JPH07203998A - 核酸塩基配列決定方法 - Google Patents
核酸塩基配列決定方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 短時間に核酸の塩基配列が決定可能な核酸塩
基配列決定方法を提供する。 【構成】 プライマーとして全てのｋ塩基の配列を含む
オリゴヌクレオチドを各コラム内に固定する。そして、
このようにしてプライマーが各コラム内に固定されたキ
ャピラリープレートＣＡの各コラム内に未知の一本鎖被
検核酸を加えて各コラム内のプライマーと被検核酸とを
ハイブリダイズさせた後各コラムに４種類のｄＮＴＰを
ＤＮＡポリメラーゼを触媒として同時に加える。これに
より、プライマーの５´から３´方向には、被検核酸の
各塩基に相補的な塩基が被検核酸の塩基とハイブリダイ
ズし、プライマーの一方向伸張反応が生じる。この伸張
量を測定することにより、結合したプライマーおよびプ
ライマーと被検核酸との結合位置を同定する。
基配列決定方法を提供する。 【構成】 プライマーとして全てのｋ塩基の配列を含む
オリゴヌクレオチドを各コラム内に固定する。そして、
このようにしてプライマーが各コラム内に固定されたキ
ャピラリープレートＣＡの各コラム内に未知の一本鎖被
検核酸を加えて各コラム内のプライマーと被検核酸とを
ハイブリダイズさせた後各コラムに４種類のｄＮＴＰを
ＤＮＡポリメラーゼを触媒として同時に加える。これに
より、プライマーの５´から３´方向には、被検核酸の
各塩基に相補的な塩基が被検核酸の塩基とハイブリダイ
ズし、プライマーの一方向伸張反応が生じる。この伸張
量を測定することにより、結合したプライマーおよびプ
ライマーと被検核酸との結合位置を同定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体内の核酸を物理的
および化学的な手法により分析することにより、生体の
遺伝子情報を得ることが可能な核酸塩基配列決定方法に
関するものである。
および化学的な手法により分析することにより、生体の
遺伝子情報を得ることが可能な核酸塩基配列決定方法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡの塩基配列はＳａｎｇｅｒらのジ
デオキシチェーンターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒ，
Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｏ
ｎ，．Ａ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７，１９７７）及
びＭａｘａｍ−Ｇｌｉｂｅｒｔの化学分解法（Ｍａｘａ
ｍ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｌｉｂｅｒｔ，Ｗ．Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０−
５６４，１９７７）の２つが実用化されている。いずれ
も被検ＤＮＡのいろいろの長さの断片の末端塩基の種類
が同定できるように放射性同位元素や蛍光色素等でラベ
ルされるようにして合成もしくは分解した後、ゲル電気
泳動することにより、各断片を短い順に分離し短い方か
ら順番に末端の塩基の種類を読み取って行くことにより
配列を推測する。これらの方法は改良されて現在に至っ
ているが、いずれも電気泳動によって分離しているので
多大の時間と労力を要していた。人の全グノム（約３０
億塩基配列）等のように大規模な塩基配列を決定するた
めにはより効率の良い新しい方法が求められている。
デオキシチェーンターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒ，
Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｏ
ｎ，．Ａ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７，１９７７）及
びＭａｘａｍ−Ｇｌｉｂｅｒｔの化学分解法（Ｍａｘａ
ｍ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｌｉｂｅｒｔ，Ｗ．Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０−
５６４，１９７７）の２つが実用化されている。いずれ
も被検ＤＮＡのいろいろの長さの断片の末端塩基の種類
が同定できるように放射性同位元素や蛍光色素等でラベ
ルされるようにして合成もしくは分解した後、ゲル電気
泳動することにより、各断片を短い順に分離し短い方か
ら順番に末端の塩基の種類を読み取って行くことにより
配列を推測する。これらの方法は改良されて現在に至っ
ているが、いずれも電気泳動によって分離しているので
多大の時間と労力を要していた。人の全グノム（約３０
億塩基配列）等のように大規模な塩基配列を決定するた
めにはより効率の良い新しい方法が求められている。
【０００３】このような新しい方法の１つとしてｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｚａｔｉｏｎ（ＳＢ
Ｈ）法とよばれるものが提唱されている（Ｂａｉｎｓ，
Ｗａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｃ． Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂ
ｉｏｌ． １３５：３０３−３０７，１９８８；Ｄａｒ
ｍａｎｃｅ，Ｒ．，Ｌａｂａｔ，Ｉ．，Ｂｒｕｋｎｅ
ｒ，Ｉ．ａｎｄ Ｃｒｋｖｅｎｊａｋｏｖ，Ｒ．，Ｇｅ
ｎｏｍｉｃｓ ４：１１４−１２８，１９８９）。
ｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｚａｔｉｏｎ（ＳＢ
Ｈ）法とよばれるものが提唱されている（Ｂａｉｎｓ，
Ｗａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｃ． Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂ
ｉｏｌ． １３５：３０３−３０７，１９８８；Ｄａｒ
ｍａｎｃｅ，Ｒ．，Ｌａｂａｔ，Ｉ．，Ｂｒｕｋｎｅ
ｒ，Ｉ．ａｎｄ Ｃｒｋｖｅｎｊａｋｏｖ，Ｒ．，Ｇｅ
ｎｏｍｉｃｓ ４：１１４−１２８，１９８９）。
【０００４】この方法の基本は、被検ＤＮＡの塩基配列
をその中に含まれている長さｋ塩基の全てのオリゴヌク
レオチドの組成ＦK から整列決定することにある。整列
決定のアルゴリズムはよくパズルで見かける図形の一筆
書きの問題に帰着される（Ｐｅｖｚｎｅｒ，Ｐ．Ａ．
Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．７：６３−
７３，１９８９）。Ｐｅｖｚｎｅｒら（１９９１）は、
長さｋ塩基のオリゴヌクレオチド組成を基に９５％の確
率で決定できるＤＮＡの長さをシュミレーションにより
求めている（Ｐｅｖｚｎｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｌｙｓｏｖ，
Ｙ．Ｐ．，Ｋｈｒａｐｋｏ，Ｋ．Ｒ．Ｂｅｌｙａｖｓｋ
ｉｉ，Ａ．Ｖ．，Ｆｌｏｒｅｎｔ ｅｖ，Ｖ．Ｌ． ａ
ｎｄ Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏ
ｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ． ９：３９９−４１９，１
９９１）。例えば、６５５３６通りある長さ８塩基のオ
リゴヌクレオチドを用いると、図１０に示すように、約
１８０塩基のＤＮＡ塩基配列を整列決定できる。実際の
決定法では、被検核酸の一本鎖をｋ塩基のオリゴヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーション（交雑）により組成
ＦK を見出す。従って８塩基の場合、被検核酸で塩基数
が約１８０を越える被検核酸を交雑させることはできな
い。また、この場合、オリゴヌクレオチドは６５５３６
通りもあるので、実用的な装置を構成するためには、オ
リゴヌクレオチドもしくは被検核酸を計測器にセットで
きる程度の大きさのマトリックス状に固定する必要があ
る（この方法は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ ｍａｔｒｉｘ（ＳＨＯＭ）法と呼ばれる。）
をその中に含まれている長さｋ塩基の全てのオリゴヌク
レオチドの組成ＦK から整列決定することにある。整列
決定のアルゴリズムはよくパズルで見かける図形の一筆
書きの問題に帰着される（Ｐｅｖｚｎｅｒ，Ｐ．Ａ．
Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．７：６３−
７３，１９８９）。Ｐｅｖｚｎｅｒら（１９９１）は、
長さｋ塩基のオリゴヌクレオチド組成を基に９５％の確
率で決定できるＤＮＡの長さをシュミレーションにより
求めている（Ｐｅｖｚｎｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｌｙｓｏｖ，
Ｙ．Ｐ．，Ｋｈｒａｐｋｏ，Ｋ．Ｒ．Ｂｅｌｙａｖｓｋ
ｉｉ，Ａ．Ｖ．，Ｆｌｏｒｅｎｔ ｅｖ，Ｖ．Ｌ． ａ
ｎｄ Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏ
ｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ． ９：３９９−４１９，１
９９１）。例えば、６５５３６通りある長さ８塩基のオ
リゴヌクレオチドを用いると、図１０に示すように、約
１８０塩基のＤＮＡ塩基配列を整列決定できる。実際の
決定法では、被検核酸の一本鎖をｋ塩基のオリゴヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーション（交雑）により組成
ＦK を見出す。従って８塩基の場合、被検核酸で塩基数
が約１８０を越える被検核酸を交雑させることはできな
い。また、この場合、オリゴヌクレオチドは６５５３６
通りもあるので、実用的な装置を構成するためには、オ
リゴヌクレオチドもしくは被検核酸を計測器にセットで
きる程度の大きさのマトリックス状に固定する必要があ
る（この方法は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ ｍａｔｒｉｘ（ＳＨＯＭ）法と呼ばれる。）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、以上説
明したＳＢＨ／ＳＨＯＭ法には２つの大きな問題点があ
ることが指摘されている（陶山 明 蛋白質核酸酵素，
３８：６４７−６５７，１９９３）。１つは不完全交
雑、部分交雑によるミスマッチの問題である。完全に相
補的でなくても部分的に相補的であれば、オリゴヌクレ
オチドは被検核酸と交雑することが可能であり、本来被
検核酸に含まれない配列まで整列計算に含めてしまう可
能性がある。もう１つは、繰り返し配列（又は同じヌク
レオチド配列）の問題である。もしも被検核酸に同じヌ
クレオチド配列が複数含まれている場合には、交雑を検
出するだけではその塩基配列が含まれているということ
は分かるが、計算アルゴリズムによる整列だけで繰り返
し塩基配列のそれぞれの位置を決定することは極めて困
難になる。
明したＳＢＨ／ＳＨＯＭ法には２つの大きな問題点があ
ることが指摘されている（陶山 明 蛋白質核酸酵素，
３８：６４７−６５７，１９９３）。１つは不完全交
雑、部分交雑によるミスマッチの問題である。完全に相
補的でなくても部分的に相補的であれば、オリゴヌクレ
オチドは被検核酸と交雑することが可能であり、本来被
検核酸に含まれない配列まで整列計算に含めてしまう可
能性がある。もう１つは、繰り返し配列（又は同じヌク
レオチド配列）の問題である。もしも被検核酸に同じヌ
クレオチド配列が複数含まれている場合には、交雑を検
出するだけではその塩基配列が含まれているということ
は分かるが、計算アルゴリズムによる整列だけで繰り返
し塩基配列のそれぞれの位置を決定することは極めて困
難になる。
【０００６】さらに、繰り返し配列はないがＳＢＨ法で
