WO1993024643A1

WO1993024643A1 - Farnesyltransferase inhibitors oh-4652 and production thereof

Info

Publication number: WO1993024643A1
Application number: PCT/JP1993/000681
Authority: WO
Inventors: Satoshi Omura; Hideo Takeshima; Junji Inokoshi; Didier Van Der Pyl
Original assignee: The Kitasato Institute
Priority date: 1992-05-27
Filing date: 1993-05-24
Publication date: 1993-12-09
Also published as: JPH05331181A

Abstract

Low-molecular-weight farnesyltransferase inhibitors, OH-4652A, OH-4652B, OH-4652C, OH-4652D, OH-4652E and/or OH-4652F (collectively referred to as OH-4652 substances), and a process for producing OH-4652 by culturing an OH-4652-producing bacterium belonging to the genus Streptomyces in a medium and collecting the OH-4652 substances from the product of culture. They have a potent enzyme-inhibiting activity and are lowly toxic, so that they are useful as a carcinostatic substance for inhibiting the progress of canceration caused by r^_a^_s^_ genes.

Description

明細書フアルネシルトランスフェラーゼ阻害物質 O H— 4 6 5 2物質およびその製造法技術分野 Description FARNESYLTRANSFERASE INHIBITOR O H—465 2 SUBSTANCE AND PRODUCTION METHOD

本発明は、ヒト及びマウス由来のフアルネシルトランスフヱラーゼの活性を阻害する新規フアルネシルトランスフヱラーゼ阻害物質 O H— 4 6 5 2 A物質、 O H - 4 6 5 2 B物質、 O H— 4 6 5 2 C物質、 O H— 4 6 5 2 D物質、 O H— 4 6 5 2 E物質またはおよび O H— 4 6 5 2 F物質（以下、総称して O H— 4 6 5 2物質という）およびその製造法に関する。従来の技術 The present invention relates to a novel huanesyltransferase inhibitor OH—4652A substance, OH-4652B substance, OH— 4 652 C substance, OH— 4652 D substance, OH— 4652 E substance or and OH— 4652 F substance (hereinafter collectively referred to as OH— 4652 substance) and It relates to the manufacturing method. Conventional technology

これまでに数多くの抗瘙剤が開発されてきているが、その殆どはまだ完全な治療薬とは言えないのが現状である。また、癸癌の機構についても充分な解析はなされていないが、いわゆる癌遺伝子と称される遺伝子について、その癌化への関連性が明らかにされている例がある。例えば r a s 伝子と呼ばれているものがそれで、この遺伝子は酵母からヒトに至るあらゆる真核生物の染色体に保存されていることが数多くの研究例から証明されている。 Although a number of anti-inflammatory drugs have been developed so far, most of them are not yet complete therapeutics. In addition, although the mechanism of kishi cancer has not been fully analyzed, there are cases in which the so-called oncogenes have been clarified in relation to oncogenesis. Numerous studies have shown that the gene, for example, is called the ras gene, and is conserved in the chromosomes of all eukaryotes, from yeast to humans.

この遺伝子と癌化との関連は、以下のように説明されている。 r a s遺伝子の産物である分子量 2 1 0 0 0のタンパク質（r a s p 2 1 ) は、そのカルボキシル末端から 4番目のァミノ酸残基であるシスティン残基がフアルネシルトランスフヱラ一ゼによつて脂質の一種であるフアルネシル基が付加することによって活性化され、更にプロセシングされて癌化を引き起こすとされている。そこで、この r a s p 2 1の活性化への第一段階であるフアルネシル基の付加を阻止することができれば少なくとも r a s遺伝子産物であるタンパク質の活性化が抑えられ、その結果、発癌は抑制できることが期待される。発明が解決しょうとする課題 The relationship between this gene and cancer is explained as follows. The ras gene product, a protein with a molecular weight of 21000 (rasp21), has a cysteine residue, the fourth amino acid residue from the carboxyl terminus, of the protein, which is converted to phenylsyltransferase. Therefore, it is said that it is activated by the addition of a pharmacoside group, a kind of lipid, and is further processed to cause cancer. So, in this first step to the activation of rasp 21 If the addition of a certain huanesyl group can be prevented, it is expected that at least the activation of the protein, which is the ras gene product, will be suppressed, and as a result, carcinogenesis can be suppressed. Problems to be solved by the invention

上記と同様の作用をする物質としては合成べプチドの例が知られている。〔ジャーナル 'ォブ 'バイオロジカルケミストリー、第 2 2 6巻、第 1 5 5 7 5頁（ 1 9 9 1 ) 〕。しかしながら、これらいずれのぺプチドも細胞内で直ちに加水分解され、安定な活性を発現するに至らないのが現状である。かかる実情において、本発明は、ヒトの医学上または社会問題の解決策としてきわめて重要であることに鑑みて研究開発されたものである。従って、本発明はより安定でかつ毒性が低く、しかも該酵素阻害活性の強い物質を提供することを目的とするものである。課題を解決するた'めの手段 As a substance having the same action as described above, an example of a synthetic peptide is known. [Journal 'OB' Biological Chemistry, Vol. 226, Vol. 1, pp. 575 (1991)]. However, at present, all of these peptides are immediately hydrolyzed in cells and do not exhibit stable activity. Under such circumstances, the present invention has been researched and developed in view of its extremely importance as a solution to human medical or social problems. Accordingly, an object of the present invention is to provide a substance which is more stable, has lower toxicity, and has a strong enzyme inhibitory activity. Means to solve the problem

そこで、本発明者らは上記のごとき課題を解決すべく、新規なフアルネシルトランスフ Xラーゼ阻害物質の探索を目的として種々の土壌から菌株を分離し、その生産物について研究を続けた結果、栃木県那須町の牧場の土壌から分離した放線菌 O H— 4 6 5 2菌株の培養中にフアルネシルトランスフェラ一ゼ活性を阻害する物質が産生されることを見出した。 In order to solve the above problems, the present inventors isolated strains from various soils for the purpose of searching for novel pharmacophorase inhibitors, and continued their research on the products. During the culture of the actinomycetes OH-4652 strain isolated from the soil of a ranch in Nasu-machi, Iwate Prefecture, we found that a substance that inhibits the activity of pharmacophorase was produced.

次いで、該培養物からフアルネシルトランスフェラ一ゼ阻害活性物質を分離、精製した結果、後記の理化学的性質を有する物質は従来全く知られていないことから、本物質を O H— 4 6 5 2 A物質、 O H— 4 6 5 2 B物質、 O H— 4 6 5 2 C物質、 O H— 4 6 5 2 D物質、 O H— 4 6 5 2 E物質および O H— 4 6 5 2 F物質と称することにした。本発明はかかる知見に基いて完成されたものである。本発明は、 0H— 4 6 5 2 A物質、 OH— 4 6 5 2 B物質、 OH— 4 6 5 2 C物質、 OH— 4 6 5 2 D物質、 OH— 4 6 5 2 E物質および OH -Next, as a result of separating and purifying the substance inhibiting pharmacotransferase activity from the culture, no substance having the following physicochemical properties has been known so far. Substance A, OH—4652B substance, OH—4652C substance, OH—4652D substance, OH—4652E substance and OH—4652F substance I decided to call it. The present invention has been completed based on such findings. The present invention relates to 0H—4652A substance, OH—4652B substance, OH—4652C substance, OH—4652D substance, OH—4652E substance and OH -

4 6 52 F物質からなる群より選ばれた OH— 4 6 5 2物質を提供するものである。 It provides an OH—4652 substance selected from the group consisting of 4652F substances.

更に、本発明は、ストレブトマイセス属に属し、 OH— 4 6 52 A物質、 OH- 4 6 5 2 B物質、 OH - 4 6 5 2 C物質、 OH— 4 6 5 2 D物質、 OH- 4 6 52 E物質および/または OH— 4 6 5 2 F物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養して培養物に OH— 4 6 52 A物質、 OH Furthermore, the present invention belongs to the genus Streptomyces, and includes OH—4652A substance, OH-4652B substance, OH-4652C substance, OH—4652D substance, -4 652 E substance and / or OH— 4 652 F substance can be produced in a culture medium, and OH— 4652 A substance, OH

- 4 6 5 2 B物質、 OH— 4 6 52 C物質、 OH— 4 6 5 2 D物質、 OH-4 652 B substance, OH— 4652 C, OH— 4652 D substance, OH

- 4 6 5 2 E物質およびまたは OH— 4 6 5 2 F物質を蓄積せしめ、該培養物から OH— 4 6 52 A物質、 OH— 4 6 52 B物質、 OH— 4 6 5 2 C物質、 OH— 4 6 52 D物質、 OH— 4 652 E物質およびまたは OH- 4 6 52 F物質を採取することを特徴とする OH— 4 6 52 A物質、 OH- 4 6 52 B物質、 OH - 4 6 5 2 C物質、 OH - 4 6 5 2 D物質、 OH- 4 6 5 2 E物資および Zまたは OH— 4 6 5 2 F物質の製造法を提供するものである。 -Accumulate 4652 E substance and / or OH-4652F substance, and from the culture, OH-4652A substance, OH-4652B substance, OH-4652C substance, OH—4652D substance, OH—4652E substance and / or OH-4652F substance are collected. OH—4652A substance, OH-4652B substance, OH-4 It provides a method for producing 652C substances, OH-4652D substances, OH-4652E substances and Z or OH-4652F substances.

