JP6231307B2 - Method for measuring dysfunctional HDL, kit for measuring dysfunctional HDL, and method for measuring markers for lifestyle-related diseases - Google Patents
Method for measuring dysfunctional HDL, kit for measuring dysfunctional HDL, and method for measuring markers for lifestyle-related diseases Download PDFInfo
- Publication number
- JP6231307B2 JP6231307B2 JP2013135064A JP2013135064A JP6231307B2 JP 6231307 B2 JP6231307 B2 JP 6231307B2 JP 2013135064 A JP2013135064 A JP 2013135064A JP 2013135064 A JP2013135064 A JP 2013135064A JP 6231307 B2 JP6231307 B2 JP 6231307B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hdl
- measuring
- dysfunctional
- dysfunctional hdl
- receptor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、機能不全ＨＤＬの測定方法、機能不全ＨＤＬ測定用キット、並びに、生活習慣病マーカーの測定方法に関し、さらに詳細には、機能不全ＨＤＬの受容体を使用する機能不全ＨＤＬの測定方法、当該方法に用いられる機能不全ＨＤＬ測定用キット、並びに当該方法を利用したマーカーの測定方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring dysfunctional HDL, a kit for measuring dysfunctional HDL, and a method for measuring a marker for lifestyle-related diseases, and more specifically, a method for measuring dysfunctional HDL using a receptor for dysfunctional HDL, The present invention relates to a dysfunctional HDL measurement kit used in the method and a marker measurement method using the method.
近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられるメタボリックシンドローム、耐糖能異常、糖尿病、脂質異常症、高血圧、動脈硬化等の生活習慣病が増加している。これら生活習慣病に共通して問題になるのは、血中コレステロールの濃度と質である。 In recent years, westernization of eating habits has progressed, and lifestyle-related diseases such as metabolic syndrome, impaired glucose tolerance, diabetes, dyslipidemia, hypertension, and arteriosclerosis, which are considered to be caused by this, are increasing. A common problem with these lifestyle-related diseases is the concentration and quality of blood cholesterol.
コレステロールは脂質の一種でステロイドに分類され、中でもステロールと呼ばれるサブグループに属する有機化合物の一種である。このコレステロールが血中を運ばれるとき、タンパク質と結合して複合体となったリポタンパク質の分子形態をとる。肝臓から末梢へのコレステロール輸送は、比較的比重が軽く粒子径の大きなリポタンパク質（低比重リポタンパク質。low-density lipoprotein。以下、「ＬＤＬ」と称する）が担当し、組織から肝臓への輸送は、比較的比重が重く粒子径の小さなリポタンパク質（高比重リポタンパク質。high-density lipoprotein。以下、「ＨＤＬ」と称する）が担当する。ＬＤＬ分子に含まれるタンパク質はアポリポタンパク質Ｂである。ＨＤＬ分子には多種類のタンパク質が含まれるが、その大半はアポリポタンパク質Ａ１（以下、「ＡｐｏＡ１」と略記することがある。）である。 Cholesterol is a kind of lipid and classified as a steroid, and is a kind of organic compound belonging to a subgroup called sterol. When this cholesterol is transported through the blood, it takes the molecular form of a lipoprotein that combines with the protein to form a complex. Cholesterol transport from the liver to the periphery is handled by lipoproteins with a relatively low specific gravity and large particle size (low-density lipoprotein, hereinafter referred to as “LDL”). Lipoprotein having a relatively high specific gravity and a small particle diameter ( high -density lipoprotein, hereinafter referred to as “HDL”) is in charge. The protein contained in the LDL molecule is apolipoprotein B. The HDL molecule includes many types of proteins, most of which are apolipoprotein A1 (hereinafter sometimes abbreviated as “ApoA1”).
１９６０年代にリポタンパク質の研究が進歩し、ＬＤＬが動脈硬化のリスクを高め、ＨＤＬがリスクを低減させるという学説が定着した。このため、ＬＤＬを「悪玉コレステロール」、ＨＤＬを「善玉コレステロール」と呼ぶことがある。現在、一般的な健康診断では総コレステロール、ＨＤＬ、中性脂肪を測定し、３者の測定値から計算式によってＬＤＬを算出している。日本動脈硬化学会が発出した動脈硬化性疾患予防ガイドラインでは、望ましいＬＤＬ、ＨＤＬ、中性脂肪、非ＨＤＬ（総コレステロール−ＨＤＬ）の血中濃度を定義し、薬剤の服用によるコレステロールの管理目標を明記している。 Advances in lipoprotein research in the 1960s established the theory that LDL increases the risk of arteriosclerosis and HDL reduces the risk. For this reason, LDL is sometimes called “bad cholesterol” and HDL is sometimes called “good cholesterol”. Currently, in general medical examinations, total cholesterol, HDL, and neutral fat are measured, and LDL is calculated from the measured values of the three using a calculation formula. The Atherosclerotic Disease Prevention Guidelines issued by the Japanese Atherosclerosis Society define desirable blood levels of LDL, HDL, triglycerides, and non-HDL (total cholesterol-HDL), and specify the cholesterol management goals by taking drugs doing.
このように、ＬＤＬは動脈硬化の原因であり、血中濃度を管理するべきであるとされているが、１９９０年代末からの研究の進歩により、ＬＤＬそのものよりもむしろ、ＬＤＬが体内で酸化修飾を受けた酸化変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）が動脈硬化のリスクを高める分子であることが明らかにされている。そして、酸化ＬＤＬの測定法がいくつか開発されており、そのような測定法の一部は、重症糖尿病患者の予後管理に用いる体外診断用医薬品に採用されている。 As described above, LDL is a cause of arteriosclerosis, and it is said that the blood concentration should be controlled. However, due to research progress from the late 1990s, LDL rather than LDL itself is oxidatively modified in the body. Oxidized modified LDL (oxidized LDL) has been shown to be a molecule that increases the risk of arteriosclerosis. Several methods for measuring oxidized LDL have been developed, and some of these methods are used for in-vitro diagnostic drugs used for prognosis management of patients with severe diabetes.
しかし近年、善玉とされていたＨＤＬにも、酸化などの修飾により、機能が損なわれて動脈硬化のリスクを高める「機能不全ＨＤＬ」があることが明らかになってきている。機能不全ＨＤＬは正常なＨＤＬとは異なり、動脈硬化や炎症を促進又は惹起することが明らかになっている。 However, in recent years, it has become clear that HDL, which has been regarded as good, also has “dysfunctional HDL” which increases the risk of arteriosclerosis by impairing the function by modification such as oxidation. Dysfunctional HDL has been shown to promote or cause arteriosclerosis and inflammation, unlike normal HDL.
機能不全ＨＤＬにはさまざまな分子形態の種類が知られている。例えば、ＨＤＬの構成成分のアポリポタンパク質Ａ１のリジン残基が過酸化脂質によって酸化修飾された「ＭＤＡ−ＨＤＬ」、メチオニン残基が酸化修飾された「ＭｅｔＯ−ＨＤＬ」、ミエロペルオキシダーゼの作用によって次亜塩素酸塩化した「ＨＯＣl−ＨＤＬ」、などである。さらにこのほかにも、ＨＤＬの構成成分の脂質部分が酸化された分子種もあるとされている。 Various types of molecular forms are known for dysfunctional HDL. For example, “MDA-HDL” in which the lysine residue of apolipoprotein A1, which is a component of HDL, is oxidatively modified with lipid peroxide, “MetO-HDL” in which methionine residue is oxidatively modified, and hypothesis by the action of myeloperoxidase. Chlorinated “HOCl-HDL”, and the like. In addition to this, there are molecular species in which the lipid portion of the HDL component is oxidized.
