CN117701412A - 具有辣椒炭疽病和细菌病防治及生育促进效果的多功能天然植物保护剂的开发 - Google Patents
具有辣椒炭疽病和细菌病防治及生育促进效果的多功能天然植物保护剂的开发 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是有效地解决防治困难的辣椒炭疽病、细菌性枯萎病、斑纹病等的方法,不仅直接抑制引起该病的霉菌及细菌病原菌的生长,而且将具有增强寄主植物辣椒的病免疫性和促进繁育效果的内生细菌从韩国国内根圈土壤中分离、培养而做好制剂,开发而提供具有综合植物强化(plant strengthener)的新功效的新型天然植物保护剂。
Description
【技术领域】
本发用于防治辣椒炭疽病和细菌病的多功能天然植物保护剂与开发有关，更为详细的是关于含有共生细菌多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90菌株的的微生物制剂的开发。
本发明由农林水产食品部支持的"防治作物病毒及病虫害的产业化技术开发”项目和科学技术信息通信部支援的"雇佣危机企业附属研究所R&D专门人力活用支援(R&D)”事业执行中，得出的结果。
【课题固有编号:1545022768，课题名:辣椒炭疽病的药剂抵抗性机理的查明及防治防治剂的技术开发(2020～2024)]
[课题固有编号:1711140886，课题名:为防治果树细菌孔病(穿孔病)的微生物质能分析及作用机理研究(2021～2022)]
【发明背景的技术】
韩国农产品中辣椒的产量约为1兆18亿韩元(2018年)，辣椒与水稻、蔬菜等是韩国重要的汇兑作物。大部分辣椒是种植在同一地区，好几年连种，每年栽培期间长，因此在栽培种由于多种酶病，细菌和病毒的病原菌的发生,稳定的生产受到了很大的损失。其中辣椒的炭疽病造成的损失约占总产值的10％左右，达1000亿韩元左右。
严重时还会造成50～80％的损失(参照：非专利文献1)。这样的损失根据炭疽病的发生地和病原菌的农药抵抗性不同，韩国国内的炭疽病菌在20世纪90年代是胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides),而在最近变化到辣椒炭疽病菌(Colletotrichumacutatum)(参照：非专利文献2)。这期间为了辣椒炭疽病的防治，提供给农民抵抗炭疽病的辣椒品种，但由于种子单价高，部分品种的辣味丧失和辣椒病毒的复合抵抗性不足等原因，多少会暴露出使用上的局限性。相反，最容易有效的防治方法是使用化学杀菌剂。
辣椒种植期间平均使用杀菌剂的处理次数是平均在20次以上，其中，为防治炭疽病平均杀菌剂处理次数是11.2次(在建议炭疽病防治日历资料，杀菌剂处理次数是6～7次)(忠北辣椒协力组教育资料，2018)。如此滥用杀菌剂，目前广泛使用的麦角固醇(ergosterol)生合成阻碍杀菌剂及甲氧丙烯酸酯(strobilurin)系杀菌剂抵抗性病原菌产生，正在防治效果越来越下降(参照：非专利文献3至4)。因此为杀菌剂抵抗性炭疽病的有效防治，需要利用拮抗或共生微生物的天然植物保护剂(生物)的开发等综合防治方法。
与炭疽病一起对辣椒生产造成很大危害的疾病是细菌引起的枯萎病(青枯病)、细菌性斑纹病及软病(参照：非专利文献1)。青枯病是青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的土壤传染性细菌病,主要在地温25℃以上时发生,在低温期不会发病。这病原菌的生育适当温度为35～37℃，除辣椒外，还有西红柿、茄子、芝麻、土豆等400多种的植物上会造成疾病。这个病主要发生在7～8月的夏季，一旦被感染的病株慢慢枯死，切断受害茎的话，导管会变成褐色，在这部分会分泌牛奶光色的细菌液。一旦有一棵被感染，就是病原菌顺着这个水扩散，很快导致邻居植物的发病，导致整个田的作物枯死。现在为防治这种病，有种抵抗性品种和滴灌抗生素的方法，但对抗生物质抗药性发生等防治效果低，使用拮抗微生物的天然植物保护剂迫切需要开发(参照：非专利文献5至7).