本発明の OH— 4 6 52 A物質、 OH— 4 6 5 2 B物質、 OH— 4 6 5 2 C物質、 OH— 4 6 5 2 D物質、 OH— 4 652 E物質およびノまたは OH- 4 6 5 2 F物質を生産する能力を有する微生物（以下、 OH— 4 6 OH—4652A substance, OH—4652B substance, OH—4652C substance, OH—4652D substance, OH—4652E substance and OH—OH-4 substance of the present invention 6 5 2 Microorganisms capable of producing F substances (hereinafter referred to as OH-

52物質生産菌と称する）は、ストレブトマイセス属に属するが、例えば本発明者らが分離したストレブトマイセス属に属する OH— 4 6 52菌株は、本発明の最も有効に使用される菌株の一例であって、本菌株の菌学的性状を示すと次の通りである。 The OH-4652 strain belonging to the genus Streptomyces isolated by the present inventors is used most effectively in the present invention. This is an example of the strain, and the bacteriological properties of the strain are as follows.

本発明の OH— 4 6 5 2 A物質、 OH— 4 6 52 B物質、 OH— 4 6 5 2 C物質、 OH— 4 6 5 2 D物質、 OH— 4 65 2 E物質または Zおよび OH- 4 6 52 F物質（以下、総称して OH— 4 6 52物質という）を生産するために使用される菌株としては、例えば本発明者らによって栃木県那須町の牧場の土壌から分離されたストレブトマイセスエスピー（S t r ep t omyc e s s p. ) OH- 4652株が挙げられる。 OH—4652A substance, OH—4652B substance, OH—4652C substance, OH—4652D substance, OH—4652E substance or Z and OH— of the present invention. 4 652 F substance (hereinafter collectively referred to as OH— 4652 substance) Examples of the strain used for production include, for example, Streptomyces sp. OH-4652 strain isolated from the soil of a ranch in Nasu town, Tochigi prefecture by the present inventors. Can be

( I )形態的性質 (I) Morphological properties

栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察されない。気菌糸は酵母エキス ·麦芽エキス寒天、スターチ ·無機塩寒天等で豊富に着生し、白色からグレイ系の色調を呈する。顕微鏡下の観察では、気菌糸はらせん状を呈し、 20ケ以上の胞子の連鎖が認められる。胞子の大きさは 1. 1 X 0. 6 zmである。胞子の表面は平滑である。菌核、胞子のうおよび遊走子は見出されない。 The vegetative hypha develops well on various agar media and no fragmentation is observed. Aerial mycelia grow abundantly on yeast extract, malt extract agar, starch, inorganic salt agar, etc., and have a white to gray color. Microscopic observation shows that the aerial hyphae is spiral and has a linkage of more than 20 spores. The size of the spores is 1.1 x 0.6 zm. The spore surface is smooth. Sclerotia, sporangia and zoospores are not found.

(I)各種培地上での性状 (I) Properties on various media

ィー · ビ— . シヤーリング〔E. B. Sh i r 1 i n g) とデ一 ·ゴットリーブ（D. Go t t l i eb) の方法（ィン夕ーナショナル ·ジャーナル ·ォブ · システィマティック ·パクテリォロジ一、第 16巻、第 31 3頁、 1 966年）によって調べた本生産菌の培養性状を第 1表、第 2表および第 3表に示す。色調は標準色として、カラー 'ハーモニー ·マニュアル第 4版（コンテナー · コーポレーション ·ォブ 'アメリカ ' シカゴ、 1 958年）を用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコードを併せて記した。以下は特記しない限り、 27 、 2週間目の各培地における観察結果である。第 1表 The Method of EB Shir 1ing and D. Gottli eb , P. 313, 1966), the culture characteristics of the produced microorganism are shown in Tables 1, 2 and 3. The color tone is determined by using the color 'Harmony Manual 4th Edition (Container Corporation of America' Chicago ', Chicago, 1958) as the standard color, and the code in parentheses is added together with the color chart name. did. The following are the observation results for each medium at 27 and 2 weeks, unless otherwise noted. Table 1

± it- 杳 R 由 ~ ¾ 1i£tΙ¾5 »—>~·ϋ杳 > ァ > ラノく、八スフクーチノっ ± it- R R R ~ i 1i £ tΙ¾5 »—> ~ · ϋ ϋ> ラ> ノ

ン卜（ 1 3 b a ) (1 3 b a)

グリセロール . リン裏面ァラベスターティント Glycerol phosphorus back side

ゴ酸カルシウム寒天 (1 3 b a) Calcium formate agar (1 3 ba)

菌糸貧弱に着生、ホワイト（a) 可溶性色素產生しない Hyphal poorly formed, white (a) soluble pigment

生育良好に生育、バンブー（2 g c) グルコース ·ぺプト裏面ライトホイート（2 e a) ン寒天気菌糸豊富に着生、アラバスターティント Growth Good growth, bamboo (2 g c) Glucose Peptide Backside light wheat (2 ea) agar aerial hyphae Abundant growth, Alabaster tint

( 1 3 b a) (1 3 ba)

可溶性色素産生しない生育貧弱に生育、ライトマスタードペプトン ·酵母ヱキタン（2 i e) Does not produce soluble pigments Growth Poorly grown, light mustard peptone · yeast petan (2 ie)

ス鉄寒天裏面ライトマスタ一ドタン（2 i e)Light iron agar back side light master tongue (2 i e)

( I SP) 気菌糸着生しない (I SP) No aerial mycelium

可溶性色素産生しない Soluble pigment does not produce

生育中程度に生育、アイボリーグルコース ·硝酸塩 (2 db) Growth Medium growth, ivory glucose / nitrate (2 db)

寒天裏面アイボリー（2 db) Agar back side ivory (2 db)

貧弱に着生、アイボリー（2 db) 可溶性色素産生しない第 2表生育良好に生育、カメル（3 i e) 酵母エキス ·麦芽ェ裏面ライトアンバー（ 3 i c) キス寒天気菌糸豊富に着生、力べ一トグレイ〜Poorly established, ivory (2 db) soluble pigment not produced Table 2 Growth Good growth, camel (3 ie) yeast extract, malt, back side light amber (3 ic) kiss agar aerial mycelium Abundant growth, power gray

( I SP) パール（2 f e〜3 b a) (I SP) Pearl (2 f e to 3 ba)

-i ft- } ) - 口 J溶往索産生しなレゝ生育貧弱に生育、ライトアイボリー -i ft-})-Mouth J

(2 c a) (2 c a)

栄養寒天裏面バンプ一（2 g c) Nutrition agar Back side One bump (2 g c)

気菌糸わずかに着生、ホワイト（a) Aerial mycelium slightly settled, white (a)

Oj溶往産生しなレヽ生育良好に生育、パール（2 b a) チロシン寒天裏面ダークブラウン（2pn)Oj dissolution Non-producing resin Growth Good growth, pearl (2ba) Tyrosine agar Back side Dark brown (2pn)

( I SP) 気菌糸豊富に着生、アラバスターティン卜（1 3ba)(ISP) Aerial mycelium abundant, alabaster tint (13ba)

7ノヽ一ノノヮノ n丄 ) 生育貧弱に生育、ライトアイボリ一 7 ヽノヮ生生生生

(2 c a) (2 c a)

ォートミ—ル寒天裏面バンブー（2 g c) Oatmeal Agar Back Side Bamboo (2 g c)

( I SP) 気菌糸貧弱に着生、パール（2 b a) 可溶性色素産生しない第 3表 t 月 JXΪJΡί *>-_Ε.杳 > オ Λ リ J一" 7、、ゲしィ 1 (ISP) Aerial mycelium Poorly established, pearl (2 ba) No soluble pigment produced Table 3 Month JXΪJΡί *> -_ Ε.

( 1 V₂ i g) . (1 V ₂ ig).

