JP6210484B2 - 鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法 - Google Patents
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(1)
第1のオリゴヌクレオチド(ODN1)と第2のオリゴヌクレオチド(ODN2)とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド(ただし、
ODN2は、ODN1とハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB1)を有し、このHYB1に隣接して、ODN1とハイブリダイズしない塩基配列(NHYB1)を有し、
ODN2は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ODN1は、ODN2のHYB1の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ODN2のNYYB1の領域においては一本鎖となっている。)と、
第3のオリゴヌクレオチド(ODN3)(ただし、
ODN3は、ODN2のHYB1及びNHYB1にハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB2)を連続して有し、
ODN3は、ODN2の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。)とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、
を含む、ODN1とODN2の二重鎖が鎖交換されてODN3とODN2の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。
(2)
第1のオリゴヌクレオチド(ODN1)と第4のオリゴヌクレオチド(ODN4)とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド(ただし、
ODN4は、ODN1とハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB1)を有し、このHYB1に隣接して、ODN1とハイブリダイズしない塩基配列(NHYB1)を有し、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ODN4のNYYB1の領域においては一本鎖となっている。)と、
第5のオリゴヌクレオチド(ODN5)(ただし、
ODN5は、ODN4のHYB1及びNHYB1にハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB2)を連続して有し、
ODN5は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ODN4は、ODN5の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。)とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、
を含む、ODN1とODN4の二重鎖が鎖交換されてODN5とODN4の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法。
光応答性修飾塩基が、核酸塩基の塩基部分として、次の式I:
R1及びR2は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
N−は、Nの一価基を表す。)
で表される人工塩基を有する光応答性修飾塩基である、(1)〜(2)のいずれかに記載の方法。
光応答性修飾塩基と光架橋可能な塩基が、シトシン、ウラシル、チミン、シュードウラシル及びシュードチミンからなる群から選択された1種以上の塩基である、(3)に記載の方法。
(5)
光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置が、光応答性修飾塩基の5’末端側に隣接する塩基と相補的な位置である、(3)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)
ODN1とハイブリダイズしない塩基配列(NHYB1)が、ODN1とハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB1)の5’末端側又は3’末端側に隣接している、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)
光照射が、366nmの波長を含む光の光照射である、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8)
光照射が、0.01〜30秒間の光照射である、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)
光照射が、0〜70℃の範囲の温度で行われる、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)
鎖交換反応前の二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの1本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る1本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させて、
鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドが製造されたことが、蛍光発光によって検出可能である、(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(11)
ODN2が、HYB1の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有している、(1)に記載の方法。
(12)
ODN2のHYB1の塩基配列が、光応答性修飾塩基の位置を除いて、ODN1と相補的な塩基配列であり、
ODN3のHYB2の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置、及び光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置を除いて、ODN2と相補的な塩基配列である、(1)又は(11)に記載の方法。
