DE60311879T2 - Synthese und screening von liganden mit hilfe von röntgenkristallographie - Google Patents

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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins

Description

  • Diese Erfindung betrifft Verfahren für die Synthese von Verbindungen und die Identifikation von Liganden von diesen Verbindungen, die Zielmakromoleküle binden, mittels Röntgen-Kristallographie.
  • Hintergrund
  • Die Bestimmung der Struktur von Proteinen durch Röntgen-Kristallographie ist ein elegantes und verlässliches Verfahren und stellt die Grundlage von strukturbasiertem Ligandendesign dar, bei dem kleine Moleküle als potenzielle Liganden für das Protein von Interesse synthetisiert werden. Auf diesem Gebiet wird intensiv Forschung betrieben, um die Liganden für Arzneimittel für therapeutisch interessante Proteine zu optimieren (siehe R. E. Babine und S. L. Bender, Chemical Reviews 97, 1359–1472 (1997), sowie R. S. Bohacek et al., Med. Res. Rev. 16, 3–50 (1996)).
  • Ein Verfahren des Ligandenscreenens wird in WO 99/45379 beschrieben, wobei eine Bibliothek von Verbindungen mit verschiedenen Formen, von denen angenommen wird, dass sie potenzielle Liganden sind, eingetaucht oder mit einem Zielprotein cokristallisiert wird, und dann wird der resultierende Komplex mittels Röntgen-Kristallographie analysiert, um die Natur des Liganden, der gebunden wurde, zu bestimmen. Die Bibliothek der Verbindungen, die bei dem Screening-Verfahren eingesetzt werden, umfasst die zuvor charakterisierten Verbindungen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Das oben beschriebene Verfahren erfordert, dass jeder potenzielle Ligand synthetisiert, gereinigt und charakterisiert werden muss, bevor er einen Teil einer Bibliothek für das Screenen bilden kann. Wenn die potenziellen Liganden einfach käuflich erworben werden, sind sie üblicherweise teuer, da diese drei Schritte einen hohen Arbeitsaufwand erfordern. Wenn alternativ dazu die Verbindungen "betriebsintern" synthetisiert werden, ist für die Zusammenstellung der Ligandenbibliothek für das Screenen viel Zeit und Aufwand erforderlich.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ein Verfahren entwickelt, bei dem eine Gruppe von Verbindungen synthetisiert und dann gescreent wird, ohne dass Reinigungs- und/oder Charakterisierungsschritte erforderlich sind.
  • Im Allgemeinen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifikation eines Liganden eines Zielmakromoleküls bereit, das folgende Schritte umfasst:
    • a) das Eintauchen von einem oder mehreren Kristallen des Zielmakromoleküls in einer Lösung, die eine Gruppe von Verbindungen umfasst, die in situ oder getrennt von dem Kristall hergestellt wurden, wobei die Lösung ohne Reinigung, und vorzugsweise ohne Charakterisierung, der synthetisierten Gruppe von Verbindungen hergestellt wurde;
    • b) das Erstellen eines Röntgen-Kristallbeugungsdiagramms des eingetauchten Makromolekülkristalls; und
    • c) die Verwendung des Röntgen-Kristallbeugungsdiagramms zur Identifikation einer beliebigen Verbindung, die an den Makromolekülkristall gebunden ist, wobei die Verbindung ein Ligand des Zielmakromoleküls ist.
  • Ein beliebiges gelöstes Kristallsystem, in dem die Lösungsmittel- und/oder die Ligandenmoleküle in der Lage sind, durch Diffusion in den Kristall einzudringen, wobei das Kristallsystem mit der Sammlung an Röntgen-Beugungsdaten kompatibel ist, ist für die Verwendung in dieser Erfindung geeignet.
  • Das Zielmakromolekül wird aus Polypeptiden (Proteinen), Ribosenucleinsäuren (RNA, Ribozyme etc.), Desoxyribosenucleinsäuren (DNA) und Komplexen von Kombinationen dieser drei Beispiele, z.B. Ribosome oder Viren (DNA- und/oder RNA-Proteinkomplexe), ausgewählt.
  • Ein Ligand ist ein Molekül, das an ein Makromolekül binden kann. Für eine Polypeptidkette (ein Protein) ist dies alles, für das die DNA-Sequenz des Proteins nicht kodiert. Das umfasst die Post-Translations-Modifikation von Proteinen (z.B. kovalente Bindung von Zuckern etc.), die kovalente und nicht kovalente Bindung von Cofakto ren (z.B. Häm-Gruppen), die Bindung von anderen Polypeptiden oder Aminosäuren, die Bindung von kleinen Molekülen (z.B. Arzneimittel, Substrate etc.) und die Bindung von DNA und RNA an Proteine. Für Nucleinsäuren sind dies Moleküle, die entweder kovalent oder nicht kovalent an DNA oder RNA gebunden sind (z.B. zwischen Basen eingelagerte Liganden).
  • In der vorliegenden Erfindung können die Verbindungen durch Parallelsynthese oder (zweckdienlicher) durch kombinatorische Chemie hergestellt werden. Traditionellerweise wird kombinatorische Chemie eingesetzt, um Inhibitoren mit geringer Größe für das Screenen gegen ein oder mehrere biologische Targets herzustellen. Die Synthese von Verbindungsbibliotheken zielt im Allgemeinen darauf ab, entweder Verbindungen als gereinigte Einzeleinheiten oder als hochqualitative Gemische von Verbindungen herzustellen, wobei eine Methode eingesetzt wird, die die Dekonvolution des Gemischs ermöglicht, wenn festgestellt wurde, dass eine aktive Verbindung in diesem Gemisch vorhanden ist. Die Dekonvolution erfordert einen erneuten Test jedes Verbindungselements der aktiven Bibliothek. Beide Verfahren erfordern also die sorgfältige Analyse und Charakterisierung der Bibliotheken, um die Interpretation der durch das biologische Screenen gegen das Zielmakromolekül erhaltenen Daten zu ermöglichen. Wie oben bereits angesprochen erfordert die vorliegende Erfindung nicht die Reinigung und/oder Charakterisierung der Elemente der synthetisierten Bibliothek, da die Identität der Liganden durch Röntgenkristallographie des Liganden-Makromolekül-Komplexes bestimmt wird.
  • Die Lösung, die die Gruppe von Verbindungen enthält, kann im Wesentlichen auf zwei Arten hergestellt werden, die hierin als "In-situ-Synthese" und "Just-in-time-Synthese" bezeichnet werden.
  • Die "In-situ-Synthese" umfasst das Synthetisieren der Gruppe von Verbindungen in einer Lösung, die ebenfalls einen oder mehrere Kristalle des Zielmakromoleküls enthält, und erfordert daher die Verwendung von chemischen Verfahren, die unter Bedingungen durchgeführt werden können, unter denen der Makromolekülkristall stabil bleibt.
  • Dementsprechend stellt ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Identifikation eines Liganden eines Zielmakromoleküls wie oben definiert bereit, das die folgenden Schritte umfasst:
    • a) das Synthetisieren einer Gruppe von Verbindungen, die zum Screenen gegen ein Zielmakromolekül geeignet sind, worin die Gruppe von Verbindungen durch ein oder mehrere Syntheseverfahren hergestellt wurde, die dazu konzipiert sind, zwei oder mehrere Sätze von Monomeren miteinander zu verbinden, und worin alle Verbindungen in der Gruppe eine gemeinsame funktionelle Gruppe aufweisen, die durch Reaktion zweier oder mehrerer komplementärer funktioneller Gruppen im Satz von Monomeren gebildet wird, und zwar in einer Lösung, die einen oder mehrere Kristalle des Zielmakromoleküls enthält;
    • b) das Erstellen eines Röntgen-Kristallbeugungsdiagramms des eingetauchten Makromolekülkristalls; und
    • c) das Verwenden des Röntgen-Kristallbeugungsdiagramms zur Identifikation einer beliebigen Verbindung, die an den Makromolekülkristall gebunden ist, wobei die Verbindung ein Ligand des Zielmakromoleküls ist.
  • Bei diesem Verfahren erfolgt die Synthese der Gruppe von Verbindungen in einem einzigen Reaktionsgefäß, d.h. in dem Gefäß, in dem die Lösung, die einen oder mehrere Kristalle des Zielmakromoleküls enthält, vorhanden ist.
  • Die "Just-in-time-Synthese" umfasst das Synthetisieren der Gruppe von Verbindungen getrennt von der Lösung, die einen oder mehrere Kristalle des Zielproteins umfasst, und dann die Übertragung der synthetisierten Gruppe in die Lösung, die einen oder mehrere Kristalle des Zielproteins umfasst. Es erfolgt keine Reinigung und/oder Charakterisierung der synthetisierten Gruppe. Die Synthese kann in einem Lösungsmittel erfolgen, das mit den Makromolekülkristallen nicht verträglich ist, von dem die Gruppe von Verbindungen getrennt werden muss, damit sie zu der Lösung zugesetzt werden kann, die die Makromolekülkristalle umfasst.
  • Dementsprechend stellt ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Identifikation eines Liganden eines Zielmakromoleküls wie oben definiert bereit, das die folgenden Schritte umfasst:
    • a) das Synthetisieren einer Gruppe von ungereinigten Verbindungen, die zum Screenen gegen ein Zielmakromolekül geeignet sind, worin die Gruppe von Verbindungen durch ein oder mehrere Syntheseverfahren hergestellt wurde, die dazu konzipiert sind, zwei oder mehrere Sätze von Monomeren miteinander zu verbinden, und worin alle Verbindungen in der Gruppe eine gemeinsame funktionelle Gruppe aufweisen, die durch Reaktion zweier oder mehrerer komplementärer funktioneller Gruppen im Satz von Monomeren gebildet wird;
    • b) das Zusetzen der Gruppe von Verbindungen zu einer Lösung, die einen oder mehrere Kristalle des Zielmakromoleküls enthält;
    • c) das Erstellen eines Röntgenkristallbeugungsdiagramms des eingetauchten Makromolekülkristalls; und
    • d) das Verwenden des Röntgenkristallbeugungsdiagramms zur Identifikation jeglicher Verbindung, die an den Makromolekülkristall gebunden ist, wobei die Verbindung ein Ligand des Zielmakromoleküls ist.
  • Bei diesem Verfahren kann die Synthese der Gruppe von ungereinigten Verbindungen in einem oder mehreren Reaktionsgefäßen erfolgen.
  • Wenn Schritt a) in einem Lösungsmittel erfolgt, das mit den Makromolekülkristallen nicht verträglich ist, wird die Gruppe von Verbindungen nach Schritt a) von dem Lösungsmittel getrennt, in dem die Verbindungen synthetisiert wurden.
  • Typischerweise sind solche nicht verträglichen Lösungsmittel organisch, und der Schritt des Trennens der Gruppe von Verbindungen von diesem Lösungsmittel erfolgt üblicherweise durch das Abdampfen des Lösungsmittels. Danach wird die Gruppe von Verbindungen erneut in der Lösung gelöst, die einen oder mehrere Makromolekülkristalle umfasst.
  • Die Enzymkatalyse in organischen Lösungsmitteln war in den letzten Jahren von großem Interesse (C. Mattos und D. Ringe, Curr. Opin. Struct. Biol. 11(6), 761–764), und die Verwendung von Enzymen in nicht-wässrigen Medien hat das Gebiet der Biokatalyse ausgeweitet (ASGSB Bull. 4(2), 125–132 (1991)). Es wurde viel daran gearbeitet, die organischen Bindungsstellen in Kristallen durch das Eintauchen von Kristallen in organische Lösungsmittel darzustellen (A. C. English et al., Proteins 37, 628–640 (1999); C. Mattos und D. Ringe, Nauret Biotechnol. 14(5), 595–599 (1996)). Zusätzlich dazu wurde gezeigt, dass Enzymkristalle ihre Aktivität in organischen Lösungsmitteln beibehalten können, sowohl in Gegenwart von Vernetzern als auch ohne diese (M. Ayala et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 295(4), 828–831 (2002)).
