JP2007093312A - Method and kit for discriminating acute aortic dissection by h-fabp and d-dimer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血液中のＤ−ダイマー（D-dimer）濃度およびＨ−ＦＡＢＰ（Heart-type Fatty Acid-Binding Protein；心臓由来脂肪酸結合蛋白）濃度に基づいて、Stanford分類とDeBakey分類を組合せたStanford-DeBakey分類（以下、本明細書において単に「Stanford-DeBakey分類」という）による各病型の発症を判断する急性大動脈解離の鑑別方法、鑑別用試薬、鑑別用キット及び該キットを含む商業パッケージに関する。 The present invention relates to a Stanford that combines the Stanford classification and the DeBakey classification based on the D-dimer concentration and H-FABP (Heart-type Fatty Acid-Binding Protein) concentration in blood. -DeBakey classification (hereinafter simply referred to as “Stanford-DeBakey classification” in this specification) Acute aortic dissection discrimination method for judging the onset of each disease type, a differentiation reagent, a differentiation kit, and a commercial package including the kit .
急性大動脈解離は、循環器系疾患による死因の上位を占める疾患であり、激烈な胸痛を主訴とし、突然に発症して急速に死に至る転帰をとることが稀ではない疾患である。 Acute aortic dissection is a disease that occupies the top cause of death due to circulatory system disease, and is a rare disease that has a major complaint of severe chest pain and suddenly develops and results in rapid death.
本疾患は解離の発症部位やその大きさ等によって、臨床症状、治療方法及び予後等が異なる。従って、急性大動脈解離の適切な治療方針決定のために、Stanford分類やDeBakey分類などの各種の病型分類が、主にコンピューター断層撮影法（ＣＴ）などの画像診断によって行われている。 This disease has different clinical symptoms, treatment methods, prognosis, etc., depending on the site of dissection and its size. Therefore, in order to determine an appropriate treatment policy for acute aortic dissection, various types of disease types such as Stanford classification and DeBakey classification are mainly performed by image diagnosis such as computed tomography (CT).
Ｄ−ダイマーは二次線溶系亢進のマーカーとして、血液凝固・線溶系亢進の病態を詳細に把握するために利用されている生体内蛋白である。具体的には、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）や各種の血栓性疾患の診断、病態把握、治療効果判定のマーカーとして使用されている。 D-dimer is an in vivo protein that is used as a marker for secondary fibrinolysis enhancement to grasp in detail the pathology of blood coagulation / fibrinolysis enhancement. Specifically, it is used as a marker for diagnosing disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC) and various thrombotic diseases, grasping pathological conditions, and determining therapeutic effects.
非特許文献１には、急性心筋梗塞患者の血液中Ｄ−ダイマー濃度は健常人よりも上昇していることが記載されている（TABLE IV参照）。 Non-Patent Document 1 describes that the D-dimer concentration in blood of patients with acute myocardial infarction is higher than that in healthy individuals (see TABLE IV).
非特許文献２には、StanfordＡ型またはＢ型の急性大動脈解離を発症している患者血液中のＤ−ダイマー濃度が記載され、同じ急性大動脈解離患者をDeBakey分類によりI、II、III型に分類した場合の各患者血液中のＤ−ダイマー濃度も記載されている（Table ３参照）。 Non-patent document 2 describes the concentration of D-dimer in the blood of patients with acute aortic dissection of Stanford type A or B, and classifies the same acute aortic dissection patients as types I, II, and III according to the DeBakey classification. The D-dimer concentration in each patient's blood is also described (see Table 3).
また、特許文献１には、血液中のＤ−ダイマー濃度に基づいて急性大動脈解離（Stanford Ａ型またはＢ型）を判定する方法および急性大動脈解離（Stanford Ａ型またはＢ型）と急性心筋梗塞を鑑別する方法等が記載されている。 Patent Document 1 discloses a method for determining acute aortic dissection (Stanford type A or B) based on the concentration of D-dimer in blood, acute aortic dissection (Stanford type A or B), and acute myocardial infarction. The method of discrimination is described.
一方、Ｈ−ＦＡＢＰは心筋の細胞質内に豊富に存在し、脂肪酸と結合する能力を有し、脂肪酸の細胞内輸送に関係していると考えられている生体内蛋白であり、急性心筋梗塞判定用の血液中マーカーとして知られている。 On the other hand, H-FABP is an in vivo protein that is abundant in the cytoplasm of the myocardium, has the ability to bind to fatty acids, and is considered to be involved in intracellular transport of fatty acids. It is known as a blood marker.
