JP5110353B2 - Novel oxidized LDL complex and detection method thereof - Google Patents
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Description
本発明は、血清アミロイドＰコンポーネント、酸化ＬＤＬ及びβ２−グリコプロテインＩからなる複合体、その検知方法及びこれに用いるキット等に関する。 The present invention relates to a complex composed of serum amyloid P component, oxidized LDL and β2-glycoprotein I, a detection method thereof, a kit used therefor, and the like.
本出願書類において使用する略号及びその意義は以下の通りである。
β2-GPI：β２−グリコプロテインＩ
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＲＰ：Ｃ−反応性タンパク質
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＨＲＰ：ホースラディッシュ（西洋ワサビ）のペルオキシダーゼ
ＬＤＬ：低密度リポタンパク質（酸化されていないネイティブなもの）
ＯＤ：吸光度
oxLDL：酸化ＬＤＬ
oxLDL/β2-GPI複合体：oxLDL及びβ2-GPIからなる複合体
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＳＡＰ：血清アミロイドＰコンポーネント（serum amyloid P component；ペントラキシンタンパク質の１つ）
SAP/oxLDL/β2-GPI複合体：SAP、oxLDL及びβ2-GPIからなる複合体
SAP/oxLDL複合体：SAP及びoxLDLからなる複合体
ＴＢＳ：トリス緩衝生理食塩水
Abbreviations used in this application document and their meanings are as follows.
β 2 -GPI: β2-glycoprotein I
BSA: bovine serum albumin CRP: C-reactive protein EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay HRP: horseradish peroxidase LDL: low-density lipoprotein (non-oxidized native)
OD: Absorbance
oxLDL: Oxidized LDL
oxLDL / β 2 -GPI complex: complex consisting of oxLDL and β 2 -GPI PBS: phosphate buffered saline SAP: serum amyloid P component (one of the pentraxin proteins)
SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex: Complex consisting of SAP, oxLDL and β 2 -GPI
SAP / oxLDL complex: complex consisting of SAP and oxLDL TBS: Tris buffered saline
SAPはマウスの炎症において誘導される急性期タンパク質の一種である（非特許文献１）。一方、oxLDLはβ2-GPIと複合体を形成し、ヒトにおいてこのoxLDLとβ2-GPIとの複合体はさらにCRPとの複合体を形成することが知られている（特許文献１）。
しかし、SAPが、oxLDL及びβ2-GPIと複合体を形成することは知られていない。ましてこの複合体が、疾患のマーカーにとして利用できることも知られていない。またSAPがoxLDLと複合体を形成することも知られておらず、この複合体が、疾患のマーカーにとして利用できることも知られていない。
SAP is a kind of acute phase protein induced in mouse inflammation (Non-patent Document 1). On the other hand, it is known that oxLDL forms a complex with β 2 -GPI, and this complex of oxLDL and β 2 -GPI further forms a complex with CRP in humans (Patent Document 1).
However, it is not known that SAP forms a complex with oxLDL and β 2 -GPI. Moreover, it is not known that this complex can be used as a disease marker. Also, it is not known that SAP forms a complex with oxLDL, and it is not known that this complex can be used as a disease marker.
本発明は、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体、SAP/oxLDL複合体、これらの検知方法及びこれらに用いるキット等を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex, an SAP / oxLDL complex, a detection method thereof, a kit used for these, and the like.
本発明者は、SAP、oxLDL及びβ2-GPIの三者の関係を調べた結果、驚くべきことにこれら三者が複合体を形成することを見出し、当該複合体を提供するに至り、本発明を完成した。さらに本発明者は、当該複合体の検知方法及びキット並びに当該複合体の検知を通じた疾患の検知方法及びキットを提供するに至り、本発明を完成した。 As a result of examining the relationship between the three of SAP, oxLDL, and β 2 -GPI, the present inventor has surprisingly found that these three form a complex, and has provided this complex. Completed the invention. Furthermore, the present inventor has provided the detection method and kit of the complex and the detection method and kit of the disease through the detection of the complex, thereby completing the present invention.
すなわち本発明は、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体（以下、「本発明複合体」という。）を提供する。
また本発明は、本発明複合体を含有している可能性がある試料に、抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、本発明複合体の検知方法（以下、「本発明複合体検知方法」という。）を提供する。本発明複合体検知方法の一例として、本発明複合体を含有している可能性がある試料に、抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体を接触させて、「抗ＳＡＰ抗体−本発明複合体−抗β２−ＧＰＩ抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、本発明複合体の検知方法を挙げることができる。本発明複合体検知方法における抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものであることが好ましい。
That is, the present invention provides an SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex (hereinafter referred to as “the complex of the present invention”).
The present invention also includes a method for detecting the complex of the present invention (hereinafter referred to as) comprising a step of contacting at least one of an anti-SAP antibody and an anti-β 2 -GPI antibody with a sample that may contain the complex of the present invention. And “the complex detection method of the present invention”). As an example of the method of detecting the complex of the present invention, an anti-SAP antibody and an anti-β 2 -GPI antibody are contacted with a sample that may contain the complex of the present invention, and “anti-SAP antibody-complex of the present invention” is obtained. And a method for detecting the complex of the present invention, comprising the step of forming a sandwich complex composed of “anti-β 2 -GPI antibody”. Either one of the anti-SAP antibody and the anti-β 2 -GPI antibody in the complex detection method of the present invention is preferably fixed to a solid phase.
また本発明複合体検知方法の一例として、以下の（１）〜（３）のステップを少なくとも含む、本発明複合体の検知方法も挙げることができる；
ステップ（１）：抗体Ａが固着された固相に、本発明複合体を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体」で示される第１複合体を形成させるステップ、
ステップ（２）：ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させ、「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体−抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び
ステップ（３）：ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検出するステップ。（ただし、抗体Ａは抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ示す。）。
以上にいう「本発明複合体を含有している可能性がある試料」は、生体に由来する試料であることが好ましい。またこの「生体に由来する試料」は、体液であることが好ましい。
Moreover, as an example of the complex detection method of the present invention, a detection method of the complex of the present invention including at least the following steps (1) to (3) can also be mentioned;
Step (1): A sample that may contain the complex of the present invention is brought into contact with the solid phase to which the antibody A is immobilized, and this is indicated by “Antibody A immobilized on the solid phase—the complex of the present invention”. Forming a first complex
Step (2): The antibody B is brought into contact with the first complex formed in Step 1 to form a sandwich-like complex represented by “Antibody A immobilized on a solid phase—the complex of the present invention—antibody B”. And step (3): detecting the sandwich complex formed in step 2. (However, antibody A represents one of anti-SAP antibody and anti-β 2 -GPI antibody, and antibody B represents the other antibody).
The “sample that may contain the complex of the present invention” mentioned above is preferably a sample derived from a living body. The “sample derived from a living body” is preferably a body fluid.
また本発明は、以下の（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法（以下、「本発明疾患検知方法」という。）を提供する；
ステップ（１）：本発明複合体検知方法を用いて、体液中に存在する本発明複合体を検知するステップ、及び
ステップ（２）：ステップ（１）における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。
ここにいう「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。
The present invention also provides a disease detection method (hereinafter referred to as “the disease detection method of the present invention”) comprising at least the following steps (1) and (2):
Step (1): a step of detecting the complex of the present invention present in a body fluid using the complex detection method of the present invention; and step (2): a step of associating the detection result in step (1) with a disease.
The “disease” here is preferably selected from hyperlipidemia and arteriosclerosis.
また本発明は、抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体を構成成分として少なくとも含む、本発明複合体の検知キット（以下、「本発明複合体検知キット」という。）を提供する。この抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものが好ましい。 The present invention also provides a detection kit for the complex of the present invention (hereinafter referred to as “the complex detection kit of the present invention”) comprising at least an anti-SAP antibody and an anti-β 2 -GPI antibody as components. One of the anti-SAP antibody and the anti-β 2 -GPI antibody is preferably fixed to a solid phase.
また本発明は、本発明複合体検知キットからなる、疾患の検知キット（以下、「本発明疾患検知キット」という。）を提供する。この「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。
同時に本発明者は、SAP及びoxLDLが複合体を形成することを見出し、当該複合体を提供するに至り、本発明を完成した。さらに本発明者は、当該複合体の検知方法及びキット並びに当該複合体の検知を通じた疾患の検知方法及びキットを提供するに至り、本発明を完成した。
すなわち本発明は、SAP/oxLDL複合体（以下、「本発明複合体２」という。）をさらに提供する。
The present invention also provides a disease detection kit (hereinafter referred to as “the disease detection kit of the present invention”) comprising the complex detection kit of the present invention. This “disease” is preferably selected from hyperlipidemia and arteriosclerosis.
At the same time, the present inventors have found that SAP and oxLDL form a complex, and have provided the complex, thereby completing the present invention. Furthermore, the present inventor has provided the detection method and kit of the complex and the detection method and kit of the disease through the detection of the complex, thereby completing the present invention.
That is, the present invention further provides an SAP / oxLDL complex (hereinafter referred to as “the complex of the present invention 2”).
また本発明は、本発明複合体２を含有している可能性がある試料に、抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、本発明複合体２の検知方法（以下、「本発明複合体検知方法２」という。）を提供する。本発明複合体検知方法２の一例として、本発明複合体２を含有している可能性がある試料に、抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体を接触させて、「抗ＳＡＰ抗体−本発明複合体２−抗ｏｘＬＤＬ抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、本発明複合体２の検知方法を挙げることができる。本発明複合体検知方法２における抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものであることが好ましい。 In addition, the present invention includes a method for detecting the complex 2 of the present invention (hereinafter referred to as the following), which comprises a step of contacting at least one of an anti-SAP antibody and an anti-oxLDL antibody with a sample that may contain the complex 2 of the present invention. "The complex detection method 2 of the present invention"). As an example of the complex detection method 2 of the present invention, an anti-SAP antibody and an anti-oxLDL antibody are contacted with a sample that may contain the complex 2 of the present invention, and “anti-SAP antibody-present complex 2” is obtained. And a method for detecting the complex 2 of the present invention, which includes a step of forming a sandwich complex composed of “anti-oxLDL antibody”. It is preferable that one of the anti-SAP antibody and the anti-oxLDL antibody in the complex detection method 2 of the present invention is fixed to a solid phase.
また本発明複合体検知方法２の一例として、以下の（１）〜（３）のステップを少なくとも含む、本発明複合体２の検知方法も挙げることができる；
ステップ（１）：抗体Ｃが固着された固相に、本発明複合体２を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体Ｃ−本発明複合体２」で示される第１複合体を形成させるステップ、
ステップ（２）：ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｄを接触させ、「固相に固着された抗体Ｃ−本発明複合体２−抗体Ｄ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び
ステップ（３）：ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検出するステップ。（ただし、抗体Ｃは抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｄは他方の抗体をそれぞれ示す。）。
以上にいう「本発明複合体２を含有している可能性がある試料」は、生体に由来する試料であることが好ましい。またこの「生体に由来する試料」は、体液であることが好ましい。
In addition, as an example of the complex detection method 2 of the present invention, a detection method of the complex 2 of the present invention including at least the following steps (1) to (3) can also be mentioned:
Step (1): A sample that may contain the complex 2 of the present invention is brought into contact with the solid phase to which the antibody C is immobilized, and “Antibody C immobilized on the solid phase—the complex 2 of the present invention” Forming a first complex represented by:
Step (2): The antibody D is brought into contact with the first complex formed in Step 1 to form a sandwich-like complex represented by “Antibody C immobilized on a solid phase—the complex of the present invention 2—the antibody D”. And step (3): detecting the sandwich complex formed in step 2. (However, antibody C represents one of anti-SAP antibody and anti-oxLDL antibody, and antibody D represents the other antibody).
The “sample that may contain the complex 2 of the present invention” mentioned above is preferably a sample derived from a living body. The “sample derived from a living body” is preferably a body fluid.
また本発明は、以下の（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法（以下、「本発明疾患検知方法２」という。）を提供する；
ステップ（１）：本発明複合体検知方法２を用いて、体液中に存在する本発明複合体２を検知するステップ、及び
ステップ（２）：ステップ（１）における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。
ここにいう「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。
The present invention also provides a disease detection method (hereinafter referred to as “the disease detection method 2 of the present invention”) comprising at least the following steps (1) and (2):
Step (1): Step of detecting the complex 2 of the present invention present in a body fluid using the complex detection method 2 of the present invention; and Step (2): correlating the detection result in step (1) with a disease. Step.
