JP3577485B2 - バチルス・サーキュランス新規菌を用いた大豆粕由来の植物成長肥料 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、タンパク質分解酵素を産生して大豆粕のタンパク質が特異的早期に低分子化分解される新規菌株を用いて生成した植物に対する根毛増殖を伴う大豆粕由来の植物成長肥料に関するものである。
【０００２】
【技術的背景】
日本国内において大正１０年頃までは、植物に対する肥料として大豆粕などの植物油搾り粕類の肥料や魚肥が広く利用されていたが、これら有機質肥料は高分子タンパク質を主成分とするために植物への吸収が長期化し、また、安価な硫安や尿素の化学肥料が激増し、更には、今では硫安等より効果の高い化学肥料や農薬が開発されたために、大豆粕の肥料はほとんど利用されていないのが現状である。
ところで、化学肥料の使用初期効果は非常に優れているが、使用を回数が重なるに伴ない土中への蓄積を増大することになり、それにより土中微生物の存在種類及び量が限定減少され、且つ、土壌が硬くなり、根毛を張ることができずに植物の成長を逆に阻害してしまう点が指摘されることになった。
このような状況下であっても、大豆油の搾り粕である大豆粕には顧みられなく、ほとんど利用されず、一部家畜の飼料として利用されている以外は埋め立てや海洋投棄されているのが現状である。
本発明者等は、この大豆粕の有効利用を図るべく鋭意研究する中で、大豆粕のタンパク質を特異的早期に低分子化分解する新規菌株を見い出し、この新規菌株を用いて、短期間にタンパク質を低分子化分解して植物への吸収をよくし、且つ根毛の増殖を伴う植物成長肥料が完成されるに至った。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、プロテアーゼを産生し、タンパク質を早期に低分子化分解する新規菌株を提供し、この新規菌株が用いられて大豆粕のタンパク質を短期間に低分子化分解し、植物に対する根毛増殖を伴なう植物成長肥料として有効に利用し、従来の化学肥料では絶対に不可能なタンパク質の低分子化分解による早期吸収を可能とする。しかも、原料が安価で且つ環境や人体に悪影響を及ぼす惧れのない大豆粕とされ、大豆粕の利用促進を図ることを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
斯る目的を達成する本発明の微生物は、バチルス属に属し、タンパク質分解酵素を産生し、大豆粕を特異的早期に低分子化分解する菌株であり、詳しくはバチルス・サーキュランスＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）及び／又はバチルス・ステアロサーモフィルスＨＡ１９（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２９）の新規菌株である。
また、本発明に係る大豆粕由来植物成長肥料としては、大豆粕に水を加えた溶液を原料とし、この溶液のタンパク質を新規菌株で分解し、早期に、且つ効率的に低分子化することにより生成できることを特徴とし、大豆粕のタンパク質を分解する新規菌株がバチルス・サーキュランスＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）である事を特徴としたものである。
【０００５】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明する。
【０００６】
［大豆粕分解微生物のスクリーニング］
＜大豆粕液体培地の調整＞
大豆粕１ｇに蒸留水１００ｍｌを加えて、５００ｍｌ振盪培養フラスコでオートクレーブ（１２１℃／２０ｍｉｎ ）を行ない大豆粕液体培地とした。
【０００７】
＜スクリーニング用培地の調整＞
３００ｍｌ三角フラスコに、ペプトン１ｇと酵母エキス０．５ｇ，塩化ナトリウム０．５ｇ，寒天０．５ｇ，カゼイン２ｇ及び蒸留水１００ｍｌを加え、蓋をして高圧蒸気滅菌（１２１℃／２０ｍｉｎ ）を行ない、オートクレーブ終了後、培地が６０〜７０℃に冷えてから、三角フラスコの底部に濃く溶けた寒天を良く振り混ぜながら、乾熱滅菌したシャーレに分注して、ＬＢ＋寒天＋カゼインのプレート（培地）を作成した。
【０００８】
＜前培養用ＬＢ液体培地の調整＞