このような機能不全ＨＤＬの血中濃度の測定は、動脈硬化のリスク及び進展を判定する検査方法としての有用性が期待されるため、その測定技術の研究が進められた。測定技術としては、メチオニン残基が酸化修飾されたアポリポタンパク質Ａ１（ＭｅｔＯ−アポＡ１）をエピトープとするモノクローナル抗体と、抗アポリポタンパク質Ａ１抗体とを用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法が報告されている（例えば、特許文献１〜４、非特許文献１，２）。 The measurement of the blood concentration of such dysfunctional HDL is expected to be useful as a test method for determining the risk and progression of arteriosclerosis, and research on the measurement technique has been advanced. As a measurement technique, a sandwich ELISA method using a monoclonal antibody having an epitope of apolipoprotein A1 (MetO-apoA1) whose methionine residue is oxidatively modified and an anti-apolipoprotein A1 antibody has been reported (for example, patents). Documents 1 to 4, Non-Patent Documents 1 and 2).
しかし、これらの方法ではモノクローナル抗体を利用するため、検出できる機能不全ＨＤＬの分子形態が限定される。そのため、上記のように多様な分子形態の機能不全ＨＤＬを広く捕捉して検出することはできないという共通の問題がある。 However, since these methods utilize monoclonal antibodies, the molecular form of dysfunctional HDL that can be detected is limited. Therefore, there is a common problem that dysfunctional HDL of various molecular forms cannot be widely captured and detected as described above.
上記のように、動脈硬化の原因は一種類の因子に帰するのではなく、ＬＤＬやＨＤＬをはじめとするさまざまな生体分子が、病態準備状態にある生体内環境のストレスによって変質し、変質した分子が特異的受容体と結合することによって動脈硬化のリスクを高めていることが、近年の研究によって明らかになりつつある。このため、循環血中の機能不全ＨＤＬの濃度を測定することは、動脈硬化のリスクの程度を判定し、適切な医療介入を支援する有用な検査になる可能性がある。 As mentioned above, the cause of arteriosclerosis is not attributed to one type of factor, but various biomolecules such as LDL and HDL have been altered and altered by stress in the in vivo environment in the state of pathological preparation. Recent studies have shown that molecules bind to specific receptors to increase the risk of atherosclerosis. Thus, measuring the concentration of dysfunctional HDL in the circulating blood can be a useful test to determine the degree of risk of arteriosclerosis and support appropriate medical intervention.
しかし、変質又は酸化を受けて生じた機能不全ＨＤＬの特定の構造をエピトープとするモノクローナル抗体を利用する方法では、異なる修飾基の構造を有する機能不全ＨＤＬを検出することができない。モノクローナル抗体を用いる限り、この制約を払拭できない。 However, in a method using a monoclonal antibody having a specific structure of dysfunctional HDL generated by alteration or oxidation as an epitope, dysfunctional HDL having a structure of a different modifying group cannot be detected. As long as monoclonal antibodies are used, this limitation cannot be overcome.
そこで本発明は、多様な分子形態の機能不全ＨＤＬを広く検出できる機能不全ＨＤＬの測定技術を提供するとともに、当該技術を利用した生活習慣病の検出技術を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a technique for measuring dysfunctional HDL that can widely detect dysfunctional HDLs in various molecular forms, and to provide a technique for detecting lifestyle-related diseases using the technique.
上記の課題を解決すべく、本発明者らは、モノクローナル抗体を用いずに機能不全ＨＤＬを測定するための研究を進めた。その結果、機能不全ＨＤＬの受容体（受容体タンパク質）を利用することにより、上記した課題を解決できることを見出した。すなわち、受容体を用いることにより、多様な機能不全ＨＤＬを広く捕捉することができることを見出した。そして、当該方法で測定した血中の機能不全ＨＤＬが、糖尿病、非アルコール性脂肪肝の患者では高値を示し、生活習慣病の検出が可能であることを見出し、本発明を完成した。 In order to solve the above problems, the present inventors have advanced research for measuring dysfunctional HDL without using a monoclonal antibody. As a result, it has been found that the above-described problems can be solved by using a receptor for dysfunctional HDL (receptor protein). That is, it was found that various dysfunctional HDLs can be widely captured by using a receptor. The inventors have found that dysfunctional HDL in blood measured by this method is high in patients with diabetes and non-alcoholic fatty liver, and that it is possible to detect lifestyle-related diseases, thereby completing the present invention.
上記した知見に基づいて提供される１つの様相は、試料中に含まれる機能不全ＨＤＬの測定方法であって、機能不全ＨＤＬの受容体に前記試料を接触させて、試料中の機能不全ＨＤＬを前記受容体に結合させ、受容体に結合した機能不全ＨＤＬを検出することを特徴とする機能不全ＨＤＬの測定方法である。 The above-mentioned one aspect that will be provided based on the findings, a method for measuring dysfunctions HDL contained in a sample, the sample is contacted to a receptor dysfunction HDL, dysfunction HDL in a sample It is a method for measuring dysfunctional HDL, characterized by detecting dysfunctional HDL bound to the receptor and bound to the receptor.
この発明は機能不全ＨＤＬの測定方法に係るものである。この発明では、機能不全ＨＤＬが含まれる試料を機能不全ＨＤＬの受容体に接触させ、試料中の機能不全ＨＤＬを前記受容体に結合させる。そして、受容体に結合した機能不全ＨＤＬを検出することにより、試料中の機能不全ＨＤＬを測定する。この発明では、機能不全ＨＤＬの受容体を用いるので、多様な分子形態の機能不全ＨＤＬを受容体上に捕捉することができる。そのため、機能不全ＨＤＬを幅広く捉えることができる。モノクローナル抗体を用いた従来技術のように、測定対象が特定の機能不全ＨＤＬに限定されることはない。 The present invention relates to a method for measuring dysfunctional HDL. In the present invention, a sample containing dysfunctional HDL is contacted with a receptor for dysfunctional HDL, and the dysfunctional HDL in the sample is bound to the receptor. The dysfunctional HDL in the sample is then measured by detecting dysfunctional HDL bound to the receptor. Since the present invention uses a receptor for dysfunctional HDL, various molecular forms of dysfunctional HDL can be captured on the receptor. Therefore, it is possible to catch a wide range of dysfunctional HDL. The measurement object is not limited to a specific dysfunctional HDL as in the prior art using monoclonal antibodies.
