JP3796539B2

JP3796539B2 - グリセロ糖脂質の製造方法及びそれに用いる微生物

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Publication number: JP3796539B2
Application number: JP2002039694A
Authority: JP
Inventors: 聰福岡; 健何森; 康弘川浪
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2002-02-18
Filing date: 2002-02-18
Publication date: 2006-07-12
Anticipated expiration: 2022-02-18
Also published as: JP2003235597A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生分解性の界面活性剤、化粧料添加剤、ガン予防剤などとして有用なグリセロ糖脂質の製造方法及びそれに用いられる新規な微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
グリセロ糖脂質は、１個以上のグリセロールを含む糖脂質であって、近年、その機能が解決された結果、生分解性の界面活性剤（特開平７−２５２４９４号公報）、皮膚用化粧料（特開平８−２０８４２３号公報、特開平９−２４１１４９号公報）、毛髪用化粧品（特開平８−９９８４５号公報、特開平７−３０９７２５号公報）、ガン予防食品（特開２００１−２１３７８２号公報）などとしての利用がはかられている。
【０００３】
これまで、このグリセロ糖脂質は、コムギその他の天然物から抽出したり、その使用目的に応じこのような天然物から抽出された各種糖脂質を原料として合成されていた。また、最近に至りコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する微生物を培養して、炭素数１５のアシル基をもつグリセロ糖脂質を製造する方法も提案されている（特開２００１−２４７５９３号公報）。
【０００４】
しかしながら、これらの方法は、得られるグリセロ糖脂質中のアシル基の種類が限られている上に、抽出や精製に有機溶剤を用いる必要があり、大量生産する場合、環境汚染や健康管理上の問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術における上記の欠点を克服し、所望のアシル基をもったグリセロ糖脂質を効率よく製造する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グリセロ糖脂質を効率よく製造する方法を開発するために鋭意研究を重ねた結果、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属するある種の微生物を培養すれば、菌体中に炭素数１５〜１７個の飽和脂肪酸残基をもつグリセロ糖脂質が蓄積されること、及びこの微生物は文献未載の新しい微生物であることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭＰ−１８６９８）を培養し、その培養した菌体からグリセロ糖脂質を分離することを特徴とするグリセロ糖脂質の製造方法、及びオーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭＰ−１８６９８）を提供するものである。
【０００８】
この方法により得られるグリセロ糖脂質は、炭素数１５の飽和脂肪酸残基２個、炭素数１５の飽和脂肪酸残基１個と炭素数１６の飽和脂肪酸残基１個、炭素数１６の飽和脂肪酸残基２個又は炭素数１５の飽和脂肪酸残基１個と炭素数１７の飽和脂肪酸残基１個との組合せを有するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明方法において培養に用いる微生物は、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、グリセロ糖脂質を生産する能力を有することをもって特徴づけられる菌株、すなわち菌株ＡＡ１は独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−１８６９８として寄託されている。
【００１０】
この菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭＰ−１８６９８）は熊本県天草郡有明町の海水から分離された文献未載の新菌である。
【００１１】
次に本発明方法で用いる微生物の菌学的性状を説明する。
（１）形態
コロニーの形態は、偏平で丸く、不透明で黄色である集落の周辺細胞の伸長は陰性である。細胞の光学顕微鏡観察に基づく形態は、多形成桿菌で０．４〜０．７μｍの幅を有し、培養の経過により初期の桿菌から対数増殖の終末期には短桿菌〜球菌状に形状が変化し、また、運動性を有していた。グラム染色は陽性で、胞子形成能は認められなかった。
（２）生理学的性質
（ａ）炭素源の発酵性グルコースの酸化分解性は陰性である。
（ｂ）細胞壁のジアミノ酸はオルニチンである。
（ｃ）主要キノン系はＭＫ−１１，ＭＫ−１０，ＭＫ−１２である。
（ｄ）酵素活性
カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）活性は陽性である。オキシダーゼ（ｏｘｉｄａｓｅ）活性は陰性である。
（ｅ）酸素に対する態度は好気的である。
【００１２】
以上の菌学的性質から菌株ＡＡ１は文献を参考に既知菌種を検索したところ、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の性状と一致した。
【００１３】
本発明方法によりグリセロ糖脂質を製造するには、上記の菌株を栄養培地に接種し、好気的に培養する。この菌株の培養方法は、原則的には一般微生物の培養方法に従って行われるが、通常は液体培養による振とう培養、通気撹拌培養などの好気的条件下で行うのが好ましい。
【００１４】
この際、培養に用いることのできる培地としては、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭＰ−１８６９８）が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも用いることができる。培地組成としては、例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース、プシコース、糖みつ、デンプンなどを単独又は組み合わせて使用することができ、窒素源としては、大豆粉、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウムなどを単独又は組み合わせて使用することができる。また必要に応じて、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸塩、金属塩などの無機塩を加えることができる。その他、これらの菌株の生育あるいはグリセロ糖脂質の生産を促進する有機物、例えば、ビタミン類、アミノ酸類を加えることができる。
