CB del residuo enlazado por disulfuro en la cisteina a la posición j más cercana a cualquier átomo del sitio de interés que el átomo CB del residuo i (cuando es mutado a cisteina), la posición i es considerada preferida. En un procedimiento alternativo, el residuo en la posición i es computacionalmente "mutado" a una cisteina y encasquetado con un grupo S-metilo vía un enlace disulfuro. Detalles adicionales del o de los sitios de identificación de interés sobre los objetivos de la invención son proporcionados en la solicitud copendiente No. de Serie 60/310, 725, presentada el 7 de agosto del 2001, la descripción completa de la cual se incorpora por referencia en la presente expresamente. 4. Extensor de Molécula Pequeña (SME) (A) SME Estático En una modalidad de la invención el SME forma un enlace covalente "estático" o irreversible a través del nucleófilo o electrófilo, preferentemente nucleófilo, sobre la TBM, con lo cual se forma un complejo TBM-SME irreversible. Este método es ilustrado en la Figura 2. Opciona Imente , el SME también forma un enlace no covalente con un primer sitio de interés sobre la TBM. Adicionalmente el SME contiene un segundo grupo funcional capaz de formar un enlace reversible con un miembro de la biblioteca de una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas, teniendo cada molécula un grupo funcional capaz de formar un enlace reversible con el segundo grupo funcional del SME. El complejo TMB-SME y la biblioteca son sometidos a condiciones en donde el miembro de la biblioteca que tiene afinidad, preferentemente la más alta afinidad, por el segundo sitio de interés sobre la TBM, forma un enlace reversible con el complejo TMB-SME. Las TBM' s preferidas son proteinas y los nucleófilos preferidos sobre las TBM' s adecuadas para la formación de un complejo TBM-SME irreversible, incluyen -??, -OH, -NH2 y -COOH usualmente surgiendo de las cadenas laterales de cys, ser o thr, lys y asp o glu respectivamente. Las TBM' s pueden ser modificadas (por ejemplo mutantes o derivados] para contener estos nucleófilos que pueden contenerlos de manera natural. Por ejemplo, las proteasas de cisteína (por ejemplo Caspasas, especialmente 1, 3, 8 y 9; Catepsínas, especialmente S y K, etc.) y fosfatasas (por ejemplo PTP PTPIB, LAR, SHP1,2, PTP y CD45) son ejemplos de proteínas adecuadas que contienen nucleófilos de tiol de cisteína de origen natural. La derivatización de tales TBM' s con un SME para producir un complejo TBM-SME estático y su reacción con un miembro de la biblioteca es ilustrado enseguida.

TBM ¦SH ???G SR' TBM|—SG- SMEf -SR' U, — SS ' |TBM — SG- SMEt ¦ SR ¦ SS— Ln ß-rre Aquí, el nucleófilo sobre la TBM es el azufre sobre un tiol, usualmente una cisteína, que se hace reaccionar con dos, un SME que contiene un sustituyente G capaz de formar un enlace covalente irreversible (bajo condiciones que no desnaturalizan el objetivo) y un tiol libre, tiol protegido o tiol SR' derivat i zado . Preferentemente, G es un grupo capaz de sufrir el ataque SN2 por el tiol o la formación de un aducto de tipo Michael con el tiol para producir el producto de reacción irreversible 3 de ese ataque que tiene un enlace covalente nuevo -SG'-. Los siguientes son ejemplos representativos de grupos G capaces de sufrir adición similar a SN2 o tipo Michael. 1) -haloácidos: flúor, cloro y bromo sustituido a un ácido COOH, P03H2 o P(OR)02H que es parte del SME, pueden formar un tioéter con el tiol de la TBM. Ejemplos simples de tal G-SME-SR' son: donde X es el halógeno y R' es hidrógeno, SCH3 S(CH2)nA, donde A es OH, COOH, S03H, CONH2 o NH2 y n es 2 ó 3. 2) Fluorofos ( fon) atos : Estos pueden ser compuestos similares a Sarin que reaccionan fácilmente con los nucleófilos SH y OH. Por ejemplo, cys 215 de PTP1B se puede hacer reaccionar con un G-SME-SR' simple representado por lo siguiente: Aquí, el anillo de fenilo representa un SME simplificado, R es un alquilo inferior sustituido o no sustituido y R' es como se definió anteriormente. Estos compuestos forman SME's de t iofos ( fon) ato con el nucleófilo de tiol. Estos compuestos son también capaces de formar TBM-SME's estáticos con -OH de origen natural proveniente de las fosfatasas o lactamasas de serina o de treonina. 3) Epóxidos, aziridinas y tiiranos: los SME's que contienen estos grupos funcionales reactivos son capaces de sufrir reacciones de apertura de anillo tipo ??2 con los nucleófilos -??, -OH y -COOH. Los ejemplos preferidos de los últimos son aspartil-proteasas como la secretasa (BASE) . Los ejemplos genéricos preferidos de los epóxidos, aziridinas y tiiranos se muestran enseguida.

Aquí, R' es como se definió anteriormente, R es usualmente hidrógeno o alquilo inferior y R' ' es alquilo inferior, alcoxi inferior, OH, NH2 o SR' . En el caso de tiiranos del grupo SR' está opcionalmente presente, debido a que después del ataque nucleofílico y la apertura del anillo, se produce un tiol libre que puede ser utilizado en la reacción de traba extendida subsiguiente. 4) Halo-metil-cetonas/amidas : Estos compuestos tienen la forma - ( C=0 ) -CH2- . Donde X puede ser un número grande de grupos salientes buenos como halógenos, N2, O-R (donde R puede ser heteroarilo sustituido o no sustituido, arilo, alquilo, -(P=0)Ar2, -N-O- (C=0) -arilo/alquilo, -(C=0)-arilo/alquilo/alquilarilo y similares), s-arilo, S-heteroarilo y vinilsulfonas .

Las fluorometilcetonas son ejemplos simples de esta clase de cetonas activadas que dan como resultado la formación de un tioéter cuando se hace reaccionar con una proteina que contiene tiol. Otros ejemplos bien conocidos incluyen las aciloximet ilcetonas como la benzoiloximetilcetona, aminometilcetonas como la fenilmetilaminometilcetona y sulfonilaminometilcetonas . Estos y otros tipos de compuestos adecuados son revisados en J. Med. Chem. 43 (18) p. 3351-71, 7 de septiembre del 2000. 5) Sistemas aromáticos electrofilicos : Los ejemplos de éstos incluyen 7-halo-2 , 1 , 3-benzoxadia zoles y los halobencenos sustituidos con orto/para-nitro.

Los compuestos de este tipo forman arilalquiltioéteres con las TBM' s que contienen tiol. 6) Otras reacciones similares a SN2 adecuadas, apropiadas para la formación de enlaces covalentes estáticos con nucleófilos de TBM, incluyen la formación de una base de Schiff entre un aldehido y el grupo amina de lisina, y las enzimas como las proteínas de reparación de ADN , seguido por la reducción por ejemplo con NaCNBH4. 7) Adiciones tipo Michael: Los compuestos de la forma -RC=CR-Q, o -C=C-Q_ donde Q es C(=0)H, C(=0)R (incluyendo quininas), COOR, C(=0)NH2, C(=0)NHR, CN, N02, SOR, S02R, donde cada R es independientemente alquilo sustituido o no sustituido, arilo, hidrógeno, halógeno u otro Q puede formar aducios de Michael con SR (donde R es hidrógeno, glutation o S-alquilo inferior sustituido con NH2 u OH), OH y NH2 sobre la TBM. 8) Ácidos borónicos: Estos compuestos pueden ser utilizados para marcar los hidroxilos de ser o thr para formar complejos de TBM-SME de la forma mostrada enseguida: donde R' es como se definió anteriormente. En cada uno de los casos anteriores se forma un enlace covalente "estático" o irreversible a través del nucleófilo sobre la TBM produciendo un complejo TBM-SME que contiene un tiol o tiol protegido. Estos complejos son luego expuestos a una biblioteca de compuestos orgánicos que contiene tiol o disulfuro, en presencia de un agente reductor (por ejemplo mercaptoetanol ) para la selección de un ligando de molécula pequeña capaz de enlazarse a un segundo sitio de enlace sobre la TBM. Como se anotó anteriormente, en este procedimiento estático, ei SME puede, pero no tiene que, incluir una porción que tiene afinidad de enlace (por ejemplo es capaz de enlazarse a) un primer sitio de interés sobre la TBM. Incluso si el SME no incluye tal porción, éste debe ser de longitud y flexibilidad apropiadas para asegurar que los ligandos candidatos tengan libre acceso al segundo sitio de interés sobre el objetivo.