例えば、特許文献２及び非特許文献３には血液中のＨ−ＦＡＢＰの濃度に基づく急性心筋梗塞の判定方法が記載されている。そして、血液中のＨ−ＦＡＢＰ濃度に基づく急性心筋梗塞の体外診断用医薬品として「ラピチェック（登録商標） Ｈ−ＦＡＢＰ」および「マーキット（登録商標）Ｍ Ｈ−ＦＡＢＰ」が大日本製薬株式会社より販売されている。 For example, Patent Document 2 and Non-Patent Document 3 describe a method for determining acute myocardial infarction based on the concentration of H-FABP in blood. Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. provides “RAPYCHECK (registered trademark) H-FABP” and “MERKIT (registered trademark) MH-FABP” as in vitro diagnostic pharmaceuticals for acute myocardial infarction based on H-FABP concentration in blood. Sold.
非特許文献４には、Stanford Ａ型急性大動脈解離患者およびＢ型急性大動脈解離患者の血液中のＨ−ＦＡＢＰ濃度が上昇することが記載されている。 Non-Patent Document 4 describes that the H-FABP concentration in the blood of patients with Stanford type A acute aortic dissection and type B acute aortic dissection increases.
また、非特許文献５には、Stanford Ａ型急性大動脈解離患者およびＢ型急性大動脈解離患者の血液中Ｈ−ＦＡＢＰ濃度の平均値が記載されている。 Non-Patent Document 5 describes the average value of H-FABP concentration in blood of Stanford type A acute aortic dissection patients and type B acute aortic dissection patients.
以上のように、非特許文献１、３及び特許文献２には各マーカーと急性心筋梗塞との関係が記載されている。また非特許文献２、４、５及び特許文献１においては、急性大動脈解離患者の血液中Ｄ−ダイマー濃度又はＨ−ＦＡＢＰ濃度のどちらか一方のみが測定の対象とされている。 As described above, Non-Patent Documents 1 and 3 and Patent Document 2 describe the relationship between each marker and acute myocardial infarction. In Non-Patent Documents 2, 4, 5 and Patent Document 1, only one of the D-dimer concentration and the H-FABP concentration in the blood of an acute aortic dissection patient is measured.
非特許文献６には、血液中のＤ−ダイマー濃度及びＨ−ＦＡＢＰ濃度の測定がStanfordＡ型急性大動脈解離と、StanfordＢ型急性大動脈解離と、急性心筋梗塞の鑑別に有用であることが記載されている。しかしながら、この文献には、Ｄ−ダイマー濃度及びＨ−ＦＡＢＰ濃度が、急性大動脈解離をStanford-DeBakey分類する際の指標となり得ることは記載されていない。 Non-Patent Document 6 describes that measurement of D-dimer concentration and H-FABP concentration in blood is useful for distinguishing between Stanford type A acute aortic dissection, Stanford type B acute aortic dissection, and acute myocardial infarction. Yes. However, this document does not describe that the D-dimer concentration and the H-FABP concentration can be used as an index when the acute aortic dissection is classified into the Stanford-DeBakey classification.
急性大動脈解離は前述のとおり経過が早く、その発症から重篤化するまでの時間が非常に短い疾患である。各病型に応じた適切な治療を急性大動脈解離発症の早期に行うためには、発症している病型を迅速に鑑別する必要がある。 As described above, acute aortic dissection is a disease that progresses quickly and the time from its onset to its seriousness is very short. In order to perform appropriate treatment according to each disease type at an early stage of acute aortic dissection, it is necessary to quickly identify the disease type that has developed.
疾患の迅速且つ簡便な診断手段として、生体試料中の生化学的マーカーを指標とした臨床検査法が広く用いられている。急性大動脈解離の病型分類においても、生化学的マーカーを指標にして、発症している病型の判断ができる急性大動脈解離の鑑別方法が望まれている。 As a rapid and simple diagnostic means of a disease, a clinical test method using a biochemical marker in a biological sample as an index is widely used. Also in the classification of acute aortic dissection, there is a demand for a method for differentiating acute aortic dissection that can be used to determine the type of disease that has occurred, using biochemical markers as indicators.