ペプトン１ｇと酵母エキス０．５ｇ，塩化ナトリウム０．５ｇ及び蒸留水１００ｍｌを加えて、前培養用のＬＢ液体培地となし、オートクレーブにて滅菌した後滅菌試験管１０本に５ｍｌずつ分注した。
【０００９】
而して、自然界から採集してきた土壌サンプル１ｇを前記大豆粕液体培地に加え、１５０回転／ｍｉｎ の振盪培養器で５０℃に保持して２４時間振盪培養した。振盪培養終了後、その培養液１００μｌ を１０ｍｌの希釈用滅菌水が入った試験管に分注して希釈し、さらにその希釈培養液１００μｌ を希釈用滅菌水１０ｍｌ入りの試験管に分注する操作を２回行なって、培養液を１０６ 倍に希釈した。
【００１０】
この希釈培養液１００μｌ をスクリーニング用培地である前記ＬＢ＋寒天＋カゼインのプレートに分注して、コンラジ棒にて広げ、５０℃で１２時間培養し、生育したコロニーの数，色，形態，ハローの様子などを観察した。
【００１１】
そして、生育したコロニーの中からハローが観察されたシングルコロニーを、滅菌した爪楊枝でもって前記ＬＢ＋寒天＋カゼインのプレート（スクリーニング用培地）に植菌し、５０℃で１２時間培養した。
然る後、生育したそれぞれのシングルコロニーから１白金耳の量を採取し、それを前培養用ＬＢ液体培地を入れた試験管内に加え、５０℃で１２時間培養した（前培養）。
【００１２】
次に、上記前培養した前培養液を大豆粕液体培地に１ｍｌずつ加え、１５０回転／ｍｉｎ の振盪培養器で５０℃に保持して２４〜７２時間振盪培養した。
その結果、振盪培養器内の大豆粕がドロドロになっていた場合、その菌をプラス（＋）とし、それ以外をマイナス（−）と判定した。尚、表皮の堅い部分は除いて考えた。
【００１３】
［大豆粕資化の判定と各菌株の生育温度］
＜培養条件＞
３００ｍｌ三角フラスコに、ペプトン１ｇと酵母エキス０．５ｇ，塩化ナトリウム０．５ｇ，寒天２ｇ及び蒸留水１００ｍｌを加え、オートクレーブで滅菌後、乾熱滅菌したシャーレに分注して、ＬＢ＋寒天のプレート（培地）を作成した。
【００１４】
大豆粕分解微生物のスクリーニングでプラス（＋）と判定された菌を滅菌した爪楊枝で採取し、上記ＬＢ＋寒天のプレート（培地）に植菌し、３０℃以下と、３７．５℃，５０℃，７０℃，７５℃及び８０℃に設定した恒温器で１２時間培養した。
そして、カゼインを分解してタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）を産生しているハローが観察された菌をプラス（＋）とし、それ以外の菌をマイナス（−）と判定した。その結果、大豆粕培地で生育する菌株を合計２０株取得することができ、それぞれＨＡ１〜ＨＡ２０と命名した。
【００１５】
取得した大豆粕分解菌と培養条件（温度）をまとめて下記の表１に示す。
【表１】

【００１６】
［菌株の同定］
分離選別した大豆粕分解菌の菌学的性質を調べるために、グラム染色を始めとした種々の確認試験をそれぞれ下記の手法により行なった。
【００１７】
１．グラム染色
Ｈｕｃｋｅｒの変法に従って、スライドガラス上に塗抹し、乾燥後火炎固定した菌液について、Ｈｕｃｋｅｒの液（１．５％クリスタルバイオレット−エタノール溶液）で３０秒間染色した。染色後ただちに水洗いし、Ｌｕｇｏｌ 液で１分間媒染した。媒染終了後水洗し、さらにアルコールで３０秒間脱色し、ただちに水洗した。水をよく切った後、サフラニンで３０秒間染色を行なった。染色した標本を顕微鏡で観察し、紫色に染色された菌をグラム陽性とし、赤色に染色された菌をグラム陰性とした。また、検鏡により菌の形態を観察した。
【００１８】
２．生育温度
下記組成の液状チオグリコレート培地を１２１℃で１５分間滅菌し、試験管に５ml分注した。この培地にコロニーから採取した菌を植え、３７℃，２５℃のそれぞれの中温域温度で静置培養して、１２時間または２４時間後に培地が混濁したものを生成したと判断した。
＜液状チオグリコレート培地の組成＞
Ｌ−シスチン ０．７５ｇ
ＮａＣｌ ２．５ｇ
ブドウ糖 ５．０ｇ
酵母エキス ５．０ｇ
寒天 ０．７５ｇ
カゼイン消化物 １５．０ｇ
チオグリコール酸ナトリウム ０．５ｇ
０．１％レザズリン １．０ml
蒸留水 １０００ml
ｐＨ ７．２
【００１９】
３．オキシダーゼ
