JP3670272B2 - Method for producing a hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to a fragment of lactoferrin - Google Patents

Description

本発明は、ウシ若しくはヒトのラクトフェリン類の断片に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造方法に関する。   The present invention relates to a method for producing a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically binds to a bovine or human lactoferrin fragment.

天然のウシ及びヒトラクトフェリンに対するモノクローナル抗体は、既に開示されているが（例えば、特許文献１及び２）、これらの抗体は、天然のラクトフェリンを抗原として得られたモノクローナル抗体であり、ラクトフェリンとは結合するが、ラクトフェリン類の加水分解物中に存在する抗菌性ペプチドとは結合しない。また、ラクトフェリン類の加水分解物から得られる抗菌性ペプチドと結合する抗体の報告は皆無である。   Although monoclonal antibodies against natural bovine and human lactoferrin have already been disclosed (for example, Patent Documents 1 and 2), these antibodies are monoclonal antibodies obtained using natural lactoferrin as an antigen and bind to lactoferrin. However, it does not bind to the antimicrobial peptide present in the hydrolyzate of lactoferrins. Moreover, there is no report of the antibody couple | bonded with the antimicrobial peptide obtained from the hydrolyzate of lactoferrin.

抗菌性ペプチドは、ウシ又はヒトのラクトフェリン類の加水分解物から単離された抗菌性ペプチドであり、既に公知のものである（特許文献３）。
経口摂取したラクトフェリンは胃液中に分泌された消化酵素、例えばペプシンによって消化され、更に抗菌活性が強い抗菌性ペプチドが生じるものと考えられている。このように酵素により加水分解され、タンパク質から新たに生成した生理活性ペプチドを検出及び定量するためには、加水分解前のタンパク質を抗原として得られた抗体では不十分である。その理由は、加水分解前のタンパク質を抗原としてモノクローナル抗体の作成を行った場合、生理活性ペプチドのみならず、抗菌性活性のないペプチド、抗菌性活性のないタンパク質とも結合する抗体が得られる可能性が高いからである。 The antibacterial peptide is an antibacterial peptide isolated from a hydrolyzate of bovine or human lactoferrins and is already known (Patent Document 3).
Orally ingested lactoferrin is considered to be digested by digestive enzymes secreted into the gastric juice, such as pepsin, to produce antibacterial peptides with strong antibacterial activity. Thus, in order to detect and quantify a bioactive peptide newly produced from a protein hydrolyzed by an enzyme, an antibody obtained using the protein before hydrolysis as an antigen is insufficient. The reason is that when a monoclonal antibody is prepared using the protein before hydrolysis as an antigen, not only a bioactive peptide but also a peptide that does not have antibacterial activity or a protein that binds to a protein without antibacterial activity may be obtained. Because it is expensive.

このような観点から、ラクトフェリンとは結合せず活性の高い抗菌性ペプチドのみを認識できる抗体が待望されていた。
特公平６−６９３７０号公報 特公平６−６１２６３号公報等 特開平５−９２９９４号公報 From such a viewpoint, an antibody capable of recognizing only an antibacterial peptide having high activity without binding to lactoferrin has been desired.
Japanese Patent Publication No. 6-69370 Japanese Patent Publication No. 6-61263 Japanese Patent Laid-Open No. 5-92994

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒト又はウシのラクトフェリン類の断片と特異的に結合するモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマの製造法を提供することである。   The present invention has been made in view of the above prior art, and an object thereof is to provide a method for producing a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically binds to a fragment of human or bovine lactoferrins. .

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ヒト又はウシのラクトフェリン類の断片、特に抗菌性ペプチドと特異的に結合するモノクロナール抗体を作成することに成功し、本発明を完成した。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have succeeded in producing a monoclonal antibody that specifically binds to a fragment of human or bovine lactoferrin, particularly an antimicrobial peptide, The present invention has been completed.

すなわち、前記課題を解決する本発明は、マウスの皮下に配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとフロイント完全アジュバントを投与して免疫し、最終免疫３日目に脾臓を摘出し、摘出した脾臓から採取した脾細胞とミエローマ細胞をポリエチレングリコールを添加して細胞融合し、融合した細胞から配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、限界希釈法を行ってモノクローナル化されたハイブリドーマを得ることを特徴とする配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原としたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製造方法である。   That is, in the present invention for solving the above-mentioned problems, a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and Freund's complete adjuvant are administered subcutaneously to mice and immunized, and the spleen is extracted and removed on the third immunization day. Spleen cells collected from the spleen and myeloma cells are fused by adding polyethylene glycol, and a hybridoma that produces an antibody that binds to the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is selected from the fused cells. And a monoclonal antibody-producing hybridoma using the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an antigen.

本発明の製造方法により、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる化学合成抗菌性ペプチドを抗原としたモノクローナル抗体であって、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと結合し、脱脂乳から分離したラクトフェリンとは結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造することができる。   According to the production method of the present invention, a monoclonal antibody having a chemically synthesized antibacterial peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as an antigen, which binds to the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. A hybridoma that produces a monoclonal antibody that does not bind to lactoferrin separated from skim milk can be produced.

また、前記ハイブリドーマを用いて、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる化学合成抗菌性ペプチドを抗原としたモノクローナル抗体であって、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと結合し、脱脂乳から分離したラクトフェリンとは結合しないモノクローナル抗体を製造することができる。   In addition, using the hybridoma, a monoclonal antibody having a chemically synthesized antibacterial peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as an antigen and binding to the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 Thus, a monoclonal antibody that does not bind to lactoferrin separated from skim milk can be produced.

また、本発明により、 試料中に含まれる配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを、前記モノクローナル抗体を用いて免疫学的に測定することを特徴とする、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを検出又は定量する方法が提供される。   Further, according to the present invention, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is characterized in that a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 contained in a sample is immunologically measured using the monoclonal antibody. A method for detecting or quantifying a peptide consisting of is provided.

また、本発明により、 次のア）又はイ）；
ア）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する希釈試料を固相に固定化し、前記モノクローナル抗体を添加し、このモノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した２次抗体を前記固相に添加し、この標識物質を検出すること、
イ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを含有する希釈試料を固相に固定化し、前記モノクローナル抗体を標識物質で標識化した標識化モノクローナル抗体を添加し、この標識物質を検出すること、のいずれかを含む、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを検出又は定量する方法が提供される。 Further, according to the present invention, the following a) or a):
A) A diluted sample containing a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is immobilized on a solid phase, the monoclonal antibody is added, and an antibody against the immunoglobulin of the immunized animal used for the preparation of the monoclonal antibody is labeled. Adding a secondary antibody labeled with a solid phase to detect the labeled substance,
B) Immobilizing a diluted sample containing a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 on a solid phase, adding a labeled monoclonal antibody obtained by labeling the monoclonal antibody with a labeling substance, and detecting the labeling substance A method for detecting or quantifying a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is provided.

また、本発明により、次のａ）〜ｅ）；
ａ）脱脂乳から分離したラクトフェリン、鉄を一部又は完全に飽和したラクトフェリン、鉄を除去したラクトフェリン、鉄以外の金属（例えば、銅、亜鉛等）を一部又は完全に飽和させたラクトフェリンのいずれかを抗原としたポリクローナル抗体を予め固定化したプレート、
ｂ）前記モノクローナル抗体、
ｃ）前記モノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を酵素で標識化した２次抗体、
ｄ）前記酵素の反応により発色する基質色素、及び
ｅ）標準濃度の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの溶液、を含む、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを検出又は定量するための試薬キットが提供される。 According to the present invention, the following a) to e);
a) Any of lactoferrin separated from skim milk, lactoferrin partially or completely saturated with iron, lactoferrin from which iron has been removed, or lactoferrin partially or completely saturated with metals other than iron (for example, copper, zinc, etc.) A plate preliminarily immobilized with a polyclonal antibody using the
b) said monoclonal antibody,
c) a secondary antibody obtained by labeling an antibody against immunoglobulin of the immunized animal used for the preparation of the monoclonal antibody with an enzyme,
d) detecting or quantifying a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, comprising a substrate dye that develops color by the reaction of the enzyme, and e) a solution of the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 at a standard concentration. A reagent kit is provided.

さらに、本発明により、次のａ）〜ｇ）；
ａ）脱脂乳から分離したラクトフェリン、鉄を一部又は完全に飽和したラクトフェリン、鉄を除去したラクトフェリン、鉄以外の金属（例えば、銅、亜鉛等）を一部又は完全に飽和させたラクトフェリンのいずれかを抗原としたポリクローナル抗体を予め固定化したプレート、
ｂ）前記モノクローナル抗体、
ｃ）前記モノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体をビオチン標識した２次抗体、
ｄ）ビオチニル化アルカリフォスファターゼ、
ｅ）ストレプトアビジン溶液、
ｆ）アルカリフォスファターゼの反応により発色する基質色素、及び
ｇ）標準濃度の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの溶液、を含む、配列
番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを検出又は定量するための試薬キットが提供される。 Furthermore, according to the present invention, the following a) to g);
a) Any of lactoferrin separated from skim milk, lactoferrin partially or completely saturated with iron, lactoferrin from which iron has been removed, or lactoferrin partially or completely saturated with metals other than iron (eg, copper, zinc, etc.) A plate preliminarily immobilized with a polyclonal antibody using the
b) said monoclonal antibody,
c) a secondary antibody in which an antibody against immunoglobulin of the immunized animal used for the preparation of the monoclonal antibody is labeled with biotin;
d) biotinylated alkaline phosphatase,
e) Streptavidin solution,
Detection or quantification of a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 comprising f) a substrate dye that develops color by the reaction of alkaline phosphatase, and g) a solution of the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 at a standard concentration. A reagent kit is provided.

本発明において、ラクトフェリン類は、天然のラクトフェリン、具体的には脱脂乳から分離したラクトフェリン、鉄を一部又は完全に飽和したラクトフェリン、鉄を除去したラクトフェリン、鉄以外の金属（例えば、銅、亜鉛等）を一部又は完全に飽和させたラクトフェリンを意味している。
また、本明細書において、百分率の表示は、特に断りのない限り、重量による値である。 In the present invention, lactoferrins include natural lactoferrin, specifically lactoferrin separated from skim milk, lactoferrin partially or completely saturated with iron, lactoferrin from which iron has been removed, metals other than iron (for example, copper, zinc Etc.) means lactoferrin partially or completely saturated.
In the present specification, the percentage display is a value by weight unless otherwise specified.

本発明は、ウシ若しくはヒトのラクトフェリン類の断片と結合し、天然のラクトフェリンとは結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造方法に関するものであり、本発明によって奏せられる効果は、次のとおりである。
１）ヒト若しくはウシ由来のラクトフェリン類の断片に対して特異性の高い抗体及びこれを産生する細胞ラインが得られる。
２）複雑な装置等を使用することなく、ヒト若しくはウシ由来のラクトフェリン類の断片、例えば胃液、腸内容物、便、血液、尿等に含有されるラクトフェリン類由来の抗菌性ペプチドを、特異的、かつ高感度に検出又は定量することができる。 The present invention relates to a method for producing a hybridoma that produces a monoclonal antibody that binds to a bovine or human lactoferrin fragment and does not bind to natural lactoferrin. The effects exhibited by the present invention are as follows. is there.
1) An antibody highly specific to a fragment of human or bovine derived lactoferrin and a cell line producing the same can be obtained.
2) Specific use of lactoferrin-derived antibacterial peptides contained in human or bovine-derived lactoferrins, such as gastric juice, intestinal contents, feces, blood, urine, etc., without using complicated devices And can be detected or quantified with high sensitivity.