「機能不全ＨＤＬ」とは、修飾を受けたＨＤＬ（修飾ＨＤＬ）であって、構成タンパクや構成脂質の酸化や欠損などにより、機能に異常を来したＨＤＬを指す。
機能不全ＨＤＬには、ＨＤＬを構成するタンパク質や脂質部分が酸化された修飾ＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）が含まれる。また機能不全ＨＤＬには、ＨＤＬを構成するタンパク質の一部が欠損した修飾ＨＤＬが含まれる。
例えば、上述したような、ＨＤＬの構成成分のアポリポタンパク質Ａ１のリジン残基が過酸化脂質によって酸化修飾された「ＭＤＡ−ＨＤＬ」、メチオニン残基が酸化修飾された「ＭｅｔＯ−ＨＤＬ」、ミエロペルオキシダーゼの作用によって次亜塩素酸塩化した「ＨＯＣl−ＨＤＬ」が、機能不全ＨＤＬの具体例として挙げられる。
“Dysfunctional HDL” refers to HDL that has been modified (modified HDL) and has an abnormality in function due to oxidation or loss of constituent proteins or lipids.
The dysfunctional HDL includes a modified HDL (oxidized HDL) in which a protein or lipid part constituting the HDL is oxidized. In addition, dysfunctional HDL includes modified HDL in which a part of the protein constituting HDL is deleted.
For example, as described above, “MDA-HDL” in which the lysine residue of the apolipoprotein A1, which is a component of HDL, is oxidatively modified with lipid peroxide, “MetO-HDL” in which the methionine residue is oxidatively modified, myeloperoxidase, A specific example of dysfunctional HDL is "HOCl-HDL" that has been hypochlorinated by the action of.
「機能不全ＨＤＬの受容体」には、受容体としての機能、すなわち、リガンドである機能不全ＨＤＬに対する結合性を保持している限り、天然型の受容体（受容体タンパク質の全長）の他、その改変体も含まれる。受容体の改変体としては、受容体タンパク質の変異体（アミノ酸置換体等）、受容体タンパク質の部分断片、受容体タンパク質と他タンパク質との融合タンパク質（キメラタンパク質）、等が例示される。
機能不全ＨＤＬの受容体としては、ＬＯＸ−１（ＯＬＲ−１とも呼ばれる）、ＣＤ３６、等が知られている。
The “receptor of dysfunctional HDL” includes a natural receptor (full length of receptor protein) as long as it retains the function as a receptor, that is, binding to dysfunctional HDL which is a ligand, Such variants are also included. Examples of receptor variants include receptor protein variants (amino acid substitutions, etc.), receptor protein partial fragments, receptor proteins and other proteins fusion proteins (chimeric proteins), and the like.
LOX-1 (also called OLR-1), CD36, etc. are known as receptors for dysfunctional HDL.
好ましくは、前記受容体は、担体に固定化されている。 Preferably, the receptor is immobilized on a carrier.
かかる構成により、受容体に結合した機能不全ＨＤＬの検出が容易となる。例えば、固相法による測定が可能となる。 Such a configuration facilitates detection of dysfunctional HDL bound to the receptor. For example, measurement by a solid phase method becomes possible.
好ましくは、前記受容体は、ＬＯＸ−１又はその改変体である。 Preferably, the receptor is LOX-1 or a variant thereof.
ＬＯＸ−１とは、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体（Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1）のことであり、酸化ＬＤＬの受容体の一種として知られている（日薬理誌，第１１９巻，ｐ１４５−１５４，２００２年；特開２０１１−１０６８４７号公報；特開２０１２−１００５８５号公報）。近年、修飾されたＨＤＬがＬＯＸ−１のリガンドとして作用しているとの報告がある（Besler C, et al. J Clin Invest. 2011;121:2693-708）。そしてこの発明は、機能不全ＨＤＬの受容体として、ＬＯＸ−１又はその改変体を用いるものである。 LOX-1 is a lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 and is known as a kind of receptor for oxidized LDL (Nippon Pharmacology, Vol. 119). , P145-154, 2002; JP 2011-106847 A; JP 2012-100585 A). Recently, it has been reported that modified HDL acts as a ligand for LOX-1 (Besler C, et al. J Clin Invest. 2011; 121: 2693-708). And this invention uses LOX-1 or its modification as a receptor of dysfunctional HDL.
ＬＯＸ−１の改変体の例としては、ＬＯＸ−１の変異体（アミノ酸置換体等）、ＬＯＸ−１の部分断片、ＬＯＸ−１と他タンパク質との融合タンパク質（キメラタンパク質）等であって、受容体としての機能を保持しているものが挙げられる。 Examples of LOX-1 variants include LOX-1 mutants (amino acid substitutions, etc.), LOX-1 partial fragments, LOX-1 and other protein fusion proteins (chimeric proteins), etc. The thing holding the function as a receptor is mentioned.
好ましくは、前記機能不全ＨＤＬは、酸化ＨＤＬである。 Preferably, the dysfunctional HDL is oxidized HDL.
酸化ＨＤＬは、ＨＤＬの構成タンパク質や構成脂質が酸化された修飾ＨＤＬであり、機能不全ＨＤＬの代表例である。 Oxidized HDL is a modified HDL in which HDL constituent proteins and constituent lipids are oxidized, and is a representative example of dysfunctional HDL.
好ましくは、受容体に結合した機能不全ＨＤＬに、機能不全ＨＤＬを認識する抗体をさらに結合させる。 Preferably, an antibody recognizing dysfunctional HDL is further bound to dysfunctional HDL bound to the receptor.
かかる構成により、受容体に結合した機能不全ＨＤＬを抗体で検出することができる。 With this configuration, dysfunctional HDL bound to a receptor can be detected with an antibody.
好ましくは、前記抗体は、抗アポリポタンパク質Ａ１抗体である。 Preferably, the antibody is an anti-apolipoprotein A1 antibody.
他の様相は、上記の機能不全ＨＤＬの測定方法に用いるためのキットであって、機能不全ＨＤＬの受容体を含むことを特徴とする機能不全ＨＤＬ測定用キットである。 Another aspect is a kit for measuring dysfunctional HDL, which is a kit for use in the above-described method for measuring dysfunctional HDL, comprising a receptor for dysfunctional HDL.
この発明は、機能不全ＨＤＬ測定用キットに係るものであり、機能不全ＨＤＬの受容体を含むことを特徴とする。この発明のキットによれば、上記した受容体を用いた機能不全ＨＤＬの測定を簡便に行うことができる。 The present invention relates to a kit for measuring dysfunctional HDL, and includes a receptor for dysfunctional HDL. According to the kit of the present invention, it is possible to easily measure dysfunctional HDL using the above-described receptor.
好ましくは、さらに、機能不全ＨＤＬを認識する抗体を含む。 Preferably, it further comprises an antibody that recognizes dysfunctional HDL.
かかる構成により、受容体に結合した機能不全ＨＤＬの検出を簡便かつ容易に行うことができる。 With this configuration, it is possible to easily and easily detect dysfunctional HDL bound to a receptor.
好ましくは、さらに、機能不全ＨＤＬの標準品を含む。 Preferably, it further comprises a dysfunctional HDL standard.
かかる構成により、検量線の作成が容易となる。 Such a configuration makes it easy to create a calibration curve.
他の様相は、上記の機能不全ＨＤＬの測定方法によって、被験者から採取した体液中の機能不全ＨＤＬを測定し、その測定結果に基づいて前記被験者における生活習慣病の有無を検出することを特徴とする生活習慣病の検出方法である。 According to another aspect, the method for measuring dysfunctional HDL measures dysfunctional HDL in a body fluid collected from a subject, and detects the presence or absence of lifestyle-related diseases in the subject based on the measurement result. This is a method for detecting lifestyle-related diseases.