はこの塩基配列を一義的に決定することが不可能な場合
もある。以下に簡単な例を示す。
はこの塩基配列を一義的に決定することが不可能な場合
もある。以下に簡単な例を示す。
【０００７】まず、被検核酸は［ＡＴＧＡＴ］であると
する。この場合において、３ｍｅｒのプライマーがハイ
ブリダイズするとすると、この被検核酸の部分配列は、
［ＡＴＧ］，［ＴＧＡ］，［ＧＡＴ］の３つであること
になる。しかし、この３つの部分配列を整列させること
により元の配列を決定しようとすると、被検核酸の塩基
配列には、 と、 の２通りの場合が考えられる。よって、ＳＢＨ法では一
義的に核酸塩基の配列を決定できないことなる。
する。この場合において、３ｍｅｒのプライマーがハイ
ブリダイズするとすると、この被検核酸の部分配列は、
［ＡＴＧ］，［ＴＧＡ］，［ＧＡＴ］の３つであること
になる。しかし、この３つの部分配列を整列させること
により元の配列を決定しようとすると、被検核酸の塩基
配列には、 と、 の２通りの場合が考えられる。よって、ＳＢＨ法では一
義的に核酸塩基の配列を決定できないことなる。
【０００８】そして、ＳＢＨ／ＳＨＯＭ法は、これらの
方法以前の配列決定方法によりも格段に処理時間が短縮
されているが、遺伝子解析においてはさらに短時間でこ
れら核酸の塩基配列を決定できることが望まれる。
方法以前の配列決定方法によりも格段に処理時間が短縮
されているが、遺伝子解析においてはさらに短時間でこ
れら核酸の塩基配列を決定できることが望まれる。
【０００９】本発明は、このような問題に鑑みてなされ
たものであり、迅速に核酸の塩基配列を決定することが
可能な核酸塩基配列決定法を提供することを主たる目的
とする。
たものであり、迅速に核酸の塩基配列を決定することが
可能な核酸塩基配列決定法を提供することを主たる目的
とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】以上の問題を解決するた
め、本発明は、一重鎖の核酸塩基配列決定方法を対象と
するものであり、一重鎖の被検核酸の塩基配列決定方法
において、複数の領域に種類ごとに分離して配置された
プライマー（オリゴヌクレオチド）と一重鎖の被検核酸
とをハイブリダイゼーションさせて鋳型・プライマーの
二重鎖部分を有する複合体を形成する第１の工程と、複
数の領域に配置されたそれぞれの複合体に、複合体の鋳
型のヌクレオチドに相補的で塩基対合しうる複数種類の
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を実質的に同時
に加えて、被検核酸を鋳型にしたプライマーの５´から
３´方向への伸張反応を行う第２の工程と、プライマー
の伸張した量を検出する第３の工程とを含むこととし
た。
め、本発明は、一重鎖の核酸塩基配列決定方法を対象と
するものであり、一重鎖の被検核酸の塩基配列決定方法
において、複数の領域に種類ごとに分離して配置された
プライマー（オリゴヌクレオチド）と一重鎖の被検核酸
とをハイブリダイゼーションさせて鋳型・プライマーの
二重鎖部分を有する複合体を形成する第１の工程と、複
数の領域に配置されたそれぞれの複合体に、複合体の鋳
型のヌクレオチドに相補的で塩基対合しうる複数種類の
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を実質的に同時
に加えて、被検核酸を鋳型にしたプライマーの５´から
３´方向への伸張反応を行う第２の工程と、プライマー
の伸張した量を検出する第３の工程とを含むこととし
た。
【００１１】
【作用】このように本発明に係る核酸塩基配列決定方法
によれば、まず、第１の工程により、複数の領域に種類
ごとに分離して配置されたプライマーと被検核酸とをハ
イブリダイゼーションさせてこれらの複合体を形成し、
次に、第２の工程により被検核酸を鋳型としてこれに対
合しうるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を実質
的に同時に加えて、一度に被検核酸を鋳型にしたプライ
マーの５´から３´方向への伸張反応を行う。そして、
第３の工程により、これらのプライマーの伸張量を検出
する。これにより、複数の領域に配置されたそれぞれの
プライマーの伸張量すなわちプライマーと被検核酸の結
合位置が判明し、また、各領域内のプライマーの種類は
異なっているので、プライマーの塩基配列をいわゆる一
筆書きのアルゴリズムを用いて解析すれば、被検核酸の
塩基配列を決定することが可能である。
によれば、まず、第１の工程により、複数の領域に種類
ごとに分離して配置されたプライマーと被検核酸とをハ
イブリダイゼーションさせてこれらの複合体を形成し、
次に、第２の工程により被検核酸を鋳型としてこれに対
合しうるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を実質
的に同時に加えて、一度に被検核酸を鋳型にしたプライ
マーの５´から３´方向への伸張反応を行う。そして、
第３の工程により、これらのプライマーの伸張量を検出
する。これにより、複数の領域に配置されたそれぞれの
プライマーの伸張量すなわちプライマーと被検核酸の結
合位置が判明し、また、各領域内のプライマーの種類は
異なっているので、プライマーの塩基配列をいわゆる一
筆書きのアルゴリズムを用いて解析すれば、被検核酸の
塩基配列を決定することが可能である。
【００１２】また、このような、複数の領域はガラス製
もしくはシリコン製の材料から構成されるキャピラリー
プレートのコラムによって規定されることとすれば、コ
ラムは分離されて互いに独立であるので、別の領域に配
置されたプライマー同士が混ざり合うことがない。この
ようなキャピラリープレート形状としては、被検核酸の
シーケンシングの観点からはコラムがマトリックス状に
配列しており、方形状のが有用であるが、本発明ではこ
の形状として円形や三角形のものでも適用されうる。ま
た、このようなキャピラリープレートのコラムは、一般
的には直径数ないし数百μｍ程度の円筒穴で規定される
ので、コラム内にプライマーや被検核酸などの液体を導
入する際には、表面張力を考慮してキャピラリープレー
トの厚み方向への電気泳動を用いることが望ましい。さ
らに、被検核酸のシーケンシングの観点からはプライマ
ーはキャピラリープレートのコラム内に固定されるほう
が望ましい。
もしくはシリコン製の材料から構成されるキャピラリー
プレートのコラムによって規定されることとすれば、コ
ラムは分離されて互いに独立であるので、別の領域に配
置されたプライマー同士が混ざり合うことがない。この
ようなキャピラリープレート形状としては、被検核酸の
シーケンシングの観点からはコラムがマトリックス状に
配列しており、方形状のが有用であるが、本発明ではこ
の形状として円形や三角形のものでも適用されうる。ま
た、このようなキャピラリープレートのコラムは、一般
的には直径数ないし数百μｍ程度の円筒穴で規定される
ので、コラム内にプライマーや被検核酸などの液体を導
入する際には、表面張力を考慮してキャピラリープレー
トの厚み方向への電気泳動を用いることが望ましい。さ
らに、被検核酸のシーケンシングの観点からはプライマ
ーはキャピラリープレートのコラム内に固定されるほう
が望ましい。
【００１３】また、このような伸張量の検出方法には、
様々なものが考えられるが、例えば、上記第３の工程に
おけるプライマーの伸張量を、第２の工程における伸張
反応に伴って複数種類のヌクレオチドまたはヌクレオチ
ド類似体から遊離したピロリン酸をＡＰＳと反応させて
ＡＴＰを生成し、このＡＴＰのルシフェラーゼ反応に伴
う発光量を検出することにより行うこととしてもよい。
これにより、発光量は伸張量に比例するので、伸張した
長さとプライマーと被検核酸との結合位置を求めること
が可能である。
様々なものが考えられるが、例えば、上記第３の工程に
おけるプライマーの伸張量を、第２の工程における伸張
反応に伴って複数種類のヌクレオチドまたはヌクレオチ
ド類似体から遊離したピロリン酸をＡＰＳと反応させて
ＡＴＰを生成し、このＡＴＰのルシフェラーゼ反応に伴
う発光量を検出することにより行うこととしてもよい。
これにより、発光量は伸張量に比例するので、伸張した
長さとプライマーと被検核酸との結合位置を求めること
が可能である。
【００１４】また、第２の工程において複数種類のヌク
レオチド類似体として蛍光ラベルしたデオキシリボヌク
レオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を加えて被検核酸を鋳型
にしたプライマーの伸張反応を行い、第３の工程におけ
るプライマーの伸張量を、複数の領域に励起光を照射し
て、伸張したプライマーの蛍光ラベルからの発光量を検
出することにより行うこととしてもよい。これにより、
励起光の照射により、各複合体から観測される発光量は
伸張量に比例するので、伸張した長さとプライマーと被
検核酸との結合位置を求めることが可能である。
レオチド類似体として蛍光ラベルしたデオキシリボヌク
レオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を加えて被検核酸を鋳型
にしたプライマーの伸張反応を行い、第３の工程におけ
るプライマーの伸張量を、複数の領域に励起光を照射し
て、伸張したプライマーの蛍光ラベルからの発光量を検
出することにより行うこととしてもよい。これにより、
励起光の照射により、各複合体から観測される発光量は
伸張量に比例するので、伸張した長さとプライマーと被
検核酸との結合位置を求めることが可能である。
【００１５】
（第１実施例） （１）まず、図１に示すような複数のコラムを有する方
形板のガラス製キャピラリープレートＣＡを容易し、Ｓ
ＢＨ／ＳＨＯＭ法と同様にプライマーとして全てのｋ塩
基（同図内ではＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの全ての組み合わせの３
ｍｅｒ、すなわち、６４コラム）の配列を含むオリゴヌ
クレオチドを各コラム内に固定する。
形板のガラス製キャピラリープレートＣＡを容易し、Ｓ
ＢＨ／ＳＨＯＭ法と同様にプライマーとして全てのｋ塩
基（同図内ではＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの全ての組み合わせの３
ｍｅｒ、すなわち、６４コラム）の配列を含むオリゴヌ
クレオチドを各コラム内に固定する。
【００１６】（ａ）これらのオリゴマーは、例えば、ア
プライド バイオシステム社製の３８１Ａ型機などの自
動合成機を用いて作製することができる。
プライド バイオシステム社製の３８１Ａ型機などの自
動合成機を用いて作製することができる。
【００１７】（ｂ）そしてこのようにして合成したプラ
イマーの固定は、以下のようにして行ことができる。
イマーの固定は、以下のようにして行ことができる。
【００１８】各コラム内にアミノ（−ＮＨ2 ）基を固
定する。この固定には、まず、キャピラリープレートＣ
Ａのコラム以外の部分にマスクを施し、このマスクを形
成したキャピラリープレートＣＡをデシケーター等の密
閉容器内に設置する。しかる後、該密閉容器内にアミノ
プロピルトリメトキシシランをガス化して充満させ、数
時間放置する。続いて、このキャピラリープレートＣＡ
をオーブン（ベーク炉）で１６０℃程度でベークする。
定する。この固定には、まず、キャピラリープレートＣ
Ａのコラム以外の部分にマスクを施し、このマスクを形
成したキャピラリープレートＣＡをデシケーター等の密
閉容器内に設置する。しかる後、該密閉容器内にアミノ
プロピルトリメトキシシランをガス化して充満させ、数
時間放置する。続いて、このキャピラリープレートＣＡ
をオーブン（ベーク炉）で１６０℃程度でベークする。
【００１９】次に自動合成装置で合成したプライマー
の５´端にアミノ（−ＮＨ2 ）基を付ける。これは、プ
ライマーにＨ2 Ｎ（ＣＨ2 ）2 ＮＨ2 とカーボジイミド
（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ｐＨ６）とを反応させ
ることにより５´端にＮＨ−（ＣＨ2 ）2 −Ｈ2 Ｎを固
定することができる。
の５´端にアミノ（−ＮＨ2 ）基を付ける。これは、プ
ライマーにＨ2 Ｎ（ＣＨ2 ）2 ＮＨ2 とカーボジイミド