次に、本発明について詳述する。
説明する。
＜１＞本発明のハイブリドーマの製造方法
本発明は、ウシ若しくはヒトのラクトフェリン類の断片、例えばウシラクトフェリン類由来の抗菌性ペプチド及びヒトラクトフェリン類由来の抗菌性ペプチドの少なくともいずれかと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造方法に関する。 Next, the present invention will be described in detail.
explain.
<1> Method for producing hybridoma of the present invention The present invention specifically binds to a fragment of bovine or human lactoferrin, for example, an antibacterial peptide derived from bovine lactoferrin and an antibacterial peptide derived from human lactoferrin. The present invention relates to a method for producing a hybridoma producing a monoclonal antibody.

本発明のハイブリドーマの製造方法は、より具体的には、マウスの皮下に配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとフロイント完全アジュバントを投与して免疫し、最終免疫３日目に脾臓を摘出し、摘出した脾臓から採取した脾細胞とミエローマ細胞をポリエチレングリコールを添加して細胞融合し、融合した細胞から配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、限界希釈法を行ってモノクローナル化されたハイブリドーマを得ることを特徴とする配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原としたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製造方法である。   More specifically, the method for producing a hybridoma of the present invention is such that a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and Freund's complete adjuvant are administered subcutaneously to a mouse and immunized, and the spleen is removed on the third immunization day Then, spleen cells collected from the extracted spleen and myeloma cells are fused by adding polyethylene glycol, and a hybridoma that produces an antibody that binds to the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is selected from the fused cells. A method for producing a monoclonal antibody-producing hybridoma using a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as an antigen, characterized in that a monoclonal hybridoma is obtained by performing a limiting dilution method.

一般にペプチドに対する抗体を作成する場合、そのアミノ酸配列のうち５残基以上の連続したアミノ酸配列を抗原として用いることが望ましいとされている。従って、例えば、ウシラクトフェリン類由来の抗菌ペプチドの場合、ウシラクトフェリン類のＮ末端から１７〜４１番目の抗菌性ペプチドに相当するアミノ酸配列のうち５残基以上のアミノ酸配列を含むペプチドを、ヒトラクトフェリン類由来の抗菌ペプチドの場合、ヒトのラクトフェリン類のＮ末端から４７番目のヒト抗菌性ペプチドに相当するアミノ酸配列のうち５残基以上のアミノ酸配列を含むペプチドを、抗原として用いることが好ましい。   In general, when an antibody against a peptide is prepared, it is desirable to use a continuous amino acid sequence of 5 residues or more in the amino acid sequence as an antigen. Therefore, for example, in the case of an antibacterial peptide derived from bovine lactoferrins, a peptide comprising an amino acid sequence of 5 or more residues among amino acid sequences corresponding to the 17th to 41st antibacterial peptides from the N-terminus of bovine lactoferrin is In the case of antibacterial peptides derived from a class, it is preferable to use, as an antigen, a peptide comprising an amino acid sequence of 5 residues or more in the amino acid sequence corresponding to the 47th human antibacterial peptide from the N-terminus of human lactoferrin.

ウシ若しくはヒトのラクトフェリン類の断片としては、ラクトフェリン類を酸又は酵素で加水分解することによって得られるペプチド、又はラクトフェリン類が生体内において酵素により消化されて生じるペプチド等を例示することができる。   Examples of the fragments of bovine or human lactoferrin include peptides obtained by hydrolyzing lactoferrins with acid or enzymes, or peptides generated by digesting lactoferrins with enzymes in vivo.

酸による加水分解は、これらラクトフェリン類を０．１〜２０％、望ましくは５〜１５％の濃度で水又は精製水等に溶解し、得られた溶液に塩酸、リン酸等の無機塩、又はクエン酸等の有機酸を添加し、溶液のｐＨを１〜４、望ましくは２〜３に調整し、調整されたｐＨに応じて、適当な温度で所定時間加熱して加水分解する。例えば、ｐＨが１〜２に調整された場合には８０〜１３０℃、望ましくは９０〜１２０℃で、ｐＨ２〜４に調整された場合には１００〜１３０℃、望ましくは１００〜１２０℃で、１〜１２０分間、望ましくは５〜６０分間加熱する。   Hydrolysis with acid is performed by dissolving these lactoferrins in water or purified water or the like at a concentration of 0.1 to 20%, preferably 5 to 15%, and the resulting solution contains an inorganic salt such as hydrochloric acid or phosphoric acid, or An organic acid such as citric acid is added to adjust the pH of the solution to 1 to 4, desirably 2 to 3, and hydrolysis is carried out by heating at an appropriate temperature for a predetermined time according to the adjusted pH. For example, when the pH is adjusted to 1 to 2, it is 80 to 130 ° C, preferably 90 to 120 ° C. When the pH is adjusted to 2 to 4, it is 100 to 130 ° C, preferably 100 to 120 ° C. Heat for 1 to 120 minutes, preferably 5 to 60 minutes.

酵素により加水分解する場合には、ラクトフェリン類を０．５〜２０％、望ましくは５〜１５％の濃度で水、精製水等に溶解し、得られた溶液を使用される酵素の至適ｐＨで加水分解する。使用する酵素は特に制限はなく、市販の酵素、例えばモルシンＦ（商標。森進製薬社製。至適ｐＨ２．５〜３）、豚ペプシン（和光純薬工業社製。至適ｐＨ２〜３）、ミリスームＡＰ（商標。新日本化学社製。至適ｐＨ３．０）、アマノＭ（商標。アマノ製薬社製。至適ｐＨ３．０）、アマノＡ（商標。アマノ製薬社製。至適ｐＨ７．０）、トリプシン（ノボ社製。至適ｐＨ８．０）等を単用又は任意に併用することができる。   When hydrolyzing with an enzyme, lactoferrins are dissolved in water, purified water or the like at a concentration of 0.5 to 20%, preferably 5 to 15%, and the obtained solution is used to obtain an optimum pH of the enzyme. Hydrolyze with The enzyme to be used is not particularly limited, and commercially available enzymes such as Morsin F (trademark, manufactured by Morishin Pharmaceutical Co., Ltd., optimal pH 2.5-3), porcine pepsin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., optimal pH 2-3) Millisum AP (trademark, manufactured by Shin Nippon Chemical Co., Ltd., optimum pH 3.0), Amano M (trademark, produced by Amano Pharmaceutical Co., Ltd., optimum pH 3.0), Amano A (trademark, produced by Amano Pharmaceutical Co., Ltd., optimum pH 7.) 0), trypsin (manufactured by Novo Corp., optimum pH 8.0), etc. can be used alone or in combination.

ラクトフェリン類が生体内において酵素によって消化されて生じたペプチドとしては、例えば、抗菌性ペプチド；乳児の糞便、血、尿中に存在が確認されているラクトフェリン類の断片ペプチド（小児臨床、第３９巻、第７頁、１９８６年）を例示することができる。
特に望ましい抗菌性ペプチドとしては、配列番号１〜配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを例示することができる。このようなペプチドは、ラクトフェリン類の酵素分解物から公知の方法（例えば、特開平５−２３８９４８号公報）によって精製できるが、液相又は固相合成法等の化学合成、組み換えＤＮＡ法によっても調製することができる。 Peptides produced by enzymatic digestion of lactoferrin in vivo include, for example, antibacterial peptides; fragment peptides of lactoferrins that have been confirmed to exist in the feces, blood, and urine of infants (pediatric clinical, vol. 39 , Page 7, 1986).
As a particularly desirable antibacterial peptide, peptides having the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8 can be exemplified. Such a peptide can be purified from an enzymatic degradation product of lactoferrin by a known method (for example, JP-A-5-238948), but it can also be prepared by chemical synthesis such as liquid phase or solid phase synthesis method or recombinant DNA method. can do.

抗体を製造する場合、アミノ酸残基が２０個程度以上のペプチドの場合は、公知の方法（大海忍著、「抗ペプチド抗体実験プロトコール」、第４４頁、秀潤社、１９９４年）により、そのペプチドのまま動物を直接免疫しても十分な抗原性を有している。しかしながら、アミノ酸残基が５から２０程度のペプチドの場合は、キャリアタンパク質にこれらペプチドを結合させた状態で、前記公知の方法により免疫するのが望ましい。この場合、キャリアタンパク質としてはウシ血清アルブミン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Keyhole Limpet Hemocyanin：以下「ＫＬＨ」と記載する）等を例示することができる。これらキャリアタンパク質とペプチドの結合は、ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシニドエステルを用い、ペプチドのシステイン残基のチオール基とキャリアタンパク質のアミノ基とを共有結合することにより、実施することができる。以上のようにして、本発明の抗体産生に使用可能なペプチド−キャリアタンパク質複合体が得られる。   In the case of producing an antibody, in the case of a peptide having about 20 or more amino acid residues, the known method (Shino Ohumi, “Anti-peptide antibody experimental protocol”, page 44, Shujunsha, 1994) Even if the animal is directly immunized as a peptide, it has sufficient antigenicity. However, in the case of peptides having about 5 to 20 amino acid residues, it is desirable to immunize by the above-mentioned known method in a state where these peptides are bound to a carrier protein. In this case, examples of the carrier protein include bovine serum albumin, keyhole limpet hemocyanin (hereinafter referred to as “KLH”), and the like. Bonding of these carrier proteins and peptides can be carried out by using m-maleimidobenzoyl N-hydroxysuccinide ester and covalently bonding the thiol group of the cysteine residue of the peptide and the amino group of the carrier protein. . As described above, a peptide-carrier protein complex that can be used for production of the antibody of the present invention is obtained.

前記のペプチド又はペプチド−キャリアタンパク質複合体を抗原として、マウスを常法［エー・エム・キャンベル(A.M. Campbell) 著、大沢利明訳、「生化学実験法１０」、第９０ページ、東京化学同人、１９８９年］により免疫する。使用するマウスの種類は特に限定されないが、一般にはＢＡＬＢ／ｃ系のマウスが用いられる。マウス１匹当たり抗原１０〜２００μｇの割合で、フロイントの完全アジュバント若しくは不完全アジュバントと共に腹腔内若しくは皮下に、又はアジュバントを加えずに静脈内若しくは直接脾臓に免疫する。初回免疫２〜３週間後に同一の方法により追加免疫を行う。   Using the above peptide or peptide-carrier protein complex as an antigen, mice were treated in a conventional manner [AM Campbell, Toshiaki Osawa, “Biochemical Experimental Method 10”, page 90, Tokyo Chemical Dojin, 1989]. The type of mouse to be used is not particularly limited, but generally a BALB / c mouse is used. The mice are immunized intraperitoneally or subcutaneously with Freund's complete or incomplete adjuvant, or intravenously or directly with no adjuvant, at a rate of 10-200 μg of antigen per mouse. Booster immunization is performed by the same method 2 to 3 weeks after the first immunization.

免疫成立の確認は、マウスから採血し、公知のエンザイム・リンクド・イムノソルベント・アッセイ(Enzyme-linked immunosorbent assay) 法［ビオキミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta)、第２５１巻、第４２７〜４３４ページ、１９７１年。以下「ＥＬＩＳＡ法」と記載する］により血中の抗体価を測定することによ
り実施することができる。細胞融合の３日前に抗原を免疫動物に静脈注射することにより、抗体産生活性を有するハイブリドーマを得る確率を高くすることが可能である。 Confirmation of the establishment of immunity is obtained by collecting blood from mice and using the known enzyme-linked immunosorbent assay method [Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 251, 427]. ~ 434 pages, 1971. Hereinafter, it is described as “ELISA method” by measuring the antibody titer in blood. It is possible to increase the probability of obtaining a hybridoma having antibody-producing activity by intravenously injecting an antigen into an immunized animal 3 days before cell fusion.