  • Einen alternativen Ansatz stellt die Trennung des nicht verträglichen Lösungsmittels von der Lösung, die einen oder mehrere Makromolekülkristalle umfasst, durch eine durchlässige Membran dar, die die Übertragung der Verbindungen in der Gruppe von dem nicht verträglichen Lösungsmittel in die Lösung, die einen oder mehrere Makromolekülkristalle umfasst, ermöglicht. Dieser Ansatz erfordert eine Membran, die ausreichend porös ist, um die Diffusion der synthetisierten Verbindungen von dem Lösungsmittel, in dem sie synthetisiert wurden, in die Lösung, die ein oder mehrere Makromoleküle umfasst, zu ermöglichen, während sie im Wesentlichen jegliche Diffusion der Lösungsmittel verhindert. Dialyseknöpfe stellen ein Mittel dafür bereit und sind beispielsweise bei Hampton Research erhältlich. Ihre Verwendung wird in A. Ducruix und R. Giege, Crystallisation of Nucleic Acids and Proteins, in: The Practical Approach Series, Oxford University Press (1992), beschrieben.
  • Die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten Liganden können in der Folge modifiziert werden, um ihre Bindung an das Zielmakromolekül zu verändern oder ihre Wirksamkeit als pharmazeutische Produkte zu verbessern. Solche Modifikationen werden auf dem Stand der Technik herkömmlich eingesetzt. Mögliche Modifikationen umfassen: Substitution oder Entfernung von Gruppen, die Reste umfassen, die mit dem Zielmakromolekül in Wechselwirkung treten, beispielsweise Gruppen, die mit den Aminosäureseitenkettengruppen eines Proteins in Wechselwirkung treten; die Addition oder Entfernung von Gruppen, um die Ladung einer Gruppe in einer Verbindung zu senken oder zu steigern; das Ersetzen einer geladenen Gruppe durch eine Gruppe mit entgegengesetzter Ladung; oder das Ersetzen einer hydrophoben Gruppe durch eine hydrophile Gruppe oder umgekehrt. Zusätzlich dazu kann eine Gruppe durch eine andere Gruppe ersetzt werden, die ähnliche Eigenschaften aufweist, aber den Hohlraum in dem Makromolekül besser ausfüllt, wodurch die Oberfläche des Liganden, die den Makromolekülhohlraum kontaktiert, vergrößert wird. Das kann durch die in dieser Erfindung offenbarten Methoden oder durch herkömmliche synthetische Ansätze erzielt werden, die typischerweise von Fachleuten auf dem Gebiet der medizinischen Chemie eingesetzt werden. Viele dieser Veränderungen verbessern die Wirksamkeit der Verbindungen als pharmazeutische Produkte. Es ist klar, dass diese nur Beispiele für die Substitutionsarten sind, die von medizinischen Chemikern bei der Entwicklung von neuen pharmazeutischen Verbindungen in Betracht gezogen werden, und es können in Abhängigkeit von der Natur der Ausgangsverbindung und ihrer Aktivität andere Modifikationen vorgenommen werden.
  • Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, beruht der Nachweis des an das Zielmakromolekül gebundenen Liganden auf der Besetzung in den Makromolekülkristallen durch einen der Liganden mit der höchsten Affinität, wobei das durch Ligand-Makromolekül-Wechselwirkungen hervorgerufen wird.
  • Dieses Verfahren vermeidet die Nachteile im Zusammenhang mit biologischen Screening-Verfahren, in denen die Veränderung der Makromolekülaktivität durch einen potenziellen Liganden bewertet wird, da in diesem Fall Verbindungen, die schwach aber nicht spezifisch binden, die Aktivität des Makromoleküls auf nichtselektive Weise verändern können. Diese nichtselektive Inhibition führt zu falschen positiven Ergebnissen, da der Test eine Proteinaktivitätsinhibition aufweist, die Verbindung jedoch als Arzneimittel keine wirksame Funktion erfüllen würde, da es die Aktivität von anderen Proteinen beeinflussen würde. Nur Verbindungen, die an eine Bindungsstelle binden, werden durch das vorliegende Verfahren nachgewiesen. Insbesondere werden durch das vorliegende Verfahren nur Verbindungen nachgewiesen, die an eine Bindungsstelle mit lösbarer Besetzung binden.
  • Bindungsstellen sind Stellen innerhalb eines Makromoleküls oder auf dessen Oberfläche, an die Liganden binden können. Beispiele sind die katalytische oder aktive Stelle eines Enzyms (die Stelle an einem Enzym, an der sich an der Katalyse der enzymatischen Reaktion beteiligte Aminosäurereste befinden), allosterische Bindungsstellen (Ligandenbindungsstellen, die keine katalytischen Stellen sind, aber die enzymatische Aktivität durch die Bindung von Liganden modulieren können), Cofaktorbindungsstellen (an der Bindung/Koordination von Cofaktoren, wie z.B. Metallionen, beteiligte Stellen) oder Substratbindungsstellen (die Ligandenbindungsstellen an einem Protein, an die die Substrate für die enzymatische Reaktion binden). Es gibt auch Stellen der Protein-Protein-Wechselwirkung. Wenn das Makromolekül eine Nucleinsäure ist, können die Bindungsstellen Basen der Nucleinsäure oder Zwischenräume in ihren Strukturen sein, z.B. die großen oder kleinen Furchen in der DNA-Helix, Wechselwirkungen mit Phosphat-, Ribose- oder Desoxyribosegruppen oder zwischen den Basen angeordnet.
  • Das vorliegende Verfahren ermöglicht auch das Screenen, wenn das Zielmakromolekül mehr als eine aktive Stelle aufweist, da die Daten für jede Stelle unabhängig von den anderen Stellen analysiert werden können, um die an diese Stelle gebundene Verbindung zu bestimmen. In diesen Fällen kann die Information, die das Verfahren der Erfindung in Bezug auf die Bindung von zwei oder mehreren separaten Liganden an das Zielmakromolekül bereitstellt, in dem Ansatz der gebundenen Fragmente zur Arzneimittelherstellung eingesetzt werden, auf ähnliche Weise wie von Greer et al., J. Med. Chem. 37 (8), 1035–1054 (1994), für die Synthese von Thymidylat-Synthase-Hemmerserien beschrieben. Das Grundkonzept hinter den Ansätzen der gebundenen Fragmente für Arzneimitteldesign besteht in der Bestimmung (mittels Computer oder Experimenten) der Bindungsstelle für eine Vielzahl von Liganden an ein Zielmolekül und der darauf folgende Konstruktion eines Molekülgerüsts, um die Liganden so aneinander zu binden, dass ihre relative Bindungspositionen beibehalten werden. Die Synthese- und Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung können eingesetzt werden, um die besten Liganden aus einer Bibliothek solcher Verbindungen zu bestimmen, oder die Bindungsfähigkeit einzelner Verbindungen kann unter Einsatz bekannter Verfahren getestet werden.
  • Auch wenn die vorliegende Erfindung nur Informationen über die Bindungen der Liganden an einer einzigen Bindungsstelle eines Zielmakromoleküls bereitstellt, kann ein strukturbasierter Ansatz eingesetzt werden, um Liganden zu entwickeln, die mit weiteren Bindungsstellen in Wechselwirkung treten. Ein solcher Ansatz für die Kultivierung von Fragmenten wird in T. Blundell et al., Nature Reviews Drug Discovery, Band 11, 45–54 (2002), beschrieben.
  • Vorzugsweise sind Elemente der Gruppe von Verbindungen in einer Konzentration von zumindest 5- bis 50-mal, typischerweise zumindest 10-mal, ihrer Ki (hängt in jedem Fall von dem verwendeten Makromolekül ab) vorhanden, so dass die Besetzung der Bindungsstelle in dem Zielmakromolekül nicht von den relativen Mengen jeder Verbindung in der Gruppe abhängt.
  • Wenn ein Ligand kompetitiv an ein Makromolekül bindet, ist Ki wie folgt definiert:
    Figure 00090001
    worin [M] die Konzentration des Makromoleküls, [L] die Konzentration des freien Liganden, [ML] die Konzentration des Liganden-Makromolekül-Komplexes ist.
  • Wenn Hemmer auf unkompetitive oder nicht-kompetitive Weise binden, ist Ki wie in A. Cornish-Bowden, Fundamentals of Enzyme Kinetics, Portland Press, ISBN 1 85579 0720 (1995), definiert.
  • Vorzugsweise entspricht die Menge jeder Verbindung, die ein Element der Gruppe von Verbindungen und in der Lösung vorhanden ist, einer Konzentration, die zumindest 5- bis 10-mal der Konzentration des Zielmakromoleküls in dem Reaktionssystem, noch bevorzugter 100-, 1.000- oder sogar 10.000-mal der Konzentration des Zielmakromoleküls in dem Reaktionssystem, entspricht.
  • Die Bindung der Liganden an das Zielmakromolekül kann durch nicht kovalente Wechselwirkungen oder durch kovalente Bindung erfolgen. Wenn das Zielmakromolekül ein Protein ist, kann es zu einer kovalenten Bindung des Liganden an das Protein kommen, wenn die aktive Stelle des Proteins einen katalytischen Rest umfasst, wie z.B. in Serin- und Cysteinproteasen. Wenn das Zielmakromolekül eine Nucleinsäure ist, sind bestimmte Verbindungsklassen dafür bekannt, dass sie durch kovalente Bindung in Wechselwirkung treten, z.B. binden Pyrrolobenzodiazepine kovalent an die exozyklischen Aminogruppen von Guanin.
  • Bei manchen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung binden die Elemente der Gruppe von Verbindungen vorzugsweise nicht kovalent an das Zielmakromolekül, sondern treten durch nicht kovalente Bindung mit diesem in Wechselwirkung.
  • Weitere Aspekte der Erfindung betreffen beliebige neue Verbindungen, die hierin offenbart werden, deren Verwendung als pharmazeutische Produkte und für Therapieverfahren. Insbesondere umfassen weitere Aspekte der Erfindung Folgendes:
    • a) einen durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten Liganden oder Salze, Solvate und chemisch geschützte Formen davon;
    • b) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten Liganden oder Salze, Solvate und chemisch geschützte Formen davon sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel umfasst;
    • c) die Verwendung eines durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten Liganden oder von Salzen, Solvaten und geschützten Formen davon in einem Verfahren zur Behandlung des Körpers eines Menschen oder eines Tieres;
    • d) die Verwendung eines durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten Liganden oder von Salzen, Solvaten und geschützten Formen davon für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, bei der durch die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Bindung eines Liganden an das Makromolekül eine Verbesserung erzielt werden kann; und
    • e) ein Verfahren für die Behandlung einer Erkrankung, bei der durch die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Bindung eines Liganden an das Makro molekül eine Verbesserung erzielt werden kann, wobei das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten Liganden, eines Salzes oder von Solvaten an ein Individuum, das an der Erkrankung leidet, umfasst.