辣椒的细菌性斑纹病是由(Xanthomonas euvesicatoria)发生，病原菌在病叶、叶茎残渣或种子过冬后第二年春天,通过第一次传染源雨、风或农具等传播。首先病原菌通过叶子的气孔或伤口侵入，起初病斑以灰褐色地小点纹开始，如果发病进行，整个叶子就会枯死为褐色(参照：非专利文献8)。除此之外还有由软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)引起的软腐病，该病除辣椒外，白菜、洋白菜、甜椒等发生的土壤传染病。辣椒细菌病防治药剂只有铜制、农用新悬浮剂、玉素里尼克酸等几种。辣椒的病害是由多种病原菌引起的，因为病的产生造成巨大损失，所以发病前要好好预防。但化学农药对于霉菌或细菌性病原菌没法同时防治，根据作用机理，该混配主成分不同的原药，形态的制剂合剂被开发而使用合制。
这些化学农药对人畜毒性、环境污染和生态***影响及病原菌的杀菌剂抵抗性持续的发生问题，对环保天然植物保护剂的关注和开发最近在国内外迅速增加。在我们韩国很久，为防治辣椒，果树，谷物等农作物的病虫害而杂草，使用了很多农药。为解决由此带来的各种问题，政府正在努力减少化肥和农药的使用量而推动环保绿色农业培育政策。该计划从2001年开始以每5年为单位进行，实施至今，推进第4次计划(2016～2020年),目标是在此期间,与亲环境农产品(无农药以上)的种植面积比率从目前4.5％(7万5千公顷)达到8％(13万3千公顷)，扩大大约78％，减少每年1.5％以上的化肥及农药使用量。就是可替代化学农药的病害虫防治用资材在韩国国内可以注册亲环境农资材，那种资材有有机农业资材和天然植物保护剂。使用材料有直接利用微生物本身的生菌剂及微生物培养液，或提取植物体而使用的。天然植物保护剂方面,前者分为微生物农药,后者分为生化农药。微生物基础产品分析土壤、植物根圈、海洋等特定自然环境的所有微生物种(microbiome)，选拔具有新功能的微生物，大量培养后喷洒叶面，或是开发土壤处理用途的制剂而使用于病害虫防治剂的目的(见非专利文献9)。
这里使用的微生物主要是可抑制植物病原菌的天敌(拮抗)微生物、植物生育促进根圈细菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)及在植物组织中共生的内生(endophytic)微生物等。在这些微生物中，最近十年来,植物内生细菌的研究甚多,特别是处理到种子或苗秧后发挥到植物疫苗的作用，以对病害虫、盐类及高温干燥压力产生抵抗性的技术曾经在韩国开发过(见非专利文献10至12)。植物内生细菌不给寄主任何害处，是共生而有益作用的细菌，还存在于普通细胞之间的空间或细胞内部。作为作用机理，氮固化，磷酸的可溶化、铁着化合物质(siderophore)的生产、生产植物激素而脂质肽(lipopeptide)等抗菌物质，诱导病害虫的抵抗性或促进植物生长。
目前为止，很多研究过的内生细菌是杆菌，芽孢杆菌(Bacillus)和类芽孢杆菌
(Paenibacillus)、绿脓杆菌(Pseudomonas)、溶菌(Lysobacter)、土壤杆菌(Agrobacterium)等130多种，它们作用于水稻、小麦等谷类、辣椒、西红柿、土豆等蔬菜作物，抑制病的发生而增进作物的生产(参照：非专利文献13至17)。
Bacillus oryzicolaYC7007是具有水稻病害的防治及促进生长效果的复合功能内生细菌，根据寄主植物的不同，表现出不同的作用机理。(见非专利文献18)。
目前在韩国注册的植物病害防治用天然植物保护剂共有18个(以2019年为准)，主要成分是细菌芽孢杆菌(Bacillus)和霉菌木霉菌(Tricoderma)。其中实际销售的产品只是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)10个，霉菌哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)1个(见非专利文献9)。其中5个是利用国外进口微生物进行产品化的，除此之外，在国外还有使用解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)等。为了把微生物作为产品使用，在恶劣的环境或流通中，可以长时间保持密度，防治效果也很好。从这点来看，形成孢子的芽孢杆菌(Bacillus)和木霉菌(Tricoderma)是作为适合于开发天然植物护剂的适当微生物，很多研究者研发了病害虫的生物防治剂。