JP3537464B2 - 新規イソマルトオリゴ糖並びにそれを製造するための酵素 - Google Patents
新規イソマルトオリゴ糖並びにそれを製造するための酵素Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、機能性の優れた食品素
材として産業上有用である新規イソマルトオリゴ糖並び
にそれを製造するための酵素及び方法に関する。
材として産業上有用である新規イソマルトオリゴ糖並び
にそれを製造するための酵素及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】α−１, ４−グルコシド結合のみからな
るマルトオリゴ糖に対して、α−１,６−グルコシド結
合を有するイソマルトオリゴ糖は分岐糖と称されてお
り、近年、機能性食品として注目されている糖質であ
る。本来、糖質は甘味源や栄養源として利用されてきた
が、低甘味、低カロリー、非発酵性、ビフィズス菌増殖
因子、難う蝕性等の機能性を有する糖が開発され、健康
食品素材として利用されている。特に、イソマルトース
やパノース (イソマルトシルグルコース、イソマルトト
リオース) 、イソマルトシルマルトース (イソマルトテ
トラオース) 等のイソマルトオリゴ糖は機能性に優れた
オリゴ糖として注目されている。
るマルトオリゴ糖に対して、α−１,６−グルコシド結
合を有するイソマルトオリゴ糖は分岐糖と称されてお
り、近年、機能性食品として注目されている糖質であ
る。本来、糖質は甘味源や栄養源として利用されてきた
が、低甘味、低カロリー、非発酵性、ビフィズス菌増殖
因子、難う蝕性等の機能性を有する糖が開発され、健康
食品素材として利用されている。特に、イソマルトース
やパノース (イソマルトシルグルコース、イソマルトト
リオース) 、イソマルトシルマルトース (イソマルトテ
トラオース) 等のイソマルトオリゴ糖は機能性に優れた
オリゴ糖として注目されている。
【０００３】現在までに、イソマルトオリゴ糖としては
イソマルトース、パノース、イソマルトシルマルトース
等が知られている。これらのイソマルトオリゴ糖は澱粉
を通常のα−アミラーゼでα−１, ４−グルコシド結合
を加水分解した時、アミロペクチン由来のα−１, ６−
グルコシド結合が加水分解を受けにくいため、α−１,
６−グルコシド結合が残って生成する。あるいは、グル
コアミラーゼの逆反応によってイソマルトース等が生成
する。
イソマルトース、パノース、イソマルトシルマルトース
等が知られている。これらのイソマルトオリゴ糖は澱粉
を通常のα−アミラーゼでα−１, ４−グルコシド結合
を加水分解した時、アミロペクチン由来のα−１, ６−
グルコシド結合が加水分解を受けにくいため、α−１,
６−グルコシド結合が残って生成する。あるいは、グル
コアミラーゼの逆反応によってイソマルトース等が生成
する。
【０００４】しかしながら、本発明の新規イソマルトオ
リゴ糖（イソマルトシルイソマルトース、以下「ＩＭＩ
Ｍ」という。）のように、イソマルトース２個がα−
１, ４−グルコシド結合で結ばれたオリゴ糖は全く知ら
れていない。
リゴ糖（イソマルトシルイソマルトース、以下「ＩＭＩ
Ｍ」という。）のように、イソマルトース２個がα−
１, ４−グルコシド結合で結ばれたオリゴ糖は全く知ら
れていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、アミラー
ゼの酵素作用を詳細に検討している中で、α−１, ６−
グルコシド結合を２個有する４個のグルコースからなる
ホモオリゴ糖であり、新規なイソマルトオリゴ糖である
ＩＭＩＭを得ることに成功し、本発明を完成するに至っ
た。
ゼの酵素作用を詳細に検討している中で、α−１, ６−
グルコシド結合を２個有する４個のグルコースからなる
ホモオリゴ糖であり、新規なイソマルトオリゴ糖である
ＩＭＩＭを得ることに成功し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００６】即ち、本発明は、機能性が重要視される食
品産業において注目されているオリゴ糖の中で、特に優
れた機能性を示すことが知られるイソマルトオリゴ糖に
おいて、２個のα−１, ６−グルコシド結合を有する４
個のグルコースからなる新規なイソマルトオリゴ糖であ
るＩＭＩＭ、及び新規α−アミラーゼ、並びに加水分解
酵素を利用した該新規イソマルトオリゴ糖の製造法を提
供することを目的とする。
品産業において注目されているオリゴ糖の中で、特に優
れた機能性を示すことが知られるイソマルトオリゴ糖に
おいて、２個のα−１, ６−グルコシド結合を有する４
個のグルコースからなる新規なイソマルトオリゴ糖であ
