JP3708210B2 - 抗線維芽細胞増殖因子−8モノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、線維芽細胞増殖因子−8によって増殖するヒト腫瘍細胞の病態解析および治療に有用であり、線維芽細胞増殖因子−8に特異的に反応し、かつ中和活性を有する、すなわち、線維芽細胞増殖因子−8活性を阻害するモノクローナル抗体を提供する。
【0002】
【従来の技術】
アンドロジェン誘導増殖因子(AIGF)は、1992年、性ホルモン依存的増殖を示すマウス乳癌細胞株SC−3〔Shionogi Carcinoma-3:J.Steroid Biochem.27, 459(1987) 〕の培養上清中より単離された因子である。AIGFは、アンドロジェン刺激により誘導産生され、オートクライン的にSC−3細胞を増殖させる増殖因子である[Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.89, 8928ー8932, (1992)]。遺伝子クローニングの結果、FGFファミリーとアミノ酸レベルで30〜40%のホモロジーがあることが示され、線維芽細胞増殖因子−8(以下、FGF−8と略す。)と命名された。その後、マウスFGF−8をプローブとしてヒト胎盤ゲノムライブラリーよりヒトFGF−8がクローン化され、マウスFGF−8と塩基レベルで85%、アミノ酸レベルで100%一致することが示された[FEBS Letters, 363, 226(1995)]。従来より、前立腺癌や乳癌など性ホルモン依存的増殖を示す腫瘍においては、性ホルモン誘導性の増殖因子がオートクライン的に作用していると推測されてきたが、FGF−8の単離およびクローニングは、マウスの系ではあるが、初めてそのメカニズムを実証するものであった。ヒトにおいても同様のメカニズムでFGF−8が発癌や腫瘍の増殖に関与していることが推察されるが、これまでのところ明確な証拠は得られていない。しかし、前立腺癌や乳癌のいくつかのヒト腫瘍細胞株でFGF−8のメッセンジャーRNAの発現が認められること、さらにCHO細胞で発現させたFGF−8をこれらの細胞株や繊維芽細胞の細胞株の培養系に添加すると増殖の促進が認められることから[FEBS Letters, 363, 226(1995)]、FGF−8が性ホルモン依存性腫瘍にオートクラインあるいはパラクライン的に作用する増殖因子の一つである可能性は十分にあると思われる。
【0003】
したがってFGF−8に対する抗体は、上記に示した腫瘍細胞におけるFGF−8の役割や生物学的機能の解析、さらには前立腺癌および乳癌等の免疫学的検出による診断に有効である。さらに中和活性を有する抗体であれば、FGF−8の生物活性を研究するうえで役立つと考えられ、また、前述の癌治療に有効であるとも考えられる。
【0004】
これまでのところFGF−8に対するモノクローナル抗体は取得されていない。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、前立腺癌や乳癌などのホルモン依存性腫瘍の増殖因子である可能性があるFGF−8に特異的に反応し、さらにFGF−8の活性を阻害する性質を有するモノクローナル抗体を提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、FGF−8の部分ペプチドを免疫原に用いてハイブリドーマを作製し、該ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を確立し、該ハイブリドーマを培地中に培養するか動物に投与して腹水癌化し、培養上清または腹水を採取することによりモノクローナル抗体を得た。これを用いてウエスタンブロッティングを行い、該モノクローナル抗体がFGF−8蛋白に反応することを見い出し、さらに性ホルモン依存的増殖を示すマウス乳癌細胞株SC−3の培養液中に該モノクローナル抗体を添加し、該モノクローナル抗体がFGF−8活性を阻害すること、すなわち、FGF−8に対する中和活性を見いだした。
【0007】
本発明は、FGF−8に特異的に反応し、かつ、FGF−8活性を阻害するモノクローナル抗体に関する。
本発明のFGF−8に特異的に反応するモノクローナル抗体(以下、抗FGF−8と称す)の具体例としては、ハイブリドーマ細胞株KM1334が生産する抗FGF−8モノクローナル抗体KM1334をあげることができる。
【0008】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
(1)抗原の調製
抗FGF−8モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原としては、FGF−8を産生する細胞あるいはその細胞画分、またはFGF−8をコードするDNAにより形質転換された宿主細胞、すなわち、大腸菌などの原核性宿主細胞および昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核性宿主細胞中に、FGF−8をコードするcDNAの全長または部分断片を公知の方法を用いて組み込み、そのままあるいは融合蛋白として発現、精製された蛋白質、さらには、ペプチド合成機を用いて合成されたFGF−8の部分ペプチド等を用いることができる。
【0009】
抗原として用いるペプチドは免疫原性を高めるために、架橋剤を用いてキャリアタンパクと結合させる。キャリアタンパクとしてはキーホールリンペットヘモシアニン(以下KLHと略す。)、ウシ血清アルブミン(以下BSAと略す。)あるいはサイログロブリン(以下THYと略す。)などがある。架橋剤としてはグルタールアルデヒドやN-(m-マレイミドベンゾイルオキシ)スクシンイミド(以下MBSと略す。)などがある。
【0010】
(2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