The “disease” here is preferably selected from hyperlipidemia and arteriosclerosis.
また本発明は、抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体を構成成分として少なくとも含む、本発明複合体２の検知キット（以下、「本発明複合体検知キット２」という。）を提供する。この抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものが好ましい。 The present invention also provides a detection kit for the complex 2 of the present invention (hereinafter referred to as “the complex detection kit 2 of the present invention”) comprising at least an anti-SAP antibody and an anti-oxLDL antibody as components. The anti-SAP antibody or anti-oxLDL antibody is preferably one in which either one is fixed to a solid phase.
また本発明は、本発明複合体検知キット２からなる、疾患の検知キット（以下、「本発明疾患検知キット２」という。）を提供する。この「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。 The present invention also provides a disease detection kit comprising the complex detection kit 2 of the present invention (hereinafter referred to as “the disease detection kit 2 of the present invention”). This “disease” is preferably selected from hyperlipidemia and arteriosclerosis.
本発明複合体は、例えば本発明複合体検知方法、本発明疾患検知方法、本発明複合体検知キット及び本発明疾患検知キットのスタンダード等として利用することができ、極めて有用である。また本発明複合体検知方法によれば、試料中に存在する本発明複合体を簡便、迅速、容易、高感度、高精度かつ安価に検知することができ、これに基づいて本発明複合体検知キットが提供されることから極めて有用である。本発明疾患検知方法は、体液中のSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の検知を通じて、高脂血症や動脈硬化などの疾患を簡便、迅速、容易、高感度、高精度かつ安価に検知することができ、さらにこれに基づいて本発明疾患検知キットが提供されることから極めて有用である。また本発明複合体検知キットや本発明疾患検知キットは、これを用いることによって本発明複合体検知方法や本発明疾患検知方法をさらに簡便、迅速、かつ容易に実施することができ、極めて有用である。そしてこれらの本発明は、疾患（例えば高脂血症や動脈硬化など）のモデル動物を用いてその疾患に対する医薬の候補物質を探索したり、その物質の有効性を評価するような医薬開発の場面においても利用することができる。 The complex of the present invention can be used, for example, as a standard of the complex detection method of the present invention, the disease detection method of the present invention, the complex detection kit of the present invention, the disease detection kit of the present invention, and the like, and is extremely useful. Further, according to the complex detection method of the present invention, the complex of the present invention present in a sample can be detected simply, quickly, easily, with high sensitivity, high accuracy and low cost, and based on this detection of the complex of the present invention. It is extremely useful since a kit is provided. The disease detection method of the present invention can detect diseases such as hyperlipidemia and arteriosclerosis easily, quickly, easily, with high sensitivity, high accuracy and low cost through detection of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex in body fluid. This is extremely useful since the disease detection kit of the present invention is provided based on this. In addition, the complex detection kit and the disease detection kit of the present invention are very useful because the complex detection method and the disease detection method of the present invention can be carried out more easily, quickly and easily by using the kit. is there. These inventions are based on the development of drugs that can be used to search for drug candidates for the disease using model animals of the disease (for example, hyperlipidemia and arteriosclerosis) and to evaluate the effectiveness of the substance. It can also be used in scenes.
また本発明複合体２、本発明複合体検知方法２、本発明疾患検知方法２、本発明複合体検知キット２及び本発明疾患検知キット２についても、上記の本発明複合体、本発明複合体検知方法、本発明疾患検知方法、本発明複合体検知キット及び本発明疾患検知キットと同様に極めて有用である。 The complex of the present invention, the complex detection method of the present invention 2, the disease detection method of the present invention 2, the complex detection kit of the present invention 2, and the disease detection kit of the present invention are also described above. The detection method, the disease detection method of the present invention, the complex detection kit of the present invention, and the disease detection kit of the present invention are extremely useful.
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明複合体
本発明複合体は、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体である。本発明複合体は、SAP、oxLDL及びβ2-GPIの三者により構成されることを特徴とする。
本発明複合体は、SAP、oxLDL及びβ2-GPIの三者を生理的条件下で接触させることにより製造することができる。SAP、oxLDL及びβ2-GPIは、それぞれ公知の方法で製造することができる。また市販のものを用いることもできる。
ここにいう「生理的条件」も、マウス生体内（特に血液）における塩濃度、ｐＨ、温度等と同等の条件である限りにおいて特に限定されないが、例えば、緩衝作用を有する生理的塩類溶液中、ｐＨ６〜８（好ましくはｐＨ６．５〜７．５）、温度３５℃〜４０℃（好ましくは３６℃〜３８℃）の条件が例示される。
また、本出願書類における「接触」の方法は、接触対象となる分子同士が互いに接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
<1> Complex of the Present Invention The complex of the present invention is an SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex. The complex of the present invention is composed of three components, SAP, oxLDL and β 2 -GPI.
The complex of the present invention can be produced by bringing three members of SAP, oxLDL, and β 2 -GPI into contact under physiological conditions. SAP, oxLDL and β 2 -GPI can be produced by known methods, respectively. Commercially available products can also be used.
The “physiological conditions” referred to here are not particularly limited as long as the conditions are equivalent to the salt concentration, pH, temperature, etc. in the mouse body (particularly blood). For example, in a physiological salt solution having a buffering action, Examples include conditions of pH 6 to 8 (preferably pH 6.5 to 7.5) and temperature of 35 ° C. to 40 ° C. (preferably 36 ° C. to 38 ° C.).
In addition, the method of “contact” in the present application document is not particularly limited as long as molecules to be contacted are brought into contact with each other.
また、SAP、oxLDL及びβ2-GPIを接触させる順序も特に限定されない。例えば、これら三者を同時に接触させてもよく、いずれか二者をまず接触させた後これに残りの一者を接触させてもよい。例えば、まずoxLDLとβ2-GPIを接触させ、次いでこれにSAPを接触させる方法が例示される。
接触させる際における各分子の量比も特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。例えば、まずoxLDLとβ2-GPIを接触させ、次いでこれにSAPを接触させる方法を採用する場合には、oxLDLとβ2-GPIの質量比として、oxLDL：β2-GPI＝１：５〜５：１（好ましくは１：４〜４：１、より好ましくは１：３〜３：１、より好ましくは１：２〜２：１）を例示することができる。次いでSAPを接触させる際には、oxLDL/β2-GPI複合体とSAPの質量比として、oxLDL/β2-GPI複合体：SAP＝20：１〜１：10（好ましくは15：１〜１：５、より好ましくは12：１〜１：２）を例示することができる。この場合において、SAPは、終濃度0.1mM〜10mM程度（好ましくは0.5mM〜5mM程度）のカルシウムイオン存在下で接触させることが好ましい。
Further, the order of contacting SAP, oxLDL and β 2 -GPI is not particularly limited. For example, these three parties may be contacted at the same time, or any two parties may be contacted first, and then the other party may be contacted. For example, a method in which oxLDL and β 2 -GPI are first contacted and then SAP is contacted is exemplified.
The amount ratio of each molecule in the contact is not particularly limited, and can be appropriately set by those skilled in the art. For example, when adopting a method in which oxLDL is first brought into contact with β 2 -GPI and then SAP is brought into contact therewith, the mass ratio of oxLDL and β 2 -GPI is set to oxLDL: β 2 -GPI = 1: 5 5: 1 (preferably 1: 4 to 4: 1, more preferably 1: 3 to 3: 1, more preferably 1: 2 to 2: 1) can be exemplified. When contacting the SAP is then as the mass ratio of oxLDL / β 2 -GPI complex and SAP, oxLDL / β 2 -GPI complex: SAP = 20: 1 to 1: 10 (preferably 15: 1 to 1 : 5, more preferably 12: 1 to 1: 2). In this case, SAP is preferably contacted in the presence of calcium ions having a final concentration of about 0.1 mM to 10 mM (preferably about 0.5 mM to 5 mM).
また、これらの接触時間も特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。一般に、反応は時間依存的で接触時間が長いほど十分に複合体が形成されることから、例えば１０時間〜４８時間（好ましくは１２時間〜２４時間）程度を例示することができる。本発明複合体のより具体的な製造方法の一例は、後述の実施例を参照されたい。 Also, these contact times are not particularly limited and can be appropriately set by those skilled in the art. In general, the reaction is time-dependent, and the longer the contact time, the more the complex is formed. Thus, for example, about 10 to 48 hours (preferably 12 to 24 hours) can be exemplified. For an example of a more specific method for producing the composite of the present invention, refer to the examples described later.
また本発明複合体は、高脂肪食を摂取させた（高脂肪食を負荷した）高脂血症モデルマウスの血液から精製することによっても製造することができる。具体的には、高脂血症モデルマウス（例えば、後述のLDLR-/-マウスや、apoE-/-マウスなど）に高脂肪食を摂取させ、その後採血して、その血液中から本発明複合体を精製することによって製造することができる。
ここにいう「精製」は、いわゆる完全精製のみならず、部分精製を含む概念である。精製の方法も特に限定されないが、例えば、抗SAP抗体又は抗β2-GPI抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー等の手法を採用することができる。これに用いる抗SAP抗体又は抗β2-GPI抗体は、いずれも公知のものを用いることができる。もちろん、市販のものを用いてもよい。例えば、後述の実施例に示す通り、抗SAP抗体は市販されており、これを用いることができる。また抗β2-GPI抗体は、例えば「WB-CAL-1」（J. Immunol., 149, p1063-1068(1992)）を用いることができる。
The complex of the present invention can also be produced by purification from the blood of a hyperlipidemic model mouse fed with a high fat diet (loaded with a high fat diet). Specifically, hyperlipidemia model mice (for example, LDLR-/-mice and apoE-/-mice described later) are ingested with a high-fat diet, then blood is collected, and the composite of the present invention is collected from the blood. It can be produced by purifying the body.
Here, “purification” is a concept that includes not only so-called complete purification but also partial purification. The purification method is not particularly limited, and for example, a technique such as affinity chromatography using an anti-SAP antibody or an anti-β 2 -GPI antibody can be employed. Any known anti-SAP antibody or anti-β 2 -GPI antibody can be used. Of course, a commercially available product may be used. For example, as shown in the examples described later, anti-SAP antibodies are commercially available and can be used. As the anti-β 2 -GPI antibody, for example, “WB-CAL-1” (J. Immunol., 149, p1063-1068 (1992)) can be used.
本発明複合体は、例えば、本発明複合体検知方法、本発明疾患検知方法、本発明複合体検知キット及び本発明疾患検知キット等のスタンダードとして使用することができる。例えば本発明複合体を用いて、これらの検知方法又は検知キットによる本発明複合体の検知の品質をチェックすることができる。また例えば、既知濃度の本発明複合体とELISAによるその検知結果との関係について検量線や関係式を作成すれば、試料中に含まれる未知濃度の本発明複合体を定量することもできる。もちろん、本発明複合体を、本発明の各キットの構成成分として用いることもできる。 The complex of the present invention can be used as a standard for, for example, the complex detection method of the present invention, the disease detection method of the present invention, the complex detection kit of the present invention, and the disease detection kit of the present invention. For example, the quality of detection of the complex of the present invention by these detection methods or detection kits can be checked using the complex of the present invention. For example, if a calibration curve or a relational expression is created for the relationship between the complex of the present invention having a known concentration and the detection result by ELISA, the complex of the present invention having an unknown concentration contained in the sample can be quantified. Of course, this invention composite_body | complex can also be used as a structural component of each kit of this invention.
＜２＞本発明複合体検知方法
本発明複合体検知方法は、本発明複合体を含有している可能性がある試料に、抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、本発明複合体の検知方法である。
ここで、「本発明複合体を含有している可能性がある試料」とは、本発明複合体の検知が意図されている試料を意味する。このような意図がある限りにおいて、現実にその試料に本発明複合体が含有されているか否かは関係ない。
また「試料」の種類も特に限定されず、人工的に製造された試料であっても、天然物に由来する試料であってもよい。例えば、人工的に製造した本発明複合体の水溶液や、生体に由来する試料等は、当然にここにいう「試料」に包含される。なかでも、生体に由来する試料が好ましく、生体に由来する液体（体液）が好ましい。体液の種類も特に限定されないが、例えば、血液を例示することができる。ここにいう「血液」は、血清や血漿等を包含する概念である。
本発明複合体検知方法は、このような試料に、抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含むことを特徴とする。
<2> Complex Detection Method of the Present Invention The complex detection method of the present invention is a step of bringing at least one of an anti-SAP antibody and an anti-β 2 -GPI antibody into contact with a sample that may contain the complex of the present invention. Is a method for detecting a complex of the present invention.