研究发现，大部分的芽孢杆菌菌株分泌脂质肽抗菌物质fengyein，脂肽类抗生素(iturin)、芽孢杆菌代谢活性物质(surfactin)等，直接抑制霉菌病原菌或诱导寄主的病抵抗性(见非专利文献19)。前面提到的芽孢杆菌以外，最近对多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的植物病防治效果研究结果发表了。这种菌最初被归类为芽孢杆菌属(genus)，从1993年开始重新分类到新的类芽孢杆菌属。这些菌株中有一些菌种不仅具有植物病源霉菌的抑制效果，还可有效抑制细菌病青枯病。还有通过氮固定或磷酸溶解、植物生长激素分泌等，被确认为各种作物的生长促进。特别是分泌镰孢菌素(fusaricidin)、细菌素(bacteriocin)、脂质肽等多种抗生物质，其中多粘菌素(polymyxin)在很早以前就被利用为抑制人体病源细菌的医药用产品。(见非专利文献20至23)。
目前国内外芽孢杆菌属的几种产品已经成为商品化，使用于植物病防治，但防治效果相对比化学农药低,正在在市场上的扩散缓慢进行。为了开发更有效的产品,在技术上对防治对象病原菌，要选拔出能有效地抑制的优良微生物，同时需要考虑作用机理的开发战略。
【非专利文献】
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【发明的内容】
【想要解决的课题】
在此，辣椒的炭疽病、细菌性青枯病、斑纹病的防治很困难，本发明是为了解决这种病的方法，不仅直接抑制引起此病的霉菌和细菌病原菌的生长，还促进作为寄主植物辣椒的病免疫力增加和繁育，将具有全部效果的内生细菌从韩国国内根圈土壤中分离、培养，制剂，以开发出具有综合性植物强化(plant strengthener)功效的新型天然植物保护剂。
【课题的解决手段】
为了解决上述课题，本发明提供新的微生物多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株。
而且上记提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株的特点包含碱基序列16S rRNA遗传基因，同碱基序列用序列号1的号码记载，
还有上记提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株的特点,是对辣椒炭疽病菌、辣椒青枯病菌及苹果炭疽病菌组成的群中选择的1种以上病原菌，具有拮抗能力
另外，上记提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株的特点是，辣椒炭疽病的病原菌是尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)，茄子枯萎病的病原菌是青枯菌(Ralstonia Solanacearum)
此外，上记提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株的特点,是对果树黑枝枯萎病菌、桃子穿孔病菌，辣椒软腐病及辣椒点纹病菌组成的群中选择的1种以上病原菌，具有拮抗能力。
另外，上记提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株的特点是，辣椒软腐病的病原菌是果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)，辣椒点纹病菌的病原菌是疱病黄单胞菌(Xanthomonaseuvesicatoria)
此外，上记提供的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株的特点是，具有对辣椒的生育促进及诱导免疫性的功效。
另外，本发明提供含有上述菌株或其培养液的有效成分的微生物制剂。
另外，上述微生物制剂的特点是使用于肥料用途或天然植物保护剂用途。
【发明的效果】
据本发明，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90作为韩国国内土著细菌，在抗生素分泌和植物免疫性诱导作用下，同时可以抑制辣椒的重要的植物病炭疽病及细菌性青枯病、软病、斑纹病的发生，而具备果树重要细菌性病原菌生长抑制能力的多功能细菌，同时提可以供发挥天然植物保护剂及微生物肥料作用的优秀微生物
另外，尽管目前在全国范围内扩散，但对很难防治的果树黒枝枯萎病(烧伤病)及溃疡病原菌具有优秀的抗菌活性，同时可以提供具有诱导寄主植物的病免疫性及促进繁育效果的新型多功能微生物及利用同微生物的微生物制剂。