次に前記のようにして免疫したマウスの脾細胞とミエローマ細胞とを融合させる。ミエローマ細胞としては、ＢＡＬＢ／ｃ由来のＸ−６３−Ａｇ８−６．５．３又はＳＰ２／０−Ａｇ１４を例示することができる。   Next, the spleen cells and myeloma cells of the mouse immunized as described above are fused. Examples of myeloma cells include BALB / c-derived X-63-Ag8-6.5.3 or SP2 / 0-Ag14.

細胞融合及びハイブリドーマの選択方法を、例示すれば次のとおりである。平均分子量１５００〜４０００のポリエチレングリコールを細胞融合促進剤として使用し、脾細胞及びミエローマ細胞を、市販のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地（ギブコ社製。以下「ＨＡＴ培地」と記載する）中で培養する。ミエローマ細胞として、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子又はチミジンキナーゼ遺伝子が変異した変異株を用い、融合処理後の細胞をこの培地で培養すると、融合しない細胞は死滅し、融合した細胞のみが増殖するので、融合細胞を選別することができる。次に、ＥＬＩＳＡ法により目的とする抗菌性ペプチドに対する抗体を産生しているハイブリドーマの選択を次のとおり行う。   Examples of cell fusion and hybridoma selection methods are as follows. Polyethylene glycol having an average molecular weight of 1500 to 4000 is used as a cell fusion promoter, and spleen cells and myeloma cells are cultured in a commercially available hypoxanthine / aminopterin / thymidine medium (manufactured by Gibco, hereinafter referred to as “HAT medium”). Incubate. When a mutant strain in which hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene or thymidine kinase gene is mutated is used as myeloma cells, cells after fusion treatment are cultured in this medium, unfused cells die, and only fused cells grow. So fused cells can be sorted out. Next, a hybridoma producing an antibody against the target antibacterial peptide by ELISA is selected as follows.

固相ＥＬＩＳＡ法に使用するマイクロプレートに、ラクトフェリン類の断片、例えばウシ抗菌性ペプチド若しくはヒト抗菌性ペプチドをコーティングし、ハイブリドーマ培養上清を適当に希釈して添加し、未吸着物を洗浄除去し、アルカリフォスファターゼ又はパーオキシダーゼを結合させた２次抗体を添加する。未吸着の２次抗体を洗浄して除去し、発色基質としてパラニトロフェニルリン酸、オルトフェニレンジアミン又は２，２−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（バイオラッド社製。以下「ＡＢＴＳ」と記載する）を、使用した酵素に応じて添加し、目的とする抗体を産生している細胞の培養上清を加えたウェルを発色させる。このようにして目的とするハイブリドーマが得られ、公知の限界希釈法［エー・エム・キャンベル(A.M. Campbell) 著、大沢利明訳、「生化学実験法１０」、第１５４ページ、東京化学同人、１９８９年］によりクローニングを行い、ハイブリドーマ・クローンを確立することができる。以上の操作により目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。   A microplate used in the solid-phase ELISA method is coated with a lactoferrin fragment such as bovine antibacterial peptide or human antibacterial peptide, and the hybridoma culture supernatant is appropriately diluted and added to wash away unadsorbed substances. A secondary antibody conjugated with alkaline phosphatase or peroxidase is added. Unadsorbed secondary antibody was removed by washing, and paranitrophenyl phosphate, orthophenylenediamine or 2,2-azino-di- (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (manufactured by Bio-Rad) as a chromogenic substrate (Hereinafter referred to as “ABTS”) is added according to the enzyme used, and the well to which the culture supernatant of the cell producing the target antibody is added is colored. The hybridoma was cloned by the known limiting dilution method (AM Campbell, translated by Toshiaki Osawa, “Biochemical Experimental Method 10”, page 154, Tokyo Kagaku Dojin, 1989). A clone can be established, and a hybridoma producing the target monoclonal antibody can be obtained by the above operation.

＜２＞本発明の製造方法により得られるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体
ウシ若しくはヒトのラクトフェリン類の断片、例えばウシ抗菌性ペプチド、ヒト抗菌性ペプチドのいずれかと特異的に結合するモノクローナル抗体は、上記のようにして得られたハイブリドーマの培養上清から、公知のイオン交換クロマトグラフィー又はプロテインＡカラム等によって分離精製することができるが、同系のマウス腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を生成させることにより、１０００〜１００００倍程度に濃縮されたモノクローナル抗体を得ることもできる。この方法は、腹水から硫酸アンモニウムにより沈殿させるのみで、高純度のモノクローナル抗体を得ることができるので、極めて効率がよい。 <2> Monoclonal antibody produced by hybridoma obtained by the production method of the present invention A bovine or human lactoferrin fragment, for example, a bovine antimicrobial peptide or a monoclonal antibody that specifically binds to a human antimicrobial peptide, The hybridoma culture supernatant thus obtained can be separated and purified by known ion exchange chromatography, protein A column, or the like, but by inoculating the hybridoma into the same mouse abdominal cavity and generating ascites Monoclonal antibodies concentrated about 1000 to 10,000 times can also be obtained. This method is extremely efficient because a highly pure monoclonal antibody can be obtained simply by precipitation from ascites with ammonium sulfate.

＜３＞ラクトフェリン類の断片の検出・定量方法
ウシ若しくはヒトのラクトフェリン類の断片を含有する希釈試料を固相に固定化し、本発明のモノクローナル抗体を添加し、固定化されたラクトフェリン類の断片に対して結合したモノクローナル抗体を検出することによって、前記ラクトフェリン類の断片を免疫学的に検出又は定量することができる。 <3> Method for Detecting and Quantifying Lactoferrin Fragments A diluted sample containing a bovine or human lactoferrin fragment is immobilized on a solid phase, and the monoclonal antibody of the present invention is added to the immobilized lactoferrin fragment. By detecting the bound monoclonal antibody, the lactoferrin fragments can be detected or quantified immunologically.

固定化されたラクトフェリン類の断片に結合したモノクローナル抗体の検出は、モノクローナル抗体として標識物質で標識化した標識化モノクローナル抗体を用い、この標識物質を検出することによって行うことができる。また、固相に非標識モノクローナル抗体を添加した後、さらに、このモノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリ
ンに対する抗体を標識物質で標識化した２次抗体を前記固相に添加し、この標識物質を検出することによっても、固定化されたラクトフェリン類の断片に結合したモノクローナル抗体を間接的に検出することができる。 Detection of the monoclonal antibody bound to the immobilized fragment of lactoferrin can be performed by using a labeled monoclonal antibody labeled with a labeling substance as the monoclonal antibody and detecting the labeling substance. In addition, after adding an unlabeled monoclonal antibody to the solid phase, a secondary antibody obtained by labeling an antibody against the immunoglobulin of the immunized animal used for the preparation of the monoclonal antibody with a labeling substance is added to the solid phase. The monoclonal antibody bound to the immobilized fragment of lactoferrin can also be indirectly detected by detecting the labeling substance.

２次抗体は、モノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体であり、マウスモノクローナル抗体に対しては抗マウスイムノグロブリン抗体が用いられる。また、モノクローナル抗体のクラスがＩｇＧであれば、２次抗体としては抗ＩｇＧ抗体が好ましいが、抗ＩｇＧ抗体を含んでいれば、他のクラスのイムノグロブリンに対する抗体を含んでいても差し支えない。   The secondary antibody is an antibody against the immunoglobulin of the immunized animal used for the preparation of the monoclonal antibody, and an anti-mouse immunoglobulin antibody is used for the mouse monoclonal antibody. In addition, if the class of the monoclonal antibody is IgG, the secondary antibody is preferably an anti-IgG antibody, but if it contains an anti-IgG antibody, it may contain antibodies against other classes of immunoglobulins.

ラクトフェリン類の断片を固定化する固相としては、アガロースビーズ、ラテックス粒子、ポリスチレン、ナイロン等のマイクロプレートが挙げられる。これらの固相にラクトフェリン類の断片を含有する試料を含む緩衝液を入れるか、あるいはラクトフェリン類の断片を溶解した緩衝液に固相を浸漬することによって、ラクトフェリン類の断片を固相に固定化することができる。また、ドットブロットあるいはウェスタンブロットによっても、ニトロセルロースフィルターやナイロンメンブレンにラクトフェリン類の断片を固定化することができる。さらに、異なる抗原決定基を認識する２種類のモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体とを組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行う場合には、一方のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を固相に固定化し、これにラクトフェリン類の断片を結合させることにより、ラクトフェリン類の断片を固相に間接的に固定化することができる。   Examples of the solid phase for immobilizing the lactoferrin fragments include agarose beads, latex particles, polystyrene, nylon, and other microplates. Place a buffer solution containing a sample containing lactoferrin fragments on these solid phases, or immerse the solid phase in a buffer solution in which lactoferrin fragments are dissolved to immobilize the lactoferrin fragments on the solid phase. can do. Also, a lactoferrin fragment can be immobilized on a nitrocellulose filter or nylon membrane by dot blot or Western blot. Furthermore, when performing sandwich ELISA using two types of monoclonal antibodies that recognize different antigenic determinants, or a combination of monoclonal and polyclonal antibodies, one monoclonal antibody or polyclonal antibody is immobilized on a solid phase. The lactoferrin fragments can be indirectly immobilized on the solid phase by binding the lactoferrin fragments.

モノクローナル抗体を標識する標識物質としては、酵素、ビオチン、ケイ光物質、発光物質、放射性同位元素等が挙げられる。酵素の検出は、酵素反応により発色する色素を基質として用いることにより行うことができる。このような酵素及び基質については後述する。ビオチンの検出は、ストレプトアビジンで標識した酵素をさらにビオチンに結合させることにより、あるいはストレプトアビジンを介してビオチニル化した酵素を結合させることにより、酵素の検出と同様にして行うことができる。   Examples of labeling substances for labeling monoclonal antibodies include enzymes, biotin, fluorescent substances, luminescent substances, and radioisotopes. The enzyme can be detected by using a dye that develops color by an enzymatic reaction as a substrate. Such enzymes and substrates will be described later. The detection of biotin can be performed in the same manner as the detection of the enzyme by further binding an enzyme labeled with streptavidin to biotin, or by binding an enzyme biotinylated via streptavidin.

本発明の方法によるウシ若しくはヒトのラクトフェリン類の断片、例えばウシ抗菌性ペプチド又はヒト抗菌性ペプチドを検出又は定量する具体的な方法を例示する。９６穴（ウェル）マイクロプレートのウェルに、ｐＨ９．６の炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液又はリン酸緩衝溶液（以下、「ＰＢＳ」と記載する）等のタンパク質吸着バッファで希釈した試料（例えば、ラクトフェリン類、ラクトフェリン類の断片、胃液、腸内容物、便、血液、尿等）を入れ、４℃で１夜又は３７℃で１時間吸着させ、のちマイクロプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳに０．０５％の割合でＴｗｅｅｎを混合した液）を用いて洗浄する。   Specific examples of detecting or quantifying bovine or human lactoferrin fragments, such as bovine antibacterial peptides or human antibacterial peptides, according to the method of the present invention are illustrated. In a 96-well (well) microplate well, a sample diluted with a protein adsorption buffer such as sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer or phosphate buffer solution (hereinafter referred to as “PBS”) at pH 9.6 (for example, Lactoferrins, lactoferrin fragments, gastric juice, intestinal contents, stool, blood, urine, etc.) are added and adsorbed overnight at 4 ° C. or 1 hour at 37 ° C., and then the microplate is PBS-Tween (0. Washing is performed using a liquid in which Tween is mixed at a rate of 05%.

