JPH0378107B2

JPH0378107B2 -

Info

Publication number: JPH0378107B2
Application number: JP22068883A
Authority: JP
Inventors: Shigeo Inoe; Yoshiharu Kimura
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1983-11-25
Filing date: 1983-11-25
Publication date: 1991-12-12
Also published as: JPS60114188A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はロドコツカス属に属する新規な微生物
に関する。従来、脂肪酸のω−末端のみを選択的に酸化す
ることは工業的には困難とされてきた。例えば、
ラクトン系ムスク（じや香合成香料）の主成分で
あるヘキサデカノライドの製造にはω−ヒドロキ
シパルミチン酸が使用されるが、ムスクが高価で
あるのは、この前駆体たるω−ヒドロキシパルミ
チン酸の製造が困難なことに起因する。即ち、パ
ルミチン酸のω−末端を選択的に酸化してω−ヒ
ドロキシパルミチン酸とすることは、合成化学上
困難である。一方、微生物にノルマルパラフインを資化させ
てジカルボン酸を製造する際に副産物としてω−
ヒドロキシ高級脂肪酸も得られることが報告され
ている（例えば特公昭48−26238号）このように
ω−ヒドロキシ高級脂肪酸はノルマルパラフイン
のアルカン資化性菌によるジカルボン酸への代謝
中間体であるが、その著量生産は困難とされてい
る。その理由としてはω−ヒドロキシ高級脂肪酸
の生成速度に比べて、そのジカルボン酸への転化
速度の方がずつと大きいためと推測される。また、ω−ヒドロキシ脂肪酸と同様にラクトン
系ムスクの主成分である大環状ラクトンの有用な
中間体としてはω−ハロカルボン酸がある。ω−
ハロカルボン酸はハロゲンに官能基を導入するこ
とにより種々の誘導体にも導びくこともできる。
このω−ハロカルボン酸に関しては、アルスロバ
クター属、コリネバクテリウム属、ノカルデイア
属に属し、アルキルハライドからω−ハロカルボ
ン酸を生産する能力を有する菌を培養し、ω−ハ
ロカルボン酸を生産する方法が報告されている
（特開昭57−50893号）。また一方、ジカルボン酸は合成樹脂、高級潤滑
油、可塑剤、香料等の製造原料として有用な物質
であるが、合成法により製造されていたジカルボ
ン酸は炭素数にも限度があり、炭素数12個以上の
ジカルボン酸を製造することは困難であつた。そ
こで近年、微生物を利用した発酵法によるジカル
ボン酸の製造法が注目されてきた。従来、微生物によるジカルボン酸の製造法とし
てはキヤンデイダ（Candida）属（特公昭50−
19630号等）、ピキア（Pichia）属（特公昭45−
24392号等）等の酵母によるものが多く、細菌に
よるものではコリネバクテリウム
（Corynebacterium）属（特公昭56−17075号等）
しか見出されていなかつた。そこで、本発明者らは、斯かる現状に鑑みアル
キル（又はアルケニル）ハライドを対応するω−
ハロカルボン酸又は／及びジカルボン酸に変換す
る能力を有する微生物を広く検索した結果、ロド
コツカス（Rhodococcus）属に属する微生物中
に斯かる能力を有するものがあることを見出し、
本発明を完成した。すなわち、本発明はロドコツカス属に属し、ア
ルキル（又はアルケニル）ハライドを資化してω
−ハロカルボン酸又は／及びジカルボン酸を生産
する能力を有する新規なロドコツカス・エスピ
ー・KSM−Ｂ−18（微工研菌寄第7307号）に関す
るものである。次に、本発明者らが分離、採取した本菌株の菌
学的性質を詳述する。 (a) 形態桿菌で気中菌糸を作る。大きさは0.5〜0.8×
1.0〜3.0μである。 (b) 各培地における生育状態 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地：生育は中程度であり、コロニーの色は柿色
で光沢がある。コロニーの縁は突起状であ
る。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地：生育は中程度であり、コロニーの色は黄〜
レモン色で乾いた凹状である。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地：生育は貧弱であり、コロニーの色は淡柿色
〜レモン色で、乾いたかび状のコロニーであ
る。 (4) スターチ寒天培地：生育は貧弱であり、コロニーの色は淡柿色
で乾いたコロニーである。 (5) チロシン寒天培地：生育は中程度であり、淡柿〜肌色の光沢の