この発明は生活習慣病の検出方法に係るものであり、上記した機能不全ＨＤＬの測定方法によって体液中の機能不全ＨＤＬを測定し、その測定結果に基づいて生活習慣病の有無を検出する。この発明によれば、体液中に存在する多様な分子形態の機能不全ＨＤＬを指標とすることができるので、機能不全ＨＤＬが関与する生活習慣病を幅広く高感度で検出することができる。 The present invention relates to a method for detecting lifestyle-related diseases, and measures dysfunctional HDL in body fluids by the method for measuring dysfunctional HDL described above, and detects the presence or absence of lifestyle-related diseases based on the measurement results. According to this invention, dysfunctional HDL of various molecular forms present in body fluid can be used as an index, so that lifestyle-related diseases involving dysfunctional HDL can be detected widely and with high sensitivity.
ここで「生活習慣病」とは、食生活や運動習慣、休養や喫煙、飲酒などの生活習慣が、病気の発症や進行に関与している疾患と定義される。当該生活習慣病には、少なくともメタボリックシンドローム、耐糖能異常、糖尿病、脂質異常症、動脈硬化、及び高血圧、並びにこれらの合併症が含まれる。 Here, “lifestyle-related diseases” are defined as diseases in which lifestyle habits such as eating habits, exercise habits, rest, smoking, and drinking are related to the onset and progression of the disease. The lifestyle-related diseases include at least metabolic syndrome, impaired glucose tolerance, diabetes, dyslipidemia, arteriosclerosis, and hypertension, and complications thereof.
「生活習慣病の有無の検出」とは、生活習慣病の罹患の有無だけでなく、将来の発症リスクの有無も含む概念である。生活習慣病の将来の発症リスクの有無とは、生活習慣病を発症していない時点において、将来、生活習慣病に罹患する可能性（危険性）の有無を指す。 “Detection of the presence or absence of lifestyle-related diseases” is a concept that includes not only the presence or absence of lifestyle-related diseases but also the presence or absence of future onset risks. The presence or absence of a future risk of developing a lifestyle-related disease refers to the presence or absence of a risk (risk) of suffering from a lifestyle-related disease in the future when no lifestyle-related disease has developed.
好ましくは、前記体液は、血清又は血漿である。 Preferably, the body fluid is serum or plasma.
好ましくは、前記生活習慣病は、メタボリックシンドローム、耐糖能異常、糖尿病、脂質異常症、動脈硬化、及び高血圧からなる群より選ばれた少なくとも１つである。 Preferably, the lifestyle-related disease is at least one selected from the group consisting of metabolic syndrome, impaired glucose tolerance, diabetes, dyslipidemia, arteriosclerosis, and hypertension.
請求項１に記載の発明は、試料中に含まれる機能不全ＨＤＬの測定方法であって、機能不全ＨＤＬの受容体に前記試料を接触させて、試料中の機能不全ＨＤＬを前記受容体に結合させ、受容体に結合した機能不全ＨＤＬを検出するものであり、前記受容体は、ＬＯＸ−１又はその改変体であり、前記受容体は、担体に固定化されており、前記受容体に結合した機能不全ＨＤＬに、機能不全ＨＤＬを認識する抗体をさらに結合させることを特徴とする機能不全ＨＤＬの測定方法である。The invention according to claim 1 is a method of measuring dysfunctional HDL contained in a sample, wherein the sample is brought into contact with a receptor of dysfunctional HDL, and the dysfunctional HDL in the sample is bound to the receptor. And detecting dysfunctional HDL bound to the receptor, wherein the receptor is LOX-1 or a variant thereof, and the receptor is immobilized on a carrier and binds to the receptor This is a method for measuring dysfunctional HDL, wherein an antibody recognizing dysfunctional HDL is further bound to the dysfunctional HDL.
請求項２に記載の発明は、前記機能不全ＨＤＬは、酸化ＨＤＬであることを特徴とする請求項１に記載の機能不全ＨＤＬの測定方法である。The invention according to claim 2 is the method for measuring dysfunctional HDL according to claim 1, wherein the dysfunctional HDL is oxidized HDL.
請求項３に記載の発明は、前記抗体は、抗アポリポタンパク質Ａ１抗体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の機能不全ＨＤＬの測定方法である。The invention according to claim 3 is the method for measuring dysfunctional HDL according to claim 1 or 2, wherein the antibody is an anti-apolipoprotein A1 antibody.
請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれかに記載の機能不全ＨＤＬの測定方法に用いるためのキットであって、ＬＯＸ−１又はその改変体と機能不全ＨＤＬを認識する抗体とを含むことを特徴とする機能不全ＨＤＬ測定用キットである。The invention according to claim 4 is a kit for use in the method for measuring dysfunctional HDL according to any one of claims 1 to 3, wherein the antibody recognizes LOX-1 or a variant thereof and dysfunctional HDL. A kit for measuring dysfunctional HDL, comprising:
請求項５に記載の発明は、前記抗体は、抗アポリポタンパク質Ａ１抗体であることを特徴とする請求項４に記載の機能不全ＨＤＬ測定用キットである。The invention according to claim 5 is the kit for measuring dysfunctional HDL according to claim 4, wherein the antibody is an anti-apolipoprotein A1 antibody.
請求項６に記載の発明は、さらに、機能不全ＨＤＬの標準品を含むことを特徴とする請求項４又は５に記載の機能不全ＨＤＬ測定用キットである。The invention according to claim 6 is the kit for measuring dysfunctional HDL according to claim 4 or 5, further comprising a standard product of dysfunctional HDL.
請求項７に記載の発明は、機能不全ＨＤＬからなる生活習慣病マーカーの測定方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の機能不全ＨＤＬの測定方法によって、被験者から採取した体液中の機能不全ＨＤＬを測定することを特徴とする生活習慣病マーカーの測定方法である。The invention according to claim 7 is a method for measuring a lifestyle-related disease marker comprising dysfunctional HDL, which is in a body fluid collected from a subject by the method for measuring dysfunctional HDL according to any one of claims 1 to 3. This is a method for measuring a lifestyle-related disease marker characterized by measuring dysfunctional HDL.
請求項８に記載の発明は、前記体液は、血清又は血漿であることを特徴とする請求項７に記載の生活習慣病マーカーの測定方法である。The invention according to claim 8 is the method for measuring a lifestyle-related disease marker according to claim 7, wherein the body fluid is serum or plasma.
請求項９に記載の発明は、前記生活習慣病は、メタボリックシンドローム、耐糖能異常、糖尿病、脂質異常症、動脈硬化、及び高血圧からなる群より選ばれた少なくとも１つであることを特徴とする請求項７又は８に記載の生活習慣病マーカーの測定方法である。The invention according to claim 9 is characterized in that the lifestyle-related disease is at least one selected from the group consisting of metabolic syndrome, impaired glucose tolerance, diabetes, dyslipidemia, arteriosclerosis, and hypertension. It is the measuring method of the lifestyle-related disease marker of Claim 7 or 8.