(13)
ODN5が、HYB2の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有している、(2)に記載の方法。
(14)
ODN4のHYB1の塩基配列が、ODN1と相補的な塩基配列であり、
ODN4のHYB2の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置を除いて、ODN5と相補的な塩基配列である、(2)又は(13)に記載の方法。
(21)
第1のオリゴヌクレオチド(ODN1)と第2のオリゴヌクレオチド(ODN2)とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド(ただし、
ODN2は、ODN1とハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB1)を有し、このHYB1に隣接して、ODN1とハイブリダイズしない塩基配列(NHYB1)を有し、
ODN2は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ODN1は、ODN2のHYB1の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ODN2のNYYB1の領域においては一本鎖となっている。)。
(22)
ODN2が、HYB1の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有している、(21)に記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
光応答性修飾塩基が、核酸塩基の塩基部分として、次の式I:
R1及びR2は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
N−は、Nの一価基を表す。)
で表される人工塩基を有する光応答性修飾塩基である、(21)〜(22)のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
光応答性修飾塩基と光架橋可能な塩基が、シトシン、ウラシル、チミン、シュードウラシル及びシュードチミンからなる群から選択された1種以上の塩基である、(23)に記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
(25)
光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置が、光応答性修飾塩基の5’末端側に隣接する塩基と相補的な位置である、(23)〜(24)のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
(26)
ODN1とハイブリダイズしない塩基配列(NHYB1)が、ODN1とハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB1)の5’末端側又は3’末端側に隣接している、(21)〜(25)のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
(27)
二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの1本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る1本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させた、(21)〜(26)のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
(28)
二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの1本の鎖が、担体に固定されてなる、(21)〜(27)のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
(29)
二重鎖オリゴヌクレオチドが、折り返された1本のオリゴヌクレオチド鎖によって形成されたものである、(21)〜(28)のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
[鎖交換反応の概要]
本発明によれば、二重らせんを形成した二重鎖オリゴヌクレオチドの鎖の1本を、外部から添加した一本鎖のオリゴヌクレオチドの鎖と速やかに交換して、新しい二重鎖オリゴヌクレオチドを得ることができる。すなわち、本発明は、速やかな鎖交換反応によって、新しい組み合わせの二重鎖オリゴヌクレオチドを速やかに製造する方法である。本発明による高速化の原理は、オリゴヌクレオチド鎖に光応答性修飾塩基を導入して、光架橋を行うことによって、新しく製造される二重鎖オリゴヌクレオチドの生成が、熱力学的に有利なものとなるように導くことにある。
したがって、本発明の好適な実施の一態様は、第1のオリゴヌクレオチド(ODN1)と第2のオリゴヌクレオチド(ODN2)とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド(ただし、ODN2は、ODN1とハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB1)を有し、このHYB1に隣接して、ODN1とハイブリダイズしない塩基配列(NHYB1)を有し、ODN2は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、ODN1は、ODN2のHYB1の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、二重鎖オリゴヌクレオチドは、ODN2のNYYB1の領域においては一本鎖となっている。)と、第3のオリゴヌクレオチド(ODN3)(ただし、ODN3は、ODN2のHYB1及びNHYB1にハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB2)を連続して有し、ODN3は、ODN2の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。)とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、を含む、ODN1とODN2の二重鎖が鎖交換されてODN3とODN2の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法、にある。