  • Geeignete Träger und Verdünnungsmittel und Informationen über pharmazeutische Zusammensetzungen finden sich in pharmazeutischen Standardtexten, wie z.B. dem Handbook of Pharmaceutical Additives (2. Aufl.), M. Ash und I. Ash (Hrsg.), Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA (2001); Remington's Pharmaceutical Sciences (20. Aufl.), Lippincott, Williams & Wilkins (Hrsg.) (2000), und Handbook of Pharmaceutical Excipients (2. Aufl.) (1994).
  • Weitere Details der Erfindung werden nun zur Veranschaulichung und als Beispiele angeführt.
  • Wenngleich sich die untenstehende Erläuterung auf die Reinigung, die Kristallzüchtung, die Röntgen-Kristallographie und die Bestimmung der Ligandenstruktur konzentriert, wenn es sich bei dem Makromolekül um ein Protein handelt, können die beschriebenen Techniken im Allgemeinen nach geeigneten Modifikationen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, auf andere Makromoleküle, wie z.B. Nucleinsäuren und Komplexe, angewandt werden.
  • Zielproteinreinigung
  • Ein spezifisches Zielprotein kann von einem Tier, einer Pflanze oder bakteriellen Quellen direkt oder durch Rekombinationsverfahren isoliert werden. Die Erzeugung von rekombinanten Proteinen unter Einsatz von Systemen, wie z.B. Insektenzellen (z.B. S.-frugiperda- oder Drosphila-Zellen), E. coli, Hefe (S. cerevisiae, S. pombe, P. Pastoris etc.) oder modifizierten menschlichen Zelllinien, bedeutet, dass trunkierte oder auf andere Weise genetisch veränderte Proteine erzeugt werden können. Ein Proteinkristallographie-Projekt für das Erhalten von Kristallen erfordert gewöhnlicherweise den Zugang zu einem Produktionssystem von rekombinanten Proteinen, je doch kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch mit einem einzigen Kristall durchgeführt werden, der beispielsweise zwischen 0,1 und 100 μg aufweisen kann.
  • Im Allgemeinen ist anerkannt, dass es umso leichter ist, Proteinkristalle aus einem Präparat zu züchten, je höher das Reinheits- und Homogenitätsausmaß des Proteinpräparats ist. Die Proteinreinheit spiegelt die Anzahl der Protein-Spezies in einem Präparat wider. Sie bezieht sich ebenfalls auf die Anzahl und die Natur anderen Nicht-Protein-Spezies, die vorhanden sind (z.B. niedermolekulare Verunreinigungen). Ein ideales Proteinpräparat sollte nur eine Protein-Spezies oder eine Spezies eines Proteinkomplexes umfassen, in dem alle Proteinmoleküle oder Proteinkomplexe in Bezug auf ihre Aminosäurezusammensetzung, ihre Masse etc. ident sind. Die Reinheit eines Proteinpräparats kann durch eine Reihe von experimentellen Techniken bestimmt werden, wie z.B. durch Natriumdodecylsulfat-PAGE-(SDS-PAGE-)Gele, Massenspektrometrie, Antikörperbindung und -nachweis (Western-Blotting) etc. Eine Proteinreinheit von über 90% wird oft als annehmbar für Kristallisationsversuche gehalten, jedoch versuchen Fachleute auf dem Gebiet der Proteinreinigung im Allgemeinen aufgrund der erkannten Vorteile der Maximierung der Proteinreinheit, eine Reinheit über dieser willkürlichen Schwelle zu erzielen und streben nach dieser.
  • In einem Proteinpräparat kann sich Homogenität auf das Maß an Gleichförmigkeit in Bezug auf Parameter, wie z.B. die Stöchiometrie von Proteinen in einem Multiproteinkomplex, die Monodispersität von Protein/Komplexen in Lösung, die Oxidation oder Protonation, den Zustand der Aminosäureseitenketten innerhalb der Proteine, die Gleichförmigkeit von Post-Translations-Modifikationen (z.B. sind alle Proteinmoleküle in der Population entsprechend phosphoryliert, glykosyliert oder wurden essentielle Cofaktoren einheitlich und korrekt integriert) sowie die Proteinkonformation, die in einer Population von Proteinmolekülen/Komplexen vorliegt, beziehen. Die Homogenität eines Proteinpräparats kann unter Einsatz einer Vielzahl von experimentellen Verfahren getestet werden, zu welchen folgende gehören: Massenspektrometrie, Western-Blotting, SDS-PAGE, analytisches Ultrazentrifugieren, Größenausschlusschromatographie, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Oberflächenplasmonresonanz, Aktivitätstests, Elektronenmikroskopie, dynamische Lichtstreuung (DLS), N-terminales Sequenzieren, isoelektrische Fokussierung (IEF), proteolytischer Verdau, Fluoreszenz, zirkularer Dichroismus (CD), native Gelelektrophorese, Band-Shift-Tests oder kernmagnetische Resonanz (NMR). Das Maximieren des Ausmaßes der Homogenität in einem Proteinpräparat ist wiederum wünschenswert, da angenommen wird, dass das Maximieren der Homogenität mit der Maximierung der Kristallisierbarkeit in positiver Wechselbeziehung steht.
  • Züchten von Proteinkristallen
  • Die Kristallisation einer beliebigen Spezies erfordert die Bildung einer übersättigten Lösung der jeweiligen Spezies und ein Keimbildungsereignis, das in der Lage ist, Kristallwachstum zu initiieren. Nach der Keimbildung müssen die Umgebungsbedingungen so sein, dass das Kristallwachstum fortgesetzt werden kann, bis die physikalischen Dimensionen und Eigenschaften des so erhaltenen Kristalls für die folgenden erforderlichen experimentellen Verfahren geeignet sind. Proteinmoleküle behalten typischerweise ihre strukturelle Integrität nur in einer wässrigen Umgebung bei. Deshalb werden Proteinkristalle gewöhnlicherweise in einer wässrigen Phase gezüchtet. Proteinkristalle können wachsen, wenn ein Keimbildungsereignis in einer reinen und homogenen Proteinlösung eintritt, die in einen übersättigten Zustand gebracht wurde.
  • Es wird im Allgemeinen versucht, Proteinkristallisierung unter Einsatz von Dampfdiffusions- (Sitting-Drop, Hängetropfen, Sandwich-Drop, pH-Gradient etc.), Dialyse-, Chargen-, Mikrochargen-, Flüssig-Flüssig-Diffusions- oder In-Gel-Kristallisierungsverfahren durchzuführen. Alle diese Methoden wurden umfassend beschrieben (Protein Crystallisation: Techniques, Strategies and Tips, T. M. Bergfors (Hrsg.), IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla, Californien, ISBN: 0-9636817-5-3 (1999)). Alle zuvor angeführten Kristallisationsverfahren funktionieren durch die Erzeugung einer übersättigten Proteinlösung, die die spontane Bildung von Kristallisationskernen fördert und dann in der Folge in der Lage ist, das Kristallwachstum aufrechtzuerhalten.
  • Es gibt verschiedene physikalische und chemische Parameter, die einen Einfluss darauf haben können, ob ein Proteinkonstrukt oder ein Proteinkomplex kristallisiert oder nicht. Typischerweise kristallisiert jedes Protein unter einzigartigen Bedingungen, die im Vorhinein nicht vorausgesagt werden können. Eine einfache Übersättigung der Proteinkonzentration, um sie aus dem Lösungszustand zu bringen, funktioniert im Allgemeinen nicht. Das Ergebnis wäre in den meisten Fällen ein amorpher Niederschlag. Einige Parameter, die variiert werden können, sind folgende: pH der Lösungen, Wahl und Konzentration des Puffers (wenn vorhanden) (z.B. Phosphat, MES, BIS-TRIS, TRIS, BES, PIPES, HEPES, MOPS, BICINE, CHES, CAPS etc.), Temperatur, Wahl des Kristallisierungsverfahrens (siehe oben), Kristallisierungsvolumen, Proteinkonzentration, Zusatz von Reduktionsmitteln (z.B. DTT, β-Mercaptoethanol), Detergenzien (z.B. Decyl-β-D-maltosid, Dodecyl-β-D-maltosid, Octyl-β-D-glucopyranosid, Decanoyl-N-methylglucamid, Triton, Octyltetraoxyethylenether etc.), Alkohole (z.B. Ethanol, Isopropanol, Methanol, 2-Methyl-2,4-pentandiol (MPD)), Salze (z.B. Chloride, Acetate, Sulfate, Phosphate, Bromide, Iodide, Fluoride, Nitrate, Bicarbonate, Chlorate, Chromate, Citrate, Tartrate, Cacodylate, Formiate, Hydroxide etc.), Polyethylenglykole (PEGS), Ethylenglykole, Methoxypolyethylenglykole (MPEGS), schwere Atome und Ionen (z.B. Eisen, Kupfer, Zink, Cobalt, Mangan, Nickel, Wolframate, Vanadate, Natrium, Magnesium, Kalium, Lithium, Calcium, Aluminium, Xenon etc.) oder andere Additive, wie z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Denaturierungsmittel (z.B. Harnstoff, Guanadiniumchlorid etc.), Glycerin, Sulfabetaine, Jeffamine, AMPPNP-, ATP-, ADP-, GTP-, GDP-Peptide, tert-Butanol, Aminosäuren, Azide, DNA, RNA, Zucker, Fette, Arzneimittel etc.
  • Es gibt zahlreiche verfügbare Kristallisierungssets (z.B. von Hampton Research), die versuchen, möglichst viele Parameter in dem Kristallisierungsraum umfassend zu testen. In vielen Fällen helfen solche allgemeine Screens, einen Ausgangspunkt für die Kristallisierung in Form von kristallinen Niederschlägen und/oder rohen Kristallen oder Mikrokristallen zu identifizieren. Typischerweise sind diese Kristalle für eine direkte Beugungsanalyse nicht geeignet und erfordern eine weitere Optimierung. Eine erfolgreiche Kristallisierung kann durch das Wissen über das Verhalten eines Prote ins in Bezug auf Löslichkeit, Abhängigkeit von Metallionen für richtiges Falten oder richtige Aktivität, Wechselwirkungen mit anderen Molekülen und andere verfügbare Daten unterstützt werden.
  • Das systematische Screenen von einer so großen Anzahl an Parametern stellt ein äußerst komplexes, multidimensionales Suchproblem dar, und es ist außergewöhnlich schwierig, dieses auf systematische Weise durchzuführen. Auch wenn es zu einer automatischen Proteinkristallisierung kommt, ist es oft so, dass die Kristallisierung eines Proteins ein hohes Maß an menschlichem Zutun und den Einfluss von unbeeinflussbaren Parametern, wie z.B. glücklichen Zufall, Einsicht, Zufallsfehler, erfordert.
  • Wenn vorläufige Kristalle erhalten wurden, ist es oft erforderlich, die Kristallisierungsbedingungen weiter zu verändern, um zu versuchen, die innere Ordnung und die physikalischen Dimensionen der gezüchteten Kristalle gleichzeitig zu optimieren. Die Optimierung dieser Parameter ist hilfreich, um die Datenqualität, die in folgenden Röntgen-Beugungsexperimenten gewonnen werden, zu maximieren. Die Identifikation einer Reihe von anfänglichen Kristallisierungsbedingungen reduziert den Bereich der potentiellen Parameter, der untersucht werden muss, jedoch kann die Kristalloptimierung weiterhin ein zeitaufwändiges und mühevolles Verfahren darstellen. Techniken, wie z.B. Mikro- oder Makro-Säen, können die Kristalloptimierung ebenfalls unterstützen.
