JPH06121695A - 抗ヒトマンノース結合蛋白モノクローナル抗体およびその利用 - Google Patents
抗ヒトマンノース結合蛋白モノクローナル抗体およびその利用Info
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- JPH06121695A JPH06121695A JP31389692A JP31389692A JPH06121695A JP H06121695 A JPH06121695 A JP H06121695A JP 31389692 A JP31389692 A JP 31389692A JP 31389692 A JP31389692 A JP 31389692A JP H06121695 A JPH06121695 A JP H06121695A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒトマンノース結合蛋白のマンノース結合部
位を認識する新規な抗ヒトマンノース結合蛋白モノクロ
ーナル抗体と、それを用いて血中に存在するヒトマンノ
ース結合蛋白およびその分解産物を酵素免疫測定法によ
り定量することを特徴とする血中ヒトマンノース結合蛋
白およびその分解産物の定量法。 【効果】 ヒトマンノース結合蛋白のマンノース結合部
位を認識する抗ヒトマンノース結合蛋白モノクローナル
抗体を用いて血中のヒトＭＢＰを定量し、その定量値に
より生体侵入異物による補体活性化、感染防御能の指
標、自己免疫による補体活性化に伴う組織障害の活動性
の指標を得ることができる。
位を認識する新規な抗ヒトマンノース結合蛋白モノクロ
ーナル抗体と、それを用いて血中に存在するヒトマンノ
ース結合蛋白およびその分解産物を酵素免疫測定法によ
り定量することを特徴とする血中ヒトマンノース結合蛋
白およびその分解産物の定量法。 【効果】 ヒトマンノース結合蛋白のマンノース結合部
位を認識する抗ヒトマンノース結合蛋白モノクローナル
抗体を用いて血中のヒトＭＢＰを定量し、その定量値に
より生体侵入異物による補体活性化、感染防御能の指
標、自己免疫による補体活性化に伴う組織障害の活動性
の指標を得ることができる。
Description
【０００１】
【技術分野】本発明は、血中に存在するヒトマンノース
結合蛋白およびその分解産物を定量するのに有用なヒト
マンノース結合蛋白のマンノース結合部位を認識する抗
ヒトマンノース結合蛋白モノクローナル抗体ならびにそ
のモノクローナル抗体を用いて血中のヒトマンノース結
合蛋白およびその分解産物を定量する方法に関する。
結合蛋白およびその分解産物を定量するのに有用なヒト
マンノース結合蛋白のマンノース結合部位を認識する抗
ヒトマンノース結合蛋白モノクローナル抗体ならびにそ
のモノクローナル抗体を用いて血中のヒトマンノース結
合蛋白およびその分解産物を定量する方法に関する。
【０００２】
【背景技術】マンノース結合蛋白（以下ＭＢＰと記す）
は、ヒト、ウシ、ラット、ウサギなど多くの哺乳類の血
清や肝臓から単離される蛋白質で、分子量は約４００Ｋ
Ｄａ〜７００ＫＤａであり、約３２ＫＤａのサブユニッ
ト十数個がジスルフィド結合を介して会合した構造を有
するものと言われている。（Ｍ．Ｗ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８６，Ｓｕｐｐｌｅｍ
ｅｎｔ １，５３−５６（１９９１））。このＭＢＰ
は、マンノースやＮ−アセチルグルコサミンに特異的に
結合する。この結合に際しては、カルシウムイオンが必
要である。
は、ヒト、ウシ、ラット、ウサギなど多くの哺乳類の血
清や肝臓から単離される蛋白質で、分子量は約４００Ｋ
Ｄａ〜７００ＫＤａであり、約３２ＫＤａのサブユニッ
ト十数個がジスルフィド結合を介して会合した構造を有
するものと言われている。（Ｍ．Ｗ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８６，Ｓｕｐｐｌｅｍ
ｅｎｔ １，５３−５６（１９９１））。このＭＢＰ
は、マンノースやＮ−アセチルグルコサミンに特異的に
結合する。この結合に際しては、カルシウムイオンが必
要である。
【０００３】ＭＢＰについては、これまでに種々の実
験、研究がなされており、それらの結果から、ＭＢＰの
機能は、生体侵入異物上のマンノースやＮ−アセチルグ
ルコサミンの糖鎖に結合することにより、種々の免疫機
構と連関して、それら異物を排除することにあると考え
られている。
験、研究がなされており、それらの結果から、ＭＢＰの
機能は、生体侵入異物上のマンノースやＮ−アセチルグ
ルコサミンの糖鎖に結合することにより、種々の免疫機
構と連関して、それら異物を排除することにあると考え
られている。
【０００４】さらにまた、ヒトＭＢＰについては、これ
まで大腸菌、サルモネラ菌などのバクテリアやＨＩＶ
（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖ
ｉｒｕｓ）などのウイルスに関して種々の実験が行なわ
れ、その結果が報告されている。例えば、大腸菌に関し
ては、ヒトＭＢＰが大腸菌に結合して補体依存性の殺菌
作用を示したとの報告がなされている（Ｎ．Ｋａｗａｓ
ａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，９４，９３
７−９４７（１９８３））。また、サルモネラ菌につい
ては、ヒトＭＢＰが補体第２経路を活性化するとの報告
がなされている（Ｍ．Ｋｕｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９，１７３３−１７４５
（１９８９））。さらに、ＨＩＶに関しては、ヒトＭＢ
Ｐは、ＨＩＶのヘルパーＴ細胞への感染を制御したとの
報告がなされている（Ｒ．Ａ．Ｂ．Ｅｚｅｋｏｗｉｔ
ｚ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９，１８５−１９６
（１９８９））。
まで大腸菌、サルモネラ菌などのバクテリアやＨＩＶ
（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖ
ｉｒｕｓ）などのウイルスに関して種々の実験が行なわ
れ、その結果が報告されている。例えば、大腸菌に関し
ては、ヒトＭＢＰが大腸菌に結合して補体依存性の殺菌
作用を示したとの報告がなされている（Ｎ．Ｋａｗａｓ
ａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，９４，９３
７−９４７（１９８３））。また、サルモネラ菌につい
ては、ヒトＭＢＰが補体第２経路を活性化するとの報告
がなされている（Ｍ．Ｋｕｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９，１７３３−１７４５
（１９８９））。さらに、ＨＩＶに関しては、ヒトＭＢ
Ｐは、ＨＩＶのヘルパーＴ細胞への感染を制御したとの
報告がなされている（Ｒ．Ａ．Ｂ．Ｅｚｅｋｏｗｉｔ
ｚ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９，１８５−１９６
（１９８９））。
【０００５】ヒトＭＢＰが、生体侵入異物上のマンノー
スやＮ−アセチルグルコサミンの糖鎖に結合することに
より、種々の免疫機構と連関して、それら異物を排除す
ること、ある種の大腸菌に結合して補体依存性の殺菌作
用を示すこと、ある種のサルモネラ菌に結合し、食細胞
の貧食能を亢進させること、さらにＨＩＶのヘルパーＴ
細胞への感染をヒトＭＢＰが抑制したことなどの従来の
報告からみて、血中のヒトＭＢＰを定量できれば、その
定量値により生体侵入異物による補体活性化、すなわち
感染防御能の指標、自己免疫による補体活性化に伴う組
織障害の活動性の指標を得ることができるので、血中の
ヒトＭＢＰの定量について、感度、精度および簡便性に
優れた測定法の開発が、強く望まれている。
スやＮ−アセチルグルコサミンの糖鎖に結合することに
より、種々の免疫機構と連関して、それら異物を排除す
ること、ある種の大腸菌に結合して補体依存性の殺菌作