るＩＭＩＭ、及び新規α−アミラーゼ、並びに加水分解
酵素を利用した該新規イソマルトオリゴ糖の製造法を提
供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、下記の発明を
包含する。 （１）次式（Ｉ）：
包含する。 （１）次式（Ｉ）：
【０００８】
【化４】
【０００９】で示される新規イソマルトオリゴ糖ＩＭＩ
Ｍ。 （２）以下に示す理化学的性質： 作用 （ａ）澱粉から主にマルトースを生成する。 （ｂ）プルランからパノースを生成する。
Ｍ。 （２）以下に示す理化学的性質： 作用 （ａ）澱粉から主にマルトースを生成する。 （ｂ）プルランからパノースを生成する。
【００１０】（ｃ）グルコースの存在下でプルランを加
水分解し、次式（Ｉ）：
水分解し、次式（Ｉ）：
【００１１】
【化５】
【００１２】で示されるイソマルトオリゴ糖及び次式
（II）：
（II）：
【００１３】
【化６】
【００１４】で示されるイソマルトオリゴ糖を生成す
る。 基質特異性 澱粉やプルラン等のα−１，４−グルコシド結合を加水
分解し、マルトースやパノースを生成する。生成したパ
ノースは分解せず、グルコースの存在下で前記式（Ｉ）
で示されるイソマルトオリゴ糖及び前記式（II）で示さ
れるイソマルトオリゴ糖を生成する。前記式（II）で示
されるイソマルトシルマルトースを分解する。
る。 基質特異性 澱粉やプルラン等のα−１，４−グルコシド結合を加水
分解し、マルトースやパノースを生成する。生成したパ
ノースは分解せず、グルコースの存在下で前記式（Ｉ）
で示されるイソマルトオリゴ糖及び前記式（II）で示さ
れるイソマルトオリゴ糖を生成する。前記式（II）で示
されるイソマルトシルマルトースを分解する。
【００１５】プルランに対する活性よりも澱粉に対する
活性は強いものの、高温放線菌Thermoactinomyces vulg
aris R-47 の生産するα−アミラーゼ（澱粉から主にマ
ルトースを生成する酵素、以下「ＴＶＡＩ」という。）
に比べてプルランに対する活性が強い。 至適pH及びpH安定性 プルランを基質としてpH 6〜7 に至適pHがあり、pH 6〜
9 で安定である。
活性は強いものの、高温放線菌Thermoactinomyces vulg
aris R-47 の生産するα−アミラーゼ（澱粉から主にマ
ルトースを生成する酵素、以下「ＴＶＡＩ」という。）
に比べてプルランに対する活性が強い。 至適pH及びpH安定性 プルランを基質としてpH 6〜7 に至適pHがあり、pH 6〜
9 で安定である。
【００１６】至適温度及び熱安定性
プルランを基質として45〜55℃に至適温度があり、50℃
まで安定である。 分子量は約60,000である（ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル・スラブ電気泳動法による）。を有するα−アミラ
ーゼ。 （３）グルコースの存在下において、α−１，４−グル
コシド結合を加水分解する酵素をプルラン又はパノース
に作用させることを特徴とする前記（１）に記載の新規
イソマルトオリゴ糖ＩＭＩＭの製造法。
まで安定である。 分子量は約60,000である（ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル・スラブ電気泳動法による）。を有するα−アミラ
ーゼ。 （３）グルコースの存在下において、α−１，４−グル
コシド結合を加水分解する酵素をプルラン又はパノース
に作用させることを特徴とする前記（１）に記載の新規
イソマルトオリゴ糖ＩＭＩＭの製造法。
【００１７】本発明の製造法に用いる加水分解酵素とし
ては、α−１，４−グルコシド結合を加水分解する酵素
であれば特に制限はないが、好ましくはプルランからパ
ノースを生成するα−アミラーゼが挙げられる。かかる
酵素としては、例えば、高温放線菌 Thermoactinomyces
vulgaris R-47(M. Shimizu et al., Agric. Biol. Che
m., 42, 1681(1978))の生産するα−アミラーゼ、即ち
本発明の新規α−アミラーゼが挙げられる。
ては、α−１，４−グルコシド結合を加水分解する酵素
であれば特に制限はないが、好ましくはプルランからパ
ノースを生成するα−アミラーゼが挙げられる。かかる
酵素としては、例えば、高温放線菌 Thermoactinomyces
vulgaris R-47(M. Shimizu et al., Agric. Biol. Che
m., 42, 1681(1978))の生産するα−アミラーゼ、即ち
本発明の新規α−アミラーゼが挙げられる。