3〜20週令のマウスまたはラットに、(1)に示した方法で作製された抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント(Complete Freund’s Adjuvant)または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、1回目の投与の後1〜2週間おきに5〜10回行う。各投与後3〜7日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法(ELISA法):医学書院刊 1976年〕などで調べる。免疫に用いたペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源として供する。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後3〜7日目に、免疫したマウスまたはラットより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓を血清無添加の基礎培地(以下洗浄用培地という。)中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH7.65)で1〜2分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として提供する。
【0011】
(3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1(P3−U1)〔カレント・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・アンド・イムノロジィ−1(Current Topics in Microbiology and Immunology-1) 、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジィ(European J. Immunology)6, 511-519 (1976) 〕、SP2/O−Ag14(SP−2)〔ネイチャー(Nature)276, 269-270 (1978)〕、P3−X63−Ag8653(653)〔ジャーナル・オブ・イムノロジィ(J. Immunology )123 ,1548-1550 (1979) 〕、P3−X63−Ag8(X63)〔ネイチャー(Nature)256, 495-497 (1975) 〕などが用いられる。これらの細胞株は、8−アザグアニン培地〔RPMI-1640 培地にグルタミン(1.5mM )、2−メルカプトエタノール(5 ×10-5M)、ジェンタマイシン(10μg/ml)および牛胎児血清(FCS)を10%加えた培地(以下、正常培地という。)に、さらに8−アザグアニン(15μg/ml)を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日2 ×107 個以上の細胞数を確保する。
【0012】
(4)細胞融合
(2)で免疫した抗体産生細胞と(3)で得られた骨髄腫細胞を洗浄用培地またはPBS(リン酸二ナトリウム1.83g 、リン酸一カリウム0.21g 、食塩7.65g 、蒸留水1リットル、pH7.2 )でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合させる。細胞回収後、細胞をよくほぐし、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1,000(PEG−1,000)2g、洗浄用培地2mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液0.2〜1ml/108 抗体産生細胞を加え、1〜2分間毎に洗浄用培地1〜2mlを数回加え、全量が50mlになるまで洗浄する。細胞回収後、ゆるやかに細胞をほぐしながら、HAT培地〔正常培地にヒポキサンチン(10-4M)、チミジン(1.5 ×10-5M)およびアミノプテリン(4 ×10-7M)を加えた培地〕100ml中に懸濁する。この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルずつ分注し、5%CO2 インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり、例えば(5)に述べる酵素免疫測定法あるいはFACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting の略)などを用いて、FGF−8部分ペプチドに特異的に反応する抗体を選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを2回繰り返し〔1回目は、HT培地(HAT培地からアミノプテリンを除いた培地)、2回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗FGF−8モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【0013】
(5)抗FGF−8モノクローナル抗体の選択
抗体を測定する酵素免疫測定法としてはサンドイッチ法、イムノエンザイムメトリック法、酵素標識第2抗体を用いた固相法、固相化第2抗体を用いた方法、酵素・抗酵素抗体を用いた固相法などがある〔蛋白質核酸酵素 別冊No.31 P.23 (1987) 〕。以下に、酵素標識第2抗体を用いた固相法で行う方法について述べる。
【0014】