  • Details über einige der kristallisierten Proteine und Informationen in Bezug auf einige der identifizierten Proteinkristallisierungsbedingungen finden sich beispielsweise in den folgenden Internet-Datenbanken:
    http://wwwbmcd.nist.gov:8080/bmcd/bmcd.html (G. L. Gilland et al., Acta Crystallogr. D50, 408–413 (1994));
    http://xray.bmc.uu.se/embo/structdb/links.html;
    http://www.mpibp-frankfurt.mpg.de/michel/public/memprotstruct.html;
    http://www.rcsb.org/pdb/(H. M. Berman et al., Nucleic Acids Research 28, 235–242 (2000));
    http://www.ebi.ac.uk/msd/
    und wurden in folgenden Veröffentlichung beschrieben:
    T. Blundell et al., Protein Crystallography, Academic Press, New York (1976); McPherson et al., Preparation and Analysis of Protein Crystals, in Preparation and Analysis of Protein Crystals, JohnWiley & Sons, New York (1982); Carter et al., Design of crystallization experiments and protocols, in Crystallization of Nucleic Acids and Proteins – A Practical Approach, 47–71, A. Ducruix und R. Giege (Hrsg.), IRL Press, Oxford (1992); A. Ducruix et al., Methods of crystallization, in Crystallization of Nucleic Acids and Proteins – A Practical Approach, 73–98, A. Ducruix und R. Giege (Hrsg.), IRL Press, Oxford (1992); Protein Crystallisation: techniques, strategies, and tips, IUL Biotechnology Series, ISBN 0-9636817-5-3 (1999).
  • Erhalten von Röntgen-Beugungsdaten von eingetauchten Proteinkristallen
  • Ein Röntgen-Beugungsexperiment besteht darin, dass ein Proteinkristall mit gebündelten, kohärenten Röntgenstrahlen bestrahlt wird und das resultierende Röntgen-Beugungsmuster aufgezeichnet wird. Ein Beugungsmuster entsteht durch die elastische Streuung von Röntgenstrahlen durch Elektronen in den Atomebenen innerhalb eines Proteinkristalls. Die Mathematik, die der Röntgen-Beugung zugrunde liegt, kann in ihrer einfachsten Form durch die Bragg-Gleichung dargestellt werden: nλ = 2dsinθworin n eine ganze Zahl ist, λ die Wellenlänge der einfallenden Röntgenstrahlen ist, θ der Streuungswinkel der Röntgenstrahlen von einer Atomebene ist und d der Bragg-Abstand oder der Abstand zwischen aufeinander folgenden Atomebenen (Bragg-Ebenen) ist. Solange λ demnach dem atomaren Maßstab (d.h. ≈ 1 Å) entspricht, sollten Merkmale auf atomarem Maßstab mithilfe eines unter Einsatz der Beugungsdaten berechneten Elektronendichtediagramms erkennbar sein. Typischerweise wird angenommen, dass Röntgen-Daten für einen Bragg-Abstand von ≤ 3 Å für eine bestimmte Röntgenwellenlänge erforderlich sind, wenn die Daten aus dem Röntgen- Beugungsexperiment für die Bestimmung der Atompositionen innerhalb einer Struktur nützlich sein sollen. Während eines Experiments erfüllen die verschiedenen Bragg-Ebenen innerhalb eines Kristalls nur die für die Beugung an bestimmten Kristallorientierungen in Bezug auf den einfallenden Röntgenstrahl erforderlichen mathematischen Kriterien. Um die Beugungsdaten für möglichst viele Bragg-Ebenen zu erhalten, wird der Kristall in dem Röntgenstrahl gedreht. So werden alle möglichen Ebenenorientierungen untersucht. Der Winkel, in dem ein Kristall gedreht werden muss, um einen vollständigen Datensatz in Bezug auf einen spezifischen Bragg-Abstand zu erhalten, wird durch die Raumgruppen des Kristalls bestimmt ebenso wie die Ausgangsorientierung des Kristalls in dem Röntgenstrahl. Der geringste Bragg-Abstand, für den Beugungsdaten zur Verfügung stehen, wird als Auflösung des Experiments bezeichnet. Es ist wünschenswert, die Vollständigkeit der Daten für ein Experiment zu maximieren. D.h. die Daten sollten bis zu der Auflösungsgrenze des Experiments im Idealfall zu 100% vollständig sein.
  • Leider verursacht die hohe Energie der Röntgen-Photonen eine Beschädigung der Proteinmoleküle. Es wird angenommen, dass das zumindest teilweise auf die Erzeugung von Ionen und Radikalen innerhalb der Kristalle zurückzuführen ist. Eine längere Bestrahlung eines Proteins, das einen Kristall enthält, mit einem Röntgenstrahl führt demnach zur Zersetzung und zum Zerfall der Proteine. Dies zeigt sich typischerweise durch eine Abnahme der Datenauflösung und -qualität. Dieses Problem kann teilweise umgangen werden, indem das Protein, das die Kristalle umfasst, kryogen bei 100 K in Glaseis gefroren wird. Das Frieren des Kristalls bewirkt, dass jedes Ion oder alle Radikale, die erzeugt werden, nicht in der Lage sind, durch den Kristall zu wandern. Demnach wird die Beständigkeit des Kristalls in dem Röntgenstrahl verlängert, und die Datenqualität und -auflösung werden typischerweise im Vergleich mit der Datengewinnung in nicht gefrorenem Zustand verbessert. Gewöhnlicherweise können kristallhältige Proteine nicht direkt in der Lösung, in der sie wachsen (Mutterlösung), gefroren werden. Das liegt daran, dass das direkte Frieren oft zur Bildung von Eiskristallen in der Mutterlösung führt. Diese Eiskristalle können die innere Ordnung in einem Proteinkristall zerstören und so die Beugung einschränken. Die Zugabe eines Kryo-Schutzmittels zur Mutterlösung des Proteins kann jedoch zu Bildung von Glaseis beim Frieren führen. Dies sollte die innere Ordnung eines Proteinskristalls nicht zerstören und somit die Beugung aus dem Kristall beibehalten. Gewöhnlicherweise müssen kristallhältige Proteine vor dem Frieren von ihrer Mutterlösung in eine speziell formulierte Kryo-Schutzlösung übertragen werden. Die genaue Zusammensetzung der Kryo-Schutzlösung, die Übertragungsarbeitsvorschrift und die Gefrierarbeitsvorschrift müssen für jedes Kristallsystem und oft für jedes Experiment extra bestimmt werden.
  • Bestimmung der Ligandenstruktur
  • Eine mathematische Operation, die als Fouriertransformation bezeichnet wird, setzt das beobachtete Beugungsmuster eines Kristalls und die Molekülstruktur eines Proteins und eines Liganden, die den Kristall umfassen, miteinander in Beziehung (T. Blundell et al., Protein Crystallography, Academic Press, New York (1976); Drenth, Principles of Protein X-ray Crystallography, Springer (1994)). Eine Fouriertransformation kann als Summe von Sinus- und Kosinuswellen innerhalb einer definierten Amplitude und Phase erachtet werden. Theoretisch ist es also möglich, die Elektronendichte in Zusammenhang mit einem Protein und einer Ligandenstruktur zu berechnen, indem eine umgekehrte Fouriertransformation der Beugungsdaten durchgeführt wird. Das erfordert, dass Informationen in Bezug auf Amplitude und Phase aus den Beugungsdaten extrahiert werden. Informationen in Bezug auf die Amplitude können erhalten werden, indem die Intensitäten der Punkte in dem Beugungsmuster analysiert werden. Die herkömmlichen Verfahren für die Aufzeichnung von Beugungsdaten führen jedoch dazu, dass alle "Phasen-Informationen" verloren gehen. Diese Phaseninformationen müssen irgendwie wiedergewonnen werden, und der Verlust dieser Informationen stellt das "Kristallographie-Phasen-Problem" dar. Die für die Durchführung einer umgekehrten Fouriertransformation erforderlichen Phaseninformationen können durch verschiedene Verfahren erhalten werden.
  • Wenn die Struktur des nicht eingetauchten Proteins bereits zur Verfügung steht, wie es gewöhnlich der Fall ist, kann eine Reihe von theoretischen Amplituden und Phasen unter Einsatz des Proteinmodells berechnet werden, wonach die theoretischen Phasen mit den aus dem Experiment abgeleiteten Amplituden kombiniert werden. Ein Elektronendichtediagramm kann dann berechnet werden, und die Protein- und Ligandenstruktur kann beobachtet werden. Elektronendichtediagramme können unter Einsatz von Programmen berechnet werden, z.B. unter Einsatz der Programme, die Teil der CCP4-Programmgruppe sind (Collaborative Computational Project 4, Acta Crystallographica D50, 760–763 (1994)). Für die Visualisierung des Diagramms und Modellerstellung können Programme, wie z.B. "O" (Jones et al., Acta Crystallographica A47, 110–119 (1991)) oder "QUANTA" (Jones et al. (1991), und im Handel erhältlich von Accelrys, San Diego, Kalifornien), eingesetzt werden.
  • Ein alternativer Ansatz verwendet (i) Röntgen-Kristallographiebeugungsdaten von dem Ligand-Protein-Komplex und (ii) eine dreidimensionale Struktur des nicht eingetauchten Proteins, um ein Differenz-Fourier-Elektronendichtediagramm des Komplexes zu erstellen. Das Differenz-Fourier-Elektronendichtediagramm kann dann zur Identifikation des Liganden analysiert werden.
  • Die Analyse der Elektronendichtediagramme kann Software-unterstützt erfolgen, beispielsweise durch AutoSolve® (T. Blundell et al., Nature Reviews Drug Discovery 11, 45–54 (2002)) oder durch das Liganden-Anpassungs-Modul in QUANTA, X-LIGAND (QUANTA: siehe oben; X-LIGAND: T. J. Oldfield, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 57(5), 696–705 (2001)).
  • Wenn keine bekannte Struktur in dem Protein vorliegt, müssen alternative Verfahren für das Erhalten der Phasen untersucht werden, um die Struktur des nicht eingetauchten Proteins zu bestimmen (T. Blundell et al., Protein Crystallography, Academic Press, New York (1976)). Ein Verfahren ist der mehrfache isomorphe Ersatz (MIR). Dieser beruht darauf, Verbindungen aus "schweren Atomen" (d.h. Platin, Uran, Quecksilber etc.) in die Kristalle aufzusaugen und zu beobachten, wie deren Integration in die Kristalle die in dem Beugungsmuster beobachteten Punktintensitäten verändert. Ein alternatives Verfahren für das Erhalten der Phaseninformationen für ein Protein mit unbekannter Struktur ist die Durchführung eines anomalen Dispersionsexperiments mit Mehrfach-Wellenlängen (MAD-Experiment). Dieses beruht auf der Absorption von Röntgenstrahlen durch Elektronen bei charakteristischen Röntgenwellenlängen. Die anomale Beugung durch Atome innerhalb eines Proteins verändert das erhaltene Beugungsmuster des Proteinkristalls. Wenn ein Protein Atome enthält, die zu anomaler Streuung in der Lage sind, kann demnach ein Beugungsdatensatz (anomaler Datensatz) bei einer Röntgenwellenlänge, bei der eine maximale anomale Streuung vorliegt, erhalten werden. Die gängigste Art, um anomale Streuobjekte in ein Protein einzuführen, ist es, die schwefelhältigen Methionin-Aminosäurereste durch selenhältige Seleno-Methionin-Reste zu ersetzen. Dies erfolgt durch die Erzeugung eines rekombinanten Proteins, das aus Zellen isoliert wird, die in einem gesteuerten Kulturmedium, das Selen-Methionin umfasst, gezüchtet werden (S. Doublie, Methods in Enzymology 276, 523–530 (1997)). Selen ist in der Lage, Röntgenstrahlen anormal zu streuen, und kann deshalb für ein MAD-Experiment eingesetzt werden. Ein weiteres Verfahren, das im Allgemeinen für die Berechnung der für die Bestimmung einer unbekannten Proteinstruktur erforderlichen Phasen zur Verfügung steht, ist der molekulare Ersatz. Dieses Verfahren beruht auf der Annahme, dass Proteine mit ähnlichen Aminosäuresequenzen (Primärsequenzen) eine ähnliche Faltung und dreidimensionale Struktur (Tertiärstruktur) aufweisen. Beispiele für Computerprogramme, die auf dem Gebiet der Erfindung für die Durchführung von molekularem Ersatz bekannt sind, sind CNX (A. T. Brunger et al., Current Opinion in Structural Biology 8(5), 606–611 (1998), und im Handel von Accelerys, San Diego, Calif. erhältlich) oder AMORS (J. Navaza, Acta Cryst. A50, 157–163 (1994)). Die auf eine der erläuterten Arten erhaltenen Phaseninformationen ermöglichen in Kombination mit den experimentell aus den nativen Datensatz erhaltenen Amplituden die Erstellung eines Elektronendichtediagramms des unbekannten Proteinmoleküls, das unter Einsatz des Fouriertransformationsverfahrens berechnet wird.