ある凸状のコロニーである。 (6) 栄養寒天培地：生育は豊富であり、柿〜ピンク色の光沢の
ある凸状のコロニーである。 (7) イースト・麦芽寒天培地：生育は最も豊富であり、柿色でしわ状の大
きなコロニーとなり、にぶい光沢がある。 (8) オートミール寒天培地：生育は中程度であり、コロニーは淡柿色で
にぶい光沢がある。コロニーの周縁ははつき
りしない。 (c) 生理学的性質 (1) 生育範囲：温度22〜43℃（最適30〜40℃） PH5.5〜9.5（最適6.5〜8.0） (2) ゼラチンの液化（グルコース・ペプトンゼ
ラチン培地）：陰性 (3) スターチの加水分解（スターチ寒天培
地）：陰性 (4) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：ともに陰性 (5) メラニン様色素の生成：陰性 (d) 炭素源の同化性Ｌ−アラビノース：− Ｄ−キシロース：− Ｄ−グルコース：＋Ｄ−フラクトース：＋シユクロース：＋イノシトール：− Ｌ−ラムノース：− ラフイノース：− Ｄ−マンニトール：＋ (e) 糖からの酸、ガスの生成フラクトース：＋（ガスは生成しない）ソルビトール：＋（ガスは生成しない） (f) 細胞壁組成ジアミノピメリン酸：meso型糖：アラビノース、ガラクトース (g) ５−フルオロウラシル耐性（５mg／）：耐
性なし (h) プロピレングリコール資化性：あり (i) 分離源：土壌以上の菌学的性質を有する菌についてバージエ
イのマニユアル（Bargey's Manual of
Daterminative Bacteriology）第８版（1975年）
に基づいて検索した結果、本菌株はロドコツカス
（Rhodococcus）属に属する新菌株と認め、ロド
コツカス・エスピー・KSM−Ｂ−18
（Rhodococcus sp.KSM−Ｂ−18）と命名した。
なお、本菌株は、微工研菌寄第7307号として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。分離源の土壌からの本菌株の分離はアルキル
（又はアルケニル）ハライド含有培地を用い常法
で行なつた。本菌株の培養に使用する培地の組成は、使用す
る菌株が良好に生育し、アルキル（又はアルケニ
ル）ハライドからのω−ハロカルボン酸又は／及
びジカルボン酸の生産を順調に行なわしめるため
に適当な炭素源、窒素源あるいは有機栄養源、無
機塩などからなる。炭素源としては、炭水化物
（例えば、グルコース、フラクトース、シユクロ
ース、ソルビトール等）、有機酸（例えば、クエ
ン酸、コハク酸等）、炭化水素（例えば、ｎ−ド
デカン、ｎ−ヘキサデカン等）、アルキル（又は
アルケニル）ハライドなど資化されるものならば
いずれでも使用できる。また、窒素源あるいは有
機栄養源としては、例えば、硝酸ナトリウム、硝
酸カリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩類、酵
母エキス、肉エキス、ペプトンが挙げられる。ま
た、無機塩としては各種リン酸塩、硫酸マグネシ
ウムなどが使用できる。さらに微量の重金属塩類
が使用されるが、天然物を含む培地では必ずしも
添加を必要としない。また栄養要求を必要とする
変異株を用いる場合には、その栄養要求を満たす
物質を培地に添加しなければならない。培養は培地を加熱等により殺菌後、菌を接種
し、28〜35℃で３〜５日振盪又は通気撹拌すれば
良い。PHは6.5〜８程度に調整すると良い結果が
得られる。水に難溶性の炭素源等を使用する場合
には、ポリオキシエチレンソルビタン等の各種界
面活性剤を培地に添加することも可能である。叙上の如く得られた培養物は、そのまま酵素源
として用いることもできるが、菌体を培養液より
分離する場合は、通常の固液分離手段が用いられ
る。このように分離された生菌体及びその処理物
（凍結乾燥菌体等）も酵素源として用いることが
できる。アルキル（又はアルケニル）ハライドを反応基
質として本菌株を上記の如く培養するとω−ハロ
カルボン酸及びジカルボン酸が生産される。該基
質は炭素数12〜18のものが特に適当である。これらの培養液から目的物質であるω−ハロカ
ルボン酸及びジカルボン酸の採取および精製は、
一般の有機化合物の採取および精製の手段に準じ
て行うことができる。たとえば培養液から菌体等
を除去したろ液もしくは培養液そのものを酸性と
し、エチルエーテル、酢酸エチル又はクロロホル
ム−メタノール混液等の有機溶媒で抽出する。こ
の抽出物をカラムクロマトグラフイーあるいは再
結晶などの方法を用いてω−ハロカルボン酸及び
ジカルボン酸を単離することができる。以下、実施例により本発明を更に詳しく説明す
る。実施例１採取した土壌サンプル約0.5ｇを滅菌水10mlに
懸濁した充分撹拌後、この土壌懸濁液0.2mlを下
記組成の液体培地（）10ml（50ml容試験管に
て）に接種し、30℃にて４日間振盪培養を行な
う。