テルモ（株）製バクトラボ オキシダーゼ・テストを用いて試験した。即ち、二塩化Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミンを含んだ綿棒に菌体を付け、オキシダーゼ活性により生成する青紫色を生じた場合に、オキシダーゼ陽性と判断した。
【００２０】
４．カタラーゼ
毛細管の一端に菌を付けた後、毛細管の菌を付けた一端から３％過酸化水素水を吸い上げて菌体と過酸化水素水とを毛細管内で混合させた。毛細管内で過酸化水素分解にともない酸素の気泡が発生した場合をカタラーゼ陽性とした。
【００２１】
５．硝酸塩還元能
０．１％硝酸ナトリウム加ブイヨン培地に菌を接種し、最適生育温度で５日間培養した。得られた培養液に、α− ナフチルアミン液（α− ナフチルアミン０．１ｇを３０％酢酸水溶液２００ｍｌに溶解したもの）１．０ｍｌとスルファニル酸液（スルファニル酸０．５ｇを３０％酢酸水溶液１５０ｍｌに溶解したもの）１．０ｍｌを加えてよく混和させた後、３０分以内に硝酸還元により生成した亜硝酸による桃赤色を呈した場合を陽性とした。
【００２２】
６．クリグラー培地
下記組成のクリグラー培地を試験管に分注した後、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌して高層斜面に固めた。斜面部分および高層部分に被検菌を植え、各菌の生育温度で１８〜２４時間培養した。培養後、斜面部分が黄変色した場合を斜面部陽性（乳糖を分解し酸を生成）とし、高層部分で黄変色した場合を高層部陽性（ブドウ糖を分解し酸を生成）とした。
尚、表２に示した（ＮＣ）は斜面部陰性を、（Ｙ）は高層部陽性を、（Ｒ）は高層部陰性を、それぞれ意味する。
＜クリグラー培地の組成＞
肉エキス ４．０ｇ ペプトン １５．０ｇ
乳糖 １０．０ｇ ブドウ糖 １．０ｇ
塩化ナトリウム ５．０ｇ チオ硫酸ナトリウム ０．０８ｇ
亜硫酸ナトリウム ０．４ｇ 硫酸第一鉄 ０．２ｇ
フェノール赤 ０．０２ｇ 寒天末 １５．０ｇ
精製水 １０００ｍｌ ｐＨ ７．２
【００２３】
７．ＳＣ培地
下記組成の培地を蒸留水に溶し約２ｍｌずつ試験管に分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し全斜面に固めた。斜面部分に被検菌を植え、各菌の生育温度で１８〜２４時間培養した。この培地に含まれる唯一の炭素源であるクエン酸を利用し生育した場合を陽性とした。陽性の場合に、培地に含まれるブロム・チモールが緑色から深青色に変色した。
＜ＳＣ培地の組成＞
塩化ナトリウム ５．０ｇ
硫酸マグネシウム ０．２ｇ
リン酸二水素アンモニウム １．０ｇ
リン酸二水素カリウム １．０ｇ
クエン酸ナトリウム ２．０ｇ
ブロム・チモール青 ０．０８ｇ
寒天末 １５．０ｇ
精製水 １０００ｍｌ
ｐＨ ６．８
【００２４】
８．ＳＩＭ培地
下記組成の培地を１０００ｍｌの蒸留水に加温溶解して約３ｍｌずつ試験管に分注し、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した後高層に固めた。被検菌を高層部分に穿刺し、それぞれの菌の生育温度で１８〜２４時間培養した。培養後培地が黒変した場合を硫化水素発生（＋）とし、穿刺部分から広がって生育した場合を運動性（＋）とし、さらに培地上部にクロロホルム１ｍｌを重層し、その上にコバック試薬１ｍｌを重層してクロロホルム層が赤変した場合をインドール（＋）とした。
＜ＳＩＭ培地の組成＞
エールリッヒ肉エキス ３．０ｇ
プロテオーゼペプトン １０．０ｇ
ポリペプトン ２０．０ｇ
チオ硫酸ナトリウム ０．２ｇ
クエン酸鉄アンモニウム ０．２ｇ
寒天末 ３．０ｇ
精製水 １０００ｍｌ
ｐＨ ７．３
【００２５】
９．メチルレッド
下記組成のグルコース−リン酸塩−ペプトン水を試験管に３ｍｌ分注し、１００℃で３０分間の滅菌操作を３回繰返した。この培地に被検菌を植え、各菌の生育温度で３日間培養した。得られた培養液１ｍｌを別の試験管に移し、メチルレッドを滴下し、培地色調が赤変した場合を陽性とした。
＜グルコース−リン酸塩−ペプトン水の組成＞
ペプトン ７．０ｇ リン酸二水素カリウム ５．０ｇ
ブドウ糖 ５．０ｇ 蒸留水 １０００ｍｌ
【００２６】
１０．フォゲスプロスカウエル（ＶＰ）