  • Wenn ein Elektronendichtediagramm in Bezug auf ein Protein mit unbekannter Struktur berechnet wurde, müssen die Aminosäuren, die das Protein umfassen, in die Elektronendichte für das Protein eingepasst werden. Das erfolgt gewöhnlicherweise manuell, wenngleich Daten mit hoher Auflösung eine automatische Modellerstellung ermöglichen können. Das Verfahren der Modellerstellung und der Anpassung der Aminosäuren an die Elektronendichte kann sowohl zeitaufwändig als auch mühevoll sein. Wenn die Aminosäuren an die Elektronendichte angepasst wurden, ist es erforderlich, die Struktur zu verfeinern. Durch die Verfeinerung wird versucht, die Übereinstimmung zwischen der experimentell berechneten Elektronendichte und der ausgehend von dem erstellten Proteinmodell berechneten Elektronendichte zu maximieren (T. Blundell et al., Protein Crystallography, Academic Press, New York (1976), und Methods in Enzymology, Band 114 und 115, H. W. Wyckoff et al. (Hrsg.), Academic Press (1985)). Durch die Verfeinerung wird ebenfalls versucht, die Geometrie und Anordnung der Atome und Aminosäuren innerhalb des durch den Anwender erstellten Modells der Proteinstruktur zu optimieren. Manchmal wird eine manuelle Umbildung der Struktur erforderlich sein, um die Struktur von örtlichen Energieminima freizusetzen. Es gibt nun einige Softwarepakete, die es einem Experimentator ermöglichen, die Verfeinerung einer Proteinstruktur durchzuführen, wie z.B. CNX (siehe oben) oder REFMAC (G. N. Murshudov et al., Acta Crystallographica D53, 240–255 (1997)). Es gibt eine bestimmte Geometrie- und Wechselwirkungsdiagnostik, die eingesetzt werden, um den Fortschritt der Verfeinerung zu überwachen. Diese Diagnostikparameter werden überwacht, und die Umbildung/Verfeinerung wird fortgesetzt, bis der Experimentator überzeugt ist, dass die Struktur angemessen verfeinert wurde.
  • Die Atomkoordinatendaten der durch die erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten Co-Komplexe können routinemäßig unter Einsatz von Computerprogrammen bestimmt werden, z.B. RASMOL (Sayle et al., TIBS 20, 374 (1995)), das ein allgemein erhältliches Computersoftwarepaket ist, das die Bestimmung und Analysen in Bezug auf die Atomkoordinatendaten für Strukturbestimmung und/oder zweckmäßiges Arzneimitteldesign ermöglicht, oder AstexViewerTM, das Teil der CCP4-Programmgruppe ist.
  • Informationen aus der Röntqenkristallographie
  • Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Informationen können eingesetzt werden, um viel mehr Informationen über die Identität des Liganden, der bindet, bereitzustellen. Da die Informationen in Bezug auf den Liganden aus der Anpassung an die an der proteinaktiven Stelle gemessene Elektronendichte stammt, kann ermöglicht werden, die Bindungsart und Wechselwirkungen festzustellen, was bei weiterer Bearbeitung und Optimierung des Liganden hilfreich sein kann.
  • Die Gruppen von Verbindungen
  • Die Gruppen an Verbindungen für den Einsatz in der vorliegenden Erfindung werden durch ein oder mehrere Syntheseverfahren hergestellt, die so gestaltet sind, dass sie zwei oder mehrere Monomersätze miteinander verbinden. Monomere sind Moleküle, die eine gemeinsame Reaktivität aufweisen, wodurch sie in der Lage sind, sich mit einem anderen komplementären Monomer zu verbinden, um eine größere Verbindung zu bilden. Jeder Monomersatz umfasst zumindest ein Monomer und vorzugsweise nicht mehr als 100 Monomere, so dass in jeder Gruppe von Verbindungen zwischen etwa 5 und etwa 1000 Verbindungen vorhanden sind. Vorzugsweise umfassen alle Verbindungen in einer Gruppe eine gemeinsame funktionelle Gruppe (manchmal als "Matrizen-Gruppierung" bezeichnet), die durch die Reaktion von zwei oder mehreren komplementären funktionellen Gruppen entsteht, die in den für das Syntheseverfahren verwendeten Monomersätzen vorhanden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist jede Verbindung in einer Gruppe mit den anderen Elementen der Gruppe dadurch verbunden, dass sie aus zumindest einer gemeinsamen Monomereinheit synthetisiert wurden. Durch gemeinsame Merkmale oder Trends in der Struktur der Verbindungen der Gruppe ist es möglich, zu identifizieren, welche Gruppierungen in der Verbindung (von einzelnen Monomereinheiten abgeleitet) am besten an das Zielprotein binden, auch wenn das unabhängige Monomer selbst keine nachweisbare Bindung aufweist. Das erfolgt durch die Beobachtung der Bindungspräferenzen, die das Makromolekül in Bezug auf Verbindungen der Gruppe aufweist.
  • Es ist weiters zu bevorzugen, dass die Gruppe von Verbindungen Formmerkmale aufweist, die ausreichend unterschiedlich sind, damit zumindest ein für die Herstellung verwendeter Monomersatz von den anderen unterschieden werden kann. Das ermöglicht dann die Bestimmung der chemischen Struktur des gebundenen Ligan den oder zumindest die Bestimmung eines Teils seiner Struktur. Wenn nur ein Teil seiner Struktur bestimmt werden kann, wird eine erneute Synthese einiger Elemente der Gruppe von Verbindungen erforderlich, die diese Teilstruktur umfassen, und diese Verbindungen werden dann als Singulettexperimente in den Kristall aufgesaugt, so dass die chemische Struktur des/der gebundenen Liganden bestimmt werden kann. Diese Art des Ansatzes der erneuten Synthese wird als chemische Dekonvolution bezeichnet und ist Fachleuten auf dem Gebiet der kombinatorischen oder parallelen Synthese für die Identifikation eines biologisch aktiven Elements aus einem Gemisch von synthetisierten Verbindungen bekannt.
  • "In-situ"-Synthese
  • Wie oben angesprochen, sind Proteinkristalle empfindlich in Bezug auf die Medien, in welchen sie gezüchtet und aufbewahrt werden, weshalb die Verfahren, die für die "In-situ"-Synthese, d.h. die Synthese einer Gruppe von Verbindungen in Gegenwart des Zielproteinkristalls, ausgewählt werden, so ausgewählt werden müssen, dass sie unter Bedingungen erfolgen können, die den Zielproteinkristall nicht zerstören. Wenn es zu einem Zerfall der Kristalle kommt, sollte das nur in einem solchen Maß erfolgen, dass die Röntgen-Beugungsergebnisse noch ausreichende Qualität aufweisen, um die Identifikation des Liganden zu ermöglichen (siehe oben).
  • Typische Reaktionen sind jene, die in einem rein wässrigen Medium etwa bei Raumtemperatur (4 bis 30°C) und einem pH von 4 bis 10 erfolgen können.
  • Beispiele für diese chemischen Reaktionen, die für die Verfahren der kombinatorischen Synthese und der parallelen Synthese angewandt werden können, umfassen: Acetal- oder Ketalbildung; Additionsreaktionen; Aldolkondensationen und verwandte Kondensationsreaktionen; Allylierungen; Cycloadditionsreaktionen; Disulfidbildung; Hydrazonbildung; Mannich-Reaktionen; Michael-Reaktionen und verwandte Konjugat-Additionsreaktionen; Palladium-vermittelte Reaktionen; reduktive Alkylierung; Substitutionsreaktionen und Drei- oder Vier-Komponenten-Reaktionen.
  • Die folgenden Reaktionen können unter Einsatz von synthetischen Verfahren, die in allgemeinen Texten über organische Chemie, wie z.B. March's Advanced Organic Chemistry (M. B. Smith und J. March (5. Aufl.), Wiley-Interscience, New York, 2001) oder darin angeführten Verweisen, beschrieben werden, durchgeführt werden. Einige Synthese-Reaktionen, die unter wässrigen Bedingungen erfolgen, wurden kürzlich von Ulf Lindstroem rezensiert, siehe Steroselective Organic Reactions in Water, Chemical Reviews 102 (8), 2751–2771 (2002). Die Praxis der kombinatorischen Chemie wird in Verweisen beschrieben, die in den Veröffentlichungen von Roland Dolle zitiert werden (Journal of Combinatorial Chemistry 4(5), 369–418 (2002); Journal of Combinatorial Chemistry 3(6), 477–517 (2001); Journal of Combinatorial Chemistry 2(5), 383–433 (2000); Molecular Diversity 4(4), 233–256 (2000); Journal of Combinatorial Chemistry 1(4), 235–282 (1999); Molecular Diversity 3(4), 199–233 (1998)).
  • Diese Reaktionen erfolgen zwischen den geeigneten Sätzen von Ligandenvorläufermolekülen ("Monomeren"), die untenstehend schematisch dargestellt werden, wobei M für eine Substituentengruppe steht, die in jedem Monomersatz variiert wird (z.B. M1, M2, M3 etc.). Jeder reagierende Satz von Monomeren kann ein einziges Element bis zu beispielsweise 40 Elemente aufweisen, wenngleich ein Maximum von etwa 20 Elementen üblicher wäre. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst jeder Satz von reagierenden Monomeren vorzugsweise zumindest zwei Monomere. Eine typische Größe für die resultierende Gruppe von Verbindungen wäre zwischen 5 und 1000, vorzugsweise zwischen 5 und 100, wobei ein Bereich von 10 oder 20 bis 50 oder 70 zu bevorzugen ist.
  • In den folgenden Beispielen steht R für einen Substituenten oder H an einem Monomer.
  • Acetal- oder Ketal-Bildung
  • Addition von Alkoholen oder einem Diol an ein Aldehyd oder Keton, katalysiert durch Säure. Die Reaktionen sind vollständig reversibel, wodurch man thermodynamische Produkte erhält.
  • Figure 00250001
  • Additionsreaktionen
  • Beispielsweise die Addition an ein Epoxid unter sauren Bedingungen oder die Addition von Alkoholen an Enolether.
  • Figure 00250002
  • X = O, S, N oder P, und der Ring kann fakultativ an einer beliebigen verfügbaren Stelle substituiert sein.
  • Aldolkondensationen und verwandte Kondensationsreaktionen
  • Siehe beispielsweise S. Kobayashi und K. Manabe, Accounts of Chemical Research 35(4), 209–217 (2002).