（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ｐＨ６）とを反応させ
ることにより５´端にＮＨ−（ＣＨ2 ）2 −Ｈ2 Ｎを固
定することができる。
【００２０】すなわち、この反応は以下の反応式に従
う。
う。
【００２１】
【化１】
【００２２】しかる後、アミノ（−ＮＨ2 ）基に共有
結合するバイファンクショナルクロスリンカー［例え
ば、ジサクシミディル サベラート（ｄｉｓｕｃｃｉｎ
ｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）
結合するバイファンクショナルクロスリンカー［例え
ば、ジサクシミディル サベラート（ｄｉｓｕｃｃｉｎ
ｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）
【００２３】
【化２】
【００２４】もしくはこれの水溶性同族体ビスサルフサ
クシニミディル サベラート（ｂｉｓ−ｓｕｌｆｕｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）］
クシニミディル サベラート（ｂｉｓ−ｓｕｌｆｕｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）］
【００２５】
【化３】
【００２６】をこれに加えると
【００２７】
【化４】
【００２８】が生成される。
【００２９】但し、このような反応を用いた場合にはプ
ライマー同士が結合する恐れがあるので、アミノプロピ
ルトリメキシシランにＣＯＯＨ基を付けるかまたはコラ
ム（ガラス）に固定されたアミノ基にＣＯＯＨ基を付け
て、ガラス−ＣＯＯＨ基を上述のようにサクシニミディ
ル化する。
ライマー同士が結合する恐れがあるので、アミノプロピ
ルトリメキシシランにＣＯＯＨ基を付けるかまたはコラ
ム（ガラス）に固定されたアミノ基にＣＯＯＨ基を付け
て、ガラス−ＣＯＯＨ基を上述のようにサクシニミディ
ル化する。
【００３０】ここで、Ｎ−ハイドロキシサクシニミディ
ル
ル
【００３１】
【化５】
【００３２】で活性化すると、
【００３３】
【化６】
【００３４】が生成される。これにで得られたアミノ
化プライマーを混ぜるとこれらがクロスリンクする。
化プライマーを混ぜるとこれらがクロスリンクする。
【００３５】また、バイファンクショナルクロスリンカ
ーとアミノプライマーに時間差をつけて加える（すなわ
ち、ガラス−リンカーにまずアミノプライマーを加え
る）ことによりガラス−（リンカー）−プライマーを得
ることができる。すなわち、
ーとアミノプライマーに時間差をつけて加える（すなわ
ち、ガラス−リンカーにまずアミノプライマーを加え
る）ことによりガラス−（リンカー）−プライマーを得
ることができる。すなわち、
【００３６】
【化７】
【００３７】として効率よくガラスにプライマーを固定
することができる。
することができる。
【００３８】さらに、下記〜の手順を用いて効率よ
くプライマーを各コラムの（−ＳＨ基）に固定すること
もできる。
くプライマーを各コラムの（−ＳＨ基）に固定すること
もできる。
【００３９】まず、全コラム表面でメルカプトプロピ
ルトリメトキシシランを反応させ、（−ＳＨ基）を固定
する。なお、この固定は前記のコラム−アミノ基にＴｒ
ａｕｔの試薬
ルトリメトキシシランを反応させ、（−ＳＨ基）を固定
する。なお、この固定は前記のコラム−アミノ基にＴｒ
ａｕｔの試薬
【００４０】
【化８】
【００４１】を作用させて（−ＳＨ基）を付加すること
もできる。
もできる。
【００４２】次に、前記と同様の方法であらかじめ各
プライマーの５´端にアミノ基を付加し、そこにバイフ
ァンクショナルクロスリンカーである（ｓｕｌｆｏｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ
ｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂ
ｏｘｙｌａｔｅ（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を共有結合さ
せておく（ｐＨ７）。なおこれの構造式は、
プライマーの５´端にアミノ基を付加し、そこにバイフ
ァンクショナルクロスリンカーである（ｓｕｌｆｏｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ
ｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂ
ｏｘｙｌａｔｅ（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）を共有結合さ
せておく（ｐＨ７）。なおこれの構造式は、
【００４３】
【化９】
【００４４】である。
【００４５】このようにして活性化させたプライマー
は（−ＳＨ基）と反応して共有結合するので、各コラム
に別々のプライマーを導入するとすると（ｐＨ６）、
は（−ＳＨ基）と反応して共有結合するので、各コラム
に別々のプライマーを導入するとすると（ｐＨ６）、
【００４６】
【化１０】
【００４７】のように固定化される。
【００４８】なお、図１のキャピラリープレートＣＡの
コラムでは、図２に示すオリゴヌクレオチド組成でプラ
イマーが配列しているものとし、プライマーのコラム内
への注入は、注入する液体（プライマー）の表面張力を
考慮して、コラム内に自動合成装置からのプライマー注
入針を嵌通させるとともに、キャピラリープレートＣＡ
の厚み方向に電界を生ぜしめて電気泳動により行う。上
記の手順に従った結果、図１中、一部抜き出し、拡大し
て模式的に示すようにコラム内にオリゴヌクレオチドが
固定されることになる（同図中では、プライマーは［Ｃ
ＣＣ］）。
コラムでは、図２に示すオリゴヌクレオチド組成でプラ
イマーが配列しているものとし、プライマーのコラム内
への注入は、注入する液体（プライマー）の表面張力を
考慮して、コラム内に自動合成装置からのプライマー注
入針を嵌通させるとともに、キャピラリープレートＣＡ
の厚み方向に電界を生ぜしめて電気泳動により行う。上
記の手順に従った結果、図１中、一部抜き出し、拡大し
て模式的に示すようにコラム内にオリゴヌクレオチドが
固定されることになる（同図中では、プライマーは［Ｃ
ＣＣ］）。
【００４９】（２）そして、このようにしてプライマー
が各コラム内に固定されたキャピラリープレートＣＡの
各コラム内（例えば、［ＧＡＣ］のコラム）に未知の一
本鎖被検核酸（例えば、塩基配列が［ＡＧＣＴＧＣＴ
Ａ］とする。）を加える（図３（ｂ））。これにより、
各コラム内のプライマーは被検核酸とハイブリダイズ
（交雑）する。その後、交雑しなかった被検核酸は洗浄
して洗い流す。そして、コラム内には、以下のポリメラ
ーゼ反応およびルシフェラーゼ反応が円滑に行われるよ
うに、緩衝液を導入しておく（図３（ｃ））。この緩衝
液としては、シーケンスバッファーとしてのグリセロー
ル、グルコース、ＡＰＳ、ルシフェリン、ｐＨ緩衝液と
してのトリス−塩酸等、ポリメラーゼ反応やルシフェラ
ーゼ反応の基質となる錯体（ｄＮＴＰ、ＡＴＰとＭｇ2+
の錯体）を生成するためのＭｇＣｌ2、反応の活性化を
高めかつ安定性を向上させるための塩溶液としてＮａＣ
ｌ等、酵素タンパク質を酸化変性から保護するためのデ
ィチオスレイトール等を用いる。
が各コラム内に固定されたキャピラリープレートＣＡの
各コラム内（例えば、［ＧＡＣ］のコラム）に未知の一
本鎖被検核酸（例えば、塩基配列が［ＡＧＣＴＧＣＴ
Ａ］とする。）を加える（図３（ｂ））。これにより、
各コラム内のプライマーは被検核酸とハイブリダイズ
（交雑）する。その後、交雑しなかった被検核酸は洗浄
して洗い流す。そして、コラム内には、以下のポリメラ
ーゼ反応およびルシフェラーゼ反応が円滑に行われるよ
うに、緩衝液を導入しておく（図３（ｃ））。この緩衝
液としては、シーケンスバッファーとしてのグリセロー
ル、グルコース、ＡＰＳ、ルシフェリン、ｐＨ緩衝液と
してのトリス−塩酸等、ポリメラーゼ反応やルシフェラ
ーゼ反応の基質となる錯体（ｄＮＴＰ、ＡＴＰとＭｇ2+
の錯体）を生成するためのＭｇＣｌ2、反応の活性化を
高めかつ安定性を向上させるための塩溶液としてＮａＣ
ｌ等、酵素タンパク質を酸化変性から保護するためのデ
ィチオスレイトール等を用いる。
【００５０】（３）これらの被検核酸がプライマーと交
雑した各コラムに４種類のｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）をＤＮＡポリメラ
ーゼを触媒として同時に加える（図３（ｄ））。これに
より、プライマーの５´から３´方向には、被検核酸の
各塩基（Ａ；アデニン、Ｔ；チミン、Ｇ；グアニン、
Ｃ；シトシン）に相補的な塩基が被検核酸の塩基とハイ
ブリダイズし、プライマーの一方向伸張反応が生じる
（模式的には図３（ｂ）に示す）。
雑した各コラムに４種類のｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）をＤＮＡポリメラ
ーゼを触媒として同時に加える（図３（ｄ））。これに
より、プライマーの５´から３´方向には、被検核酸の
各塩基（Ａ；アデニン、Ｔ；チミン、Ｇ；グアニン、
Ｃ；シトシン）に相補的な塩基が被検核酸の塩基とハイ
ブリダイズし、プライマーの一方向伸張反応が生じる
（模式的には図３（ｂ）に示す）。
【００５１】ここで、被検核酸（例えば、［ＡＧＣＴＧ
ＴＣＡ］）は、［ＴＧＣ］，［ＣＧＡ］，［ＧＡＣ］，
［ＡＣＧ］，［ＧＡＴ］のプライマーと交雑しているの
で、［ＴＧＣ］の固定されたコラムでは、伸張反応に伴
って以下の反応式（１）に従って５のピロリン酸（ＰＰ
ｉ）が遊離し、［ＣＧＡ］，［ＧＡＣ］，［ＡＣＧ］，
［ＧＡＴ］のコラムではそれぞれｎ＝２．５，３，２，
０のＰＰｉが遊離する。
ＴＣＡ］）は、［ＴＧＣ］，［ＣＧＡ］，［ＧＡＣ］，
［ＡＣＧ］，［ＧＡＴ］のプライマーと交雑しているの
で、［ＴＧＣ］の固定されたコラムでは、伸張反応に伴
って以下の反応式（１）に従って５のピロリン酸（ＰＰ
ｉ）が遊離し、［ＣＧＡ］，［ＧＡＣ］，［ＡＣＧ］，
［ＧＡＴ］のコラムではそれぞれｎ＝２．５，３，２，
０のＰＰｉが遊離する。
【００５２】 テンプレートプライマー＋ｎｄＮＴＰ →テンプレート−（プライマー＋ｎｄＮＭＰ）＋ｎＰＰｉ…反応式（１） （４）なお、ルシフェラーゼによる発光反応の基質はル
シフェリンとＡＴＰと酵素であるが、測定系に含まれて
いるｄＡＴＰ及びＡＰＳも基質となり、若干発光反応を
するので測定精度を高めるためにこれらの物質は発光反
応を行う前に酵素的に除く必要がある。すなわち、これ
らのコラムにヘキソナーゼ（具体的にはヘキソナーゼ固
定化ビーズ）を加えることにより、（１）式の形成過程
で残った余分なｄＡＴＰからＰｉを遊離させてｄＡＤＰ
にする（図３（ｅ））。
シフェリンとＡＴＰと酵素であるが、測定系に含まれて
いるｄＡＴＰ及びＡＰＳも基質となり、若干発光反応を
するので測定精度を高めるためにこれらの物質は発光反
応を行う前に酵素的に除く必要がある。すなわち、これ
らのコラムにヘキソナーゼ（具体的にはヘキソナーゼ固
定化ビーズ）を加えることにより、（１）式の形成過程
で残った余分なｄＡＴＰからＰｉを遊離させてｄＡＤＰ
にする（図３（ｅ））。
【００５３】各コラムにグリセロキナーゼ（具体的には
グリセロキナーゼ固定化ビーズ）を加えることにより、
以下の反応式（２）に従ってコラム内に残留しているｄ
ＡＴＰからＰｉが遊離する。
グリセロキナーゼ固定化ビーズ）を加えることにより、
以下の反応式（２）に従ってコラム内に残留しているｄ
ＡＴＰからＰｉが遊離する。
【００５４】 ｄＡＴＰ→ｄＡＤＰ＋Ｐｉ …反応式（２） （５）次に、各コラムにＡＴＰスルフリラーゼを加える
ことにより、コラム内のＰＰｉを以下の反応式（３）に
従ってＡＰＳと反応させてＡＴＰとする（図３
（ｆ））。
ことにより、コラム内のＰＰｉを以下の反応式（３）に
従ってＡＰＳと反応させてＡＴＰとする（図３
（ｆ））。
【００５５】 ＰＰｉ＋ＡＰＳ→ＡＴＰ …反応式（３） なお、コラム内に残留したＡＰＳは、コラムにＡＰスル
ファターゼを加えて分解する。
ファターゼを加えて分解する。
【００５６】（６）この後、キャピラリープレートＣＡ
を図４に示すような核酸塩基配列決定装置の暗箱ＤＢ内
に配置する。なお、図４に示す核酸塩基配列決定装置
は、キャピラリープレートＣＡを収納し、外部からの光