【图纸的简单说明】
图1，是本发明实施例子1中辣椒炭疽病病原菌抑制试验结果的照片。图1中A，表示分离微生物和病原菌的对峙培养试验结果，B显示出抑制活性好的菌株的抑制效果试验结果。
图2是表示JG90菌株的16S rRNA基因的碱基序列的图
图3是用JG90菌株的16S rRNA基因序列分析得出的***数的图纸。
图4是利用JG90菌株的基因分析(BOX-PCR)的标准菌株对比基因比较分析结果的照片。
图5是说明JG90菌株的辣椒炭疽病防治效果的各处理区的比较结果的照片。
图6是说明JG90菌株的苹果炭疽病防治效果的各处理区的比较结果
图7是说明JG90菌株的辣椒枯萎病防治效果的各处理区的比较结果
图8是JG90菌株的主要植物病源细菌抑制效果的照片。
图9是说明JG90菌株的桃子细菌穿孔病防治效果的各处理区比较结果的照片。
图10是说明JG90菌株对辣椒炭疽病免疫性诱导效果的处理区比较结果的照片。
图11是JG90菌株的辣椒生育及果实个数增加效果的照片。
图11中，(a)表示4周后，(b)表示8周后的效果。
图12是表示JG90菌株的辣椒生育促进效果的图表。
图13是根据JG90菌株的培养周基和培养期间，表示生长的图表。
【为实施发明的具体内容】
以下,通过实施例子详细说明本发明。在此前，本明细单及请求范围所使用的用语或单词，不能解释仅限于一般性或词典意义。发明者为用最好的方法说明自己的发明，能在合理定义原则之下定义用语概念,根据发明的技术思想，应该用符合意义来解释概念和含义。因此,本明细表中记载的实施例子构成，只是本发明最理想的实施例子，并且不全部代言发明的技术思想，所以该理解本申请时间可以代替它们的多样均等物和变形例子的存在。
发明者发现了具有寄主植物的病免疫性诱导和促进生育效果的新型多功能微生物，这微生物由于抗生素分泌和植物免疫性诱导作用，可以抑制辣椒的重要植物病炭疽病及细菌性青枯病、软病、斑纹病的发生，同时既具有果树重要细菌性病原菌生长抑制能力。
因此,本发明公开了新微生物多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus
polymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株。
以下使用实施例子，详细说明本发明。
实施例子1:JG46菌株的分离及鉴定
(1)JG90菌株分离
JG9菌株从产业土壤中的杂草芒草(Miscanthus sinensis)的根部内部组织中分离出来，它生长在晋州市文山邑(株)第一green。首先为了分离植物内生细菌，根部样品用自来水清洗后，切成小块，在1％NaOCl溶液中浸泡10分钟,进行表面杀菌。这些碎片用灭菌水清洗后,为了确认表面杀菌是否正常，将杀菌碎片1/10放在TSA培养基(Tryptic SoyBroth 3g、琼脂16g/蒸馏水1升)上，培养2～3天左右，在表面观察了细菌是否生长。取细菌几乎不生长的根部碎片1克，加入在高压灭菌器中被杀菌蒸馏水9毫升，用杀菌的酒钵和臼磨碎后，再加入将该液1毫升放入蒸馏水9毫升，依次稀释10倍(10-3、10-4、10-4、10-5)。将稀释液0.1毫升在1/10TSA培养基上倒下而均匀涂抹后，在28℃的培养基中培养1～2周。
将被生长的细菌350多种纯分离出来，这些菌株与辣椒炭疽病病原菌对持培育结果，如下列表1所示，选拔了抑制效果好的菌株15种(参照图1)
在选拔菌株中，最终选出了生长速度最适合于产品化的1种(JG No.90)，将其命名为JG90菌株。
下列表1中，细菌的拮抗能力，在28℃下培养4～6天之后，测量了菌丝生长抑制程度(+,<3mm；++,4-5mm；++,6-7mm)，R是杀菌剂抵抗性菌株,S是杀菌剂敏感性菌株。
【表1】
(2)JG90菌株的鉴定
为了鉴定上述分离的JG90菌株，确定16S rRNA基因的碱基序列(见1499bp,图2),与GenBank/EMBL/DDBJ的数据库进行互通性搜索，研究了***学位置。
图3中显示着用JG90菌株的16S rRNA基因序列分析做成的***数。图3中交点数显示出在1000次反复中出来的引导程序值(bootstrap value)。
另一方面，以下述类似标准菌株(type species)为对象，遗传基因组碱基序列的平均核酸同一性(ANI,average nucleotide identity)做好比较，其结果记载表2(见非专利文献24)