(B) SME Dinámico En otra modalidad más de la invención el SME es un SME con enlace covalente reversible doble (extensor de "doble disulfuro"), es decir, este SME es bifuncional y contiene dos grupos funcionales (usualmente disulfuro) capaces de formar enlaces covalentes reversibles. Este SME forma un primer enlace covalente reversible o "dinámico" a través de un primer grupo funcional sobre el SME con el nucleófilo sobre la TBM, con lo cual se forma un complejo T3M-SME reversible (7 más adelante) . Opcionalmente , el SME también forma un enlace no covalente con un primer sitio de interés sobre la TBM (la porción del SME que forma un enlace no covalente con la TBM es denominada en la presente como SME' ) . Adicionalmente, el SME contiene o es modificado para contener un segundo grupo funcional capaz de formar un segundo enlace reversible con un miembro de la biblioteca de una segunda biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas, teniendo cada molécula un grupo funcional capaz de formar un enlace reversible con el primero o segundo grupo funcional del SME. El complejo TBM-SME y la segunda biblioteca son sometidos a condiciones en donde el miembro de la biblioteca que tiene la más alta afinidad por un segundo sitio de interés sobre la TBM forma un enlace reversible con el complejo TBM-SME (8 más adelante).

Preferentemente, los enlaces covalentes son disulfuros, los cuales pueden ser reversibles en presencia de un agente reducto .

TBM| SH + R'S [ SME | SR' TBM SS SMEh— SR' ???G - SS- SMEr SR' El proceso de traba extendida dinámica es ilustrado en la figura 3 donde una TBM que contiene o que es modificado para contener un tiol o tiol protegido es incubado con una primera biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas que contienen un tiol o tiol protegido (un monóforo que contiene disulfuro) bajo condiciones, tal como con un agente reductor, en donde al menos un miembro de la biblioteca forma un enlace disulfuro que enlaza el miembro de la biblioteca seleccionado con la TBM. Opcionalmente este proceso es repetido con una biblioteca de TBM' s que difieren una de la otra por la localización del tiol o tiol protegido, por ejemplo, diferentes mutantes de cisteina de la misma proteina. Preferentemente, cada miembro de la biblioteca de moléculas pequeñas difiere en peso molecular de cada uno de los otros miembros de la biblioteca. Preferentemente, la biblioteca de moléculas pequeñas contiene de 1 a 100 miembros, más preferentemente de 5 a 15 y lo más preferentemente de aproximadamente 10 miembros. Opcionalmente el miembro seleccionado de la biblioteca de moléculas pequeñas (monóforo seleccionado) también forma un enlace no covalente con un primer sitio de interés de la TBM. El monóforo seleccionado, o un derivado del mismo, es luego modificado para contener un segundo tiol o tiol protegido, con lo cual se forma un extensor de "disulfuro doble". Este extensor sintético de disulfuro doble es luego incubado con la TBM en presencia de una segunda biblioteca de moléculas pequeñas, que contienen un tiol o tiol protegido (la biblioteca puede ser la misma o diferente de la primera biblioteca) bajo condiciones, tales como con un agente reductor como el mercaptoetanol , en donde al menos un miembro de la segunda biblioteca forma un enlace disulfuro que une el miembro seleccionado de la biblioteca con la TBM, a través del extensor de disulfuro doble como se muestra en 8 anterior. Opcionalmente después de esto, un diáforo es sintetizado con base en los dos miembros seleccionados de la biblioteca (monóforos) . Existen dos estrategias básicas para sintetizar un extensor de "disulfuro doble". En la primera, la síntesis del extensor dinámico, procede genéricamente, es decir mediante modificación del ligador monóforo sin ninguna modificación de la porción del monóforo que forma un enlace no covalente con la TBM. manera de ilustración, el extensor surge usualmente de la selección de una biblioteca de monóforos de disulfuro, como se muestra en la Figura 3. Un monóforo típico seleccionado de la biblioteca o combinado, contendrá un ligador de 2 ó 3 unidades de metileno entre el disulfuro que enlaza el monóforo a la cisteína de TBM, y la porción del monóforo que se enlaza no covalentemente al primer sitio de interés sobre la TBM. Este ligador de monóforo puede ser derivatizado como se muestra más adelante, para producir un extensor de disulfuro doble en el cual el grupo "R" o variable del monóforo permanece invariante y se vuelve la porción del extensor (SME') que se enlaza no covalentemente con el primer sitio de interés sobre la TBM.

H Bdcnsor 1 de Disulfuro Doble Dinámico Extensor 2 de Disulfuro Doble Dinámico Aquí, el monóforo es derivatizado ya sea metileno más cerca del nitrógeno de la cisteamina para producir el extensor 1 de disulfuro doble dinámico, o en el nitrógeno mismo de la cisteamina para producir el extensor 2 de disulfuro doble, dinámico, simétrico. Alternativamente, cuando el monóforo es un derivado del ácido 3-mercaptopropionico, el carbono alfa puede ser derivatizado para producir un extensor de disulfuro doble, dinámico, genérico de la forma mostrada en 3 más adelante.

Opcionalmente , el nitrógeno de la amida puede ser derivatizado con un grupo acilo o sulfonilo para producir un extensor de la forma mostrada en 4 anterior. Una segunda estrategia involucra la derivatización de la porción del monóforo que se enlaza no covalentemente al primer sitio de interés sobre la TBM. La derivatización es preferentemente llevada a cabo en un sitio que altera mínimamente el enlace del monóforo al primer sitio interés como se ilustra enseguida.

Aquí el trabador dinámico es mostrado enlazado al tiol de TBM que forma el complejo TBM.-SME, donde R ' es el radical de cisteamina. Este complejo puede ser luego puesto en contacto con un monóforo de disulfuro o biblioteca de monóforos de disulfuro para obtener un compuesto enlazado que tiene una mayor afinidad por la TBM que por el SME o el monóforo seleccionado solo. Un segundo ejemplo de un SME diseñado a partir de un monóforo de disulfuro que se enlaza a la TBM, es mostrado enseguida. Este SME dinámico puede ser puesto en contacto con la TBM en presencia de uno o más monóforos de disulfuro para formar un complejo covalente de ???-???- monóforo donde el SME tiene una afinidad para el primer sitio de interés y el monóforo tiene una afinidad para el segundo sitio de interés sobre la TBM.

La detección y la identificación de la estructura del complejo TBM-SME-monóforo puede ser llevada a cabo mediante espectrometría de masa o inhibición en un ensayo funcional (por ejemplo ELISA, ensayo enzimático, etc.) - Los SME' s son f ecuentemente hechos a la medida para una TBM particular o familia de TBM's. Por ejemplo, los derivados de quinazolina son capaces de formar extensores estáticos o dinámicos con el receptor EGF o una cinasa de XRD". En el caso del receptor EGF, cys 773 es un nucleófilo adecuado ya sea para un extensor de quinazolina como se muestra más adelante: R2 es -(CH2)n-SR' y -C (=0) - (CH2 ) n-SR' ; R3, R4 y R5 son -0- (CH2) n-SR' y - ( CH2 ) n-SR' ; R6 son; - (CH2) n-SR' ; donde n es 1, 2 ó 3 y Rr es H, un disulfuro o un grupo protector de tiol. Pueden ser utilizados miméticos o sustitutos de fosfotirosina (P-tyr), fosfoserina (P-ser) y fos fotreonina (?-thr) como extensores en la presente invención para identificar los fragmentos que interactúan con los subsitios cercanos para mejorar la especificidad o afinidad por una fosfatasa objetivo. De este modo, la traba extendida utilizando sustratos conocidos o inhibidores como "anclas" para encontrar fragmentos cercanos mediante traba covalente estándar con el extensor, es una modalidad preferida de la presente invención. Los miméticos de fosfotirosina (P-tyr) son ejemplos de SME's que pueden ser hechos a la medida para las fosfatasas como PTP-1B, LAR, etc. Los miméticos P-tyr conocidos PTP-1B derivat i zados con ácido mercapto-propanoico y/o cisteamina o las formas protegidas de los mismos, mostradas más adelante, se enlazan al sitio activo de un mutante de cys PTP-1B.