Here, the “sample that may contain the complex of the present invention” means a sample intended to detect the complex of the present invention. As long as there is such an intention, it does not matter whether or not the complex of the present invention is actually contained in the sample.
Also, the type of “sample” is not particularly limited, and it may be an artificially manufactured sample or a sample derived from a natural product. For example, an aqueous solution of the complex of the present invention produced artificially, a sample derived from a living body, and the like are naturally included in the “sample” herein. Especially, the sample derived from a biological body is preferable, and the liquid (body fluid) derived from a biological body is preferable. Although the kind of body fluid is not specifically limited, For example, blood can be illustrated. The “blood” here is a concept including serum, plasma and the like.
The complex detection method of the present invention includes a step of bringing such a sample into contact with at least one of an anti-SAP antibody and an anti-β 2 -GPI antibody.
したがって、このような試料に抗SAP抗体のみを接触させてもよく、抗β2-GPI抗体のみを接触させてもよく、両者を接触させてもよい。また、両者を接触させる場合、両者を同時に接触させてもよく、まず一方を接触させた後に他方を接触させても良いことは、前記と同様である。両者を接触させる方法を採用すれば、試料中にSAP、β2-GPI、oxLDL/β2-GPI複合体等の夾雑物が存在していても、本発明複合体のみを特異的に検知することができる。ここで用いる抗SAP抗体や抗β2-GPI抗体は、それぞれSAPやβ2-GPIに結合する抗体である限りにおいて特に限定されないが、検知精度を高めるためには、これらの抗原に特異的に結合するものであることが好ましい。なお、これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、大量生産や均質性を考慮した場合には、モノクローナル抗体であることが好ましい。 Therefore, only the anti-SAP antibody may be contacted with such a sample, only the anti-β 2 -GPI antibody may be contacted, or both may be contacted. Moreover, when making both contact, you may make both contact simultaneously, and it is the same as the above that you may contact the other after making one contact first. If the method of contacting both is adopted, even if contaminants such as SAP, β 2 -GPI, oxLDL / β 2 -GPI complex are present in the sample, only the complex of the present invention is specifically detected. be able to. The anti-SAP antibody and anti-β 2 -GPI antibody used here are not particularly limited as long as they are antibodies that bind to SAP and β 2 -GPI, respectively. It is preferable that they are bonded. These antibodies may be either monoclonal antibodies or polyclonal antibodies, but are preferably monoclonal antibodies in consideration of mass production and homogeneity.
これらの抗体は、これらの抗原を用いて、抗体の通常の作製方法に従って作製することができる。また、市販されているものをそのまま用いても良い。例えば、抗SAP抗体は市販のものをそのまま用いることができる。また、抗β2-GPI抗体として具体的には、WB-CAL-1（J. Immunol., 149, p1063-1068(1992)）、Cof-22及びCof-23（Blood, 87, p3262-3270(1996)）、EY2C9（Arthritis Rheum., 37, p1453-1461(1994)）等が例示される。
また「接触」の条件は、これらの抗体と本発明複合体とが抗原抗体反応する条件である限りにおいて特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。
本発明複合体検知方法は、このようなステップを含む限りにおいて、他のステップをさらに含んでいてもよい。例えば、試料を調製するステップや、洗浄するステップ、本発明複合体を検出するための反応を行うステップ、検量線や関係式を作成するステップ、本発明複合体の検知結果を解析するステップ等をさらに含んでいてもよい。
These antibodies can be produced using these antigens in accordance with a normal production method for antibodies. Moreover, you may use what is marketed as it is. For example, a commercially available anti-SAP antibody can be used as it is. Specific examples of anti-β 2 -GPI antibodies include WB-CAL-1 (J. Immunol., 149, p1063-1068 (1992)), Cof-22 and Cof-23 (Blood, 87, p3262-3270 (1996)), EY2C9 (Arthritis Rheum., 37, p1453-1461 (1994)) and the like.
Further, the “contact” conditions are not particularly limited as long as these antibodies and the complex of the present invention undergo an antigen-antibody reaction, and those skilled in the art can appropriately set them.
The complex detection method of the present invention may further include other steps as long as such steps are included. For example, a step of preparing a sample, a step of washing, a step of performing a reaction for detecting the complex of the present invention, a step of creating a calibration curve or a relational expression, a step of analyzing the detection result of the complex of the present invention, etc. Further, it may be included.
なお、本出願書類において「検知」とは、定性的な検知（存否や有無の検知）及び定量的な検知（存在量や程度の検知）の両方を含む概念である。したがって、例えば本発明複合体の量（濃度）等を測定することもここにいう「検知」の語に包含される。 In the present application document, “detection” is a concept including both qualitative detection (detection of presence / absence or presence / absence) and quantitative detection (detection of abundance and degree). Therefore, for example, measuring the amount (concentration) of the complex of the present invention is also included in the term “detection”.
また本発明複合体検知方法は、前記のステップを含む限りにおいて、その具体的な方法も限定されない。具体的な方法の一例としては、例えば抗体を用いた免疫学的な測定手法（ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法、競合法、阻害法等）、イムノブロッティング、凝集法等）が例示される。
本発明複合体検知方法の一例として、本発明複合体を含有している可能性がある試料に、抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体を接触させて、「抗SAP抗体−本発明複合体−抗β2-GPI抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、本発明複合体の検知方法を挙げることができる。本発明複合体検知方法における抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものであることが好ましい。
Moreover, as long as the composite_body | complex detection method of this invention includes the said step, the specific method is not limited. Examples of specific methods include, for example, immunological measurement methods using antibodies (ELISA method (sandwich method, competition method, inhibition method, etc.), immunoblotting, aggregation method, etc.).
As an example of the method for detecting the complex of the present invention, an anti-SAP antibody and an anti-β 2 -GPI antibody are brought into contact with a sample that may contain the complex of the present invention, and “anti-SAP antibody-present complex” is obtained. And a method for detecting the complex of the present invention, which includes the step of forming a sandwich complex composed of “anti-β 2 -GPI antibody”. Either one of the anti-SAP antibody and the anti-β 2 -GPI antibody in the complex detection method of the present invention is preferably fixed to a solid phase.
また本発明複合体検知方法の一例として、以下の（１）〜（３）のステップを少なくとも含む、本発明複合体の検知方法も挙げることができる；
ステップ（１）：抗体Ａが固着された固相に、本発明複合体を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体」で示される第１複合体を形成させるステップ、
ステップ（２）：ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させ、「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体−抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び
ステップ（３）：ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップ。
（ただし、抗体Ａは抗ＳＡＰ抗体及び抗β２−ＧＰＩ抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ示す。）。
以下、ステップごとに説明する。
ステップ（１）は、抗体Ａが固着された固相に、本発明複合体を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体」で示される第１複合体を形成させるステップである。
ここにいう「抗体Ａが固着された固相」は、抗体Ａを固相に固着させることにより製造することができる。
Moreover, as an example of the complex detection method of the present invention, a detection method of the complex of the present invention including at least the following steps (1) to (3) can also be mentioned;
Step (1): A sample that may contain the complex of the present invention is brought into contact with the solid phase to which the antibody A is immobilized, and this is indicated by “Antibody A immobilized on the solid phase—the complex of the present invention”. Forming a first complex
Step (2): The antibody B is brought into contact with the first complex formed in Step 1 to form a sandwich-like complex represented by “Antibody A immobilized on a solid phase—the complex of the present invention—antibody B”. Step and Step (3): A step of detecting the sandwich-like complex formed in Step 2.
(However, antibody A represents one of anti-SAP antibody and anti-β 2 -GPI antibody, and antibody B represents the other antibody).
Hereinafter, each step will be described.
In the step (1), a sample that may contain the complex of the present invention is brought into contact with the solid phase to which the antibody A is immobilized, and “Antibody A immobilized on the solid phase—the complex of the present invention” is obtained. Forming the first complex shown.
The “solid phase on which antibody A is immobilized” as used herein can be produced by immobilizing antibody A on a solid phase.
この抗体Ａを固着するために用いる固相は、抗体Ａを固着させることができ、かつ、水、体液、測定反応液等に不溶性である限りにおいて特に限定されない。固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウェル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等を例示することができる。固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
これらの固相に抗体Ａを固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法等、タンパク質や脂質の一般的な固着方法を利用することができる。これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。物理的吸着法として具体的には、例えば、抗体Ａを緩衝液等に溶解し、この溶液を固相（例えばマイクロプレート）に接触させることによって、抗体Ａを固相に吸着させる方法を挙げることができる。
The solid phase used for fixing antibody A is not particularly limited as long as antibody A can be fixed and is insoluble in water, body fluid, measurement reaction solution and the like. Examples of the shape of the solid phase include a plate (for example, a well of a microplate), a tube, a bead, a membrane, a gel, and the like. Examples of the solid phase material include polystyrene, polypropylene, nylon, and polyacrylamide. Among these, a plate made of polystyrene is preferable.
As a method for immobilizing the antibody A to these solid phases, a general protein or lipid immobilization method such as a physical adsorption method or a covalent bond method can be used. Among these, the physical adsorption method is preferable because the operation is simple and frequently used. Specific examples of the physical adsorption method include a method in which antibody A is adsorbed to a solid phase by dissolving antibody A in a buffer solution or the like and bringing this solution into contact with a solid phase (for example, a microplate). Can do.
また、抗体Ａを固着させた固相の表面には、これらが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこに試料中の本発明複合体や夾雑分子などが固着すると検知の結果に影響を及ぼすおそれがある。よって、試料を固相と接触させる前にブロッキング物質を添加して抗体Ａが固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、その他ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。 In addition, the surface portion of the solid phase to which the antibody A is fixed may remain on the surface portion where the antibody A is not fixed, and when the complex of the present invention or a contaminating molecule in the sample is fixed to the surface portion, it is detected. May affect results. Therefore, it is preferable to add a blocking substance before the sample is brought into contact with the solid phase so as to cover the portion where the antibody A is not fixed. As such a blocking substance, serum albumin, casein, skim milk, gelatin, and other commercially available blocking substances can also be used.
このようにして得られる「抗体Ａが固着された固相」に、本発明複合体を含有している可能性がある試料を接触させることにより、「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体」で示される第１複合体が形成される。ここにいう「接触」は、試料中の本発明複合体分子と、固相に固着された抗体Ａ分子が互いに接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。「接触」の条件も、前記と同様に、抗体Ａと本発明複合体とが抗原抗体反応する条件である限りにおいて特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。
ステップ（２）は、ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させ、「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体−抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップである。
ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させることにより、「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体−抗体Ｂ」で示されるサンドイッチ状複合体が形成される。
ここにいう「接触」も、抗体Ｂ分子と、第１複合体分子（固相に固着されている）が互いに接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。「接触」の条件も、前記と同様に、抗体Ｂと第１複合体分子（固相に固着されている）とが抗原抗体反応する条件である限りにおいて特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。
By contacting the sample possibly containing the complex of the present invention with the “solid phase on which antibody A is immobilized” thus obtained, “antibody A immobilized on the solid phase—the present invention” is obtained. A first complex indicated by “complex” is formed. The “contact” here is not particularly limited as long as the complex molecule of the present invention in the sample and the antibody A molecule fixed to the solid phase come into contact with each other. Similarly to the above, the “contact” conditions are not particularly limited as long as the antibody A and the complex of the present invention undergo an antigen-antibody reaction, and can be appropriately set by those skilled in the art.
In step (2), antibody B is brought into contact with the first complex formed in step 1 to form a sandwich-like complex represented by “antibody A immobilized on a solid phase—complex of the present invention—antibody B”. It is a step to make.
By bringing antibody B into contact with the first complex formed in step 1, a sandwich-like complex represented by “Antibody A immobilized on a solid phase-complex of the present invention-antibody B” is formed.
The “contact” here is not particularly limited as long as the antibody B molecule and the first complex molecule (adhered to the solid phase) come into contact with each other. Similarly to the above, the “contact” conditions are not particularly limited as long as the antibody B and the first complex molecule (adhered to the solid phase) undergo an antigen-antibody reaction, and are appropriately set by those skilled in the art. can do.
なお、抗体Ａは抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ意味する。したがって、抗体Ａとして抗SAP抗体を採用した場合には、抗体Ｂは抗β2-GPI抗体である。逆に、抗体Ａとして抗β2-GPI抗体を採用した場合には、抗体Ｂは抗SAP抗体である。
ステップ（３）は、ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップである。
この「ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体の検知」の方法も、「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体−抗体Ｂ」からなるサンドイッチ状複合体を検知しうる限りにおいて特に限定されないが、当該サンドイッチ状複合体の開放端（固相に直接固着されていない側）に存在する「抗体Ｂ」を検知することによって行うことが好ましい。
そのために、ステップ２において接触させる「抗体Ｂ」自体を標識物質で標識しておいてもよい。また「抗体Ｂ」として標識されていないものを用いる場合には、「『抗体Ｂ』に結合する物質」であって標識物質で標識されたものを用いてもよい。「『抗体Ｂ』に結合する物質」としては、例えば「抗体Ｂ」（免疫グロブリン）が由来する動物又はクラス等に応じた、その免疫グロブリンに特異的に結合する抗体等が例示される。例えば「抗体Ｂ」がヒツジ由来のIgGである場合には、「『抗体Ｂ』に結合する物質」として抗ヒツジIgG抗体を用いることができる。
Antibody A means one of the anti-SAP antibody and anti-β 2 -GPI antibody, and antibody B means the other antibody. Therefore, when an anti-SAP antibody is employed as antibody A, antibody B is an anti-β 2 -GPI antibody. Conversely, when an anti-β 2 -GPI antibody is employed as antibody A, antibody B is an anti-SAP antibody.
Step (3) is a step of detecting the sandwich-like complex formed in step 2.
The method of “detecting the sandwich complex formed in step 2” is also particularly effective as long as it can detect the sandwich complex consisting of “antibody A—the complex of the present invention—antibody B” immobilized on the solid phase. Although not limited, it is preferable to carry out by detecting “antibody B” present at the open end (the side not directly fixed to the solid phase) of the sandwich complex.
For this purpose, “antibody B” itself to be contacted in step 2 may be labeled with a labeling substance. In addition, when using an unlabeled “antibody B”, a “substance that binds to“ antibody B ”” and labeled with a labeling substance may be used. Examples of the “substance that binds to“ antibody B ”” include an antibody that specifically binds to the immunoglobulin according to the animal or class from which “antibody B” (immunoglobulin) is derived. For example, when “antibody B” is sheep-derived IgG, an anti-sheep IgG antibody can be used as “substance that binds to“ antibody B ””.
この標識物質を検出することによって、ステップ２で形成された「固相に固着された抗体Ａ−本発明複合体−抗体Ｂ」からなるサンドイッチ状複合体中に存在する「抗体Ｂ」を検知することができる。すなわち、当該サンドイッチ状複合体が検知されることとなる。
このような標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）など）、化学発光物質（ルミノールなど）、ビオチン、アビジン（ストレプトアビジンを含む）等が挙げられるが、通常タンパク質の標識に可能なものであれば、特に限定されない。標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等〔「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、１９８７年発行参照〕等から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのヒドラジド誘導体を用いる方法（Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, 57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994年発行参照）、またフルオレセインイソチオシアネートを使用する場合は特公昭６３−１７８４３号公報記載の方法等から適宜選択できる。
By detecting this labeling substance, “antibody B” present in the sandwich-like complex composed of “antibody A fixed to the solid phase—complex of the present invention—antibody B” formed in step 2 is detected. be able to. That is, the sandwich complex is detected.
Labeling substances used for such labeling include enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, luciferase, acetylcholinesterase, etc.), fluorescent dyes (fluorescein isothiocyanate (FITC), etc.), chemiluminescent substances (luminol, etc.) , Biotin, avidin (including streptavidin), and the like, but are not particularly limited as long as they are usually capable of labeling proteins. The labeling method is a known method suitable for the labeling substance, for example, glutaraldehyde method, periodate crosslinking method, maleimide crosslinking method, carbodiimide method, activated ester method, etc. ["Protein Chemistry (below)", Tokyo Chemical Dojin , Published in 1987] or the like. For example, when biotin is used as a labeling substance, a method using a hydrazide derivative of biotin (see Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, 57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994), or when using fluorescein isothiocyanate It can be suitably selected from the method described in JP-B-63-17843.
標識物質の検出は、用いた標識物質に応じて当業者が適宜検出方法を選択することができる。例えば、標識物質としてペルオキシダーゼを使用した場合には、当該酵素の基質としてテトラメチルベンジジン、o-フェニレンジアミン等の発色基質および過酸化水素水を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定することにより検出を行うことができる。また、蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。 The detection of the labeling substance can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the labeling substance used. For example, when peroxidase is used as a labeling substance, a coloring substrate such as tetramethylbenzidine or o-phenylenediamine and hydrogen peroxide solution are added as a substrate for the enzyme, and the degree of color development of the product by the enzyme reaction is determined by the absorbance. Detection can be performed by measuring the change. Moreover, when using a fluorescent substance and a chemiluminescent substance, the method etc. which measure the fluorescence and light emission of the solution after reaction are mentioned.
＜３＞本発明疾患検知方法
本発明疾患検知方法は、以下の（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法である。
ステップ（１）：本発明複合体検知方法を用いて、体液中に存在する本発明複合体を検知するステップ、及び
ステップ（２）：ステップ（１）における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。
以下、ステップごとに説明する。
ステップ（１）：本発明複合体検知方法を用いて、体液中に存在する本発明複合体を検知するステップである。
本発明疾患検知方法は、本発明複合体検知方法を疾患の検知方法に応用したものである。ステップ（１）における「本発明複合体検知方法」については、前記の「＜２＞本発明複合体検知方法」を参照されたい。ただし、ここでは「本発明複合体を含有している可能性がある試料」として「体液」を用いることとなる。ここで用いる「体液」は、疾患の検知対象となる動物由来のものである限りにおいて特に限定されない。疾患の検知対象となる動物も特に限定されないが、ヒト以外の動物、例えばマウス、ラット、家兎等を例示することができる。
また「体液」の種類については、含有される本発明複合体の量が疾患によって変動する体液である限りにおいて特に限定されないが、血液（血清や血漿を包含する概念である。）であることが好ましい。
<3> Disease Detection Method of the Present Invention The disease detection method of the present invention is a disease detection method including at least the following steps (1) and (2).
Step (1): a step of detecting the complex of the present invention present in a body fluid using the complex detection method of the present invention; and step (2): a step of associating the detection result in step (1) with a disease.
Hereinafter, each step will be described.
Step (1): This is a step of detecting the complex of the present invention present in the body fluid using the complex detection method of the present invention.
The disease detection method of the present invention is an application of the complex detection method of the present invention to a disease detection method. For the “invention complex detection method” in step (1), refer to the above “<2> invention complex detection method”. However, “body fluid” is used here as “a sample possibly containing the complex of the present invention”. The “body fluid” used here is not particularly limited as long as it is derived from an animal that is a disease detection target. An animal that is a disease detection target is not particularly limited, and examples thereof include animals other than humans, such as mice, rats, and rabbits.
The type of “body fluid” is not particularly limited as long as the amount of the complex of the present invention contained is a body fluid that varies depending on the disease, but it is blood (a concept including serum and plasma). preferable.
ステップ（２）は、ステップ（１）における検知結果と、疾患とを関連づけるステップである。これにより、疾患の検知を行うことができる。
前記の通り、本出願書類における「検知」の語は、定性的な検知のみならず、定量的な検知をも含む概念である。したがって、ここにいう「ステップ（１）における検知結果」は、体液中の本発明複合体の「存否や有無」（定性的な検知結果）であっても、「存在量や程度」（定量的な検知結果）であってもよい。また「存在量」や「程度」については、濃度既知のスタンダードを用いて作成した検量線や関係式等から求めた量（実測値）であっても良く、健常動物（疾患に罹患していない動物）に対する比（相対値）であっても良い。
そして、体液中における本発明複合体の量は疾患によって増加しうる。この場合において、体液中の当該複合体量が健常動物のそれに比して多い場合には、「疾患に罹患している」もしくは「疾患に罹患している可能性が高い」と関連づけることができる。体液中の当該複合体量が健常動物のそれと同等であれば、「疾患に罹患していない」もしくは「疾患に罹患している可能性は低い」と関連づけることができる。
Step (2) is a step of associating the detection result in step (1) with a disease. Thereby, a disease can be detected.
As described above, the term “detection” in the present application document is a concept that includes not only qualitative detection but also quantitative detection. Therefore, even if the “detection result in step (1)” here is “presence / absence / presence / absence” (qualitative detection result) of the complex of the present invention in body fluid, Detection result). The “abundance” and “degree” may be an amount (measured value) obtained from a calibration curve or a relational expression created using a standard of known concentration, and may be a healthy animal (not suffering from a disease). It may be a ratio (relative value) to (animal).
And the quantity of this invention complex in a bodily fluid may increase with a disease. In this case, if the amount of the complex in the body fluid is larger than that of the healthy animal, it can be related to “being affected by the disease” or “possibly affected by the disease”. . If the amount of the complex in the body fluid is equivalent to that of a healthy animal, it can be related to “not suffering from a disease” or “not likely to be suffering from a disease”.
また本発明疾患検知方法は、疾患への罹患の有無のみでなく、罹患の程度の検知も含まれる。例えば、ある動物の体液中の当該複合体量を定期的に測定し、当該複合体量が増加傾向にある場合には「疾患が進行している」もしくは「疾患が進行している可能性が高い」と関連づけることができる。逆に、測定された当該複合体量が減少傾向にある場合には、「疾患が改善方向にある」もしくは「疾患が改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。また測定された当該複合体量に変化がない場合には、「疾患の程度（または健常性）に変化がない」もしくは「疾患の程度（または健常性）に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。したがって、本発明疾患検知方法は、医薬品の候補物質の探索やその物質の有効性評価等の用途にも使用しうる。 The disease detection method of the present invention includes not only the presence / absence of disease, but also detection of the degree of disease. For example, when the amount of the complex in a body fluid of an animal is regularly measured and the amount of the complex tends to increase, “the disease is progressing” or “the disease may be progressing” High ”can be associated. On the other hand, when the measured amount of the complex tends to decrease, it can be associated with “the disease is in the improvement direction” or “the possibility that the disease is in the improvement direction”. In addition, when there is no change in the measured amount of the complex, it is said that “the degree of disease (or health) is not changed” or “the degree of disease (or health) is not likely to change”. Can be related. Therefore, the disease detection method of the present invention can also be used for applications such as searching for drug candidate substances and evaluating the effectiveness of the substances.
本発明疾患検知方法によって検知される「疾患」は、疾患により体液中の本発明複合体の量が変動する性質のものである限りにおいて特に限定されないが、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。
以上のように、本発明複合体検知方法を用いて体液中に存在する本発明複合体を検知し、その検知結果と疾患とを関連づけることによって、疾患を検知することができる。
The “disease” detected by the disease detection method of the present invention is not particularly limited as long as the amount of the complex of the present invention in a body fluid varies depending on the disease, but is selected from hyperlipidemia and arteriosclerosis. It is preferable that it is a thing.
As described above, a disease can be detected by detecting the complex of the present invention present in a body fluid using the complex detection method of the present invention and associating the detection result with the disease.
＜４＞本発明複合体検知キット
本発明複合体検知キットは、抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体を構成成分として少なくとも含む、本発明複合体の検知キットである。
ここで用いることができる抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体は、前記の「＜２＞本発明複合体検知方法」と同様である。この抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものが好ましい。ここで用いることができる固相及び抗体の固着の方法は、前記の「＜２＞本発明複合体検知方法」と同様である。
本発明複合体検知キットは、抗SAP抗体及び抗β2-GPI抗体を構成成分として含んでいる限りにおいて、さらに他の構成成分を含んでいてもよい。
本発明複合体検知キットに加えうる他の構成成分としては、標識物質の検出試薬、「抗SAP抗体又は抗β2-GPI抗体に結合し、かつ標識物質で標識された抗体（二次抗体）」等を例示することができる。これらの構成成分の他に、ブロッキング物質、洗浄液、試料希釈液、酵素反応停止液等を含んでいてもよい。
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明複合体検知方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。本発明複合体検知キットを用いた本発明複合体の検知は、本発明複合体検知方法に従って行うことができる。なかでも、サンドイッチ状複合体を形成させてこれを検知する方法（いわゆるサンドイッチ法；前記の「＜２＞本発明複合体検知方法」参照）において用いられることが好ましい。
<4> Complex Detection Kit of the Present Invention The complex detection kit of the present invention is a detection kit of the complex of the present invention containing at least an anti-SAP antibody and an anti-β 2 -GPI antibody as components.
The anti-SAP antibody and anti-β 2 -GPI antibody that can be used here are the same as those in the above-mentioned “<2> Complex detection method of the present invention”. The anti-SAP antibody or anti-β 2 -GPI antibody is preferably one in which either one is fixed to a solid phase. The solid phase and antibody fixing method that can be used here are the same as those described in the above-mentioned “<2> Complex detection method of the present invention”.
The complex detection kit of the present invention may further contain other components as long as it contains an anti-SAP antibody and an anti-β 2 -GPI antibody as components.
Other components that can be added to the complex detection kit of the present invention include a detection reagent for a labeling substance, “an antibody that binds to an anti-SAP antibody or anti-β 2 -GPI antibody and is labeled with a labeling substance (secondary antibody) And the like. In addition to these components, a blocking substance, a washing solution, a sample diluent, an enzyme reaction stop solution, and the like may be included.
These components can be stored in separate containers and stored as a kit that can be used according to the complex detection method of the present invention at the time of use. Detection of the complex of the present invention using the complex detection kit of the present invention can be performed according to the complex detection method of the present invention. Among them, it is preferably used in a method of forming a sandwich-like complex and detecting it (so-called sandwich method; see “<2> Complex Detection Method of the Present Invention” above).
＜５＞本発明疾患検知キット
本発明疾患検知キットは、本発明複合体検知キットからなる、疾患の検知キットである。本発明複合体検知キットについては、前記を参照されたい。
ここにいう「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。本発明疾患検知キットを用いた疾患の検知は、本発明疾患検知方法に従って行うことができる。
<5> Disease Detection Kit of the Present Invention The disease detection kit of the present invention is a disease detection kit comprising the complex detection kit of the present invention. See above for the complex detection kit of the present invention.
The “disease” here is preferably selected from hyperlipidemia and arteriosclerosis. Disease detection using the disease detection kit of the present invention can be performed according to the disease detection method of the present invention.
＜６＞本発明複合体２
本発明複合体２は、SAP/oxLDL複合体である。本発明複合体２は、SAP及びoxLDLの二者により構成されることを特徴とする。
本発明複合体２は、SAP及びoxLDLの両者を生理的条件下で接触させることにより製造することができる。SAP及びoxLDLは、それぞれ公知の方法で製造することができる。また市販のものを用いることもできる。
ここにいう「生理的条件」については、前記＜１＞と同様である。
また両者を接触させる際における各分子の量比も特に限定されず、当業者が適宜設定することができる。例えば、oxLDLとSAPの質量比として、oxLDL：SAP＝20：１〜１：10（好ましくは15：１〜１：５、より好ましくは12：１〜１：２）を例示することができる。この場合において、SAPは、終濃度0.1mM〜10mM程度（好ましくは0.5mM〜5mM程度）のカルシウムイオン存在下で接触させることが好ましい。
これらの接触時間、その他の点については前記＜１＞と同様である。
本発明複合体２は、例えば、本発明複合体検知方法２、本発明疾患検知方法２、本発明複合体検知キット２及び本発明疾患検知キット２等のスタンダードとして使用することができる。例えば本発明複合体２を用いて、これらの検知方法又は検知キットによる本発明複合体２の検知の品質をチェックすることができる。また例えば、既知濃度の本発明複合体２とELISAによるその検知結果との関係について検量線や関係式を作成すれば、試料中に含まれる未知濃度の本発明複合体２を定量することもできる。もちろん、本発明複合体２を、本発明の各キットの構成成分として用いることもできる。
<6> Invention complex 2
The complex 2 of the present invention is an SAP / oxLDL complex. The complex 2 of the present invention is characterized by being composed of two members, SAP and oxLDL.
The complex 2 of the present invention can be produced by bringing both SAP and oxLDL into contact under physiological conditions. SAP and oxLDL can be produced by known methods, respectively. Commercially available products can also be used.
The “physiological conditions” here are the same as in the above <1>.
In addition, the amount ratio of each molecule when contacting them is not particularly limited, and can be appropriately set by those skilled in the art. For example, oxLDL: SAP = 20: 1 to 1:10 (preferably 15: 1 to 1: 5, more preferably 12: 1 to 1: 2) can be exemplified as the mass ratio of oxLDL and SAP. In this case, SAP is preferably contacted in the presence of calcium ions having a final concentration of about 0.1 mM to 10 mM (preferably about 0.5 mM to 5 mM).
The contact time and other points are the same as in the above <1>.
The complex 2 of the present invention can be used as a standard for the complex detection method 2, the disease detection method 2, the complex detection kit 2, the disease detection kit 2, and the like of the present invention. For example, the quality of detection of the complex 2 of the present invention by these detection methods or detection kits can be checked using the complex 2 of the present invention. Further, for example, if a calibration curve or a relational expression is created for the relationship between the complex 2 of the present invention 2 and the detection result by ELISA, the complex 2 of the present invention contained in the sample can be quantified. . Of course, this invention composite body 2 can also be used as a component of each kit of this invention.
＜７＞本発明複合体検知方法２
本発明複合体検知方法２は、本発明複合体２を含有している可能性がある試料に、抗SAP抗体及び抗oxLDL抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含む、本発明複合体２の検知方法である。
「本発明複合体２を含有している可能性がある試料」、「試料」等についての説明は、前記＜２＞と同様である。
本発明複合体検知方法２は、このような試料に、抗SAP抗体及び抗oxLDL抗体の少なくとも一方を接触させるステップを含むことを特徴とする。
なお、抗oxLDL抗体は、oxLDLに結合する抗体である限りにおいて特に限定されない。oxLDLを抗原として、抗体の通常の作製方法に従ってモノクローナル抗体やポリクローナル抗体を作製することができる。なかでも、マウスモノクローナル抗ｏｘＬＤＬ抗体を用いることが好ましい。
他の説明は、前記＜２＞と同様である。
<7> Method 2 for detecting the complex of the present invention
The complex detection method 2 of the present invention includes the step of bringing the sample possibly containing the complex 2 of the present invention into contact with at least one of an anti-SAP antibody and an anti-oxLDL antibody. Is the method.
The description of the “sample that may contain the complex 2 of the present invention”, “sample”, and the like is the same as in the above <2>.
The complex detection method 2 of the present invention includes a step of bringing such a sample into contact with at least one of an anti-SAP antibody and an anti-oxLDL antibody.
The anti-oxLDL antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that binds to oxLDL. Using oxLDL as an antigen, monoclonal antibodies and polyclonal antibodies can be prepared according to a conventional antibody production method. Of these, it is preferable to use a mouse monoclonal anti-oxLDL antibody.
Other explanations are the same as in the above <2>.
本発明複合体検知方法２の一例として、本発明複合体２を含有している可能性がある試料に、抗SAP抗体及び抗oxLDL抗体を接触させて、「抗SAP抗体−本発明複合体２−抗oxLDL抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させるステップを含む、本発明複合体２の検知方法を挙げることができる。本発明複合体検知方法２における抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体は、そのいずれか一方が固相に固着されているものであることが好ましい。 As an example of the complex detection method 2 of the present invention, an anti-SAP antibody and an anti-oxLDL antibody are contacted with a sample that may contain the complex 2 of the present invention, and “anti-SAP antibody-present complex 2” is obtained. Examples include a method for detecting the complex 2 of the present invention, which includes the step of forming a sandwich complex composed of “anti-oxLDL antibody”. It is preferable that one of the anti-SAP antibody and the anti-oxLDL antibody in the complex detection method 2 of the present invention is fixed to a solid phase.
また本発明複合体検知方法２の一例として、以下の（１）〜（３）のステップを少なくとも含む、本発明複合体２の検知方法も挙げることができる；
ステップ（１）：抗体Ｃが固着された固相に、本発明複合体２を含有している可能性がある試料を接触させて「固相に固着された抗体Ｃ−本発明複合体２」で示される第１複合体を形成させるステップ、
ステップ（２）：ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｄを接触させ、「固相に固着された抗体Ｃ−本発明複合体２−抗体Ｄ」で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び
ステップ（３）：ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップ。
（ただし、抗体Ｃは抗ＳＡＰ抗体及び抗ｏｘＬＤＬ抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｄは他方の抗体をそれぞれ示す。）。
これらの説明は、前記＜２＞と同様である。前記＜２＞における「抗体Ａ」及び「抗体Ｂ」を、それぞれ「抗体Ｃ」及び「抗体Ｄ」と読み替えて理解されたい。また前記＜２＞における「抗β2-GPI抗体」は「抗oxLDL抗体」と読み替えて理解されたい。
In addition, as an example of the complex detection method 2 of the present invention, a detection method of the complex 2 of the present invention including at least the following steps (1) to (3) can also be mentioned:
Step (1): A sample that may contain the complex 2 of the present invention is brought into contact with the solid phase to which the antibody C is immobilized, and “Antibody C immobilized on the solid phase—the complex 2 of the present invention” Forming a first complex represented by:
Step (2): The antibody D is brought into contact with the first complex formed in Step 1 to form a sandwich-like complex represented by “Antibody C immobilized on a solid phase—the complex of the present invention 2—the antibody D”. And step (3): detecting the sandwich-like complex formed in step 2.
(However, antibody C represents one of anti-SAP antibody and anti-oxLDL antibody, and antibody D represents the other antibody).
These descriptions are the same as in the above <2>. It should be understood that “antibody A” and “antibody B” in the above <2> are read as “antibody C” and “antibody D”, respectively. The “anti-β 2 -GPI antibody” in the above <2> should be understood as “anti-oxLDL antibody”.
＜８＞本発明疾患検知方法２
本発明疾患検知方法２は、以下の（１）及び（２）のステップを少なくとも含む、疾患の検知方法である。
ステップ（１）：本発明複合体検知方法２を用いて、体液中に存在する本発明複合体２を検知するステップ、及び
ステップ（２）：ステップ（１）における検知結果と、疾患とを関連づけるステップ。
本発明疾患検知方法２についての説明は、前記＜３＞と同様である。
<8> Disease detection method 2 of the present invention
The disease detection method 2 of the present invention is a disease detection method including at least the following steps (1) and (2).
Step (1): Step of detecting the complex 2 of the present invention present in a body fluid using the complex detection method 2 of the present invention; and Step (2): correlating the detection result in step (1) with a disease. Step.
The description of the disease detection method 2 of the present invention is the same as in <3> above.
＜９＞本発明複合体検知キット２
本発明複合体検知キット２は、抗SAP抗体及び抗oxLDL抗体を構成成分として少なくとも含む、本発明複合体２の検知キットである。
本発明複合体検知キット２についての説明は、前記＜４＞と同様である。なお前記＜４＞における「抗β2-GPI抗体」は「抗oxLDL抗体」と読み替えて理解されたい。
<9> The complex detection kit 2 of the present invention
The complex detection kit 2 of the present invention is a detection kit of the complex 2 of the present invention, which contains at least anti-SAP antibody and anti-oxLDL antibody as components.
The description of the complex detection kit 2 of the present invention is the same as the above <4>. The “anti-β 2 -GPI antibody” in the above <4> should be understood as “anti-oxLDL antibody”.
＜１０＞本発明疾患検知キット２
本発明疾患検知キット２は、本発明複合体検知キット２からなる、疾患の検知キットである。本発明複合体検知キット２については、前記を参照されたい。
ここにいう「疾患」は、高脂血症及び動脈硬化から選択されるものであることが好ましい。本発明疾患検知キット２を用いた疾患の検知は、本発明疾患検知方法２に従って行うことができる。
<10> Disease detection kit 2 of the present invention
The disease detection kit 2 of the present invention is a disease detection kit comprising the complex detection kit 2 of the present invention. Please refer to the above for the complex detection kit 2 of the present invention.
The “disease” here is preferably selected from hyperlipidemia and arteriosclerosis. Disease detection using the disease detection kit 2 of the present invention can be performed according to the disease detection method 2 of the present invention.
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
SAP/oxLDL/β2-GPI複合体の調製と測定系の確立
＜材料及び方法＞
（１）高脂血症モデルマウス（LDLR-/-、apoE-/-）
本実施例では、動脈硬化好発・高脂血症モデルマウスとして、LDLR-/- マウス及びapoE-/- マウス（C57BL/6マウス バックグラウンド；米国Jackson社より購入）を用いた。これらはそれぞれ、LDL代謝に関わる受容体（LDLR）やリガンド（apoE）を欠損させたマウスである。マウスの血中にはLDLがほとんど存在しないため、本来動脈硬化と無縁の動物であるが、これらの高脂血症モデルマウスは、LDLの前駆体であるカイロミクロンレムナントやIDL（intermediate (low)-density lipoprotein）が肝臓や組織に取り込まれなくなり、LDLを血中に滞留させることが可能となる。よって、これらのLDLR-/- マウス及びapoE-/- マウスに高脂肪食を負荷し、血中コレステロールを上昇させることによって、高脂血症および動脈硬化を容易に発症させることができる（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98, p7946-51（2001）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, p4431-5（1994））。
Preparation of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex and establishment of measurement system <Materials and methods>
(1) Hyperlipidemia model mice (LDLR-/-, apoE-/-)
In this example, LDLR − / − mice and apoE − / − mice (C57BL / 6 mouse background; purchased from Jackson, USA) were used as arteriosclerosis-prone hyperlipidemia model mice. These are mice deficient in receptors (LDLR) and ligands (apoE) involved in LDL metabolism. Since LDL is hardly present in the blood of mice, these animals are essentially unrelated to arteriosclerosis, but these hyperlipidemic model mice are the precursors of LDL, chylomicron remnants and IDL (intermediate (low) -density lipoprotein) is not taken up by the liver and tissues, and LDL can stay in the blood. Therefore, hyperlipidemia and arteriosclerosis can be easily developed by loading these LDLR − / − mice and apoE − / − mice with a high fat diet and increasing blood cholesterol (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, p7946-51 (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, p4431-5 (1994)).
（２）マウスおよびヒトoxLDLの調製
高脂肪食（オリエンタル酵母（株））を２週間負荷したLDLR-/- 又は apoE-/-高脂血症モデルマウス血漿、あるいはヒト新鮮血漿に終濃度0.25 mM となるように200 mM EDTAを添加し、EDTA含有血漿とした。３ml用の超遠心管（3.5 PC, Beckman, fullerton, CA）にそのEDTA含有血漿750μlを添加し、PBS（0.25 mM EDTA含有）250μlを重層し、100,000 rpm、10℃で７分間遠心分離を行った（TL-100ローター；TLA100.3, Beckman）。その後、上清250μlを除去し、PBS（0.25 mM EDTA含有）を250μl重層して、さらに同条件で2.5時間遠心を行った。その後、上清250μlを除去し、KBrを含有するPBS 150μlを添加して混和した。その後、同条件で５時間遠心分離し、上清200μlを回収してLDL画分とした。得られたLDL画分を、PBS（1mM EDTA含有）に対して一晩透析した後、酸化させた。
(2) Preparation of mouse and human oxLDL LDLR-/-or apoE-/-hyperlipidemia model mouse plasma loaded with high-fat diet (Oriental Yeast Co., Ltd.) for 2 weeks, or fresh human plasma to a final concentration of 0.25 mM 200 mM EDTA was added to obtain EDTA-containing plasma. Add 750 μl of the EDTA-containing plasma to a 3 ml ultracentrifuge tube (3.5 PC, Beckman, fullerton, Calif.), Overlay 250 μl of PBS (containing 0.25 mM EDTA), and centrifuge at 100,000 rpm for 7 minutes at 10 ° C. (TL-100 rotor; TLA100.3, Beckman). Thereafter, 250 μl of the supernatant was removed, 250 μl of PBS (containing 0.25 mM EDTA) was overlaid, and further centrifuged for 2.5 hours under the same conditions. Thereafter, 250 μl of the supernatant was removed, and 150 μl of PBS containing KBr was added and mixed. Thereafter, the mixture was centrifuged for 5 hours under the same conditions, and 200 μl of the supernatant was collected to obtain an LDL fraction. The obtained LDL fraction was dialyzed overnight against PBS (containing 1 mM EDTA) and then oxidized.
LDLの酸化は、終濃度100μg/mlのLDLを、５μM 硫酸銅の存在下で37℃でインキュベーションすることにより行った。インキュベーションを開始して12時間後に、EDTAを終濃度1mMとなるように添加して、酸化反応を停止させた。酸化後の画分を、PBS（1mM EDTA含有）に対して透析し、その後濃縮して、thiobarbituric acid reactive substance（TBARS）で酸化度を確認した（J. Lipid Res., 28, p495-509（1987））。 The oxidation of LDL was carried out by incubating LDL at a final concentration of 100 μg / ml at 37 ° C. in the presence of 5 μM copper sulfate. Twelve hours after the start of incubation, EDTA was added to a final concentration of 1 mM to stop the oxidation reaction. The oxidized fraction was dialyzed against PBS (containing 1 mM EDTA), then concentrated, and the degree of oxidation was confirmed with thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) (J. Lipid Res., 28, p495-509 ( 1987)).
（３）抗体（抗β2-GPI抗体）
抗β2-GPI抗体として、「WB-CAL-1」（IgG2a,κ）を用いた。この抗体はβ2-GPI反応性のモノクローナル自己抗体である。抗リン脂質抗体症候群モデルマウス（NZW x BXSBマウス）由来の抗体であり、遊離のβ2-GPIには反応せず、oxLDLと複合体を形成したβ2-GPIに反応性を示す抗体である。本抗体は複合体型のヒトおよびマウスβ2-GPIを認識する（Immunol., 149, p1063-1068(1992)）。
(3) Antibody (anti-β 2 -GPI antibody)
“WB-CAL-1” (IgG2a, κ) was used as an anti-β 2 -GPI antibody. This antibody is a β 2 -GPI-reactive monoclonal autoantibody. An anti-phospholipid antibody syndrome model mice (NZW x BXSB mice) from the antibody, the free beta 2 -GPI not react, is an antibody reactive with beta 2 -GPI forming a oxLDL complexes . This antibody recognizes complex human and mouse β 2 -GPI (Immunol., 149, p1063-1068 (1992)).
（４）ELISA（マウスおよびヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体のアッセイ方法）
まず、Immulon 2HB プレート（Thermo Labsystems）に、８μg/mlのWB-CAL-1を50μl/ウェルで添加し、４℃で一晩インキュベートすることによってWB-CAL-1をプレートに固相化した。固相化後、0.05% Tween20を含有するTBS（1.25mM Ca2＋含有）を200μl/ウェル添加し、プレートを洗浄した。洗浄は３回行った。
次いで、0.5% BSAを含有するTBS（1.25 mM Ca2＋含有）でプレートをブロッキングした。プレートを上記と同様に洗浄後、適当な倍率に希釈したサンプルを各ウェルに添加して、27℃で一晩インキュベートした。その後、上記と同様に洗浄した。
(4) ELISA (mouse and human SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex assay method)
First, 8 μg / ml WB-CAL-1 was added at 50 μl / well to an Immulon 2HB plate (Thermo Labsystems), and incubated at 4 ° C. overnight to immobilize WB-CAL-1 on the plate. After immobilization, 200 μl / well of TBS (containing 1.25 mM Ca 2+ ) containing 0.05% Tween 20 was added, and the plate was washed. Washing was performed 3 times.
The plate was then blocked with TBS containing 0.5% BSA (containing 1.25 mM Ca 2+ ). After washing the plate as described above, a sample diluted to an appropriate magnification was added to each well and incubated overnight at 27 ° C. Then, it wash | cleaned similarly to the above.
次いで、10000倍に希釈したヒツジ抗マウスSAP抗体(あるいは家兎抗ヒトSAP抗体)溶液を100μl/ウェル添加して、室温で１時間インキュベートした。その後、上記と同様に洗浄した。
次いで、4000倍に希釈したHRP標識抗ヒツジIgG抗体（あるいは抗家兎IgG抗体）溶液を100μl/ウェル添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、同様に洗浄した。
次いで、o-PD試薬溶液（o-phenylenediamine dihydrochloride ４mg/10ml 0.1 M クエン酸緩衝液（pH5.0）及び10μl 30％ H2O2）を各ウェルに100μlずつ添加し、室温で20分間インキュベートした。その後、１Ｍ H2SO4 を100μl/ウェル添加して反応を停止させ、490nmで吸光度を測定した。
Subsequently, a sheep anti-mouse SAP antibody (or rabbit anti-human SAP antibody) solution diluted 10,000 times was added at 100 μl / well and incubated at room temperature for 1 hour. Then, it wash | cleaned similarly to the above.
Subsequently, an HRP-labeled anti-sheep IgG antibody (or anti-rabbit IgG antibody) solution diluted 4000 times was added at 100 μl / well and incubated at room temperature for 1 hour. Then, it washed similarly.
Next, 100 μl of o-PD reagent solution (o-phenylenediamine dihydrochloride 4 mg / 10 ml 0.1 M citrate buffer (pH 5.0) and 10 μl 30% H 2 O 2 ) was added to each well and incubated at room temperature for 20 minutes. . Thereafter, 1 MH 2 SO 4 was added at 100 μl / well to stop the reaction, and the absorbance was measured at 490 nm.
（５）マウスおよびヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の調製と、当該複合体の標準曲線作成
まず、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体の標準品を調製した。調製は次の通り行った。まずＰＢＳ中でマウスあるいはヒト由来のoxLDLとβ2-GPIを質量比１：１となるように混合し、37℃で一晩インキュベートした。その後、その複合体溶液に終濃度1mMとなるようにカルシウムイオンを添加し、これにマウスあるいはヒト由来のSAPを、oxLDL/β2-GPI複合体：SAPの質量比10：１となるように混合し、37℃で一晩インキュベートした。なお、複合体の最終濃度は、oxLDLとして0.1 mg/mlとなるように調製した。
これにより得られたマウスあるいはヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を段階的に希釈して、前記のELISAにより490nmの吸光度を測定した。対照として、oxLDL/β2-GPI複合体及びSAPを同様に段階的に希釈して、上記複合体と同時に測定した。マウスあるいはヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の濃度とその測定結果との関係について、標準曲線を作成した。
(5) Preparation of mouse and human SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex and creation of standard curve of the complex First, a standard product of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex was prepared. The preparation was performed as follows. First, oxLDL derived from mouse or human and β 2 -GPI were mixed at a mass ratio of 1: 1 in PBS and incubated overnight at 37 ° C. Thereafter, calcium ions are added to the complex solution to a final concentration of 1 mM, and mouse or human-derived SAP is added thereto so that the mass ratio of oxLDL / β 2 -GPI complex: SAP is 10: 1. Mix and incubate overnight at 37 ° C. The final concentration of the complex was adjusted to 0.1 mg / ml as oxLDL.
The mouse or human SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex thus obtained was diluted stepwise and the absorbance at 490 nm was measured by the ELISA described above. As a control, oxLDL / β 2 -GPI complex and SAP were serially diluted and measured simultaneously with the complex. A standard curve was created for the relationship between the concentration of the mouse or human SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex and the measurement results.
（６）マウスSAP/oxLDL/β2-GPI複合体形成の経時変化
マウスoxLDL/β2-GPI複合体（質量比４：１で混合し、37℃で一晩インキュベートしたもの）に、SAPをカルシウムイオン存在下で混合（oxLDL/β2-GPI複合体：SAPの質量比＝20：１）し、37℃で反応を開始させた。反応開始後、１時間目、２時間目、４時間目及び８時間目にサンプルを一定量ずつ採取し、−80℃で凍結保存することによって反応を停止させた。残りのサンプルはそのまま反応を続行し、反応開始後24時間目に反応を停止させた。
マウスSAP/oxLDL/β2-GPI複合体形成の経時変化を調べるために、このサンプルをELISA及び電気泳動で確認した。ELISAの方法は前記の通りである。
また電気泳動は、サンプルをアガロースゲルフィルム（ヘレナ研究所）に6〜7μgスポットし、0.05 M バルビタール緩衝液（pH8.6）中で90Ｖ、40分間で泳動を行った。染色は脂質染色とタンパク質染色の二通り行った。脂質染色にはFat Red 7B（Sigma-Aldrich）を、タンパク質染色にはAmido Black 10B（ナカライテスク）を用いた。
(6) Time course of mouse SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex formation SAP was added to mouse oxLDL / β 2 -GPI complex (mixed at a mass ratio of 4: 1 and incubated overnight at 37 ° C.). The mixture was mixed in the presence of calcium ion (oxLDL / β 2 -GPI complex: SAP mass ratio = 20: 1), and the reaction was started at 37 ° C. After the start of the reaction, a certain amount of sample was taken at 1 hour, 2 hours, 4 hours and 8 hours, and the reaction was stopped by freezing at -80 ° C. The remaining sample continued the reaction, and was stopped 24 hours after the start of the reaction.
In order to examine the time course of mouse SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex formation, this sample was confirmed by ELISA and electrophoresis. The ELISA method is as described above.
Electrophoresis was performed by spotting the sample on an agarose gel film (Helena Laboratories) at 6 to 7 μg and running in 0.05 M barbital buffer (pH 8.6) at 90 V for 40 minutes. Staining was performed in two ways: lipid staining and protein staining. Fat Red 7B (Sigma-Aldrich) was used for lipid staining, and Amido Black 10B (Nacalai Tesque) was used for protein staining.
（７）高脂肪食負荷マウス血清中からの複合体検出
LDLR-/-高脂血症モデルマウス27匹に高脂肪食を２週間与え、その後全採血した。採取した血液をヘパリンを添加したチューブに回収し、10,000rpm、４℃で10分間の遠心分離することにより血漿を分離し、これをサンプルとして前記のELISAによりSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を定量した。また、コントロールとしては、BALB/cマウス及びC57BL/6マウスの血清を用いた。
(7) Complex detection from serum of mice loaded with high-fat diet
Twenty-seven LDLR-/-hyperlipidemic model mice were fed a high fat diet for 2 weeks, after which all blood was collected. The collected blood is collected in a tube to which heparin has been added, and plasma is separated by centrifugation at 10,000 rpm, 4 ° C. for 10 minutes, and this is used as a sample for the SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex by the ELISA described above. Was quantified. As controls, sera from BALB / c mice and C57BL / 6 mice were used.
（８）測定系の信頼性確認試験
（希釈直線性試験）
高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウス（Apoe-/-マウス及びLDLR-/-マウス）から採取した血漿サンプルのうち、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体がポジティブであるサンプルを段階的に希釈して、前記のELISAでSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を測定した。希釈倍率と測定値との相関関係を調べ、濃度依存的かつ正確に定量できているかどうかを調べた。
(8) Measurement system reliability confirmation test (dilution linearity test)
Out of the plasma samples collected from hyperlipidemia model mice (Apoe-/-mice and LDLR-/-mice) loaded with a high-fat diet, samples that were positive for SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex were staged The SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex was measured by ELISA described above. The correlation between the dilution rate and the measured value was examined, and it was examined whether or not the concentration could be accurately determined in a concentration-dependent manner.
（添加回収試験）
SAP/oxLDL/β2-GPI複合体の標準品（濃度既知）を、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体がネガティブである血清（BALB/cマウス由来）を用いて段階的に希釈した。このサンプル中のSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を前記のELISAで測定し、期待された量が検出されるか否かを確かめるため、回収率を算出した。
(Additive recovery test)
A standard product of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex (concentration known) was serially diluted with serum (derived from BALB / c mice) that is negative for SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex. The SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex in this sample was measured by the above-mentioned ELISA, and the recovery rate was calculated to confirm whether the expected amount was detected.
（同時再現性試験）
高脂肪食負荷高脂血症モデルマウスにおけるSAP/oxLDL/β2-GPI複合体がポジティブである血漿サンプルを用いて、同一サンプルを同時に10ウェル分、前記のELISAに付することによってSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を測定した。それぞれの測定値のＣＶ（変動係数）を算出することにより、それぞれの各測定値における平均値からのばらつきを調べた。
(Simultaneous reproducibility test)
Using plasma samples positive for SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex in high fat diet-loaded hyperlipidemia model mice, SAP / oxLDL by subjecting the same sample to the above ELISA simultaneously for 10 wells The / β 2 -GPI complex was measured. By calculating CV (coefficient of variation) of each measured value, variation from the average value in each measured value was examined.
＜結果＞
（１）マウスSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の標準曲線
マウスSAP/oxLDL/β2-GPI複合体、マウスoxLDL/β2-GPI複合体、マウスSAP単独の三種類を段階希釈していき、測定した。結果を図１に示す。なお図１中の黒四角印はSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の測定値（対数値）を、白四角印はoxLDL/β2-GPI複合体の測定値を、三角印はSAP単独の測定値をそれぞれ示す。なお、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体濃度はLDLタンパク質相当濃度として表した。
図１から明かな通り、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体の濃度と測定値は、両対数グラフにおいて良好な直線性が確認され、標準曲線を描くことができた。また、本測定系においてoxLDL/β2-GPI複合体とSAP単独との交差反応性は見られなかった。よって、本測定系において、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体を特異的に検出できることが示された。
<Result>
(1) mouse SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex standard curve mouse SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex of mouse oxLDL / β 2 -GPI complex, three kinds of mouse SAP alone were serially diluted I measured it. The results are shown in FIG. The black squares in Fig. 1 indicate the measured values (logarithmic values) of the SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex, the white squares indicate the measured values of the oxLDL / β 2 -GPI complex, and the triangles indicate SAP alone. The measured values are shown respectively. The SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex concentration was expressed as the LDL protein equivalent concentration.
As is clear from FIG. 1, the concentration and the measured value of the SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex showed good linearity in a log-log graph, and a standard curve could be drawn. In this measurement system, no cross-reactivity between oxLDL / β 2 -GPI complex and SAP alone was observed. Therefore, it was shown that the SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex can be specifically detected in this measurement system.
（２）SAP/oxLDL/β2-GPI複合体形成の経時変化
SAP/oxLDL/β2-GPI複合体形成の経時変化を観察するために、複合体形成の反応時間を変化させて調製したサンプルについて、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体をELISA及び電気泳動で確認した。ELISAの結果を図２に、電気泳動の結果を図３にそれぞれ示す。なお図３中の（ａ）はFat Red 7Bによる染色結果を、（ｂ）はAmide Blackによる染色結果をそれぞれ示す。また図３では、比較のため、oxLDLとoxLDL/β2-GPIについても同時に泳動した。
図２から、反応時間の経過とともにSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の濃度が上昇（複合体形成が進行）していることがわかる。
(2) Time course of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex formation
In order to observe the time course of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex formation, SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex was subjected to ELISA and electrophoresis for samples prepared by varying the complex formation reaction time. Confirmed with. The results of ELISA are shown in FIG. 2, and the results of electrophoresis are shown in FIG. 3A shows the result of staining with Fat Red 7B, and FIG. 3B shows the result of staining with Amide Black. In FIG. 3, oxLDL and oxLDL / β 2 -GPI were also migrated at the same time for comparison.
FIG. 2 shows that the concentration of the SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex increases (complex formation proceeds) as the reaction time elapses.
図３に関し、電気泳動では、oxLDLにβ2-GPIが結合すると陰性荷電が消失し、oxLDL単独のものと比べて移動度が減少することが知られている。このoxLDL/β2-GPI複合体にさらにSAPが結合することによる移動度の変化によって、複合体形成の経時的変化を調べた。その結果、脂質を染色するFat Red 7B染色、タンパク質を染色するAmide Black染色の両染色において、反応時間の経過とともに陽極方向への泳動距離が次第に減少することが示された（図３の右側が陽極である）。したがって、複合体の形成に伴ってoxLDLの陰性荷電が消失していくことが示された。また、Amide Black染色においては、中央付近に太いバンドが二本確認されたが、これはもともとSAP（試薬）中に補体成分C3が存在しており、それが検出されたものと考えられる。 With respect to FIG. 3, it is known in electrophoresis that when β 2 -GPI binds to oxLDL, the negative charge disappears and the mobility decreases compared to that of oxLDL alone. The time course of complex formation was examined by the change in mobility due to SAP binding to the oxLDL / β 2 -GPI complex. As a result, it was shown that the migration distance toward the anode gradually decreased with the passage of reaction time in both staining of Fat Red 7B staining for staining lipids and Amide Black staining for staining proteins (the right side of FIG. 3 shows The anode). Therefore, it was shown that the negative charge of oxLDL disappears with the formation of the complex. In Amide Black staining, two thick bands were confirmed near the center. This is probably because the complement component C3 was originally present in the SAP (reagent) and was detected.
（３）高脂肪食負荷（High fat fed）マウス（16周齢〜24週齢）におけるSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の検出
高脂肪食を２週間負荷したLDLR-/-マウス（high fat fed LDLR-/-マウス）から採取した血漿並びに同週齢のBALB/cマウス及びC57BL/6マウスの血清（いずれもコントロール）をサンプルとして、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体をELISAで測定した。尚、当該週齢の高脂血症モデルマウスで、動脈硬化巣（プラーク）の増加が観察でき始めている。結果を図４に示す。
図４より、高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウス（high fat fed LDLR-/-マウス）のサンプルにおいて、数値の高いものがいくつか観察された。このサンプルにおけるSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の濃度の平均値もコントロール群より高いため、高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウスにSAP/oxLDL/β2-GPI複合体が存在している可能性が示唆された。
(3) Detection of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex in high fat fed mice (16 to 24 weeks old) LDLR-/-mice loaded with high fat diet for 2 weeks (high fat fed LDLR-/-mice) and serum of BALB / c mice and C57BL / 6 mice of the same age (both controls), and SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex by ELISA It was measured. In addition, an increase in arteriosclerotic lesion (plaque) is beginning to be observed in the hyperlipidemic model mouse of the age. The results are shown in FIG.
As shown in FIG. 4, several samples with high numerical values were observed in the samples of hyperlipidemia model mice (high fat fed LDLR − / − mice) loaded with a high fat diet. Since the average concentration of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex in this sample is higher than that in the control group, SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex is present in hyperlipidemia model mice loaded with a high fat diet. It was suggested that it might be.
（４）測定系の信頼性試験
ELISA測定系の信頼性を確認するため、以下の試験を行ったところ、いずれも良好な結果が得られ、本測定系の信頼性が確認された。
(4) Measurement system reliability test
In order to confirm the reliability of the ELISA measurement system, the following tests were performed. All of the results were satisfactory and the reliability of the present measurement system was confirmed.
（希釈直線性試験）
結果を図５に示す。希釈率と測定値との間の相関性を調べた結果、全てのサンプルにおいて相関係数（R2値）が１に近い結果を示し、良好な直線関係が認められた。
(Dilution linearity test)
The results are shown in FIG. As a result of examining the correlation between the dilution rate and the measured value, the correlation coefficient (R 2 value) was close to 1 in all the samples, and a good linear relationship was recognized.
（添加回収試験）
結果を表１に示す。なお回収率（Recovery）は、以下に示す２通りの計算方法で算出し、それぞれ「Recovery 1」及び「Recovery 2」とした。なお以下の「Ａ」〜「Ｅ」は、それぞれ表１中に「Ａ」〜「Ｅ」として示した部分の数値を意味する。
Recovery 1（Ｄ）＝ （（Ａ−Ｂ）／Ｃ）×１００
Recovery 2（Ｅ）＝ （Ａ／（Ｂ＋Ｃ））×１００
その結果、回収率がほぼ100％に近い値を示していたことから、本ELISA測定系によって、期待された量を測定できていることが示された。
(Additive recovery test)
The results are shown in Table 1. The recovery rate (Recovery) was calculated by the following two calculation methods, which were “Recovery 1” and “Recovery 2”, respectively. The following “A” to “E” mean the numerical values of the portions indicated as “A” to “E” in Table 1, respectively.
Recovery 1 (D) = ((A−B) / C) × 100
Recovery 2 (E) = (A / (B + C)) × 100
As a result, the recovery rate was close to 100%, indicating that the expected amount could be measured by this ELISA measurement system.
（同時再現試験）
結果を表２に示す。ＣＶ（変動係数）は、個々の測定値の平均値からのばらつきを示すものであり、一般にＣＶ値が10％以内に収まれば良好な結果とされる。表２より、いずれのサンプルについてもＣＶ値は10％以内に収まっており、良好な結果が得られた。
(Simultaneous reproduction test)
The results are shown in Table 2. CV (coefficient of variation) indicates a variation from the average value of individual measured values, and generally a good result is obtained when the CV value is within 10%. From Table 2, the CV value was within 10% for any sample, and good results were obtained.
SAP/oxLDL/β2-GPI複合体の動脈硬化マーカーとしての可能性評価
＜材料及び方法＞
（１）マウスにおける血中動態
C57BL/6マウスの静脈に、既知量（LDLタンパク質相当濃度として0.8μg/ml）のSAP/oxLDL/β2-GPI複合体200 mlを投与し、時間経過とともに眼底より採血して遠心により血漿を回収し、ELISAによりSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を測定した。
Possibility evaluation of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex as an arteriosclerosis marker <Materials and methods>
(1) Blood dynamics in mice
200 ml of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex with a known amount (0.8 μg / ml as LDL protein equivalent concentration) is administered into the vein of C57BL / 6 mice, and blood is collected from the fundus over time and plasma is collected by centrifugation. The SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex was collected by ELISA.
（２）経時変化
10週齢のオス LDLR-/-マウス３匹を用いて試験した。事前に採血した後、このモデルマウスに高脂肪食を負荷した。その後、12週齢目、14週齢目及び16週齢目に採血し、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体をELISAにより測定した。
また別途、５週齢のオス LDLR-/-マウス６匹を用いて試験した。事前に採血した後、このモデルマウスに高脂肪食を負荷した。その後、10週齢目、15週齢目及び20週齢目に採血し、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体をELISAにより測定した。
その他の材料及び方法は、実施例１と同様である。
(2) Change with time
The test was conducted using three 10-week-old male LDLR-/-mice. After blood collection in advance, the model mice were loaded with a high fat diet. Thereafter, blood was collected at 12, 14, and 16 weeks of age, and the SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex was measured by ELISA.
Separately, 6 male 5-week-old LDLR-/-mice were used for the test. After blood collection in advance, the model mice were loaded with a high fat diet. Thereafter, blood was collected at 10, 15, and 20 weeks of age, and the SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex was measured by ELISA.
Other materials and methods are the same as in Example 1.
＜結果＞
（１）マウスにおけるSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の血中動態
結果を図６及び図７に示す。なお図６及び図７は、別個独立に試験した結果である。
図６及び図７より、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体は、投与から数分のうちに血中から消失することが示された。したがって、高脂肪食を負荷した高脂血症モデルマウス（血中から複合体が検出される）においては、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体が炎症部位（動脈硬化巣）から連続的に血中に供給されていることが示唆された（但し、絶対血中濃度は、投与の手技によって異なる）。
<Result>
(1) Blood kinetics of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex in mice The results are shown in FIG. 6 and FIG. 6 and 7 show the results of independent testing.
6 and 7 show that the SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex disappears from the blood within a few minutes after administration. Therefore, in hyperlipidemic model mice loaded with a high-fat diet (complexes are detected in the blood), the SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex continues from the inflamed site (arteriosclerotic lesion). It was suggested that the blood was supplied (however, the absolute blood concentration varies depending on the administration procedure).
（２）LDLR-/-マウスにおけるSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の経時変化
10週齢のマウスを用いた結果（平均値）を図８に、５週齢のマウスを用いた結果（平均値）を図９にそれぞれ示す。図８及び図９より、血中のSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の量は経時的に増加した。このことから、SAP/oxLDL/β2-GPI複合体の増加には、加齢に伴うプラーク形成が関係することが示唆された。
(2) Time course of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex in LDLR-/-mice
The results (average value) using 10-week-old mice are shown in FIG. 8, and the results (average value) using 5-week-old mice are shown in FIG. 8 and 9, the amount of SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex in blood increased with time. This suggests that the increase in SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex is related to plaque formation with aging.
マウスSAP/oxLDL複合体の検知と標準曲線作成
実施例１で調製したSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を段階的に希釈して、実施例１に記載のELISA（ただし、WB-CAL-1に代えて、マウスモノクローナル抗oxLDL抗体（10μg/mlの溶液）を、50μl/ウェルで固相に添加することにより固相化したものを使用）により測定した。測定されるSAP/oxLDL複合体（SAP/oxLDL/β2-GPI複合体における「SAPとoxLDLとが複合体を形成している部分」）の濃度とその測定結果との関係について、標準曲線を作成した。
結果を図１０に示す。図１０から明かな通り、SAP/oxLDL複合体の濃度と測定値は、良好な直線性が確認され、標準曲線を描くことができた。よって、本測定系において、SAP/oxLDL複合体を特異的に検出できることが示された。
Detection of mouse SAP / oxLDL complex and creation of standard curve The SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex prepared in Example 1 was diluted stepwise to obtain the ELISA described in Example 1 (however, WB-CAL- Instead of 1, it was measured by using a mouse monoclonal anti-oxLDL antibody (10 μg / ml solution) which was immobilized by adding 50 μl / well to the solid phase). Create a standard curve for the relationship between the concentration of the measured SAP / oxLDL complex (the part where SAP and oxLDL form a complex in the SAP / oxLDL / β2-GPI complex) and the measurement results did.
The results are shown in FIG. As is clear from FIG. 10, the concentration and measured value of the SAP / oxLDL complex were confirmed to have good linearity, and a standard curve could be drawn. Therefore, it was shown that the SAP / oxLDL complex can be specifically detected in this measurement system.
ヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の検知、標準曲線の作成、および患者血清中の複合体の測定
前述のマウスSAP/oxLDL/β2-GPI複合体と同様にELISAによりヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を測定した。図１１には得られた標準曲線を示す。さらに250倍希釈した健常人および急性冠症候群患者(動脈硬化性疾患患者として)血清中の本複合体を測定した。結果を表３に示す。
図１１から明かな通り、ヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の濃度と測定値は、良好な直線性が確認され、標準曲線を描くことができた。よって、本測定系において、ヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体を特異的に検出できることが示された。
また、表３の結果から、このように少数例ではあるが、健常人血清に対し疾患群ではヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体濃度が高値を示した。従って、ヒトSAP/oxLDL/β2-GPI複合体の測定により動脈硬化などが検知できることが明らかとなった。
Detection of human SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex, generation of standard curve, and measurement of complex in patient serum Human SAP / oxLDL by ELISA as in the case of mouse SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex described above The / β 2 -GPI complex was measured. FIG. 11 shows the obtained standard curve. Furthermore, the complex in serum was measured in healthy subjects and acute coronary syndrome patients (as arteriosclerotic patients) diluted 250-fold. The results are shown in Table 3.
As is clear from FIG. 11, good linearity was confirmed between the concentration and the measured value of the human SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex, and a standard curve could be drawn. Therefore, it was shown that the human SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex can be specifically detected in this measurement system.
Further, from the results of Table 3, the human SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex concentration was higher in the disease group than in the healthy human serum, although it was a small number of cases. Therefore, it was revealed that arteriosclerosis and the like can be detected by measuring the human SAP / oxLDL / β 2 -GPI complex.
本発明キットの作成
（１）下記の構成からなる本発明キット（ELISAキット）を作成した。
１．９６ウェルのイムノプレート １枚
２．抗β2-GPI抗体（WB-CAL-1；イムノプレートへの固相化用） １本
３．ヒツジ抗SAP抗体（一次抗体） １本
４．ＨＲＰ標識抗ヒツジIgG抗体（二次抗体） １本
５．o-PD試薬溶液 １本
６．SAP/oxLDL/β2-GPI複合体（スタンダード）
（２）下記の構成からなる本発明キット（ELISAキット）を作成した。
１．抗β2-GPI抗体（WB-CAL-1）が固着された９６ウェルのイムノプレート １枚
２．抗SAP抗体（一次抗体） １本
３．ＨＲＰ標識抗イムノグロブリン抗体（二次抗体） １本
４．o-PD試薬溶液 １本
５．SAP/oxLDL/β2-GPI複合体（スタンダード）
（３）下記の構成からなる本発明キット（ELISAキット）を作成した。
１．抗β2-GPI抗体（WB-CAL-1）が固着された９６ウェルのイムノプレート １枚
２．ＨＲＰ標識抗SAP抗体 １本
３．ＤＡＢ溶液 １本
４．SAP/oxLDL/β2-GPI複合体（スタンダード）
Preparation of kit of the present invention (1) A kit of the present invention (ELISA kit) having the following constitution was prepared.
1. One 96-well immunoplate One anti-β 2 -GPI antibody (WB-CAL-1; for immobilization on an immunoplate) One sheep anti-SAP antibody (primary antibody) 4. 4. One HRP-labeled anti-sheep IgG antibody (secondary antibody) One o-PD reagent solution 6. SAP / oxLDL / β2-GPI complex (standard)
(2) A kit of the present invention (ELISA kit) having the following constitution was prepared.
1. One 96-well immunoplate to which an anti-β 2 -GPI antibody (WB-CAL-1) is fixed One anti-SAP antibody (primary antibody) One HRP-labeled anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody) 4. One o-PD reagent solution 5. SAP / oxLDL / β2-GPI complex (standard)
(3) A kit of the present invention (ELISA kit) having the following constitution was prepared.
1. One 96-well immunoplate to which an anti-β 2 -GPI antibody (WB-CAL-1) is fixed One HRP-labeled anti-SAP antibody One DAB solution 4. SAP / oxLDL / β2-GPI complex (standard)
（４）下記の構成からなる本発明キット２（ELISAキット）を作成した。
１．９６ウェルのイムノプレート １枚
２．抗oxLDL抗体（イムノプレートへの固相化用） １本
３．ヒツジ抗SAP抗体（一次抗体） １本
４．ＨＲＰ標識抗ヒツジIgG抗体（二次抗体） １本
５．o-PD試薬溶液 １本
６．SAP/oxLDL複合体（スタンダード）
(4) Invention kit 2 (ELISA kit) having the following constitution was prepared.
1. One 96-well immunoplate One anti-oxLDL antibody (for immobilization on immunoplate) One sheep anti-SAP antibody (primary antibody) 4. 4. One HRP-labeled anti-sheep IgG antibody (secondary antibody) One o-PD reagent solution 6. SAP / oxLDL complex (standard)
（５）下記の構成からなる本発明キット２（ELISAキット）を作成した。
１．抗oxLDL抗体が固着された９６ウェルのイムノプレート １枚
２．抗SAP抗体（一次抗体） １本
３．ＨＲＰ標識抗イムノグロブリン抗体（二次抗体） １本
４．o-PD試薬溶液 １本
５．SAP/oxLDL複合体（スタンダード）
(5) Invention kit 2 (ELISA kit) having the following constitution was prepared.
1. One 96-well immunoplate to which the anti-oxLDL antibody is fixed One anti-SAP antibody (primary antibody) One HRP-labeled anti-immunoglobulin antibody (secondary antibody) 4. One o-PD reagent solution 5. SAP / oxLDL complex (standard)
（６）下記の構成からなる本発明キット２（ELISAキット）を作成した。
１．抗oxLDL抗体が固着された９６ウェルのイムノプレート １枚
２．ＨＲＰ標識抗SAP抗体 １本
３．ＤＡＢ溶液 １本
４．SAP/oxLDL複合体（スタンダード）
(6) Invention kit 2 (ELISA kit) having the following constitution was prepared.
1. One 96-well immunoplate to which the anti-oxLDL antibody is fixed One HRP-labeled anti-SAP antibody One DAB solution 4. SAP / oxLDL complex (standard)
Claims (11)
ステップ（１）：抗体Ａが固着された固相に、該複合体を含有している可能性がある試料を接触させて、固相に固着された抗体Ａ−該複合体、で示される第１複合体を形成させるステップ、
ステップ（２）：ステップ１で形成された第１複合体に抗体Ｂを接触させ、固相に固着された抗体Ａ−該複合体−抗体Ｂ、で示されるサンドイッチ状複合体を形成させるステップ、及び
ステップ（３）：ステップ２で形成されたサンドイッチ状複合体を検知するステップ。
ただし、抗体Ａは抗血清アミロイドＰコンポーネント抗体及び抗β２−グリコプロテインＩ抗体のいずれか一方の抗体を、抗体Ｂは他方の抗体をそれぞれ示す。 The detection method according to claim 3, comprising at least the following steps (1) to (3):
Step (1): A sample that may contain the complex is brought into contact with the solid phase to which the antibody A is immobilized, and the antibody A immobilized on the solid phase—the complex indicated by the complex Forming a complex;
Step (2): contacting the antibody B with the first complex formed in Step 1 to form a sandwich complex represented by antibody A-the complex-antibody B fixed to a solid phase; And Step (3): a step of detecting the sandwich-like complex formed in Step 2.
However, antibody A represents one of antiserum amyloid P component antibody and anti-β2-glycoprotein I antibody, and antibody B represents the other antibody.
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