【００１５】
この培養においてグリセロ糖脂質の生産量を増大するには、炭素源としてプシコースなどの緩慢代謝性の糖類を用いるのが好ましい。
また、この際、栄養源の他、５質量％以下、好ましくは０．５〜３．５質量％の塩化ナトリウムを添加し、液体培地で培養する場合は空気を吹き込むか、空気との接触を保つために振とうするのが好ましい。
【００１６】
培養条件としては、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭＰ−１８６９８）が良好に生育して本発明のグリセロ糖脂質を生産しうる範囲内で適宜選択すればよい。例えば、培地のｐＨは５〜８程度、通常中性付近とすることが好ましいが、必ずしも調整する必要はない。培養温度は、微生物が良好に生育する温度、通常１０〜４０℃、好ましくは１５〜３５℃に保つのがよい。培養時間は、１〜１４日間程度でよく、好ましくは２〜５日間である。もちろん上述した各種の培養条件は、外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれに応じて上記範囲から最適条件を選択、調整できる。その際、培養液中のグリセロ糖脂質の蓄積量が最大になったときに培養を停止して得た培養液を後続の工程に使用する。
【００１７】
このようにして得た培養液中に蓄積されたグリセロ糖脂質は、培養後、濾過、遠心分離などの一般的固液分離手段によって菌体を分離し、分離した菌体から回収可能である。
【００１８】
グリセロ糖脂質の分離、精製は、これまで知られている種々の方法を選択、組み合わせて行うことができる。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、メチルアルコールなどを用いた溶媒抽出や、シリカゲルやアルミナなどの担体を用いるクロマトグラフィー法を用いることができる。これらの担体から目的物質を溶出させる方法は、担体の種類、性質によって異なるが、一例として、シリカゲル薄層クロマトグラフィーの場合には、展開及び溶出溶媒として、クロロホルムとメチルアルコールの混合溶媒などを用いることができる。さらにゲル濾過、順相あるいは逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィーなどを用いることができる。これらの方法は単独又は適宜組み合わせて、場合によっては反復使用することにより、分離、精製する。
【００１９】
このようにして得られるグリセロ糖脂質は以下に示す物理化学的性質及び構成成分を有する。
【００２０】
グリセロ糖脂質がペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸の任意の２種類を含有することの同定はアルカリ加水分解−メチルエステル化法により行った。高純度としたグリセロ糖脂質を文献［マイクロバイオス（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ）、第７２巻、１６７〜１７３ページ、（１９９２）］記載の方法で、２Ｍ水酸化ナトリウムを含有するメチルアルコール−水溶液中、１００℃で３時間加水分解反応させて脂肪酸を遊離させた。脂肪酸はヘキサンにより抽出後、トリフルオロホウ酸−メチルアルコール錯塩でメチルエステル化した後、非極性キャピラリーカラム（スペルコ製ＳＰＢ−１，３０ｍ）を装填したガスクロマトグラフ質量分析装置及びイソブタンをイオン化ガスに用いる化学イオン化法で測定した。その結果を図１に示す。この中の記号１はペンタデカン酸のメチルエステルに相当するピーク、記号２はヘキサデカン酸のメチルエステルに相当するピーク、記号３はヘプタデカン酸のメチルエステルに相当するピークである。このように、このグリセロ糖脂質は、３種類の脂肪酸を主要成分としており、ピーク強度の強い順に質量／荷電比の値は２５７，２７１，２８５であった。これはペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸のメチルエステルにプロトン１個が付加した分子量に等しく、脂肪酸がこの３種を主要成分とすることが分る。
【００２１】
グリセロ糖脂質がグリセロール、マンノースとグルコースを含有することの同定は文献記載の酸加水分解−アルジトールアセテート法により行った。すなわちトリフルオロ酢酸溶液中で１２１℃、６０分加水分解処理した後、アルジトールアセテート法による酢酸エステル化したのち強極性のキャピラリーカラム（スペルコ製ＳＰＢ−２３８０，３０ｍ）を装填したガスクロマトグラフ質量分析装置を用いてエレクトロンイオン化法で測定した。この測定結果を図２に示す。ピークの中で記号１，２，３はそれぞれ市販の標準物質と比較したときにグリセロールトリアセテート、マンノース還元物のヘキサアセテート、グルコース還元物のヘキサアセテートと同一の溶出時間及び質量スペクトルパターンを示した。このことから、該グリセロ糖脂質がグリセロール、マンノース、グルコースを含有することが分る。
【００２２】
グリセロ糖脂質を文献［アーカイブス・オフ・マイクロバイオロジー（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第１５７巻、３１１〜３１８ページ、（１９９２）］記載の方法に準じて高速原子衝撃質量スペクトル分析したときのポジテイブイオン法による測定結果を図３に示す。スペクトルにはｍ／ｚ８８７．５，９０１．５，９１５．５の３本の主要プリカーサーイオンピークが認められ、グリセロ糖脂質がグリセロール１個、ヘキソース２個、脂肪酸２個を含有する、グリセロ糖脂質であることが推定される。
【００２３】
該グリセロ糖脂質の物理化学的性質
（１）分子量：８６４．６，８７８．６，又は８９２．６
（２）分子式：Ｃ₄₅Ｈ₈₄Ｏ₁₅，Ｃ₄₆Ｈ₈₆Ｏ₁₅，又はＣ₄₇Ｈ₈₈Ｏ₁₅
（３）図３の高速原子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）より［Ｍ＋Ｎａ］＋として質量／荷電比はｍ／ｚ８７７．５，９０１．５，９１５．５にイオンピークを示し、これらは分子量にナトリウム原子１個が付加した質量計算値にほぼ一致した値である。表１に分子量の測定値に基づく脂肪酸の組合せを示す。
【００２４】
【表１】