抗原ペプチドは、架橋剤を用いて、免疫に使用したものとは異なるキャリアタンパクと結合させておく。コントロールペプチドとしては、ヒトFGF−8部分ペプチドおよび該部分ペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドをキャリアタンパクと結合させて用いる。上記ペプチドを1〜50μg/ml、10〜100μl/ウェルで96ウェルプレートに分注し、4℃で一晩放置してプレートコートする。BSA溶液などでブロッキング後、ハイブリドーマ培養上清もしくは(6)で得られる精製抗体を第一抗体として50〜100μl/ウェルずつ分注し、室温で2時間または4℃で一晩反応させる。PBSまたはPBSに0.05%Tween−20を加えた溶液(以下Tween−PBSと称す)で洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体もしくは抗ラットイムノグロブリン抗体1〜50μg/mlを50〜100μl/ウェルずつ分注し、室温1〜2時間反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、ヒトFGF−8部分ペプチドに特異的に反応するウェルを抗FGF−8モノクローナル抗体として選択する。
【0015】
(6)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5mlを腹腔内投与し、3〜10日飼育する〕した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、(4)で得られた抗FGF−8モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞2 ×107 〜5 ×106 細胞/匹を腹腔内注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離(3,000rpm、5分)して固形分を除去後、40〜50%飽和硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、DEAE−セファロースカラム、プロテインA−カラムあるいはゲルろ過カラムに通塔し、IgGあるいは、IgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットもしくはラットモノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行う。蛋白量は、ローリー法もしくは280nmでの吸光度より算出する。
【0016】
(7)モノクローナル抗体の特異性の確認(ウエスタンブロッティング)
(5)で選択された抗FGF−8モノクローナル抗体がFGF−8タンパクに反応するか否かを、ウエスタンブロッティングにて調べる。マウス乳癌細胞株SC−3のテストステロン刺激時の培養液もしくはその培養液中のFGF−8蛋白あるいはCHO細胞発現FGF−8蛋白を精製した後、SDS−PAGEにて分画後、ニトロセルロース膜あるいはPVDF膜にブロッティングする。BSA溶液でブロッキング後、抗FGF−8モノクローナル抗体の培養上清もしくは精製抗体1〜10μg/mlを室温で2時間または4℃で一晩反応させる。PBSまたはPBS−Tweenでよく洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体もしくは抗ラットイムノグロブリン抗体1〜50μg/mlを50〜100μl/ウェルずつ分注し、室温1〜2時間反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、抗FGF−8モノクローナル抗体がFGF−8蛋白の分子量に一致するバンドに反応することを確認する。
【0017】
(8)モノクローナル抗体によるFGF−8活性の阻害
(5)で選択された抗FGF−8モノクローナル抗体がFGF−8活性を阻害できるか否かを、ターゲット細胞にマウス乳癌細胞株SC−3もしくはヒト前立腺癌または乳癌の細胞株を用いた増殖阻害アッセイにて調べる。方法としては、ターゲット細胞をFGF−8(1〜100ng/ml)あるいはテストステロンを含む培地にて培養する際、培養上清もしくは精製した抗FGF−8モノクローナル抗体の最終濃度が0.1 〜100μg/mlになるように段階希釈して培地中に添加する。24〜72時間培養後、MTT[3−(4,5−ジメチル−2−チアゾニル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロマイド]溶液もしくはセルカウンティングキットなどを用いて生細胞数を測定し、抗FGF−8モノクローナル抗体によりFGF−8活性が阻害されることを確認する。
【0018】
【実施例】
実施例1
(1)免疫原の調製
ヒトFGF−8のN末端より23残基から46残基までの部分アミノ酸配列にキャリア蛋白との結合のためにC末端にCysを付加してペプチド合成を行った(配列番号1)。ペプチド合成には、他種品目同時固層法自動ペプチド合成装置PSSM−8(島津製作所社製)を用いた。免疫原性を高める目的で、合成ペプチドとKLH(カルビオケム社製)とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、KLHをPBSに溶解して10mg/mlに調整し、KLH溶液の1/10容量の25mg/mlMBS(ナカライテスク社)を滴下して30分間撹拌反応させた。あらかじめPBSで平衡化したセファデックスG−25カラムなどのゲルろ過カラムでフリーのMBSを除き、KLH−MBSコンジュゲート2.5mgを得た。さらに、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(PH7.0)に溶解したペプチド1mgと混合し、室温で3時間、攪拌反応した。反応後、PBS−0.5MNaClで透析したものを免疫原とした。
【0019】