【表2】
| Hit taxon | ANI(％) | ANI coverage(％) |
| Paenibacillus polymyxa | 97.16 | 98 |
| Paenibacillus polymyxa ATCC 842(T) | 92.74 | 84 |
| Paenibacillus jamilae | 92.49 | 83.2 |
| Paenibacillus polymyxa E681 | 89.52 | 81.1 |
| Paenibacillus seodonensis DCT19(T) | 87.50 | 1.9 |
| Paenibacillus brasilensis PB172(T) | 87.39 | 65.9 |
| Paenibacillus kribbensis AM49(T) | 87.20 | 64.4 |
| Paenibacillus peoriae DSM 8320(T) | 86.78 | 62.1 |
| Paenibacillus maysiensis SX-49(T) | 86.49 | 59.1 |
| Paenibacillus barcinonensis BP-23(T) | 86.09 | 1.4 |
| Paenibacillus qingshengii S1-9(T) | 85.72 | 1 |
| Paenibacillus panacisoli Gsoil 1411T | 85.20 | 2.3 |
| Paenibacillus polysaccharolyticus | 85.19 | 1.1 |
| Paenibacillus illinoisensis NRRL | 84.95 | 1.5 |
| Paenibacillus massiliensis Smarlab | 84.68 | 2.2 |
参照表2，分离的JG90菌株在更准确的遗传学特性中，通过平均核酸同一性分析，把16s rRNA相似性分析结果，确认为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
图4显示，利用JG90菌株的基因分析(BOX-PCR)的标准菌株对比基因比较分析结果。用于基因分析(BOX-PCR)的聚合酶(polymerase)是Platinum Taq DNA polymeraseHigh Fidelity(Invitrogen),底层涂料(primer)使用了BOXAR1(5'-CATCGGCAAGGCGACGCTGACG-3)。PCR条件在初期变性(initial denaturation)是在95℃下反应7分钟、35次反复过程的变性(denaturation)、退火(anne aling)和延长(extension)分别在90℃花30秒，40℃1分钟，72℃3分钟，最后final extension在72℃反应10分钟，被增大。
对经过此过程获得的PCR产物，利用1％LE agarose gel(Seakem)，确认了增大与否。图4中显示出，M是1kb marker，1是JG22菌株，2是JG90菌株，3是JG91菌株，4是JG93菌株，5是(Paenibacillus jamiliae)KCTC13919、6是(Paenibacillus polymyxa)KACC10098，7是(Paenibacillus polymyxa)E681标准菌株
如图4所示，为了与JG90菌株学名相同或相似的标准菌株进行更详细的此较，进行了基因分析(BOX-PCR)，结果鉴定JG90菌株与标准菌株不同。
因此，本发明的微生物命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90菌株，并将其寄托给寄托机构，2020年11月24日从韩国生命工学研究院生物资源中心(KCTC：Korean Collection for Type Culture)被赋予了委托号码KCTC14388BP。
(3)JG90菌株的全基因组(whole genome)分析
为了分析上述分离的JG90菌株的全基因组，利用(株)chun lab的Trueback ID-Genome***和Ex Bio Cloud，确认鉴定并分析全基因，其结果显示在下表3中。
【表3】
| 菌株名称 | JG90 |
| Genome·size·(bp) | 5,630,584 |
| No.·of·contigs | 3 |
| DNA·G+C·content(％) | 45.33 |