【００１８】清水らは高温放線菌Thermoactinomyces vu
lgaris R-47 の生産するα−アミラーゼＴＶＡＩがプル
ランを分解してパノースを生成することを見出した。次
いで、本発明者はＴＶＡＩの酵素作用について詳細な研
究を行い、その性質を明らかにしている (Y. Sakano et
al., Agric. Biol. Chem., 46, 1121(1982); Y. Sakan
o et al., Agric. Biol. Chem., 46, 1423(1982); Y. S
akano et al., Agric.Biol. Chem., 47, 2211(1983);
Y. Sakano et al., Agric. Biol. Chem., 49,3391(198
5)) 。
lgaris R-47 の生産するα−アミラーゼＴＶＡＩがプル
ランを分解してパノースを生成することを見出した。次
いで、本発明者はＴＶＡＩの酵素作用について詳細な研
究を行い、その性質を明らかにしている (Y. Sakano et
al., Agric. Biol. Chem., 46, 1121(1982); Y. Sakan
o et al., Agric. Biol. Chem., 46, 1423(1982); Y. S
akano et al., Agric.Biol. Chem., 47, 2211(1983);
Y. Sakano et al., Agric. Biol. Chem., 49,3391(198
5)) 。
【００１９】更に、本発明者は本菌の遺伝子からシット
ガン方式でプラスミドを分取してクローン化した大腸菌
の中にＴＶＡＩと異なるα−アミラーゼ（ＴＶＡII）が
生成することを見出した (Y. Sakano et al., Biosci.
Biotech. Biochem., 57, 395(1993)) 。その後、ＴＶＡ
IIの蛋白質合成能を高める発現系を構築して大腸菌の本
酵素生産を大きく増加させると同時に、大腸菌を培養し
た後、加熱、超音波処理等の抽出操作によって容易に結
晶化する高純度な酵素の生産方法を開発した。
ガン方式でプラスミドを分取してクローン化した大腸菌
の中にＴＶＡＩと異なるα−アミラーゼ（ＴＶＡII）が
生成することを見出した (Y. Sakano et al., Biosci.
Biotech. Biochem., 57, 395(1993)) 。その後、ＴＶＡ
IIの蛋白質合成能を高める発現系を構築して大腸菌の本
酵素生産を大きく増加させると同時に、大腸菌を培養し
た後、加熱、超音波処理等の抽出操作によって容易に結
晶化する高純度な酵素の生産方法を開発した。
【００２０】ＴＶＡIIはＴＶＡＩと遺伝子の塩基配列及
びアミノ酸配列が異なり、従来の酵素と理化学的性質の
異なるα−アミラーゼである (Y. Sakano et al., Bios
ci.Biotech. Biochem., 57, 395(1993)) 。ＴＶＡIIの
遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を図１に示す。本発
明者は、ＴＶＡIIの酵素作用を調べる内、グルコースの
存在下でプルランに作用させると薄層クロマトグラフィ
ーでパノースよりも展開距離の短い２つのオリゴ糖が生
成すること（図２）を見出した。両者は４個のグルコー
スからなるオリゴ糖であり、その一つは既知のイソマル
トシルマルトース（以下「ＩＭＭ」という。）と同じ位
置に展開され、もう一つの未知の糖はＩＭＭより展開距
離の短い糖であり、明らかにＩＭＭと異なる糖であっ
た。そこで、未知の糖を単離してＮＭＲを測定すると、
13Ｃ−ＮＭＲでα−１, ４−及びα−１, ６−グルコシ
ド結合のシグナルを示すピークがほぼ同じ高さで得られ
（図３）、α−１, ６−結合のシグナルは２つのピーク
に別れていた。従って、グルコシド結合はα−１, ４−
結合：α−１, ６−結合＝１：２の割合で存在すること
が明らかとなった。次いで、ＩＭＭにイソマルトデキス
トラナーゼを作用させるとマルトースとイソマルトース
が生成し、未知の糖に同じ酵素を作用させるとイソマル
トースのみが生成された（図４）。なお、図２及び図４
に示した薄層クロマトグラフィーにおいて、展開溶媒と
しては１−ブタノール：エタノール：水＝５：５：３を
用い、薄層としてはメルク社のシリカゲルＧ60を用い
た。
びアミノ酸配列が異なり、従来の酵素と理化学的性質の
異なるα−アミラーゼである (Y. Sakano et al., Bios
ci.Biotech. Biochem., 57, 395(1993)) 。ＴＶＡIIの
遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を図１に示す。本発