グリセロール .ァス裏面ライトォリーブグレイ（ /₂ li) パラギン寒天気菌糸豊富に着生、アラバスターティントGlycerol.as reverse light olive gray (/ ₂ li) Paragine agar aerial hyphae abundant, alabaster tint

(I SP) (1 3 b a) (I SP) (1 3 b a)

可溶性色素産生しない生育良好に生育、無色 Does not produce soluble pigments Growth Good growth, colorless

スターチ■無機塩裏面ライトホイート（2 e a) 寒天気菌糸豊富に着生、シルバーグレイ〜ホヮStarch Inorganic Salt Back Light Wheat (2 e a) Agar Aerial mycelium Abundantly set, silver gray to white

( I SP) イト（2 ί e a) (ISP) site (2 ί e a)

^HJ ί合は糸ま 4：しなし、 ^H J If the thread 4

生育貧弱に生育、アイボリー（2 db) シユークロース ·硝裏面アイボリ— （2 d b) Growth Poorly grown, ivory (2 db) sucrose / glass back ivory (2 db)

酸塩寒天気菌糸着生しない Salt agar Aerial mycelium Does not form

可溶性色素産生しない生育良好（一 Φ杳、ダークカバ一ト Does not produce soluble pigments Good growth (1 Φ 杳, dark hippo

グレイ（2 i h) Gray (2 i h)

グルコース ·ァスパ裏 Si 力バートグレイ（21 i) ラギン寒天豊富に着生、アラバスターティGlucose a spa Back Si power bart gray (21i) Lagin agar Abundantly grown, Alabaster

( I SP) ント（ 13 b a ) (ISP) contact (13 b a)

可溶生色素産生しない (Π) 生理学的性質 Soluble viable dye does not produce (Π) Physiological properties

(1) メラニン色素の生成 (1) Melanin pigment formation

(ィ）チロシン寒天陽性 (B) Tyrosine agar positive

(口）ペプトン ·イースト鉄寒天陰性(Mouth) Peptone yeast iron agar negative

(ハ）グルコース ·ペプトン .ゼラチン培地陰性 (C) Glucose, peptone, gelatin medium negative

( 21 ~ 23 ^eC) (21 to 23 ^e C)

(二）トリプトン ·ィ一スト液陰性 (Ii) Negative trypton-test liquid

(2) チロシナ一ゼ反応陽性 (2) Tyrosinase reaction positive

( 3 ) 硫化水素の生産陰性 (3) Production of hydrogen sulfide negative

(4) 硝酸塩の還元陰性 (4) Nitrate reduction negative

(5) ゼラチンの液化（21〜23。C) 陰性 (5) Liquefaction of gelatin (21-23.C) Negative

(グルコース 'ペプトン 'ゼラチン培地） (Glucose 'peptone' gelatin medium)

(6) スターチの加水分解陽性 (6) Starch hydrolysis positive

(7) 脱脂乳の凝固（37°C) 擬陽性 (7) Coagulation of skim milk (37 ° C) False positive

( 8 ) 脱脂乳のぺプトン化（ 37 °C) 陰性 (8) Negative of skim milk (37 ° C)

( 9 ) 生育温度範囲 1 0〜 37 °C (9) Growth temperature range 10-37 ° C

(1 0) 炭素源の利用性 (10) Utilization of carbon source

(プリ一ダム ·ゴトリーブ寒天培地） (Puri Dam Gottlieb agar)

利用する；グルコース、ァラビノース、キシロース、ラフイノース、マンニトール、ラムノース Use; glucose, arabinose, xylose, raffinose, mannitol, rhamnose

やや利用する；メリビオース、フラクトース、シュ一クロース利用しない；イノシトール Slightly used; Melibiose, fructose, sucrose Not used; Inositol

(1 1) セルロースの分解陰性 (1 1) Cellulose degradation negative

(IV) 細胞壁組成 (IV) Cell wall composition

細胞壁のジァミノピメリン酸は L L型である。 Diaminopimelic acid in the cell wall is LL type.

以上、本菌の菌学的性状を要約すると次の通りである。細胞壁中のジァミノピメリン酸は LL型である。気菌糸の形態はラセン状で、長い胞子鎖を形成する。胞子の表面は平滑である。培養状の諸性質としては、栄養菌糸はアイボリ一系の色調を呈し、気菌糸はグレイあるいは白色系の色調を呈する。可溶性色素はチロシン寒天で、メラニン色素を生産する。 The bacteriological properties of this bacterium are summarized below. Jia in the cell wall Minopimelic acid is of the LL type. Aerial hyphae are helical and form long spore chains. The spore surface is smooth. The vegetative mycelium has an ivory-type color tone, and the aerial mycelium has a gray or white color tone. The soluble pigment is tyrosine agar, which produces melanin pigment.

これらの結果から、本菌株はストレブトマイセス属に属する菌種であり、プリドハムとトレスナーの分類（バージズ ·マニュアル ·ォブ ·デターミネーティブ ·バクテリォロジ一、第八版、第 74 8〜 82 9頁、 1 9 74 年）によるグレイあるいはホワイトシリーズに属する菌種であると考えられる。なお、本菌株は、ストレブトマイセスエスピー OH— 4 6 5 2 ( S t r e p t omy c e s s p. OH— 4 6 52として工業技術院微生物生命工学技術研究所に寄託されている。受託番号は（FERM BP— 4 3 0 9 ) であり、寄託日は平成 4年 2月 3日である。 Based on these results, this strain is a strain belonging to the genus Streptomyces, and the classification of Pridham and Tresner (Birges Manual, Deterministic Bacteriology, Eighth Edition, pp. 748-829) (P. 1974). This strain has been deposited with the National Institute of Bioscience and Biotechnology at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the name of Streptomyces sp. OH—4652 (Streptomyces p. OH—4652). (FERM BP-4309) and the date of deposit is February 3, 1992.

以上、 0H— 4 6 52物質生産菌について説明したが、放線菌の一般的性状として菌学上の性状はきわめて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射または X線照射または変異誘導剤などを用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工的変異株は勿論、自然変異株も含め、ストレブトマイセス属に属し、 0H— 4 6 52物質を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。又、細胞融合、遺伝子操作などの細胞工学的に変異させた菌株も物質 0H— 4 6 5 2物質生産菌として包含される。本発明においては、先ずストレブトマイセス属に属する 0H— 4 6 52 物質を生産する能力を有する生産菌が培地に培養される。培地としては、通常の放線菌の培養に適する炭素源、資化し得る窒素源および無機物、さらに必要に応じてその他の栄養物をほどよく含有する合成培地または天然培地を使用することができる。培地に使用される炭素源および窒素源としては、使用菌株の利用可能なものならばいずれの種類でもよい。すなわち、炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、マルト一ス、マンニット、キシロース、ガラクト一ス、リボース、澱粉またはその加水分解物等の種々の炭水化物が使用できる。その濃度は通常、培地に対して 0 . 1〜5 %が好ましい。またグルコン酸、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の各種有機酸、グリシン、グルタミン酸、ァラニン酸等の各種ァミノ酸、さらにはメタノール、エタノール等のアルコール類ゃノルマルパラフィン等の各種の非芳香属系炭化水素、あるいは植物もしくは動物性の各種油脂等も使用可能である。 Although the 0H—4652 substance-producing bacterium has been described above, the mycological properties of actinomycetes are extremely variable and uncertain as a general property. It is a well-known fact that mutations are made by means of artificial irradiation using radiation or a mutagenic agent. Such artificial mutants, as well as natural mutants, belong to the genus Streptomyces, and Any strain capable of producing 4652 substances can be used in the present invention. In addition, strains mutated by cell engineering such as cell fusion and genetic manipulation are also included as substance 0H-4652 substance producing bacteria. In the present invention, first, a production bacterium having an ability to produce a 0H-4652 substance belonging to the genus Streptomyces is cultured in a medium. As a medium, a synthetic medium or a natural medium containing a carbon source suitable for cultivation of normal actinomycetes, a nitrogen source and an inorganic substance capable of assimilation, and if necessary, other nutrients can be used. . As the carbon source and the nitrogen source used in the medium, any type can be used as long as the strain to be used can be used. That is, as the carbon source, various carbohydrates such as glucose, glycerol, fructose, maltose, mannite, xylose, galactose, ribose, starch or a hydrolyzate thereof can be used. Usually, the concentration is preferably 0.1 to 5% based on the medium. Various organic acids such as gluconic acid, pyruvic acid, lactic acid and acetic acid; various amino acids such as glycine, glutamic acid and alanic acid; and alcohols such as methanol and ethanol; and various non-aromatic carbons such as normal paraffin. Hydrogen or various plant or animal fats and oils can also be used.

窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニゥ厶、燐酸アンモニゥム、硝酸アンモニゥム等の各種の無機酸あるいは有機酸のアンモニゥム塩類、尿素、ペプトン、 N Z—ァミン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールあるいはその消化物、大豆粉あるいはその消化物、脱脂大豆あるいはその消化物、加水分解物などの含窒素有機物、さらにはグリシン、グルタミン酸、ァラニン等の各種ァミノ酸が使用可能である。 Examples of the nitrogen source include ammonia, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium nitrate and other inorganic or organic acid ammonium salts, urea, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, dried yeast, corn Nitric organic substances such as chip liquor, casein hydrolyzate, fishmeal or its digest, soy flour or its digest, defatted soy or its digest, hydrolyzate, and various types of glycine, glutamic acid, and alanine Amino acids can be used.