【００２５】
（４）色及び形状：白色粉末。
（５）溶解性：メチルアルコール、クロロホルム混合溶媒に溶け、水にはほとんど溶けない。
（６）呈色反応：硫酸オルシノール試薬で呈色する。
（７）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：シリカゲル薄層プレート（Ｍｅｒｃｋ社製：１．０５６４１）にて０．３３（展開溶媒クロロホルム／メチルアルコール、体積比４／１）
【００２６】
【実施例】
次に実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２７】
実施例１
寒天［デイフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製、「マリンアガー２２１６」］５５．１ｇを水１リットルに溶解し、１２１℃で１５分オートクレーブ滅菌したのち、直径９０ｍｍのシャーレに３０ｍｌ分注し、室温まで放冷することにより固体培地を調製した。
次いで、上記の寒天の表面に４質量％プシコース溶液２００μｌを塗布した上に、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭＰ−１８６９８）の菌体を接種し、２０℃の恒温インキュベーター中に静置し、培養した。
７日間培養したのち、菌体を採取し、凍結乾燥することにより、乾燥菌体１９８ｍｇを得た。
【００２８】
次に、この乾燥菌体１９８ｍｇを、クロロホルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）１５ｍｌずつで３回抽出し、この抽出液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固することにより粗グリセロ糖脂質２８．７ｍｇを得た。次いでこの粗グリセロ糖脂質をシリカゲル薄層クロマトグラフィープレート（メルク社製、１．０５６４１）に担持させたのち、クロロホルム／メチルアルコール混液（体積比４／１）で展開した。展開終了後、溶媒を蒸発させ、薄層プレートを純水に浸漬し、直ちに引き上げ、Ｒｆ値０．３３の白く抜けたバンド部分を分取し、クロロホルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）で溶出し、溶出液をロータリーエバポレーターで乾固することにより精製グリセロ糖脂質１．７ｍｇを得た。
【００２９】
実施例２
先ず、以下に示す組成の液体栄養培地（ｐＨ６．５）を調製した。