  • Figure 00250003
  • Verwandte Kondensationsreaktionen sind die Knoevenagel-Reaktion, die Peterson-Reaktion, die Perkin-Reaktion, die Darzen-Reaktion, die Tollens-Reaktion, die Wittig-Reaktion und die Thorpe-Reaktion. Eine sorgfältige Auswahl der Monomere ist erforderlich, damit diese Reaktionen unter wässrigen Bedingungen ablaufen können.
  • Allylierungen
  • Siehe beispielsweise S. Kobayashi und I. Hachiya, Yuki Gosei Kagaku Kyokaishi 53(5), 370–380 (1995).
  • Cycloadditionsreaktionen
  • Beispielsweise die Diels-Alder-Reaktion, siehe F. Fringuelli et al., European Journal of Organic Chemistry 3, 439–455 (2001).
  • Figure 00260001
  • Es gibt viele Variationen der obenstehenden Formel, einschließlich jener, worin beispielsweise Heteroatome integriert werden (z.B. Aza-Diels-Alder-Reaktionen). Cycloadditionen zur Bildung von Ringsystemen mit 5 Elementen sind ebenfalls sehr allgemein, und die Cycloaddition von Nitriloxiden mit Alkinen zur Bildung von Oxazolen, die bei Raumtemperatur unter sehr milden Bedingungen erfolgt, ist ein veranschaulichendes Beispiel.
  • Figure 00260002
  • Ein Beispiel für eine wassertolerante Cycloadditionsreaktion ist die "Click-Chemie", die von Sharpless in Lewis et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41(6), 1053–1057 (2002), beschrieben wird. Dabei werden ein Azid und ein Acetylen einer 1,3-dipolaren Cycloaddition nach Huisgen unterzogen, um 1,2,3-Triazole zu erhalten.
  • Figure 00260003
  • Disulfid-Bildung
  • Erfolgt reversibel unter sehr milden Bedingungen.
  • Figure 00270001
  • Hydrazonbildung
  • Erfolgt reversibel unter sehr milden Bedingungen.
  • Figure 00270002
  • Mannich-Reaktionen
  • Siehe beispielsweise T. Akiyama et al., Advanced Synthesis & Catalysis 344(3 + 4), 338–347 (2002).
  • Figure 00270003
  • Michael-Reaktionen und verwandte Konjugat-Additionsreaktionen
  • Die Addition von Nucleophilen an α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen ist ein weiteres Beispiel für eine Additionsreaktion, die sich für den Einsatz in der vorliegenden Erfindung eignet.
  • Figure 00270004
  • Das Carbonyl kann auch durch andere Elektronen-entziehende Gruppen, wie z.B. Nitrogruppen, ersetzt werden, siehe F. Da Silva und J. Jones, Journal of the Brazilian Chemical Society 12(2), 135–137 (2001).
  • Eine verwandte Transformation ist die Baylis-Hillman-Reaktion, siehe C. Yu et al., Journal of Organic Chemistry 66(16), 5413–5418 (2001).
  • Palladium-vermittelte Reaktionen
  • Viele Palladium-vermittelte Reaktionen können in wässrigen Medien erfolgen, z.B. Heck, Sonogashira, Tsuji-Trost, Suzuki, Stille, siehe J. Pierre Genet und M. Savignac, Journal of Organometallic Chemistry 576(1–2), 305–317 (1999). Die Suzuki-Kupplungsreaktion ist ein veranschaulichendes Beispiel:
    Figure 00280001
  • Reduktive Alkylierung
  • Erfolgt unter sehr milden Bedingungen. Ein Beispiel, das in der Gegenwart eines Proteins durchgeführt wird, ist M. Hochguertel et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99(6), 3382–3387 (2002).
  • Figure 00280002
  • Substitutionsreaktionen
  • Viele nützliche Substitutionsreaktionen erfolgen unter wässrigen Bedingungen, z.B. nucleophile Ersetzung (mit Alkoholen, Aminen, Thiolen, Carbonsäuren, Enolaten, Hydrazinen, Dithianen etc.) von Alkylhalogeniden, Tosylaten, Mesylaten und Aziden; Ester-, Amid- und Harnstoffbildung durch Ersatz eines aktivierten Esters oder eines Carbonats oder Carbamats; und aromatische nucleophile Substitution von elektronendefizienten aromatischen Verbindungen mit Aminen, Alkoholen, Thiolen etc.
  • Ein Beispiel für Alkylierungsreaktionen in Gegenwart eines Proteins ist R. Nguyen und I. Huc, Angew. Chem. Int. Ed. 40(9), 1774–1776 (2001).
  • Ein allgemeines Schema sieht wie folgt aus:
    Figure 00290001
    worin LG eine Abgangsgruppe und X ein nucleophiles Heteroatom oder ein Kohlenstoffanion ist.
  • Drei- oder Vier-Komponenten-Reaktionen
  • Eine Reihe von Mehrfachkomponenten-Reaktionen erfolgen unter milden, gemischten, wässrigen Bedingungen und sind für das Design einer kombinatorischen Bibliothek für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet. Ein Beispiel ist die Ugi-Kondensation (siehe A. Domling, Current Opinion in Chemical Biology 6(3), 306–313 (2002); I. Ugi et al., Combinatorial Chemistry, 125–165 (1999)):
    Figure 00290002
  • Der Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst ebenfalls das Design von kombinatorischen Reaktionen, in welchen mehr als eine funktionelle Gruppe an einem Monomer vorhanden sein kann, so dass multimere Liganden zusammengestellt werden können. Auf diese Weise können zwei oder mehrere Monomere durch die gegenseitige Umsetzung von zwei oder mehreren funktionellen Gruppen unter Einsatz der oben veranschaulichten chemischen Reaktion oder einer anderen Reaktion, die un ter milden, wässrigen Bedingungen erfolgen kann, hergestellt werden. Beispielsweise schematisch:
    Figure 00300001
    worin die Monomersätze, die die Gruppen M1 und M2 umfassen, miteinander durch eine chemische Reaktion (A + B = X) reagieren, um trimere Produkte zu erhalten, die die Gruppen M1 und M2 umfassen, und Monomersätze, die M1, M2 und M3 enthalten, miteinander durch zwei chemische Reaktionen (A + B = X und P + Q = Y) reagieren, um trimere Produkte zu erhalten, die die Gruppen M1, M2 und M3 umfassen.
  • Weitere Faktoren, die beim Design von geeigneten kombinatorischen Bibliotheken unter wässrigen Bedingungen in Betracht gezogen werden müssen, sind folgende:
    Die Löslichkeit in Wasser der reagierenden Monomere kann die Transformationseffizienz einschränken.
  • Katalyse – Brönsted- und Lewis-Säurekatalyse und andere Katalysatoren können eingesetzt werden, um die Transformation in einem wässrigen Umfeld zu ermöglichen [Beispielsweise U. Lindstroem, Chemical Reviews, 102(8), 2751–2771 (2002)].
  • Mizellen – die Verwendung von mizellaren Katalysatoren, um die Verwendung von Wasser als Lösungsmittel zu ermöglichen [Beispielsweise U. Lindstroem (2002)].
  • Hilfslösungsmittel – die Verwendung von Hilfslösungsmitteln, um die Verwendung von Wasser als Lösungsmittel zu ermöglichen, wie z.B., aber nicht ausschließlich, DMSO, Polyethylenglykole, Ethylenglykole, Methanol, Ethanol, Isopropanol, Aceton und Acetonitril. Diese Hilfslösungsmittel sollten mit dem Proteinkristall verträglich sein und können typischerweise in einer Menge von bis zu 20% des Lösungsmittelsystems eingesetzt werden, was zu bevorzugen ist, wenngleich eine Menge von bis zu 40% oder mehr möglich sein kann.
  • Lösungsvermittler – die Verwendung von Lösungsvermittlern, um die Verwendung von Wasser als Lösungsmittel bei der Umsetzung von organischen Verbindungen möglich zu machen [siehe beispielsweise U. Lindstroem (2002)].
  • Tenside – die Verwendung von Tensiden, um die Verwendung von Wasser als Lösungsmittel bei der Umsetzung von organischen Verbindungen möglich zu machen [siehe beispielsweise U. Lindstroem (2002)]. Diese Tenside sollten mit dem Proteinkristall verträglich sein.
  • Die oben beschriebene Synthese der kombinatorischen Bibliothek und die oben beschriebenen Verfahren können auf ähnliche Weise für die Bedingungen eines wässrigen Lösungsmittelgemischs angepasst werden.
  • In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die Monomere vorzugsweise im Wesentlichen nicht an das Zielprotein binden, sondern nur die Gruppe von Verbindungen, die gebildet wurde, umfasst Verbindungen, die eine Affinität für das Zielprotein aufweisen. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis von Ki des am stärksten bindenden Liganden, der gebildet wurde, zu der Ki des am stärksten bindenden Monomers zumindest 10 zu 1, noch bevorzugter 100, 1000 oder sogar 10.000 zu 1.
  • In einem bevorzugten Fall ist es möglich, dass die Gegenwart des Proteinkristalls in der Lösung, in der kombinatorische Chemie durchgeführt wird, die ablaufenden Reaktionen beeinflusst. Wenn die Reaktionen reversibel sind, würde das, ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, die Herstellung von thermodynamischen Produkten ermöglichen, was den Vorteil hat, dass die Produkte an der Proteinoberfläche "örtlich angereichert" werden können, was zur Bildung der stärksten möglichen Liganden in der Bibliothek führt. Die Grundlagen für diesen Effekt werden in I. Huc und R. Nugyen, Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening, 109–130 (2001), beschrieben. Wenn die Reaktionen irreversibel sind, würde das, ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, die Herstellung von kinetischen Produkten ermöglichen, was den Vorteil hat, dass die Produkte an der Proteinoberfläche "örtlich Matrizen bilden", was zur Bildung der stärksten möglichen Liganden in der Bibliothek führt. Die Grundlagen dieses Effekts werden in R. Nguyen und I. Huc, Angew. Chem. Int. Ed. 40(9), 1774–1776 (2001), und in "Click-Chemie" beschrieben, z.B. W. Lewis et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41(6), 1053–1057 (2002).
  • "Just-in-time"-Synthese
  • Da die "Just-in-time"-Synthese nicht in Gegenwart der Proteinkristalle erfolgt, gibt es weniger Beschränkungen in Bezug auf die Art der chemischen Reaktionen, die eingesetzt werden können, um die Gruppen von Verbindungen für das Screenen herzustellen. Bei der Auswahl der passenden Ausgangsmaterialien und Reaktionsbedingungen führen die Reaktionen jedoch vorzugsweise nicht zu einer großen Zahl von Nebenprodukten, die das Screening-Verfahren beeinträchtigen könnten, und somit sind Reaktionen, die keine fremden Reaktionsmittel erfordern, zu bevorzugen.
  • Die oben im Zusammenhang mit der "In-situ"-Synthese erläuterten Reaktionen wären besonders geeignet, jedoch könnten auch andere Reaktionen in Betracht gezogen werden, beispielsweise jene, die auf einer Methode beruhen, bei der die Reagenzien, die die synthetischen Umsetzungen katalysieren oder antreiben, an ein Festphasenmedium gebunden sind und deshalb aus der Lösung durch Filtration entfernt werden. Die chemischen Verfahren, die für die Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden in S. V. Ley et al., Perkin 1, 23, 3815–4195 (2002), und den darin zitierten Verweisen beschrieben.