したがって、本発明の好適な実施の一態様は、第1のオリゴヌクレオチド(ODN1)と第4のオリゴヌクレオチド(ODN4)とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド(ただし、ODN4は、ODN1とハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB1)を有し、このHYB1に隣接して、ODN1とハイブリダイズしない塩基配列(NHYB1)を有し、二重鎖オリゴヌクレオチドは、ODN4のNYYB1の領域においては一本鎖となっている。)と、第5のオリゴヌクレオチド(ODN5)(ただし、ODN5は、ODN4のHYB1及びNHYB1にハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB2)を連続して有し、ODN5は、塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、ODN4は、ODN5の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。)とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、を含む、ODN1とODN4の二重鎖が鎖交換されてODN5とODN4の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法、にある。
本発明の好適な実施の態様において、鎖交換に使用されるオリゴヌクレオチドの長さには特に制約はない。例えば、鎖交換されるオリゴヌクレオチド鎖のHYB1の塩基配列の長さが、4〜40000塩基、10〜10000塩基、10〜1000塩基、10〜100塩基などとすることができる。塩基配列が長い場合においても、本発明による光架橋は、熱力学的な原理から、鎖交換反応を有効に高速化する。本発明で1本のオリゴヌクレオチド鎖に導入される光応答性修飾塩基の数は、1個に限られるものではなく、例えば、1個以上、例えば、1〜l00個、1〜10個、1〜5個とすることができる。したがって、塩基配列が長い場合に、高速化の程度を、所望の程度にまで高めるために、複数の光応答性修飾塩基をオリゴヌクレオチド鎖に導入して、複数箇所で光架橋を形成させることも、本発明の範囲内である。また、鎖交換されるオリゴヌクレオチド鎖のNHYB1の長さも特に制約はないが、このNHYB1の領域は、二重鎖から露出する一本鎖部分となって、外部から添加した一本鎖オリゴヌクレオチドが最初に付着する部分となるので、その役割を果たす程度の長さがあれば十分であり、例えば、NHYB1の塩基配列の長さが、4〜24塩基、4〜16塩基、6〜12塩基などとすることができる。ODN2又はODN4のオリゴヌクレオチド鎖において、NHYB1の塩基配列は、HYB1の塩基配列の5’末端側又は3’末端側に隣接して位置しており、いずれの位置とするかについては、当業者が適宜選択することができる。好適な実施の態様において、例えば、NHYB1の塩基配列は、ODN2又はODN4のオリゴヌクレオチド鎖において、HYB1の塩基配列の5’末端側に隣接させることができる。
光応答性修飾塩基としては、上記原理を実現可能な光応答性修飾塩基であれば使用することができるが、好適に使用可能な光応答性修飾塩基としては、次式I:
本発明による鎖交換反応の高速化は、その原理が光化学反応にあるので、後述する光照射の条件を妨げない限り、鎖交換反応において使用される公知の条件を、特に制限無く使用することができる。例えば、溶液としては、水溶液を使用することができ、公知の塩類、公知の緩衝液、を所望により使用することができる。このような緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、カコジル酸緩衝液、等をあげることができる。このような塩類としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等を挙げることができ、例えば、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2等をあげることができるが、これらに限られるものではない。また、例えば、溶液のpHは、鎖交換反応に使用される公知のpHを使用することができ、例えば、pH5.0〜pH8.0、pH6.0〜pH7.5等とすることができる。また、鎖交換反応に先立って、二重鎖オリゴヌクレオチドを用意するために、適宜、アニーリング等を行ってもよい。また、本発明の鎖交換反応は、広汎な条件下で行うことができることから、この鎖交換反応をPCRのプロセスと組み合わせて、PCRで使用される条件下で行うこともできる。
光架橋を形成させるための光照射は、一般に330〜370nmの範囲、好ましくは330〜360nmの波長を含む光を使用することができる。また、好適な実施の態様において、366nmの波長を含む光、特に好ましくは、366nmの単波長のレーザー光を使用することができる。鎖交換反応に有利に、光架橋反応を進行させるために、例えば、0〜70℃の範囲の温度、例えば0〜40℃の範囲の温度、例えば20〜40℃の範囲の温度で、光照射を行うことができる。この光架橋は、光反応を使用しているために、光照射時のpH、塩濃度などに特段の制約がない点で有利である。この光架橋の形成は、光照射によって極めて迅速に進行するために、光照射の時間は、極めて短時間で十分であり、例えば、0.01〜30秒間、0.01〜20秒間、0.05〜10秒間、0.1〜10秒間、0.1〜5秒間、0.1〜1秒間などの光照射時間とすることができる。光照射によって生じる光架橋は、共有結合であって、十分に安定であり、例えば、二重鎖オリゴヌクレオチドが完全に解離してしまうような強い変性条件下においても、切断されることはない。この光架橋によって、鎖交換反応が、熱力学的に有利となり、迅速に進行する。