Tal compuesto puede ser utilizado como un extensor dinámico para seleccionar un segundo fragmento mediante "raba o enlace covalente como se describió ante iormente. El compuesto mostrado arriba cuando se enlaza al objetivo y es titulado contra el -mercaptoetanol (-) muestra una BME50 (la concentración del -mercaptoetanol que, en equilibrio, es capaz de desplazar 50% del compuesto enlazado desde el objetivo) de aproximadamente 2.5 mM. Cuando se utiliza un extensor dinámico se prefiere medir la BME50 para el extensor dinámico, y para seleccionar un segundo fragmento mediante traba o enlace covalente a una concentración total de tiol (BME + tioles de la biblioteca) en o por debajo de la BME50 del extensor dinámico. Por ejemplo, con el extensor dinámico mostrado anteriormente que tiene una BME50 de 2.5 mM, la concentración total de tiol en el paso de selección del segundo fragmento debe ser de 2.5 mM o menor, y más preferentemente aproximadamente 2 veces menor, por ejemplo aproximadamente 1 mM o menor. Alternativamente, el extensor dinámico puede ser convertido a un extensor estático eliminando el problema de la concentración total de tiol de selección del segundo fragmento. Cuando se convierte un extensor dinámico a un extensor estático, es importante mantener la misma cuenta de átomos, de modo que el enlace no covalente del extensor estático al objetivo no será distorsionado. Por razones similares, es importante minimizar la introducción de otros átomos o grupos voluminosos. Con estos factores en mente, el extensor dinámico anterior, el extensor puede ser convertido a los extensores estáticos definidos enseguida. donde R se selecciona de En otra modalidad más de la invención, un extensor puede ser un péptido ya sea reversible o irreversiblemente enlazado a la TB . En esta modalidad, el péptido es de aproximadamente 2 a 15 residuos de longitud, preferentemente de 5 a 10 residuos, y puede estar compuesto de alfa-aminoácidos naturales y/o artif ciales. Un ejemplo de tal extensor peptidico es un péptido del fragmento p53 helicoidal alfa (o péptidos no naturales conocidos, más pequeños) que son capaces de enlazarse al dominio N-terminal de MDM2 en una hendidura hidrofóbica profunda con afinidades de nM . BCL-2 y BCL-xL se sabe que también contienen ranuras profundas de enlace a los péptidos, análogas a MDM2. Los péptidos que se enlazan a estos objetivos pueden también ser extensores peptidicos útiles de acuerdo a la presente invención. Por ejemplo, un fragmento peptidico de p53 pueden formar un enlace reversible (por ejemplo disulfuro) a través de un tiol existente (por ejemplo cys) o un tiol introducido (cys introducido, cisteamina derivafizada con el extremo carboxilo o ácido mercapto-propanoico a través del extremo amino) sobre el péptido con un tiol existente o introducido sobre la TBM. En este caso, un complejo extensor TBM-péptido será formado, el cual es capaz de ser utilizado para seleccionar un fragmento tiol o disulfuro a partir de una selección de traba o enlace covalente subsecuente. Este extensor peptidico dinámico tendrá otro tiol libre o tiol protegido (por ejemplo uno de los anteriores no utilizado para formar el complejo extensor TBM-péptido) , el cual se pone en contacto con una biblioteca de tiol o fragmentos de tiol protegidos bajo condiciones adecuadas para formar un enlace disulfuro covalente con un fragmento que tiene afinidad para la TBM. Opcionalmente , el extensor peptidico puede ser uno estático donde un enlace covalente irreversible es formado con un nucleófilo o electrófilo sobre la TBM, como se describe anteriormente. Opcionalmente en esta modalidad, un marcador de fotoafinidad puede ser utilizado para acoplar el extensor peptídico a la TBM. Como se describió anteriormente, un tiol libre o protegido pre-existente o introducido es utilizado para formar un disulfuro en una selección subsecuente para encontrar un fragmento de molécula pequeña que tenga afinidad por la TBM. Tal extensor peptídico puede también ser un péptido sintético tal como el péptido "Z-WQPY" donde la TBM es el receptor de IL-1. Aquí, el péptido FEWTPGYWQPYALPL o los fragmentos, mutantes o análogos del mismo pueden ser utilizados como un extensor estático o dinámico como se describió anteriormente para descubrir los fragmentos vía el enlace o traba covalente, donde el enlace disulfuro está en o con el extensor y el enlace no covalente está entre el fragmento seleccionado y la TBM. Otras químicas disponibles para la formación de un enlace covalente reversible o irreversible entre los grupos reactivos sobre un SME y un objetivo o ligando, respectivamente, o entre dos ligandos, son bien conocidos en la técnica, y se describen en los libros de texto básicos, tales como, por ejemplo, March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York, 4a edición, 1992. Las aminaciones reductivas entre aldehidos y las cetonas y las aminas se describen, por ejemplo, en March et al., supra, en las páginas 898-900; los métodos alternativos para preparar las aminas en la página 1276; las reacciones entre los aldehidos y las cetonas y los derivados de hidracida para dar hidrazonas y los derivados de hidrazona tales como las semicarbazonas en las páginas 904-906; la formación del enlace amida en la página 1275; formación de ureas en la página 1299; formación de tiocarbamatos en la página 892; formación de carbamatos en la página 1280; formación de sulfonamidas en la página 1296; formación de tioéteres en la página 1297; formación de disulfuros en la página 1284; formación de éteres en la página 1285; formación de ásteres en la página 1281; adiciones a epóxidos en la página 368; adiciones a aziridinas en la página 368; formación de acétales y cetales en la página 1269; formación de carbonatos en la página 392; formación de denaminas en la página 1264; metátesis de alquenos en las páginas 1146-1148 (ver también Grubbs et al., Acc.Chem. Res. 28: 446-453

[1995]); acoplamientos catalizados con metales de transición de haluros de arilo y sulfonatos con alcanos y acetilenos, por ejemplo reacciones de Heck, en las páginas 717-718; la reacción de haluros de arilo y sulfonatos con reactivos organometálicos, tales como oragnoboro, reactivos, en la página 662 (ver también Miyaura et al., Chem. Rey. 95: 2457

[1995]); reactivos de organoestaño, y organozinc, formación de oxazolidinas (Ede et al. Tetrahedron Letts. 28: 7119-7122

[1997]); formación de tiazolidinas (Patek et al., Tetrahedron Letts. 36: 2227-2230

[1995]); aminas enlazadas a través de grupos amidina mediante acoplamiento de aminas a través de imidoésteres (Davies et al., Canadian J. Biochem. C50: 416-422

[1972]), y similares. En particular, las bibliotecas de molécula pequeña que contienen disulfuro pueden ser elaboradas a partir de ácidos carboxilicos comercialmente disponibles y cisteamina protegida (por ejemplo mono-BOC-ci steamina ) mediante la adaptación del método de Parlow et al., Mol . Diversity 1: 266-269 (1995), y pueden ser seleccionadas mediante el enlace a los polipéptidos que contienen, o han sido modificados para contener, cisteinas reactivas. Todas las referencias citadas en esta sección son expresamente incorporadas por referencia en la misma. Mientras que se prefiere usualmente que el acoplamiento o enlace del SME no desnaturalice el objetivo, el complejo TBM-SME puede también ser formado bajo condiciones de desnaturalización, seguidas por el replegamiento del complejo mediante métodos conocidos en la materia. Además, el SME y el enlace covalente no deben alterar sustancialmente la estructura tridimensional del objetivo, de modo que los ligandos reconocerán y se enlazarán a un sitio de interés sobre el objetivo con especificidad de sitio útil. Finalmente, que el SME debe ser sustancialmente no reactivo con otros sitios sobre el objetivo bajo las condiciones de reacción y de ensayo. 5. Detección e identi icación de los ligandos enlazados a un objetivo Los ligandos enlazados a un objetivo pueden ser fácilmente detectados e identificados mediante espectroscopia de masa (MS) . La MS detecta moléculas basadas en la proporción masa a carga (m/z) y de este modo pueden resolver moléculas con base en sus tamaños (revisado en Yates, Trends Genet. 16: 5-8

[2000]) . Un espectrómetro de masa convierte primeramente las moléculas a iones en fase gaseosa, luego los iones individuales son separados con base en las proporciones m/z y son finalmente detectados. Un analizador de masa, el cual es una parte integral de un espectrómetro de masa, utiliza una propiedad física (por ejemplo, campos eléctricos o magnéticos, o tiempo de vuelo [TOF]) para separar los iones de un valor m/z particular que golpea luego el detector de iones. Los espectrómetros de masa son capaces de generar datos rápidamente, y de este modo tienen un gran potencial para el análisis de alto rendimiento. La MS ofrece una herramienta muy versátil que puede ser utilizada para el descubrimiento de fármacos. La espectroscopia de masa puede ser empleada ya sea sola o en combinación con otros medios para la detección o identificación del ligando compuesto orgánico enlazado al objetivo. Las técnicas que emplean la espectroscopia de masa son bien conocidas en la materia y han sido empleadas para una variedad de aplicaciones (ver por ejemplo, Fitzgerald y Siuzdak, Chemistry & Biology 3:707-715

[1996]; Chu et al., J. Am. Chem. Soc. 118:7827-7835

[1996]; Siudzak, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91: 11290-11297