明者は、ＴＶＡIIの酵素作用を調べる内、グルコースの
存在下でプルランに作用させると薄層クロマトグラフィ
ーでパノースよりも展開距離の短い２つのオリゴ糖が生
成すること（図２）を見出した。両者は４個のグルコー
スからなるオリゴ糖であり、その一つは既知のイソマル
トシルマルトース（以下「ＩＭＭ」という。）と同じ位
置に展開され、もう一つの未知の糖はＩＭＭより展開距
離の短い糖であり、明らかにＩＭＭと異なる糖であっ
た。そこで、未知の糖を単離してＮＭＲを測定すると、
13Ｃ−ＮＭＲでα−１, ４−及びα−１, ６−グルコシ
ド結合のシグナルを示すピークがほぼ同じ高さで得られ
（図３）、α−１, ６−結合のシグナルは２つのピーク
に別れていた。従って、グルコシド結合はα−１, ４−
結合：α−１, ６−結合＝１：２の割合で存在すること
が明らかとなった。次いで、ＩＭＭにイソマルトデキス
トラナーゼを作用させるとマルトースとイソマルトース
が生成し、未知の糖に同じ酵素を作用させるとイソマル
トースのみが生成された（図４）。なお、図２及び図４
に示した薄層クロマトグラフィーにおいて、展開溶媒と
しては１−ブタノール：エタノール：水＝５：５：３を
用い、薄層としてはメルク社のシリカゲルＧ60を用い
た。
【００２１】これらの実験事実から未知のオリゴ糖は前
記式（Ｉ）で示されるＩＭＩＭであり、これまで見出さ
れていない全く新規なイソマルトオリゴ糖であることが
判明した。本発明のＩＭＩＭは、プルラン又はパノース
とグルコースとを溶解してα−１，４−グルコシド結合
を加水分解する酵素を作用させることにより容易に製造
できる。
記式（Ｉ）で示されるＩＭＩＭであり、これまで見出さ
れていない全く新規なイソマルトオリゴ糖であることが
判明した。本発明のＩＭＩＭは、プルラン又はパノース
とグルコースとを溶解してα−１，４−グルコシド結合
を加水分解する酵素を作用させることにより容易に製造
できる。
【００２２】ここで用いる酵素としては、例えば、前述
したＴＶＡIIが挙げられるが、その他、ネオプルラナー
ゼ(N. Kuriki et al., J. Bacteriol., 170, 1554(198
8); N. Kuriki et al., J. Bacteriol., 173, 6147(199
1))等のプルランからパノースを生成するα−アミラー
ゼを用いることができる。例えば、ＴＶＡIIを用いる場
合、プルランとグルコースを共に５％濃度でリン酸ナト
リウム緩衝液（pH 6.5）1.5Lに溶解し、ＴＶＡIIを60mg
加えて40℃で72時間反応させる。この反応液を経時的に
採取し、薄層クロマトグラフィーにかけると図２に示す
ように、ＩＭＩＭとＩＭＭが生成した。この時、ＩＭＭ
はＴＶＡIIによって加水分解を受けるため、反応24時間
以降は減少する。
したＴＶＡIIが挙げられるが、その他、ネオプルラナー
ゼ(N. Kuriki et al., J. Bacteriol., 170, 1554(198
8); N. Kuriki et al., J. Bacteriol., 173, 6147(199
1))等のプルランからパノースを生成するα−アミラー
ゼを用いることができる。例えば、ＴＶＡIIを用いる場
合、プルランとグルコースを共に５％濃度でリン酸ナト
リウム緩衝液（pH 6.5）1.5Lに溶解し、ＴＶＡIIを60mg
加えて40℃で72時間反応させる。この反応液を経時的に
採取し、薄層クロマトグラフィーにかけると図２に示す
ように、ＩＭＩＭとＩＭＭが生成した。この時、ＩＭＭ
はＴＶＡIIによって加水分解を受けるため、反応24時間
以降は減少する。
【００２３】反応の一方の基質はプルラン又はパノース
であり、パノースの原料となる澱粉やアミロペクチン等
も基質となる。プルラン又はパノースの濃度については
濃度の高い程良いが、１〜30％の範囲が好ましい。勿
論、プルラン又はパノースを反応途中で添加して生成す
るＩＭＩＭの濃度を高くすることもできる。他方の基質
であるグルコースは、通常、反応の始めから反応液に添
加するが、反応の途中から添加してもさしつかえない。
即ち、ＴＶＡIIはパノースを加水分解できず、グルコー
スの転移反応はパノースの存在下でも進行するため、高
濃度のプルラン溶液が酵素分解を受けて粘度が低下して
からグルコースを加えてＩＭＩＭの濃度を高くすること
もできる。また、酵素濃度は、酵素の種類により異なる
が、通常0.0001〜1.0 ％である。
であり、パノースの原料となる澱粉やアミロペクチン等
も基質となる。プルラン又はパノースの濃度については
濃度の高い程良いが、１〜30％の範囲が好ましい。勿
論、プルラン又はパノースを反応途中で添加して生成す