無機物としては、例えば各種リン酸塩、硫酸マグネシウム、食塩、さらに微量の重金属塩が使用される。また、栄養要求性を示す変異株を用いる場合には、当然その栄養要求を満足させる物質を培地に加えなければならないが、この種の栄養素は、天然物を含む培地を使用する場合にはとくに必要としない場合がある。 As the inorganic substance, for example, various phosphates, magnesium sulfate, salt, and a trace amount of a heavy metal salt are used. In addition, when a mutant strain that exhibits auxotrophy is used, a substance that satisfies the auxotrophy must be added to the medium, but this kind of nutrient must be added when a medium containing natural products is used. It may not be necessary.

培養は、通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条件下で行うのがよい。工業的には深部通気攪拌培養が好ましい。培養の p Hはたとえば 5 . 0〜8 . 0であるが、中性付近で培養を行うのが好ましい。培養温度は例えば 2 0〜4 0 °Cで行い得るが、通常はたとえば 2 6〜3 2 °C (好ましくは 2 7 °C付近）とする。培養時間は、液体の場合、通常 3〜6日間培養を行い、培養物中の O H— 4 6 5 2物質蓄積量が最大に達したときに培養を終了すればよい。 The cultivation is usually carried out under aerobic conditions such as shaking or aeration-agitation culture. Industrially, deep aeration stirring culture is preferred. The pH of the culture is, for example, 5.0 to 8.0, but it is preferable to perform the culture near neutrality. The cultivation temperature can be, for example, 20 to 40 ° C., but is usually, for example, 26 to 32 ° C. (preferably around 27 ° C.). In the case of liquid, culture is usually performed for 3 to 6 days, and when the amount of accumulated OH-4652 substance in the culture reaches the maximum, culture is performed. It should just end.

これらの培地組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節、選択されることはいうまでもない。液体培養において、発泡があるときは、シリコン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用できる。 Cultivation conditions such as the composition of the medium, the liquid properties of the medium, the culture temperature, the agitation speed, and the aeration rate are appropriately adjusted and selected according to the type of the strain used and the external conditions, etc., so as to obtain preferable results. Needless to say. If foaming occurs in the liquid culture, an antifoaming agent such as silicone oil, vegetable oil, or a surfactant can be used as appropriate.

このようにして得られた培養物に蓄積される O H— 4 6 5 2物質は、通常は培養濾液中に生成される。培養濾液から O H - 4 6 5 2物質を採取するには、通常微生物の培養物から代謝物を採取するのに用いられる手段を単独あるいは任意の順序に組み合わせて、または反復して用いられる。すなわち、例えば、濾過、遠心分離、透析、濃縮、乾燥、凍結、吸着、脱着、各種溶媒に対する溶解度の差を利用する方法（例えば、沈澱、結晶化、再結晶、転溶、向流分配等）、クロマトグラフィー等の手段が用いられる。本発明の O H— 4 6 5 2物質は菌体内および培養濾液の双方に生成蓄積されるので、本物質を分離採取するには、菌体を含む全培養液から採取すればよい。 The OH—4652 substance accumulated in the culture thus obtained is usually produced in the culture filtrate. In order to collect the OH-4652 substance from the culture filtrate, the means normally used for collecting metabolites from a culture of a microorganism can be used alone, in any combination, or repeatedly. That is, for example, filtration, centrifugation, dialysis, concentration, drying, freezing, adsorption, desorption, and a method utilizing the difference in solubility in various solvents (eg, precipitation, crystallization, recrystallization, phase transfer, countercurrent distribution, etc.) Means such as chromatography and chromatography are used. Since the OH—4652 substance of the present invention is produced and accumulated in both the cells and the culture filtrate, the substance can be separated and collected by collecting it from the whole culture solution containing the cells.

例えば、菌体を含む全培養濾液から、クロ口ホルムや酢酸ェチルなどの有機溶剤などで抽出する。抽出液を濃縮した後セフアデックス L H— 2 0、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等によって本 O H— 4 6 5 2物質を個々の成分、即ち O H— 4 6 5 2 A物質、 O H— 4 6 5 2 B物質、 O H— 4 6 5 2 C物質、 O H— 4 6 5 2 D物質、 O H— 4 6 5 2 E物質または 0 H— 4 6 5 2 F物質に単離することができる。 For example, extract from the whole culture filtrate containing bacterial cells with an organic solvent such as black form and ethyl acetate. After concentrating the extract, Sephadex LH-20, the present OH-4652 substance was separated into individual components by silica gel column chromatography, etc., ie, OH-465A substance, OH-465B substance. OH-4652C substance, OH-4652D substance, OH-4652E substance or 0H-4652F substance.

次に、本発明の O H— 4 5 6 2 A物質、 O H— 4 5 6 2 B物質、 O H— 4 5 6 2 C物質、 O H— 4 6 5 2 D物質、 O H— 4 6 5 2 E物質および 0 H— 4 6 5 2 F物質の理化学的性状について述べる。 Next, the OH-4562A substance, OH-4562B substance, OH-4562C substance, OH-4652D substance, OH-4652E substance of the present invention And the physicochemical properties of 0 H—4 652 F substances.

〔 1〕 O H— 4 6 5 2 A物質 ( 1 ) 性状；白色粉末 [1] OH— 4 65 2 A substance (1) Properties; white powder

(2)分子量； 926 (M + H、高分解能高速原子衝撃マススぺクトルによる） (2) Molecular weight: 926 (M + H, by high-resolution high-speed atomic bombardment mass spectrum)

(3) 分子式； C₄₉H₅₆N₅ OnCl (3) Molecular formula: C ₄₉ H ₅₆ N ₅ OnCl

( 4 ) 融点； 1 3 6〜 1 38 °C (4) Melting point: 136-138 ° C

(5) 比旋光度；〔ひ〕 D ²⁶ =— 9 8. 9° (c = 0. 3メタノール）(5) Specific rotation: [H] D ²⁶ = — 98.9 ° (c = 0.3 methanol)

(6) 紫外部吸収スぺクトル（エタノール中）；第 1図に示すとおりであ. り、 2 0 5、 225、 28 2 (肩） nmに極大吸収を有する (6) Ultraviolet absorption spectrum (in ethanol); as shown in Fig. 1, with maximum absorption at 205, 225, 282 (shoulder) nm

(7) 赤外部吸収スペクトル（KB r) ；第 2図に示すとおりであり、 3 38 0、 325 0、 29 5 0、 2 9 20、 1 735、 1 6 70、 1 6 2 Ocnr¹付近に特徴的な吸収帯を有する (7) Infrared absorption spectrum (KB r); is as shown in FIG. 2, 3 38 0, 325 0, 29 5 0, 2 9 20, 1 735, 1 6 70, 1 6 2 Ocnr near ¹ Has a characteristic absorption band

(8) 溶媒に対する溶解性；メタノール、エタノール、アセトン、クロ口ホルムに可溶、水、へキサンに難溶 (8) Solubility in solvents; soluble in methanol, ethanol, acetone, chloroform, poorly soluble in water and hexane

( 9 ) 呈色反応；ヨウ素、バニリン反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性〔2〕 0 H - 4 6 5 2 B物質 (9) Color reaction; positive for iodine and vanillin reactions, negative for ninhydrin reaction [2] 0H-4652B substance

( 1 ) 性状；白色粉末 (1) Properties; white powder

(2) 分子量； 92 6 (M + H、高分解能高速原子衝撃マススぺクトルによる） (2) Molecular weight: 926 (M + H, using high-resolution high-speed atomic bombardment mass spectrum)

(3) 分子式； C₄₃H₅₆N₅ OnCl (3) Molecular formula: C ₄₃ H ₅₆ N ₅ OnCl

( 4 ) 融点； 1 34〜 1 3 7 °C (4) Melting point: 134-137 ° C

(5) 比旋光度；〔ひ〕。 ²⁶ =— 1 24. 2° (c = 0. 3 5、メタノール） (5) Specific rotation; ²⁶ = — 1 24.2 ° (c = 0.35, methanol)

(6) 紫外部吸収スぺクトル（メタノール中）；第 3図に示すとおりであり、 204、 225、 28 0 (肩） nmに極大吸収を有する (6) Ultraviolet absorption spectrum (in methanol), as shown in Fig. 3, with maximum absorption at 204, 225 and 280 (shoulder) nm

(7) 赤外部吸収スペクトル（KB r) ；第 4図に示すとおりであり、 3 3 8 0、 325 0、 29 5 0、 2 9 20、 1 735、 1 6 70、 1 6 2 Ocm— ¹付近に特徴的な吸収帯を有する (7) Infrared external absorption spectrum (KBr): As shown in Fig. 4, 3380, 3250, 2950, 2920, 1735, 1670, 1 Characteristic absorption band around 6 2 Ocm- ¹