請求項１０に記載の発明は、得られた機能不全ＨＤＬの測定値を基準値と比較する工程を包含することを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の生活習慣病マーカーの測定方法である。The invention according to claim 10 includes a step of comparing the obtained measurement value of dysfunctional HDL with a reference value, and measuring the lifestyle-related disease marker according to any one of claims 7 to 9 Is the method.
本発明の機能不全ＨＤＬの測定方法によれば、多様な分子形態の機能不全ＨＤＬを測定することができる。 According to the method for measuring dysfunctional HDL of the present invention, various types of dysfunctional HDL can be measured.
本発明の機能不全ＨＤＬ測定用キットによれば、受容体を用いた上記機能不全ＨＤＬの測定方法を簡便に実施することができる。 According to the kit for measuring dysfunctional HDL of the present invention, the method for measuring dysfunctional HDL using a receptor can be easily carried out.
本発明の生活習慣病マーカーの測定方法によれば、機能不全ＨＤＬが関与する生活習慣病の有無を幅広く高感度で検出することができる。 According to the method for measuring a lifestyle-related disease marker of the present invention, the presence or absence of a lifestyle-related disease involving dysfunctional HDL can be detected widely and with high sensitivity.
以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明の機能不全ＨＤＬの測定方法は、機能不全ＨＤＬの受容体に試料を接触させて、試料中の機能不全ＨＤＬを受容体に結合させ、受容体に結合した機能不全ＨＤＬを検出することを特徴とするものである。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
The method for measuring dysfunctional HDL of the present invention comprises contacting a sample with a receptor of dysfunctional HDL, binding dysfunctional HDL in the sample to the receptor, and detecting dysfunctional HDL bound to the receptor. It is a feature.
上述したように、「機能不全ＨＤＬ」とは、修飾を受けたＨＤＬ（修飾ＨＤＬ）であって、構成タンパクや構成脂質の酸化や欠損などにより、機能に異常を来したＨＤＬを指す。例えば、ＨＤＬを構成するタンパク質や脂質部分が酸化されたＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）、ＨＤＬを構成するタンパク質の一部が欠損したＨＤＬが、機能不全ＨＤＬに含まれる。機能不全ＨＤＬの具体例としては、ＭＤＡ−ＨＤＬ、ＭｅｔＯ−ＨＤＬ、ＨＯＣl−ＨＤＬ等が挙げられる。
特に酸化ＨＤＬは、本発明の測定対象である機能不全ＨＤＬの代表例である。
As described above, “dysfunctional HDL” refers to HDL that has been modified (modified HDL) and has an abnormality in function due to oxidation or loss of constituent proteins and lipids. For example, HDL in which a protein constituting HDL, HDL in which a lipid portion is oxidized (oxidized HDL), or HDL in which a part of the protein constituting HDL is deleted is included in dysfunctional HDL. Specific examples of dysfunctional HDL include MDA-HDL, MetO-HDL, HOCl-HDL, and the like.
In particular, oxidized HDL is a representative example of dysfunctional HDL that is a measurement target of the present invention.
なお当然ながら、機能不全ＨＤＬの受容体には、機能不全ＨＤＬに対する抗体（イムノグロブリン）は含まれない。 Of course, the receptor for dysfunctional HDL does not include antibodies (immunoglobulin) against dysfunctional HDL.
本発明では、試料中の機能不全ＨＤＬを「機能不全ＨＤＬの受容体」に結合させる。機能不全ＨＤＬの受容体としては、機能不全ＨＤＬがリガンドとなる受容体であれば特に限定はない。機能不全ＨＤＬの受容体の具体例としては、上述したＬＯＸ−１、ＣＤ３６が挙げられる。 In the present invention, dysfunctional HDL in a sample is bound to a “receptor for dysfunctional HDL”. The receptor for dysfunctional HDL is not particularly limited as long as it is a receptor for which dysfunctional HDL is a ligand. Specific examples of the receptor for dysfunctional HDL include the above-mentioned LOX-1 and CD36.
ＣＤ３６はクラスＢスカベンジャー受容体ファミリーのひとつで、細胞の表面に発現する膜タンパク質である。分子量は８８ｋＤで、コラーゲン、トロンボスポンジンをはじめとするさまざまなタンパク質と結合し、各種のシグナル伝達に重要な役割を果たすことが知られており、酸化ＨＤＬとも結合する。 CD36 is a family of class B scavenger receptors and is a membrane protein expressed on the surface of cells. It has a molecular weight of 88 kD, and is known to bind to various proteins such as collagen and thrombospondin, play an important role in various signal transduction, and also binds to oxidized HDL.
また、機能不全ＨＤＬの受容体には、機能不全ＨＤＬに対する結合性を保持している限り、天然型の受容体（受容体タンパク質の全長）の他、その改変体（受容体タンパク質の変異体、受容体タンパク質の部分断片、受容体タンパク質と他タンパク質との融合タンパク質等）が含まれる。 In addition, as long as the receptor for dysfunctional HDL retains the binding ability to dysfunctional HDL, in addition to the natural type receptor (the full length of the receptor protein), a modified form thereof (a mutant of the receptor protein, A partial fragment of a receptor protein, a fusion protein of a receptor protein and another protein, etc.).
好ましい実施形態では、機能不全ＨＤＬの受容体としてＬＯＸ−１を用いる。なお、ＬＯＸ−１の遺伝子は既にクローニングされており、組換え型のＬＯＸ−１が入手可能である(特開平９−９８７８７号公報）。 In a preferred embodiment, LOX-1 is used as a receptor for dysfunctional HDL. The gene for LOX-1 has already been cloned, and recombinant LOX-1 is available (Japanese Patent Laid-Open No. 9-98787).
本発明における試料としては特に限定はないが、例えば、ヒトから採取した体液（例えば、血清や血漿）を挙げることができる。 Although there is no limitation in particular as a sample in this invention, For example, the bodily fluid (for example, serum and plasma) extract | collected from the human can be mentioned.
本発明では、受容体に結合した機能不全ＨＤＬを検出する。この際、担体（支持体）に固定化された受容体を用いることが好ましい。これにより、いわゆる固相法による測定が可能となる。担体としては、受容体を固定化できるものであれば特に限定はなく、マイクロタイタープレート、ビーズ、ラテックス粒子等、公知の担体を用いることができる。 In the present invention, dysfunctional HDL bound to the receptor is detected. At this time, it is preferable to use a receptor immobilized on a carrier (support). Thereby, measurement by a so-called solid phase method becomes possible. The carrier is not particularly limited as long as the receptor can be immobilized, and a known carrier such as a microtiter plate, beads, latex particles, or the like can be used.
また、機能不全ＨＤＬを認識する抗体をさらに用いることができる。当該抗体の例としては、抗アポリポタンパク質Ａ１抗体（抗ＡｐｏＡ１抗体）が挙げられる。本実施形態によれば、例えば、受容体によって機能不全ＨＤＬを捕捉し、抗体によって機能不全ＨＤＬを検出することができる。 An antibody that recognizes dysfunctional HDL can be further used. Examples of the antibody include anti-apolipoprotein A1 antibody (anti-ApoA1 antibody). According to this embodiment, for example, dysfunctional HDL can be captured by a receptor, and dysfunctional HDL can be detected by an antibody.