上記グルコース−リン酸塩−ペプトン水を試験管に３ｍｌ分注し、１００℃で３０分間の滅菌操作を３回繰返した。この培地に被検菌を植え、各菌の生育温度で３日間培養した。得られた培養液１ｍｌを別の試験管に移し、これにα−ナフトール液（５％α−ナフトール−無水エタノール溶液）０．６ｍｌと４０％ＫＯＨ水溶液０．２ｍｌを加えてよく混和させた後、試験管を斜めに傾けて静置した。静置後１５分後と１時間後にそれぞれ培地色調の変化を観察し、培地色調が濃赤色となったものを陽性とした。
【００２７】
１１．ＯＦ（Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ）
Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎの方法に従って、下記組成のＯＦ培地を１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、培地が６０℃程度に冷めたところで終濃度１％となるように濾過滅菌したグルコースを加え、得られた培地を２本の試験管にそれぞれ３ｍｌ分注し、高層に固めた。この培地に被検菌を穿刺し、１本の試験管には流動パラフィンを１〜２ｃｍの厚さに重層して嫌気的に培養し、他方の試験管はそのまま好気的に培養した。各菌体の生育温度で３〜４日間培養した後、酸化的糖分解を行なう菌で好気的条件で培養した培地色調が黄変したものを（Ｏ）と結果に表記し、発酵的糖分解を行なう菌で好気的及び嫌気的両条件で培地色調が黄変したものを（Ｆ）と結果に表記し、また４日間の培養後さらに次の７日間に糖分解が観察されたものを（Ｗ）と結果に表記した。
＜ＯＦ培地の組成＞
トリプトン ２．０ｇ 塩化ナトリウム ５．０ｇ
寒 天 ２．５ｇ リン酸二水素カリウム ０．３ｇ
Ｂ．Ｔ．Ｂ． ０．０３ｇ 蒸留水 １０００ｍｌ
ｐＨ ７．１
【００２８】
１２．Ｕｒｅａｓｅ
下記組成の栄研化学（株）製ウレアーゼ確認用尿素培地（滅菌済み）を用い、０．５〜１．０ｍｌを滅菌済の試験管に分注し、被検菌を接種した。この培地を各被検菌の生育温度で６〜２４時間培養し、アンモニアの生成にともなう培地の赤変を生じた場合を陽性とした。
＜尿素培地の組成＞
ペプトン ２．０ｇ 尿素 ３０．０ｇ
塩化ナトリウム ５．０ｇ リン酸１カリウム ９．０ｇ
リン酸２ナトリウム ３．０ｇ フェノールレッド ０．０１ｇ
ｐＨ ６．２
【００２９】
１３．ＮａＣｌ
１％ペプトン水に種々の濃度のＮａＣｌを加え、滅菌した培地（ｐＨ７．２）を約３ｍｌ試験管に加えて被検菌を植菌後、各菌体の生育温度で１８〜２４時間静置培養した。そして培養液が混濁したものを陽性とした。
【００３０】
１４．マンニット食塩（ＭＳ）培地
下記組成の栄研化学（株）製マンニット食塩培地「栄研」を用い、この培地１１２ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解して、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した。滅菌した培地を滅菌したシャーレに約２０ｍｌずつ分注し、平板に固めた。得られた平板培地に被検菌を植菌し、各菌体の生育温度で２４〜４８時間培養した。
マンニットを分解しコロニーの周囲が黄変したものをＭＳ陽性とし、黄変せず生育しコロニーを形成したものをＮａＣｌ陽性とした。
＜マンニット食塩培地「栄研」の組成＞
肉エキス「栄研」 ２．５ｇ ペプトン「栄研」 １０．０ｇ
マンニット １０．０ｇ 塩化ナトリウム ７５．０ｇ
フェノールレッド ０．０２５ｇ 寒 天 １５．０ｇ
【００３１】
１５．Ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ
普通寒天１５ｍｌを溶解し４５℃に保ちながら、これに５％の割合で脱繊維素血液を加えた。この培地に微量の被検菌を植えてよく混和し、滅菌シャーレに注ぎ平板に固めた。各菌の生育温度で２４時間培養し、溶血の有無により判定した。溶血を起しハローを生じたものを陽性とした。
【００３２】
１６．エスクリン
１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した下記組成のＢａｒｓｉｅｋｏｗ 培地が８０℃に冷えたところで濾過滅菌したエスクリン（配糖体）を０．５％の割合で加え、滅菌試験管に２ｍｌ分注した。この培地に被検菌を植菌し、各菌体の生育温度で１８〜２４時間培養し、エスクリン分解により培地色調が青色から黄変した場合を陽性とした。