鎖交換反応によって、開始時に存在した二重鎖オリゴヌクレオチドが消耗して、新しい組み合わせの二重鎖オリゴヌクレオチドが生成したことは、公知の手段によって検出することができる。例えば、分子量の変化があればPAGE等の手段でそれを検出してもよく、いずれかの鎖を公知の手段で標識しておいて、PAGE等と組み合わせて検出してもよい。好適な実施の態様において、蛍光発光色素分子と蛍光消光分子とを用いた検出を行うことができる。例えば、鎖交換反応前の二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの1本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る1本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させれば、鎖交換反応前の二重鎖オリゴヌクレオチドは蛍光発光しない。しかし、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドが製造されると、蛍光発光色素分子は蛍光消光分子から離れて、蛍光発光可能となる。蛍光発光分子が鎖交換反応によって一本鎖として遊離するようにしてもよく、蛍光発光分子が鎖交換反応によって二重鎖として残るようにしてもよい。また、このような蛍光発光分子や蛍光消光分子を含めて、所望の標識の部位をいずれかのオリゴヌクレオチドの鎖に結合させて使用する態様もまた、本発明の範囲内である。さらに、このような検出を容易にするために、いずれかのオリゴヌクレオチドの鎖を、担体や固定基板に結合させて使用する態様もまた、本発明の範囲内である。また、上記のように鎖交換反応を検出することによって、鎖交換反応が可能な、二重鎖オリゴヌクレオチド、あるいは外部の一本鎖オリゴヌクレオチドが存在することを検出するということができる。したがって、本発明は、高速化された鎖交換反応によって、二重鎖オリゴヌクレオチド、あるいは外部の一本鎖オリゴヌクレオチドを、検出する方法にもある。
次の式V:
上記で製造したODN1、ODN2、ODN3を使用して、次のスキーム2(Scheme2)に示す鎖交換反応を行って、その進行を変性PAGE解析で確認した。この実施例で使用するODN1、ODN2、ODN3の番号付けは、本明細書の「課題を解決するための手段」や「発明を実施するための形態」におけるODN1、ODN2、ODN3にそれぞれ相当する。
500nM ODN1と500nM ODN2をバッファー(100mM NaCl,50mMカコジル酸ナトリウム)中で70℃で5分間加熱した後、37℃もしくは25℃で1時間以上放置し、アニーリングを行った。その後、ODN3を最終濃度が500nMとなるように加え、すぐUV−LED照射機を用い、366nmのUV照射を37℃もしくは25℃で行った。光照射時間は0,0.1,0.5,1,2,5,10,15秒(s)行った。それぞれのサンプルを変性PAGEによる解析を行い、光架橋を介した鎖交換反応の速度解析を行った。その結果を図1に示す。
次の表2に示すODN4、ODN5、ODN6を使用して、実験を行った。これらのODNを使用して、次のスキーム3(Scheme3)に示す鎖交換反応を行った。
500nM ODN4と500nM ODN5をバッファー(100mM NaCl,50mMカコジル酸ナトリウム)中で70℃で5分間加熱した後、37℃もしくは25℃で1時間以上放置し、アニーリングを行った。その後、ODN3を最終濃度が500nMとなるように加え、蛍光分光光度計を用い、Cy3の蛍光強度の変化を測定した。その結果を図3に示す。
光架橋の有無による鎖交換反応の比較を図4にまとめた。図4は、光架橋の有無による鎖交換反応のグラフを対比した図である。ここからわかるように、光架橋した場合は、光架橋しない場合と比較して、5秒間で70%以上の鎖交換反応が進行しており、25℃と37℃のいずれの温度であっても、鎖交換反応の進行の圧倒的な加速が確認された。
鎖交換反応の開始時点において、形成されている二重らせんにはCNVKが導入されておらず、遊離のODNにCNVKが導入されている実験系を使用して、鎖交換反応を解析した。実験には、次の表4に示すODN1、ODN6、ODN7を使用した。これらのODNを使用して、次のスキーム4(Scheme4)に示す鎖交換反応を行った。この実施例で使用するODN1、ODN6、ODN7の番号付けは、本明細書の「課題を解決するための手段」や「発明を実施するための形態」におけるODN1、ODN4、ODN5にそれぞれ相当する。
500nM ODN1と500nM ODN6をバッファー(100mM NaCl,50mMカコジル酸ナトリウム)中で70℃で5分間加熱した後、37℃もしくは25℃で1時間以上放置し、アニーリングを行った。その後、ODN7を最終濃度が500nMとなるように加え、すぐUV−LED照射機を用い、366nmのUV照射を37℃もしくは25℃で行った。光照射時間は0,0.1,0.5,1,5,10,15秒行った。それぞれのサンプルを変性PAGEによる解析を行い、光架橋を介した鎖交換反応の速度解析を行った。その結果を図5に示す。
次の表5に示すODN4、ODN5、ODN8を使用して、実験を行った。これらのODNを使用して、次のスキーム5(Scheme5)に示す鎖交換反応を行った。
500nM ODN4と500nM ODN5をバッファー(100mM NaCl,50mMカコジル酸ナトリウム)中で70℃で5分間加熱した後、37℃もしくは25℃で1時間以上放置し、アニーリングを行った。その後、ODN8を最終濃度が500nMとなるように加え、蛍光分光光度計を用い、Cy3の蛍光強度の変化を測定した。その結果を図7に示す。
Claims (13)
- 第1のオリゴヌクレオチド(ODN1)と第2のオリゴヌクレオチド(ODN2)とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド(ただし、
ODN2は、ODN1とハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB1)を有し、このHYB1に隣接して、ODN1とハイブリダイズしない塩基配列(NHYB1)を有し、
ODN2は、HYB1の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ODN1は、ODN2の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ODN2のNHYB1の領域においては一本鎖となっている。)と、
第3のオリゴヌクレオチド(ODN3)(ただし、
ODN3は、ODN2のHYB1及びNHYB1にハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB2)を連続して有し、
ODN3は、ODN2の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。)とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、