[1994]; Burlingame et al., Anal. Chem. 68: 599R-651R

[1996]; Wu et al., Chemistry & Biology 4: 653-657

[1997]; y Loo et al., Am. Reports Med. Chem. 31:319-325

[1996]) . No obstante, el alcance de la presente invención no está limitado al uso de MS . De hecho, cualquier otra técnica adecuada para la detección del aducto formado entre la molécula objetivo biológica y el miembro de la biblioteca, puede ser utilizada. Por ejemplo, se pueden emplear varias técnicas cromatograficas tales como la cromatografía líquida, cromatografía en capa delgada y similares para la separación de los componentes de la mezcla de reacción, para aumentar la habilidad para identificar la molécula orgánica covalentemente enlazada. Tales técnicas cromatográficas pueden ser empleadas en combinación con la espectroscopia de masa o separadas de la espectroscopia de masa. Se puede acoplar opcionalmente una sonda marcada ( flurescentemente , radioactivamente o de otro modo) al compuesto orgánico liberado para facilitar su identificación utilizando cualquiera de las técnicas anteriores. En otra modalidad más, la formación de los nuevos enlaces libera una sonda marcada, la cual puede ser luego monitori zada . Un ensayo funcional simple, tal como un ensayo de ELISA o ensayo enzimático puede también ser utilizado para detectar el enlace cuando el enlace del extensor o del segundo fragmento al objetivo, ocurre en un área esencial para lo que mide el ensayo (por ejemplo, el enlace a un "Punto Caliente o Punto Crítico" en una ELISA de proteína : proteína o el enlace en la bolsa de enlace al sustrato para un ensayo enzimático) . Otras técnicas que pueden encontrar uso para la identificación del compuesto orgánico enlazado a la molécula objetivo incluyen, por ejemplo, resonancia magnética nuclear (RMN) , electroforesis capilar, cristalografía de rayos X, y similares, todas las cuales serán bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. 6. Preparación de moléculas conjugadas (por ejemplo diáforos) Los elementos ligadores que encuentran uso para el enlace de dos o más ligandos de molécula orgánica, para producir una molécula conjugada, serán moléculas de reticulación, multifuncionales, preferentemente difuncionales , que pueden funcionar para enlazar covalentemente al menos dos moléculas orgánicas entre sí vía las funcionalidades reactivas poseídas por esas moléculas. Los elementos enlazadores tendrán el menos dos, preferentemente solo dos, funcionalidades reactivas que son disponibles para el enlace al menos a dos moléculas orgánicas, en donde esas funcionalidades pueden aparecer en cualquier sitio sobre el ligador, preferentemente en cada extremo del ligador, y en donde esas funcionalidades pueden ser las mismas o diferentes dependiendo de si las moléculas orgánicas que van a ser enlazadas tienen o no funcionalidades reactivas iguales o diferentes. Los elementos ligadores que encuentran uso en la presente pueden ser de cadena lineal, ramificados, aromáticos y similares, preferentemente de cadena lineal y en general serán de al menos aproximadamente 2 átomos de longitud, más en general de aproximadamente 4 átomos de longitud, y f ecuentemente tantos como aproximadamente 12 o más átomos de longitud. Elementos ligadores comprenderán en general átomos de carbono, ya sea hidrógeno saturado o insaturado, y por lo tanto pueden comprender alcanos, alquenos o alquinos, y/o otros heteroátomos incluyendo nitrógeno, azufre, oxigeno y similares, que pueden estar no sustituidos o sustituidos, preferentemente con grupos alquilo, alcoxilo, hidroxialquilo o hidroxialquilo. Los elementos ligadores que encuentran uso serán de longitudes variantes, con lo cual se proporciona un medio para optimizar las propiedades de enlace de un compuesto ligando conjugado, preparado a partir de éstos. El primer compuesto orgánico que se enlazó covalentemente a la biomolécula objetivo puede por si mismo poseer un grupo químicamente reactivo que proporciona un sitio para el enlace a un segundo compuesto orgánico. Alternativamente, la primera molécula orgánica puede ser modificada (ya sea químicamente, mediante el enlace de un compuesto que comprende un grupo químicamente reactivo a éste, o de otro modo) antes de la selección contra una segunda biblioteca de compuestos orgánicos. 7. Compuestos de la invención Los compuestos de la presente invención están caracterizados por abarcar al menos uno, preferentemente al menos dos, ligandos, al menos uno de los cuales han sido identificado por el procedimiento de traba extendida descrito en la presente, y en análogos de tales compuestos. En consecuencia, los compuestos de la presente invención abarcan numerosas clases químicas, incluyendo pero no limitadas a moléculas orgánicas pequeñas, péptidos (poli ) nucleótidos , oligo (sacáridos ) , etc. Los ligandos identificados por los presentes métodos sirven típicamente como compuestos guía para el desarrollo de variantes y derivados adicionales diseñados siguiendo técnicas bien conocidas. En particular, los ligandos identificados (incluyendo monóforos, diáforos y estructuras más complejas) son propios para la química medicinal y la maduración de afinidad, y pueden ser fácilmente optimizados utilizando el diseño ayudado por estructura. El presente procedimiento de traba extendida es superior sobre otras técnicas conocidas, incluyendo la química combinatoria, ya que permite modificaciones químicas adicionales enfocadas sobre los ligandos que han mostrado ya que se enlazan a diferentes sitios sobre un objetivo, por ejemplo una TBM. 8. Uso de los compuestos identificados El método de la presente invención es una técnica poderosa para generar guías de fármaco, permite la identificación de dos o más fragmentos que se enlazan débilmente o con afinidad de enlace moderada a un objetivo en sitios cercanos uno al otro, y la síntesis de los diáforos o moléculas más grandes que comprenden los fragmentos identificados (monóforos) covalentemente enlazados uno al otro para producir compuestos de mayor afinidad. Los diáforos o compuestos multiméricos similares que incluyen compuestos ligandos adicionales son herramientas valiosas en el diseño racional de fármacos que pueden ser además modificados y optimizados utilizando procedimientos químicos medicínales y diseño auxiliado por estructura. Los diáforos identificados de acuerdo con la presente invención y las guias de fármaco modificadas y los fármacos diseñados a partir de éstos, pueden ser utilizados por ejemplo, para regular una variedad de procesos biológicos in vitro e in vivo los cuales requieren o dependen de la interacción especifica del sitio de dos moléculas. Las moléculas que se enlazan a un polinucleótido pueden ser utilizados por ejemplo, para inhibir o prevenir la activación de los genes mediante el bloqueo del acceso de un factor necesario para la activación al gen objetivo, o reprimir la transcripción mediante la estabilización del ADN dúplex o la interferencia de la maquinaria transcripcional . 9. Composiciones f rmacéuticas Los ligandos identificados de acuerdo con la presente invención, y los compuestos que comprenden tales ligandos, asi como los análogos de tales compuestos, pueden ser utilizados en composiciones farmacéuticas para prevenir y/o tratar una enfermedad o condición objetivo. La enfermedad o condición objetivo depende de la función biológica/fisiológica del objetivo, por ejemplo la TBM a la cual se enlaza el ligando o los compuestos diseñados con base en tal o tales ligandos. Los ejemplos de tales enfermedades de condiciones se enlistan en la tabla de la TBMs anteriormente mencionada.

Las formas adecuadas para las composiciones farmacéuticas en parte, dependen del uso o la ruta de entrada, por ejemplo, oral, transdérmica , inhalación o mediante inyecciones. Tales formas deben permitir que el agente o la composición alcancen una célula objetivo ya sea que la célula objetivo esté presente o no en un huésped multicelular o en cultivo. Por ejemplo, los agentes o composiciones farmacológicas inyectados en la corriente sanguínea deben ser solubles. Otros factores son conocidos en la técnica e incluyen las consideraciones tales como la toxicidad y formas que previenen que el agente o composición ejerza su efecto. El ingrediente activo, cuando es apropiado, puede también ser formulado como sales farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, sales por adición de ácido) y/o complejos. Las sales farmacéuticamente aceptables son no tóxicas a la concentración a la cual éstas son administradas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales por adición de ácido tales como aquellas que contienen sulfato, clohidrato, fosfato, sulfonato, sulfonato, sulfato, acetato, citrato, lactato, tartrato, metansulfonato, etansulfonato, bencensulfonato, ?-toluensulfonato, ciclohexilsulfonato, ciclohexilsul famato y quinato. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden ser obtenidas a partir de ácidos tales como el ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido sulfámico, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido malónico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido bencensulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido ciclohexilsulfónico, ácido ciclohexilsulfámico, y ácido quínico. Tales sales pueden ser preparadas por ejemplo mediante la reacción del ácido o de la base libre de un producto con uno o más equivalentes de la base o ácido apropiado en un solvente o medio en el cual la sal es insoluble, o en un solvente tal como agua, que es removido luego a vacío o mediante liofilización o mediante intercambio de los iones de una sal existente por otro ion sobre una resina de intercambio iónico, adecuada. Los portadores o excipientes pueden ser también utilizados para facilitar la administración del compuesto. Los ejemplos de portadores o excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares tales como lactosa, glucosa o sucrosa, o tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, pol ietílenglicoles y solventes fisiológicamente aceptables. Las composiciones o composiciones farmacéuticas pueden ser administradas mediante diferentes rutas incluyendo, pero no limitadas a, intravenosa, intra-arterial , intraperitoneal , intrapericardial , intracoronarias , subcutánea, intramuscular, oral tópica o transmucosal .