(2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例1(1)に示した方法により調製したペプチド−KLHコンジュゲート100μgをアルミニウムゲル2mgおよび百日咳ワクチン(千葉県血清研究所製)1×109 細胞とともに5週令雌マウス(Balb/c)に投与し、2週間後より100μgのペプチド−KLHコンジュゲートを1週間に1回、計4回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を実施例1(3)に述べる酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫3日後に脾臓を摘出した。脾臓をMEM培地(日水製薬社製)中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離(1,200rpm、5分)した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液(pH7.65)で1〜2分間処理し赤血球を除去し、MEM培地で3回洗浄し、細胞融合に用いた。
【0020】
(3)酵素免疫測定法
アッセイ用の抗原としては、配列番号1に示すヒトFGF−8部分ペプチドを以下の方法でサイログロブリン(以下、THYと略す。)と架橋したコンジュゲートを用いた。すなわち、ペプチド1mgを0.1 M酢酸アンモニウムバッファーに溶解し、あらかじめ同バッファーに溶解しておいたTHY5mgを加えながら、1mlにメスアップした。さらに、攪拌しながら、0.02Mグルタールアルデヒド540μlを滴下し、室温で5時間攪拌反応させた。反応後、PBSで一晩透析したものを抗原として用いた。対照抗原には配列番号2に示すペプチドを先に述べた方法でTHYと架橋したコンジュゲートを用いた。96ウェルのEIA用プレート(グライナー社)に、調製した10μg/mlのコンジュゲートを, 50μl/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、残っている活性基をブロックするために、1%BSA−PBSを100μl/ウェルで加え、室温1時間反応させた。1%BSA−PBSを捨て、ハイブリドーマの培養上清もしくは被免疫マウス抗血清を50μl/ウェルで分注し2時間反応させた。tween−PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン(ダコ社)を50μl/ウェルで加えて室温、1時間反応させ、tween−PBSで洗浄後、ABTS基質液[2,2-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸)アンモニウム]を用いて発色させOD415nmの吸光度(NJ2001;日本インターメッド社)を測定した。
【0021】
(4)マウス骨髄腫細胞の調製
8−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3−U1を正常培地で培養し、細胞融合時に2×107 個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
【0022】
(5)ハイブリドーマの作製
実施例1(2)で得られたマウス脾細胞と実施例1(4)で得られた骨髄腫細胞とを10:1になるよう混合し、遠心分離(1,200rpm、5分)した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−1,000(PEG−1,000)2g、MEM培地2mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液を0.2〜1ml/108 個マウス脾細胞の割合で加え、さらに1〜2分間毎にMEM培地1〜2mlを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mlになるようにした。遠心分離(900rpm、5分)後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでHAT培地100ml 中に細胞をゆるやかに懸濁した。この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルずつ分注し、5%CO2 インキュベーター中、37℃で10〜14日間培養した。この培養上清を実施例1(3)に記載した酵素免疫測定法を用いて、FGF−8ペプチドに特異的に反応するウェルを選んだ。さらにHT培地と正常培地に換え、2回クローニングを繰り返して、抗FGF−8モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株を確立した。当該ハイブリドーマ株の具体例としては、図1に示したようにモノクローナル抗体KM1334が挙げられる。ハイブリドーマKM1334は、平成8年3月7日付で工業技術院生命工学工業技術研究所(茨城県つくば市東1丁目1番3号)にFERM BP-5451として寄託されている。なお、抗体クラスはサブクラスタイピングキットを用いた酵素免疫測定法によりIgG1と決定された。
【0023】
(6)モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した8週令ヌード雌マウス(Balb/c)に実施例1(3)で得られたハイブリドーマ株を5〜20×106 細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取(1〜8ml/匹)し、遠心分離(3,000rpm、5分)して固形分を除去した後、カプリル酸沈殿法(Antibodies-A Labpratorymanual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
【0024】
実施例2
(1)ウエスタンブロッティングによるモノクローナル抗体の特異性の検討