( 9) 呈色反応；ヨウ素、バニリン反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性〔3〕 OH- 4 652 C物質 (9) Color reaction; positive for iodine and vanillin reactions, negative for ninhydrin reaction [3] OH-4652C substance

( 1 ) 性状；白色粉末 (1) Properties; white powder

(2) 分子量； 9 24 (M + H、高分解能高速原子衝撃マススぺクトルによる） (2) Molecular weight: 9 24 (M + H, by high-resolution high-speed atomic bombardment mass spectrum)

(3) 分子式； C₄₉H₅₄N₅ OnCl (3) Molecular formula: C ₄₉ H ₅₄ N ₅ OnCl

(4) 融点； 1 25〜1 27°C (4) Melting point: 125-127 ° C

(5) 比旋光度；〔ひ〕 D ²⁶ = _ 1 5 1. 9° (c = 0. 8、メタノール）(5) Specific rotation; [H] D ²⁶ = _ 15 1 1.9 ° (c = 0.8, methanol)

( 6) 紫外部吸収スぺクトル（メタノール中）；第 5図に示すとおりであり、 204、 225、 28 0 (肩） nmに極大吸収を有する (6) Ultraviolet absorption spectrum (in methanol); as shown in Fig. 5, with maximum absorption at 204, 225 and 280 (shoulder) nm

(7) 赤外部吸収スペクトル（KB r) ；第 6図に示すとおりであり、 3 3 8 0、 325 0、 29 5 0、 2 9 20、 1 7 35、 1 6 70、 1 62 Ocnr¹付近に特徴的な吸収帯を有する (7) Infrared absorption spectrum (KBr); As shown in Fig. 6, around 380, 325, 295, 29, 20, 173, 670, 162 Ocnr ¹ Has a characteristic absorption band

(8) 溶剤に対する溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、クロ口ホルムに可溶、水、へキサンに難溶 (8) Solubility in solvents: Soluble in methanol, ethanol, acetone, chloroform, poorly soluble in water and hexane

(9) 呈色反応；ヨウ素、バニリン反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性〔4〕 OH- 4 652 D物質 (9) Color reaction; positive for iodine and vanillin reactions, negative for ninhydrin reaction [4] OH-4652 D substance

( 1 ) 性状；白色粉末 (1) Properties; white powder

(2) 分子量； 8 74 (M + H、高分解能高速原子衝撃マススぺクトルによる） (2) Molecular weight: 8 74 (M + H, using high-resolution high-speed atomic bombardment mass spectrum)

(3) 分子式： C₄₉H₅₅N₅ Ο,ο (3) Molecular formula: C ₄₉ H ₅₅ N ₅ Ο, ο

( 4 ) 融点； 1 3 7〜 1 3 9 °C (4) Melting point: 137-139 ° C

(5) 比旋光度；〔ひ〕。 ²⁶ =— 2 1 2. 3° (c = 0. 3、メタノール） (6) 紫外部吸収スぺクトル（メタノール中）；第 7図に示すとおりであり、 20 3、 225、 28 1 (肩） nmに極大吸収を有する(5) Specific rotation; ²⁶ = — 2 12.3 ° (c = 0.3, methanol) (6) Ultraviolet absorption spectrum (in methanol); as shown in Fig. 7, with maximum absorption at 203, 225, 281 (shoulder) nm

(7) 赤外部吸収スペクトル（KB r) ；第 8図に示すとおりであり、 3 38 0、 325 0、 2 9 5 0、 2 920、 1 735、 1 6 70、 1 62 Ocnr¹付近に特徴的な吸収帯を有する (7) Infrared absorption spectrum (KB r); is as shown in FIG. 8, 3 38 0, 325 0, 2 9 5 0, 2 920, 1 735, 1 6 70, 1 62 Ocnr near ¹ Has a characteristic absorption band

( 8 ) 溶剤に対する溶解性；メタノール、エタノール、アセトン、クロ口ホルムに可溶、水、へキサンに難溶 (8) Solubility in solvents; soluble in methanol, ethanol, acetone, chloroform, poorly soluble in water and hexane

(9) 呈色反応；ヨウ素、バニリン反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性〔5〕 OH- 4 6 5 2 E物質 (9) Color reaction; positive for iodine and vanillin reactions, negative for ninhydrin reaction [5] OH-4652E substance

( 1 ) 性状；白色粉末 (1) Properties; white powder

(2) 分子量； 9 0 8 (M + H、高分解能高速原子衝撃マススぺクトルによる） (2) Molecular weight: 908 (M + H, by high-resolution high-speed atomic bombardment mass spectrum)

(3) 分子式； C₄₉H₅₄N₅ OioCl (3) Molecular formula: C ₄₉ H ₅₄ N ₅ OioCl

( 4 ) 融点； 1 4 3〜 1 4 6 °C (4) Melting point: 144-146 ° C

(5) 比旋光度；〔ひ〕 _D ²⁶ =— 20 7 ° (c = 0. 8、メタノール）(5) Specific rotation; [H] _D ²⁶ = — 207 ° (c = 0.8, methanol)

(6) 紫外部吸収スぺクトル（メタノール中）；第 9図に示すとおりであり、 2 0 5、 225、 282 (肩） nmに極大吸収を有する(6) Ultraviolet absorption spectrum (in methanol); as shown in Fig. 9, with maximum absorption at 205, 225, 282 (shoulder) nm

(7) 赤外部吸収スぺクトル（KB r) ；第 1 0図に示すとおりであり、 33 8 0、 325 0、 295 0、 2 920、 1 735、 1 6 70、 1 6 2 Ocnr¹付近に特徴的な吸収帯を有する (7) Infrared absorption scan Bae-vector (KB r); is as shown in the first 0 FIG, 33 8 0, 325 0, 295 0, 2 920, 1 735, 1 6 70, 1 6 2 Ocnr 1 Has a characteristic absorption band near

(8) 溶剤に対する溶解性；メタノール、エタノール、アセトン、クロ口 (8) Solubility in solvents; methanol, ethanol, acetone,

" ホルムに可溶、水、へキサンに難溶 "Soluble in form, poorly soluble in water and hexane

(9) 呈色反応；ヨウ素、バニリン反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性(9) Color reaction; positive for iodine and vanillin reactions, negative for ninhydrin reaction

( 1 0) 元素分析； C= 6 3. 0 9 %； Η= 6. Π% ; Ν= Ί . 04 % (10) Elemental analysis; C = 63.09%; Η = 6.Π%; Ν = Ί.04%

C 1 = 3. 7 1 % C 1 = 3.7 1%

( 1 1 ) ァミノ酸分析値；グリシン：セリン：チロシン = 1 ： 1 ： 1 ( 1 3) プロトン核磁気共鳴スぺクトル（バリアン XL— 4 0 0、 4 0 0 MHz) ；第 1 1図に示すとおり (11) Amino acid analysis value; glycine: serine: tyrosine = 1: 1: 1 (13) Proton nuclear magnetic resonance spectrum (Varian XL—400, 400 MHz); as shown in Fig. 11

〔6〕 OH- 4 6 5 2 F物質 (6) OH- 4 65 2 F substance

( 1) 性状；白色粉末 (1) Properties; white powder

(2) 分子量； 94 2 (M + H, 高分解能高速原子衝撃マススぺクトルによる） (2) Molecular weight: 94 2 (M + H, using high-resolution high-speed atomic bombardment mass spectrum)

(3)分子式； C_4SH₅₃N₅ 0,oCl₂ (3) Molecular _{_{_{formula; C 4S H 53 N 5 0}}} , oCl 2

( 4 ) 融点； 1 4 3〜 1 4 6 °C (4) Melting point: 144-146 ° C

(5) 比旋光度；〔a〕 D ²⁶ =— 1 9 3. 5 ° (c = 0. 7、メタノール）(5) Specific rotation: [a] D ²⁶ = — 1 93.5 ° (c = 0.7, methanol)

(6) 紫外部吸収スぺクトル（メタノール中）；第 1 2図に示すとおりであり、 20 3、 225、 28 2 (肩） nmに極大吸収を有する(6) Ultraviolet absorption spectrum (in methanol); as shown in Fig. 12, with maximum absorption at 203, 225, 282 (shoulder) nm

(7) 赤外部吸収スぺクトル（KB r) ；第 1 3図に示すとおりであり、 3 38 0、 325 0、 295 0、 2 920、 1 735、 1 6 70、 1 6 2 Ocnr¹付近に特徴的な吸収帯を有する (7) Infrared absorption scan Bae spectrum (KB r); is as shown in the first 3 FIG, 3 38 0, 325 0, 295 0, 2 920, 1 735, 1 6 70, 1 6 2 Ocnr near ¹ Has a characteristic absorption band

(8) 溶剤に対する溶解性；メタノール、エタノール、アセトン、クロ口ホルムに可溶、水、へキサンに難溶 (8) Solubility in solvents; soluble in methanol, ethanol, acetone, chloroform, poorly soluble in water and hexane

( 9) 呈色反応；ヨウ素、バニリン反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性次に、本発明の OH— 4 6 52物質のフアルネシルトランスフェラ一ゼ阻害物質作用について説明する。 (9) Color reaction: positive for iodine and vanillin reactions, negative for ninhydrin reaction Next, the action of the OH-4652 compound of the present invention as a pharmacophorase inhibitor will be described.