La isotonicidad deseada de las composiciones puede ser lograda utilizando cloruro de sodio u otros agentes farmacéuticamente aceptables tales como dextrosa, ácido bórico, tartrato de sodio, propilenglicol, polioles (tales como manitol y sorbitol) , u otros solutos inorgánicos u orgánicos . Las técnicas e ingredientes para la elaboración de formulaciones farmacéuticas en general pueden ser encontradas, por ejemplo en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990. Ver también, Wang y Hanson "Parental Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Journal of Parenteral Science and technology, Technical Report No. 10, Supp. 42-2S (1988). Un formato de administración adecuado puede ser determinado mejor por un practicante médico para cada enfermedad o condición individualmente, y también en vista de la condición del paciente. Las composiciones farmacéuticas son preparadas mediante el mezclado de los ingredientes siguiendo procedimientos en general aceptados. Por ejemplo, los componentes seleccionados pueden ser mezclados simplemente en un mezclador u otro dispositivo estándar para producir una mezcla concentrada que puede ser luego ajustada a la concentración final y a la viscosidad final, mediante la adición de agua o agente espesante, y posiblemente un amortiguador para controlar el pH, o un soluto adicional para controlar la tonicidad. Las cantidades de los diversos compuestos para el uso en las composiciones de la invención que van a ser administradas, pueden ser determinadas mediante procedimientos estándares. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva está entre aproximadamente 100 mg/kg y 10~12 mg/kg, dependiendo de la edad y el tamaño del paciente, y la enfermedad o desorden asociada con el paciente. En general, ésta es una cantidad entre aproximadamente 0.05 y 50 mg/kg del individuo que va a ser tratado. La determinación de la dosis efectiva está muy por dentro de la experiencia de un médico de experiencia ordinaria . 10. Descripción de las modalidades preferidas En una modalidad preferida, los métodos de la presente invención son utilizados para identificar ligandos de bajo peso molecular que se enlazan al menos a dos diferentes sitios de interés sobre las proteínas objetivo, a través de trabadores de disulfuro intermediarios entre un primer ligando y la proteína, y un grupo reactivo sobre el primer ligando y un segundo ligando, respectivamente. Los ligandos de bajo peso molecular, seleccionados en las modalidades preferidas de la invención, serán, para la mayor parte, moléculas químicas pequeñas tendrán menos de aproximadamente 2000 daltones en tamaño, usualmente menos de aproximadamente 1500 daltones en tamaño, más usualmente menos de aproximadamente 750 daltones, preferentemente menos de aproximadamente 500 daltones, frecuentemente menos de aproximadamente 250 daltones, y lo más frecuentemente menos de 200 daltones, aunque moléculas orgánicas con tamaños mayores de 2000 daltones encontrarán también uso en la presente. En una modalidad preferida, tales moléculas químicas pequeñas son moléculas orgánicas pequeñas, diferentes de los polípéptidos o polinucleótidos . En otra modalidad preferida, las moléculas orgánicas pequeñas son no poliméricas, por ejemplo son no peptídicas, polipeptídicas , polínucleotídicas , etc. Las moléculas orgánicas pueden ser obtenidas a partir de una fuente comercial o no comercial. Por ejemplo, un número grande de compuestos químicos orgánicos pequeños serán fácilmente obtenibles a partir de proveedores comerciales tales como Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI y Sigma Chemical Co., Sr. Louis, MO, o pueden ser obtenidas por síntesis química. Los métodos de la presente invención son preferentemente utilizados para seleccionar bibliotecas de compuestos orgánicos pequeños que poseen grupo reactivo apropiado, preferentemente grupos con tiol o tiol protegido.

En años recientes, bibliotecas combinatorias, que tiene típicamente de docenas o cientos de miles de miembros, se han vuelto una herramienta principal para el descubrimiento de ligandos y el desarrollo de fármacos. En general, las bibliotecas de compuestos orgánicos que encuentran uso en la presente, comprenderán al menos dos compuestos orgánicos, f ecuentemente al menos aproximadamente 25 diferentes compuestos orgánicos, más frecuentemente al menos aproximadamente 100 diferentes compuestos orgánicos, usualmente al menos aproximadamente 300 diferentes compuestos orgánicos, preferentemente al menos aproximadamente 2500 diferentes compuestos orgánicos, y lo más preferentemente al menos aproximadamente 5000 o más compuestos orgánicos. Las poblaciones pueden ser seleccionadas o construidas tales que cada molécula individual de la población pueda ser espacíalmente separada de las otras moléculas de la población (por ejemplo, en un pozo de microtitulación separado) o dos o más miembros de la población pueden ser combinados si los métodos de desconvolución son fácilmente disponibles. Usualmente, cada miembro de la biblioteca de moléculas orgánicas será de la misma clase química (por ejemplo todos los miembros de la biblioteca son aldehidos, todos los miembros de la biblioteca son aminas primarias, etc.), no obstante, bibliotecas de compuestos orgánicos pueden también contener moléculas de dos o más diferentes clases químicas.

En una modalidad preferida, la molécula biológica objetivo (TBM) es un polipéptido que contiene o que ha sido modificado para contener un grupo tiol, grupo tiol protegido o enlace disulfuro reversible. La TBM se hace luego reaccionar con un extensor de molécula pequeña (SME), que incluye una porción que tiene afinidad por un primer sitio de interés sobre la TBM, y un grupo reactivo con el tiol, tiol protegido o enlace disulfuro reversible sobre la TBM. Como se discutió anteriormente, el enlace entre la TBM y el SME puede ser ya sea un enlace covalente irreversible (traba extendida "estática") o unn enlace covalente reversible (traba extendida "dinámica") para formar un complejo TBM-SME. Ya sea que utilice procedimiento estático o dinámico, el complejo TBM-SME es luego utilizado para seleccionar una biblioteca de monóferos que contienen disulfuro para identificar un miembro de la biblioteca que tienen afinidad intrínseca, más preferentemente la más alta afinidad intrínseca, para un segundo sitio de enlace (sitio de interés) sobre la molécula objetivo. En una modalidad preferida, el grupo reactivo sobre la TBM modificada es un grupo tiol libre contribuido por el extensor, y la biblioteca está constituida de compuestos de pequeño peso molecular que contiene grupo tiol reactivo. Para la traba del disulfuro, para capturar el ligando más estable, la reacción debe ser bajo intercambio rápido para permitir el equilibrio. En una modalidad preferida, la reacción es llevada a cabo en presencia de una cantidad catalítica de un agente reductor tal como 2-mercaptoetanol. El equilibrio termodinámico alcanzado en presencia de un agente reductor favorecerá la formación del enlace disulfuro entre el grupo tiol del extensor sobre la TBM modificada y el grupo tiol de un miembro de la biblioteca que tiene afinidad intrínseca por la TBM. De este modo, dos diferentes ligandos con afinidad intrínseca para dos sitios diferentes sobre la misma TBM, serán covalentemente enlazados para formar un diáforo. El diáforo se enlazará a la TBM como una mayor afinidad que cualquiera de las unidades monóforas constituyentes. Las unidades monóforos o de monóforo en un diáforo pueden ser de la misma o de diferentes clases químicas. Por "misma clase química" se entiende que cada componente monóforo es del mismo tipo químico, por ejemplo ambos son aldehidos o aminas, etc . En una modalidad particular, el objetivo puede estar presente sobre un microcircuito o chip puesto en contacto con los ligandos candidatos. En este caso, el enlace covalente que une el primer ligando al objetivo puede ser formado con el chip, en cuyo caso, el chip se volverá parte del enlace covalente, representando una clase especial de "Extensores de Molécula Pequeña". La biblioteca de los ligandos candidatos, por ejemplo, ligandos de molécula orgánica pequeña, pueden ser acoplados a una superficie sólida, por ejemplo, mostrados sobre esferas, por ejemplo como se describe en la publicación del PCT, WO 98/11436 publicada el 19 de Marzo de 1998. En una modalidad particular, las esferas son modificadas para introducir grupos reactivos, por ejemplo, un bajo nivel de grupo sulfhidrilo. Una biblioteca de ligandos candidatos es luego sintetizada sobre las esferas modificadas. Subsecuentemente, la biblioteca es incubada bajo condiciones oxidantes, con el objetivo que contiene o que está modificado para contener un grupo reactivo, por ejemplo, un grupo sulfhidrilo tal que puede ser formado un enlace disulfuro entre el objetivo y el sulfhidrilo sobre la esfera. Las esferas son luego lavadas en presencia de un agente reductor, seguido por la incubación en presencia de un agente de apagado de sulfhidrilo, tal como yodoacetato. Las esferas pueden ser luego lavadas bajo condiciones de desnaturalización para eliminar cualquier objetivo enlazado no covalentemente .