用を示すこと、ある種のサルモネラ菌に結合し、食細胞
の貧食能を亢進させること、さらにＨＩＶのヘルパーＴ
細胞への感染をヒトＭＢＰが抑制したことなどの従来の
報告からみて、血中のヒトＭＢＰを定量できれば、その
定量値により生体侵入異物による補体活性化、すなわち
感染防御能の指標、自己免疫による補体活性化に伴う組
織障害の活動性の指標を得ることができるので、血中の
ヒトＭＢＰの定量について、感度、精度および簡便性に
優れた測定法の開発が、強く望まれている。
【０００６】ヒトＭＢＰを定量する方法としては、従
来、固相化マンナンと抗ヒトＭＢＰウサギポリクローナ
ル抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ、固相化抗ヒ
トＭＢＰウサギポリクローナル抗体とビオチン化抗ヒト
ＭＢＰウサギポリクローナル抗体を用いたエンザイムイ
ムノアッセイ（Ｓｕｐｅｒ Ｍ．，Ｔｈｉｅｌ Ｓ．，
Ｌｕ Ｊ．，Ｌｅｖｉｎｓｋｙ Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｔｕ
ｎｅｒ Ｍ．Ｗ．，ＴＨＥ ＬＡＮＣＥＴ，Ｎｏｖｅｍ
ｂｅｒ ２５，１２３６−１２３９（１９８９））が報
告されているが、いずれもポリクローナル抗体を使用し
ているために、ヒトＭＢＰのみに特異的に反応しないた
め、ヒトＭＢＰの濃度を正確には測定できない。したが
って、いずれの測定系においてもそのような不正確な数
値に基づいている限り、各測定値を疾患群別に分けて判
断するに至らず、バラツキも大きく、感染防御能の程
度、自己免疫による補体活性化に伴う組織障害の活動性
を正確に判断することは不可能である。
来、固相化マンナンと抗ヒトＭＢＰウサギポリクローナ
ル抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ、固相化抗ヒ
トＭＢＰウサギポリクローナル抗体とビオチン化抗ヒト
ＭＢＰウサギポリクローナル抗体を用いたエンザイムイ
ムノアッセイ（Ｓｕｐｅｒ Ｍ．，Ｔｈｉｅｌ Ｓ．，
Ｌｕ Ｊ．，Ｌｅｖｉｎｓｋｙ Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｔｕ
ｎｅｒ Ｍ．Ｗ．，ＴＨＥ ＬＡＮＣＥＴ，Ｎｏｖｅｍ
ｂｅｒ ２５，１２３６−１２３９（１９８９））が報
告されているが、いずれもポリクローナル抗体を使用し
ているために、ヒトＭＢＰのみに特異的に反応しないた
め、ヒトＭＢＰの濃度を正確には測定できない。したが
って、いずれの測定系においてもそのような不正確な数
値に基づいている限り、各測定値を疾患群別に分けて判
断するに至らず、バラツキも大きく、感染防御能の程
度、自己免疫による補体活性化に伴う組織障害の活動性
を正確に判断することは不可能である。
【０００７】さらに、抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体
を用いての血中ヒトＭＢＰの濃度の定量を行なうとして
も、その抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体が、ヒトＭＢ
Ｐのマンノース結合部位を認識するものでなければ、血
中ヒトＭＢＰの濃度を正確には測定することはできな
い。すなわち、ヒトＭＢＰは、そのマンノース結合部位
が、生体侵入異物上のマンノースと結合することによ
り、種々の免疫機能を発揮することから、ヒトＭＢＰの
作用は、そのマンノース結合部位の有無により決定され
ると考えられているので、定量目的が上記の作用の大小
を判断することにある限り、上記のマンノース結合部位
を認識する抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体でなけれ
ば、その目的を達成することはできないのである。
を用いての血中ヒトＭＢＰの濃度の定量を行なうとして
も、その抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体が、ヒトＭＢ
Ｐのマンノース結合部位を認識するものでなければ、血
中ヒトＭＢＰの濃度を正確には測定することはできな
い。すなわち、ヒトＭＢＰは、そのマンノース結合部位
が、生体侵入異物上のマンノースと結合することによ
り、種々の免疫機能を発揮することから、ヒトＭＢＰの
作用は、そのマンノース結合部位の有無により決定され
ると考えられているので、定量目的が上記の作用の大小
を判断することにある限り、上記のマンノース結合部位
を認識する抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体でなけれ
ば、その目的を達成することはできないのである。
【０００８】エンザイムイムノアッセイのような免疫学
的測定法においては、用いる抗体の特異性、結合部位、
安定性等によって、その感度や精度が左右される。特に
ヒトＭＢＰの場合には、生体侵入異物による補体活性化
の状態、すなわち感染防御の状態、自己免疫による補体
活性化に伴う組織障害の活動性の状態を判断できるよう
なデータが得られる適切な抗体を得ることは、重要なこ
とである。
的測定法においては、用いる抗体の特異性、結合部位、
安定性等によって、その感度や精度が左右される。特に
ヒトＭＢＰの場合には、生体侵入異物による補体活性化
の状態、すなわち感染防御の状態、自己免疫による補体
活性化に伴う組織障害の活動性の状態を判断できるよう
なデータが得られる適切な抗体を得ることは、重要なこ
とである。
【０００９】
【発明の開示】本発明は、ヒトＭＢＰのマンノース結合
部位を認識する抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体を提供
するものであり、さらにそのモノクローナル抗体を用い
て、血中ヒトＭＢＰ及びその分解産物を定量する方法を
提供するものである。ヒトＭＢＰのマンノース結合部位
を認識する抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体を用いて酵
素免疫測定法を行なうことにより、血中ヒトＭＢＰ及び
その分解産物を定量し、その定量値により、生体侵入異
物による補体活性化、すなわち感染防御能の指標、自己
免疫による補体活性化に伴う組織障害の活動性の指標と
し得るレベルの精度および感度に優れた測定値を得るこ
とができる。
部位を認識する抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体を提供
するものであり、さらにそのモノクローナル抗体を用い
て、血中ヒトＭＢＰ及びその分解産物を定量する方法を
提供するものである。ヒトＭＢＰのマンノース結合部位
を認識する抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体を用いて酵
素免疫測定法を行なうことにより、血中ヒトＭＢＰ及び
その分解産物を定量し、その定量値により、生体侵入異
物による補体活性化、すなわち感染防御能の指標、自己
免疫による補体活性化に伴う組織障害の活動性の指標と
し得るレベルの精度および感度に優れた測定値を得るこ
とができる。
【００１０】以下に本発明の実施例を揚げ、本発明をさ
らに詳細に説明する。なお、以下の実施例では、ヒトＭ
ＢＰのマンノース結合部位を認識する抗ヒトＭＢＰモノ
クローナル抗体とマンナンまたは抗ヒトＭＢＰウサギポ
リクローナル抗体を使用して、サンドイッチ法に基づく
酵素免疫測定法を行なった例が示されているが、これは
例示にすぎず、酵素免疫測定法としては、その他に第一
抗体固相法、二抗体法、エミット法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍ
ｕｌｔｉｐｌｉｅｄ ＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＴｅｃｈ
ｑｕｅ：ＥＭＩＴ），エンザイムチャネリングイムノア
ッセイ法、酵素活性修飾物質標識イムノアッセイ法及び
リポソーム膜−酵素イムノアッセイ法などの競合法や、
サンドイッチ法、イムノエンザイムメトリックアッセイ
法、酵素活性増強イムノアッセイ法およびプロキシマー
ルリンケージイムノアッセイ法などの非競合法など、い
ずれも任意に選択使用することができる。
らに詳細に説明する。なお、以下の実施例では、ヒトＭ
ＢＰのマンノース結合部位を認識する抗ヒトＭＢＰモノ
クローナル抗体とマンナンまたは抗ヒトＭＢＰウサギポ
リクローナル抗体を使用して、サンドイッチ法に基づく
酵素免疫測定法を行なった例が示されているが、これは
例示にすぎず、酵素免疫測定法としては、その他に第一
抗体固相法、二抗体法、エミット法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍ
ｕｌｔｉｐｌｉｅｄ ＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＴｅｃｈ
ｑｕｅ：ＥＭＩＴ），エンザイムチャネリングイムノア
ッセイ法、酵素活性修飾物質標識イムノアッセイ法及び
リポソーム膜−酵素イムノアッセイ法などの競合法や、
サンドイッチ法、イムノエンザイムメトリックアッセイ
法、酵素活性増強イムノアッセイ法およびプロキシマー
ルリンケージイムノアッセイ法などの非競合法など、い
ずれも任意に選択使用することができる。
【００１１】上記の測定法においては、固相担体として
は、抗原や抗体を効率良く吸着するポリスチレン、ポリ
カーボネイト、ポリプロピレンあるいはポリビニールを
材料とすることができ、また、その形状としては、ボー
ル、マイクロプレート、ステイック、試験管などの形状
とすることができる。
は、抗原や抗体を効率良く吸着するポリスチレン、ポリ
カーボネイト、ポリプロピレンあるいはポリビニールを
材料とすることができ、また、その形状としては、ボー
ル、マイクロプレート、ステイック、試験管などの形状
とすることができる。
【００１２】標識用酵素としては、ペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼなどが用いられ、また、それらの酵素活性の測定
方法としては、比色法、蛍光法、生物発光法あるいは、
化学発光法などのほか、使用目的に応じて任意好適な手
段を用いることができる。
アルカリフォスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼなどが用いられ、また、それらの酵素活性の測定
方法としては、比色法、蛍光法、生物発光法あるいは、
化学発光法などのほか、使用目的に応じて任意好適な手
段を用いることができる。
【００１３】酵素標識を付与する抗体としては、抗体含
有物を硫安分画して得られたＩｇＧ画分、その画分をＤ
ＥＡＥ−セファセルのごとき陰イオン交換ゲルにより分
類精製した画分、更にはその画分をペプシン消化した
後、還元して得られる特異的結合部分Ｆａｂ’フラグメ
ントを用いることができる。測定対象試料としては、採
取した血液を、血清あるいは血漿等の状態として用いる
ことが好ましい。
有物を硫安分画して得られたＩｇＧ画分、その画分をＤ
ＥＡＥ−セファセルのごとき陰イオン交換ゲルにより分
類精製した画分、更にはその画分をペプシン消化した
後、還元して得られる特異的結合部分Ｆａｂ’フラグメ
ントを用いることができる。測定対象試料としては、採
取した血液を、血清あるいは血漿等の状態として用いる
ことが好ましい。
【００１４】
実施例１ 抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体作製 （ａ）抗原−ヒトＭＢＰの精製 ヒト血清を酵母マンナン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに添加
後、１Ｍ ＮａＣｌ，５０Ｍ ＣａＣｌ２を含む５０ｍ
Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）でカラムの非吸着
画分を充分に洗浄した後，１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５
０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）でヒトＭＢＰ
画分を溶出させた。
後、１Ｍ ＮａＣｌ，５０Ｍ ＣａＣｌ２を含む５０ｍ
Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）でカラムの非吸着
画分を充分に洗浄した後，１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５
０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）でヒトＭＢＰ
画分を溶出させた。
【００１５】次に、このヒトＭＢＰ画分を再びマンナン
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに添加した後、５０ｍＭト
リス・塩酸緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ，２０Ｍ ＣａＣｌ
２含有、ｐＨ７．８）でそのカラムを洗い、非吸着画分
を除いた後、吸着しているヒトＭＢＰを５０ｍＭマンノ
ースを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（１Ｍ ＮａＣ
ｌ，２０Ｍ ＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．８）で溶出させ
た。次に，このヒトＭＢＰ画分を、ＮｏｎｏＱカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ社製）によるイオン交換
クロマトグラフィーを行ない単離した。
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに添加した後、５０ｍＭト
リス・塩酸緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ，２０Ｍ ＣａＣｌ
２含有、ｐＨ７．８）でそのカラムを洗い、非吸着画分
を除いた後、吸着しているヒトＭＢＰを５０ｍＭマンノ
ースを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（１Ｍ ＮａＣ
ｌ，２０Ｍ ＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．８）で溶出させ
た。次に，このヒトＭＢＰ画分を、ＮｏｎｏＱカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ社製）によるイオン交換
クロマトグラフィーを行ない単離した。
【００１６】すなわちＭｏｎｏＱカラムを予め、５０ｍ
Ｍトリス・塩酸緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ含有、ｐＨ
８．０）で平衡化しておき、ヒトＭＢＰ画分をＭａｎｏ
Ｑカラムに吸着させた後、０．５Ｍ ＮａＣｌまでの直
線的勾配溶出法を行なうと、ヒトＭＢＰが０．２５Ｍ
ＮａＣｌ付近に溶出される。これを免疫源とする。ま
た、これを透折した後、０．１％になるようにＢＳＡを
加え、凍結乾燥したものを精製ＭＢＰとする。前記のヒ
トＭＢＰ画分については、これを還元して、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行なうと分子量３２０
００の蛋白が主たる成分であることが確認された。
Ｍトリス・塩酸緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ含有、ｐＨ
８．０）で平衡化しておき、ヒトＭＢＰ画分をＭａｎｏ
Ｑカラムに吸着させた後、０．５Ｍ ＮａＣｌまでの直
線的勾配溶出法を行なうと、ヒトＭＢＰが０．２５Ｍ
ＮａＣｌ付近に溶出される。これを免疫源とする。ま
た、これを透折した後、０．１％になるようにＢＳＡを
加え、凍結乾燥したものを精製ＭＢＰとする。前記のヒ
トＭＢＰ画分については、これを還元して、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行なうと分子量３２０
００の蛋白が主たる成分であることが確認された。
【００１７】（ｂ）抗体産生細胞の調製 上記（ａ）で得られた精製ヒトＭＢＰ（１０μｇ）をフ
ロイント完全アジュバンドでエマルジョンを作製して、
ＢＡＬＢ／Ｃマウスへ初回免疫した。３週間後、６２．
５ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０３１％ルブロール含有１
２．５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し
た前記の精製ヒトＭＢＰ１０μｇを追加免疫した。更に
最終免疫として、６０日後、腹腔内投与（５０μｇ／４
５０μｇ：１００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％ルブ
ロール含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．５に
溶解）により補助免疫し、３日後にマウス脾臓を取りだ
し、脾細胞を調製した。
ロイント完全アジュバンドでエマルジョンを作製して、
ＢＡＬＢ／Ｃマウスへ初回免疫した。３週間後、６２．
５ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０３１％ルブロール含有１
２．５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し
た前記の精製ヒトＭＢＰ１０μｇを追加免疫した。更に
最終免疫として、６０日後、腹腔内投与（５０μｇ／４
５０μｇ：１００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％ルブ
ロール含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．５に
溶解）により補助免疫し、３日後にマウス脾臓を取りだ
し、脾細胞を調製した。
【００１８】（ｃ）細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いた。 ＲＰＭＩ １６４０培地：ＲＰＭＩ Ｎｏ．１６４０
（Ｆｌｏｗ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）に重炭酸ナトリウム
（２４ｍＭ），ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ），ペニ
シリンＧカリウム（５０Ｕ／ｍｌ），硫酸ストレプトマ
イシン（５０μｇ／ｍｌ）および硫酸アミカシン（１０
０μｇ／ｍｌ）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２に
調製し、０．２μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌濾
過した。
（Ｆｌｏｗ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）に重炭酸ナトリウム
（２４ｍＭ），ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ），ペニ
シリンＧカリウム（５０Ｕ／ｍｌ），硫酸ストレプトマ
イシン（５０μｇ／ｍｌ）および硫酸アミカシン（１０
０μｇ／ｍｌ）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２に
調製し、０．２μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌濾
過した。
【００１９】ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ培地に、除菌
濾過した子牛胎児血清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ）を，１５％（ｖ／ｖ）の濃度に加えた。 ＰＥＧ ４０００溶液：ＲＰＭＩ培地のポリエチレング
リコール４０００（ＰＥＧ４０００，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃ
ｏ，Ｉｎｃ．）５０％（ｗ／ｗ）無血清溶液を調製し
た。
濾過した子牛胎児血清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ）を，１５％（ｖ／ｖ）の濃度に加えた。 ＰＥＧ ４０００溶液：ＲＰＭＩ培地のポリエチレング
リコール４０００（ＰＥＧ４０００，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃ
ｏ，Ｉｎｃ．）５０％（ｗ／ｗ）無血清溶液を調製し
た。
【００２０】８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＰＳ
Ｕ１との融合は、ＳｅｌｅｃｔｄＭｅｔｈｏｄ ｉｎ
ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄ．Ｂ．
Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇ
ｉ）．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ
（１９８０），３５１〜３７２に記載のＯｉ等の方法を
若干改変して行なった。
Ｕ１との融合は、ＳｅｌｅｃｔｄＭｅｔｈｏｄ ｉｎ
ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄ．Ｂ．
Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇ
ｉ）．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ
（１９８０），３５１〜３７２に記載のＯｉ等の方法を
若干改変して行なった。
【００２１】（２）前記（ｂ）で調製した有核脾細胞
（生細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率１０
０％）とを５：１の割合で融合した。脾臓細胞とミエロ
ーマ細胞とを別に前記のＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し
た。次に同じ培地に懸濁し、融合させるため上記の割合
で混合した。容量５０ｍｌの円錐形スチロール樹脂製試
験管（Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓｓ）を用いて、４０ｍｌの
ＲＰＭＩ １６４０培地中、４００ｘｇ，１０分間遠心
分離し、上清を完全に吸出した。
（生細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率１０
０％）とを５：１の割合で融合した。脾臓細胞とミエロ
ーマ細胞とを別に前記のＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し
た。次に同じ培地に懸濁し、融合させるため上記の割合
で混合した。容量５０ｍｌの円錐形スチロール樹脂製試
験管（Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓｓ）を用いて、４０ｍｌの
ＲＰＭＩ １６４０培地中、４００ｘｇ，１０分間遠心
分離し、上清を完全に吸出した。
【００２２】沈殿細胞に３７℃加温、ＰＥＧ４０００溶
液０．２ｍｌ穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、更
に１分間撹拌し、細胞を再懸濁、分散させる。つぎに３
７℃加温ＲＰＭＩ １６４０培地２．１ｍｌを１分間で
滴下した。この操作を更に１回繰り返した後、同培地１
４．７ｍｌを２〜３分間で常に撹拌しながら滴下し、細
胞を分散させた。これを、４００ｘｇ，１０分間遠心分
離し、上清を完全に吸引除去した。
液０．２ｍｌ穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、更
に１分間撹拌し、細胞を再懸濁、分散させる。つぎに３
７℃加温ＲＰＭＩ １６４０培地２．１ｍｌを１分間で
滴下した。この操作を更に１回繰り返した後、同培地１
４．７ｍｌを２〜３分間で常に撹拌しながら滴下し、細
胞を分散させた。これを、４００ｘｇ，１０分間遠心分
離し、上清を完全に吸引除去した。
【００２３】次にこの沈殿細胞に、３７℃加温ＮＳ−１
培地２１ｍｌを、速やかに加え、細胞の大きい塊を１０
ｍｌのピペットを用いて注意深くピペッテイングして分
散した。更に同培地４２ｍｌを加えて希釈し、ポリスチ
レン製９６穴マイクロウエル（Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓ
ｓ）に、１ウエル当たり６．０×１０５個／０．１ｍｌ
の細胞を加えた。なお、この時使用した９６穴マイクロ
ウエルは、前処理として、０．２ｍｌのＮＳ−１培地を
加え、炭酸ガス培養器中（３７℃）で一晩保温し、使用
時に培地を吸引除去した。細胞を加えた上記のマイクロ
ウエルを５％炭酸ガス／９５％空気中で温度３７℃、湿
度１００％下に培養に付した。
培地２１ｍｌを、速やかに加え、細胞の大きい塊を１０
ｍｌのピペットを用いて注意深くピペッテイングして分
散した。更に同培地４２ｍｌを加えて希釈し、ポリスチ
レン製９６穴マイクロウエル（Ｉｗａｋｉ Ｇｌａｓ
ｓ）に、１ウエル当たり６．０×１０５個／０．１ｍｌ
の細胞を加えた。なお、この時使用した９６穴マイクロ
ウエルは、前処理として、０．２ｍｌのＮＳ−１培地を
加え、炭酸ガス培養器中（３７℃）で一晩保温し、使用
時に培地を吸引除去した。細胞を加えた上記のマイクロ
ウエルを５％炭酸ガス／９５％空気中で温度３７℃、湿
度１００％下に培養に付した。
【００２４】（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの選
択的増殖 （１）使用した培地は下記の通りである。 ＨＡＴ培地：前記（ｃ）で述べたＮＳ−１培地に、さら
にヒポキサンチン（１００ｍｌ），アミノプテリン
（０．４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は、上記ＨＡ
Ｔ培地と同一組成のものである。
択的増殖 （１）使用した培地は下記の通りである。 ＨＡＴ培地：前記（ｃ）で述べたＮＳ−１培地に、さら
にヒポキサンチン（１００ｍｌ），アミノプテリン
（０．４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は、上記ＨＡ
Ｔ培地と同一組成のものである。
【００２５】（２）前記（ｃ）の培養開始後１日目（翌
日）、細胞にパスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約
０．１ｍｌ）を加えた。２日目、３日目、５日目、８日
目、１１日目にその都度培地の半分（０．１ｍｌ）を新
しいＨＡＴ培地で置き換え、１４日目に培地の半分を新
しいＨＴ培地で置き換えた。以降３〜４日ごとに培地の
半分を新しいＨＴ培地で置き換えた（通常２〜３週間で
十分なハイブリドーマの生育が観察される）。ハイブリ
ドーマ生育ウエルについて、次項（ｅ）に記載のイムノ
ブロット法により陽性ウエルをチエックした。
日）、細胞にパスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約
０．１ｍｌ）を加えた。２日目、３日目、５日目、８日
目、１１日目にその都度培地の半分（０．１ｍｌ）を新
しいＨＡＴ培地で置き換え、１４日目に培地の半分を新
しいＨＴ培地で置き換えた。以降３〜４日ごとに培地の
半分を新しいＨＴ培地で置き換えた（通常２〜３週間で
十分なハイブリドーマの生育が観察される）。ハイブリ
ドーマ生育ウエルについて、次項（ｅ）に記載のイムノ
ブロット法により陽性ウエルをチエックした。
【００２６】（ｅ）イムノブロット法による抗ヒトＭＢ
Ｐ抗体産生ハイブリドーマの検索 前記（ａ）で得られたヒトＭＢＰを、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動に付したのち、Ｉｍｍｏｂｉｌ
ｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。前記
（ｄ）の（２）における各培地の培養上清をこの転写膜
に反応させた後、ビオチン化抗マウス免疫グロブリン
（ＤＡＫＯ社製）、ペルオキシダーゼ標識アビジン（Ｖ
ｅｃｔｏｒ社製）を順次反応させた。最後に、ペルオキ
シダーゼの基質であるＤＡＢ（３，３’−Ｄｉａｍｉｎ
ｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を添加して発色反応を行なっ
た。発色の結果より、ヒトＭＢＰに反応する上記培養上
清をポジテイブとした。
Ｐ抗体産生ハイブリドーマの検索 前記（ａ）で得られたヒトＭＢＰを、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動に付したのち、Ｉｍｍｏｂｉｌ
ｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。前記
（ｄ）の（２）における各培地の培養上清をこの転写膜
に反応させた後、ビオチン化抗マウス免疫グロブリン
（ＤＡＫＯ社製）、ペルオキシダーゼ標識アビジン（Ｖ
ｅｃｔｏｒ社製）を順次反応させた。最後に、ペルオキ
シダーゼの基質であるＤＡＢ（３，３’−Ｄｉａｍｉｎ
ｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を添加して発色反応を行なっ
た。発色の結果より、ヒトＭＢＰに反応する上記培養上
清をポジテイブとした。
【００２７】（ｆ）クローニング 前記（ｄ）の操作後、各ウエル中には２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、抗体産出の
確認されたウエルのハイブリドーマについてクローニン
グを行なった。９６穴培養プレートにＨＴ培地を用いて
ハイブリドーマ２〜２００個／１００μｌ／ウエルで培
養を行ない、上清を再びイムノブロット法によるスクリ
ーニングにて抗体産生ウエルを検索して、ヒトＭＢＰに
対するモノクローナル抗体産出のハイブリドーマ１株が
得られた（微工研菌寄第１３１５８号）。
リドーマが生育している可能性があるので、抗体産出の
確認されたウエルのハイブリドーマについてクローニン
グを行なった。９６穴培養プレートにＨＴ培地を用いて
ハイブリドーマ２〜２００個／１００μｌ／ウエルで培
養を行ない、上清を再びイムノブロット法によるスクリ
ーニングにて抗体産生ウエルを検索して、ヒトＭＢＰに
対するモノクローナル抗体産出のハイブリドーマ１株が
得られた（微工研菌寄第１３１５８号）。
【００２８】（ｇ）モノクローナル抗体の生体外増殖お
よび生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は、常法に従った。すなわ
ち、得られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適
当な培養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から
１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を
得ることができた。一方、大量抗体を得るために、１匹
当たり０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤プリスタン（２，
６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン，Ａｌｄｒ
ｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を腹腔内投与した。１〜３
週間後に、各ハイブリドーマ１×１０７個を同じく腹腔
内投与し、さらにその１〜２週間後に生体内で産生され
た４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む腹水を
得ることができた。
よび生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は、常法に従った。すなわ
ち、得られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適
当な培養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から
１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を
得ることができた。一方、大量抗体を得るために、１匹
当たり０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤プリスタン（２，
６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン，Ａｌｄｒ
ｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を腹腔内投与した。１〜３
週間後に、各ハイブリドーマ１×１０７個を同じく腹腔
内投与し、さらにその１〜２週間後に生体内で産生され
た４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む腹水を
得ることができた。
【００２９】（ｈ）モノクローナル抗体のアイソタイプ 前記（ｇ）で得られた培養上清を用いて、オクタロニー
法にてモノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。
すなわち、アイソタイプに特異性のあるウサギ抗マウス
ＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）と培養上
清との沈降反応によって、アイソタイプを決定した。得
られたモノクローナル抗体は、免疫グロブリン鎖γ１／
κであった。
法にてモノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。
すなわち、アイソタイプに特異性のあるウサギ抗マウス
ＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）と培養上
清との沈降反応によって、アイソタイプを決定した。得
られたモノクローナル抗体は、免疫グロブリン鎖γ１／
κであった。
【００３０】（ｉ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｇ）で得られた各腹水をアフィゲルプロテインＡ
ＭＡＰＳ−ＩＩキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精
製した。
ＭＡＰＳ−ＩＩキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精
製した。
【００３１】実施例２ マンノースとモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡに
よるヒトＭＢＰの測定マンナン（Ｓｉｇｍａ社製）０．
５ｍｇ／ｍｌ（炭酸緩衝液，ｐＨ９．６）を９６穴プレ
ート１ウエル当たり１００μｌ添加し、４℃で一晩放置
してマンナンをプレートに吸着させた。
よるヒトＭＢＰの測定マンナン（Ｓｉｇｍａ社製）０．
５ｍｇ／ｍｌ（炭酸緩衝液，ｐＨ９．６）を９６穴プレ
ート１ウエル当たり１００μｌ添加し、４℃で一晩放置
してマンナンをプレートに吸着させた。
【００３２】翌日、プレート上のマンナン液を捨て、各
ウエルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．３）で洗浄した
後、測定対象試料を１００μｌずつ各ウエルに入れ、室
温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．
３）でウエルを洗浄した後、実施例１で作製したモノク
ローナル抗体（１μｇ／ｍｌ ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を
１００μｌずつ各ウエルに添加して、３７℃で１時間反
応させた。
ウエルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．３）で洗浄した
後、測定対象試料を１００μｌずつ各ウエルに入れ、室
温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．
３）でウエルを洗浄した後、実施例１で作製したモノク
ローナル抗体（１μｇ／ｍｌ ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を
１００μｌずつ各ウエルに添加して、３７℃で１時間反
応させた。
【００３３】各ウエルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．
３）で洗浄した後、ビオチン化抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫ
Ｏ社製，１／２００）を１００μｌずつ各ウエルに添加
して、３７℃で１時間反応させた。各ウエルをＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．３）で洗浄した後、ＡＢＣ法に従
い、アビジン−ビオチン複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ
社製）を反応させた後、パーオキシダーゼ標識ビオチン
により基質であるＡＢＴＳを反応させて発色を行ない、
波長４０５ｎｍにて吸光度を測定した。
３）で洗浄した後、ビオチン化抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫ
Ｏ社製，１／２００）を１００μｌずつ各ウエルに添加
して、３７℃で１時間反応させた。各ウエルをＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．３）で洗浄した後、ＡＢＣ法に従
い、アビジン−ビオチン複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ
社製）を反応させた後、パーオキシダーゼ標識ビオチン
により基質であるＡＢＴＳを反応させて発色を行ない、
波長４０５ｎｍにて吸光度を測定した。
【００３４】予め、実施例１の（ａ）で得られた精製ヒ
トＭＢＰを用いて、検量線を作成しておき、測定対象試
料についての上記の測定結果から試料中のヒトＭＢＰ量
を算出する。
トＭＢＰを用いて、検量線を作成しておき、測定対象試
料についての上記の測定結果から試料中のヒトＭＢＰ量
を算出する。
【００３５】実施例３ ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を用いたＥＬ
ＩＳＡによるＭＢＰの測定 （ａ）抗ヒトＭＢＰポリクローナル抗体の作製 実施例１（ａ）で得られたヒトＭＢＰをフロイント完全
アジュバンドと共にウサギに初回免疫する。すなわち
０．５５ｍｇのヒトＭＢＰを１ｍｌのアジュバンドとの
混合液として背部２ヵ所に皮下投与する。さらに、２ヵ
月間、２週間ごとに背部皮下に上記の混合液を用いて追
加免疫した。追加免疫ごとに、血液を採取し、得られた
各抗血清について、オクタロニー法を行ないヒトＭＢＰ
とのみ反応する抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体を作製
した。その確認は、オクタロニー法とウエスタン ブロ
ット法により行なった。
ＩＳＡによるＭＢＰの測定 （ａ）抗ヒトＭＢＰポリクローナル抗体の作製 実施例１（ａ）で得られたヒトＭＢＰをフロイント完全
アジュバンドと共にウサギに初回免疫する。すなわち
０．５５ｍｇのヒトＭＢＰを１ｍｌのアジュバンドとの
混合液として背部２ヵ所に皮下投与する。さらに、２ヵ
月間、２週間ごとに背部皮下に上記の混合液を用いて追
加免疫した。追加免疫ごとに、血液を採取し、得られた
各抗血清について、オクタロニー法を行ないヒトＭＢＰ
とのみ反応する抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体を作製
した。その確認は、オクタロニー法とウエスタン ブロ
ット法により行なった。
【００３６】（ｂ）抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体の
ビオチン化 実施例１で作製した抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体を
プロテインＡカラム−ＣＬ４Ｂで精製、濃縮する。その
溶液を、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．９）で透析
し、抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体１０ｍｇ／ｍｌ
（０．１Ｍ ホウ酸緩衝液ｐＨ８．９）を調製した。次
に、ＢＮＨＳ（ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシミ
ド：ＭＷ３４１．４１）を、ＤＭＳＯに溶解して、１０
０μｇ／１０μｌとなるように調製する。ＢＮＨＳ１０
μｇ／抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体ｍｇとなるよう
に調製し、室温で１晩放置する。その後、ＰＢＳ（０．
０２ＭＰＢ ｐＨ７．０，０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で透
析し、ビオチン化抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体１０
ｍｇ／０．９ｍｌ ＰＢＳを調製した。
ビオチン化 実施例１で作製した抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体を
プロテインＡカラム−ＣＬ４Ｂで精製、濃縮する。その
溶液を、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．９）で透析
し、抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体１０ｍｇ／ｍｌ
（０．１Ｍ ホウ酸緩衝液ｐＨ８．９）を調製した。次
に、ＢＮＨＳ（ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシミ
ド：ＭＷ３４１．４１）を、ＤＭＳＯに溶解して、１０
０μｇ／１０μｌとなるように調製する。ＢＮＨＳ１０
μｇ／抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体ｍｇとなるよう
に調製し、室温で１晩放置する。その後、ＰＢＳ（０．
０２ＭＰＢ ｐＨ７．０，０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で透
析し、ビオチン化抗ヒトＭＢＰモノクローナル抗体１０
ｍｇ／０．９ｍｌ ＰＢＳを調製した。
【００３７】（ｃ）マイクロタイタープレートに前記実
施例３の（ａ）で得られたウサギ抗ヒトＭＢＰポリクロ
ーナル抗体２０μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ：０．０２Ｍ Ｐ
Ｂ，ｐＨ７．０，０．１５Ｍ ＮａＣｌ）を１００μｌ
ずつ各ウエルに添加し、室温で２時間、その後４℃で４
日間静置後、吸引、洗浄した。１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ
を２５０μｌずつ各ウエルに添加してブロッキング後、
吸引、洗浄した。０．１％ＢＳＡ，０．１％ Ｔｗｅｅ
ｎ２０，０．０１％チメロサールを含むＰＢＳで測定対
象試料を２００倍希釈して被検体とし、それを１００μ
ｌずつ各ウエルに添加し、室温で２時間反応させた後、
吸引、洗浄した。
施例３の（ａ）で得られたウサギ抗ヒトＭＢＰポリクロ
ーナル抗体２０μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ：０．０２Ｍ Ｐ
Ｂ，ｐＨ７．０，０．１５Ｍ ＮａＣｌ）を１００μｌ
ずつ各ウエルに添加し、室温で２時間、その後４℃で４
日間静置後、吸引、洗浄した。１％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ
を２５０μｌずつ各ウエルに添加してブロッキング後、
吸引、洗浄した。０．１％ＢＳＡ，０．１％ Ｔｗｅｅ
ｎ２０，０．０１％チメロサールを含むＰＢＳで測定対
象試料を２００倍希釈して被検体とし、それを１００μ
ｌずつ各ウエルに添加し、室温で２時間反応させた後、
吸引、洗浄した。
【００３８】その後、ビオチン結合マウス抗ヒトＭＢＰ
モノクローナル抗体を１００μｌずつ各ウエルに添加
し、４℃で１晩反応させた後、吸引、洗浄した。さら
に、ストレプトアビジン結合ＨＲＰ（ニチレイ製）溶液
（１００培希釈）を添加し、室温で９０分間反応させた
後、吸引、洗浄し、Ｏ−フェニレンジアミン３ｍｇ／ｍ
ｌ（基質緩衝液：０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍ Ｎａ２
ＨＰＯ４，ｐＨ５．５，０．０２％Ｈ２Ｏ２，０．０１
％チメロサール）を１００μｌずつ各ウエルに添加し
た。室温で３０分間反応させた後、２Ｎ ＨＣｌを１０
０μｌずつ各ウエルに添加し、波長４９２ｎｍで吸光度
を測定した。実施例２と同様に、検量線により測定対象
試料中のヒトＭＢＰを算出する。
モノクローナル抗体を１００μｌずつ各ウエルに添加
し、４℃で１晩反応させた後、吸引、洗浄した。さら
に、ストレプトアビジン結合ＨＲＰ（ニチレイ製）溶液
（１００培希釈）を添加し、室温で９０分間反応させた
後、吸引、洗浄し、Ｏ−フェニレンジアミン３ｍｇ／ｍ
ｌ（基質緩衝液：０．１Ｍクエン酸、０．２Ｍ Ｎａ２
ＨＰＯ４，ｐＨ５．５，０．０２％Ｈ２Ｏ２，０．０１
％チメロサール）を１００μｌずつ各ウエルに添加し
た。室温で３０分間反応させた後、２Ｎ ＨＣｌを１０
０μｌずつ各ウエルに添加し、波長４９２ｎｍで吸光度
を測定した。実施例２と同様に、検量線により測定対象
試料中のヒトＭＢＰを算出する。
【００３９】実施例４ 実施例１で作製したモノクローナル抗体のヒトＭＢＰに
よる補体第１経路活性化におよぼす効果の検討 Ｉｋｅｄａらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６６
７４５１−７４５４，１９８７）に従って調製した１０
０μｌの酵母マンノース感作ヒツジ赤血球（以下Ｅｍａ
ｎｎａｎと記す，１×１０８／ｍｌ ＧＶＢ：ゼラチン
−ベロナール緩衝液）と同量のヒトＭＢＰの溶液を３７
℃，３０分間反応させた。
よる補体第１経路活性化におよぼす効果の検討 Ｉｋｅｄａらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６６
７４５１−７４５４，１９８７）に従って調製した１０
０μｌの酵母マンノース感作ヒツジ赤血球（以下Ｅｍａ
ｎｎａｎと記す，１×１０８／ｍｌ ＧＶＢ：ゼラチン
−ベロナール緩衝液）と同量のヒトＭＢＰの溶液を３７
℃，３０分間反応させた。
【００４０】次に、未反応のヒトＭＢＰをＧＶＢで洗
浄、除去し、得られたヒトＭＢＰ感作Ｅｍａｎｎａｎを
１００μｌのＧＶＢに懸濁した後、前記実施例１で作製
したモノクローナル抗体の溶液１００μｌを加えて３７
℃，３０分間反応させた。次に反応物をＧＶＢで洗浄し
た後、１００μｌのＧＶＢに懸濁して、１００μｌのモ
ルモット血清と３７℃，６０分間反応させた。反応混合
液に１ｍｌのＥＤＴＡ−ＧＶＢを加えて反応を停止させ
遠心した後、上清について４１４ｎｍの吸光度測定を行
なった。
浄、除去し、得られたヒトＭＢＰ感作Ｅｍａｎｎａｎを
１００μｌのＧＶＢに懸濁した後、前記実施例１で作製
したモノクローナル抗体の溶液１００μｌを加えて３７
℃，３０分間反応させた。次に反応物をＧＶＢで洗浄し
た後、１００μｌのＧＶＢに懸濁して、１００μｌのモ
ルモット血清と３７℃，６０分間反応させた。反応混合
液に１ｍｌのＥＤＴＡ−ＧＶＢを加えて反応を停止させ
遠心した後、上清について４１４ｎｍの吸光度測定を行
なった。
【００４１】得られた値を溶血率（ｙ）として、ｙより
赤血球当たりの平均溶血サイト（ｚ）を、式ｚ＝−ｌｎ
（１−ｙ）に従って算出した。このｚに基づき、次式よ
り前記モノクローナル抗体の溶血におよぼす阻止効果を
阻止率（％）として算出した。 阻止率（％）＝（対照（Ｚ）−被検体（Ｚ）／対照
（Ｚ））×１００
赤血球当たりの平均溶血サイト（ｚ）を、式ｚ＝−ｌｎ
（１−ｙ）に従って算出した。このｚに基づき、次式よ
り前記モノクローナル抗体の溶血におよぼす阻止効果を
阻止率（％）として算出した。 阻止率（％）＝（対照（Ｚ）−被検体（Ｚ）／対照
（Ｚ））×１００
【００４２】ここで、対照（Ｚ）とは、前記モノクロー
ナル抗体の非存在下での溶血率（ｙ）より算出した場合
のＺ値、被検体（Ｚ）とは、前記モノクローナル抗体の
存在下での溶血率（ｙ）より算出した場合のＺ値であ
る。
ナル抗体の非存在下での溶血率（ｙ）より算出した場合
のＺ値、被検体（Ｚ）とは、前記モノクローナル抗体の
存在下での溶血率（ｙ）より算出した場合のＺ値であ
る。
【００４３】添付図１に示されているとおり、前記モノ
クローナル抗体は、濃度依存的にヒトＭＢＰ感作Ｅｍａ
ｎｎａｎのモルモット補体による溶血反応を阻止した。
クローナル抗体は、濃度依存的にヒトＭＢＰ感作Ｅｍａ
ｎｎａｎのモルモット補体による溶血反応を阻止した。
【００４４】本発明に係るヒトマンノース結合蛋白のマ
ンノース結合部位を認識する抗ヒトマンノース結合蛋白
モノクローナル抗体は、ヒトＭＢＰによる補体第１経路
活性化反応において、ヒトＭＢＰの活性化部位又は、そ
の近傍に結合するものであり、ヒトＭＢＰのマンノース
結合部位を認識するものである。
ンノース結合部位を認識する抗ヒトマンノース結合蛋白
モノクローナル抗体は、ヒトＭＢＰによる補体第１経路
活性化反応において、ヒトＭＢＰの活性化部位又は、そ
の近傍に結合するものであり、ヒトＭＢＰのマンノース
結合部位を認識するものである。
【図１】本発明のヒトＭＢＰのマンノース結合部位を認
識するモノクローナル抗体が溶血作用を阻止する効果を
算出した結果をグラフに示したものであって、縦軸に阻
止率を、横軸に使用したモノクローナル抗体の濃度が示
されている。
識するモノクローナル抗体が溶血作用を阻止する効果を
算出した結果をグラフに示したものであって、縦軸に阻
止率を、横軸に使用したモノクローナル抗体の濃度が示
されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒトマンノース結合蛋白のマンノース結
合部位を認識する抗ヒトマンノース結合蛋白モノクロー
ナル抗体。 - 【請求項２】 ヒトマンノース結合蛋白のマンノース結
合部位を認識する抗ヒトマンノース結合蛋白モノクロー
ナル抗体を用いて血中に存在するヒトマンノース結合蛋
白およびその分解産物を酵素免疫測定法により定量する
ことを特徴とする血中ヒトマンノース結合蛋白およびそ
の分解産物の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31389692A JPH06121695A (ja) | 1992-10-13 | 1992-10-13 | 抗ヒトマンノース結合蛋白モノクローナル抗体およびその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31389692A JPH06121695A (ja) | 1992-10-13 | 1992-10-13 | 抗ヒトマンノース結合蛋白モノクローナル抗体およびその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06121695A true JPH06121695A (ja) | 1994-05-06 |
Family
ID=18046821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31389692A Pending JPH06121695A (ja) | 1992-10-13 | 1992-10-13 | 抗ヒトマンノース結合蛋白モノクローナル抗体およびその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06121695A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1140171A1 (en) * | 1998-12-15 | 2001-10-10 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for regulating lectin complement pathway associated complement activation |
| US7273925B1 (en) | 1998-12-15 | 2007-09-25 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for regulating lectin complement pathway associated complement activation |
| US8524453B2 (en) | 2006-02-10 | 2013-09-03 | The Brigham And Woman's Hospital, Inc. | Lectin complement pathway assays and related compositions and methods |
-
1992
- 1992-10-13 JP JP31389692A patent/JPH06121695A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1140171A1 (en) * | 1998-12-15 | 2001-10-10 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for regulating lectin complement pathway associated complement activation |
| EP1140171A4 (en) * | 1998-12-15 | 2002-03-13 | Brigham & Womens Hospital | METHODS AND PRODUCTS FOR REGULATING THE COMPLEMENT ACTIVATION ASSOCIATED WITH THE LECTIN COMPLEMENT SYSTEM |
| JP2002532079A (ja) * | 1998-12-15 | 2002-10-02 | ザ ブライハム アンド ウイミンズ ホスピタル， インコーポレイテッド | 補体活性化に関連するレクチン補体経路を調節するための方法および産物 |
| US7273925B1 (en) | 1998-12-15 | 2007-09-25 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for regulating lectin complement pathway associated complement activation |
| US8524453B2 (en) | 2006-02-10 | 2013-09-03 | The Brigham And Woman's Hospital, Inc. | Lectin complement pathway assays and related compositions and methods |
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