＜Ｂａｒｓｉｅｋｏｗ培地の組成＞
ペプトン水 １００ｍｌ
０．２％Ｂ．Ｔ．Ｂ溶液 １．２ｍｌ
【００３３】
１７．ゼラチンの液化
普通ブイヨン１０００ｍｌに精製ゼラチン１００ｇを加え、１２１℃で１２分間高圧蒸気滅菌した培地を滅菌試験管に３ｍｌ分注し、高層に固めた。被検菌を高層部分に穿刺し、各菌体の生育温度で１週間培養した。穿刺線に沿ったゼラチン液化の有無を観察し、液化が観察されたものを陽性とした。
【００３４】
１８．オルニチンからの脱炭酸試験
Ｄｉｆｃｏ 社製 Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ １０．５ｇ及びＬ−オルニチン１０．０ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解させ、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、滅菌試験管に３ｍｌ分注した。この培地に被検菌を植菌し、各菌体の生育温度で１８〜２４時間培養し、培地色調が小豆色から黄変したものを陽性とした。
【００３５】
１９．リジンからの脱炭酸試験
Ｄｉｆｃｏ 社製 Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ １０．５ｇ及びＬ−オルニチン１０．０ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解させ、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、滅菌試験管に３ｍｌ分注した。この培地に被検菌を植菌し、各菌体の生育温度で１８〜２４時間培養し、培地色調が赤紫色から黄変したものを陽性とした。
【００３６】
２０．アルギニンからの脱炭酸試験
Ｄｉｆｃｏ 社製 Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ １０．５ｇ及びＬ−オルニチン１０．０ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解させ、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、滅菌試験管に３ｍｌ分注した。この培地に被検菌を植菌し、各菌体の生育温度で１８〜２４時間培養し、培地色調が茶褐色から黄変したものを陽性とした。
【００３７】
２１．糖の資化能判定
前記ＯＦ培地を１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌し、培地温度が６０℃程度に冷めたところで濾過滅菌した糖を１％の割合で加え、よく混和した後、試験管に３ｍｌ分注し、高層に固めた。この培地に被検菌を穿刺し、各菌体の生育温度で２４時間培養し、培地色調が黄変したものを陽性とした。
【００３８】
以上の試験の結果を表２に示す。
【表２】

【００３９】
上記表２に示した種々の同定確認試験の結果から、ここで分離選別した菌株はグラム陽性の中桿菌であり、内胞子を形成し、またオキシダーゼやカタラーゼを産生する、等の性質を有することが確認された。
また、両菌株ともバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する菌株であることが判明し、種名はＨＡ１２がサーキュランス（ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ）、ＨＡ１９がステアロサーモフィルス（ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）であると同定され、それぞれバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＨＡ１２並びにバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）ＨＡ１９と命名した。（以後、これら菌株をそれぞれＨＡ１２，ＨＡ１９と称する。）