るＩＭＩＭの濃度を高くすることもできる。他方の基質
であるグルコースは、通常、反応の始めから反応液に添
加するが、反応の途中から添加してもさしつかえない。
即ち、ＴＶＡIIはパノースを加水分解できず、グルコー
スの転移反応はパノースの存在下でも進行するため、高
濃度のプルラン溶液が酵素分解を受けて粘度が低下して
からグルコースを加えてＩＭＩＭの濃度を高くすること
もできる。また、酵素濃度は、酵素の種類により異なる
が、通常0.0001〜1.0 ％である。
【００２４】ＩＭＩＭを生成する反応条件としては、酵
素の作用pH及び温度範囲であれば、如何なる条件でもよ
く、好ましくはpH 4.0〜7.0 で、温度20〜80℃の条件が
用いられる。更に、必要に応じて有機溶媒等の添加も可
能である。反応時間は生成物の利用目的に応じて適宜設
定されるが、多くの場合30分〜72時間が好ましい。反応
で得られるＩＭＩＭを含む糖液は、常法に従い活性炭に
よる脱色及びイオン交換樹脂による脱塩等の精製操作を
経て、そのままシロップとして利用できる。また、還元
処理すれば糖アルコールとしても利用することができ
る。
素の作用pH及び温度範囲であれば、如何なる条件でもよ
く、好ましくはpH 4.0〜7.0 で、温度20〜80℃の条件が
用いられる。更に、必要に応じて有機溶媒等の添加も可
能である。反応時間は生成物の利用目的に応じて適宜設
定されるが、多くの場合30分〜72時間が好ましい。反応
で得られるＩＭＩＭを含む糖液は、常法に従い活性炭に
よる脱色及びイオン交換樹脂による脱塩等の精製操作を
経て、そのままシロップとして利用できる。また、還元
処理すれば糖アルコールとしても利用することができ
る。
【００２５】更に、必要に応じてゲル濾過クロマトグラ
フィー、カーボンカラムクロマトグラフィー、イオン交
換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いたり、膜分画法
や晶析法等を用いることにより、高純度のＩＭＩＭを調
製することができる。
フィー、カーボンカラムクロマトグラフィー、イオン交
換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いたり、膜分画法
や晶析法等を用いることにより、高純度のＩＭＩＭを調
製することができる。
【００２６】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明は下記実施例によりその技術的範囲が
限定されるものではない。 （実施例１）Thermoactinomyces vulgaris R-47を清水
らの方法(M. Shimizu et al., Agric. Biol. Chem., 4
2, 1681(1978)) により培養し、Marmurの方法(J. Marmu
r, J.Mol. Biol., 3, 208(1961))により本菌の培養菌体
からゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを制限
酵素 Sau3AI で部分消化し、得られた４〜10kbのＤＮＡ
断片をｐＵＣ１１９プラスミドの BamHIサイトに導入し
た。こうして得られた組換えプラスミドで大腸菌 JM83
株を形質転換した。
明するが、本発明は下記実施例によりその技術的範囲が
限定されるものではない。 （実施例１）Thermoactinomyces vulgaris R-47を清水
らの方法(M. Shimizu et al., Agric. Biol. Chem., 4
2, 1681(1978)) により培養し、Marmurの方法(J. Marmu
r, J.Mol. Biol., 3, 208(1961))により本菌の培養菌体
からゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを制限
酵素 Sau3AI で部分消化し、得られた４〜10kbのＤＮＡ
断片をｐＵＣ１１９プラスミドの BamHIサイトに導入し
た。こうして得られた組換えプラスミドで大腸菌 JM83
株を形質転換した。
【００２７】ＴＶＡII遺伝子を持つ大腸菌の探索は、ヨ
ウ素澱粉反応の有無を指標にして行った。約30,000株よ
り５株のＴＶＡII遺伝子を持つ大腸菌を得、このうち最
も短い４kbの遺伝子をｐＴＯ１と名付け、以下、図５に
示す手順に従い、ＴＶＡIIの大量生産系の構築を行っ
た。先ず、不要な部分の削除を行った。ｐＴＯ１のＴＶ
ＡII遺伝子部分の2.8kb のPstI-PstI 断片をｐＵＣ１１
９にサブクローニングしたプラスミドｐＴＯ１２４では
ＴＶＡII活性がみられた。次に、エキソヌクレアーゼII