EJEMPLOS La invención es además ilustrada por los siguientes ejemplos no limitantes. A no ser que se anote de otro modo, todos los procedimientos de biología molecular estándares son realizados de acuerdo a los protocolos descritos en "Molecular Cloning: A Laboratory manual, vols. 1-3, editado por Sambrook, J. , Fritsch, E.F., y Maniatis, T . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, vols. 1-2, editado por Ausbubel, F. , Brent, R., Kingston, R. , Moore, D., Seidman, J.G., Smith, J. , y Struhl, K., illey Interscience , 1987". El concepto de procedimiento de traba básico ha sido descrito por Erlanson et al., supra, y en la Publicación PCT No. WO 00/00823. El procedimiento de "traba extendida" es ilustrado en esta solicitud utilizando la caspasa-3 como una molécula biológica objetivo (TBM) . Las caspasas son una familia de proteasas de cisteina, que se sabe participan en el inicio y la ejecución de la muerte celular programada (apoptosis) . La primera caspasa (ahora denominada como caspasa-1) fue originalmente designada como enzima de conversión de interleucina-?ß (ICE) (Thornburry et al., nature 356: 768-774

[1992]; Cerretti et al., Science 356: 97-100

[1992]) . Subsecuentemente, ha sido identificado y caracterizado un gran número de caspasas, que forman una familia de caspasas. Actualmente, existen al menos 10 miembros en la familia (Caspasa-1 a caspasa-10). Las caspasas son expresadas en células en una forma enzimáticamente inactiva y se llegan a activar mediante escisión proteolitica en respuesta a un estimulo apoptótico.

La forma de proenzima inactiva consiste de un dominio grande y uno pequeño (subunidad), además de un dominio N-terminal inhibitorio. La activación de la caspasa involucra el procesamiento de la proenzima en las unidades grandes y pequeñas, lo cual ocurre internamente dentro de la molécula. Las caspasas son activadas ya sea mediante autoagregación y autoprocesamiento (como en el inicio de la apoptosis) o via la escisión por una caspasa activada corriente arriba (como una fase de ejecución de la apoptosis) . Para una revisión, ver por ejemplo, Cohén, G.M. Biochem. J. 326: 1-16 (1997). Con base en un inhibidor tetrapeptidico conocido de la caspasa (Ator y Dolle. Current Pharmaceutical Design 1: 191-210 (1995)), fue sintetizado un extensor: éster 3-(2-acetilsulfanilacetilamino) -4-carboxi-2-oxobutilico del ácido 2 , 6-diclorobenzoico (mostrado como el compuesto 5 en la figura 4), la síntesis del cual se describe en el Ejemplo 2 siguiente. Una estructura genérica del extensor es mostrada en la Figura 4. La caspasa fue modificada mediante la reacción con el extensor (Ejemplo 3) y subsecuentemente utilizado como una molécula objetivo biológico para la selección de la biblioteca de disulfuros preparada como se describe en el Ejemplo 1, mediante el uso de procedimiento de traba extendida. Todos los materiales comercialmente disponibles fueron utilizados tal como se recibieron. Todos los compuestos sintetizados fueron caracterizados por RMN H [Espectrómetro Bruker (Billerica, MA) DMX400 MHz] y HPLC-MS (Hewlett-Packard Series 1100 MSD) .

Ejemplo 1 Biblioteca de disulfuro Las bibliotecas de disulfuro fueron sintetizadas utilizando la quimica estándar a partir de las siguientes clases de compuestos: aldehidos, cetonas, ácidos carboxilicos , aminas, cloruros de sulfonilo, isocianatos, e isotiocianatos . Por ejemplo, los miembros de la biblioteca que contiene disulfuro fueron elaborados a partir de ácidos carboxilicos comercialmente disponibles y cistamina rnono-N- ( ter-butoxicarbonil ) -protegida (mono-BOC-cistamina ) mediante la adaptación del método de Parlow y colaboradores (Parlow y Normansell, Mol. Diversity 1: 266-269

[1995]). En resumen, 260 µp??? de cada ácido carboxilico se inmovilizaron sobre 130 µ?t??? equivalentes de 4-hidroxi-3-nitrobenzofenona sobre resina de poliestireno utilizando 1 , 3-diisopropilcarbodiimida (DIC) en N , N-dimetilformamida (DMF) . Después de 4 horas a temperatura ambiente, la resina se enjuagó 2 veces con DMF, 3 veces con diclorometano (DMC) y 1 vez con tetrahidrofurano (THF) para eliminar el ácido no acoplado y DIC. Los ácidos fueron escindidos de la resina por medio de la formación de la amida con 66 µp??? de la cistamina mono-BOC-protegida, en THF. Después de la reacción por 12 horas a temperatura ambiente, el solvente se evaporó, y el grupo BOC fue eliminado de la mitad no acoplada de cada disulfuro mediante el uso de ácido trifluoroacético TFA al 80% en DCM. Los productos fueron caracterizados mediante HPLC-MS, y aquellos productos que fueron sustancialmente puros fueron utilizados sin purificación adicional. Se elaboraron un total de 530 compuestos mediante el uso de esta tecnología. Fueron también construidas bibliotecas a partir de la cistamina mono-BOC-protegida y una variedad de cloruro de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos . En el caso de los cloruros de sulfonilo 10 µ?t??? de cada cloruro de sulfonilo fue acoplado con 10.5 µt??? de la cistamina de mon-BOC-protegida en THF (con 2% de diisopropiletilamina) en presencia de 15 mg de poli ( 4 -vinilpiridina ) . Después de 48 horas, la poli ( -vinilpiridin ) fue retirada por medio de filtración y el solvente se evaporó. Luego fue removido mediante 50% de TFA en DMC . En el caso de los isotiocianatos, 10 µp??? de cada isocianato o isotiocianato fue acoplado con 10.5 µ?t??? de la cistamina mono-BOC-protegida, en THF. Después de la reacción por 12 horas a temperatura ambiente, el solvente se evaporó y el grupo BOC fue eliminado mediante el uso de TFA al 50% en DCM. Se elaboraron un total de 212 compuestos mediante el uso de esta metodología . Finalmente, fueron construidas las bibliotecas basadas en oxima mediante la reacción de 10 µ???? de aldehidos o cetonas específicas con 10.5 µ?t??? de HO ( CH2 ) 2S-S ( CH2 ) 2ONH2 en metanol/cloroforrao 1:1 (con 2% de ácido acético agregado) por 12 horas a temperatura ambiente, para producir el producto de oxima. Se elaboraron un total de 448 compuestos mediante el uso de esta metodología. Los miembros individuales de la biblioteca fueron disueltos nuevamente ya sea en acetonitrilo o en sulfóxido de dimetilo hasta una concentración final de 50 ó 100 mM. Las alícuotas de cada uno de éstos fueron luego combinados en grupos 8 a 15 compuestos discretos, con cada miembro del combinado que tenía un peso molecular único.

Ejemplo 2 Síntesis del extensor (SME) Para el procedimiento de traba extendido, el extensor (éster 3- (2-acetilsulfanilacetilamino) - -carboxi-2-oxobutílico del ácido 2 , 6-diclorobenzoico, mostrado como el compuesto 5 en la Figura 4) fue sintetizado utilizando una serie de reacciones químicas como se muestra en la Figura 4 y descrito más adelante.

Síntesis del éster 4-ter-butílico del ácido 2- (2-acet ilsulfanilacetilamino) -succinico (compuesto 2 de la Figura 4) El éster pentafluorofenílico del ácido acetilsulfonilacético (1.6 g, 5.3 mmol) y H-Aspr (OtBu) -OH (1 g, 5.3 mmol) se mezclaron en 20 mi de diclorcmetano (DMC) anhidro. Luego, se agregaron 1.6 mi de trietilamina (11.5 mmol), y la reacción se dejó proceder a temperatura ambiente por 3.5 horas. La capa orgánica se extrajo luego con 3 porciones de 15 mi de carbonato de sodio 1 M, las fracciones acuosas combinadas se acidificaron con 100 mi de sulfato ácido de sodio 1 M y se extrajeron con 3 porciones de 30 mi de acetato de etilo. Las fracciones orgánicas combinadas se enjuagaron luego con 30 mi de sulfato ácido de sodio 1 M, 30 mi de cloruro de sodio 5 M, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron bajo presión reducida para producir 1.97 g de un jarabe casi incoloro, el cual se utilizó sin purificación adicional. PM = 305 (encontrado 306, M+l).

Síntesis del éster ter-butilico del ácido 3- (2-acetilsulfanilacetilamino) -5-eloro-4 -oxo-pentanoico (compuesto 3, Figura 4) 11 El ácido libre (compuesto 2) se disolvió en 10 mi de tetrahidrofurano (THF) anhidro enfriado a 0°C, y se trató con 0.58 mi de N-metilmorfolina (5.3 mmol) y 0.69 mi de cloroformiato de isobutilo. Se formó inmediatamente un precipitado blanco denso, y después de 30 minutos la reacción se filtró a través de frita de vidrio y se transfirió a un nuevo matraz con 10 mi adicionales de THF. Mientras tanto, se preparó diazometano mediante la reacción de l-metil-3-nitro-l-nitrosoguanidina (2.3 g, 15.6 mmol) con 7.4 mi de hidróxido de potasio acuoso al 40% y 25 mi de éter dietilico por 45 minutos a 0°C. La capa de éter amarilla fue luego decantada dentro de la reacción que contenía anhídrido mixto y la reacción se dejó proceder mientras que se calentaba lentamente a temperatura ambiente en un periodo de 165 minutos. La reacción se enfrió a 8°C, y se agregaron gota a gota 1.5 mi de ácido clorhídrico 4 N en dioxano (6 mmol en total) esto dio como resultado mucho burbujeo y la solución amarilla se volvió incolora. La reacción se dejó proceder por dos horas mientras que se calentaba gradualmente la temperatura ambiente y luego se apagó con 1 mi de ácido acético glacial. El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo se disolvió nuevamente en 75 mi de acetato de etilo, se enjuagó con 2 porciones de 50 mi de carbonato ácido de sodio saturado, 50 mi de cloruro de sodio 5 M, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó hasta sequedad antes de la purificación mediante cromatografía instantánea utilizando cloroformo : acetato de etilo 90:10 para producir 0.747 g de un aceite amarillo claro (2.2 mmol, 42% de (1)). PM esperado = 337.7, encontrado 338 (M+l) .