  • Solche Reaktionen können unter Einsatz von Syntheseverfahren durchgeführt werden, die in allgemeinen Texten über organische Chemie, wie z.B. March's Advanced Organic Chemistry (M. B. Smith und J. March (5. Aufl.), Wiley-Interscience, New York (2001)) oder den darin angeführten Verweisen, beschrieben werden, und weiters wird auf Texte über die oben angesprochene Praxis der kombinatorischen Chemie verwiesen.
  • Wie bei der "In-situ"-Synthese finden die Reaktionen zwischen geeigneten Sätzen von Ligandenvorläufermolekülen ("Monomeren") statt, in welchen zumindest eine Substituentengruppe variiert wird, um Monomersätze zu liefern. Jeder reagierende Monomersatz kann nur ein Element und bis zu beispielsweise 40 Elemente umfassen, wenngleich ein Maximum von etwa 20 Elementen üblicher wäre. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst jeder Satz von reagierenden Monomeren vorzugsweise zumindest 2 Monomere. Eine typische Größe für die resultierende Gruppe von Verbindungen würde zwischen 5 und 1000 liegen, vorzugsweise zwischen 5 und 100, wobei ein Bereich von 10 oder 20 bis 50 oder 70 bevorzugt ist.
  • Die gewöhnlichen Reinigungs- und Charakterisierungsschritte, die in der Praxis der kombinatorischen oder parallelen Synthese eingesetzt werden, sind bei Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich. Diese Schritte werden in der herkömmlichen Praxis dieser Syntheseverfahren als wesentlich erachtet, um Verbindungen zu erzeugen, die für das Testen in einem biologischen Test geeignet sind, wie in zahlreichen der hierin angeführten Verweise beschrieben. Die Reinigung umfasst keine physikalischen Trennungstechniken, wie z.B. Lösungsmittelverdampfen oder Entfernung der nichtlöslichen Substanzen, z.B. durch Sedimentation, Zentrifugieren oder Filtration. Herkömmliche Reinigungsverfahren umfassen wässrige Extraktion, Trituration, Chromatographie, wie z.B. Flash-Säulenchromatographie oder HPLC-Reinigung, Kristallisation und Destillation, wenngleich bestimmte Charakterisierungsverfahren auch zur Reinigung eingesetzt werden können. Die Charakterisierung kann auf verschiedene Arten erfolgen, beispielsweise unter Einsatz von LCMS-, MS- und NMR-Analyse.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die chemische Reaktion, die für die "Just-in-time"-Synthese eingesetzt wird, in einem Lösungsmittel, das als Hilfslösungsmittel für wässrige Lösungen von Proteinkristallen geeignet ist. Solche Lösungsmittel umfassen DMSO, NMP und Alkohole, wie z.B. Methanol und Ethanol (mehr Details sind bei der Erläuterung der Hilfslösungsmittel unter "In-situ"-Synthese zu finden). Auf diese Weise können, nach einer Inkubation der Reaktion über einen angemessenen Zeitraum hinweg, Aliquoten aus der Lösung genommen und direkt zu der Proteinkristall-hältigen Lösung zugesetzt werden, ohne dass Reinigungs- oder Charakterisierungsschritte erforderlich sind.
  • Beispiel
  • Bei dem als Zielmakromolekül ausgewählten Protein handelte es sich um Cyclinabhängige Kinase 2 (CDK2). Dieses Ziel war das Thema intensiver Untersuchungen mit dem Ziel, Hemmer für die Behandlung von einer Reihe von menschlichen Krebsarten zu entwickeln, und wurde mit einer Reihe von Hemmern, die in der ATP-Bindungsfurche gebunden waren, kristallisiert (W. F. de Azevedo et al., Eur. J. Biochem. 243, 518–526 (1997); R. Hoessel et al., Nat. Cell Biol. 1, 60–67 (1999)).
  • Die Gruppe von Verbindungen, die für die Synthese ausgewählt wurden, basierte auf der Oxindol-Matrize, wobei es sich um eine Klasse von Hemmern handelte, die bereits für CDK2 offenbart worden war (H. N. Bramson et al., J. Med. Chem. 44, 4339–4358 (2001)). Diese Liganden (AB, Schema 1) stellen Substituenten in benachbarten lipophilen Bindungstaschen in der ATP-Bindungsfurche dar und können in Monomere getrennt werden, die etwa dieselbe Größe und Komplexität aufweisen (Hydrazine A und Isatine B; Schema 1).
  • Schema 1
    Figure 00340001
  • Eine Reihe von Hydrazinen (A1 bis A6; Tabelle 1) und Isatinen (B1 bis B5; Tabelle 1) wurden ausgewählt, so dass die Gruppe der gebildeten Oxindole eine Reihe von funktionellen Gruppen an der ATP-Bindungsstelle aufweisen würde.
  • Tabelle 1
    Figure 00350001
  • Es wurde dann gezeigt, dass die Synthese der Gruppe von Liganden unter wässrigen Bedingungen in der Gegenwart von 20% des Hilfslösungsmittels Dimethylsulfoxid (DMSO) fortschritt, gemäß Schema 2:
  • Schema 2
    Figure 00360001
  • Die Analyse der 30 Reaktionen in der Gruppe mittels Massenspektrometrie deutete darauf hin, dass alle Reaktionen erfolgreich über einen Zeitraum von 24–72 h hinweg die erwarteten Produkte bildeten, und die Effizienz der einzelnen Reaktionen wurde mittels IC/MS-Analyse bewertet (Tabelle 2). In den meisten Fällen fielen die Produkte unter dieses Reaktionsbedingungen langsam im Laufe der Zeit aus der Reaktionslösung aus. Aus den in Tabelle 2 angeführten qualitativen Daten geht klar hervor, dass Monomer A6 keine hohen Umsatz oder hohe Reinheit in den Reaktionen ergab und dass manche andere einzelne Reaktionen auch unergiebig war, wobei jedoch erwartet wird, dass die Variabilität der absoluten Menge an Produkten, die durch die einzelnen Reaktionen gebildet werden, nicht mehr als das 10fache dieser Ergebnisse beträgt. Tabelle 2 (% Reinheit pro durch LC/MS ermittelte Peak-Fläche des Produkts)
    Figure 00370001
    • R-Gruppen
    = H, wenn nicht anders angegeben.
  • Untersuchungen in Bezug auf die Monomere, um die kinetische Konkurrenz der Monomere zu ermitteln, wiesen darauf hin, dass die Produkte nicht-stöchiometrische Gemische bildeten, wobei erwartet werden würde, dass die Hydrazine und Isatine variierende Reaktivitäten aufweisen. Die IC/MS-Analyse der Konkurrenz-Experimente (unter Einsatz eines Photodiodengruppen-Detektors, der Wellenlängen von 200–400 nm scannt) deutete darauf hin, dass Hydrazingemische, die mit einem 10fachen Unterschuss jedes Isatins umgesetzt wurden, einen weniger als 5fachen Überschuss der individuellen Produkte in Bezug auf alle anderen und typischerweise einen weniger als 3fachen Überschuss lieferten. Diese Daten deuteten wiederum darauf hin, dass das Monomer A6 dazu neigte, abgelehnt zu werden, jedoch wurde wiederum eine messbare Menge an Produkten nachgewiesen, die das Ergebnis einer Reaktion dieses Monomers mit jedem Isatin waren (5–10% des Gemischs).
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass bei der Ligandensynthese in Gegenwart eines Proteins alle diese Reaktionsprodukte in einer wirksamen Konzentration gebildet werden konnten. Zusätzlich dazu hätte man erwartet, dass unter diesen Bedingungen thermodynamische Produkte vorherrschen, da die Reaktionen vollständig reversibel sind.
  • Die Analyse der Reaktionen, z.B. mittels LC-MS, und Isolation der Verbindungen ist für das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich, jedoch ist es nun, da die Reaktionsbedingungen ermittelt wurden, die für das in dieser Erfindung offenbarte Röntgen-Screeningverfahren geeignet sind, möglich, die in den Monomersätzen A und B vorhandenen Substitutionsmuster (d.h. R1–R7) zu verändern und in der Gegenwart von CDK2-Kristallen eine "In-situ"-Synthese von weiteren Verbindungsbibliotheken durchzuführen, die hierin nicht beschrieben sind.
  • Kristalle aus menschlicher CDK2 voller Länge (Reste 1–298) wurden gezüchtet. Für das Eintauchen wurden die Kristalle in eine Lösung übertragen, die die Ionenstärke und die Ausfällungskonzentrationen der ursprünglichen Kristallmutterlösung beibehielt, jedoch auch 20% DMSO und die reaktiven Hydrazin- und Isatin-Spezies umfasste (siehe Tabelle 3). In allen Fällen betrug die Hydrazin-Gesamtkonzentration 10-mal mehr als die Isatinkonzentration.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der zuvor erläuterten Verfahren für die Herstellung von CDK2-Liganden.
  • Experimentelle Verfahren
  • Kristalle aus menschlicher Cyclin-abhängiger Kinase 1 (CDK2) voller Länge (Reste 1–298) wurden unter den in (1) Lawrie et al., Nat. Str. Biol. 4, 796–800 (1997), und (2) J. Rosenblatt et al., J. Mol. Biol. 230, 1317–1319 (1993), dargelegten Bedingungen gezüchtet. Kristalle, die unter Einsatz von (1) gezüchtet wurden, wurden unter Einsatz des Hängetropfen-Dampfdiffusionsverfahrens bei 4°C oder 18°C erhalten. 1 μl von 10 mg/ml CDK2 in 10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 15 mM NaCl wurde mit 1 μl Reservoirlösung vermischt. Die Reservoirlösung (1 ml Gesamtvolumen) umfasste (25–55) mM Ammoniumacetat, (10–17,5) % Polyethylenglykol (PEG) (mittleres Molekulargewicht 3350) und 100 mM HEPES/NaOH, pH 7,4. Kristalle, die unter Einsatz von (2) gezüchtet wurden, wurden ebenfalls durch das Hängetropfen-Dampfdiffusionsverfahren bei 4°C hergestellt. 4 μl von 10 mg/ml CDK2 in 10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, wurden über 1 ml Reservoirlösung suspendiert, die (200–800) mM HEPES/NaOH, pH 7,4, umfasste.
  • Für das Eintauchen wurden die unter Einsatz von (1) gezüchteten Kristalle in Mikrobrücken übertragen, die 20 μl Eintauchlösung umfassten. Die Eintauchlösungen wurden so hergestellt, dass die Konzentrationen von Ammoniumacetat, PEG und HEPES/NaOH, pH 7,4, dem Tropfen entsprachen, von dem der jeweilige Kristall geerntet wurde. Die Eintauchlösungen umfassten außerdem 20% DMSO und die Hydrazin- und Isatinspezies, die umgesetzt werden sollten. Es wurden jeweils Hydrazin- und Isatinkonzentrationen in den Bereichen von (5–20) mM (gesamter organischer Anteil) bzw. (0,5–2) mM (gesamter organischer Anteil) eingesetzt. "Gesamter organischer Anteil" bezieht sich auf die Tatsache, dass in einer Eintauchlösung, die zahlreiche Isatine und Hydrazine umfasst, die kombinierte Konzentration aller Hydrazine (5–20) mM und die kombinierte Konzentration aller Isatine (0,5–2) mM betragen würde. Alle Hydrazine waren in äquimolaren Konzentrationen vorhanden, und alle Isatine waren in äquimolaren Konzentrationen vorhanden. Das bedeutet, dass, wenn eine Eintauchlösung zwei Isatine und vier Hydrazine mit gesamten organischen Hydrazin- und Isatinkonzentrationen von 10 mM bzw. 1 mM umfasste, jedes Isatin in einer Konzentration von 0,5 mM und jedes Hydrazin in einer Konzentration von 2,5 mM vorhanden wäre. Eintauchlösungen umfassten typischerweise Permutationen von (1–5) Isatinen und/oder (1–6) Hydrazinen (siehe Tabelle 1). Die allgemeine Formel für die Produkte, die durch die Permutation der Reaktionsmittel entstanden, ist in Schema 2 angeführt (siehe auch Tabelle 2). Die exakte Natur der gebildeten Produkte wird detailliert in Tabelle 2 angeführt. Die Kristalle wurden 3–5 Tage lang bei 18°C eingetaucht.