I とマングビーンヌクレアーゼを用いる方法により、ｐ
ＴＯ１２４のＴＶＡII遺伝子部分の下流側0.2kb を削っ
たｐＴＯ４２４、及び、更に上流の0.5kb を削ったｐＴ
Ｎ１を構築し、これらのプラスミドについてもＴＶＡII
活性がみられることを確認した。こうして得られた2.1k
b のＴＶＡII遺伝子を含むプラスミドｐＴＮ１のプロモ
ーター、及びShine-Dalgarnoリボソーム結合配列とし
て、ｐＵＣ１１９由来のβ−ガラクトシダーゼ由来のプ
ロモーターの直下に、ＴＶＡII遺伝子由来のShine-Dalg
arnoリボソーム結合配列をつないだものをクンケル法に
よる部位指定突然変異の方法で構築した。得られたプラ
スミドｐＴＮ３０２−１０で大腸菌 MV1184 株を形質転
換した。この形質転換体は、培養液１Ｌ当たり100mg 以
上のＴＶＡIIを生産した。
ウ素澱粉反応の有無を指標にして行った。約30,000株よ
り５株のＴＶＡII遺伝子を持つ大腸菌を得、このうち最
も短い４kbの遺伝子をｐＴＯ１と名付け、以下、図５に
示す手順に従い、ＴＶＡIIの大量生産系の構築を行っ
た。先ず、不要な部分の削除を行った。ｐＴＯ１のＴＶ
ＡII遺伝子部分の2.8kb のPstI-PstI 断片をｐＵＣ１１
９にサブクローニングしたプラスミドｐＴＯ１２４では
ＴＶＡII活性がみられた。次に、エキソヌクレアーゼII
I とマングビーンヌクレアーゼを用いる方法により、ｐ
ＴＯ１２４のＴＶＡII遺伝子部分の下流側0.2kb を削っ
たｐＴＯ４２４、及び、更に上流の0.5kb を削ったｐＴ
Ｎ１を構築し、これらのプラスミドについてもＴＶＡII
活性がみられることを確認した。こうして得られた2.1k
b のＴＶＡII遺伝子を含むプラスミドｐＴＮ１のプロモ
ーター、及びShine-Dalgarnoリボソーム結合配列とし
て、ｐＵＣ１１９由来のβ−ガラクトシダーゼ由来のプ
ロモーターの直下に、ＴＶＡII遺伝子由来のShine-Dalg
arnoリボソーム結合配列をつないだものをクンケル法に
よる部位指定突然変異の方法で構築した。得られたプラ
スミドｐＴＮ３０２−１０で大腸菌 MV1184 株を形質転
換した。この形質転換体は、培養液１Ｌ当たり100mg 以
上のＴＶＡIIを生産した。
【００２８】なお、本形質転換体は、Escherichia coli
NK699311 (FERM P-13717)として工業技術院生命工学工
業技術研究所に平成５年７月２日付けにて寄託されてい
る。前記形質転換体１白金耳を培地（１％ペプトン、
0.5％酵母エキス、 0.5％食塩を含む）に接種し、37℃
で16時間培養して種培養を行った。得られた種培養液１
mLを1.6gペプトン、1.0g酵母エキス、 0.5g 食塩、５mg
アンピシリンを含む培地 100mLに加えて、500mL 容坂口
フラスコで37℃で16時間往復振盪して本培養（培地 100
mL×10）した。なお、培養５時間で0.5Mイソプロピルβ
−Ｄ−チオガラクトシド0.1mL を培地に添加した。菌体
は培養液を遠心分離（2,000g, 20分）して回収し、5mM
CaCl2を含む100mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）に懸濁し
た。懸濁菌体は80℃で30分間加熱処理してから超音波処
理により破砕され、遠心分離（7,500g, 10分）により上
清液が回収された。得られた上清液をＴＶＡIIの粗酵素
液とし、反応に用いた。酵素蛋白質の測定はLowry の方
法により行った。
NK699311 (FERM P-13717)として工業技術院生命工学工
業技術研究所に平成５年７月２日付けにて寄託されてい
る。前記形質転換体１白金耳を培地（１％ペプトン、
0.5％酵母エキス、 0.5％食塩を含む）に接種し、37℃
で16時間培養して種培養を行った。得られた種培養液１
mLを1.6gペプトン、1.0g酵母エキス、 0.5g 食塩、５mg
アンピシリンを含む培地 100mLに加えて、500mL 容坂口
フラスコで37℃で16時間往復振盪して本培養（培地 100
mL×10）した。なお、培養５時間で0.5Mイソプロピルβ
−Ｄ−チオガラクトシド0.1mL を培地に添加した。菌体
は培養液を遠心分離（2,000g, 20分）して回収し、5mM
CaCl2を含む100mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）に懸濁し
た。懸濁菌体は80℃で30分間加熱処理してから超音波処
理により破砕され、遠心分離（7,500g, 10分）により上
清液が回収された。得られた上清液をＴＶＡIIの粗酵素