を遮断する暗箱ＤＢと、暗箱ＤＢの一側面に設けられて
キャピラリープレートＣＡのコラム内を観察できる顕微
鏡もしくはマイクロレンズ２０と、顕微鏡もしくはマイ
クロレンズ２０から観察されるキャピラリープレートＣ
Ａを撮像するＣＣＤテレビカメラ１０と、このＣＣＤカ
メラ１０からのビデオ信号を画像処理する（例えば、閾
値以下の強度の背景光信号をフィルタを通すことにより
除去する）画像処理装置３０と、画像処理装置３０から
の信号に基づいて、一筆書きのアルゴリズムにより被検
核酸の配列を決定するコンピュータ４０とから構成され
ている。このような核酸塩基配列決定装置内にキャピラ
リープレートＣＡを配置した後、コラムにルシフェラー
ゼ（具体的にはルシフェラーゼ固定化ビーズ）を加える
ことにより（図３（ｇ））、以下の（ルシフェラーゼ反
応）反応式（４）に従ってＡＴＰの量に比例した発光が
得られる（図３（ｈ））。
を図４に示すような核酸塩基配列決定装置の暗箱ＤＢ内
に配置する。なお、図４に示す核酸塩基配列決定装置
は、キャピラリープレートＣＡを収納し、外部からの光
を遮断する暗箱ＤＢと、暗箱ＤＢの一側面に設けられて
キャピラリープレートＣＡのコラム内を観察できる顕微
鏡もしくはマイクロレンズ２０と、顕微鏡もしくはマイ
クロレンズ２０から観察されるキャピラリープレートＣ
Ａを撮像するＣＣＤテレビカメラ１０と、このＣＣＤカ
メラ１０からのビデオ信号を画像処理する（例えば、閾
値以下の強度の背景光信号をフィルタを通すことにより
除去する）画像処理装置３０と、画像処理装置３０から
の信号に基づいて、一筆書きのアルゴリズムにより被検
核酸の配列を決定するコンピュータ４０とから構成され
ている。このような核酸塩基配列決定装置内にキャピラ
リープレートＣＡを配置した後、コラムにルシフェラー
ゼ（具体的にはルシフェラーゼ固定化ビーズ）を加える
ことにより（図３（ｇ））、以下の（ルシフェラーゼ反
応）反応式（４）に従ってＡＴＰの量に比例した発光が
得られる（図３（ｈ））。
【００５７】 ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｏ2 →オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ＋ＣＯ2 ＋光…反応式（４） すなわち、ここでのＡＴＰの量は被検核酸から遊離した
ＰＰｉの量に比例し、ＰＰｉの量は伸張反応した塩基の
量に比例し、プライマーは５´端から３´端方向にしか
伸張しないので、被検核酸とプライマーとのハイブリダ
イズの有無および被検核酸とプライマーとの結合位置が
分かる。図４に示した核酸塩基配列決定装置により、こ
のキャピラリープレートＣＡを観察すれば、図５（ａ）
に示すような発光現象が観察される。なお、キャピラリ
ープレートＣＡのコラム内のプライマーも配列は、前述
のように、図２に示した通りである。
ＰＰｉの量に比例し、ＰＰｉの量は伸張反応した塩基の
量に比例し、プライマーは５´端から３´端方向にしか
伸張しないので、被検核酸とプライマーとのハイブリダ
イズの有無および被検核酸とプライマーとの結合位置が
分かる。図４に示した核酸塩基配列決定装置により、こ
のキャピラリープレートＣＡを観察すれば、図５（ａ）
に示すような発光現象が観察される。なお、キャピラリ
ープレートＣＡのコラム内のプライマーも配列は、前述
のように、図２に示した通りである。
【００５８】すなわち、［ＴＧＣ］，［ＣＧＡ］，［Ｇ
ＡＣ］，［ＡＣＧ］，［ＧＡＴ］コラムでは、それぞれ
発光量５，２．５，３，２，０の発光が観察されるの
で、これらを一筆書きのアルゴリズムに従って発光量の
少ない順に並べるとＴＣＧＡＣＧＡＴというプライマー
に伸張した塩基配列が決定される。そして被検核酸はこ
れに相補的な核酸であるので、被検核酸は［ＡＧＣＴＧ
ＣＴＡ］と同定できる（図５（ｂ）。
ＡＣ］，［ＡＣＧ］，［ＧＡＴ］コラムでは、それぞれ
発光量５，２．５，３，２，０の発光が観察されるの
で、これらを一筆書きのアルゴリズムに従って発光量の
少ない順に並べるとＴＣＧＡＣＧＡＴというプライマー
に伸張した塩基配列が決定される。そして被検核酸はこ
れに相補的な核酸であるので、被検核酸は［ＡＧＣＴＧ
ＣＴＡ］と同定できる（図５（ｂ）。
【００５９】このように、測定したプライマーの長さを
基にすれば、測定精度の範囲内において、それぞれのオ
リゴヌクレオチドの相互の位置関係が求められる。測定
精度が向上してｋ塩基以下の差が検出できれば、図６に
示すように、この段階で被検核酸の塩基配列が決定でき
る。同図は被検核酸として、 ３´−ＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＧＣＧＧＧＡ
ＴＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＴＡＡＴＣＧＣＣＧＣＧＡＧ
ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴ−５´ を用い、コラム内に８ｍｅｒのプライマーを用いた場合
のハイブリダイゼーションの仕方とこのプライマー伸張
反応により生じたピロリン酸の遊離量を測定することに
より被検核酸の塩基配列方法を表している。このよう
に、本実施例の方法によれば、被検核酸が長鎖になった
場合でもコラム内のプライマーの長さを長くすることに
より、短時間に核酸塩基の配列を決定することができる
ばかりでなく、この核酸塩基配列決定方法を用いれば、
プライマーの種類ばかりでなくこれと鋳型の被検核酸と
の結合位置を測定することが可能であるので、結合位置
が特定できないために決定できなかった一筆書きのオイ
ラー道が２つ以上ある核酸塩基の配列をある程度決定す
ることが可能である。
基にすれば、測定精度の範囲内において、それぞれのオ
リゴヌクレオチドの相互の位置関係が求められる。測定
精度が向上してｋ塩基以下の差が検出できれば、図６に
示すように、この段階で被検核酸の塩基配列が決定でき
る。同図は被検核酸として、 ３´−ＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＧＣＧＧＧＡ
ＴＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＴＡＡＴＣＧＣＣＧＣＧＡＧ
ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴ−５´ を用い、コラム内に８ｍｅｒのプライマーを用いた場合
のハイブリダイゼーションの仕方とこのプライマー伸張
反応により生じたピロリン酸の遊離量を測定することに
より被検核酸の塩基配列方法を表している。このよう
に、本実施例の方法によれば、被検核酸が長鎖になった
場合でもコラム内のプライマーの長さを長くすることに
より、短時間に核酸塩基の配列を決定することができる
ばかりでなく、この核酸塩基配列決定方法を用いれば、
プライマーの種類ばかりでなくこれと鋳型の被検核酸と
の結合位置を測定することが可能であるので、結合位置
が特定できないために決定できなかった一筆書きのオイ
ラー道が２つ以上ある核酸塩基の配列をある程度決定す
ることが可能である。
【００６０】測定精度の誤差限界がｋ塩基以上ある場合
には、決定できない部分において上記ＳＢＨ法で述べら
れている計算アルゴリズムによりもとめればよい。ま
た、精密かつ簡単に測定を行うためには（例えば、８ｍ
ｅｒの）オリゴヌクレオチドまたは被検核酸を計測器に
セットできる程度の大きさのマトリックス状に固定する
かもしくはコンパートメント化して（例えば、６５５３
６通りの）交雑、伸張、計測ができるようにする必要が
ある。また、被検核酸もしくはオリゴヌクレオチドを管
壁に固定化すると伸張反応操作は簡単になる。
には、決定できない部分において上記ＳＢＨ法で述べら
れている計算アルゴリズムによりもとめればよい。ま
た、精密かつ簡単に測定を行うためには（例えば、８ｍ
ｅｒの）オリゴヌクレオチドまたは被検核酸を計測器に
セットできる程度の大きさのマトリックス状に固定する
かもしくはコンパートメント化して（例えば、６５５３
６通りの）交雑、伸張、計測ができるようにする必要が
ある。また、被検核酸もしくはオリゴヌクレオチドを管
壁に固定化すると伸張反応操作は簡単になる。
【００６１】次に、コラム内で実際に４種類のｄＮＴＰ
（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ）をＤＮＡポリメラーゼを触媒として導入し、４種類
のｄＮＴＰを略同時被検核酸に加えることによってハイ
ブリダイゼーションとこれに伴うピロリン酸の遊離およ
びピロリン酸の遊離に起因する被検核酸とプライマーと
の結合位置に比例した発光が起こるかどうかを以下の実
験により確かめた。
（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ）をＤＮＡポリメラーゼを触媒として導入し、４種類
のｄＮＴＰを略同時被検核酸に加えることによってハイ
ブリダイゼーションとこれに伴うピロリン酸の遊離およ
びピロリン酸の遊離に起因する被検核酸とプライマーと
の結合位置に比例した発光が起こるかどうかを以下の実
験により確かめた。
【００６２】（実験例１）上記のＤＮＡポリメラーゼに
よる伸張反応では１個のｄＮＴＰがＤＮＡに取り込まれ
ると１個のピロリン酸が遊離する。従って、伸張反応の
量は遊離してくるピロリン酸の量を定量すれば求められ
る。実際の塩基配列決定装置に用いられる例えば百万の
コンパートメントを持つキャピラリープレートは百万の
試験管を束ねたものと同等であるので、ここでは３本の
試験管を上記の発明を実証する実験を行い、被検核酸か
ら遊離するピロリン酸に起因する発光量を検出した。な
お、プライマーの固定は発光の現象とは無関係であるの
で行わなかった。ここで、ピロリン酸の量はアデノシン
５´ホスホ硫酸（ＡＰＳ）とＡＴＰサルフリラーゼを用
いてＡＴＰの量に置き換えてルシフェラーゼによる発光
反応で検出した。
よる伸張反応では１個のｄＮＴＰがＤＮＡに取り込まれ
ると１個のピロリン酸が遊離する。従って、伸張反応の
量は遊離してくるピロリン酸の量を定量すれば求められ
る。実際の塩基配列決定装置に用いられる例えば百万の
コンパートメントを持つキャピラリープレートは百万の
試験管を束ねたものと同等であるので、ここでは３本の
試験管を上記の発明を実証する実験を行い、被検核酸か
ら遊離するピロリン酸に起因する発光量を検出した。な
お、プライマーの固定は発光の現象とは無関係であるの
で行わなかった。ここで、ピロリン酸の量はアデノシン
５´ホスホ硫酸（ＡＰＳ）とＡＴＰサルフリラーゼを用
いてＡＴＰの量に置き換えてルシフェラーゼによる発光
反応で検出した。
【００６３】（材料と方法） 試薬 グリセロキナーゼ固定化セファロスビーズ ヘキソキナーゼ固定化セファロスビーズ ＡＴＰスルフリラーゼ固定化セファロスビーズ ＡＰスルファターゼ固定化セファロスビーズ ルシフェラーゼ固定化セファロースビーズ ２２４塩基長１本鎖ＤＮＡ（プラスミドのマルチクロー
ニングサイト） リバースプライマー ＫＳプライマー ＤＮＡポリメラーゼ ｄＮＴＰ緩衝液（ｄＡＴＰ・ｄＴＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＣ
ＴＰ各２５μＭ，グルコース・グリセロール各１０ｍ
Ｍ、ＡＰＳ１μｍＭ、ルシフェリン１００μｇ／ｍｌ、
４０ｍＭ−トリス・塩酸（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ−Ｍ
ｇＣｌ2 、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ディチオス
レイトール） ここで、リバースプライマーとしての塩基配列は、 ［５´−ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３´］ をであり、ＫＳプライマーの塩基配列は、 ［５´−ＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧ−３´］ をである。
ニングサイト） リバースプライマー ＫＳプライマー ＤＮＡポリメラーゼ ｄＮＴＰ緩衝液（ｄＡＴＰ・ｄＴＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＣ
ＴＰ各２５μＭ，グルコース・グリセロール各１０ｍ
Ｍ、ＡＰＳ１μｍＭ、ルシフェリン１００μｇ／ｍｌ、
４０ｍＭ−トリス・塩酸（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ−Ｍ
ｇＣｌ2 、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ディチオス
レイトール） ここで、リバースプライマーとしての塩基配列は、 ［５´−ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３´］ をであり、ＫＳプライマーの塩基配列は、 ［５´−ＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧ−３´］ をである。
【００６４】そして、被検核酸の塩基配列としては、 ［３´−ＴＴＧＴＣＧＡＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＡＡＴＧ
ＣＧＧＴＴＣＧＣＧＣＧＴＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡ
ＴＴＴＣＣＣＴＴＧＴＴＴＴＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣ
ＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＴＡＧ
ＣＴＡＴＴＣＧＡＡＣＴＡＴＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＣＧ
ＴＣＧＧＧＣＣＣＣＣＴＡＧＧＴＧＡＴＣＡＡＧＡＴＣ
ＴＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧ
ＧＴＴＡＡＧＣＧＧＧＡＴＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＴＡ
ＡＴＧＣＧＣＧＣＧＡＧＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡ
ＡＴＧ−５´］ を用いた。
ＣＧＧＴＴＣＧＣＧＣＧＴＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡ
ＴＴＴＣＣＣＴＴＧＴＴＴＴＣＧＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣ
ＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＴＡＧ
ＣＴＡＴＴＣＧＡＡＣＴＡＴＡＧＣＴＴＡＡＧＧＡＣＧ
ＴＣＧＧＧＣＣＣＣＣＴＡＧＧＴＧＡＴＣＡＡＧＡＴＣ
ＴＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧ
ＧＴＴＡＡＧＣＧＧＧＡＴＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＴＡ
ＡＴＧＣＧＣＧＣＧＡＧＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡ
ＡＴＧ−５´］ を用いた。
【００６５】実験器具 恒温槽 試験管用測定ホルダー付き光電子増倍管型積分球 ユニバーサルホトンカウンター 実験操作 まず、試験管（ａ〜ｃ）を３本用意してそれぞれに以下
のものを加えた。
のものを加えた。
【００６６】ａ）ｄＮＴＰ緩衝液（１００μｌ） ｂ）ｄＮＴＰ緩衝液（１００μｌ）、１本鎖ＤＮＡ（２
ピコモル）、ＫＳプライマー（１ピコモル） ｃ）ｄＮＴＰ緩衝液（１ｍｌ）、１本鎖ＤＮＡ（２ピコ
モル）、リバースプライマー（１ピコモル） そして、それぞれの試験管を６５℃、３分間インキュベ
ート後直ちに氷上で冷却後ＤＮＡポリメラーゼ（３ユニ
ットを加えて３７℃、５分間インキュベートし氷上で保
存した。
ピコモル）、ＫＳプライマー（１ピコモル） ｃ）ｄＮＴＰ緩衝液（１ｍｌ）、１本鎖ＤＮＡ（２ピコ
モル）、リバースプライマー（１ピコモル） そして、それぞれの試験管を６５℃、３分間インキュベ
ート後直ちに氷上で冷却後ＤＮＡポリメラーゼ（３ユニ
ットを加えて３７℃、５分間インキュベートし氷上で保
存した。
【００６７】それぞれの試験管に以下の（１〜４）の順
序で酵素固定化セファロースビーズ懸濁液１０μｌを加
えて静かに撹拌して２５℃、３分間インキュベート後、
上澄を新しい試験管に移し替えた。
序で酵素固定化セファロースビーズ懸濁液１０μｌを加
えて静かに撹拌して２５℃、３分間インキュベート後、
上澄を新しい試験管に移し替えた。
【００６８】１．グリセロキナーゼ固定化セファロビー
ズ ２．ヘキソナーゼ固定化セファロースビーズ ３．ＡＴＰスルフリラーゼ固定化セファロースビーズ ４．ＡＰスルファターゼ固定化セファロースビーズ 最後の上澄にルシフェラーゼ固定化ビーズを１０μｌ加
えて静かに撹拌した後直ちに積分球にセットして発光光
量をカウントした。発光量を測定した結果、プライマー
の入っていない試験管（ａ）からは、２０４．８秒間の
間に０．１９×１０7 個の光電子パルスが計測され、リ
バースプライマーの入っている試験管（ｂ）では２．０
６×１０7 個の光電子パルスが計測され、ＫＳプライマ
ーの入っている試験管（ｃ）では１．４５×１０7 個の
光電子パルスが計測された。
ズ ２．ヘキソナーゼ固定化セファロースビーズ ３．ＡＴＰスルフリラーゼ固定化セファロースビーズ ４．ＡＰスルファターゼ固定化セファロースビーズ 最後の上澄にルシフェラーゼ固定化ビーズを１０μｌ加
えて静かに撹拌した後直ちに積分球にセットして発光光
量をカウントした。発光量を測定した結果、プライマー
の入っていない試験管（ａ）からは、２０４．８秒間の
間に０．１９×１０7 個の光電子パルスが計測され、リ
バースプライマーの入っている試験管（ｂ）では２．０
６×１０7 個の光電子パルスが計測され、ＫＳプライマ
ーの入っている試験管（ｃ）では１．４５×１０7 個の
光電子パルスが計測された。
【００６９】すなわち、上記被検核酸とのハイブリダイ
ゼーションによりリバースおよびＫＳプライマーが伸張
する長さは夫々２０８、１２７であることが被検核酸の
塩基配列から期待される。よって、このハイブリダイゼ
ーションに伴うピロリン酸の遊離量はそれぞれ２０８、
および１２７であると考えられ、上記の実験結果は約１
３塩基数の誤差で伸張した夫々のプライマーの長さを見
積もれることを示している。この約１３塩基数の誤差
は、バックグラウンド発光によるものと考えられるの
で、更にバックグラウンド発光を抑える工夫をして、測
定装置に改良を加えれば検出精度は改善されるものと思
われる。すなわち、この核酸塩基配列決定方法を用いれ
ば、短時間に結合するプライマーの種類を決定できるば
かりでなく、これと鋳型である被検核酸との結合位置を
測定することが可能であるので、結合位置が特定できな
いために決定できなかった一筆書きのオイラー道が２つ
以上ある核酸塩基の配列をもある程度決定することが可
能である。
ゼーションによりリバースおよびＫＳプライマーが伸張
する長さは夫々２０８、１２７であることが被検核酸の
塩基配列から期待される。よって、このハイブリダイゼ
ーションに伴うピロリン酸の遊離量はそれぞれ２０８、
および１２７であると考えられ、上記の実験結果は約１
３塩基数の誤差で伸張した夫々のプライマーの長さを見
積もれることを示している。この約１３塩基数の誤差
は、バックグラウンド発光によるものと考えられるの
で、更にバックグラウンド発光を抑える工夫をして、測
定装置に改良を加えれば検出精度は改善されるものと思
われる。すなわち、この核酸塩基配列決定方法を用いれ
ば、短時間に結合するプライマーの種類を決定できるば
かりでなく、これと鋳型である被検核酸との結合位置を
測定することが可能であるので、結合位置が特定できな
いために決定できなかった一筆書きのオイラー道が２つ
以上ある核酸塩基の配列をもある程度決定することが可
能である。
【００７０】（第２実施例）上述の第１実施例では、プ
ライマーと被検核酸をハイブリダイゼーションさせて、
このハイブリダイゼーションにより遊離したピロリン酸
の量を定量することにより、被検核酸の塩基配列を決定
することができた。次に、蛍光ラベル体ｄＮＴＰを用い
て核酸塩基配列を決定する方法について説明する。
ライマーと被検核酸をハイブリダイゼーションさせて、
このハイブリダイゼーションにより遊離したピロリン酸
の量を定量することにより、被検核酸の塩基配列を決定
することができた。次に、蛍光ラベル体ｄＮＴＰを用い
て核酸塩基配列を決定する方法について説明する。
【００７１】（１）まず、第１実施例と同様にして、図
１に示すような複数のコラムを有する方形板のガラス製
キャピラリープレートＣＡにプライマーとして全てのｋ
塩基（同図内ではＡＴＧＣの全ての組み合わせの３ｍｅ
ｒ、すなわち、６４コラム）の配列を含むオリゴヌクレ
オチドを各コラム内に固定する（図７（ａ））。
１に示すような複数のコラムを有する方形板のガラス製
キャピラリープレートＣＡにプライマーとして全てのｋ
塩基（同図内ではＡＴＧＣの全ての組み合わせの３ｍｅ
ｒ、すなわち、６４コラム）の配列を含むオリゴヌクレ
オチドを各コラム内に固定する（図７（ａ））。
【００７２】（２）そして、このようにしてプライマー
が各コラム内に固定されたキャピラリープレートＣＡの
各コラム内（例えば、［ＧＡＣ］のコラム）に未知の一
本鎖被検核酸（例えば、塩基配列が［ＡＴＣＴＧＣＴ
Ａ］とする。）を加える（図７（ｂ））。これにより、
各コラム内のプライマーは被検核酸とハイブリダイズ
（交雑）する。その後、交雑しなかった被検核酸は洗浄
して洗い流す。そして、コラム内には、以下のポリメラ
ーゼ反応およびルシフェラーゼ反応が円滑に行われるよ
うに、緩衝液を導入しておく（図７（ｃ））。この緩衝
液としては、第１実施例のものと同様とする。
が各コラム内に固定されたキャピラリープレートＣＡの
各コラム内（例えば、［ＧＡＣ］のコラム）に未知の一
本鎖被検核酸（例えば、塩基配列が［ＡＴＣＴＧＣＴ
Ａ］とする。）を加える（図７（ｂ））。これにより、
各コラム内のプライマーは被検核酸とハイブリダイズ
（交雑）する。その後、交雑しなかった被検核酸は洗浄
して洗い流す。そして、コラム内には、以下のポリメラ
ーゼ反応およびルシフェラーゼ反応が円滑に行われるよ
うに、緩衝液を導入しておく（図７（ｃ））。この緩衝
液としては、第１実施例のものと同様とする。
【００７３】（３）これらの被検核酸がプライマーと重
合した各コラムに４種類の蛍光−ｄＮＴＰ（すなわち、
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）をＤＮＡポ
リメラーゼを触媒として同時に加える（図７（ｄ））。
これにより、プライマーの５´から３´方向には、被検
核酸の各塩基（Ａ；アデニン、Ｔ；チミン、Ｇ；グアニ
ン、Ｃ；シトシン）に相補的な塩基が被検核酸の塩基と
ハイブリダイズし、プライマーの一方向伸張反応が生じ
る（模式的には図７（ｂ）に示す）。この後、蛍光−ｄ
ＮＴＰは洗浄によりコラム内から除去しておく。
合した各コラムに４種類の蛍光−ｄＮＴＰ（すなわち、
ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）をＤＮＡポ
リメラーゼを触媒として同時に加える（図７（ｄ））。
これにより、プライマーの５´から３´方向には、被検
核酸の各塩基（Ａ；アデニン、Ｔ；チミン、Ｇ；グアニ
ン、Ｃ；シトシン）に相補的な塩基が被検核酸の塩基と
ハイブリダイズし、プライマーの一方向伸張反応が生じ
る（模式的には図７（ｂ）に示す）。この後、蛍光−ｄ
ＮＴＰは洗浄によりコラム内から除去しておく。
【００７４】ここで、被検核酸（例えば、［ＡＧＣＴＧ
ＴＣＡ］）は、［ＴＧＣ］，［ＣＧＡ］，［ＧＡＣ］，
［ＡＣＧ］，［ＧＡＴ］のプライマーと重合しているの
で、［ＴＧＣ］の固定されたコラムでは、伸張反応に伴
って以下の反応式（１）に従ってｎ＝５の蛍光色素が取
り込まれるとともに、［ＣＧＡ］，［ＧＡＣ］，［ＡＣ
Ｇ］，［ＣＧＡ］，［ＧＡＴ］のコラムではそれぞれｎ
＝２．５，３，２，０の蛍光色素が取り込まれる。
ＴＣＡ］）は、［ＴＧＣ］，［ＣＧＡ］，［ＧＡＣ］，
［ＡＣＧ］，［ＧＡＴ］のプライマーと重合しているの
で、［ＴＧＣ］の固定されたコラムでは、伸張反応に伴
って以下の反応式（１）に従ってｎ＝５の蛍光色素が取
り込まれるとともに、［ＣＧＡ］，［ＧＡＣ］，［ＡＣ
Ｇ］，［ＣＧＡ］，［ＧＡＴ］のコラムではそれぞれｎ
＝２．５，３，２，０の蛍光色素が取り込まれる。
【００７５】（４）この後、キャピラリープレートＣＡ
を図８に示すような核酸塩基配列決定装置の暗箱ＤＢ内
に配置する。図８に示す核酸塩基配列決定装置は、キャ
ピラリープレートＣＡを収納し、外部からの光を遮断す
る暗箱ＤＢ１と、このキャピラリープレートＣＡに励起
光を照射する励起光源（例えば、キセノンランプ）７０
と、暗箱ＤＢ１の一側面に設けられてキャピラリープレ
ートＣＡのコラムを撮像するＣＣＤテレビカメラ１０と
を備えている。また、励起光源７０とキャピラリープレ
ートＣＡとの間には励起光透過フィルタ５０が設けられ
ており、これを透過する光の波長成分のうち、短波長
（例えば、ピ−ク値４５０ｎｍ）のみを同図（ｃ）に示
すように透過させてキャピラリープレートＣＡに照射す
る構成となっている。また、キャピラリープレートＣＡ
とＣＣＤテレビカメラ１０との間には、蛍光透過フィル
タ６０が設置されており、同図（ｂ）に示すように蛍光
波長（例えば、５００ｎｍ）以上の光を透過させる。な
お、励起光源７０としては、同図（ｄ）に示すような超
高圧水銀ランプ７０１を用いてもよい。
を図８に示すような核酸塩基配列決定装置の暗箱ＤＢ内
に配置する。図８に示す核酸塩基配列決定装置は、キャ
ピラリープレートＣＡを収納し、外部からの光を遮断す
る暗箱ＤＢ１と、このキャピラリープレートＣＡに励起
光を照射する励起光源（例えば、キセノンランプ）７０
と、暗箱ＤＢ１の一側面に設けられてキャピラリープレ
ートＣＡのコラムを撮像するＣＣＤテレビカメラ１０と
を備えている。また、励起光源７０とキャピラリープレ
ートＣＡとの間には励起光透過フィルタ５０が設けられ
ており、これを透過する光の波長成分のうち、短波長
（例えば、ピ−ク値４５０ｎｍ）のみを同図（ｃ）に示
すように透過させてキャピラリープレートＣＡに照射す
る構成となっている。また、キャピラリープレートＣＡ
とＣＣＤテレビカメラ１０との間には、蛍光透過フィル
タ６０が設置されており、同図（ｂ）に示すように蛍光
波長（例えば、５００ｎｍ）以上の光を透過させる。な
お、励起光源７０としては、同図（ｄ）に示すような超
高圧水銀ランプ７０１を用いてもよい。
【００７６】（５）このような核酸塩基配列決定装置内
にキャピラリープレートＣＡを配置した後、励起光源７
０からの励起光（例えば、波長４５０ｎｍ）をキャピラ
リープレートＣＡに照射し、蛍光像を観察する。この観
察によって得られる蛍光像は、図５（ａ）と同様であ
り、第１実施例と同様にして被検核酸の配列を決定する
ことができる。すなわち、ここでのプライマーの伸張量
は蛍光色素からの蛍光量に比例し、プライマーは５´端
から３´端方向にしか伸張しないので、被検核酸とプラ
イマーとのハイブリダイズの有無および被検核酸とプラ
イマーとの結合位置が分かる。なお、キャピラリープレ
ートＣＡのコラム内のプライマーも配列は、前述のよう
に、図２に示した通りである。
にキャピラリープレートＣＡを配置した後、励起光源７
０からの励起光（例えば、波長４５０ｎｍ）をキャピラ
リープレートＣＡに照射し、蛍光像を観察する。この観
察によって得られる蛍光像は、図５（ａ）と同様であ
り、第１実施例と同様にして被検核酸の配列を決定する
ことができる。すなわち、ここでのプライマーの伸張量
は蛍光色素からの蛍光量に比例し、プライマーは５´端
から３´端方向にしか伸張しないので、被検核酸とプラ
イマーとのハイブリダイズの有無および被検核酸とプラ
イマーとの結合位置が分かる。なお、キャピラリープレ
ートＣＡのコラム内のプライマーも配列は、前述のよう
に、図２に示した通りである。
【００７７】すなわち、［ＴＧＣ］，［ＣＧＡ］，［Ｇ
ＡＣ］，［ＡＣＧ］，［ＧＡＴ］コラムでは、それぞれ
発光量５，２．５，３，２，０の蛍光が観察されるの
で、これらを一筆書きのアルゴリズムに従って発光量の
少ない順に並べるとＴＣＧＡＣＧＡＴというプライマー
に伸張した塩基配列が決定される。そして被検核酸はこ
れに相補的な核酸であるので、被検核酸は［ＡＧＣＴＧ
ＣＴＡ］と同定できる（図５（ｂ））。また、この方法
によっても図６に示されるような長鎖の被検核酸の塩基
配列を決定することも可能である。
ＡＣ］，［ＡＣＧ］，［ＧＡＴ］コラムでは、それぞれ
発光量５，２．５，３，２，０の蛍光が観察されるの
で、これらを一筆書きのアルゴリズムに従って発光量の
少ない順に並べるとＴＣＧＡＣＧＡＴというプライマー
に伸張した塩基配列が決定される。そして被検核酸はこ
れに相補的な核酸であるので、被検核酸は［ＡＧＣＴＧ
ＣＴＡ］と同定できる（図５（ｂ））。また、この方法
によっても図６に示されるような長鎖の被検核酸の塩基
配列を決定することも可能である。
【００７８】次に、コラム内で実際に４種類の蛍光色素
−ｄＮＴＰ（すなわち、−ｄＡＴＰ、−ｄＴＴＰ、−ｄ
ＧＴＰ、−ｄＣＴＰ）をＤＮＡポリメラーゼを触媒とし
て導入し、４種類の蛍光色素−ｄＮＴＰを略同時に被検
核酸に加えることによってハイブリダイゼーションが生
じ、被検核酸とプライマーとの結合位置に比例した蛍光
（発光）が観察されるかどうかを以下の実験により確か
めた。
−ｄＮＴＰ（すなわち、−ｄＡＴＰ、−ｄＴＴＰ、−ｄ
ＧＴＰ、−ｄＣＴＰ）をＤＮＡポリメラーゼを触媒とし
て導入し、４種類の蛍光色素−ｄＮＴＰを略同時に被検
核酸に加えることによってハイブリダイゼーションが生
じ、被検核酸とプライマーとの結合位置に比例した蛍光
（発光）が観察されるかどうかを以下の実験により確か
めた。
【００７９】（実験例２）伸張反応に伴い取り込まれる
ｄＮＴＰの定量を行った。ＤＮＡポリメラーゼによる伸
張反応でｄＮＴＰをＤＮＡに取り込ませるときに一部も
しくは全部のｄＮＴＰの代わりに蛍光色素−ｄＮＴＰに
用いる。ｄＴＴＰと互換性のあるフルオレッセイン−１
２−ｄＵＴＰ（もしくはローダミン−４−ｄＵＴＰ）を
一部用いたところ伸張反応が起こった。この場合、未反
応の蛍光ラベルｄＮＴＰを洗浄により除くために交雑し
ている核酸は管壁等に固定化しておく必要がある。ここ
では、代替操作として磁気ビーズに固定化して洗浄を行
った。
ｄＮＴＰの定量を行った。ＤＮＡポリメラーゼによる伸
張反応でｄＮＴＰをＤＮＡに取り込ませるときに一部も
しくは全部のｄＮＴＰの代わりに蛍光色素−ｄＮＴＰに
用いる。ｄＴＴＰと互換性のあるフルオレッセイン−１
２−ｄＵＴＰ（もしくはローダミン−４−ｄＵＴＰ）を
一部用いたところ伸張反応が起こった。この場合、未反
応の蛍光ラベルｄＮＴＰを洗浄により除くために交雑し
ている核酸は管壁等に固定化しておく必要がある。ここ
では、代替操作として磁気ビーズに固定化して洗浄を行
った。
【００８０】（材料と方法） 試薬 ストレプトアビジン固定化磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａ
ｄｓ Ｍ−２８０） ３´末端がビオチン化された２２４塩基長１本鎖ＤＮＡ
（プラスドミドのマルチクローニングサイト） リバースプライマー ＫＳプライマー ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑTMＤＮＡ ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ） ｄＮＴＰ緩衝液（ｄＡＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＣＴＰ各２５
μＭ、ｄＴＴＰ８μＭ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴ
Ｐ（もしくはローダミン−４−ｄＵＴＰ）２μＭ、１０
ｍＭ−トリス・塩基（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ−Ｍｇ
Ｃｌ2 、５０ｍＭ−ＫＣｌ、０．０１％ゼラチン） 洗浄液（１０ｍＭ−トリス・塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍ
Ｍ−ＥＤＴＡ、１Ｍ−ＮａＣｌ） ８０％ホルムアミド水溶液 実験器具 磁石付き試験管ホルダー ＰＣＲ用恒温槽 蛍光分光光度計 実験操作 まず、２つの試験管（ａ，ｂ）を用意しておき、夫々に
以下のものを加えた。
ｄｓ Ｍ−２８０） ３´末端がビオチン化された２２４塩基長１本鎖ＤＮＡ
（プラスドミドのマルチクローニングサイト） リバースプライマー ＫＳプライマー ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑTMＤＮＡ ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ） ｄＮＴＰ緩衝液（ｄＡＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＣＴＰ各２５
μＭ、ｄＴＴＰ８μＭ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴ
Ｐ（もしくはローダミン−４−ｄＵＴＰ）２μＭ、１０
ｍＭ−トリス・塩基（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ−Ｍｇ
Ｃｌ2 、５０ｍＭ−ＫＣｌ、０．０１％ゼラチン） 洗浄液（１０ｍＭ−トリス・塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍ
Ｍ−ＥＤＴＡ、１Ｍ−ＮａＣｌ） ８０％ホルムアミド水溶液 実験器具 磁石付き試験管ホルダー ＰＣＲ用恒温槽 蛍光分光光度計 実験操作 まず、２つの試験管（ａ，ｂ）を用意しておき、夫々に
以下のものを加えた。
【００８１】ａ）ｄＮＴＰ緩衝液（５０μｌ）、１本鎖
ＤＮＡ（１ピコモル）、ＤＮＡポリメラーゼ（１ユニッ
ト）、リバースプライマー（２ピコモル） ｂ）ｄＮＴＰ緩衝液（５０μｌ）、１本鎖ＤＮＡ（１ピ
コモル）、ＤＮＡポリメラーゼ（１ユニット）、ＫＳプ
ライマー（２ピコモル） 次に、夫々を９５℃（３０秒）、４１℃（３０秒）、７
２℃（５分）、の順序でインキュベートした。その後、
直ちに４℃に保った。
ＤＮＡ（１ピコモル）、ＤＮＡポリメラーゼ（１ユニッ
ト）、リバースプライマー（２ピコモル） ｂ）ｄＮＴＰ緩衝液（５０μｌ）、１本鎖ＤＮＡ（１ピ
コモル）、ＤＮＡポリメラーゼ（１ユニット）、ＫＳプ
ライマー（２ピコモル） 次に、夫々を９５℃（３０秒）、４１℃（３０秒）、７
２℃（５分）、の順序でインキュベートした。その後、
直ちに４℃に保った。
【００８２】しかる後、磁気ビーズ（５０μｌ）を加え
て撹拌し磁石付きホルダーにセットする。磁気ビーズに
接触しないようにしてピペットで上澄を捨て洗浄液で２
回、蒸留水で１回磁気ビーズを洗浄した。そして、磁気
ビーズを５００μｌの８０％ホルムアミド水溶液に懸濁
し９５℃で３分間インキュベートし、伸張した相補鎖を
溶出した。
て撹拌し磁石付きホルダーにセットする。磁気ビーズに
接触しないようにしてピペットで上澄を捨て洗浄液で２
回、蒸留水で１回磁気ビーズを洗浄した。そして、磁気
ビーズを５００μｌの８０％ホルムアミド水溶液に懸濁
し９５℃で３分間インキュベートし、伸張した相補鎖を
溶出した。
【００８３】次に、磁石付きのホルダーに再びセット
し、今度は伸張相補鎖を含んでいる上澄み液を分光光度
計のキュベットにとり、蛍光スペクトルを測る。励起光
はフルオレッセインの場合４８８ｎｍ、ローダミンの場
合５４０ｎｍを用いた。フルオレッセインおよびローダ
ミンを取り込んだＤＮＡの蛍光スペクトルを図９に示
す。また、夫々の蛍光色素を用いた伸張反応の長さの計
測には５２０ｎｍおよび５８０ｎｍにおける蛍光強度を
用いた。また、これらの蛍光強度（発光量）を測定した
結果、フルオレッセインの蛍光色素を用いた場合には、
リバースプライマーの入っている試験管（ａ）では３．
３５（ａ．ｕ．）の蛍光強度が観測され、ＫＳプライマ
ーの入っている試験管（ｂ）では１．７１（ａ．ｕ．）
の蛍光強度が観測された。また、ローダミンの蛍光色素
を用いた場合には、リバースプライマーの入っている試
験管（ａ）では１０．１０（ａ．ｕ．）の蛍光強度が観
測され、ＫＳプライマーの入っている試験管（ｂ）では
５．２６（ａ．ｕ．）の蛍光強度が観測された。
し、今度は伸張相補鎖を含んでいる上澄み液を分光光度
計のキュベットにとり、蛍光スペクトルを測る。励起光
はフルオレッセインの場合４８８ｎｍ、ローダミンの場
合５４０ｎｍを用いた。フルオレッセインおよびローダ
ミンを取り込んだＤＮＡの蛍光スペクトルを図９に示
す。また、夫々の蛍光色素を用いた伸張反応の長さの計
測には５２０ｎｍおよび５８０ｎｍにおける蛍光強度を
用いた。また、これらの蛍光強度（発光量）を測定した
結果、フルオレッセインの蛍光色素を用いた場合には、
リバースプライマーの入っている試験管（ａ）では３．
３５（ａ．ｕ．）の蛍光強度が観測され、ＫＳプライマ
ーの入っている試験管（ｂ）では１．７１（ａ．ｕ．）
の蛍光強度が観測された。また、ローダミンの蛍光色素
を用いた場合には、リバースプライマーの入っている試
験管（ａ）では１０．１０（ａ．ｕ．）の蛍光強度が観
測され、ＫＳプライマーの入っている試験管（ｂ）では
５．２６（ａ．ｕ．）の蛍光強度が観測された。
【００８４】２つの伸張反応の蛍光強度比はいずれも
１．９程度となった。実際に伸張した長さ（塩基数）の
比は２０８／１２７＝１．６３であるが、取り込まれる
べき蛍光色素−ｄＵＴＰ（すなわちＴの位置）の数の比
を計算すると、１．９６となり、蛍光強度の実測値と非
常に近い値となっていることがわかる。
１．９程度となった。実際に伸張した長さ（塩基数）の
比は２０８／１２７＝１．６３であるが、取り込まれる
べき蛍光色素−ｄＵＴＰ（すなわちＴの位置）の数の比
を計算すると、１．９６となり、蛍光強度の実測値と非
常に近い値となっていることがわかる。
【００８５】すなわち、上記被検核酸とのハイブリダイ
ゼーションによりリバースおよびＫＳプライマーが伸張
する長さの比率は１種類の蛍光色素−ｄＮＴＰを用いた
時でもある程度蛍光強度から決定することが可能であ
り、プライマーと被検核酸との結合位置と結合したプラ
イマーの種類とが判明するので、これにより、一筆書き
のアルゴリズムを用いれば、第１実施例と同様に被検核
酸の塩基配列を決定することができた。また、計測精度
をさらに向上させることにより、プライマーの種類ばか
りでなくこれと鋳型の被検核酸との結合位置を精密に測
定することが可能であるので、結合位置が特定できない
ために決定できなかった一筆書きのオイラー道が２つ以
上ある核酸塩基の配列をも決定することが可能である。
ゼーションによりリバースおよびＫＳプライマーが伸張
する長さの比率は１種類の蛍光色素−ｄＮＴＰを用いた
時でもある程度蛍光強度から決定することが可能であ
り、プライマーと被検核酸との結合位置と結合したプラ
イマーの種類とが判明するので、これにより、一筆書き
のアルゴリズムを用いれば、第１実施例と同様に被検核
酸の塩基配列を決定することができた。また、計測精度
をさらに向上させることにより、プライマーの種類ばか
りでなくこれと鋳型の被検核酸との結合位置を精密に測
定することが可能であるので、結合位置が特定できない
ために決定できなかった一筆書きのオイラー道が２つ以
上ある核酸塩基の配列をも決定することが可能である。
【００８６】なお、本発明は、上記実施例に限定される
ものではない。すなわち、上記第１および第２実施例で
は、（ア´）遊離したピロリン酸の量を測定したり、
（イ´）蛍光ラベルからの発光を観測したりして伸張し
た長さを求めたが、この伸張した長さを求める方法とし
ては以下のようなものが挙げられる。
ものではない。すなわち、上記第１および第２実施例で
は、（ア´）遊離したピロリン酸の量を測定したり、
（イ´）蛍光ラベルからの発光を観測したりして伸張し
た長さを求めたが、この伸張した長さを求める方法とし
ては以下のようなものが挙げられる。
【００８７】（ア）伸張反応に伴い遊離してくる分解産
物の量を測定する。
物の量を測定する。
【００８８】（イ）伸張反応に伴い核酸中に取り込まれ
る塩基の量を測定する。
る塩基の量を測定する。
【００８９】（ウ）伸張反応後の被検核酸を原子レベル
の分解能を持つ電子顕微鏡やトンネル顕微鏡などで直接
２重鎖の部分長さを観測する。
の分解能を持つ電子顕微鏡やトンネル顕微鏡などで直接
２重鎖の部分長さを観測する。
【００９０】（エ）伸張反応の産物そのもの（相補鎖核
酸）を分離して現在実用化されている方法と同様にゲル
電気泳動にかけて長さを求めることも可能である。
酸）を分離して現在実用化されている方法と同様にゲル
電気泳動にかけて長さを求めることも可能である。
【００９１】また、上記第１および第２実施例ではマト
リックス状にプライマーを配置しやすいので、方形状の
キャピラリープレートＣＡを用いたが、これは円形のも
のを用いてもよい。
リックス状にプライマーを配置しやすいので、方形状の
キャピラリープレートＣＡを用いたが、これは円形のも
のを用いてもよい。
【００９２】
【発明の効果】以上の通り、本発明に係る核酸塩基配列
決定方法によれば、まず、第１の工程により、プライマ
ーと被検核酸とをハイブリダイゼーションさせてこれら
の複合体を形成し、次に、第２の工程により被検核酸を
鋳型としてプライマーの５´から３´方向への伸張反応
を行い、第３の工程によりプライマーの伸張量を検出す
る。これにより、短時間に複数の領域に配置されたそれ
ぞれのプライマーの伸張量すなわちプライマーと被検核
酸の結合位置と各領域内の結合したプライマーの種類を
知ることができるので、プライマーの塩基配列をいわゆ
る一筆書きのアルゴリズムを用いて解析すれば、被検核
酸の塩基配列を決定することが可能である。
決定方法によれば、まず、第１の工程により、プライマ
ーと被検核酸とをハイブリダイゼーションさせてこれら
の複合体を形成し、次に、第２の工程により被検核酸を
鋳型としてプライマーの５´から３´方向への伸張反応
を行い、第３の工程によりプライマーの伸張量を検出す
る。これにより、短時間に複数の領域に配置されたそれ
ぞれのプライマーの伸張量すなわちプライマーと被検核
酸の結合位置と各領域内の結合したプライマーの種類を
知ることができるので、プライマーの塩基配列をいわゆ
る一筆書きのアルゴリズムを用いて解析すれば、被検核
酸の塩基配列を決定することが可能である。
【００９３】さらに、計測精度をさらに向上させること
により、プライマーの種類ばかりでなくこれと鋳型の被
検核酸との結合位置を精密に測定することが可能である
ので、結合位置が特定できないために決定できなかった
一筆書きのオイラー道が２つ以上ある核酸塩基の配列を
も決定することが可能である。また、このような、複数
の領域はガラス製もしくはシリコン製の材料から構成さ
れるキャピラリープレートのコラムによって規定される
こととすれば、プライマー同士が混ざり合うことがな
い。
により、プライマーの種類ばかりでなくこれと鋳型の被
検核酸との結合位置を精密に測定することが可能である
ので、結合位置が特定できないために決定できなかった
一筆書きのオイラー道が２つ以上ある核酸塩基の配列を
も決定することが可能である。また、このような、複数
の領域はガラス製もしくはシリコン製の材料から構成さ
れるキャピラリープレートのコラムによって規定される
こととすれば、プライマー同士が混ざり合うことがな
い。
【００９４】このような伸張量の検出方法には、伸張反
応に伴って複数種類のヌクレオチドまたはヌクレオチド
類似体から遊離したピロリン酸に起因するＡＴＰのルシ
フェラーゼ反応に伴う発光量を検出することにより行う
こととしてもよいし、ヌクレオチド類似体として蛍光ラ
ベルしたデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）を加えて被検核酸を鋳型にしたプライマーの伸張反
応を行い、これからの発光量を検出することにより行う
こととしてもよい。これにより、発光量は伸張量に比例
するので、結合したプライマーの種類とプライマーと被
検核酸との結合位置を求めることができる。
応に伴って複数種類のヌクレオチドまたはヌクレオチド
類似体から遊離したピロリン酸に起因するＡＴＰのルシ
フェラーゼ反応に伴う発光量を検出することにより行う
こととしてもよいし、ヌクレオチド類似体として蛍光ラ
ベルしたデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）を加えて被検核酸を鋳型にしたプライマーの伸張反
応を行い、これからの発光量を検出することにより行う
こととしてもよい。これにより、発光量は伸張量に比例
するので、結合したプライマーの種類とプライマーと被
検核酸との結合位置を求めることができる。
【図１】本発明の実施例で用いるキャピラリープレート
の斜視図である。
の斜視図である。
【図２】図１のキャピラリープレート内でのプライマー
の配列を示す配列説明図である。
の配列を示す配列説明図である。
【図３】本発明の第１実施例の手順を説明する説明図で
ある。
ある。
【図４】第１実施例で用いた核酸塩基配列決定装置の斜
視構成図である。
視構成図である。
【図５】図１のキャピラリープレートにおける発光と被
検核酸の同定を説明するための説明図である。
検核酸の同定を説明するための説明図である。
【図６】長鎖の被検核酸の同定を説明するための説明図
である。
である。
【図７】本発明の第２実施例の手順を説明する説明図で
ある。
ある。
【図８】第２実施例で用いた核酸塩基配列決定装置の斜
視構成図である。
視構成図である。
【図９】第２実施例で測定した蛍光ラベルしたＤＮＡか
らの発光強度と波長の関係を示す図である。
らの発光強度と波長の関係を示す図である。
【図１０】従来のＳＢＨ法を説明するための説明図であ
る。
る。
ＣＡ…キャピラリープレート、ＤＢ，ＤＢ１…暗箱、１
０…ＣＣＤカメラ、２０…顕微鏡、３０…画像処理装
置、４０…コンピュータ、５０…励起光透過フィルタ、
６０…蛍光透過フィルタ、７０…励起光源、７０１…超
高圧水銀ランプ。
０…ＣＣＤカメラ、２０…顕微鏡、３０…画像処理装
置、４０…コンピュータ、５０…励起光透過フィルタ、
６０…蛍光透過フィルタ、７０…励起光源、７０１…超
高圧水銀ランプ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ
Claims (4)
- 【請求項１】 一重鎖の被検核酸の塩基配列決定方法に
おいて、複数の領域に種類ごとに分離して配置されたプ
ライマー（オリゴヌクレオチド）と一重鎖の被検核酸と
をハイブリダイゼーションさせて鋳型・プライマーの二
重鎖部分を有する複合体を形成する第１の工程と、 前記複数の領域に配置されたそれぞれの前記複合体に、
前記複合体の鋳型のヌクレオチドに相補的で塩基対合し
うる複数種類のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体
を実質的に同時に加えて、前記被検核酸を鋳型にしたプ
ライマーの５´から３´方向への伸張反応を行う第２の
工程と、 前記プライマーの伸張した量を検出する第３の工程と、
を含むことを特徴とする核酸塩基配列決定方法。 - 【請求項２】 前記複数の領域がガラス製もしくはシリ
コン製の材料から構成されるキャピラリープレートのコ
ラムによって規定される、ことを特徴とする請求項１に
記載の核酸塩基配列決定方法。 - 【請求項３】 前記第３の工程におけるプライマーの伸
張量を、前記第２の工程における伸張反応に伴って前記
複数種類のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体から
遊離したピロリン酸をＡＰＳと反応させてＡＴＰを生成
し、このＡＴＰのルシフェラーゼ反応に伴う発光量を検
出することにより行う、ことを特徴とする請求項１に記
載の核酸塩基配列決定方法。 - 【請求項４】 前記第２の工程において複数種類のヌク
レオチド類似体として蛍光ラベルしたデオキシリボヌク
レオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を加えて被検核酸を鋳型
にしたプライマーの伸張反応を行い、 前記第３の工程におけるプライマーの伸張量を、前記複
数の領域に励起光を照射して、伸張したプライマーの蛍
光ラベルからの発光量を検出することにより行う、こと
を特徴とする請求項１に記載の核酸塩基配列決定方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6006971A JPH07203998A (ja) | 1994-01-26 | 1994-01-26 | 核酸塩基配列決定方法 |
| EP95300468A EP0665293A3 (en) | 1994-01-26 | 1995-01-26 | Method of determining base sequence of nucleic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6006971A JPH07203998A (ja) | 1994-01-26 | 1994-01-26 | 核酸塩基配列決定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07203998A true JPH07203998A (ja) | 1995-08-08 |
Family
ID=11653094
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6006971A Pending JPH07203998A (ja) | 1994-01-26 | 1994-01-26 | 核酸塩基配列決定方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0665293A3 (ja) |
| JP (1) | JPH07203998A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10337173A (ja) * | 1997-06-05 | 1998-12-22 | Rikagaku Kenkyusho | 生化学反応用マイクロリアクタ |
| KR20010097731A (ko) * | 2000-04-25 | 2001-11-08 | 김희태 | 다양한 종류의 특이 핵산 시발자( 이하 프라이머 )를피씨알 튜브안에 함께 부착하여 핵산 중합 반응( 이하피씨알 )을 함께 수행하여 준 뒤 여기에 표지자가 부착된탐침자( 이하 프로브 )를 핵산 결합 반응을 시켜주어유전정보를 알 수 있게 하는 실험기법. |
| US6376184B1 (en) | 2000-01-13 | 2002-04-23 | Hamamatsu Photonics K.K. | Method for gene analysis |
| US6841128B2 (en) | 2000-03-17 | 2005-01-11 | Hitachi, Ltd. | DNA base sequencing system |
| JP2008022823A (ja) * | 2006-07-25 | 2008-02-07 | Hitachi Ltd | Ｄｎａ塩基配列決定方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE269908T1 (de) * | 1997-04-01 | 2004-07-15 | Manteia S A | Methode zur sequenzierung von nukleinsäuren |
| AU6846698A (en) * | 1997-04-01 | 1998-10-22 | Glaxo Group Limited | Method of nucleic acid amplification |
| US6322968B1 (en) * | 1997-11-21 | 2001-11-27 | Orchid Biosciences, Inc. | De novo or “universal” sequencing array |
| US6787308B2 (en) | 1998-07-30 | 2004-09-07 | Solexa Ltd. | Arrayed biomolecules and their use in sequencing |
| CA2339121A1 (en) * | 1998-07-30 | 2000-02-10 | Shankar Balasubramanian | Arrayed biomolecules and their use in sequencing |
| DE69916421T2 (de) * | 1998-09-09 | 2005-03-24 | Hitachi Software Engineering Co., Ltd., Yokohama | Biochip und verfahren zur verwendung des biochips |
| AR021833A1 (es) * | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
| JP2003502058A (ja) * | 1999-06-11 | 2003-01-21 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド | ４８個のヒト分泌タンパク質 |
| ITCA20000004A1 (it) * | 2000-03-07 | 2001-09-07 | Mario Raimondo Caria | Metodo e sistema per la rivelazione simultanea e multipla con quantificazione della ibridizzazione di composti molecolari quali acidi nuclei |
| EP1354064A2 (en) | 2000-12-01 | 2003-10-22 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity |
| AR031640A1 (es) | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
| AU2003221406A1 (en) | 2002-03-19 | 2003-09-29 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Method of detecting inorganic phosphoric acid, pyrophosphoric acid and nucleic acid and method of typing snp sequence of dna |
| WO2004046709A1 (de) * | 2002-11-20 | 2004-06-03 | Richard Fritz Sauter | Analyseverfahren für moleküle, zur sequenzierung von molekülen und spektrometer hierfür |
| GB0514910D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
| GB0514935D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods for sequencing a polynucleotide template |
| GB0522310D0 (en) | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Solexa Ltd | Methods of preparing libraries of template polynucleotides |
| GB0524069D0 (en) | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Solexa Ltd | Preparation of templates for solid phase amplification |
| CA2641851A1 (en) | 2006-02-08 | 2007-08-16 | Eric Hans Vermaas | Method for sequencing a polynucleotide template |
| US7754429B2 (en) | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
| WO2008093098A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-07 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
| US8728764B2 (en) | 2008-10-02 | 2014-05-20 | Illumina Cambridge Limited | Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications |
| EP2470669B1 (en) | 2009-08-25 | 2014-06-18 | Illumina, Inc. | Methods for selecting and amplifying polynucleotides |
| US8182994B2 (en) | 2009-09-15 | 2012-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing |
| CN114350773A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-04-15 | 深圳太古语科技有限公司 | 一种基于固相载体的dna分子信号扩增及核酸测序的方法 |
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| US4734363A (en) * | 1984-11-27 | 1988-03-29 | Molecular Diagnostics, Inc. | Large scale production of DNA probes |
| GB9210168D0 (en) * | 1992-05-12 | 1992-06-24 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing dna |
| US5795714A (en) * | 1992-11-06 | 1998-08-18 | Trustees Of Boston University | Method for replicating an array of nucleic acid probes |
| SE501439C2 (sv) * | 1993-06-22 | 1995-02-13 | Pharmacia Lkb Biotech | Sätt och anordning för analys av polynukleotidsekvenser |
-
1994
- 1994-01-26 JP JP6006971A patent/JPH07203998A/ja active Pending
-
1995
- 1995-01-26 EP EP95300468A patent/EP0665293A3/en not_active Withdrawn
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| JPH10337173A (ja) * | 1997-06-05 | 1998-12-22 | Rikagaku Kenkyusho | 生化学反応用マイクロリアクタ |
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| KR20010097731A (ko) * | 2000-04-25 | 2001-11-08 | 김희태 | 다양한 종류의 특이 핵산 시발자( 이하 프라이머 )를피씨알 튜브안에 함께 부착하여 핵산 중합 반응( 이하피씨알 )을 함께 수행하여 준 뒤 여기에 표지자가 부착된탐침자( 이하 프로브 )를 핵산 결합 반응을 시켜주어유전정보를 알 수 있게 하는 실험기법. |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0665293A3 (en) | 1998-06-03 |
| EP0665293A2 (en) | 1995-08-02 |
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