を含む、ODN1とODN2の二重鎖が鎖交換されてODN3とODN2の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法であって、
光応答性修飾塩基が、核酸塩基の塩基部分として、次の式I:
R1及びR2は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
N−は、Nの一価基を表す。)
で表される人工塩基を有する光応答性修飾塩基である、方法。 - 第1のオリゴヌクレオチド(ODN1)と第4のオリゴヌクレオチド(ODN4)とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド(ただし、
ODN4は、ODN1とハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB1)を有し、このHYB1に隣接して、ODN1とハイブリダイズしない塩基配列(NHYB1)を有し、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ODN4のNHYB1の領域においては一本鎖となっている。)と、
第5のオリゴヌクレオチド(ODN5)(ただし、
ODN5は、ODN4のHYB1及びNHYB1にハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB2)を連続して有し、
ODN5は、HYB1にハイブリダイズ可能な塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ODN4は、ODN5の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有している。)とを、水溶液中で、光照射して、光架橋させる工程、
を含む、ODN1とODN4の二重鎖が鎖交換されてODN5とODN4の二重鎖となった、鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドの製造方法であって、
光応答性修飾塩基が、核酸塩基の塩基部分として、次の式I:
R1及びR2は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
N−は、Nの一価基を表す。)
で表される人工塩基を有する光応答性修飾塩基である、方法。 - 光応答性修飾塩基と光架橋可能な塩基が、シトシン、ウラシル、チミン、シュードウラシル及びシュードチミンからなる群から選択された1種以上の塩基である、請求項1〜2のいずれかに記載の方法。
- 光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置が、光応答性修飾塩基の5’末端側に隣接する塩基と相補的な位置である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- ODN1とハイブリダイズしない塩基配列(NHYB1)が、ODN1とハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB1)の5’末端側又は3’末端側に隣接している、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 光照射が、366nmの波長を含む光の光照射である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 光照射が、0.01〜30秒間の光照射である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 鎖交換反応前の二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの1本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る1本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させて、
鎖交換された二重鎖オリゴヌクレオチドが製造されたことが、蛍光発光によって検出可能である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - ODN2のHYB1の塩基配列が、光応答性修飾塩基の位置を除いて、ODN1と相補的な塩基配列であり、
ODN3のHYB2の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置、及び光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置を除いて、ODN2と相補的な塩基配列である、請求項1に記載の方法。 - ODN4のHYB1の塩基配列が、ODN1と相補的な塩基配列であり、
ODN5のHYB2の塩基配列が、光応答性修飾塩基と相補的な位置を除いて、ODN4と相補的な塩基配列である、請求項2に記載の方法。 - 第1のオリゴヌクレオチド(ODN1)と第2のオリゴヌクレオチド(ODN2)とがハイブリダイズしてなる二重鎖オリゴヌクレオチド(ただし、
ODN2は、ODN1とハイブリダイズ可能な塩基配列(HYB1)を有し、このHYB1に隣接して、ODN1とハイブリダイズしない塩基配列(NHYB1)を有し、
ODN2は、HYB1の塩基配列中に、光応答性修飾塩基を有し、
ODN1は、ODN2の光応答性修飾塩基が光架橋可能な位置に光架橋可能な塩基を有しておらず、
二重鎖オリゴヌクレオチドは、ODN2のNHYB1の領域においては一本鎖となっており、
光応答性修飾塩基が、核酸塩基の塩基部分として、次の式I:
R1及びR2は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
N−は、Nの一価基を表す。)
で表される人工塩基を有する光応答性修飾塩基である。)。 - 二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの1本の鎖に、蛍光発光色素分子を結合させ、残る1本の鎖に、該蛍光発光色素分子を消光可能となる位置で蛍光消光分子を結合させた、請求項11に記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
- 二重鎖オリゴヌクレオチドのいずれかの1本の鎖が、担体に固定されてなる、請求項11〜12のいずれかに記載の二重鎖オリゴヌクレオチド。
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