【表】

【表】上記培養により増殖を示した培養液は、滅菌水
により適度に希釈した後、肉汁寒天培地（栄研化
学製；普通寒天培地）に移し、30℃にて２日間培
養し、生じた複数のコロニーが相互間に相異しな
いことを肉眼的及び顕微鏡的に確認できるまで、
肉汁寒天培地への移植を繰り返す。上記コロニーのうち10個のコロニーをそれぞれ
下記組成の斜面寒天培地（）に接種し、30℃で
３日間培養し、10本の斜面培地上の菌株が肉眼的
及び顕微鏡的に同一菌株であることを確認し、ま
た、これら10菌株の各培地上の性状及び生理学的
性質が同一であることを確認した。

【表】上記菌株の培地上の性状及び生理学的性質は前
述した通りである。上記試験の結果、各10本の培
養菌はすべて自然界より純粋に分離された単一菌
株であることが判る。次いで、上記で純粋培養された斜面培地上の菌
株から一白金耳を、滅菌した10％グリセリン水溶
液（２ml）の入つた凍結保存用バイアルに懸濁
し、−80℃にて凍結保存する。かくして３ケ月凍
結保存後、迅速に解凍し得られる懸濁液の一白金
耳を肉汁寒天培地に蘇生後、前期と同条件下に各
培地上での性状及び生理学的性質を調べた結果、
凍結前とは変化が認められなかつた。また。上記凍結及び解凍を１ケ月毎に５度繰り
返した菌株について同様に、各培地上での性状及
び生理学的性質を調べた結果、変化は認められな
かつた。次いで、本菌株を利用してω−ハロカルボン酸
又は／及びジカルボン酸を製造した例を参考例と
して挙げる。参考例１セチルクロライド50ｇ、リン酸二アンモニウム
10ｇ、リン酸一カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム
（７水塩）0.2ｇ、硫酸第一鉄（７水塩）0.02ｇ、
硫酸亜鉛（７水塩）0.016ｇ、硫酸マンガン（４
〜６水塩）0.016ｇ、酵母エキス２ｇを水道水に
溶かして１にし、PHを7.0に調製した。この液
体培地５mlを50ml容振盪試験官に仕込み、120℃
で15分間蒸気滅菌した後、ロドコツカス・エスピ
ー・KSM−Ｂ−18（Rhodococcus sp.KSM−Ｂ
−18）を一白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養
した。培養終了後、この培養液に9N硫酸１mlを加え
PHを強酸性として、クロロホルム−メタノール
（２：１）混液20mlで抽出した。この抽出液を減
圧下濃縮した後メタノールBF₃触媒でメチル化
し、ガスクロマトグラフイーにて生成物のω−ク
ロロパルミチン酸とα、ω−テトラデカンジカル
ボン酸の定量を行なつた。その結果を第１表に示
す。なお生成物のそれぞれのガス−マス（GC−
MS）データは各標品のそれと一致し、ω−クロ
ロパルミチン酸及びα、ω−テトラデカンジカル
ボン酸であることが確認された。