この後、各ウェルは、モノクローナル抗体等の非特異的吸着を防止するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、スキムミルク等の溶液を添加してブロッキングしておくとよい。   Thereafter, each well may be blocked by adding a solution such as bovine serum albumin (BSA), gelatin, skim milk or the like in order to prevent non-specific adsorption of monoclonal antibodies and the like.

次いで、一次抗体として前記本発明のモノクローナル抗体を加え、３７℃で１時間反応させ、前記と同様にプレートを洗浄し、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗体、又はペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗体を添加し、３７℃で１時間反応させる。前記と同様にプレートを洗浄し、発色基質を添加し、常法［ビオヒミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ（Bikchimica et Biophysica Acta)、第２５１巻、第４２７〜４３４ページ、１９７１年］により酵素活性を測定する。   Subsequently, the monoclonal antibody of the present invention is added as a primary antibody, reacted at 37 ° C. for 1 hour, the plate is washed in the same manner as described above, and an alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse immunoglobulin antibody or peroxidase-conjugated anti-mouse immunity is used as a secondary antibody. Add globulin antibody and react at 37 ° C. for 1 hour. The plate was washed as described above, a chromogenic substrate was added, and the enzyme activity was measured by a conventional method [Bikchimica et Biophysica Acta, Vol. 251, pp. 427-434, 1971]. To do.

アルカリフォスファターゼを用いた場合には、発色基質としてパラニトロフェニルリン
酸等を、ペルオキシダーゼを用いた場合には、発色基質としてオルトフェニレンジアミン又はＡＢＴＳ等を例示することができる。 When alkaline phosphatase is used, paranitrophenyl phosphate or the like can be exemplified as the chromogenic substrate, and when oxidase is used, orthophenylenediamine or ABTS can be exemplified as the chromogenic substrate.

また、本発明の検出法又は定量法において、２次抗体を添加する代わりに本発明のモノクローナル抗体を酵素で直接標識したものを用いることにより前記の２次抗体結合のステップを省略することもできる。   Further, in the detection method or quantification method of the present invention, instead of adding the secondary antibody, the step of binding the secondary antibody can be omitted by using the monoclonal antibody of the present invention directly labeled with an enzyme. .

また、２次抗体としてビオチン標識抗マウス免疫グロブリン抗体を用い、次にストレプトアビジン結合アルカリフォスファターゼを添加し、アビジン−ビオチン複合体を形成させ、のち発色基質を加えることにより高感度で目的のペプチドを検出又は定量することができる。さらに、前記２次抗体を加えた後に、ストレプトアビジン溶液を加え、さらにビオチニル化アルカリフォスファターゼを添加し、ストレプトアビジンを介して２次抗体にアルカリフォスファターゼを結合させてもよい。   In addition, using a biotin-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody as a secondary antibody, then adding streptavidin-conjugated alkaline phosphatase to form an avidin-biotin complex, and then adding a chromogenic substrate, the target peptide is highly sensitive. Can be detected or quantified. Furthermore, after adding the secondary antibody, a streptavidin solution may be added, and further biotinylated alkaline phosphatase may be added to allow alkaline phosphatase to bind to the secondary antibody via streptavidin.

また、異なる抗原決定基を認識する２種類のモノクローナル抗体、又は本発明のモノクローナル抗体と、抗ラクトフェリン類ポリクローナル抗体とを組み合わせて用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、定量性、検出感度の点から特に望ましい。その場合には、２種類のモノクローナル抗体の一方、あるいはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体のうちの一方を固相に固定化し、これにラクトフェリン類の断片を結合させた後、他方の抗体を用いて上記と同様に行えばよい。抗ラクトフェリン類ポリクローナル抗体は、通常のポリクローナル抗体の調製と同様にして既知の方法により調製することができる。尚、抗ラクトフェリン類ポリクローナル抗体の調製に用いる抗原は、ラクトフェリン類であってもよいし、抗菌性ペプチドのラクトフェリン類の断片であってもよい。   A sandwich ELISA method using two types of monoclonal antibodies recognizing different antigenic determinants, or a combination of the monoclonal antibody of the present invention and an anti-lactoferrin polyclonal antibody is particularly desirable from the viewpoints of quantification and detection sensitivity. In that case, one of the two types of monoclonal antibodies, or one of the monoclonal antibody and the polyclonal antibody, is immobilized on a solid phase, and a fragment of lactoferrins is bound thereto, and then the other antibody is used as described above. The same may be done. The anti-lactoferrin polyclonal antibody can be prepared by a known method in the same manner as the preparation of a normal polyclonal antibody. In addition, the lactoferrin may be sufficient as the antigen used for preparation of an anti- lactoferrin polyclonal antibody, and the fragment | piece of the lactoferrin of antimicrobial peptide may be sufficient as it.

更には、いわゆるウェスタンブロット法によっても、本発明のモノクローナル抗体を用いてラクトフェリン類の断片を検出、定量することができる。例えば、レムリらの方法［ネイチャー(Nature)、第２２７巻、第６８０〜６８５ページ、１９７０年］により、サンプル（ラクトフェリン類、ラクトフェリン類の断片、胃液、腸内容物、便、血清、尿等）をポリアクリルアミド電気泳動により分離する。このゲルを転写バッファで平衡化した後、ゲルの中のペプチド、断片をニトロセルロースメンブレン又はナイロンフィルタに電気的に転写し、固定化する。転写したメンブレン又はフィルタを、１０ｍＭトリス塩酸バッファ、ＢＳＡ、ゼラチン、スキムミルク等でブロッキングし、前記本発明のモノクローナル抗体を反応させる。メンブレン又はフィルタを洗浄し、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗体又はペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗体を添加し、洗浄し、発色基質を添加し、抗体と結合したタンパク質、ペプチドを検出する。   Furthermore, lactoferrin fragments can be detected and quantified by the so-called Western blot method using the monoclonal antibody of the present invention. For example, according to the method of Remli et al. [Nature, 227, 680-685, 1970], samples (lactoferrins, lactoferrin fragments, gastric juice, intestinal contents, stool, serum, urine, etc.) Are separated by polyacrylamide electrophoresis. After this gel is equilibrated with a transfer buffer, peptides and fragments in the gel are electrically transferred to a nitrocellulose membrane or a nylon filter and immobilized. The transferred membrane or filter is blocked with 10 mM Tris-HCl buffer, BSA, gelatin, skim milk or the like, and reacted with the monoclonal antibody of the present invention. Wash membrane or filter, add alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse immunoglobulin antibody or peroxidase-conjugated anti-mouse immunoglobulin antibody as secondary antibody, wash, add chromogenic substrate, detect protein and peptide bound to antibody .

発色基質として、アルカリフォスファターゼを用いた場合には５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、ニトロブルーテトラゾリウム、ファストレッド、ナフトールリン酸等、ペルオキシダーゼを用いた場合には４−クロロナフトール、ジアミノベンチジン、アミノエチルカルバゾール等を例示することができる。   When alkaline phosphatase is used as a chromogenic substrate, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, nitro blue tetrazolium, fast red, naphthol phosphate, etc. When peroxidase is used, 4-chloronaphthol , Diaminobenzidine, aminoethylcarbazole and the like.

また、２次抗体としてビオチン標識抗マウス免疫グロブリン抗体を用い、次にストレプトアビジン結合アルカリフォスファターゼを添加し、アビジン−ビオチン複合体を形成させ、その後発色基質を添加し、より高感度に目的のペプチド、断片を検出することもできる。   In addition, using a biotin-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody as a secondary antibody, then adding streptavidin-conjugated alkaline phosphatase to form an avidin-biotin complex, and then adding a chromogenic substrate, the target peptide with higher sensitivity Fragments can also be detected.

このようにして得られたメンブレン又はフィルタの発色を、デンシトメーターで測定し、検体中の抗原量を測定することが可能である。また、酵素標識抗体又はビオチン標識抗体の代わりに放射性同位元素で標識した抗体を用いることも可能であり、この場合はオー
トラジオグラフィー又はメンブレン若しくはフィルタ上の特定のバンドの放射活性を、バンドを含むメンブレン若しくはフィルタを切り出して液体シンチレーター等で測定することもできる。 The color of the membrane or filter thus obtained can be measured with a densitometer, and the amount of antigen in the sample can be measured. It is also possible to use an antibody labeled with a radioisotope instead of an enzyme-labeled antibody or a biotin-labeled antibody. In this case, the radioactivity of a specific band on the autoradiography or membrane or filter is included. The membrane or filter can be cut out and measured with a liquid scintillator or the like.

前記モノクローナル抗体は、ウシ若しくはヒトのラクトフェリン類の断片の検出又は定量用試薬キット（以下キットと記載する）の要素とすることができる。キットは、抗ラクトフェリン類ポリクローナル抗体を予め固定化したプレート、本発明のモノクローナル抗体、このモノクローナル抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する抗体を標識物質で標識化した２次抗体、前記標識物質を検出するための試薬、及び標準濃度のヒト若しくはウシのラクトフェリン類の断片の溶液を含む。   The monoclonal antibody can be used as an element of a reagent kit for detecting or quantifying bovine or human lactoferrin fragments (hereinafter referred to as a kit). The kit includes a plate on which an anti-lactoferrin polyclonal antibody is immobilized in advance, the monoclonal antibody of the present invention, a secondary antibody in which an antibody against immunoglobulin of an immunized animal used for the preparation of the monoclonal antibody is labeled with a labeling substance, the labeling substance And a solution of fragments of human or bovine lactoferrins at standard concentrations.

上記キットには、標識化２次抗体として酵素標識抗体が用いられる場合には、標識物質を検出するための試薬として、その酵素の反応により発色する基質色素が含まれる。また、２次抗体としてビオチン標識抗体が用いられる場合には、標識物質を検出するための試薬として、ストレプトアビジン結合酵素、またはビオチニル化酵素とストレプトアビジン溶液、さらに前記酵素の反応により発色する基質色素が含まれる。標識化２次抗体として放射性標識抗体が用いられる場合には、標識はＸ線フィルムによって検出することができる。   In the case where an enzyme-labeled antibody is used as the labeled secondary antibody, the kit contains a substrate dye that develops color by the reaction of the enzyme as a reagent for detecting the labeling substance. In addition, when a biotin-labeled antibody is used as the secondary antibody, a streptavidin-binding enzyme or a biotinylated enzyme-streptavidin solution as a reagent for detecting the labeling substance, and a substrate dye that develops color by the reaction of the enzyme Is included. When a radiolabeled antibody is used as the labeled secondary antibody, the label can be detected by an X-ray film.

前記モノクローナル抗体がマウス細胞由来の場合は、具体的には、酵素標識２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識マウス免疫グロブリン抗体、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体、ビオチニル化抗マウス免疫グロブリン抗体、¹²⁵Ｉラベル抗マウス免疫グロブリン抗体等が挙げられる。
前記キットを構成する各試薬類は、個別に包装され、一つのセットとなっている。また、上記の他に、洗浄用緩衝液、希釈液、基質色素を発色させるための他の基質等を同梱してもよい。
次に、試験例を示して本発明を詳述する。 When the monoclonal antibody is derived from a mouse cell, specifically, an alkaline phosphatase-labeled mouse immunoglobulin antibody, a peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody, a biotinylated anti-mouse immunoglobulin antibody, a ¹²⁵ I-labeled anti-antibody as an enzyme-labeled secondary antibody. Examples include mouse immunoglobulin antibodies.
Reagents constituting the kit are individually packaged to form one set. In addition to the above, a washing buffer solution, a diluting solution, and other substrates for coloring the substrate dye may be included.
Next, a test example is shown and this invention is explained in full detail.