マウス乳癌細胞株SC−3のテストステロン刺激時の培養液より精製したFGF−8蛋白を0.1 μg/レーンでSDS−PAGEにて分画後、常法によりPVDF膜にブロッティングした。1%BSA−PBSでブロッキング後、抗FGF−8モノクローナル抗体KM1334(10μg/ml)およびコントロール抗体として正常ラット血清(×500)を、室温で2時間または4℃で一晩反応させた。tween−PBSでよく洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体(ダコ社)を室温で1時間反応させた。tween−PBSでよく洗浄した後、ECL(アマシャム社製)試薬を 1分間反応させ、余分な試薬を除去した後、フィルムを10秒〜2分間程度感光させて検出した。図2に示すようにKM1334はFGF−8に反応した。FGF−8の理論値は22Kダルトンだが、糖鎖等の付加により30Kダルトン前後のバンドとして認められた。
【0025】
(2)モノクローナル抗体によるFGF−8活性阻害の検討
抗FGF−8モノクローナル抗体がFGF−8活性を阻害できるか否かを、ターゲット細胞にマウス乳癌細胞株SC−3を用いた増殖阻害アッセイにて調べた。FGF−8(50ng/ml )、テストステロン(10nM;ナカライテスク社製)あるいは塩基性線維芽細胞増殖因子(以下、bFGFと略す)(1ng/ml;Pepro Tech Inc. 製)を含む培地でSC−3を培養した。この際に、抗FGF−8モノクローナル抗体であるKM1334を最終濃度0.1〜100μg/mlになるように段階希釈して培地中に添加した。コントロール抗体としては、精製マウスIgG(シグマ社製)を用いた。72時間培養後、MTT法で生細胞数を測定した。すなわち、5mg/mlのMTT[3−(4,5−ジメチル−2−チアゾニル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロマイド]−PBS溶液を10μl/ウェルで加えて、37℃で4〜5時間インキュベートした後、0.04N HCl−イソプロパノールを150μl/ウェルで加え、さらに37℃で1〜2時間振とうして生成した色素を可溶化し、OD540nmにて吸光度を測定した。FGF−8、bFGF、およびテストステロンに対する活性阻害の結果を、図3、図4および図5に示す。図3に示すようにKM1334は濃度依存的にFGF−8によるSC−3細胞の増殖を阻害したが、図4に示すように、KM1334は濃度依存的にbFGFによるSC−3細胞の増殖を阻害しなかった。したがってKM1334はFGF−8活性を特異的に阻害することが示された。さらに、図5において、KM1334は、テストステロンによるSC−3細胞の増殖を部分的には阻害したが、抗体濃度100μg/mlにおいて、完全には阻害されなかった。
【0026】
【発明の効果】
本発明によれば、FGF−8と特異的に反応し、且つFGF−8の活性を阻害するモノクローナル抗体を提供することができる。本発明のモノクローナル抗体は、腫瘍細胞におけるFGF−8の役割や生物学的機能の解析、さらには前立腺癌および乳癌等の免疫学的検出による診断に有用である。
【0027】
【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:25
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:GlnValThrValGlnSerSerProAsnPheThrGlnHisValArgGluGlnSerLeuValThrAspGlnLeuCys
【0028】
配列番号:2
配列の長さ:15
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:CysAlaThrAlaAlaAspGlnGluLysAsnProGluGlyAspGly
【図面の簡単な説明】
【図1】 抗FGF−8モノクローナル抗体KM1334の酵素免疫測定法における抗原に対する結合反応性を示す。■はTHY−FGF−8ペプチド抗原を、□はTHY−15639ペプチド抗原に対する結合反応性をそれぞれ示している。
【図2】 抗FGF−8モノクローナル抗体KM1334のウエスタンブロッティングにおける精製FGF−8タンパクとの反応性を示す。
【図3】 抗FGF−8モノクローナル抗体KM1334のFGF−8に対する活性阻害を示す。図中、growth0%の線は増殖因子も抗体も加えなかった時の値を示す。点線はコントロール抗体である精製マウスIgG、実線は抗FGF−8モノクローナル抗体KM1334の活性阻害をそれぞれ示す。
【図4】 抗FGF−8モノクローナル抗体KM1334のbFGFに対する活性阻害を示す。図中、growth0%の線は増殖因子も抗体も加えなかった時の値を示す。点線はコントロール抗体である精製マウスIgG、実線は抗FGF−8モノクローナル抗体KM1334の活性阻害をそれぞれ示す。
【図5】 抗FGF−8モノクローナル抗体KM1334のテストステロンに対する活性阻害を示す。図中、growth0%の線は増殖因子も抗体も加えなかった時の値を示す。点線はコントロール抗体である精製マウスIgG、実線は抗FGF−8モノクローナル抗体KM1334の活性阻害をそれぞれ示す。
Claims (7)
- 線維芽細胞増殖因子−8のN末端側23番目から46番目のアミノ酸配列に特異的に反応し、かつ線維芽細胞増殖因子−8の活性を阻害するモノクローナル抗体。
- 線維芽細胞増殖因子−8がヒト由来である、請求項1記載のモノクローナル抗体。
- IgG1サブクラスに属するモノクローナル抗体である、請求項1または2記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマKM1334(FERM BP-5451)。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、乳癌の診断薬。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、乳癌の治療薬。
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