【表】参考例２セチルクロライド50ｇ、リン酸二アンモニウム
10ｇ、リン酸一カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム
（７水塩）0.2ｇ、ポリペプトン１ｇ、酵母エキス
0.5ｇを水道水１に溶かし、PHを7.0に調製し
た。この液体培地100mlを500ml容振盪フラスコに
仕込み、120℃で15分間蒸気滅菌した後、ロドコ
ツカス・エスピー・KSM−Ｂ−18（Rhodococcus
sp.KSM−Ｂ−18）を一白金耳接種し、30℃で48
時間振盪培養した。培養終了後、この培養液に9N硫酸10mlを加え
PHを強酸性として、クロロホルム−メタノール
（２：１）混液200mlで抽出した。この抽出液を源
圧下濃縮した後メタノール−BF₃触媒でメチル化
し、ガスクロマトグラフイーにて生成物のω−ク
ロロパルミチン酸とα、ω−テトラデカンジカル
ボン酸の定量を行なつた。その結果を第２表に示
す。なお生成物のそれぞれのガス−マス（GC−
MS）データは各標品のそれと一致し、ω−クロ
ロパルミチン酸及びα、ω−テトラデカンジカル
ボン酸であることが確認された。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１以下の性質を有する微工研菌寄第7307号とし
て寄託された新規なロドコツカス・エスピー・
KSM−Ｂ−18株。 (a) 形態桿菌で気中菌糸を作る。大きさは0.5〜0.8×
1.0〜3.0μである。 (b) 各培地における生育状態 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地：生育は中程度であり、コロニーの色は柿色
で光沢がある。コロニーの縁は突起状であ
る。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地：生育は中程度であり、コロニーの色は黄〜
レモン色で乾いた凹状である。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地：生育は貧弱であり、コロニーの色は淡柿色
〜レモン色で、乾いたかび状のコロニーであ
る。 (4) スターチ寒天培地：生育は貧弱であり、コロニーの色は淡柿色
で乾いたコロニーである。 (5) チロシン寒天培地：生育は中程度であり、淡柿〜肌色の光沢の
ある凸状のコロニーである。 (6) 栄養寒天培地：生育は豊富であり、柿〜ピンク色の光沢の
ある凸状のコロニーである。 (7) イースト・麦芽寒天培地：生育は最も豊富であり、柿色でしわ状の大
きなコロニーとなり、にぶい光沢がある。 (8) オートミール寒天培地：生育は中程度であり、コロニーは淡柿色で
にぶい光沢がある。コロニーの周縁ははつき
りしない。 (c) 生理学的性質 (1) 生育範囲：温度22〜43℃（最適30〜40℃） PH5.5〜9.5（最適6.5〜8.0） (2) ゼラチンの液化（グルコース・ペプトンゼ
ラチン培地）：陰性 (3) スターチの加水分解（スターチ寒天培
地）：陰性 (4) 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：ともに陰性 (5) メラニン様色素の生成：陰性 (d) 炭素源の同化性Ｌ−アラビノース：− Ｄキシロース：− Ｄ−グルコース：＋Ｄ−フラクトース：＋シユクロース：＋イノシトール：− Ｌ−ラムノース：− ラフイノース：− Ｄ−マンニトール：＋ (e) 糖からの酸、ガスの生成フラクトース：＋（ガスは生成しない）ソルビトール：＋（ガスは生成しない） (f) 細胞壁組成ジアミノピメリン酸：meso型糖：アラビノース、ガラクトース (g) ５−フルオロウラシル耐性（５mg／）：耐
性なし (h) プロピレングリコール資化性：あり。