これらは、タンパク質を特異的早期に低分子化分解する未知の新規菌株である。そこで、これらの新規菌株は、１９９３年２月１２日に工業技術院微生物工業技術研究所においてＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８及びＦＥＲＭ Ｐ−１３４２９として寄託した。
【００４０】
そこで、大豆粕に水を加えた溶液を原料とし、この溶液のタンパク質を早期に低分子化分解するバチルス・サーキュランスＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）新規菌株を用いて高速且つ効率的に低分子化分解し、これを水で希釈の上、使用に給する大豆粕由来の植物成長肥料が得られることになった。
次に、これら新菌株ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）を用いた大豆粕分解物の挙動について説明する。
新菌株ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）を用いた大豆粕分解過程におけるタンパク質濃度の経時変化をＢＣＡ法を用いて測定した。
【００４１】
［大豆粕液体培地及び試薬の調整］
＜大豆粕液体培地の調整＞
大豆粕１．５ｇに蒸留水１５０ｍｌを加えて、５００ｍｌ振盪培養フラスコでオートクレーブ（１２１℃／２０ｍｉｎ ）を行ない大豆粕液体培地とした。
＜ＢＣＡ試薬の調整＞
試薬Ａ：１００溶＋試薬Ｂ：２溶
【００４２】
＜検量線用標準溶液（ウシアルブミン）の調整＞
下記の表３に従い、種々のタンパク質濃度の標準溶液を調整した。
【表３】

【００４３】
而して、調整した検量線用アルブミン標準溶液０．１ｍｌとＢＣＡ試薬２．０ｍｌとを試験管内で撹拌した後、３７℃の恒温槽内に３０分間放置することによりＢＣＡ反応を行なった。
反応終了後、各試験管を室温まで放置し、同時に測定した水０．１ｍｌとＢＣＡ試薬０．２ｍｌの溶液をブランクとして５６２ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。
【００４４】
次に、オートクレーブした１ｗｔ％大豆粕液体培地（１５０ｍｌ）から１ｍｌを無菌的に採取し、１万ｒｐｍ／１５ｍｉｎ 遠心して得られた上清についてＢＣＡ法によるタンパク質濃度測定を行ない、この操作により得られたタンパク質濃度を培養時間０（ゼロ）におけるタンパク質濃度とした。
同様にして、１ｗｔ％大豆粕液体培地から１ｍｌを無菌的に採取し、その培地に、予め大豆粕液体培地で前培養したＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）の菌液１．５ｍｌをそれぞれ植菌し、５０℃，１５０ｒｐｍ／１５ｍｉｎ の条件で培養を行ない、この培養液から経時的に培養液を無菌的に採取し、各培養時間におけるタンパク質濃度を測定した。新菌株ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）を用いた大豆粕分解過程におけるタンパク質濃度の経時変化を別紙図１に示す。
【００４５】
この図１から理解されるように、新菌株ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）は大豆粕タンパク質を高速で効率良く低分子化分解している。
尚、図１中の白丸はプロテインの濃度を示し、黒丸はペプチドの濃度を示す。
【００４６】
次に、大豆粕に水を加えた溶液を原料とし、この溶液のタンパク質を早期に低分子化分解するバチルス・サーキュラスＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）新規菌株を用いて高速且つ効率的に低分子化分解し、これを水で希釈の上、使用に給する大豆粕由来の植物成長肥料を散布した場合における植物に対する肥料効果について説明する。
（１）小松菜を用いた例
［種子の前処理］
種子に水を吸収させ発芽を促進させるために、種子を蒸留水中に入れ１５時間放置した。
［苗の育成］
採取した土を篩にかけて草の根などを取り除き、市販の腐葉土を一割ほど加えてよく混ぜ合わせ、底に小石を敷いたプランターに約８ｃｍの厚さに入れた。
そして、前処理した種子を約５ｃｍ間隔で数粒ずつ１．５ｃｍほどの深さに植え、毎日朝に水をかけ、通常室温に置き雨を避け、天気の日は外に出し日に当てて、小松菜がある程度成長し間引きを必要とするようになってから実験に使用した。