公知の反応系〔サイエンス、第 24 5巻、第 3 79頁（ 1 9 8 9) 〕に準じて酵素反応を行つた。反応液中にはフアルネシルトランスフラーゼの他に〔³ H〕フアルネシルピロリン酸、 p 2 1タンパク質、 MgCl₂、 DDTおよびトリス '塩酸緩衝液（pH 7. 5) を含む。 An enzymatic reaction was carried out according to a known reaction system [Science, Vol. 245, p. 379 (1989)]. The reaction solution contains [ ³ H] pharmacophoric acid, p21 protein, MgCl ₂ , DDT and Tris'hydrochloric acid buffer (pH 7.5) in addition to pharmacophorase.

その結果、マウス及びヒト由来のフアルネシルトランスフェラーゼに対する I C 5 0はそれぞれ 0. 5 Mおよび 1. 1 Mであり、対照として同様の作用を有する合成ペプチド CVLSの 6. 25 /Mに対しきわめて強い阻害活性を示した。またべ口細胞に対する細胞毒性を調べたところ、 \ m g / 〗添加によっても何ら細胞の増殖および形態に影響は見られず、きわめて毒性の低いことが確認された。発明の効果 As a result, IC50 for mouse and human derived pharmacosyltransferase was 0.5 M and 1.1 M, respectively, which was 6.25 / M of the synthetic peptide CVLS having the same effect as the control. Extremely It showed strong inhibitory activity. In addition, the cytotoxicity to vegetative cells was examined, and it was confirmed that the addition of \ mg /〗 did not affect cell growth or morphology at all, and was extremely low in toxicity. The invention's effect

以上のように、本発明の O H— 4 6 5 2物質は、同様の作用を有する従来の合成べプチドに比べて著しく強い酵素阻害活性を有し、かつ毒性が低いことから r a s遺伝子による癌化の過程を阻止できる物質と推定されることから、制癌物質として有用である。図面の簡単な説明】 As described above, the OH-4652 substance of the present invention has remarkably strong enzyme inhibitory activity as compared with the conventional synthetic peptide having the same action, and has low toxicity, so that the ras gene Since it is presumed to be a substance that can inhibit the process of canceration, it is useful as an anticancer substance. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

第 1図は本発明のフアルネシルトランスフヱラ一ゼ阻害物質 O H— 4 6 FIG. 1 shows the pharmacophorase inhibitor of the present invention, O H—46.

5 2 A物質の紫外線吸収スぺクトルである。 It is an ultraviolet absorption spectrum of 52 A substance.

第 2図は O H— 4 6 5 2 A物質の赤外線吸収スぺクトルである。 Figure 2 shows the infrared absorption spectrum of the OH—4652A substance.

第 3図は本発明のファルネシルトランスフヱラーゼ阻害物質 0 H— 4 6 FIG. 3 shows the farnesyltransferase inhibitor of the present invention 0 H—46

5 2 B物質の紫外線吸収スぺクトルである。 It is an ultraviolet absorption spectrum of 52B substance.

第 4図は O H— 4 6 5 2 B物質の赤外線吸収スぺクトルである。 Fig. 4 shows the infrared absorption spectrum of the OH—4652B substance.

第 5図は本発明のフアルネシルトランスフェラーゼ阻害物質 O H— 4 6 FIG. 5 shows the pharmacophorase inhibitor O H—46 of the present invention.

5 2 C物質の紫外線吸収スぺクトルである。 It is an ultraviolet absorption spectrum of 52C substance.

第 6図は O H— 4 6 5 2 C物質の赤外線吸収スぺクトルである。 Fig. 6 shows the infrared absorption spectrum of the OH-4652C substance.

第 7図は本発明のフアルネシルトランスフェラーゼ阻害物質 O H— 4 6 FIG. 7 shows the pharmacotransferase inhibitor O H—46 of the present invention.

5 2 D物質の紫外線吸収スぺクトルである。 It is an ultraviolet absorption spectrum of 52D substance.

第 8図は O H— 4 6 5 2 D物質の赤外線吸収スぺクトルである。 Fig. 8 shows the infrared absorption spectrum of the OH—4652D substance.

第 9図は本発明のフアルネシルトランスフェラーゼ阻害物質 O H— 4 6 FIG. 9 shows the pharmacotransferase inhibitor O H—46 of the present invention.

5 2 E物質の紫外線吸収スぺケトルである。 It is an ultraviolet absorption basket of 52E substance.

第 1 0図は O H— 4 6 5 2 E物質の赤外線吸収スぺクトルである。第 1 1図は OH— 4 6 5 2 E物質のプロトン核磁気共鳴スぺクトルであ第 1 2図は本発明のフアルネシルトランスフェラーゼ阻害物質〇H— 4 6 5 2 F物質の紫外線吸収スぺクトルである。 Fig. 10 shows the infrared absorption spectrum of the OH-4652E substance. FIG. 11 is a proton nuclear magnetic resonance spectrum of the OH—4652E substance. FIG. 12 is a ultraviolet absorption spectrum of the pharmacophore inhibitor of the present invention, ie, the H—4652F substance. Vector.

第 1 3図は OH— 4 6 5 2 F物質の赤外線吸収スぺクトルである。次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。 Fig. 13 shows the infrared absorption spectrum of OH-4652F substance. Next, the present invention will be specifically described with reference to examples.

実施例 Example

5 0 0 m l容三角フラスコにグルコース 0. 1 %、馬鈴薯デンプン 2. 4 %、ペプトン 0. 3%、肉エキス 0. 3%、酵母エキス 0. 5 %、炭酸カルシウム 4 を含む液体培地（pH 7. 0) 1 0 0m lを分注し、 1 2 1 °Cで 1 5分間蒸気滅菌し、これにグリセロール 1. 0%、カゼイン 0. 0 3%、硝酸カリウム 0. 2%、塩化ナトリウム 0. 2%、燐酸二力リウム 0. 2 %、硫酸マグネシウム 0. 0 0 5 %、炭酸カルシウム 0. 0 0 2%、硫酸第二鉄 0. 0 0 1 %、寒天 1. 8 %を含む寒天斜面培地上で 2 7°Cで培養したストレトマイセスエスピー OH— 4 6 5 2株の斜面培地から 1白金耳づっ植菌し、回転式振とう機を用いて、 27°Cで 3日間振とう培養し、種培養液を得た。 Liquid medium containing glucose 0.1%, potato starch 2.4%, peptone 0.3%, meat extract 0.3%, yeast extract 0.5% and calcium carbonate 4 in a 500 ml Erlenmeyer flask (pH 7.0) Dispense 100 ml, steam sterilize at 121 ° C for 15 minutes, add glycerol 1.0%, casein 0.03%, potassium nitrate 0.2%, sodium chloride 0 Agar containing 2%, 0.2% dibasic phosphate, 0.05% magnesium sulfate, 0.02% calcium carbonate, 0.001% ferric sulfate, 1.8% agar Inoculate one platinum loop from the strain medium of Streptomyces sp. OH-465 2 strain cultured at 27 ° C on a slant medium and shake it at 27 ° C for 3 days using a rotary shaker. After culturing, a seed culture was obtained.