Síntesis del éster 3- ( 2-acetiisulfanilacetilamino) -4-ter-butoxicarbonil-2-oxobutílico del ácido 2,6-diclorobenzoico (compuesto 4, Figura 4) La clorometilcetona (compuesto 3) (0.25 g, 0.74 mmol) se disolvió en 5 mi de N, N-dimetilformamida anhidra (DMF), a la cual se agregaron 0.17 g de ácido 2,6-diclorobenzoico (0.89 mmol) y 0.107 g de fluoruro de potasio (1.84 mmol). La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente por 19 horas, punto en el cual éste se diluyó con 75 mi de acetato de etilo, se enjuagó con 2 porciones de 50 mi de carbonato ácido de sodio saturado, 50 mi de sulfato ácido de sodio 1 M, 50 mi de cloruro de sodio 5 M, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se secó bajo presión reducida para producir un jarabe amarillo el cual por HPLC-MS se reveló que era aproximadamente 75% del producto y 25% sin reaccionar (3). Este se utilizó sin purificación adicional. PM esperado = 492.37, encontrado 493 (M+l).

Síntesis del éster 3- (2-acetilsulfanilacetilamino) - 4-carboxi-2-oxobutilico del ácido 2, 6-diclorobenzoico (compuesto 5, Figura 4) El producto del paso previo (compuesto 4) se disolvió 10 mi de DCM anhidro enfriado a 0°C, y se trató con 9 mi de ácido trifluoroacético (TFA) . La reacción se retiró luego del baño de hielo y se dejó calentar hasta la temperatura ambiente en un periodo de una hora. El solvente se eliminó bajo presión reducida, y el residuo se disolvió dos veces en DCM y se evaporó para eliminar el TFA. El producto crudo se purificó mediante cromatografía líquida de alta presión de fase inversa, para producir 101.9 mg (0.234 mmol, 32% de (3)) de un polvo higroscópico blanco. PM esperado = 436.37, encontrado 437 (M+l) . Este se disolvió en sulfóxido de dimetilo (DMSO) para producir solución de reserva 50 mM.

Ejemplo 3 Modificación de la caspasa 3 con el extensor La caspasa 3 fue clonada, sobreexpresada y purificada utilizando técnicas estándares (Rotonda et al., Nature Structural Biology 3(7) : 619-625 (1996) ) . ? 2 mi de una solución de caspasa 3 a 0.2 mg/ml, se agregó 10 mi de éster 3- (2-acetilsulfanil-acetilamino) -4-carboxi~2-oxo-butilico del ácido 2, 6-diclorobenzoico (compuesto 5, Figura 3) sintetizado como se describe en el Ejemplo 2, y la reacción se dejó proceder a la temperatura ambiente por 3.5 horas, punto en el cual la espectroscopia de masa reveló la modificación completa la subunidad grande de la caspasa 3 (MP 16861DA, PM calculado 16860Da) . El tioéster fue desprotegido mediante la adición de 0.2 mi de hidroxilamina 0.5 M amortiguada en amortiguador de PBS, y permitiendo que la reacción procediera por 18 horas, punto en el cual la subunidad grande tuvo una masa de 1681Da (16818Da calculados) . La proteina fue concentrada en una unidad Ultrafree 5 MWCO (Millipore) y el amortiguador intercambiado a TES 0.1 M pH 7.5 utilizando una columna Nap-5 (Amersham Pharmacia Biotech) . La estructura de la caspasa-3 "extendida" resultante se muestra en la Figura 6. La proteina fue luego seleccionada contra una biblioteca de disulfuro preparada como se describe anteriormente, en el Ejemplo 1, y utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 4 siguiente.

Ejemplo 4 Selección de la Biblioteca de Disulfuro En un experimento típico, 1 µ? de una solución en DMSO que contenia una biblioteca de 8-15 compuestos que contenían disulfuro, se agregó a 49 µ? del amortiguador que contenía la proteína modificada con el extensor. Cuando se utilizó espectroscopia de masa para la identificación del ligando enlazado, los compuestos fueron elegidos de modo que cada uno tuvo un peso molecular único. Por ejemplo, estos pesos moleculares difieren por al menos 10 unidades de masa atómica, de modo que la desconvolución es no ambigua. Aunque los combinados de 8 a 15 compuestos que contenían disulfuro fueron típicamente elegidos para la selección debido a la facilidad de desconvulución pueden también ser utilizados combinados más grandes. La proteína estuvo presente a una concentración de aproximadamente 15 µ?, cada uno de los miembros de la biblioteca de disulfuro estuvo presente a aproximadamente 0.2 mM, y de este modo la concentración total de todos los miembros de la biblioteca de disulfuro fue de aproximadamente 2 mM. La reacción se realizó en un amortiguador que contenía fosfato de potasio 25 mM (pH 7.5) y 2-mercaptoetanol 1 mM, aunque pueden ser utilizados otros amortiguadores y agentes reductores. Las reacciones se dejaron equilibrar a temperatura ambiente por al menos 30 minutos. Estas condiciones pueden ser variadas, dependiendo considerablemente de la facilidad con la cual la proteína se ioniza en el espectrómetro de masa, la reactividad de la(s) cisteína(s) especí flea (s) , etc.

Después del equilibrio de la caspasa-3 conjugada al aspartilo (Ejemplo 3) y la biblioteca (Ejemplo 1), la reacción se inyectó sobre un HPLC HP1100 y se sometió a cromatografía sobre una columna CÍB acoplada a un espectrómetro de masa ( Finnigan-MAT LCQ, San José, CA) . Los iones múltiplemente cargados que surgen de la proteína fueron desconvulusionados con el software adecuado (XCALIBUR) para llegar a la masa de la proteína. La identidad de cualquier miembro de la biblioteca unida a través de un enlace disulfuro a la proteína fue luego fácilmente determinada mediante la sustracción de la masa conocida de la proteína no modificada de la masa observada. Este proceso asume que el acoplamiento de un miembro de la biblioteca no cambia dramáticamente las características de ionización de la proteína misma, un presunto conservador debido que en la mayoría de los casos la proteína será al menos 20 veces más grande que cualquier miembro dado de la biblioteca. Este presunto fue confirmado por la demostración que las moléculas pequeñas seleccionadas por una proteína no son seleccionadas por otra proteína. Los resultados de un experimento representativo son mostrados en la Figura 6. el espectro al lado derecho de la Figura 6 muestra el resultado de la reacción de la caspasa-3 "extendida" (sintetizada como se describe en el Ejemplo 3) con una molécula que contiene disulfuro identificada a partir de un combinado como modificación de la caspasa-3 extendida. El pico predominante obtenido (masa de 17,094) corresponde a la caspasa-3 covalentemente enlazada al ligando de molécula pequeña que tiene una afinidad intrínseca por un segundo sitio de interés sobre la caspasa-3 dando como resultado el compuesto diáforo mostrado por arriba del pico. El espectro de masa mostrado en el lado derecho es un espectro de masa desconvolucionador de la caspasa-3 no modificada (un objetivo polipeptídico que contiene cisteína) , y el mismo ligando de molécula pequeña que contiene disulfuro, utilizado anteriormente. El espectro revela un pico predominante correspondiente a la masa de la caspasa-3 modificada (16,614 DA). Un pico significativamente más pequeño representa la caspasa-3 unida por enlace disulfuro al 2-aminoetanotiol (masa combinada: 16,691 Da) . Nótese que aquí el ligando de molécula pequeña no es seleccionado debido a que su sitio de enlace está demasiado alejado de la cisteína reactiva y no ha sido introducido el extensor. El compuesto guía inicial, identificado como se cescribe anteriormente, fue luego modificado con el fin de evaluar la importancia relativa de los diversos sust ituyentes en el enlace específico a la caspasa-3. Todas las referencias citadas a todo lo largo de la especificación son expresamente incorporadas por referencia en la misma.