  • Die Kristalle wurden gefroren, indem sie kurz in eine Kryo-Schutzlösung getaucht und dann in flüssigem Stickstoff schnell gefroren wurden. Die Kryo-Schutzlösung umfasste Konzentrationen von (14,5–22,5) % Glycerin und Ammoniumacetat, PEG und HEPES/NaOH, pH 7,4, die den Tropfen entsprachen, von denen die Kristalle ursprünglich geerntet wurden.
  • Unter Einsatz von (2) gezüchtete Kristalle wurden auf dieselbe Weise wie die unter Einsatz von (1) gezüchteten Kristalle eingetaucht und gefroren, nur dass nur die Konzentration von HEPES/NaOH, pH 7,4, beibehalten wurde und nicht die Konzentrationen von Ammoniumacetat, PEG und HEPES/NaOH, pH 7,4.
  • Röntgenbeugungsdaten wurden von den eingetauchten Kristallen, die auf 100 K abgekühlt wurden, auf einer rotierenden Kupferanodenquelle von Rigaku unter Einsatz von Rigaku/MSC-Jupiter-CCD- oder Raxis-IV++-Bildelektroden-Detektoren erstellt. Die Daten wurden unter Einsatz von D*TREK-Suite (J. W. Pflugrath, Acta Crystallographica D55, 1718–1725 (1999)) oder MOSFLM (A. G. W. Leslie in Joint CCP4 and EESF-EACMB Newsletter an Protein Crystallography, Band 26, Daresbury Laborstory, Warrington (1992)), SCALA und der CCP4-Programmgruppe (CCP4: siehe oben) integriert, reduziert und skaliert. Eine apo-cdk2-Struktur (H. L. DeBondt et al., Nature 363, 595–602 (1993)) wurde als Ausgangspunkt für die Strukturverfeinerungen eingesetzt. Die Strukturen wurden ursprünglich in 25 Aminosäureabschnitte unterteilt und in CNX (siehe oben) starrkörperverfeinert. Die Strukturen wurden dann iterativen Zyklen von positionellen und isotropen B-Faktor-Verfeinerungen in CNX unterzogen, wonach eine manuelle Neubildung unter Einsatz des Graphikprogramms "O" (siehe oben) und eine automatische Ligandenanpassung unter Einsatz von AUTOSOLVE® erfolgte. Die endgültige Wasseranpassung erfolgte unter Einsatz von betriebseigener Software. Details in Bezug auf die repräsentativen Röntgendaten sind in Tabelle 2 angeführt. Tabelle 3: Repräsentative Röntgenergebnisse und experimentelle Bedingungen
    Figure 00410001
    • 1 Rmerge = ΣhΣj|Ih,,j – Ih|/ΣhΣj|Ih,,j|, worin Ih,,j die j-te Beobachtung der Reflexion h ist.
    • 2 Rconv = Σh||Fo| – |Fc||/Σh|Fo|, worin Fo und Fc jeweils die beobachteten bzw. berechneten Strukturfaktoramplituden der Reflexion h sind.
    • 3 Rfree entspricht Rconv, jedoch für eine 5% Teilmenge der Reflexionen, die nicht für die Verfeinerung herangezogen wurden.
    • 4 insgesamt organisch bezieht sich auf die kombinierte Gesamtmenge der Isatin- oder Hydrazinkonzentration in der Eintauchlösung. Jede Komponente ist dabei in einer Konzentration vorhanden, die der organischen Gesamtkonzentration dividiert durch die Anzahl von Isatin- oder Hydrazinkomponenten in dem Gemisch entspricht.
    • 5 Kontrollexperimente mit Kristallen, die (3–5) Tage in Gemische eingetaucht wurden, die entweder B2 (20 mM), (B1, B2, B3, B4, B5) (1 mM insgesamt organisch4) oder (A1, A2, A3, A4, A5, A6) (1 mm insgesamt organisch) umfassten, wiesen keine interpretierbare Ligandendichte auf. Kristalle, die in ein 10-mM-Gemisch aus (A1, A2, A3, A4, A5, A6) eingetaucht wurden, wurden wiederholt zerstört.
    • 6 In bestimmten Fällen wurde festgestellt, dass Kristalle, die Eintauchlösungen ausgesetzt waren, die nur ein Hydrazin und ein Isatin umfassten, im Vergleich mit den in Multikomponenten-Hydrazin-Isatin-Gemischen eingetauchten Kristallen eine verstärkte Zerstörung aufwiesen. Die Isatin- und Hydrazinkonzentrationen wurden schrittweise gesenkt, bis die eingetauchten Kristalle stabilisiert werden konnten und die Kristallzerstörung reduziert werden konnte. Häufig wurde während des Eintauchens Ausfällung beobachtet, die der Isatin-Hydrazin-Produktbildung zugeschrieben wird.
  • Diskussion der Ergebnisse
  • Zu Beginn wurden Experimente unter Verwendung von Reaktionsgemischen durchgeführt, die ein einziges Isatin und ein einziges Hydrazin umfassten. In diesen Fällen wurde Produktbindung beobachtet. Frühere Untersuchungen (H. N. Bramson et al., J. Med. Chem. 44, 4339–4358 (2001)) deuteten darauf hin, dass von A5 (siehe 1 und Tabelle 2) abgeleitete Hemmer aufgrund der Gegenwart einer Sulfonamidgruppe an der R3-Position in dem Liganden ein relativ hohes Maß an Wirksamkeit aufweisen sollten. Ein Reaktionsgemisch, das B2 und (A1–A4) umfasste, wies keine Liganden bindung auf, was darauf hindeutet, dass die Chlorsubstitutionen an den Positionen (R1–R3) den Produktliganden keine wesentliche Wirksamkeit verliehen. Ein Gemisch, das B2 + (A1–A6) umfasste, wies jedoch Ligandenbindung auf; die Elektronendichte war bei dem durch die Reaktion von (B2 + A5) gebildeten Produkt gleich. Demnach wurde das (B2 + A5)-Reaktionsprodukt vorzugsweise aus einem Satz von 6 möglichen Produkten ausgewählt, was die Annahme unterstützt, dass die R3-Sulfonamidgruppe dem A5B2-Liganden Bindungsaffinität verlieh. Die Degeneration der Produktbibliothek wurde unter Einsatz eines Reaktionsgemischs, das Isatine (B1–B5) und Hydrazine (A1–A6) enthielt, auf 30 mögliche Liganden gesteigert. Jedes Isatin war in einer Konzentration von 0,2 mM und jedes Hydrazin in einer Konzentration von 1,67 mM vorhanden (siehe Tabelle 3). Die Differenzelektronendichte wurde erneut als übereinstimmend mit dem Reaktionsprodukt von (B2 + A5) beobachtet. Diese Untersuchungen deuten darauf hin, dass das Protein bevorzugt Den A5B2-Liganden aus der Bibliothek der verfügbaren Produktliganden auswählt. Die Wirksamkeit dieser Verbindung wurde durch die Synthese eines A5B2-Liganden bestätigt. Aus der Literatur ist bekannt, dass die Verbindung A5B2 eine 1050 von 43 nM aufweist (Bramson et al. (2001)).

Claims (9)

  1. Verfahren zur Identifikation eines Liganden eines Zielmakromoleküls, ausgewählt aus Polypeptiden, Ribosenucleinsäuren, Desoxyribosenucleinsäuren und Komplexen aus Kombinationen davon, folgende Schritte umfassend: a) das Synthetisieren einer Gruppe von Verbindungen, die zum Screenen gegen ein Zielmakromolekül geeignet sind, worin die Gruppe von Verbindungen durch ein oder mehrere Syntheseverfahren hergestellt wurde, die dazu konzipiert sind, zwei oder mehrere Sätze von Monomeren miteinander zu verbinden, und worin alle Verbindungen in der Gruppe eine gemeinsame funktionelle Gruppe aufweisen, die durch Reaktion zweier oder mehrerer komplementärer funktioneller Gruppen im Satz von Monomeren gebildet wird, und zwar in einer Lösung, die einen oder mehrere Kristalle des Zielmakromoleküls enthält; b) das Erstellen eines Röntgen-Kristallbeugungsdiagramms des eingetauchten Makromolekülkristalls; und c) das Verwenden des Röntgen-Kristallbeugungsdiagramms zur Identifikation einer beliebigen Verbindung, die an den Makromolekülkristall gebunden ist, wobei die Verbindung ein Ligand des Zielmakromoleküls ist.
  2. Verfahren zur Identifikation eines Liganden eines Zielmakromoleküls, ausgewählt aus Polypeptiden, Ribosenucleinsäuren, Desoxyribosenucleinsäuren und Komplexen aus Kombinationen davon, folgende Schritte umfassend: a) das Synthetisieren einer Gruppe von ungereinigten Verbindungen, die zum Screenen gegen ein Zielmakromolekül geeignet sind, worin die Gruppe von Verbindungen durch ein oder mehrere Syntheseverfahren hergestellt wurde, die dazu konzipiert sind, zwei oder mehrere Sätze von Monomeren miteinander zu verbinden, und worin alle Verbindungen in der Gruppe eine gemeinsame funktionelle Gruppe aufweisen, die durch Reaktion zweier oder mehrerer komplementärer funktioneller Gruppen im Satz von Monomeren gebildet wird; b) das Zusetzen der Gruppe von Verbindungen zu einer Lösung, die einen oder mehrere Kristalle des Zielmakromoleküls enthält; c) das Erstellen eines Röntgenkristallbeugungsdiagramms des eingetauchten Makromolekülkristalls; und d) das Verwenden des Röntgenkristallbeugungsdiagramms zur Identifikation jeglicher Verbindung, die an den Makromolekülkristall gebunden ist, wobei die Verbindung ein Ligand des Zielmakromoleküls ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, worin, wenn Schritt a) in einem Lösungsmittel erfolgt, das nicht mit den Makromolekülkristallen verträglich ist, das Verfahren nach Schritt a) den weiteren Schritt des Abtrennens der Gruppe von Verbindungen vom Lösungsmittel umfasst, in dem die Verbindungen synthetisiert wurden.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, worin, wenn Schritt a) in einem Lösungsmittel erfolgt, das nicht mit den Makromolekülkristallen verträglich ist, das Lösungsmittel, in dem Schritt a) erfolgt, mittels einer permeablen Membran von der Lösung, die einen oder mehrere Makromolekülkristalle enthält, abgetrennt wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Zielmakromolekül ein Protein ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Gruppe von Verbindungen einzeln synthetisiert und dann zusammengemischt wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Gruppe von Verbindungen durch kombinatorische Chemie als Gemisch synthetisiert wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die in der Lösung vorhandene Menge jeder Verbindung, die ein Element der Gruppe von Verbindungen ist, in einer Konzentration vorliegt, die zumindest 10-mal so hoch ist wie die Konzentration des Zielmakromoleküls im Reaktionssystem.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Elemente der Gruppe von Verbindungen nicht kovalent an das Zielmakromolekül binden.
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