液とし、反応に用いた。酵素蛋白質の測定はLowry の方
法により行った。
【００２９】プルランとグルコースを共に５％濃度で20
mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）２L に溶解し、Ｔ
ＶＡIIを85mg加えて40℃で72時間反応させてＩＭＩＭを
含む糖液を得た。得られた糖液の１／10をトヨパール H
W40Sカラム（10cm×2m) を用いて分離した。流速は10ml
／分、検出は示差屈折計を用いた。分離したときのパタ
ーンを図６に示す。の画分を分取し、エバポレーター
で濃縮乾固させたところ、ＩＭＭを含まないＩＭＩＭが
0.5ｇ得られた。の画分については薄層クロマトグラ
フィーによって若干のＩＭＭが含まれていることが判明
した。この若干のＩＭＭを含む粗ＩＭＩＭの量は約２ｇ
であった。
mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）２L に溶解し、Ｔ
ＶＡIIを85mg加えて40℃で72時間反応させてＩＭＩＭを
含む糖液を得た。得られた糖液の１／10をトヨパール H
W40Sカラム（10cm×2m) を用いて分離した。流速は10ml
／分、検出は示差屈折計を用いた。分離したときのパタ
ーンを図６に示す。の画分を分取し、エバポレーター
で濃縮乾固させたところ、ＩＭＭを含まないＩＭＩＭが
0.5ｇ得られた。の画分については薄層クロマトグラ
フィーによって若干のＩＭＭが含まれていることが判明
した。この若干のＩＭＭを含む粗ＩＭＩＭの量は約２ｇ
であった。
【００３０】
【発明の効果】本発明によれば、新規イソマルトオリゴ
糖を提供することができる。新規イソマルトオリゴ糖で
ある本発明のＩＭＩＭは、近年、機能性食品として注目
されているオリゴ糖の一つであり、低甘味、低カロリ
ー、非発酵性、ビフィズス菌増殖因子、難う蝕性等の機
能性を有し、健康食品素材として有用性の高い糖であ
る。従って、本発明のＩＭＩＭは機能性が求められる食
品工業において利用価値の高いオリゴ糖である。
糖を提供することができる。新規イソマルトオリゴ糖で
ある本発明のＩＭＩＭは、近年、機能性食品として注目
されているオリゴ糖の一つであり、低甘味、低カロリ
ー、非発酵性、ビフィズス菌増殖因子、難う蝕性等の機
能性を有し、健康食品素材として有用性の高い糖であ
る。従って、本発明のＩＭＩＭは機能性が求められる食
品工業において利用価値の高いオリゴ糖である。
【図１】ＴＶＡIIの遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列
を示す図である。
を示す図である。
【図２】グルコースの存在下でプルランにＴＶＡIIを作
用させて得られる反応液の薄層クロマトグラフィーを示
す図である。
用させて得られる反応液の薄層クロマトグラフィーを示
す図である。
Ｐ ＴＶＡIIによるプルラン分解物
ＭＯＳ 一連のマルトオリゴ糖
【図３】ＩＭＩＭの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。
ある。
【図４】ＩＭＩＭにイソマルトデキストラナーゼを作用
させて得られる反応液の薄層クロマトグラフィーを示す
図である。
させて得られる反応液の薄層クロマトグラフィーを示す
図である。
ＭＯＳ 一連のマルトオリゴ糖
１ イソマルトース
２ ＩＭＭ
３ １％ＩＭＭを20mM酢酸緩衝液(pH5.3) に溶かし
たもの90μl に対し、イソマルトデキストラナーゼ(5 U
nit/ml) を10μl 加え、40℃で１時間反応させたもの ４ ＩＭＩＭ ５ １％ＩＭＩＭを20mM酢酸緩衝液(pH5.3) に溶か
したもの90μl に対し、イソマルトデキストラナーゼ(5
Unit/ml) を10μl 加え、40℃で１時間反応させたもの
たもの90μl に対し、イソマルトデキストラナーゼ(5 U
nit/ml) を10μl 加え、40℃で１時間反応させたもの ４ ＩＭＩＭ ５ １％ＩＭＩＭを20mM酢酸緩衝液(pH5.3) に溶か
したもの90μl に対し、イソマルトデキストラナーゼ(5
Unit/ml) を10μl 加え、40℃で１時間反応させたもの
【図５】ＴＶＡIIの大量生産系の構築の手順を示す図で
ある。
ある。
【図６】糖液をカラムクロマトグラフィーで分離したと
きのパターンを示す図である。
きのパターンを示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｊ． Ｊｐｎ． Ｓｏｃ． Ｓｔａｒ
ｃｈ Ｓｃｉ．， 1983， Ｖｏｌ.
30， Ｎｏ．２， ｐａｇｅｓ 191−
８
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 9/14 - 9/46