【００４７】
［発芽促進剤（市販品）及び化学肥料の調整］
発芽促進剤（商品名：メネデール，メネデール社製）２０ｍｌを蒸留水で希釈し１リットルとした。
化学肥料は、リッチェル社製化学肥料５０号（組成：窒素９．０ ％，リン１１．０％，カリ１０．０％）を用い、１株につき５ｇを直接土中に入れて使用した。
［実験用土の前処理］
採取した土を篩にかけて草の根などを取り除き、その土を金属容器に入れアルミホイルで蓋をし、１８０℃で５時間乾熱滅菌を行なった。
【００４８】
［栽培の実施］
家庭栽培用の小型プランターを栽培容器として用い、その内に上記前処理した土を入れ、小松菜の苗を８株ずつ植えた。
そして、新菌株ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）でタンパク質の低分子化分解生成した大豆粕由来の植物成長肥料溶液を毎日２００ｍｌずつ与える。
比較例として、前記発芽促進剤を使用したものと化学肥料を使用したものを同時に栽培した。
【００４９】
栽培の結果を下記の表４に示す。
【表４】

【００５０】
上記表４の数値は、３２日間（７月６日〜８月７日）栽培後の小松菜重量をグラム単位で表し、括弧内の数値は水のみで栽培した小松菜重量を１．０ とした場合の各栽培条件における小松菜重量比を表す。
【００５１】
また、栽培の結果を下記の表５で示す。
【表５】

【００５２】
上記表５の数値は、４２日間（７月３０日〜９月９日）栽培後の小松菜重量をグラム単位で表し、括弧内の数値は水のみで栽培した小松菜重量を１．０ とした場合の各栽培条件における小松菜重量比を表す。
【００５３】
前記表４の栽培結果から、新菌株ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）由来の植物成長肥料は顕著な肥料効果を示すことが理解され、また表５の栽培結果からは、新菌株ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）由来の植物成長肥料が従来の化学肥料とほぼ同様の肥料効果を示すことが理解される。
【００５４】
（２）かいわれ大根を用いた例
［種子の前処理］
かいわれ大根の種子を８０個とり、蒸留水中に入れ３分間放置した。
［苗の育成］
各栽培容器に１８０℃で５時間乾燥させた土１００ｃｍ^３ を入れ、前処理した種子を１ｃｍ間隔で５列に並べ、２１℃インキュベータ内で栽培した。
【００５５】
［微生物肥料の調整］
新菌株ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）で分解生成した大豆粕由来の植物成長肥料溶液をそれぞれ１％，１０％，２５％，５０％，及び１００％になるように調整した。
【００５６】
［栽培の実施］
プラスチック製容器（寸法１９×１４×３ｃｍ）を栽培容器として用い、１８×１３×１．５ｃｍのロックウール（ニチアス製）を敷き、その上に前処理した種子２０粒を等間隔に蒔いた。
次に、各濃度に調整した植物成長肥料各２６０ｍｌを各栽培容器に入れ、その上から前処理した土６０ｃｍ^３ を均等の厚さにかぶせ、２５℃インキュベータ内で栽培した。尚、水分蒸発を防ぐために、実験開始２日後に水２０ｍｌをそれぞれの栽培容器に加えた。
【００５７】
栽培の結果を下記の表６に示す。
【表６】

【００５８】
上記表６の数値は、８日間（１２月１８日〜１２月２５日）にわたって栽培したかいわれ大根の各日における成長（長さ）をセンチ（ｃｍ）単位で表すと共に、最終的に収穫したかいわれ大根の重量をグラム（ｇ）単位で表したものである。なお、括弧内の数値は水のみで栽培したかいわれ大根の長さ及び重量を１００％とした場合の各栽培条件におけるかいわれ大根の各比を表す。
【００５９】
前記表６の栽培結果から、新菌株ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）由来の植物成長肥料はいずれも低濃度で長さ重量とも増加し、顕著な肥料効果を示すことが理解され、また低濃度においては早期（２〜３日早く）に水のみの場合の最終長さに達し、栽培期間を短縮し得ることが理解される。
【００６０】