【００３０】
次に、この液体栄養培地１００ｍｌを５００ｍｌ体積三角フラスコに移し、オートクレーブ殺菌したのち、実施例１と同じ菌体を接種し、ロータリーシェーカーを用い、２０℃、振とう速度１００ｒｐｍの条件下、２日間振とう培養し、種母培養液を調製した。
別に、５００ｍｌ体積三角フラスコ５個を用意し、それぞれに、前記の組成の液体栄養培地１００ｍｌずつを分注し、殺菌処理したのち、前記の種母培養液１ｍｌずつを接種し、ロータリーシェーカー（１００ｒｐｍ）を用いて２０℃で４日間振とう培養した。
【００３１】
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、少量の純水で洗浄後、凍結乾燥することにより、フラスコ１個当り平均１４１ｍｇの乾燥菌体を得た。
次いで、この乾燥菌体１４１ｍｇをクロロホルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）１０ｍｌずつを用いて３回抽出したのち、この抽出液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固することにより、粗グリセロ糖脂質１１．６ｍｇを得た。このようにして得た粗グリセロ糖脂質を、シリカゲル薄層クロマトグラフィープレート（メルク社製、１．０５６４１）上に担持させ、クロロホルム／メチルアルコール混液（体積比４／１）で展開した。展開終了後、これを乾燥し、薄層プレートを純水に浸漬して直ちに引き上げ、Ｒｆ値０．３３の白く抜けたバンド部分を分取し、クロロホルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）で溶出し、この溶出液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固することにより、精製グリセロ糖脂質１．５ｍｇを得た。
【００３２】
実施例３
実施例２で用いた組成の液体培養培地１００ｍｌずつを三角フラスコ４個に分取し、それぞれにプシコース、グルコース、ガラクトース又はシュークロース０．５ｇずつ添加したのち殺菌処理した。
次いで、これらに実施例２で調製した種母培養液１ｍｌずつを接種し、ロータリーシェーカーを用いて、２０℃、振とう速度１００ｒｐｍで４日間振とう培養した。
【００３３】
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め、少量の純水で洗浄後、凍結乾燥し、乾燥菌体を得た。この乾燥菌体をクロロホルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）を用いて３回抽出し、この抽出液をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固させ、粗グリセロ糖脂質を得た。次いで、粗グリセロ糖脂質をシリカゲル薄層クロマトグラフィープレート（メルク社製、１．０５６４１）に担持させ、クロロホルム／メチルアルコール（体積比４／１）で展開した。展開終了後、乾燥させ、薄層プレートを純水に浸漬し、すぐに引き上げ、Ｒｆ値０．３３の白く抜けたバンド部分を分取し、クロロホルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）で溶出し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固することにより、精製グリセロ糖脂質を得た。各種の糖を添加したときの乾燥菌体量、粗グリセロ糖脂質、精製グリセロ糖脂質の量を表２に示す。
【００３４】
【表２】

【００３５】
実施例４
酵母エキス（デイフコ社製）０．５質量％、トリプトン（デイフコ社製）１．０質量％、塩化ナトリウム１．０質量％を海水に添加して調製した液体栄養海水培地（ｐＨ６．３）５リットルを１０リットル体積のジャーファーメンターに入れ殺菌した。これに実施例２で調製したオーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭＰ−１８６９８）の種母培養液を接種し、２０℃、撹拌速度３００ｒｐｍ送風量毎分２リットルで４日間培養した。培養終了後、得られた培養液２．６７リットルを遠心分離して菌体を集め凍結乾燥し、乾燥菌体５．８９ｇを得た。
【００３６】
乾燥菌体５．８９ｇをクロロホルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）１２０ｍｌを用いて３回抽出し、溶媒をロータリーエバポレーターにより濃縮乾固させ３６８ｍｇの粗グリセロ糖脂質を得た。粗グリセロ糖脂質をシリカゲル薄層クロマトグラフィープレート（メルク社製：Ａｒｔ．１３７９２，２００×２００×１ｍｍ厚）に担持させ、クロロホルム／メチルアルコール（体積比４／１）で展開した。展開終了後、乾燥させ、薄層プレートを純水に浸漬し、すぐに引き上げ、Ｒｆ値０．３〜０．３５の白く抜けたバンド部分を分取し、クロロホルム／メチルアルコール混液（体積比２／１）で溶出し、溶出液をロータリーエバポレーターで乾固することにより精製グリセロ糖脂質３６．５ｍｇを得た。
【００３７】
【発明の効果】
グリセロ糖脂質の製造においては、従来、植物体などより抽出して得ていたため、計画的に大量生産しようとしても設備など経費も多く要する上に、生産されるグリセロ糖脂質製剤の量も植物の生育状況に影響されていた。また、植物体におけるグリセロ糖脂質の存在は限られた部位であり、含有率が低いために抽出分離に多量の有機溶剤を必要とし、装置も大規模なものが必要であった。
【００３８】
これに対し、本発明方法は、それらの欠点を克服し、任意かつ計画的なグリセロ糖脂質の生産を可能にするものである。細菌はスケールを変えて培養することが可能であり、培養の条件は任意に制御することが可能である。また、培養槽を大きくすることにより大量製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】脂肪酸の構成を示すガスクロマトグラフ質量分析のマスクロマトグラム。
【図２】糖の構成を示すガスクロマトグラフ質量分析のマスクロマトグラム。
【図３】ポジテイブイオン化法による高速原子衝撃質量スペクトル。

Claims

オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭＰ−１８６９８）を培養し、その培養した菌体からグリセロ糖脂質を分離することを特徴とするグリセロ糖脂質の製造方法。
グリセロ糖脂質における脂肪酸残基がペンタデカン酸、ヘキサデカン酸又はヘプタデカン酸の残基である請求項１記載のグリセロ糖脂質の製造方法。
プシコースの存在下で培養する請求項１又は２記載のグリセロ糖脂質の製造方法。
オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株ＡＡ１（ＦＥＲＭＰ−１８６９８）。