一例として、担体に固定化されたＬＯＸ−１（機能不全ＨＤＬの受容体）で試料中の機能不全ＨＤＬを捕捉し、抗ＡｐｏＡ１抗体（機能不全ＨＤＬを認識する抗体）で機能不全ＨＤＬを検出する測定系について説明する。この例は、いわゆるサンドイッチ法に属するものである。 As an example, LOX-1 (receptor for dysfunctional HDL) immobilized on a carrier captures dysfunctional HDL in a sample and detects dysfunctional HDL with an anti-ApoA1 antibody (an antibody that recognizes dysfunctional HDL). The measurement system will be described. This example belongs to the so-called sandwich method.
まず、ＬＯＸ−１をマイクロタイタープレート等の担体に固定化する。そして、固定化されたＬＯＸ−１に血清等の試料を添加して接触させ、試料中の機能不全ＨＤＬをＬＯＸ−１に結合させる。洗浄後、抗ＡｐｏＡ１抗体を添加して、ＬＯＸ−１に結合した機能不全ＨＤＬに抗ＡｐｏＡ１抗体を結合させる。そして、結合した抗ＡｐｏＡ１抗体検出し、これを指標として試料中の機能不全ＨＤＬを測定する。
抗ＡｐｏＡ１抗体は、標識と未標識のいずれでもよい。未標識の抗ＡｐｏＡ１抗体を用いる場合には、抗ＡｐｏＡ１抗体に結合する標識抗体（標識二次抗体）を用いればよい。標識の種類としては、酵素、蛍光物質、放射性物質等の公知のものを採用することができる。また抗ＡｐｏＡ１抗体は、ポリクローナルとモノクローナルのいずれでもよい。
First, LOX-1 is immobilized on a carrier such as a microtiter plate. Then, a sample such as serum is added to and brought into contact with the immobilized LOX-1, and the dysfunctional HDL in the sample is bound to LOX-1. After washing, anti-ApoA1 antibody is added to allow anti-ApoA1 antibody to bind to dysfunctional HDL bound to LOX-1. Then, the bound anti-ApoA1 antibody is detected, and dysfunctional HDL in the sample is measured using this as an index.
The anti-ApoA1 antibody may be either labeled or unlabeled. When an unlabeled anti-ApoA1 antibody is used, a labeled antibody (labeled secondary antibody) that binds to the anti-ApoA1 antibody may be used. As a kind of label | marker, well-known things, such as an enzyme, a fluorescent substance, and a radioactive substance, are employable. The anti-ApoA1 antibody may be either polyclonal or monoclonal.
サンドイッチ法に代えて、競合法を用いることもできる。また、抗ＡｐｏＡ１抗体を固相化し、ＬＯＸ−１で機能不全ＨＤＬを検出することも可能である。 Instead of the sandwich method, a competitive method can also be used. It is also possible to immobilize anti-ApoA1 antibody and detect dysfunctional HDL with LOX-1.
なお、本発明の機能不全ＨＤＬの測定方法において、検量線の作成等に使用する標準品（標準物質）としては、例えば、ヒト血液から調製したＨＤＬ画分を硫酸銅等で酸化処理したもの（以下、「人工酸化ＨＤＬ」と称することがある。）を用いることができる。そして、当該標準品を用いて、タンパク濃度測定またはコレステロール測定によって濃度を規定した標準機能不全ＨＤＬの希釈系列を作製し、これらの測定結果から検量線を作成することができる。 In the method for measuring dysfunctional HDL of the present invention, as a standard product (standard substance) used for preparing a calibration curve, for example, an HDL fraction prepared from human blood is oxidized with copper sulfate or the like ( Hereinafter, it may be referred to as “artificial oxidation HDL”). Then, by using the standard product, a dilution series of standard dysfunctional HDL whose concentration is defined by protein concentration measurement or cholesterol measurement can be prepared, and a calibration curve can be created from these measurement results.
本発明の機能不全ＨＤＬ測定用キットは、機能不全ＨＤＬの受容体を含むものである。好ましい実施形態では、機能不全ＨＤＬを認識する抗体（例えば、抗ＡｐｏＡ１抗体）をさらに含む。また、機能不全ＨＤＬの標準品（例えば、上記の人工酸化ＨＤＬ）をさらに含む。 The kit for measuring dysfunctional HDL of the present invention comprises a receptor for dysfunctional HDL. In a preferred embodiment, the antibody further comprises an antibody that recognizes dysfunctional HDL (eg, an anti-ApoA1 antibody). In addition, a standard product of dysfunctional HDL (for example, the above artificial oxidized HDL) is further included.
本発明のキットの構成例を以下に挙げる。本構成のキットには、さらにプレートやビーズ等の担体、発色基質、等を含めてもよい。 Examples of the configuration of the kit of the present invention are given below. The kit having this configuration may further contain a carrier such as a plate or a bead, a chromogenic substrate, and the like.
〔キットの構成例〕
（ａ）ＬＯＸ−１（溶液又は凍結乾燥品） 適量
（ｂ）ＨＲＰ標識抗ＡｐｏＡ１抗体（溶液又は凍結乾燥品） 適量
（ｃ）人工酸化ＨＤＬ（標準品。溶液又は凍結乾燥品） 適量
[Example of kit configuration]
(A) LOX-1 (solution or lyophilized product) Appropriate amount (b) HRP-labeled anti-ApoA1 antibody (solution or lyophilized product) Appropriate amount (c) Artificial oxidized HDL (standard product. Solution or lyophilized product) Appropriate amount
本発明の生活習慣病の検出方法は、上記した機能不全ＨＤＬの測定方法によって、被験者から採取した体液中の機能不全ＨＤＬを測定し、その測定結果に基づいて前記被験者における生活習慣病の有無を検出するものである。体液の例としては、血清又は血漿が挙げられる。 According to the method for detecting lifestyle-related diseases of the present invention, dysfunctional HDL in body fluid collected from a subject is measured by the method for measuring dysfunctional HDL, and the presence or absence of lifestyle-related diseases in the subject is determined based on the measurement result. It is to detect. Examples of body fluids include serum or plasma.
例えば、健常人の体液を用いて上記の方法で機能不全ＨＤＬを測定し、基準値（カットオフ値）を設定することができる。そして、被験者の体液を用いて同様にして機能不全ＨＤＬを測定し、その測定値を基準値と比較して、当該被験者における生活習慣病の有無を検出することができる。 For example, dysfunctional HDL can be measured by the above-described method using body fluid of a healthy person, and a reference value (cut-off value) can be set. Then, dysfunctional HDL is measured in the same manner using the body fluid of the subject, and the measured value is compared with a reference value, so that the presence or absence of lifestyle-related diseases in the subject can be detected.
検出対象となる生活習慣病としては、メタボリックシンドローム、耐糖能異常、糖尿病、脂質異常症、動脈硬化、高血圧、及びこれらの合併症が挙げられる。 Examples of lifestyle-related diseases to be detected include metabolic syndrome, impaired glucose tolerance, diabetes, dyslipidemia, arteriosclerosis, hypertension, and complications thereof.