〔試験例１〕
この試験は、得られたモノクローナル抗体の特異性を調べるために行った。
１）試料の調製
後記参考例２と同一の方法により抗菌性ペプチドを調製した。また、後記実施例１と同一の方法によりモノクローナル抗体を調製した。 [Test Example 1]
This test was conducted to examine the specificity of the obtained monoclonal antibody.
1) Preparation of sample Antibacterial peptide was prepared by the same method as Reference Example 2 described later. A monoclonal antibody was prepared by the same method as in Example 1 described later.

２）試験方法
ＰＢＳ溶液１ｍｌに０．１ｍｇの割合でラクトフェリン（森永乳業社製、純度９０％）、抗菌性ペプチド又はウシ血清アルブミン（シグマ社製。以下「ＢＳＡ」と記載する）を溶解し、各１００μｌを９６穴マイクロプレートに添加し、３７℃で１時間結合させた。各ウェルに抗原を結合したプレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄し、１％ゼラチンを含むＰＢＳ溶液１５０μｌを各ウェルに添加し、３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを前記と同様に洗浄し、モノクローナル抗体及び対照のウサギ抗ウシラクトフェリン抗体（パーセル社製）を適当に希釈し、各ウェルに１００μｌずつ添加し、３７℃で１時間抗体を結合させた。プレートを前記と同様に洗浄し、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体（ザイメッド社製）、又はアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギ免疫グロブリン抗体（ザイメッド社製）を適当に希釈して各ウェルに１００μｌずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。 2) Test method Lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., purity 90%), antibacterial peptide or bovine serum albumin (manufactured by Sigma Co., hereinafter referred to as “BSA”) was dissolved in 1 ml of PBS solution at a rate of 0.1 mg. 100 μl of each was added to a 96-well microplate and allowed to bind for 1 hour at 37 ° C. The plate in which the antigen was bound to each well was washed with a PBS-Tween solution, and 150 μl of a PBS solution containing 1% gelatin was added to each well and blocked at 37 ° C. for 1 hour. The plate was washed in the same manner as described above, and the monoclonal antibody and the control rabbit anti-bovine lactoferrin antibody (manufactured by Purcell) were diluted appropriately, 100 μl was added to each well, and the antibody was allowed to bind at 37 ° C. for 1 hour. The plate was washed in the same manner as described above, and an alkaline phosphatase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (Zymed) or an alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit immunoglobulin antibody (Zymed) was appropriately diluted as a secondary antibody in each well. 100 μl was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.

その後、前記と同様に洗浄したウェルにｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム（バイオラッド社製）を発色基質として添加し、３０分後に４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、酵素活性を試験した。   Thereafter, p-nitrophenyl sodium phosphate (manufactured by Bio-Rad) was added to the wells washed as described above as a chromogenic substrate, and after 30 minutes, the absorbance at 405 nm was measured to test the enzyme activity.

３）試験結果
この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から明らかなとおり、本発明のモノクローナル抗体は、天然のラクトフェリンとは結合せず、抗菌性ペプチドとのみ特異的に結合することが認められた。尚、モノクローナル抗体及び抗菌性ペプチドの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。 3) Test results The results of this test are as shown in Table 1. As is apparent from Table 1, it was confirmed that the monoclonal antibody of the present invention did not bind to natural lactoferrin and specifically bound only to the antibacterial peptide. In addition, although it tested by changing the kind of monoclonal antibody and antibacterial peptide, the substantially same result was obtained.

〔試験例２〕
この試験は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）及び２−メルカプトエタノールにより変成させたタンパク質又は抗菌性ペプチドと抗体との交叉性を調べるために行った。
１）試料の調製
参考例１及び参考例２と同一の方法によりウシラクトフェリン及び抗菌性ペプチドを調製した。また、実施例１と同一の方法によりモノクローナル抗体を調製した。 [Test Example 2]
This test was conducted in order to examine the cross-reactivity of the protein or antibacterial peptide modified with SDS (sodium dodecyl sulfate) and 2-mercaptoethanol and the antibody.
1) Preparation of sample Bovine lactoferrin and antibacterial peptide were prepared by the same method as in Reference Example 1 and Reference Example 2. A monoclonal antibody was prepared by the same method as in Example 1.

２）試験方法
ラクトフェリン及び抗菌性ペプチドを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、１％ＳＤＳ（ナカライテスク社製）、０．０５％ブロモフェノールブルー（和光純薬工業社製）、５％グリセロール（ナカライテスク社製）、１％２−メルカプトエタノール（バイオラッド社製）に溶解し、１００℃で２分間加熱して変成させ、前記レムリらの方法により不連続緩衝液を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１５％）に供給し、電気泳動により分離した。 2) Test method: Lactoferrin and antibacterial peptide in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8), 1% SDS (manufactured by Nacalai Tesque), 0.05% bromophenol blue (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 5% SDS-dissolved in glycerol (manufactured by Nacalai Tesque), 1% 2-mercaptoethanol (manufactured by Biorad), denatured by heating at 100 ° C. for 2 minutes, and using discontinuous buffer by the method of Remli et al. It was supplied to a polyacrylamide gel (15%) and separated by electrophoresis.

電気泳動ゲル上で分離したタンパク質及びペプチドをＴｒａｎｓ Ｂｌｏｔトランスファー装置（バイオラッド社製）を用い、同社の推奨する手順にしたがって、ポアサイズ０．２５μｍのニトロセルロースシート上に電気的にブロットした。ブロットしたニトロセルロースシートは１％ＢＳＡ、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液及び５０ｍＭ塩化ナトリウムの混合液（以下、「Ｔ10Ｎ50溶液」と記載する）で２時間緩やかに振盪しながらブロッキングした。   Proteins and peptides separated on the electrophoresis gel were electrically blotted onto a nitrocellulose sheet having a pore size of 0.25 μm using a Trans Blot transfer apparatus (Bio-Rad) according to the procedure recommended by the company. The blotted nitrocellulose sheet was blocked with a mixture of 1% BSA, 10 mM Tris-HCl buffer and 50 mM sodium chloride (hereinafter referred to as “T10N50 solution”) while gently shaking for 2 hours.

その後、上記ニトロセルロースシートを、本発明のモノクローナル抗体を含む１％ＢＳＡ、Ｔ10Ｎ50溶液中で１時間振盪し抗体を結合させた。このニトロセルロースシートを、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、５０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０５％ノニデットＰ−４０混合液（以下、「Ｔ10Ｎ50ＮＰ40溶液」と記載する）で充分に洗浄した後、５μＣｉ ¹²⁵Ｉ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（アマシャム社製）及び１％ＢＳＡ及びＴ10Ｎ50溶液を含む溶液中で１時間振盪し、Ｔ10Ｎ50ＮＰ40溶液で洗浄し、乾燥させ、フィルム（コダック社製。ＸＡＲ−５）に露光させた。 Thereafter, the nitrocellulose sheet was shaken in a 1% BSA, T10N50 solution containing the monoclonal antibody of the present invention for 1 hour to bind the antibody. This nitrocellulose sheet was thoroughly washed with 10 mM Tris-HCl buffer, 50 mM sodium chloride and 0.05% nonidet P-40 (hereinafter referred to as “T10N50NP40 solution”), and then 5 μCi ¹²⁵ I-labeled rabbit. The mixture was shaken in a solution containing anti-mouse IgG (Amersham), 1% BSA and T10N50 solution for 1 hour, washed with T10N50NP40 solution, dried, and exposed to a film (Kodak Corp., XAR-5).

３）試験結果
この試験の結果は、図１に示すとおりである。図１は、ニトロセルロース紙にブロット
したタンパク質のアミドブラック染色図（図１のＡ）及び本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫染色図（図１のＢ）であり、レーン１〜３は、それぞれ分子量マーカー、ウシラクトフェリン及び抗菌性ペプチドを示す。 3) Test results The results of this test are as shown in FIG. FIG. 1 is an amide black staining diagram (A in FIG. 1) of a protein blotted on nitrocellulose paper and an immunostaining diagram (B in FIG. 1) using the monoclonal antibody of the present invention. Molecular weight markers, bovine lactoferrin and antimicrobial peptides are shown.

図１から明らかなとおり、本発明の抗体は抗菌性ペプチドと結合することはもちろんであるが、ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールで加熱変成させたラクトフェリンとも結合することが認められた。尚、モノクローナル抗体及び抗菌性ペプチドの種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。   As is apparent from FIG. 1, the antibody of the present invention not only binds to the antibacterial peptide but also binds to lactoferrin that has been heat-denatured with SDS and 2-mercaptoethanol. In addition, although it tested by changing the kind of monoclonal antibody and antibacterial peptide, the substantially same result was obtained.

前記試験例１及び本試験例２から、本発明の抗体は、天然のラクトフェリンとは結合せず、抗菌性ペプチドに特異的に結合することが明らかである。   From Test Example 1 and Test Example 2, it is clear that the antibody of the present invention does not bind to natural lactoferrin but specifically binds to an antimicrobial peptide.

〔参考例１〕
イオン交換体（ＣＭ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製））を３Ｌのカラムに充填し、４Ｌの１００ｍＭ塩酸を通液し、水洗し、イオン交換体を平衡化した。４℃に冷却したｐＨ６．９のヒト脱脂乳２２Ｌをカラムに５００ｍｌ／分の流速で通液し、透過液を回収し、再び同様にカラムに通液した。次に、５００ｍｌ／分の流速で蒸留水を通液し、１０％食塩水４Ｌを２Ｌ／分の流速で通液し、イオン交換体に吸着した塩基性タンパク質溶液３．５Ｌを得た。 [Reference Example 1]
An ion exchanger (CM-Sepharose FF (Pharmacia)) was packed in a 3 L column, 4 L of 100 mM hydrochloric acid was passed through, washed with water, and the ion exchanger was equilibrated. 22 L of human skim milk of pH 6.9 cooled to 4 ° C. was passed through the column at a flow rate of 500 ml / min, the permeate was collected, and again passed through the column in the same manner. Next, distilled water was passed at a flow rate of 500 ml / min, and 4 L of 10% saline was passed at a flow rate of 2 L / min to obtain 3.5 L of a basic protein solution adsorbed on the ion exchanger.

この回収液に、硫酸アンモニウムを飽和度８０％になるように添加し、タンパク質を沈殿させ、遠心分離（３０００×ｇ）して沈殿物を回収し、飽和度８０％の硫酸アンモニウム溶液で洗浄し、脱イオン水２００ｍｌを添加して溶解し、溶解液を限外濾過膜モジュール（旭化成社製。ＳＬＰ００５３）を用いて限外濾過し、のち水を添加し、同装置を用いてダイアフィルトレーションを行い、脱塩し、凍結乾燥し、粉末状のヒトラクトフェリン約１７ｇを得た。   To this recovered solution, ammonium sulfate is added to a saturation degree of 80%, the protein is precipitated, and centrifuged (3000 × g) to recover the precipitate, washed with an ammonium sulfate solution with a saturation degree of 80%, and removed. 200 ml of ionic water is added to dissolve, and the solution is ultrafiltered using an ultrafiltration membrane module (manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd. SLP0053), water is added, and diafiltration is performed using the same apparatus. , Desalted and lyophilized to obtain about 17 g of powdered human lactoferrin.

得られたヒトラクトフェリン凍結乾燥物を電気泳動法により分離し、純度を測定した結果、約９７％であった。   The resulting human lactoferrin lyophilized product was separated by electrophoresis, and the purity was measured. As a result, it was about 97%.

〔参考例２〕
脱脂乳から分離したウシラクトフェリン（森永乳業社製。純度約９０％）１０ｇを５％（ｗ／ｖ）の濃度で蒸留水に溶解し、１規定塩酸を添加してｐＨを３．０に調整し、ペプシン（和光純薬工業社製）を基質の３％の割合で添加し、３７℃で４時間加水分解し、のち８０℃に１５分間加熱してペプシンを失活させ、１規定水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．０に調整し、１５００×ｇで３０分間遠心して不溶物を除去し、凍結乾燥し、抗菌性ペプチドを含有する粉末状のペプチド混合物約７．９ｇを得た。 [Reference Example 2]
10 g of bovine lactoferrin (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd., purity: about 90%) separated from skim milk is dissolved in distilled water at a concentration of 5% (w / v), and 1N hydrochloric acid is added to adjust the pH to 3.0. Then, pepsin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added at a ratio of 3% of the substrate, hydrolyzed at 37 ° C. for 4 hours, then heated to 80 ° C. for 15 minutes to deactivate pepsin, and 1N hydroxylation Sodium was added to adjust the pH to 7.0, centrifugation was performed at 1500 × g for 30 minutes to remove insoluble matters, and lyophilization was performed to obtain about 7.9 g of a powdery peptide mixture containing an antibacterial peptide. .

２５ｍｌのカチオン交換体（カルボキシメチルトヨパール（商標。東ソー社製。６５０Ｍ））を１００ｍＭ第一リン酸ナトリウム−第二リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で十分洗浄し、平衡化したスラリーに前記緩衝液に溶解した抗菌性ペプチド混合物溶液を添加し、ビーカー中でマグネティックスターラーで撹袢しながら十分に吸着させた。抗菌性ペプチド混合物を吸着したカチオン交換体をカラム（長さ５ｃｍ、直径３ｃｍ）に充填し、前記緩衝液を用いて、洗浄液の２８０ｎｍにおける吸光度が０．０３以下になるまで５ｍｌ／分の流速で洗浄した。同様に洗浄液の２８０ｎｍにおける吸光度が０．０３以下になるまで５ｍｌ／分の流速で１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭ第一リン酸ナトリウム−第二リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）をカラムに通液し、非特異的にゲルに吸着したペプチドを洗浄した。   25 ml of cation exchanger (Carboxymethyl Toyopearl (trademark; manufactured by Tosoh Corp., 650M)) was thoroughly washed with 100 mM sodium monophosphate-dibasic sodium phosphate buffer (pH 7.8) to obtain an equilibrated slurry. The antibacterial peptide mixture solution dissolved in the buffer solution was added and sufficiently adsorbed while stirring with a magnetic stirrer in a beaker. A column (5 cm in length, 3 cm in diameter) is packed with a cation exchanger adsorbing an antibacterial peptide mixture, and the buffer solution is used at a flow rate of 5 ml / min until the absorbance at 280 nm of the washing solution is 0.03 or less. Washed. Similarly, 100 mM sodium chloride, 100 mM sodium monophosphate-dibasic sodium phosphate buffer (pH 7.8) was passed through the column at a flow rate of 5 ml / min until the absorbance at 280 nm of the washing solution reached 0.03 or less. The peptide adsorbed non-specifically to the gel was washed.

次に、２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．８）をカラムに通液し、抗菌性ペプチドを含む
溶液１０ｍｌを得た。得られた抗菌性ペプチド溶液を水で平衡化した脱塩用のＰＤ１０カラム（ファルマシア社製）に５回に分けて注入し、脱塩した抗菌性ペプチド溶液を取得し、この溶液を凍結乾燥し、粉末状の抗菌性ペプチド約１８ｍｇを得た。 Next, 2M ammonium acetate (pH 7.8) was passed through the column to obtain 10 ml of a solution containing an antibacterial peptide. The obtained antibacterial peptide solution was injected into a PD10 column for desalting (Pharmacia) equilibrated with water in five portions to obtain a desalted antibacterial peptide solution, which was freeze-dried. About 18 mg of powdery antibacterial peptide was obtained.

得られた精製ペプチドは、常法のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、元素分析及び質量分析により、配列番号１に記載するアミノ酸配列を有することを確認した。尚、配列番号１において、３番目のCys と２１番目のCys とがジスルフィド結合していると推定される。   The obtained purified peptide was confirmed to have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 by conventional amino acid analysis, amino acid sequence analysis, elemental analysis and mass spectrometry. In SEQ ID NO: 1, it is presumed that the third Cys and the 21st Cys are disulfide bonded.

〔参考例３〕
ペプチドシンセサイザー（ファルマシアLKB バイオテクノロジー社製。LKB Biolynx 4170）を使用し、シェパード等の方法［ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキンＩ(Journal of Chemical Society Perkin Ｉ) 、第５３８頁、１９８１年］による固相ペプチド合成法に基づいて、次のようにして配列番号２に示す配列を有するペプチドを合成した。 [Reference Example 3]
Using a peptide synthesizer (Pharmacia LKB Biotechnology Co., Ltd. LKB Biolynx 4170) according to the method of Shepard et al. (Journal of Chemical Society Perkin I, page 538, 1981) Based on the solid phase peptide synthesis method, a peptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 2 was synthesized as follows.

NovaSynKA 誘導体樹脂（Fmoc-Cys(Acm)-NovaSynKA 。カルビオケム−ノバビオケム社製）０．１ｍｅｑ（１ｇ）を用いて、前記ペプチドシンセサイザーの合成プログラムにより脱保護基反応及び縮合反応を反復してペプチド鎖を延長した。即ち、２０％ピペリジン／ジメチルフォルムアミド（関東化学社製、以下「ＤＭＦ」と記載する）によりアミノ保護基である９−フルオレニルメトキシカルボニル（以下「Ｆｍｏｃ」と記載する）基を切断除去し、ＤＭＦで洗浄し、のちＦｍｏｃ−アミノ酸活性エステル／N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下「ＨＯＢｔ」と記載する）各０．５ｍｍｏｌを反応させ、ＤＭＦで洗浄する操作を反復した。   NovaSynKA derivative resin (Fmoc-Cys (Acm) -NovaSynKA. Calbiochem-Novabiochem) 0.1 meq (1 g) was used to repeat the deprotection reaction and condensation reaction according to the peptide synthesizer synthesis program. Extended. That is, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (hereinafter referred to as “Fmoc”) group which is an amino protecting group is cleaved and removed by 20% piperidine / dimethylformamide (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc., hereinafter referred to as “DMF”). Then, washing with DMF, and subsequent reaction of 0.5 mmol each of Fmoc-amino acid active ester / N-hydroxybenzotriazole (hereinafter referred to as “HOBt”) and washing with DMF were repeated.

縮合反応後、必要に応じてカイザーテストを行ないカップリングが完全であったことを確認した。合成には０．５ｍｍｏｌのカートリッジを用いた。ペプチド鎖の伸張反応が全て終了した後、２０％ピペリジン／ＤＭＦによりＦｍｏｃ基を切断し、ＤＭＦで洗浄後１０％無水酢酸／ＤＭＦでアセチル化を行なった。カイザーテストによりアセチル化が完了したことを確認した後、樹脂をＤＭＦ、tert−ペンチルアルコール（関東化学社製）、酢酸（関東化学社製）、tert−ペンチルアルコール（関東化学社製）、ＤＭＦ、ジエチルエーテル（国産化学社製）の順で十分洗浄し、真空乾燥した。   After the condensation reaction, a Kaiser test was performed as necessary to confirm that the coupling was complete. A 0.5 mmol cartridge was used for the synthesis. After all the peptide chain elongation reactions were completed, the Fmoc group was cleaved with 20% piperidine / DMF, washed with DMF, and acetylated with 10% acetic anhydride / DMF. After confirming the completion of acetylation by the Kaiser test, the resin was treated with DMF, tert-pentyl alcohol (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), acetic acid (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), tert-pentyl alcohol (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), DMF, Diethyl ether (manufactured by Kokusan Chemical Co., Ltd.) was washed in order and dried in vacuum.

前記の保護ペプチド樹脂６５０ｍｇにエタンジチオール（渡辺化学社製）１．０ｍｌ、m-クレゾール（渡辺化学社製）２００ｍｌ、チオアニソール（渡辺化学社製）２．４ｍｌを室温、アルゴン気流下で１５分間攪拌し、のち氷冷下で更に１０分間攪拌した。これにトリフルオロ酢酸（渡辺化学社製、以下「ＴＦＡ」と記載する）１５ｍｌを添加して１０分間攪拌し、トリメチルシリルブロミド（渡辺化学社製）２．６ｍｌを添加して５０分間攪拌した。グラスフィルターで樹脂を濾過して除去し、濾液を直ちに減圧濃縮した。残渣に予め冷却したジエチルエーテル（国産化学社製）を添加し、遠沈管に移し、遠心分離（２５００ｒｐｍで５分間）し、上清を廃棄し、冷ジエチルエーテルを新たに添加して十分攪拌し、再び遠心分離する操作を４回反復した。ペプチド沈殿物を真空乾燥し、水に溶解して凍結乾燥を行ない、粗製ペプチド約９４．３ｍｇを得た。   To 650 mg of the above-mentioned protected peptide resin, 1.0 ml of ethanedithiol (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.), 200 ml of m-cresol (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) and 2.4 ml of thioanisole (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) are allowed to stand at room temperature for 15 minutes under an argon stream. The mixture was stirred and then further stirred for 10 minutes under ice cooling. To this, 15 ml of trifluoroacetic acid (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd., hereinafter referred to as “TFA”) was added and stirred for 10 minutes, and 2.6 ml of trimethylsilyl bromide (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) was added and stirred for 50 minutes. The resin was removed by filtration through a glass filter, and the filtrate was immediately concentrated under reduced pressure. Add pre-cooled diethyl ether (made by Kokusan Chemical Co., Ltd.) to the residue, transfer to a centrifuge tube, centrifuge (2500 rpm for 5 minutes), discard the supernatant, add cold diethyl ether anew and stir well. The operation of centrifugation again was repeated 4 times. The peptide precipitate was vacuum dried, dissolved in water and lyophilized to obtain about 94.3 mg of crude peptide.