従って、本発明のバチルス・サーキュランスＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）新規菌株を用いた大豆粕由来の植物成長肥料は、早期（約２０時間程）にタンパク質を低分子化分解した溶液であって、濃度を約１０％に希釈して使用することが最も良好である。
【００６１】
【発明の効果】
本発明に係るバチルス属に属するバチルス・サーキュランスＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）新規菌株は、従来において未知のものであったが、このＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）新規菌株によって、大豆粕のタンパク質を特異的早期に低分子化分解することができるようになった。そして、このＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）新規菌株が用いられて大豆粕のタンパク質を短期間に低分子化分解する大豆粕由来の根毛増殖を伴なう植物成長肥料である。この植物成長肥料は、従来の化学肥料や、有機質肥料だけでは得られない肥料効果を有する。
有機質肥料は、従来において、化学肥料では絶対に不可能とするタンパク質の生成を可能とし、しかも植物の根は有機質肥料を好むことも一応知られていることであったが、それも植物が要求するタンパク質を有機質肥料から直接吸収できるからである。しかしながら実際上、高分子タンパク質であるがために、植物が直接それらを吸収するには問題があり、低分子化分解されなければ円滑な吸収がされにくかった。現状では、植物へ吸収されるために、高分子タンパク質を低分子化分解するのに長期化し、１年以上も要するので、化学肥料のようなすぐにも吸収出来るようになっている肥料と同じであるとはいえず、まして大豆粕が有機質肥料として十分な肥料効果要件を備えていながらも、未使用状態であった。
ところで、ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）新規菌株を用いて大豆粕のタンパク質を短期間に低分子化分解し、これを水で希釈の上、使用に給する大豆粕由来の根毛増殖を伴なう植物成長肥料が産出されたことによって、植物へ低分子化分解されたタンパク質、即ちペプチドの吸収が行われ易く、且つ早くなり、これに伴って、植物の根毛に好まれるペプチドの吸収で根毛の増殖をすることになり、また、含有するＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）新規菌株によって、地中の有機物が分解されて、更なる吸収増殖をすることになって、結果的には、植物の生育を旺盛にする。
まして、大豆粕は、安価で、且つ環境や人体に悪影響を及ぼす惧れがないので、植物の根毛増殖をする有機質肥料として大豆粕由来の植物成長肥料が提供できることになる。
従って、大豆粕を肥料として有効利用し得ると共に、大豆粕の利用促進を図ることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る新菌株ＨＡ１２による大豆粕分解過程におけるタンパク質濃度の経時変化を示す図。
【図２】本発明に係る新菌株ＨＡ１９による大豆粕分解過程におけるタンパク質濃度の経時変化を示す図。

Claims (1)

1. 大豆粕に水を加えた溶液を原料とし、この溶液のタンパク質がプロテアーゼを産出して低分子化分解される、３７℃、２５℃の中温域の生育温度、オキシダーゼ、カタラーゼ、メチルレッド、そしてマンニット、ラクトース、シュクロース、サリシン等の糖の資化能判定などの種々の確認試験で陽性と判断されるバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）ＨＡ１２（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２８）新規菌株を用いて１０〜３０時間の高速で、５．０〜７．０ mg ／ ml なる効率良い低分子化（ペプチド）分解をし、これが水で５〜２５％の濃度に希釈された上で、使用に供し、３０日間で水のみの栽培に対してそれの重量の１０〜３０倍に栽培される植物に対する根毛増殖を伴う大豆粕由来の植物成長肥料。

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