| No.·of·CDSs | 5.186 |
| No_·of·rRNA·genes | 39 |
| No.·of·tRNA·genes | 111 |
| Mean·of·CDS·lengths·(bp) | 923.59 |
| Median·of·CDS·lengths·(bp) | 795 |
| Mean·of·intergenic·engths·(bp) | 165.77 |
| Nedian·of·intergenic·engths(bp) | 121 |
实施例子2：JG90菌株制剂的辣椒炭疽病防治效果鉴定
为了鉴定JG90菌株的辣椒炭疽病防治效果,如将粉末制剂化样本表4所示一样,在不同地区的两个地方调查了病防治效果。防治功效试验根据乱块法进行了无处理、JG90微生物剂3次反复调查,微生物剂稀释1000倍及2000倍,发病初期每隔10天进行4次经叶处理。防治价在经过最终微生物剂处理10天后,对每个处理区200果以上的发病和数量进行了调查,并显示发病和比率(％)。药害调查是在处理JG90微生物剂后，于7、14、21日进行了外观药害与否调查，但均无药害(见图5)。
下表4中显示了对JG90微生物剂的辣椒炭疽病的防治效果调查结果。从这些结果中确认了本微生物剂可用于辣椒炭疽病的防治。
【表4】
实例3:JG90菌株制剂的苹果炭疽病防治效果鉴定
为了鉴定JG90菌株的苹果炭疽病防治效果,将粉末制剂化样本表5所示一样,在苹果农场调查了病防治效果。防治功效试验根据完全任意配置法,进行了无处理、JG90微生物剂3次反复调查,微生物剂稀释1000倍及2000倍,发病初期每隔10天进行7次叶面喷洒处理。防治值在最终微生物剂处理10天后,对每处理区整个果的发病果数进行了调查,结果显示发病果率(％)。药害调查是在处理JG90微生物剂后的3、5、7日进行了外观药害与否调查，但均无药害(见图6)
下表5显示了，对JG90微生物剂的苹果炭疽病的防治效果调查结果。从这些结果中可以看出,本微生物剂可用于苹果炭疽病防治
【表5】
实施例子4:JG90菌株的辣椒青枯病防治效果鉴定
为了检验JG90菌株的辣椒青枯病防治效果,将粉末制剂化样本,在两个不同地区的试验地调查了病防治效果。防治功效试验根据乱块法进行了无处理、JG90微生物剂处理区3次反复地调查,微生物剂稀释1000倍及2000倍,发病初期每隔7天进行4次灌注处理。防治值在经过最终微生物剂处理7天后,对每处理区全体果树发病株数量进行了调查,结果显示发病株率(％)。药害调查是在JG90微生物剂处理后的7日、14日、21日进行了外观药害有无调查，但均未出现药害(见图7)。
下表6，显示了对JG90微生物剂的辣椒青枯病的防治效果调查结果。从这些结果中可以看出,本微生物剂可用于辣椒枯萎病防治
【表6】
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实施例子5:JG90菌株的主要植物病源细菌抑制效果
为了检验JG 90菌株的辣椒及果树的重要植物病源细菌斑纹病菌、软病菌、果树黑枝枯病菌及桃穿孔病菌的抑制功效,如下记调查病菌生长抑制效果
将JG90菌株在1/10TSB液体培养基以28℃进行72个小时震荡(180rpm)培养,用琼脂孔扩散法(agar well diffusion method)调查培养液的抑制程度。在培养基上铺设病原细菌,打孔直径10毫米的洞后,在洞内放入JG90菌株培养液100μl,确认洞周围形成的病原菌生长抑制程度,并将其结果在图8中显示出来。图8中(a)对果树黑枝枯萎病菌、(b)对辣椒软腐病菌及(c)对桃子细菌穿孔病菌具有抗菌效果。
参照图8可以看出,JG90培养液不仅对辣椒的炭疽病有很好的抑制效果,而且对病源细菌也有很好的抑制效果。
实施例子6:JG90菌株制剂的桃子细菌穿孔病防治效果鉴定
为了检验JG90菌株的桃子细菌穿孔病防治效果,调查了粉末制剂化样本的病防治功效。防治功效试验根据完全任意配置法,进行了无处理、JG90微生物剂3次反复调查,微生物剂稀释1000倍及2000倍,发病前每隔10天进行3次叶面处理。防治值在经过最终微生物剂处理11天后,对每个处理区200叶以上的发病叶数进行了调查,结果显示发病叶率(％)。药害调查是在JG90微生物剂处理后的3、5、7日进行了外观药害有无调查，但没有药害(见图9)。
下表7中显示了对JG90微生物剂的桃子细菌孔病的试验地防治效果调查结果。从这些结
果中可以看出,本微生物剂可用于防治桃子细菌穿孔病
【表7】