—方、 301 ジャーフアーメンター 1基にグルコース 2. 0 %、ァスパラギン 0. 5 %、硫酸マグネシウム 0. 0 1 %、リン酸一カリウム 0. 0 7%、酵母エキス 0. 1 %を含む液体培地（pH7. 0) 201 に仕込み、 1 2 1 °Cで 3 0分間蒸気滅菌した。これに種培養液 4本分を移植し、攪拌速度 25 0 r pm、通気量 1 51 ノ分で 27°Cで 9 6時間通気攪拌した。培養液 201 にクロ口ホルム 1 01 を加え攪拌し、これをシャープレスで遠心分離して（ 1 0 0 0 0 r pm) 菌体と:；層とクロ口ホルム層に分別した。得られたクロ口ホルム層に無水硫酸ナトリウム 5 0 0 gを加え、脱水した後、粗物を得た。クロ口ホルム層を減圧濃縮し、油状物質 1. 6 gを得た。クロ口ホルムに懸濁したシリカゲル（約 4 0 g) を充塡したカラム上端に、上記の油状物質を少量のシリカゲルとともに負荷し、クロ口ホルムメタノール（ 1 0 0 : 5、 V/V) 1 0 0m lでカラムを洗った後クロ口ホルムメタノール（ 1 0 0 : 6. 5、 V/V) で活性物質を溶出した。これを減圧下で濃縮することによって褐色の粗粉末 77 Omgを得た。この粗粉末を少量のエタノールに溶解し、あらかじめエタノールで平衡化したセフアデックス LH— 20カラム（ 1. 5 cmx i 0 0 cm) の上端に負荷しエタノールにて溶出した。活性画分を集め、減圧下濃縮することによって淡褐色の粗粉末 4 6 Omgを得た。これを 4. 6m lのメタノールに溶かし、 0. 2m 1づっ高速液体クロマトグラフィー用逆相カラム（資生堂： C 1 8 SG 1 20タイプ（20 X 25 Omm) に供し、 5 0%ァセトニトリル水で溶出（流速： 1 1 m lノ分）した。 A liquid containing 2.0% glucose, 0.5% asparagine, 0.05% magnesium sulfate, 0.07% monopotassium phosphate, and 0.1% yeast extract per 301 jar armament. The medium was charged into a medium (pH 7.0) 201, and steam-sterilized at 121 ° C for 30 minutes. To this, four seed cultures were transplanted, and agitated at 27 ° C. for 96 hours at a stirring speed of 250 rpm and an aeration amount of 151 min. To the culture broth 201 was added black-mouthed form 101, and the mixture was stirred. The mixture was centrifuged with a sharp press (100,000 rpm) to separate the cells into the following cells: 500 g of anhydrous sodium sulfate was added to the obtained foam layer for dehydration, followed by dehydration to obtain a crude product. The black form layer was concentrated under reduced pressure to obtain 1.6 g of an oily substance. Load the above oily substance together with a small amount of silica gel on the top of the column packed with silica gel (about 40 g) suspended in black-mouthed form, and then add methanol to the black-mouthed form (100: 5, V / V) After washing the column with 100 ml, the active substance was eluted with chloroform-methanol (100: 6.5, V / V). This was concentrated under reduced pressure to obtain 77 Omg of a brown crude powder. This coarse powder was dissolved in a small amount of ethanol, applied to the upper end of a Sephadex LH-20 column (1.5 cm × 10 cm) previously equilibrated with ethanol, and eluted with ethanol. The active fractions were collected and concentrated under reduced pressure to obtain 46 Omg of a light brown crude powder. This was dissolved in 4.6 ml of methanol, and applied to a reversed-phase column for high-performance liquid chromatography (0.2 ml) (Shiseido: C18SG120 type (20 x 25 Omm)) to give 50% acetone. The mixture was eluted with tonitrile water (flow rate: 11 ml).

異なる保持時間で溶出されてくるそれぞれの活性画分を集め、減圧乾固し、保持時間 1 1. 4、 1 2. 3、 1 6. 7、 1 9. 3、 2 1. 6及び 2 8. 9分で溶出される物質がそれぞれ OH— 4 6 5 2 A、 OH— 4 6 5 2 B、 OH - 4 6 5 2 C、 OH- 4 6 52 D, O H - 4 652 Eおよび O H - 4 6 52 F物質である。上記一回のクロマトグラフィーでこれら各物質をそれぞれ 0. 7、 1. 4、 2. 7、 3. 7、 3. 0及び 1. l mgを得た。 The active fractions eluted at different retention times were collected, evaporated to dryness under reduced pressure, and retention times 11.4, 12.3, 16.7, 19.3, 21.6, and 28 The substances eluted at 9 minutes are OH—4652A, OH—4652B, OH-4652C, OH-4652D, OH-4652E and OH-4, respectively. 6 52 F substance. The single chromatography described above yielded 0.7, 1.4, 2.7, 3.7, 3.0 and 1.1 mg of each of these substances, respectively.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims

1. 下記の理化学的性質を有する OH— 4 6 52 A物質、 OH— 4 6 52 B物質、 OH - 4 6 5 2 C物質、 OH - 4 6 5 2 D物質、 OH— 4 6 5 2 E物質および OH— 4 6 5 2 F物質からなる群より選ばれた OH— 4 6 5 2物質。 1. OH—4652 A substance, OH—4652B substance, OH—4652C substance, OH—4652D substance, OH—4652E substance with the following physicochemical properties: OH—4652 substances selected from the group consisting of substances and OH—4652F substances.

〔 I〕 OH- 4 6 5 2 A物質 (I) OH- 4 65 2 A substance

( 1 ) 性状；白色粉末 (1) Properties; white powder

(2) 分子量； 9 2 6 (M + H、高分解能高速原子衝撃マススぺクトルによる） (2) Molecular weight: 9 26 (M + H, by high-resolution high-speed atomic bombardment mass spectrum)

( 3) 分子式； C_4SH₅sN₅ O CI (3) Molecular _{_{_{formula; C 4S H 5 sN 5 O}}} CI

( 4 ) 融点； 1 3 6〜 1 3 8 °C (4) Melting point: 1 36 to 1 38 ° C

(5) 比旋光度； Γ 〕。 ²⁶ =— 9 8. 9 ° (c = 0. 3、メタノール)(5) Specific rotation: Γ]. ²⁶ = — 9 8.9 ° (c = 0.3, methanol)

( 6) 紫外部吸収スぺクトル（エタフール中）； 2 0 5、 2 2 5、 2 8 2 (肩） nmに極大吸収を有する (6) Ultraviolet absorption spectrum (in etafur); maximum absorption at 205, 222, 282 (shoulder) nm

(7) 赤外部吸収スぺクトル（KB r) : 33 8 0、 325 0. 2 9 5 0、 2 920、 1 735、 1 6 70、 1 620 cnT¹付近に特徴的な吸収帯を有する (7) Infrared absorption spectrum (KB r): 3380, 3250.2950, 2920, 1735, 1670, 1620 cnT1 Has characteristic absorption bands around ¹

( 8) 溶剤に対する溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、クロ口ホルムに可溶、水、へキサンに難溶 (8) Solubility in solvents: Soluble in methanol, ethanol, acetone, chloroform, poorly soluble in water and hexane

( 9 ) 呈色反応：ヨウ素、バニリン反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性〔2〕 OH- 4 6 5 2 B物質 (9) Color reaction: Positive for iodine and vanillin reactions, negative for ninhydrin reaction [2] OH-4652B substance

( 1 ) 性状；白色粉末 (1) Properties; white powder

( 2) 分子量； 9 2 6 (M + H、高分解能高速原子衝撃マススぺクトルによる） (2) Molecular weight: 9 26 (M + H, by high-resolution high-speed atomic bombardment mass spectrum)

( 3) 分子式； C₄₉H₅₆N₅ O,,Cl ( 4 ) 融点； 1 3 4〜 1 37 °C (3) Molecular _{_{_{formula; C 49 H 56 N 5 O}}} ,, Cl (4) Melting point: 134-137 ° C

(5) 比旋光度；〔ひ〕。 ²⁶ =— 1 24. 2。 (c = 0. 3 5、メタノール） (5) Specific rotation; ²⁶ = — 1 24.2. (c = 0.35, methanol)

( 6) 紫外部吸収スぺクトル（エタノール中）； 204、 22 5、 28 0 (肩） nmに極大吸収を有する (6) Ultraviolet absorption spectrum (in ethanol); maximum absorption at 204, 225, 280 (shoulder) nm

(7) 赤外部吸収スぺクトル（KB r) : 3 3 8 0、 325 0、 2 9 5 0、 2 9 20、 1 73 5、 1 6 70、 1 6 20 cm— ¹付近に特徴的な吸収帯を有する (7) Infrared absorption spectrum (KBr): 3380, 3250, 2950, 2920, 1735, 1670, 1620 cm- ¹ Characteristic around ¹ Has a strong absorption band

(9) 呈色反応：ヨウ素、バニリン反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性〔3〕 OH- 4 6 5 2 C物質 (9) Color reaction: positive for iodine and vanillin reactions, negative for ninhydrin reaction [3] OH-4652C substance

( 1 ) 性状；白色粉末 (1) Properties; white powder

(3) 分子式； C_4SH₅₄N₅ O CI (3) Molecular formula: C _4SH ₅₄ N ₅ O CI

( 4 ) 融点； 1 25〜 1 27 °C (4) Melting point: 125-127 ° C

(5) 比旋光度；〔ひ〕 _D ²⁶ =— 1 5 1. 9° (c = 0. 8、メタノール）(5) Specific rotation; [H] _D ²⁶ = — 1 5 1.9 ° (c = 0.8, methanol)