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 次式（Ｉ）： 【化１】 で示される新規イソマルトオリゴ糖。
- 【請求項２】 以下に示す理化学的性質：（１）作用 （ａ）澱粉から主にマルトースを生成する。 （ｂ）プルランからパノースを生成する。 （ｃ）グルコースの存在下でプルランを加水分解し、次
式（Ｉ）： 【化２】 で示されるイソマルトオリゴ糖及び次式（II）： 【化３】 で示されるイソマルトオリゴ糖を生成する。 （２）基質特異性 澱粉及びプルランのα−１，４−グルコシド結合を加水
分解し、それぞれマルトース及びパノースを生成する。
生成したパノースは分解せず、グルコースの存在下で前
記式（Ｉ）で示されるイソマルトオリゴ糖及び前記式
（II）で示されるイソマルトオリゴ糖を生成する。前記
式（II）で示されるイソマルトシルマルトースを分解す
る。 （３）至適pH及びpH安定性 プルランを基質としてpH 6〜7 に至適pHがあり、pH 6〜
9 で安定である。 （４）至適温度及び熱安定性 プルランを基質として45〜55℃に至適温度があり、50℃
まで安定である。 （５）分子量は約60,000である（ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル・スラブ電気泳動法による）。 を有する、 Thermoactinomyces 属に属する放線菌から得
られるα−アミラーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19388193A JP3537464B2 (ja) | 1993-07-12 | 1993-07-12 | 新規イソマルトオリゴ糖並びにそれを製造するための酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19388193A JP3537464B2 (ja) | 1993-07-12 | 1993-07-12 | 新規イソマルトオリゴ糖並びにそれを製造するための酵素 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003424104A Division JP3605410B2 (ja) | 2003-12-22 | 2003-12-22 | 新規イソマルトオリゴ糖の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0725891A JPH0725891A (ja) | 1995-01-27 |
| JP3537464B2 true JP3537464B2 (ja) | 2004-06-14 |
Family
ID=16315296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19388193A Expired - Lifetime JP3537464B2 (ja) | 1993-07-12 | 1993-07-12 | 新規イソマルトオリゴ糖並びにそれを製造するための酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3537464B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012095746A2 (en) | 2011-01-11 | 2012-07-19 | Capsugel Belgium Nv | New hard capsules |
| CA3059529A1 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Capsugel Belgium Nv | Process for making pullulan |
| CN110678170A (zh) | 2017-04-14 | 2020-01-10 | 比利时胶囊公司 | 普鲁兰多糖胶囊 |
-
1993
- 1993-07-12 JP JP19388193A patent/JP3537464B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ． Ｊｐｎ． Ｓｏｃ． Ｓｔａｒｃｈ Ｓｃｉ．， １９８３， Ｖｏｌ．３０， Ｎｏ．２， ｐａｇｅｓ １９１−８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0725891A (ja) | 1995-01-27 |
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