实施例子7:JG90菌株的辣椒免疫性诱导功效鉴定
为了鉴定JG90菌株的辣椒免疫性诱导效果,如下所示,调查了防治效果
发芽辣椒种子(颜色)后，在放入园艺用床土的陶盆(直径10cm)播种，从植物生育床(28～30℃、相对湿度80％以上、黑暗16小时、光8小时)到3～4叶期为止，育苗后，处理了在陶盆地辣椒根圈周围上JG90菌株培养液(0.5TSB、28℃、48h、160rpm、O.D≥1)10ml。菌株处理3天后,将在燕麦琼脂(oatmeal agar)培养基培养约3周的辣椒炭疽病菌Colletotrichum coccodes的菌丝盘放在辣椒苗上。将病菌盘1个放在每株叶子2个,,反复接种5次,共接种10个叶子。用塑料布覆盖病菌接种处理过的端口,调查在生育床6天后发生的病斑坏死程度。发病度分为0～3(0:无病征健康，1:菌丝盘周围叶片10％左右病斑，2:菌丝盘周围叶片30％～50％左右病斑，3:菌丝盘周围叶片50％以上坏死)，发病率根据病调查取得的发病程度，根据以下数学式1计算得出。
[数学式1]
发病率(％)＝{[(发病叶片数×1)+(发病叶片数×2)+(发病叶片数×3)]/调查叶数×3}×100
下表8中显示EG90菌株土壤根圈处理对辣椒炭疽病的防治效果调查结果，图10中显示说明辣椒炭疽病免疫性诱导效果的各处理区比较照片
【表8】
参照表8及图10,JG90菌株悬浮液在土壤中处理3天后接种病菌,对防治效果进行调查的结果显示,仅处理病原菌的叶子的发病率为2.4±0.8,JG90菌株处理区为0.9±0.7,显示62.5％的防治价位可确认寄主炭疽病免疫性诱导效果优秀。
实施例子8:JG90菌株对促进辣椒繁育的功效鉴定
为了鉴定通过JG90菌株处理促进辣椒生长的功效,如下所示,调查植物生长的功效。
将辣椒种子(颜色)发芽后,在放入园艺用床土的陶盆Pot(直径10cm)播种,从植物生长床(28～30℃,相对湿度80％以上,黑暗16小时,光8小时)到3～4叶期为止,育苗后，将JG90菌株培养液(0.5TSB,28℃,48h,160rpm,O.D≥1)10ml喷雾处理在辣椒根圈。菌株处理后在植物生育床种植两周后,分别调查茎、根的生长程度及纯重量。对照区只处理着同等数量的培养基(0.5TSB)。每种处理3次反复，每次使用5株的植物。在下表9中,显示了JG90菌株促进辣椒生长的功效调查结果。
【表9】
参照表9,将JG90菌株悬浮液处理在土壤中的两周后,对辣椒的纯重量和根及茎的长度进行了调查,结果显示,经过JG90菌株处理,纯重量比无处理区11.4克有所增加,为12.0克,但没有显著差异。但是根部的长度比无处理区的14.0厘米长，为18.0厘米而更长,但茎的长度没有差异。如上所述,在繁育床培育的苗子，再次移栽到大陶盆(直径18厘米)上,在露地栽培了2个月,调查了繁育状态,结果也显示在图11及图12。
参照图11及12,可以看出处理JG90菌株的辣椒与无处理区相比,植物高度等繁育明显提高。从这个结果来看,幼苗期通过JG90菌株处理,辣椒根的繁育及茎的促进效果得到确认,预计生长后辣椒的收获量可以增加。
实施例子9:JG90按菌株的培养基和培养时间生长比较
为了实现JG90菌株的制剂化,为了寻找大量培养及适当的生长条件,在5种培养基(GM、SYM、NB、TSB及0.5TSB)中，分别测定了12、24、36、48、60及72小时的吸光度(600nm),结果在图13中显示。
参照图13,在培养第48小时的JG90菌株在3种SYM、TSB及0.5TSB培养基中显示出最高吸光度,确认适合于培养。使用的培养基使用了正在销售的Difco培养基,主要成分如下：GM；Soypepton 2g,Yeast Extract 1g,Sucrose 0.5g,MgSO44g,MgCl22g,NaCl 10g,SYM:Yeast Extract 5g,Sucrose 10g,NB:Beef Extract 3g,Peptone 5g,TSB:Pancreaticdigest of Casein 17g,Papaic digest of soybean 3g,Dextrose 2.5g,SodiumChloride 5g,Dipotassium Phosphate 2.5g,0.5TSB:Pancreatic digest of Casein8.5g,Papaic digest of Soybean 1.5g,Dextrose 1.25g,Sodium Chloride 5g,Dipotassium Phosphate 1.25g.