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
（１）機能不全ＨＤＬの標準品（人工酸化ＨＤＬ）の調製
常法によりヒト血液からＨＤＬ画分を調製した。得られた画分のＨＤＬ濃度を０．５ｍｇ／ｍＬに調整し、終濃度が５０マイクロモルになるように硫酸銅を加え、３７℃で４８時間インキュベートし、ＨＤＬを酸化修飾した。その後、終濃度２ミリモルになるようにＥＤＴＡを加えて、酸化を停止させ、標準品となる人工酸化ＨＤＬを得た。
(1) Preparation of dysfunctional HDL standard (artificial oxidized HDL) A HDL fraction was prepared from human blood by a conventional method. The HDL concentration of the obtained fraction was adjusted to 0.5 mg / mL, copper sulfate was added so that the final concentration was 50 μmol, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 48 hours to oxidatively modify HDL. Thereafter, EDTA was added to a final concentration of 2 mmol to stop the oxidation, and an artificial oxidized HDL serving as a standard product was obtained.
（２）サンドイッチ法による測定系の構築と検量線の作成
ヒトＬＯＸ−１のＰＢＳ溶液（０．５μｇ／ｍＬ）を調製した。これをマイクロタイタープレートの各穴に１００μＬ注入し、４℃で一晩インキュベートした（ＬＯＸ−１の固相化）。ＬＯＸ−１溶液を排出し、各穴をＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、各穴にブロッキング液（５％ ＢＳＡ）を２００μＬ注入した。室温で２時間インキュベートした（ブロッキング）。
(2) Construction of measurement system by sandwich method and preparation of calibration curve Human LOX-1 in PBS (0.5 μg / mL) was prepared. 100 μL of this was injected into each well of a microtiter plate and incubated overnight at 4 ° C. (immobilization of LOX-1). After discharging the LOX-1 solution and washing each well with PBST (PBS + 0.05% Tween 20) three times, 200 μL of blocking solution (5% BSA) was injected into each well. Incubated for 2 hours at room temperature (blocking).
ブロッキング液を排出し、各穴をＰＢＳＴで３回洗浄した後、試料として上記（１）で調製した検量線作成用の標準品（人工酸化ＨＤＬ。０〜１０００ｎｇ／ｍＬ）を１００μＬ注入した。室温で２時間インキュベートした。試料を排出し、各穴をＰＢＳＴで３回洗浄した後、各穴にＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＡｐｏＡ１抗体の３０００倍希釈液を１００μＬ注入した。室温で２時間インキュベートした。 The blocking solution was discharged, and each hole was washed three times with PBST, and then 100 μL of a standard product (artificial oxidation HDL. 0 to 1000 ng / mL) for preparing a calibration curve prepared in (1) above was injected as a sample. Incubated for 2 hours at room temperature. The sample was discharged and each well was washed 3 times with PBST, and then 100 μL of a 3000-fold diluted solution of HRP-labeled goat anti-human ApoA1 antibody was injected into each well. Incubated for 2 hours at room temperature.
抗ヒトＡｐｏＡ１抗体溶液を排出し、各穴をＰＢＳＴで５回洗浄した後、各穴にＴＭＢ基質（バイオラッド社）を１００μＬ注入した。遮光して３０分間インキュベートした後、１Ｍ硫酸を５０μＬ注入して酵素反応を停止した。マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ４５０）を測定した。得られた吸光度から検量線を作成した。
コントロールとして、酸化処理していないＨＤＬ（０〜１０００ｎｇ／ｍＬ）も同時に測定した。
The anti-human ApoA1 antibody solution was discharged, each hole was washed 5 times with PBST, and then 100 μL of TMB substrate (Bio-Rad) was injected into each hole. After incubation for 30 minutes in the dark, the enzyme reaction was stopped by injecting 50 μL of 1M sulfuric acid. Absorbance (A450) at 450 nm was measured with a microplate reader. A calibration curve was prepared from the obtained absorbance.
As a control, unoxidized HDL (0 to 1000 ng / mL) was also measured.
結果を表１と図１に示す。表１と図１において、「ｏｘＨＤＬ」は人工酸化ＨＤＬ、「ＨＤＬ」は酸化処理していないＨＤＬを示す。すなわち、人工酸化ＨＤＬについては、その濃度に相関したＡ４５０値が得られた。そして、少なくとも０〜１０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で直線性が得られており、機能不全ＨＤＬ（酸化ＨＤＬ）の測定が可能であった。 The results are shown in Table 1 and FIG. In Table 1 and FIG. 1, “oxHDL” indicates artificially oxidized HDL, and “HDL” indicates HDL that has not been oxidized. That is, for artificially oxidized HDL, an A450 value correlated with the concentration was obtained. And linearity was obtained at a concentration range of at least 0 to 1000 ng / mL, and dysfunctional HDL (oxidized HDL) could be measured.
（３）血清試料を用いた検討
健常人（２５例）、非アルコール性脂肪肝患者（１１５例）、および糖尿病患者（４１５例）の血清を試料として、上記（２）の方法で酸化ＨＤＬを測定した。血清は、希釈液（5％ BSA, 2mM EDTA in HEPES with 0.05% Tween20）で５０倍希釈して使用した。標準品として、（１）で作製した人工酸化ＨＤＬを用いた。標準品の希釈系列は、４０００ｎｇ／ｍＬを先頭に１／２倍ずつ段階希釈した７点とした。測定結果を図２に示す。
(3) Examination using serum samples Using the serum of healthy individuals (25 cases), nonalcoholic fatty liver patients (115 cases), and diabetic patients (415 cases), oxidized HDL was obtained by the method of (2) above. It was measured. Serum was diluted 50-fold with a diluent (5% BSA, 2 mM EDTA in HEPES with 0.05% Tween 20). The artificial oxidation HDL produced in (1) was used as a standard product. The dilution series of the standard product was set to 7 points that were serially diluted by 1/2 times starting from 4000 ng / mL. The measurement results are shown in FIG.
機能不全ＨＤＬ濃度（人工酸化ＨＤＬ換算）の平均値±標準偏差（μｇ／ｍＬ）について、健常人では１１．９±１１．２μｇ／ｍＬ、非アルコール性脂肪肝患者では２９．６±２１．９μｇ／ｍＬ、糖尿病患者では８５．９±４８．０μｇ／ｍＬであった。そして、健常人と非アルコール性脂肪肝患者との間、並びに、健常人と糖尿病患者との間に有意差が認められた。なお、非アルコール性脂肪肝はメタボリックシンドロームの一態様と捉えることができる。
以上より、本発明の方法によって血清中の機能不全ＨＤＬを測定することにより、糖尿病等の生活習慣病の検出が可能であることが示された。
About the average value ± standard deviation (μg / mL) of the dysfunctional HDL concentration (artificial oxidized HDL conversion), 11.9 ± 11.2 μg / mL in healthy subjects and 29.6 ± 21.9 μg in nonalcoholic fatty liver patients It was 85.9 ± 48.0 μg / mL for diabetic patients. And a significant difference was recognized between a healthy person and a non-alcoholic fatty liver patient, and between a healthy person and a diabetic patient. Non-alcoholic fatty liver can be regarded as an aspect of metabolic syndrome.
From the above, it was shown that lifestyle-related diseases such as diabetes can be detected by measuring dysfunctional HDL in serum by the method of the present invention.