Mientras que la presente invención ha sido descrita con referencia a la modalidad especifica de la misma, debe ser comprendido por aquellos expertos en la técnica que pueden ser realizados diversos cambios y los equivalentes pueden ser · sustituidos sin apartarse del espíritu y alcance verdadero de la invención. Además, pueden ser realizadas muchas modificaciones para adaptar una situación particular, material, composición de materia, proceso, paso de proceso, o pasos, al objetivo, espíritu y alcance de la presente invención. Todas las modificaciones tales se pretende que estén dentro del alcance de las reivindicaciones anexas a la presente . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (28)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un proceso, caracterizado porque comprende: (i) la provisión de una Molécula Biológica Objetivo (TBM) que contiene o que es modificada para contener un nucleófilo reactivo cerca de un primer sitio de interés sobre la TBM; (ii) poner en contacto la TBM de (i) con un extensor de molécula pequeña que tiene un primero y un segundo grupo funcional, en donde el primer grupo funcional es reactivo con el nucleófilo sobre la TBM; (iii) el ajuste de las condiciones para provocar que se forme un enlace covalente entre el nucleófilo sobre la TBM y el primer grupo funcional sobre el extensor de molécula pequeña, con el cual se forma un complejo covalente que comprende la TBM y el extensor de molécula pequeña, mostrando el complejo el segundo grupo funcional cerca de un segundo sitio de interés sobre la TBM; (iv) poner en contacto el complejo de (iii) con una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas, teniendo cada molécula un grupo funcional capaz de reaccionar con el segundo grupo funcional sobre el extensor de molécula pequeña presente en el complejo de (iii), bajo condiciones tales que el miembro de la biblioteca que tiene la mayor afinidad por el segundo sitio de interés sobre la TBM forma un enlace químico con el complejo; y (v) la identificación del miembro de la biblioteca de (iv) .

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo grupo funcional sobre el segundo grupo funcional sobre el extensor de molécula pequeña es un tiol libre o un tiol protegido.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque en el paso (iv) del complejo de (iii) se pone en contacto con una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas, teniendo cada una un grupo tiol libre o un grupo de enlace al disulfuro, intercambiable.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el complejo de (iii) y la biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas se ponen en contacto bajo condiciones de intercambio de tiol en donde el miembro de la biblioteca que tiene la mayor afinidad por el segundo sitio de interés sobre la TBM, forma un enlace disulfuro con el complejo.

5. El proceso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque las condiciones de intercambio ocurren a partir de la adición de un agente reductor de disulfuro seleccionado del grupo que consiste de mercaptoetanol, ditiotreitol ( DTT) , ditioeritreitol (DTE), ácido raercaptopropanoico, glutatión, cisteamina, cisterna, tris ( carboxietil ) fosfina (TCEP) , y tris ( cianoetil ) fos fina .

6. El proceso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende además el paso de sintetizar una molécula que consiste esencialmente del extensor de molécula pequeña, en donde el primer grupo funcional ya no es reactivo con el nucleófilo sobre la TB , y el enlace disulfuro entre el segundo grupo funcional y el miembro de la biblioteca identificado en el paso (i) es reemplazado con un grupo diferente.

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el enlace disulfuro es reemplazado con un grupo alquilo.

8. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende además el paso de sintetizar derivados de la molécula.

9. El proceso de conformidad con cualquiera de las rei indicaciones 1 a 8, caracterizado porque el nucleófilo reactivo es un tiol.

10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el primer grupo funcional forma un enlace covalente irreversible con el tiol.

11. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende además, después del paso (i), (a) poner en contacto la TBM con una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas, teniendo cada molécula un grupo de enlace de disulfuro intercambiable, bajo condiciones de intercambio de tiol en donde el miembro de la biblioteca que tiene la mayor afinidad por el primer sitio de interés forma un enlace disulfuro con la TBM; (b) la identificación del miembro de la biblioteca de (a ) ; y (c) la formación de un derivado del miembro de la biblioteca en (b) que es un extensor de molécula pequeña que tiene un primer grupo funcional que es reactivo con el nucleófilo y un segundo grupo funcional que es un tiol o tiol protegido .

12. El proceso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el paso (a) comprende además la adición de un agente reductor de disulfuro seleccionado del grupo que consiste de mercaptoetanol , ditiotreitol ( DTT) , ditioe itreitol (DTE), ácido mercaptopropanoico, glutatión, cisteamina, cisteína, tris ( carboxietil ) fosfina (TCEP) , y tris (cianoetil) fosfina .

13. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el nucleófilo reactivo es un grupo hidroxilo (-OH) .

14. El proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el grupo reactivo con el nucleófilo se selecciona del grupo que consiste de un carbonilo activado, epóxido, aziridina, sulfonato aromático, hemiacetal, halometilcetona, arilaciloximetilcetona , disulfuro, tiosulfonato, y tiosulfato.

15. El proceso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el carbonilo activado está en la forma de un aldehido, cetona, un éster, o haluro de acilo.

16. El proceso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el carbonilo activado se selecciona del grupo que consiste de halometílcetonas , arilací loxometilcetonas y tioésteres.

17. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el nucleófilo reactivo es una amina.

18. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el paso de identificación comprende el análisis de espectro de masa.

19. El proceso de conformidad con la reivindicación 3 u 11, caracterizado porque cada molécula en la biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas que tiene un grupo de enlace a disulfuro intercambiable, contiene la porción cisteamina.

20. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la TBM se selecciona del grupo que consiste de receptores de la superficie celular de linfocitos, enzimas, receptores esteroides, proteínas nucleares, inhibidores de enzimas alostéricas, factores de la coagulación, cinasas y desfosforilasas de serina/treonina, cinasas y desfos forilasas de treonina, enzimas bacterianas, enzimas fúngicas y enzimas virales, moléculas de transducción de señales, factores de la transcripción, proteínas asociadas con la síntesis de ADN y/o ARN o la degradación de los mismos, inmunoglobulinas , hormonas, receptores de citocina, quimiocinas y sus receptores, ligandos y receptores para la tirosina-cinasa, neurotrofinas y sus ligandos, y otras hormonas y receptores.

21. El proceso de conformidad con cualquiera de las rei indicaciones 1 a 19, caracterizado porque la TBM se selecciona del grupo que consiste de eritropoyet ina (EPO) , receptor del factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , receptor del factor de estimulación de colonias de macrófagos (GM-CSF) , trombopoyetina (TPO) , ínterleucinas , por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-11, IL-12, hormona del crecimiento, prolactina, lactógeno placentario humano (LPL) , CNTF, oncostatina, RANTES ???ß, IL-8, insulina, factor 1 de crecimiento similar a insulina (IGF-1), factor de crecimiento epidérmico (RGF) , herregulina a y herregulina ß, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento placentario (PLGF), factores de crecimiento tisular (TGF- y TGF-ß) , factor de crecimiento nervioso (NGF) , factores morfogénicos óseos, hormona estimulante del folículo (FSH), hormona luteinizante (LH) , factor de necrosis tisular (TNF) , factores 1 y 2 de la apoptosis (AP-1 y AP-2), y mdm2.

22. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la TBM se selecciona del grupo que consiste de IgE/IgER, ZAP-70, lck, syk, ITK/BTK, TACE, Cathepsin S y F, CDlla, LFA/ICAM, VLA-4, CD28/B7, CTLA4, TNF alfa y beta, (y los receptores de TNF p55 y p75 ), CD40L, cinasa p38 map, IL-2, IL-4, IL-13, IL-15, Rae 2, PKC teta, IL-8, TA -1 , jnk, IKK2, IL-18, caspasas 1, 3, 8 y 9, IL-l/receptor de IL-1, BACE, integrasa deL VIH, PDE IV, helicasa de la Hepatitis C, proteasa de la Hepatitis c, proteasa de rinovirus, triptasa, cPLA (fosfolipasa A2 citosólica), CDK4, cinasa c-jun, adaptadores tales como Grb2, GSK-3, AKT, MEKK-1, PA -1, raf, TRAF' s 1-6, Tie2, ErbB 1 y 2, FGF, PDGF, PARP, CD2, receptor C5a, CD4, CD26, CD3 , TGF-alfa, NF-kB, IKK beta, STAT 6, Neurocinina 1, PTP-1B, CD45, Cdc25A, SHIP-2, TC-PTP, PTP-alfa, LAR y p53 humano, bax/bcl2 y mdm2.

23. Una molécula, caracterizada porque comprende un miembro de la biblioteca identificada en el paso (v) de conformidad con la reivindicación 1.

24. La molécula de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque comprende además al menos parte del extensor de molécula pequeña utilizado en el paso (ii) de conformidad con la reivindicación 1.

25. La molécula de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque comprende el miembro de la biblioteca y el extensor de molécula pequeña o parte del mismo, ligado por un enlace covalente.

26. La molécula de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el enlace covalente es diferente de un enlace disulfuro.

27. La molécula de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque comprende variantes funcionales del miembro de la biblioteca y el extensor de molécula pequeña o parte del mismo, ligado por un enlace covalente.

28. La molécula de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el enlace covalente es diferente de un enlace disulfuro.