实施例子10:JG90菌株的制剂过程
为了进行JG90菌株的产品,为了在活性与保管期间保持密度,如下记一样,制成了粉末和液体形态。
| 区分 | 纯重量(g) | 根部长度(cm) | 茎的长度(cm) |
| 无处理 | 11.4a | 14.0a | 26.0a |
| JG90微生物剂 | 12.0a | 18.0b | 26.5a |
将菌株在大型发酵机(1吨以上)中培养后，获得的细菌培养液或离心分离后获得的菌体，与geolite、kaolin、bentonite、peat等粘土矿物以1:100的重量比混合,在低温下晾干后均匀粉碎,制成粉末状膏状剂。同时将菌培养体与上述粘土矿物以1:100的重量比混合制成液体悬浮液形态
对上述制剂样品的密度进行调查的结果显示，大部分制剂含有109cfu/g以上，与粘土矿物混合制剂的液制悬浮液也含有109cfu/ml以上的密度。
以上所说明的本发明的实际实施例子，是为了解决技术课题而公开的,如果在属于本发明的技术领域具有通常知识的人,可以在本发明的思想及范围之内进行多种修改、变更、附加等,这种修改变更等属于以下专利请求范围之内。
[受托机构]
寄托机构名称:韩国生命工学研究院
受托编号:KCTC14388BP
受托日期:20201124
Claims (9)
1.新微生物多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株。
2.在第1项中，
上述菌株包括以序列号1记载的碱基序列的16SrRNA基因为特征的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株。
3.在第1项中，上述菌株是对于由辣椒炭疽病菌、辣椒枯萎病菌及苹果炭疽病菌组成的群中选择的1种以上病原菌具有拮抗力为特征的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus
polymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株。
4.在第三项中，上述辣椒炭疽病及上述辣椒枯萎病的病原菌分别为Colletotrichumacutatum和Ralstonia solanacearum为特征的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株。
5.在第1项中，上述菌株是对于由果树黑枝枯萎病菌、桃子穿孔病菌、辣椒软腐病菌及辣椒斑纹病菌组成的群中选择的1种以上病原菌具有拮抗力为特征的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90(受托编
号:KCTC14388BP)菌株。
6.在第五项中，上述辣椒软腐病病菌及上述辣椒斑纹病的病原菌分别以
Pectobacterium Carotovorum及Xanthomonas Euvesicatoria为特征的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株。
7.在第1项中，上述菌株以促进辣椒的植物生长及诱导免疫性功效为特征的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)JG90(受托编号:KCTC14388BP)菌株。
8.含有第1项至第7项中的某项菌株或其培养液的有效成分的微生物制剂。
9.在第8项中
上述微生物制剂是以肥料用或天然植物保护剂为特征的微生物制剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310161219.9A CN117701412A (zh) | 2023-02-23 | 2023-02-23 | 具有辣椒炭疽病和细菌病防治及生育促进效果的多功能天然植物保护剂的开发 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310161219.9A CN117701412A (zh) | 2023-02-23 | 2023-02-23 | 具有辣椒炭疽病和细菌病防治及生育促进效果的多功能天然植物保护剂的开发 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117701412A true CN117701412A (zh) | 2024-03-15 |
Family
ID=90143028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310161219.9A Pending CN117701412A (zh) | 2023-02-23 | 2023-02-23 | 具有辣椒炭疽病和细菌病防治及生育促进效果的多功能天然植物保护剂的开发 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117701412A (zh) |
-
2023
- 2023-02-23 CN CN202310161219.9A patent/CN117701412A/zh active Pending
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