Cys(Acm)ペプチド９４．３ｍｇにＡｇＢＦ₄ （１０ｅｑ、渡辺化学社製）／anisole （１０ｅｑ、渡辺化学社製）／ＴＦＡ溶液を加え４℃、６０分間攪拌し、ジエチルエ−テル（国産化学社製）を添加し、前記の遠心分離によるペプチドの精製を行ない、真空乾燥してＳＨ基フリ−ペプチドを得た。ＳＨ基フリ−ペプチドに５０％ＤＭＳＯ（渡辺化学社製）／１Ｎ ＨＣｌ（和光純薬社製）を加えて、室温で７時間攪拌した。ジスルフィド生成のモニタ−は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて行った。水を添加して合成吸
着剤ＨＰ２０（三菱化学社製）カラムに供給して吸着させ、水で十分洗浄し、６０％ＣＨ₃ＣＮ／１Ｎ ＡｃＯＨ（関東化学社製）でペプチドを溶出させ、遠心濃縮後水を添加して凍結乾燥し、粗製ペプチド６１．１ｍｇを得た。 AgBF ₄ (10 eq, manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) / Anisole (10 eq, manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) / TFA solution was added to 94.3 mg of Cys (Acm) peptide, stirred at 4 ° C. for 60 minutes, and diethyl ether (manufactured by Kokusan Chemical Co., Ltd.). The peptide was purified by centrifugation as described above, and dried under vacuum to obtain an SH group free peptide. 50% DMSO (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) / 1N HCl (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the SH group free peptide and stirred at room temperature for 7 hours. The disulfide production was monitored by high performance liquid chromatography (HPLC). Water is added to a synthetic adsorbent HP20 (Mitsubishi Chemical Co.) column and adsorbed, washed thoroughly with water, the peptide is eluted with 60% CH ₃ CN / 1N AcOH (Kanto Chemical Co., Ltd.), and centrifuged. After concentration, water was added and lyophilized to obtain 61.1 mg of crude peptide.

前記粗製ペプチドを水に溶解し、遠心分離（１５０００ｒｐｍで５分間）を行ない、上清を０．４５ｍｍフィルターで濾過し、この溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、ペプチドを精製した。ＨＰＬＣはＬＫＢ２１５１高圧グラジエントシステム（ファルマシア社製）を用い、カラムは逆相系の市販カラム（東ソー社製。ＯＤＳ１２０Ｔ。２１．５×３００ｍｍ）を用いた。溶離液は０．１％ＴＦＡ／水をＡ液、８０％アセトニトリル／Ａ液をＢ液として、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配により溶出した。クロマトグラムはほぼ単一のピークと認められ、相当する画分を分取した。この分取操作を数回反復し、凍結乾燥し、精製した抗菌性ペプチド約３０．５ｍｇを得た。   The crude peptide was dissolved in water, centrifuged (15000 rpm for 5 minutes), the supernatant was filtered through a 0.45 mm filter, and this solution was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) to purify the peptide. For the HPLC, an LKB 2151 high-pressure gradient system (Pharmacia) was used, and for the column, a reverse phase commercial column (Tosoh, ODS120T, 21.5 × 300 mm) was used. The eluent was 0.1% TFA / water solution A and 80% acetonitrile / water solution B was eluted with a concentration linear gradient from solution A to solution B. The chromatogram was recognized as a single peak, and the corresponding fraction was collected. This preparative operation was repeated several times and freeze-dried to obtain about 30.5 mg of purified antibacterial peptide.

精製ペプチドは、常法のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、元素分析及び質量分析を実施し、目的とする配列番号２に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。   The purified peptide was subjected to conventional amino acid analysis, amino acid sequence analysis, elemental analysis, and mass spectrometry, and confirmed to have the target amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

〔参考例４〕
使用するアミノ酸の順序が異なることを除き、参考例３と同様の操作を行ない、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は約５８１ｍｇ、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は約８３．３ｍｇであり、精製した抗菌性ペプチド約５９．９ｍｇを得た。参考例３と同一の試験方法により配列番号３に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。 [Reference Example 4]
A peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 was synthesized in the same manner as in Reference Example 3 except that the order of amino acids used was different. The yield of the acylated protected peptide resin was about 581 mg, and the yield of the crude peptide after deprotection and deresining was about 83.3 mg, and about 59.9 mg of purified antimicrobial peptide was obtained. It was confirmed to have the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 by the same test method as in Reference Example 3.

〔参考例５〕
参考例１と同様に精製したヒトラクトフェリン１０ｇ（純度９７％）を用い参考例２と同様の操作を行なった。脱塩後の抗菌性ペプチドの収量は約２５ｍｇであった。 [Reference Example 5]
The same operation as in Reference Example 2 was performed using 10 g (purity 97%) of human lactoferrin purified as in Reference Example 1. The yield of antibacterial peptide after desalting was about 25 mg.

得られた精製ペプチドは、常法のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、元素分析及び質量分析により、配列番号４及び配列番号５に示すアミノ酸配列を有するジペプチドであることを確認した。尚、配列番号４に示すペプチドの９番目のCys と２６番目のCys がジスルフィド結合し、配列番号４に示すペプチドの３５番目のCys と配列番号５に示すペプチドの１０番目のCys とがジスルフィド結合していると推定される。   The obtained purified peptide was confirmed to be a dipeptide having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 by conventional amino acid analysis, amino acid sequence analysis, elemental analysis, and mass spectrometry. The 9th Cys and 26th Cys of the peptide shown in SEQ ID NO: 4 are disulfide bonded, and the 35th Cys of the peptide shown in SEQ ID NO: 4 and the 10th Cys of the peptide shown in SEQ ID NO: 5 are disulfide bonded. It is estimated that

〔参考例６〕
使用するアミノ酸の順序が異なることを除き、参考例３と同様の操作を行ない、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は約８３０ｍｇ、脱保護、脱樹脂後のCys(Acm)粗製ペプチドの収量は約２０１．０ｍｇ、酸化した粗製ペプチド１６９．２ｍｇ、精製した抗菌性ペプチド約６２．１ｍｇを得た。参考例３と同一の試験方法により配列番号６に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。 [Reference Example 6]
A peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 was synthesized in the same manner as in Reference Example 3 except that the order of amino acids used was different. The yield of acylated protected peptide resin was about 830 mg, the yield of Cys (Acm) crude peptide after deprotection and deresin was about 201.0 mg, oxidized crude peptide 169.2 mg, and purified antimicrobial peptide about 62.1 mg. Obtained. It was confirmed to have the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6 by the same test method as in Reference Example 3.

〔参考例７〕
使用するアミノ酸の順序が異なることを除き、参考例３と同様の操作を行ない、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は約５７０ｍｇ、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は約５９．５ｍｇであり、精製した抗菌性ペプチド約３８．２ｍｇを得た。参考例３と同一の試験方法により配列番号７に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。 [Reference Example 7]
A peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 was synthesized in the same manner as in Reference Example 3 except that the order of amino acids used was different. The yield of the acylated protected peptide resin was about 570 mg, and the yield of the crude peptide after deprotection and deresining was about 59.5 mg, and about 38.2 mg of purified antimicrobial peptide was obtained. It was confirmed to have the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 7 by the same test method as in Reference Example 3.

〔参考例８〕
使用するアミノ酸の順序が異なることを除き、参考例３と同様の操作を行ない、配列番
号８に示すアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は約７５０ｍｇ、脱保護、脱樹脂後のCys(Acm)粗製ペプチドの収量は約１８６．８ｍｇであり、酸化した粗製ペプチド１３１．２ｍｇ、精製した抗菌性ペプチド約５１．４ｍｇを得た。参考例３と同一の試験方法により配列番号８に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。 [Reference Example 8]
A peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 was synthesized in the same manner as in Reference Example 3 except that the order of amino acids used was different. The yield of acylated protected peptide resin was about 750 mg, the yield of Cys (Acm) crude peptide after deprotection and deresining was about 186.8 mg, 131.2 mg of oxidized crude peptide, about 51. 1 of purified antimicrobial peptide. 4 mg was obtained. It was confirmed to have the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8 by the same test method as in Reference Example 3.

〔参考例９〕
この例は、ヒトのラクトフェリン類由来ペプチドを定量するための本発明のキットに含まれるポリクローナル抗体の作成を示すものである。 [Reference Example 9]
This example shows the preparation of a polyclonal antibody contained in the kit of the present invention for quantifying peptides derived from human lactoferrins.

参考例５と同一の方法により製造した配列番号４及び配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する抗菌性ペプチドダイマー４００μｇを１．２ｍｌの生理食塩水に溶解し、１．５ｍｌのフロイント完全アジュバントと共に、４匹の１４週齢Ｊｌａ：ＪＷ系雄ウサギの皮下に１匹当たり０．５ｍｌづつ注射した。初回免疫より３週間及び５週間目に前記と同様に作成した抗菌性ペプチドダイマー溶液をフロイント不完全アジュバントと共に同じく注射した。最終免疫７日後にウサギを屠殺し血清を調製した。血清は１匹当たり１５０ｍｌ得られた。   400 μg of the antibacterial peptide dimer having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 produced by the same method as in Reference Example 5 was dissolved in 1.2 ml of physiological saline, together with 1.5 ml of Freund's complete adjuvant, Four 14-week-old Jla: JW male rabbits were injected subcutaneously with 0.5 ml per mouse. The antibacterial peptide dimer solution prepared in the same manner as described above was injected together with Freund's incomplete adjuvant at 3 weeks and 5 weeks after the initial immunization. Seven days after the final immunization, the rabbits were sacrificed and serum was prepared. 150 ml of serum was obtained per animal.

ＭＡＰＳII結合緩衝液（バイオラッド社製）で平衡化したプロテインＡゲル（バイオラッド社製）２５ｍｌを充填したカラム（２０ｍｍ×８００ｍｍ）にＭＡＰＳII結合緩衝液で３倍に希釈した血清を５ｍｌ／分の流速でそれぞれアプライした。カラムはＭＡＰＳII結合緩衝液４００ｍｌで洗浄した後、ＭＡＰＳII溶出緩衝液７０ｍｌ（バイオラッド社製）で結合した抗体を溶出した。水酸化ナトリウムで直ちにｐＨを中性に調整した抗体溶液は分注し、使用するまで凍結保存した。   A column (20 mm × 800 mm) packed with 25 ml of Protein A gel (Biorad) equilibrated with MAPSII binding buffer (BioRad) was diluted 5 times with MAPSII binding buffer to 5 ml / min. Each was applied at a flow rate. The column was washed with 400 ml of MAPSII binding buffer, and then the bound antibody was eluted with 70 ml of MAPSII elution buffer (Biorad). The antibody solution immediately adjusted to neutral pH with sodium hydroxide was dispensed and stored frozen until use.

次に、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

〔実施例１〕
この例は、合成ペプチドを抗原とした抗ウシ抗菌性ペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製を示すものである。 [Example 1]
This example shows the production of an anti-bovine antibacterial peptide monoclonal antibody-producing hybridoma using a synthetic peptide as an antigen.

(i) 抗原の作成
１６ｍｇのＫＬＨ（ピアス社製）を１ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、２．８ｍｇのｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロサクシニミド・エステル（m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester：以下「ＭＢＳ」と記載する。和光純薬工業社製）を添加し、３０分間撹袢した。溶液を０．４５μｍのフィルターで瀘過し、セファデックスＧ−２５(Sephadex G-25：ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーにかけ、ＫＬＨ−ＭＢＳ溶液約５ｍｌを分取した。 (i) Preparation of antigen 16 mg of KLH (Pierce) was dissolved in 1 ml of 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.2), and 2.8 mg of m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester ( m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester: hereinafter referred to as “MBS” (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and stirred for 30 minutes. The solution was filtered with a 0.45 μm filter and subjected to Sephadex G-25 (Sephadex G-25: Pharmacia) column chromatography to collect about 5 ml of KLH-MBS solution.

この溶液に２．５ｍｌの０．２Ｍリン酸二ナトリウム溶液及び参考例３と同一の方法により製造した１０ｍｇの化学合成抗菌性ペプチド（配列番号２に示す配列を有する）を添加し、アルゴンガスで置換し、室温で３０分間反応させ、この溶液を免疫に使用するまで冷凍保存した。   To this solution was added 2.5 ml of 0.2 M disodium phosphate solution and 10 mg of a chemically synthesized antibacterial peptide (having the sequence shown in SEQ ID NO: 2) produced by the same method as in Reference Example 3, and argon gas was used. The solution was replaced, reacted at room temperature for 30 minutes, and this solution was stored frozen until used for immunization.

(ii)マウスの感作
前記の溶液５０μｌを生理食塩水１ｍｌと混合し、１．５ｍｌのフロイント完全アジュバントと共に５匹の６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に１匹当たり４００μｌを注射した。以後２週間の間隔で同様に３回免疫を行った。免疫の過程で抗原に対する血清の抗体価
の上昇を、マウスから採血してＥＬＩＳＡ法により観察した。最も抗体価の高かったマウスに、１５０μｌのＰＢＳに溶解した１５μｇの配列番号２に示す化学合成抗菌性ペプチドを尾静脈から注射し、ブーストとした。 (ii) Mouse sensitization 50 μl of the above solution was mixed with 1 ml of physiological saline, and 400 μl per mouse was injected subcutaneously into 5 6-week-old BALB / c mice with 1.5 ml of Freund's complete adjuvant. Thereafter, immunization was carried out three times in the same manner at intervals of 2 weeks. In the course of immunization, the increase in the antibody titer of serum against the antigen was collected from mice and observed by ELISA. The mouse with the highest antibody titer was injected with 15 μg of the chemically synthesized antibacterial peptide shown in SEQ ID NO: 2 dissolved in 150 μl of PBS through the tail vein to give a boost.

（iii)細胞融合
最終免疫３日後に脾細胞を無菌的に摘出し、ステンレスメッシュで単細胞にほぐし、ＲＰＭＩ１６４０（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２ｍＭ Ｌ−グルタミン）で３回洗浄し、脾細胞の約１／４量のＸ−６３−Ａｇ８６．５．３ミエローマ細胞（ギブコ社製）と混合して遠心した。細胞のペレットに５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００を添加し、細胞融合を行い、遠心した細胞ペレットに、３０％ウシ胎児血清（ギブコ社製。以下ＦＣＳと記載する）入りヒポキサンチン・チミジン（hypoxantine thymidine)培地を加え、９６穴マイクロプレート１９枚に播種し、翌日、各ウェルにＨＡＴ培地を添加した。 (Iii) Cell fusion Splenocytes are aseptically removed 3 days after the final immunization, loosened into single cells with a stainless mesh, washed 3 times with RPMI 1640 (25 mM HEPES and 2 mM L-glutamine), and about 1/4 volume of splenocytes. X-63-Ag86.5.3 myeloma cells (manufactured by Gibco) and centrifuged. 50% polyethylene glycol (PEG) 1500 was added to the cell pellet, cell fusion was performed, and the centrifuged cell pellet was subjected to hypoxanthine thymidine (hypoxantine) containing 30% fetal calf serum (Gibco, hereinafter referred to as FCS). thymidine) medium was added, seeded on 19 96-well microplates, and HAT medium was added to each well the next day.

（iv) 限界希釈と抗体の特異性
融合後１３００ウェルからコロニーが生育し、これらの培養上清について、ウシラクトフェリン由来の抗菌性ペプチドを抗原とするＥＬＩＳＡ法を行い、抗原と強く反応するハイブリドーマを得た。限界希釈によるクローニングを４回反復し、安定した抗体産生を示すクローン８個を得た。 (Iv) Limit dilution and antibody specificity Colonies grow from 1300 wells after fusion, and these culture supernatants are subjected to ELISA using an antibacterial peptide derived from bovine lactoferrin as an antigen, and hybridomas that react strongly with the antigen are detected. Obtained. Cloning by limiting dilution was repeated 4 times to obtain 8 clones showing stable antibody production.

〔実施例２〕
この例は、ウシラクトフェリンから調製したウシ抗菌性ペプチドを抗原とした抗ウシ抗菌性ペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製を示すものである。 [Example 2]
This example shows the production of a hybridoma producing an anti-bovine antibacterial peptide monoclonal antibody using a bovine antibacterial peptide prepared from bovine lactoferrin as an antigen.

参考例２と同一の方法により製造した配列番号１に示すウシラクトフェリン由来の抗菌性ペプチド１ｍｇを、生理食塩水１ｍｌに溶解し、１．５ｍｌのフロイント完全アジュバントと共に８匹の６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に１匹当たり３００μｌの割合で注射した。以下、実施例１と同一の方法により、安定した抗体産生を示すクローン１２個を得た。   1 mg of an antibacterial peptide derived from bovine lactoferrin shown in SEQ ID NO: 1 produced by the same method as in Reference Example 2 was dissolved in 1 ml of physiological saline and 8 6-week-old BALB / c together with 1.5 ml of Freund's complete adjuvant. Mice were injected subcutaneously at a rate of 300 μl per mouse. Thereafter, 12 clones showing stable antibody production were obtained by the same method as in Example 1.

〔実施例３〕
この例は、合成ペプチドを抗原とした抗ヒト抗菌性ペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製を示すものである。
参考例６と同一の方法により製造した配列番号６に示す抗菌性ペプチドを用いたことを除き、実施例２と同一の方法により、抗体を産生するクローン６個を得た。 Example 3
This example shows the production of a hybridoma producing an anti-human antibacterial peptide monoclonal antibody using a synthetic peptide as an antigen.
Six clones producing antibodies were obtained by the same method as in Example 2 except that the antimicrobial peptide shown in SEQ ID NO: 6 produced by the same method as in Reference Example 6 was used.

〔実施例４〕
参考例４と同一の方法により製造した配列番号３に示す抗菌性ペプチドを用いたことを除き、実施例１と同一の方法により、抗体を産生するクローン８個を得た。 Example 4
Eight clones producing antibodies were obtained by the same method as in Example 1 except that the antibacterial peptide shown in SEQ ID NO: 3 produced by the same method as in Reference Example 4 was used.

〔実施例５〕
参考例５と同一の方法により製造した配列番号４及び配列番号５に示す抗菌性ペプチドダイマーを用いたことを除き、実施例２と同一の方法により、抗体を産生するクローン１０個を得た。 Example 5
Ten clones producing antibodies were obtained by the same method as in Example 2 except that the antimicrobial peptide dimer shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 produced by the same method as in Reference Example 5 was used.

〔実施例６〕
参考例７と同一の方法により製造した配列番号７に示す抗菌性ペプチドを用いたことを除き、実施例１と同一の方法により、抗体を産生するクローン８個を得た。 Example 6
Eight clones producing antibodies were obtained by the same method as in Example 1 except that the antibacterial peptide shown in SEQ ID NO: 7 produced by the same method as in Reference Example 7 was used.

〔実施例７〕
参考例８と同一の方法により製造した配列番号８に示す抗菌性ペプチドを用いたことを
除き、実施例２と同一の方法により、抗体を産生するクローン６個を得た。 Example 7
Six clones producing antibodies were obtained by the same method as in Example 2 except that the antibacterial peptide shown in SEQ ID NO: 8 produced by the same method as in Reference Example 8 was used.

〔実施例８〕
この例は、ウシラクトフェリン由来の抗菌性ペプチドの定量法を示すものである。
１ｍｌ当たり１ｍｇのウシラクトフェリンを含有する溶液１００ｍｌを経口摂取したヒトの胃液を５分後に回収し、回収した胃液に０．０１％の割合でペプスタチンＡ（シグマ社製）を添加し、体外でのプロテアーゼ活性によるタンパク質の分解を防止した。 Example 8
This example shows a method for quantifying an antimicrobial peptide derived from bovine lactoferrin.
Human gastric juice that was orally ingested 100 ml of a solution containing 1 mg of bovine lactoferrin per ml was collected 5 minutes later, and pepstatin A (manufactured by Sigma) was added to the collected gastric juice at a rate of 0.01%. Protein degradation due to protease activity was prevented.

試験例２と同一の方法により、胃液試料及び標準の抗菌性ペプチドを電気泳動により分離し、メンブレンにブロッティングし、実施例１と同一の方法で得たクローンが産生する抗体を用いて免疫染色した。   A gastric juice sample and a standard antibacterial peptide were separated by electrophoresis by the same method as in Test Example 2, blotted on a membrane, and immunostained using an antibody produced by a clone obtained by the same method as in Example 1. .

免疫染色された抗菌性ペプチドのバンドをＰＤＩ電気泳動解析システム（東洋紡社製）で定量した結果、ウシラクトフェリンを摂取したヒトの胃液中には摂取したウシラクトフェリンから生じた活性型の抗菌性ペプチドが存在すること、及びその濃度は２０μｇ／ｍｌであることが判明した。   As a result of quantifying the band of the immunostained antibacterial peptide with the PDI electrophoresis analysis system (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), the active antibacterial peptide generated from the ingested bovine lactoferrin was found in the gastric juice of the ingested bovine lactoferrin. It was found to be present and its concentration was 20 μg / ml.

〔実施例９〕
この例は、抗菌性ペプチドを検出又は定量するための試薬キットを示すものである。
本発明にかかるモノクローナル抗体を用い、胃液、腸内容物、便、血液、尿中のヒト抗菌性ペプチドをＥＬＩＳＡ法により検出又は定量するキットを次のとおり作製した。 Example 9
This example shows a reagent kit for detecting or quantifying antibacterial peptides.
Using the monoclonal antibody according to the present invention, a kit for detecting or quantifying human antibacterial peptides in gastric juice, intestinal contents, stool, blood and urine by ELISA was prepared as follows.

本発明のキットは、参考例９と同一の方法により製造した抗ヒト抗菌性ペプチドポリクローナル抗体プレコート９６穴マイクロプレート、リン酸緩衝液、実施例５と同一の方法により製造した抗ヒト抗菌性ペプチドモノクローナル抗体、洗浄液、ペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体、ヒト抗菌性ペプチドスタンダード溶液、及び０．１％濃度のｏ−フェニレンジアミン溶液からなり、それぞれ個別に収納されている。   The kit of the present invention comprises an anti-human antibacterial peptide polyclonal antibody pre-coated 96-well microplate produced by the same method as in Reference Example 9, a phosphate buffer, and an anti-human antibacterial peptide monoclonal produced by the same method as in Example 5. The antibody, washing solution, peroxidase-conjugated anti-mouse antibody, human antibacterial peptide standard solution, and 0.1% o-phenylenediamine solution are contained individually.

電気泳動後のタンパク質をブロットしたニトロセルロース紙の、アミドブラック染色図（図１のＡ）及び本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫染色図（図１のＢ）である。FIG. 2 is an amide black stained diagram (A in FIG. 1) and an immunostained diagram using the monoclonal antibody of the present invention (B in FIG. 1) of nitrocellulose paper on which proteins after electrophoresis were blotted.

Claims (1)

マウスの皮下に配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとフロイント完全アジュバントを投与して免疫し、最終免疫３日目に脾臓を摘出し、摘出した脾臓から採取した脾細胞とミエローマ細胞をポリエチレングリコールを添加して細胞融合し、融合した細胞から配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、限界希釈法を行ってモノクローナル化されたハイブリドーマを得ることを特徴とする配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原としたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの製造方法。 The mouse is immunized by subcutaneous administration of a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and Freund's complete adjuvant, and the spleen is removed on the third day of final immunization, and spleen cells and myeloma cells collected from the removed spleen are treated with polyethylene. A hybridoma that produces an antibody that binds to the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is selected from the fused cells by adding glycol to the cells, and a monoclonal hybridoma is obtained by performing a limiting dilution method A method for producing a monoclonal antibody-producing hybridoma using the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 as an antigen.

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