( 6) 紫外部吸収スぺクトル（エタノール中）； 204、 225、 28 0 (肩） nmに極大吸収を有する (6) Ultraviolet absorption spectrum (in ethanol); maximum absorption at 204, 225, 280 (shoulder) nm

(7) 赤外部吸収スぺクトル（KB r) : 3 3 8 0、 325 0、 2 9 5 0、 2 9 20、 1 735、 1 6 70、 1 6 20 cnT¹付近に特徵的な吸収帯を有する (7) Infrared absorption spectrum (KBr): 3380, 3250, 2950, 2920, 1735, 1670, 1620 cnT ¹ Absorption specific Have a belt

( 9 ) 呈色反応：ヨウ素、バニリン反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性〔4〕 OH- 4 6 5 2 D物質 (9) Color reaction: positive for iodine and vanillin reactions, negative for ninhydrin reaction (4) OH- 4 65 2 D substance

( 1 ) 性状；白色粉末 (1) Properties; white powder

(2) 分子量； 874 (M + H、高分解能高速原子衝撃マススぺクトルによる） (2) Molecular weight: 874 (M + H, high-resolution high-speed atomic bombardment mass spectrum)

(3) 分子式； C₄₉H₅₅N₅ Ο,ο (3) Molecular formula; C ₄₉ H ₅₅ N ₅ Ο, ο

( 4 ) 融点； 1 3 7〜 1 3 9 °C (4) Melting point: 137-139 ° C

(5) 比旋光度；〔ひ〕 _D ^2S =— 2 1 2. 3° (c = 0. 3、メタノール）(5) Specific rotation; [H] _D ^2S = — 2 12.3 ° (c = 0.3, methanol)

( 6) 紫外部吸収スペクトル（エタノール中）； 20 3、 225、 28 1 (肩） nmに極大吸収を有する (6) Ultraviolet absorption spectrum (in ethanol); maximum absorption at 203, 225, 281 (shoulder) nm

(7) 赤外部吸収スぺクトル（KB r) : 3 3 8 0 , 325 0、 2 9 5 0、 (7) Infrared absorption spectrum (KBr): 3380, 3250, 2950,

2 9 2 0、 1 7 3 5、 1 6 7 0、 1 6 2 0 cm— ¹付近に特徴的な吸収帯を有する -2920, 1735, 1670, 1620 cm-with characteristic absorption band around ^1-

( 9) 呈色反応：ヨウ素、バニリン反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性〔5〕 OH- 4 6 52 E物質 (9) Color reaction: positive for iodine and vanillin reactions, negative for ninhydrin reaction [5] OH-4652 E substance

( 1 ) 性伏；白色粉末 (1) Properties: white powder

(3) 分子式； C₄₉H₅₄N₅ O₁₀Cl (3) Molecular formula: C ₄₉ H ₅₄ N ₅ O ₁₀ Cl

( 4 ) 融点； 1 4 3〜 1 4 6 °C (4) Melting point: 144-146 ° C

(5) 比旋光度；〔ひ〕。 ²⁶ =— 20 7。（c = 0. 8、メタノール）(5) Specific rotation; ²⁶ = — 20 7. (C = 0.8, methanol)

( 6) 紫外部吸収スぺクトル（エタノール中）； 20 5、 225、 28 2 (肩） nmに極大吸収を有する (6) Ultraviolet absorption spectrum (in ethanol); maximum absorption at 205, 225, 282 (shoulder) nm

(7) 赤外部吸収スペクトル（KB r) : 3 38 0 , 32.5 0、 2 9 5 0、 (7) Infrared external absorption spectrum (KB r): 3380, 32.50, 2950,

2 9 2 0、 1 7 3 5、 1 6 7 0、 1 6 2 0 cnT¹付近に特徴的な吸収帯を有する 2 9 0, 1 7 3 5, 1 6 7 0, 1 6 2 0 Characteristic absorption near cnT ¹ Have a belt

( 9 ) 呈色反応：ヨウ素、バニリン反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性〔6〕 OH- 4 6 5 2 F物質 (9) Color reaction: positive for iodine and vanillin reactions, negative for ninhydrin reaction [6] OH-4652F substance

( 1 ) 性状；白色粉末 (1) Properties; white powder

(2) 分子量； 94 2 (M + H、高分解能高速原子衝撃マススぺクトルによる） (2) Molecular weight: 94 2 (M + H, by high-resolution high-speed atomic bombardment mass spectrum)

(3) 分子式； C₄₉H₅₃N₅ O,oCl₂ (3) Molecular _{_{_{formula; C 49 H 53 N 5 O}}} , oCl 2

( 4 ) 融点； 1 4 3〜 1 4 6 ^eC (4) Melting ^{point; 1 4 3~ 1 4 6 e} C

(6) 紫外部吸収スぺクトル（エタノール中）； 203、 225、 28 2 (肩） nmに極大吸収を有する (6) Ultraviolet absorption spectrum (in ethanol); maximum absorption at 203, 225, 282 (shoulder) nm

(7) 赤外部吸収スぺクトル（KB r) : 3380、 32 50、 2 9 5 0、 (7) Infrared absorption spectrum (KB r): 3380, 3250, 295,

2 9 2 0、 1 7 3 5、 1 6 7 0、 1 6 2 0 cnT¹付近に特徴的な吸収帯を有する Having 2 9 2 0, 1 7 3 5, 1 6 7 0, 1 6 2 0 cnT characteristic absorption bands in the vicinity of ¹

(9) 呈色反応：ヨウ素、バニリン反応に陽性、ニンヒドリン反応に陰性 (9) Color reaction: positive for iodine and vanillin reactions, negative for ninhydrin reaction

2. ストレブトマイセス属に属する OH— 4 6 5 2 A物質、 OH— 4 6 5 2 B物質、 OH— 4 6 52 C物質、 OH - 4 6 5 2 D物質、 OH— 4 6 5 2 E物質およびまたは OH— 4 6 52 F物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に OH - 4 6 52 A物質、 OH - 4 6 5 2 B物質、 OH - 4 6 5 2 C物質、 OH - 4 6 52 D物質、 OH - 4 6 52 E物質および Zまたは OH— 4 652 F物質を蓄積せしめ、該培養物から 0H- 4 6 5 2 A物質、 OH— 4 6 5 2 B物質、 OH— 4 6 5 2 C物質、 OH— 4 6 5 2 D物質、 OH— 4 6 5 2 E物質およびノまたは OH— 4 62. OH—4652A substance, OH—4652B substance, OH—4652C substance, OH—4652D substance, OH—4652 belonging to the genus Streptomyces Microorganisms capable of producing substance E and / or OH-4652F are cultured in a culture medium, and OH-465A, OH-4652B, OH-46 are contained in the culture. Accumulate 52 C substance, OH-4652D substance, OH-4652E substance and Z or OH-4652 F substance, and 0H-4652A substance, OH—4652B substance, OH—4652C substance, OH—4652D substance, OH—4652E substance and OH or OH—4 6

5 2 F物質を採取することを特徴とする OH— 4 6 52 A物質、 OH— 45 2 F substance is collected, OH— 4 6 52 A substance, OH— 4

6 5 2 B物質、 OH— 4 6 5 2 C物質、 OH - 4 6 52 D物質、 OH - 4 6 52 E物質および Zまたは OH— 4 6 5 2 F物質の製造法。 Method for producing 652B substance, OH—4652C substance, OH-4652D substance, OH-4652E substance and Z or OH—4652F substance.

3. ストレブトマイセス属に属する OH— 4 6 5 2 A物質、 OH— 4 6 5 2 B物質、 OH - 4 6 52 C物質、 0H— 4 6 52 D物質、 OH - 4 6 5 2 E物質および Zまたは OH— 4 6 52 F物質を生産する能力を有する微生物がストレブトマイセスエスピー OH— 4 6 5 2 (FERM BP— 4 3 0 9 ) である請求の範囲 2記載の製造法。 3. OH—4652A substance, OH—4652B substance, OH-4652C substance, 0H—4652D substance, OH—4652E belonging to the genus Streptomyces 3. The method according to claim 2, wherein the microorganism having the ability to produce the substance and Z or OH—4652F substance is Streptomyces sp. OH—4652 (FERM BP—430). .

4. ストレブトマイセス属に属し OH— 4 6 5 2 A物質、 OH— 4 65 2 B物質、 OH— 4 6 52 C物質、 OH— 4 6 52 D物質、 OH - 4 6 5 2 E物質および Zまたは OH— 4 6 52 F物質を生産する能力を有する微生物。 4. OH—4652 A substance, OH—4652B substance, OH—4652C substance, OH—4652D substance, OH—4652E substance belonging to the genus Streptomyces And Z or OH—microorganisms capable of producing 4652 F substances.

5. 微生物がストレブトマイセスエスピー OH— 4 6 5 2である請求の範囲 4記載の微生物。 5. The microorganism according to claim 4, wherein the microorganism is Streptomyces sp. OH—4652.