Claims (10)
前記受容体は、ＬＯＸ−１又はその改変体であり、
前記受容体は、担体に固定化されており、
前記受容体に結合した機能不全ＨＤＬに、機能不全ＨＤＬを認識する抗体をさらに結合させることを特徴とする機能不全ＨＤＬの測定方法。 A method for measuring dysfunctional HDL contained in a sample, wherein the sample is brought into contact with a receptor for dysfunctional HDL, the dysfunctional HDL in the sample is bound to the receptor, and the dysfunction is bound to the receptor. HDL is detected ,
The receptor is LOX-1 or a variant thereof;
The receptor is immobilized on a carrier;
A method for measuring dysfunctional HDL, further comprising binding an antibody that recognizes dysfunctional HDL to dysfunctional HDL bound to the receptor .
請求項１〜３のいずれかに記載の機能不全ＨＤＬの測定方法によって、被験者から採取した体液中の機能不全ＨＤＬを測定することを特徴とする生活習慣病マーカーの測定方法。 A method for measuring a lifestyle-related disease marker comprising dysfunctional HDL,
A method for measuring a lifestyle-related disease marker , comprising measuring dysfunctional HDL in a body fluid collected from a subject by the method for measuring dysfunctional HDL according to any one of claims 1 to 3 .
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013135064A JP6231307B2 (en) | 2013-06-27 | 2013-06-27 | Method for measuring dysfunctional HDL, kit for measuring dysfunctional HDL, and method for measuring markers for lifestyle-related diseases |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013135064A JP6231307B2 (en) | 2013-06-27 | 2013-06-27 | Method for measuring dysfunctional HDL, kit for measuring dysfunctional HDL, and method for measuring markers for lifestyle-related diseases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2015010879A JP2015010879A (en) | 2015-01-19 |
| JP6231307B2 true JP6231307B2 (en) | 2017-11-15 |
Family
ID=52304171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013135064A Active JP6231307B2 (en) | 2013-06-27 | 2013-06-27 | Method for measuring dysfunctional HDL, kit for measuring dysfunctional HDL, and method for measuring markers for lifestyle-related diseases |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6231307B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021200797A1 (en) | 2020-03-30 | 2021-10-07 | 国立大学法人信州大学 | Quantification method for modified hdl, and analysis reagent for use in same method |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018079674A1 (en) * | 2016-10-31 | 2018-05-03 | 国立大学法人大阪大学 | Method for selecting subject needing treatment for dyslipidemia and reagent for such selection |
| CN111770997A (en) * | 2018-02-14 | 2020-10-13 | 国立大学法人信州大学 | Fusion protein and assay kit for high-density lipoprotein using same |
| JP7189537B2 (en) * | 2019-06-27 | 2022-12-14 | サンスター株式会社 | A measuring method comprising the step of measuring a reflected value of the amount of oxidized HDL in a blood sample |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3436444B2 (en) * | 1995-07-21 | 2003-08-11 | ヤマサ醤油株式会社 | Measurement method and kit for oxidized HDL |
| DE60237455D1 (en) * | 2001-07-12 | 2010-10-07 | Kyowa Medex Co Ltd | METHOD FOR QUANTITATING DENATURED LIPOPROTEIN |
| JP3998245B2 (en) * | 2002-03-19 | 2007-10-24 | ヤマサ醤油株式会社 | Method and kit for measuring oxidized apolipoprotein AI and oxidized lipoprotein containing the same |
| JP4588053B2 (en) * | 2002-03-19 | 2010-11-24 | ヤマサ醤油株式会社 | Method and kit for measuring oxidized apolipoprotein AI and oxidized lipoprotein containing the same |
| JP4625812B2 (en) * | 2003-12-05 | 2011-02-02 | ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション | Risk markers for cardiovascular disease |
| JP5560023B2 (en) * | 2009-11-13 | 2014-07-23 | 株式会社バイオマーカーサイエンス | Evaluation method and risk evaluation kit for stroke, cerebral infarction, or myocardial infarction |
| JP5706669B2 (en) * | 2010-11-10 | 2015-04-22 | 独立行政法人国立循環器病研究センター | Fusion protein, nucleic acid, vector, cell, LAB measurement method, and LAB measurement kit |
-
2013
- 2013-06-27 JP JP2013135064A patent/JP6231307B2/en active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021200797A1 (en) | 2020-03-30 | 2021-10-07 | 国立大学法人信州大学 | Quantification method for modified hdl, and analysis reagent for use in same method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2015010879A (en) | 2015-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hermans et al. | Determinants of Clara cell protein (CC16) concentration in serum: a reassessment with two different immunoassays | |
| US20140322723A1 (en) | Diabetes diagnosis through the detection of glycated proteins in urine | |
| JP6231307B2 (en) | Method for measuring dysfunctional HDL, kit for measuring dysfunctional HDL, and method for measuring markers for lifestyle-related diseases | |
| CN110088627A (en) | Biomarker | |
| Nilsen et al. | A novel turbidimetric immunoassay for fecal calprotectin optimized for routine chemistry analyzers | |
| Ma et al. | The role of antibody-based troponin detection in cardiovascular disease: A critical assessment | |
| Sodhi et al. | Role of serum biomarkers in early detection of non-alcoholic steatohepatitis and fibrosis in West Virginian children | |
| JP2014519609A (en) | Prosomatostatin diagnostic use | |
| WO2019095403A1 (en) | Aβ KIT, DETECTION METHOD AND USE | |
| Biswas et al. | Association of low-density lipoprotein particle size and ratio of different lipoproteins and apolipoproteins with coronary heart disease | |
| JP4384634B2 (en) | Quantification of degree of oxidation | |
| US20100081149A1 (en) | Novel oxidized ldl complex and method for detection thereof | |
| Umehara et al. | A novel ultra-sensitive enzyme immunoassay for soluble human insulin receptor ectodomain and its measurement in urine from healthy subjects and patients with diabetes mellitus | |
| WO2021200797A1 (en) | Quantification method for modified hdl, and analysis reagent for use in same method | |
| JP5110353B2 (en) | Novel oxidized LDL complex and detection method thereof | |
| WO2024014426A1 (en) | Method for detecting risk associated with myositis/dermatomyositis | |
| JP6141257B2 (en) | C1q-adiponectin complex and use thereof | |
| Wang et al. | Measurement of oxidized lipoprotein (a) in patients with acute coronary syndromes and stable coronary artery disease by 2 ELISAs: Using different capture antibody against oxidized lipoprotein (a) or oxidized LDL | |
| WO2023013764A1 (en) | Method for estimating fibrosis progression and/or liver disease activity in non-alcoholic steatohepatitis | |
| EP2006682B1 (en) | Diagnosis of acute enteritis by determination of intestinal fatty acid-binding protein in the blood | |
| WO2021177333A1 (en) | Adiponectin quantification method and analysis reagent for use in said method | |
| JP2024009473A (en) | Model animal developing myositis/dermatomyositis interstitial pneumonia superimposed thereon | |
| Kitamura et al. | Advances in the clinical measurement of glucagon: from diagnosis to therapy | |
| JP4907399B2 (en) | Detection method of acute enteritis by measuring blood intestinal fatty acid binding protein | |
| JP6558729B2 (en) | Inspection method of glomerular injury |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160609 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20170118 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170209 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170410 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170928 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20171019 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6231307 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |