JP3436444B2 - Measurement method and kit for oxidized HDL - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術】本発明は、酸化された高密度リポ
タンパク質（ＨＤＬ）の免疫学的測定方法及びそれに使
用するキットに関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for immunologically measuring oxidized high density lipoprotein (HDL) and a kit used therefor.

【０００２】[0002]

【従来の技術】血漿リポタンパク質は、脂質にアポリポ
タンパク質が結合して親水性複合体を形成し、疎水性で
ある脂質を組織末梢にまで輸送する重要な働きをしてい
る。リポタンパク質は、超遠心分離法あるいは電気泳動
法により水和密度や分子量の違いによってカイロミクロ
ン（０．９５０ｇ／ｍｌ以下）、超低密度リポタンパク
質（ＶＬＤＬ）（０．９５０〜１．００６ｇ／ｍｌ）、
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（１．００６〜１．０
６３ｇ／ｍｌ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）
（１．０６３〜１．２１０ｇ／ｍｌ）に分類されてい
る。2. Description of the Related Art Plasma lipoprotein plays an important role in transporting lipid, which is hydrophobic, to the periphery of tissue by forming a hydrophilic complex by binding apolipoprotein to lipid. Lipoproteins are chylomicrons (0.950 g / ml or less) and ultra-low density lipoproteins (VLDL) (0.950-1.006 g / ml) depending on the difference in hydration density and molecular weight by ultracentrifugation or electrophoresis. ),
Low density lipoprotein (LDL) (1.006 to 1.0
63 g / ml), high density lipoprotein (HDL)
(1.063 to 1.210 g / ml).

【０００３】食事由来の脂質は、小腸から吸収されてカ
イロミクロンとなり、カイロミクロンレムナントをへて
肝臓に取り込まれるが、ＶＬＤＬとして一旦肝臓から血
中に放出され、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）を経
てＬＤＬとなる。ＬＤＬは、リン脂質、コレステロール
および中性脂肪を成分とする中心核に主としてアポリポ
タンパク質Ｂ１００が結合した構造をなし、血中コレス
テロールの末梢への主たる運搬を担っているが、粥状動
脈硬化巣に蓄積する主たるコレステロールはＬＤＬ由来
と考えられることから悪玉コレステロールとも言われて
いる。一方、ＨＤＬは、肝臓、小腸などでアポリポタン
パク質Ａ１が遊離型コレステロールを取り込み原始型Ｈ
ＤＬとなり、血流に乗って末梢へ循環する間にＬＣＡＴ
酵素によって更にコレステロールを取り込んで成熟型Ｈ
ＤＬとなる。このため、末梢からコレステロールを運び
出す役割をなし、善玉コレステロールとも言われてい
る。Dietary lipids are absorbed from the small intestine to become chylomicron, and are taken up by the chylomicron remnant into the liver. However, they are once released from the liver as VLDL into the blood and then passed through intermediate density lipoprotein (IDL). It becomes LDL. LDL has a structure in which apolipoprotein B100 is mainly bound to a central nucleus composed of phospholipids, cholesterol and neutral fat, and is mainly responsible for transporting blood cholesterol to the periphery. The major cholesterol that accumulates is considered to be derived from LDL, so it is also called bad cholesterol. On the other hand, in HDL, apolipoprotein A1 takes up free cholesterol in the liver, small intestine, etc.
It becomes DL and LCAT rides on the bloodstream and circulates to the periphery.
Cholesterol is further taken up by the enzyme and mature H
It becomes DL. Therefore, it plays a role of transporting cholesterol from the periphery and is also called good cholesterol.

【０００４】また近年の研究では、生体内において変性
し、酸化体となったＬＤＬが動脈硬化症の発症要因とな
っていることが報告されている。すなわち、ＬＤＬは通
常肝臓を中心としてＬＤＬレセプターを介して再吸収さ
れて処理されるが、初期の動脈硬化段階においては、血
管内膜に遊走しているマクロファージがスカベンンジャ
ーレセプターを介して酸化ＬＤＬを特異的に取り込んで
泡沫化し、その結果、血管内膜に粥状硬化巣が形成され
ると報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci.USA,78,6
499-6503(1981)、N. Eng. J. Med.,320,915-924(198
9)、Am. J. Pathol.,135,815-825(1989)）。一方、ＨＤ
Ｌの酸化現象も確認され、ＬＤＬ酸化に先立ってＨＤＬ
酸化が進行し、生体にとって有害なフリーラジカルによ
る酸化をＨＤＬの段階で食い止める働きをＨＤＬ自身が
行なっており、ある程度以上にＨＤＬの酸化が進行する
とＬＤＬの酸化がスタートし、この酸化ＬＤＬが動脈硬
化の原因になっているのではないかと推論されている
（Proc. Natl. Acad. Sci.USA,88,6457-6461(1991)）。Further, in recent studies, it has been reported that LDL, which has been denatured in vivo to become an oxidant, is a cause of arteriosclerosis. That is, LDL is normally reabsorbed through the LDL receptor mainly in the liver and processed, but in the early stage of arteriosclerosis, macrophages migrating into the intima of the blood vessel oxidize LDL via the scavenger receptor. It has been reported that it is specifically taken up and foamed, resulting in the formation of atherosclerotic plaques in the intima (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,6).
499-6503 (1981), N. Eng. J. Med., 320, 915-924 (198
9), Am. J. Pathol., 135, 815-825 (1989)). On the other hand, HD
Oxidation phenomenon of L was also confirmed, and HDL was oxidized before LDL oxidation.
Oxidation progresses, and HDL itself acts to stop the oxidation of free radicals that are harmful to the living body at the HDL stage. When HDL oxidation progresses above a certain level, LDL oxidation starts, and this oxidized LDL is arteriosclerosis. It is inferred that it may be the cause (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 6457-6461 (1991)).

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】このように動脈硬化の
機序と酸化リポタンパク質との間には密接な関係がある
と考えられ、酸化リポタンパク質、特に酸化ＨＤＬを特
異的に測定することができれば、動脈硬化のメカニズム
の解析あるいは臨床診断に役立つものと考えられる。従
来、酸化リポタンパク質の免疫学的測定法としては、酸
化リポタンパク質をβ2ーグリコプロテインＩとの複合体
として測定する方法（ＰＣＴ／ＪＰ９４／０１５９４
号）、酸化ＬＤＬに対する抗体を用いた測定法（Clinic
a. Chimica. Acta.,218,97-103(1993)）などが報告され
ている。Thus, it is considered that there is a close relationship between the mechanism of arteriosclerosis and oxidized lipoprotein, and it is possible to specifically measure oxidized lipoprotein, particularly oxidized HDL. If possible, it would be useful for analysis of the mechanism of arteriosclerosis or clinical diagnosis. Conventionally, as an immunological assay for oxidized lipoprotein, a method of assaying oxidized lipoprotein as a complex with β 2 -glycoprotein I (PCT / JP94 / 01594
No.), a measurement method using an antibody against oxidized LDL (Clinic
Chimica. Acta., 218, 97-103 (1993)) and the like have been reported.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、より簡便
で感度のよい酸化ＨＤＬの測定法を開発すべく鋭意研究
を重ねた結果、ＨＤＬの構成成分に着目し、銅を用いて
酸化した酸化リポタンパク質を抗原として使用し、これ
を免疫して得られる酸化脂質に対する抗体とアポリポタ
ンパク質Ａ１に対する抗体の２種類の抗体を使用するこ
とにより、試料中酸化ＨＤＬを感度よく測定できること
を見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明
は、試料中に存在する酸化されたＨＤＬをサンドイッチ
法により測定するための方法であって、銅を用いて酸化
した酸化リポタンパク質を抗原として使用し、これを免
疫して得られる酸化された脂質に対する抗体とアポリポ
タンパク質Ａ１に対する抗体の２種類の抗体を使用する
ことを特徴とする酸化ＨＤＬの測定法に関するものであ
る。また、本発明は、試料中に存在する酸化されたＨＤ
Ｌをサンドイッチ法により測定するためのキットであっ
て、銅を用いて酸化した酸化リポタンパク質を抗原とし
て使用し、これを免疫して得られる酸化された脂質に対
する抗体とアポリポタンパク質Ａ１に対する抗体の２種
類の抗体を使用することを特徴とする酸化ＨＤＬの測定
用キットに関するものである。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to develop a simpler and more sensitive method for measuring oxidized HDL, the present inventors have paid attention to the constituent components of HDL and oxidized using copper. It was found that the oxidized HDL in the sample can be measured with high sensitivity by using the above-mentioned oxidized lipoprotein as an antigen and using two kinds of antibodies, an antibody against an oxidized lipid and an antibody against apolipoprotein A1 obtained by immunizing the same. The present invention has been completed. That is, the present invention is a method for measuring oxidized HDL present in a sample by a sandwich method, which is obtained by immunizing an oxidized lipoprotein oxidized with copper as an antigen. The present invention relates to a method for measuring oxidized HDL, which comprises using two kinds of antibodies, an antibody against oxidized lipid and an antibody against apolipoprotein A1. The present invention is also directed to the presence of oxidized HD present in the sample.
A kit for measuring L by the sandwich method, which comprises an antibody against oxidized lipid and an antibody against apolipoprotein A1 obtained by immunizing with oxidized lipoprotein oxidized with copper as an antigen. The present invention relates to a kit for measuring oxidized HDL, which is characterized by using different types of antibodies.

【０００７】[0007]

【発明の実施の形態】本発明で使用する試料は、酸化Ｈ
ＤＬを含有するものであれば特に限定されず、具体的に
は血液自体または血清、血漿などの血液画分を試料とし
て使用することができる。本発明の測定法は、硫酸銅な
ど銅を用いて酸化した酸化リポタンパク質を抗原として
使用し、これを免疫して得られる酸化された脂質に対す
る抗体とアポリポタンパク質Ａ１に対する抗体の２種類
の抗体を使用することを特徴とするものである。ここ
で、酸化された脂質に対する抗体とは、ＨＤＬを構成す
る脂質の酸化部位を認識し、これと結合できる抗体を意
味する。このような抗体の具体例としては、後述の実施
例で使用されているような、リゾフォスファチジルコリ
ンなどのＨＤＬを構成するリン脂質の酸化部位を認識
し、これに結合する抗体を例示することができる。ま
た、アポリポタンパク質Ａ１に対する抗体とは、ＨＤＬ
を構成するアポリポタンパク質Ａ１を認識し、これと結
合できる抗体を意味する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The sample used in the present invention is oxidized H 2
There is no particular limitation as long as it contains DL, and specifically, blood itself or a blood fraction such as serum or plasma can be used as a sample. The measuring method of the present invention is copper sulfate.
Oxidized lipoprotein that is oxidized with copper
The present invention is characterized by using two types of antibodies, an antibody against oxidized lipids obtained by immunizing the same and an antibody against apolipoprotein A1 . Here, the antibody against the oxidized lipid means an antibody capable of recognizing the oxidation site of the lipid constituting HDL and binding to this. As a specific example of such an antibody, an antibody that recognizes and binds to the oxidation site of phospholipids constituting HDL such as lysophosphatidylcholine as used in Examples described later is exemplified. be able to. Further, an antibody against apolipoprotein A1 means HDL
Means an antibody capable of recognizing and binding to apolipoprotein A1 which constitutes

【０００８】このような抗体（ポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体）は、いずれも常法により作製す
ることができる。たとえば、酸化された脂質に対する抗
体は、硫酸銅などの銅を用いて酸化したして得た酸化Ｈ
ＤＬ、酸化ＬＤＬなどの酸化型のリポタンパク質を抗原
とし、該抗原を用いて常法により抗体を調製し、得られ
た抗体の中からリポタンパク質やアポリポタンパク質と
は結合せず、酸化型のリポタンパク質とのみ特異的に結
合する抗体を選出すればよい。また、アポリポタンパク
質Ａ１に対する抗体も血清中から単離精製された抗原や
組換えＤＮＡ手法により調製された抗原を用いて常法に
より抗体を調製することができる。さらに、既に市販さ
れている抗体もあり、この場合にはこの市販品を利用す
ることもできる。使用する上記各抗体の種類は、ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの活性フラ
グメント〔Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’など〕など特に制
限されない。Any such antibody (polyclonal antibody or monoclonal antibody) can be prepared by a conventional method. For example, an antibody against an oxidized lipid is an oxidized H obtained by oxidizing with copper such as copper sulfate.
Oxidized lipoproteins such as DL and oxidized LDL are used as antigens, and antibodies are prepared by a conventional method using the antigens. The obtained antibodies do not bind to lipoproteins or apolipoproteins and oxidized lipoproteins are used. An antibody that specifically binds only to the protein may be selected. Further, an antibody against apolipoprotein A1 can also be prepared by a conventional method using an antigen isolated and purified from serum or an antigen prepared by a recombinant DNA technique. Furthermore, there are already commercially available antibodies, and in this case, this commercially available product can also be used. The type of each of the above-mentioned antibodies to be used is not particularly limited, including polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, active fragments thereof [F (ab ′) 2, Fab ′, etc.].

【０００９】本発明は、上述のような抗体を使用し、サ
ンドイッチ法により試料中の酸化ＨＤＬを測定しようと
するものである。サンドイッチ法自体は、従来行われて
いる方法、手順など何等変わるものではない。すなわ
ち、上記いずれか一方の抗体を担体に結合した固相試薬
と他方の抗体を標識剤でラベルした標識試薬を用いて行
うのが一般的である。The present invention is intended to measure oxidized HDL in a sample by the sandwich method using the above-mentioned antibody. The sandwich method itself does not change at all in conventional methods and procedures. That is, it is general to use a solid phase reagent in which one of the above antibodies is bound to a carrier and a labeling reagent in which the other antibody is labeled with a labeling agent.

【００１０】固相試薬を調製する際に使用する担体とし
ては、通常使用されているもの、たとえば、ポリ塩化ビ
ニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重
合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、
ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアク
リロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタクリ
レートなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導
体（セファデックスなど）、アガロースゲル（セファロ
ース、バイオゲルなど）、セルロース（ペーパーディス
ク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シ
リコーンなどの無機高分子化合物を例示することがで
き、これらはアミノ基、カルボキシル基、カルボニル
基、水酸基、スルヒドリル基などの官能基が導入された
ものであってもよい。As the carrier used for preparing the solid phase reagent, those which are usually used, for example, polyvinyl chloride, polystyrene, styrene-divinylbenzene copolymer, styrene-maleic anhydride copolymer, nylon are used. ,
Synthetic organic polymer compounds such as polyvinyl alcohol, polyacrylamide, polyacrylonitrile, polypropylene, polymethylene methacrylate, dextran derivatives (Sephadex, etc.), agarose gel (Sepharose, biogel, etc.), cellulose (paper disc, filter paper, etc.) Examples thereof include inorganic polymer compounds such as saccharides, glass, silica gel, and silicone, and these may have functional groups such as amino groups, carboxyl groups, carbonyl groups, hydroxyl groups, and sulfhydryl groups introduced therein.

【００１１】担体の形状は、平板状（マイクロタイター
プレート、ディスクなど）、粒子状（ビーズなど）、管
状（試験管など）、繊維状、膜状、微粒子状（ラテック
ス粒子など）、カプセル状、小胞体状などいずれの形状
であってもよく、測定法に応じて好適な形状の担体を適
宜選択すればよい。担体と抗体の結合は、物理的吸着
法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法
〔たとえば、「固定化酵素」（千畑一郎編、昭和５０年
３月２０日、（株）講談社発行）参照〕を採用すること
ができ、とりわけ、物理的吸着法は簡便である点で好ま
しい。また、上記結合は直接行ってもよく、両物質の間
に他の物質を介して行ってもよい。このようにして得ら
れた固相試薬は、非特異的結合を抑制するため、ゼラチ
ン、ＢＳＡなどの通常のブロッキング剤を用いてブロッ
キング処理を施してもよい。The shape of the carrier is flat (microtiter plate, disk, etc.), particulate (beads, etc.), tubular (test tube, etc.), fibrous, film-like, fine particle (latex particle, etc.), capsule-like, It may have any shape such as an endoplasmic reticulum, and a carrier having a suitable shape may be appropriately selected according to the measuring method. The carrier and the antibody are bound by a known method such as a physical adsorption method, an ionic binding method, a covalent binding method, or an encapsulation method [eg, "immobilized enzyme" (edited by Ichiro Chibata, March 20, 1975, Co., Ltd.). (Published by Kodansha Co., Ltd.)], and the physical adsorption method is particularly preferable because it is simple. Further, the above-mentioned binding may be carried out directly, or may be carried out between the two substances via another substance. The solid phase reagent thus obtained may be subjected to a blocking treatment using a usual blocking agent such as gelatin or BSA in order to suppress non-specific binding.

【００１２】一方、標識剤としては、放射性同位体（た
とえば³²Ｐ、³Ｈ、¹⁴Ｃ、¹²⁵Ｉなど）、酵素（たとえば
β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシ
ダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダ
ーゼなど）、補酵素・補欠分子族（たとえば、ＦＡＤ、
ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘムなど）、フルオレセイ
ン誘導体（たとえば、フルオレセインイソチオシアネー
ト、フルオレセインチオフルバミルなど）、ローダミン
誘導体（たとえば、テトラメチルローダミンＢイソチオ
シアネートなど）、ウンベリフェロンおよび１−アニリ
ノ−８−ナフタレンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノ
−ル誘導体〔たとえば、ルミノール、イソルミノール、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノー
ルなど〕などを例示することができる。抗体と標識剤と
の結合は、成書〔たとえば、「続生化学実験講座５免疫
生化学研究法」（株）東京化学同人、（１９８６年発
行）第１０２〜１１２頁〕に記載されているような公知
の方法から適宜選択して実施すればよい。On the other hand, as the labeling agent, radioactive isotopes (eg ³² P, ³ H, ¹⁴ C, ¹²⁵ I etc.), enzymes (eg β-galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, catalase). , Glucose oxidase, lactate oxidase, alcohol oxidase, monoamine oxidase, etc., coenzyme / prosthetic group (eg, FAD,
FMN, ATP, biotin, heme, etc.), fluorescein derivatives (eg, fluorescein isothiocyanate, fluorescein octulvamil, etc.), rhodamine derivatives (eg, tetramethylrhodamine B isothiocyanate, etc.), umbelliferone and 1-anilino-8-. Fluorescent dyes such as naphthalene sulfonic acid, luminol derivatives [for example, luminol, isoluminol,
N- (6-aminohexyl) -N-ethylisoluminol and the like] and the like. The binding between the antibody and the labeling agent is described in a publication [eg, "Seikagaku Kagaku Kenkyu Kozai 5 Immunobiochemical Research Method", Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd., (1986), pages 102-112). It may be performed by appropriately selecting from such known methods.

【００１３】このような固相試薬と抗体試薬を用いての
測定手順は、通常のサンドイッチ法の手順をそのまま採
用すればよい。すなわち、固相試薬と被検サンプルを反
応させ、必要によりＢＦ分離後、さらに抗体試薬を反応
させる（ツーステップ法）か、固相試薬、被検サンプル
及び抗体試薬を同時に反応させ（ワンステップ法）、以
後のそれ自体公知の方法によりサンプル中の酸化ＨＤＬ
を検出または定量することができる。As a measurement procedure using such a solid phase reagent and an antibody reagent, an ordinary sandwich method procedure may be adopted as it is. That is, the solid phase reagent and the test sample are reacted, and if necessary, after BF separation, the antibody reagent is further reacted (two-step method), or the solid phase reagent, the test sample, and the antibody reagent are simultaneously reacted (one-step method). ), And the oxidized HDL in the sample by a method known per se thereafter.
Can be detected or quantified.

【００１４】なお、サンドイッチ法の詳細に付いては、
たとえば以下の文献を参照すればよい。 入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講談
社、昭和５４年５月１日発行） 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）
医学書院、１９８２年１２月１５日発行） 臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のため
のイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、
１９８３年発行） 「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、
１９８６年１０月９日発行）Regarding the details of the sandwich method,
For example, refer to the following documents. Hiroshi Irie "Radioimmunoassay" (Kodansha Co., Ltd., published May 1, 1979) Eiji Ishikawa et al. "Enzyme Immunoassay" (2nd edition) (Co., Ltd.)
Medical Institute, December 15, 1982) Clinical pathology Extra edition special issue No. 53 "immunoassay for clinical examination-technology and application-" (Clinical Pathology Press,
Published in 1983) "Biotechnology Encyclopedia" (CMC, Inc.)
(Published October 9, 1986)

【００１５】「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Im
munochemical techniques (Part A)） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemical
techniques (Part B)） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemical
techniques (Part C)） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemical
techniques (Part D:Selected Immunoassay)） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemical
techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and Gene
ral Immunoassay Methods)） ［〜はアカデミックプレス社発行］"Methods in ENZYMOLOGY Vol.70" (Im
munochemical techniques (Part A)) "Methods in ENZYMOLOGY Vol.73" (Immunochemical
techniques (Part B)) "Methods in ENZYMOLOGY Vol.74" (Immunochemical
techniques (Part C)) "Methods in ENZYMOLOGY Vol.84" (Immunochemical
techniques (Part D: Selected Immunoassay)) "Methods in ENZYMOLOGY Vol.92" (Immunochemical
techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and Gene
ral Immunoassay Methods)) [is published by Academic Press Co.]

【００１６】本発明のキットは、上述の測定法を実施す
るためのものであり、たとえば、下記の試薬から構成さ
れる。なお、抗酸化脂質抗体とは、銅を用いて酸化した
酸化リポタンパク質を抗原として使用し、これを免疫し
て得られる酸化された脂質に対する抗体を指す。 固相化抗酸化脂質抗体 標識化抗アポリポタンパク質Ａ１抗体 このキットにおいて、固相化抗体と標識化抗体を入れ替
えててもかまわない。また、標識化抗体の代わりに標識
化抗イムノグロブリン抗体を使用してもよく、その場合
には次の試薬から構成される。 固相化抗酸化脂質抗体 抗アポリポタンパク質Ａ１抗体 標識化抗イムノグロブリン抗体 上記各試薬のほかに、必要により、発色試薬、反応停止
用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬などの各
試薬から測定法に応じた適当な試薬を適宜選択し、本発
明のキットに添付すればよい。The kit of the present invention is for carrying out the above-mentioned assay method, and comprises, for example, the following reagents. The antioxidant lipid antibody was oxidized with copper.
Immunize with oxidized lipoprotein as an antigen
The antibody thus obtained is directed to an oxidized lipid. Solid-phased antioxidant lipid antibody-labeled anti-apolipoprotein A1 antibody In this kit, the solid-phased antibody and the labeled antibody may be replaced with each other. Further, a labeled anti-immunoglobulin antibody may be used instead of the labeled antibody, and in that case, it is composed of the following reagents. Solid-phase anti-oxidizing lipid antibody Anti-apolipoprotein A1 antibody-labeled anti-immunoglobulin antibody In addition to the above reagents, if necessary, from color reagents, reaction stopping reagents, standard antigen reagents, sample pretreatment reagents, etc. A suitable reagent according to the assay method may be appropriately selected and attached to the kit of the present invention.

【００１７】[0017]

【発明の効果】本発明により簡便で実用的な酸化ＨＤＬ
の測定法及びキットを初めて提供することが可能となっ
た。また、試料中に存在する酸化された高密度リポタン
パク質（ＨＤＬ）を測定し、測定した値を基に動脈硬化
症に起因する循環器系疾患（狭心症、心筋梗塞または狭
心症・心筋梗塞併発症）を検出することが可能である。 EFFECT OF THE INVENTION Oxidized HDL which is simple and practical according to the present invention
For the first time, it has become possible to provide the assay method and kit. Also, the oxidized high density lipotan present in the sample
Measurement of protein (HDL) and arteriosclerosis based on the measured value
Cardiovascular disease (angina, myocardial infarction or narrowing)
It is possible to detect heart disease and myocardial infarction.

【００１８】[0018]

【実施例】以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明
するが、本発明はこれらによって何等限定されるもので
はない。 実施例 ＜方法＞ （１）酸化ＬＤＬの調製 ヒトＬＤＬ（Organon Teknika Corp., Durham,NC）６０
０μｇを、硫酸銅５μＭを含むリン酸緩衝液２ｍｌに添
加し、３７℃、２４時間反応させて酸化ＬＤＬを得た。EXAMPLES The present invention will now be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto. Examples <Method> (1) Preparation of oxidized LDL Human LDL (Organon Teknika Corp., Durham, NC) 60
0 μg was added to 2 ml of a phosphate buffer containing 5 μM of copper sulfate and reacted at 37 ° C. for 24 hours to obtain oxidized LDL.

【００１９】（２）抗酸化リポタンパク質抗体の作製 常法に従い、酸化ＬＤＬを免疫したＢＡＬＢ／Ｃマウス
の脾細胞とミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１を細胞融合して得ら
れたハイブリドーマからリポタンパク質（ＬＤＬ，ＨＤ
Ｌ）やアポリポタンパク質（アポＡ１、アポＢ１００）
とは結合せず、酸化型のリポタンパク質とのみ結合する
抗体を産生するクローンを選出し、モノクロナール抗体
を得た。このような抗体のうち、今回はモノクロナール
抗体９Ｆ５−３ａを用いた。(2) Preparation of Antioxidant Lipoprotein Antibody Lipoproteins (LDL, HD) were prepared from hybridomas obtained by cell fusion of splenocytes of BALB / C mice immunized with oxidized LDL and myeloma cells P3U1 according to a conventional method.
L) and apolipoprotein (Apo A1, Apo B100)
Monoclonal antibodies were obtained by selecting clones that produce antibodies that do not bind to, but that bind only to oxidized lipoprotein. Of these antibodies, the monoclonal antibody 9F5-3a was used this time.

【００２０】（３）抗体の固相化とブロッキング モノクロナール抗酸化リポタンパク質抗体液（９Ｆ５−
３ａ １．３μｇ／ｍｌ：０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ₃−
Ｎａ₂ＣＯ₃緩衝液、ｐＨ９．５）を９６穴マイクロプレ
ート（Nunc Immunoplate I）に１００μｌ毎分注し、４
℃、１晩反応させた。抗体液を吸引除去し、０．０５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むリン酸緩衝液で洗浄
し、ブロックエース（大日本製薬）２００μｌをウエル
に分注し、３７℃、１．５時間反応させてブロッキング
を行い、反応後ブロッキング液を吸引除去し、０．０５
％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むリン酸緩衝液で洗
浄後、乾燥した。(3) Immobilization and blocking of antibody Monoclonal antioxidative lipoprotein antibody solution (9F5-
3a 1.3 μg / ml: 0.05 M NaHCO ₃ −
100 μl of Na ₂ CO ₃ buffer solution (pH 9.5) was added to a 96-well microplate (Nunc Immunoplate I) every minute, and 4
The reaction was carried out overnight at 0 ° C. Remove antibody solution by suction, 0.05%
After washing with a phosphate buffer containing Triton X-100, 200 μl of Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was dispensed into the wells, reacted at 37 ° C. for 1.5 hours to perform blocking, and the blocking solution was removed by suction after the reaction. And then 0.05
It was washed with a phosphate buffer containing Triton X-100 and then dried.

【００２１】（４）ＥＬＩＳＡ法 上記９６穴マイクロプレートの各ウエルに検体あるいは
標準濃度溶液を１００μｌ毎加え、３７℃、１．５時間
反応した。０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含
むリン酸緩衝液で洗浄した後、標識二次抗体として抗ａ
ｐｏＡ１抗体（コスモバイオ社製）西洋ワサビペルオキ
シダーゼ標識体を１００μｌ加え３７℃、１．５時間反
応した。反応後 ０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０を含むリン酸緩衝液で洗浄し、発色液（１．５％ＡＢ
ＴＳおよび３０％Ｈ₂Ｏ₂含有クエン酸緩衝液液、ｐＨ
４．０）を１００μｌ毎分注し発色し、４１５ｎｍによ
って吸光度を測定した。なお、血清検体はリン酸緩衝液
によって１０倍に希釈したものを使用した。また、標準
液としては調製した酸化ＨＤＬをタンパク量として０〜
１０００ｎｇ／ｍｌに調製して用いた。［ＡＢＴＳ：2,
2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazorine-6-sulfonic aci
d)diammonium salt］(4) ELISA method 100 μl of a sample or standard concentration solution was added to each well of the 96-well microplate and reacted at 37 ° C. for 1.5 hours. After washing with a phosphate buffer containing 0.05% Triton X-100, anti-a was added as a labeled secondary antibody.
100 μl of a horseradish peroxidase labeled product of poA1 antibody (manufactured by Cosmo Bio Inc.) was added and reacted at 37 ° C. for 1.5 hours. After reaction 0.05% Triton X-10
Was washed with a phosphate buffer containing 0, and a coloring solution (1.5% AB
Citrate buffer containing TS and 30% H ₂ O ₂ , pH
4.0) was poured every 100 μl to develop a color, and the absorbance was measured at 415 nm. The serum sample used was diluted 10-fold with phosphate buffer. Further, as the standard solution, the prepared oxidized HDL is used as a protein amount of 0 to
It was adjusted to 1000 ng / ml and used. [ABTS: 2,
2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazorine-6-sulfonic aci
d) diammonium salt]

【００２２】＜結果＞ （１）標準曲線 酸化ＨＤＬの標準液を使用して作成した上記ＥＬＩＳＡ
法の標準曲線を図１に示す。図１および図２に示すよう
に、１５．６２５ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌま
で直線性を示し、なおかつ０点に収束する良好な反応性
が認められた。 （２）交差性 本ＥＬＩＳＡ法に対するＬＤＬ、酸化ＬＤＬ、ＨＤＬ、
酸化ＨＤＬそれぞれの反応性を図３に示す。その結果、
本ＥＬＩＳＡ法は酸化ＨＤＬを特異的に測定できること
が明らかとなった。<Results> (1) Standard curve The above ELISA prepared using a standard solution of oxidized HDL
The standard curve of the method is shown in FIG. As shown in FIG. 1 and FIG. 2, linearity was exhibited from 15.625 ng / ml to 1000 ng / ml, and good reactivity that converges to 0 point was observed. (2) Crossability LDL, oxidized LDL, HDL for the present ELISA method,
The reactivity of each oxidized HDL is shown in FIG. as a result,
It was revealed that this ELISA method can specifically measure oxidized HDL.

【００２３】（３）本ＥＬＩＳＡ法の特異性の解析 本ＥＬＩＳＡ法が酸化ＨＤＬを特異的に測定できる理由
を解析する目的でマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）処理お
よびリゾフォスファチジルコリン（ＬＰＣ）の影響を調
べた。表１に示すように、ＭＤＡ化ＨＤＬを本ＥＬＩＳ
Ａによって酸化ＨＤＬ量として測定すると測定値が３倍
強増加したが、これに対してＭＤＡ化酸化ＨＤＬでは僅
かに減少し、ＭＤＡ化ＬＤＬおよびＭＤＡ化酸化ＬＤＬ
は約１／２に減少した。これに対してＬＰＣをＭＤＡ処
理と同時に加えるといずれの場合も著しく減少し、さら
に前もってＬＰＣを添加しておくと、酸化ＨＤＬ量とし
てはほとんど検出できなくなった。また、ＭＤＡによる
ＨＤＬ酸化時にＬＰＣを共存させ、酸化ＨＤＬ測定にお
けるＬＰＣの影響を調べたところ、表２に示すように
１．０〜５．０μｇのＬＰＣではいずれの場合でも酸化
ＨＤＬは全く検出できなかった。(3) Analysis of specificity of this ELISA method The influence of malondialdehyde (MDA) treatment and lysophosphatidylcholine (LPC) for the purpose of analyzing the reason why this ELISA method can specifically measure oxidized HDL. I checked. As shown in Table 1, MDA-ized HDL was used in this ELIS.
When measured as the amount of oxidized HDL by A, the measured value increased slightly more than 3-fold, whereas in the case of MDA-oxidized HDL, it slightly decreased, and MDA-modified LDL and MDA-oxidized LDL were slightly decreased.
Was reduced to about 1/2. On the other hand, when LPC was added at the same time as the MDA treatment, it was markedly decreased in all cases, and when LPC was added in advance, the amount of oxidized HDL could hardly be detected. Further, when LPC was made to coexist during HDL oxidation by MDA and the influence of LPC in the measurement of oxidized HDL was examined, as shown in Table 2, in any case, 1.0-5.0 μg of LPC could not detect oxidized HDL at all. There wasn't.

【００２４】[0024]

【表１】 [Table 1]

【表２】 [Table 2]

【００２５】次に、抗酸化剤および酸化剤の影響につい
て検討した。その結果、表３に示すように抗酸化剤とし
て０．１〜１．０ｍＭのα−トコフェロール（α−Toco
pherol）をＭＤＡによるＨＤＬ酸化時に共存させるとＭ
ＤＡ単独の酸化に比べて酸化ＨＤＬ量は低下し、その程
度はα−トコフェロールの用量に比例することが確認さ
れた。また、酸化剤としてカタラーゼ（Catalase）およ
びスーパーオキシドジスムターゼ（Superoxide dismuta
se：ＳＯＤ）をＭＤＡによるＨＤＬ酸化時に共存させて
影響を調べたところ、表４に示すようにカタラーゼでは
用量に反比例して酸化ＨＤＬ量は低下したが、ＳＯＤの
影響はほとんど認められなかった。Next, the effects of antioxidants and oxidizing agents were examined. As a result, as shown in Table 3, 0.1-1.0 mM of α-tocopherol (α-Tocopherol as an antioxidant was used.
pherol) coexists with MDA during HDL oxidation
It was confirmed that the amount of oxidized HDL was lower than that of the oxidation of DA alone, and the degree thereof was proportional to the dose of α-tocopherol. In addition, catalase and superoxide dismuta as oxidants
se: SOD) was allowed to coexist during HDL oxidation by MDA, and the effect was examined. As shown in Table 4, the amount of oxidized HDL was inversely proportional to the dose of catalase, but the effect of SOD was hardly observed.

【００２６】[0026]

【表３】 [Table 3]

【表４】 [Table 4]

【００２７】これらの結果より、本ＥＬＩＳＡ法が酸化
ＨＤＬを特異的に測定することができる理由として、α
−トコフェロールやカタラーゼによって阻害されるＬＰ
Ｃ由来のＯＨラジカルが深く関係していると考えられ
た。またＬＰＣによっても著しく阻害されることから、
ＨＤＬが酸化された結果出現してくる酸化ＨＤＬ上のＬ
ＰＣも関与しているものと考えられる。From these results, the reason why the present ELISA method can specifically measure oxidized HDL is α
-LP inhibited by tocopherol or catalase
It was thought that the C-derived OH radicals were closely related. Also, because it is significantly inhibited by LPC,
L on oxidized HDL that appears as a result of oxidization of HDL
It is considered that the PC is also involved.

【００２８】（４）本ＥＬＩＳＡ測定法の臨床応用への
基礎的検討 ４−１：血清サンプルの希釈試験 酸化ＨＤＬが高値を示す任意の患者血清試料３種類につ
いて希釈試験を行ったところ、図４および図５に示すよ
うに原濃度から１／８希釈試料の測定値まではプラトー
傾向を示したが、１／１６希釈以上ではほぼ希釈率に比
例して直線的に減少した。このことから、以後の血清試
料の測定は１／１０希釈を行って測定した。 ４−２：添加回収試験 １０倍に希釈した血清サンプルに酸化ＨＤＬを添加して
回収率を観察した。その結果を表５に示す。(4) Basic examination of clinical application of this ELISA assay 4-1: Dilution test of serum sample Dilution test was carried out on three kinds of serum samples of any patient showing high value of oxidized HDL. As shown in FIG. 5 and FIG. 5, there was a plateau tendency from the original concentration to the measured value of the 1/8 diluted sample, but at 1/16 dilution or more, it decreased linearly in proportion to the dilution ratio. From this, the subsequent measurement of the serum sample was performed by diluting 1/10. 4-2: Addition recovery test Oxidized HDL was added to a 10-fold diluted serum sample and the recovery rate was observed. The results are shown in Table 5.

【００２９】[0029]

【表５】 [Table 5]

【００３０】４−３：臨床試験 健常者６０例を対照として、狭心症１７例、心筋梗塞９
例、狭心症・心筋梗塞併発例９例、糖尿病４５例につい
て本ＥＬＩＳＡによって酸化ＨＤＬを測定し、比較し
た。図６に示すように、健常例平均に比較するといずれ
の疾患でも高い平均値が見られたが、狭心症例では最も
高値の傾向が観察された。これらの症例について過酸化
脂質測定法であるＴＢＡＲＳ測定値と比較してみたとこ
ろ、図７に示したように糖尿病において相関係数γ＝
０．３７０４１が認められたが、他疾患ではいずれもこ
れ以下の相関性を示した。したがって酸化ＨＤＬは動脈
硬化症に起因する循環器系疾患の全く異なった臨床的パ
ラメータになり得る可能性が示唆された。4-3: Clinical study In contrast with 60 healthy subjects, 17 angina pectoris, 9 myocardial infarction
For example, 9 cases with angina and myocardial infarction and 45 cases with diabetes were measured and compared for oxidized HDL by this ELISA. As shown in FIG. 6, a high average value was observed in all diseases as compared with the average in healthy cases, but the highest tendency was observed in angina cases. When these cases were compared with the TBARS measurement value, which is a lipid peroxide measurement method, as shown in FIG. 7, the correlation coefficient γ =
Although 0.37041 was observed, the correlation was less than this in all other diseases. Therefore, it was suggested that oxidized HDL could be a completely different clinical parameter of cardiovascular disease caused by arteriosclerosis.

【００３１】[0031]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】図１は、ＥＬＩＳＡ法における標準曲線を示し
たものである。FIG. 1 shows a standard curve in the ELISA method.

【図２】図２は、ＥＬＩＳＡ法における標準曲線を示し
たものである。FIG. 2 shows a standard curve in the ELISA method.

【図３】図３は、ＥＬＩＳＡ法における交差性を示した
ものである。FIG. 3 shows crossability in the ELISA method.

【図４】図４は、血清サンプルの希釈性を示したもので
ある。FIG. 4 shows the dilutability of serum samples.

【図５】図５は、血清サンプルの希釈性を示したもので
ある。FIG. 5 shows the dilutability of serum samples.

【図６】図６は、血清サンプル中の酸化ＨＤＬを測定し
た結果を示したものである。FIG. 6 shows the results of measurement of oxidized HDL in serum samples.

【図７】図７は、酸化ＨＤＬ測定値とＴＢＡＲＳとの相
関性を示したものである。FIG. 7 shows the correlation between the measured HDL value and TBARS.

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 試料中に存在する酸化された高密度リポ
タンパク質（ＨＤＬ）をサンドイッチ法により測定する
ための方法であって、銅を用いて酸化した酸化リポタン
パク質を抗原として使用し、これを免疫して得られる酸
化された脂質に対する抗体とアポリポタンパク質Ａ１に
対する抗体の２種類の抗体を使用することを特徴とする
酸化ＨＤＬの測定法。1. A method for measuring an oxidized high density lipoprotein (HDL) present in a sample by a sandwich method, wherein an oxidized lipoprotein oxidized with copper is used as an antigen, A method for measuring oxidized HDL, which comprises using two kinds of antibodies, namely, an antibody against an oxidized lipid obtained by immunization and an antibody against apolipoprotein A1. 【請求項２】 酸化された脂質に対する抗体が、ＨＤＬ
のリン脂質上の酸化部位を認識するものである、請求項
１記載の方法。2. The antibody against the oxidized lipid is HDL
The method according to claim 1, which recognizes an oxidation site on the phospholipid of the above. 【請求項３】 試料中に存在する酸化された高密度リポ
タンパク質（ＨＤＬ）をサンドイッチ法により測定する
ためのキットであって、銅を用いて酸化した酸化リポタ
ンパク質を抗原として使用し、これを免疫して得られる
酸化された脂質に対する抗体とアポリポタンパク質Ａ１
に対する抗体の２種類の抗体を使用することを特徴とす
る酸化ＨＤＬの測定用キット。3. A kit for measuring an oxidized high density lipoprotein (HDL) present in a sample by a sandwich method, which comprises using an oxidized lipoprotein oxidized with copper as an antigen. Antibodies to oxidized lipids obtained by immunization and apolipoprotein A1
A kit for measuring oxidized HDL, characterized in that it uses two kinds of antibodies against the above. 【請求項４】 酸化された脂質に対する抗体が、ＨＤＬ
のリン脂質上の酸化部位を認識するものである、請求項
３記載のキット。4. The antibody against the oxidized lipid is HDL
The kit according to claim 3, which recognizes an oxidation site on the phospholipid of the above.