このような状況に鑑み、本発明は、血液を採取しその中の生化学的マーカーの濃度を測定することによって、Stanford-DeBakey分類による各病型の発症を判断する急性大動脈解離の鑑別方法、鑑別用試薬、鑑別用キット及び該キットを含む商業用パッケージを提供することを目的とする。 In view of such a situation, the present invention is a method for differentiating acute aortic dissection by determining the onset of each disease type according to the Stanford-DeBakey classification by collecting blood and measuring the concentration of a biochemical marker therein, An object is to provide a reagent for discrimination, a kit for discrimination, and a commercial package containing the kit.
本発明者らは急性大動脈解離を発症している患者の血液中のＤ−ダイマー濃度およびＨ−ＦＡＢＰ濃度を測定し、Stanford-DeBakey分類による各病型間でその値を比較した。その結果、Ｄ−ダイマー濃度とＨ−ＦＡＢＰ濃度の高低の組合せが各病型の間で異なること、特に、StanfordＢ型急性大動脈解離患者の中でもStanford B−DeBakey IIIa型とStanford B-DeBakey IIIb型の間ではＤ−ダイマー濃度が大きく異なることを見いだし本発明を完成した。 The present inventors measured the D-dimer concentration and H-FABP concentration in the blood of patients who developed acute aortic dissection, and compared the values among each disease type according to the Stanford-DeBakey classification. As a result, the combination of high and low D-dimer concentration and H-FABP concentration differs among the respective disease types. In particular, among Stanford B type acute aortic dissection patients, Stanford B-DeBakey IIIa type and Stanford B-DeBakey IIIb type It was found that the D-dimer concentrations differ greatly between the two, and the present invention was completed.
すなわち本発明は、以下のとおりである。 That is, the present invention is as follows.
［１］急性大動脈解離が疑われるヒトから分離された血液中のＤ−ダイマー濃度およびＨ−ＦＡＢＰ濃度に基づいて、Stanford A-DeBakey I型、Stanford A-DeBakey II型、Stanford A-DeBakey IIIb型、Stanford B-DeBakey IIIa型またはStanford B-DeBakey IIIb型の病型の中のいずれの急性大動脈解離を発症しているか、又はいずれの急性大動脈解離も発症していないかを判断する急性大動脈解離の鑑別方法、 [1] Stanford A-DeBakey type I, Stanford A-DeBakey type II, Stanford A-DeBakey type IIIb based on D-dimer concentration and H-FABP concentration in blood isolated from humans suspected of having acute aortic dissection Acute aortic dissection to determine which acute aortic dissection has occurred in any of Stanford B-DeBakey type IIIa or Stanford B-DeBakey IIIb type, or no acute aortic dissection has occurred Identification method,
［２］急性大動脈解離を発症しているヒトから分離された血液中のＤ−ダイマー濃度およびＨ−ＦＡＢＰ濃度に基づいて、発症している急性大動脈解離が、Stanford A-DeBakey
I型、Stanford A-DeBakey II型、Stanford A-DeBakey IIIb型、Stanford B-DeBakey IIIa型またはStanford B-DeBakey IIIb型のいずれの病型であるかを判断する急性大動脈解離の鑑別方法、
[2] Based on the D-dimer concentration and H-FABP concentration in blood isolated from a human who has developed acute aortic dissection, the developing acute aortic dissection is determined by Stanford A-DeBakey.
A method for differentiating acute aortic dissection to determine whether it is type I, Stanford A-DeBakey II, Stanford A-DeBakey IIIb, Stanford B-DeBakey IIIa or Stanford B-DeBakey IIIb,
［３］Ｄ−ダイマー濃度およびＨ−ＦＡＢＰ濃度が免疫化学的方法により測定された濃度である上記［１］又は［２］記載の鑑別方法、 [3] The differentiation method according to the above [1] or [2], wherein the D-dimer concentration and the H-FABP concentration are concentrations measured by an immunochemical method,
［４］免疫化学的方法が酵素免疫化学的方法、ラテックス凝集法または免疫クロマト法のいずれかである上記［３］記載の鑑別方法、 [4] The differentiation method according to the above [3], wherein the immunochemical method is any one of an enzyme immunochemical method, a latex agglutination method, and an immunochromatography method,
［５］Ｄ−ダイマーを認識する抗体を含む、Stanford A-DeBakey I型と、Stanford A-DeBakey II型と、Stanford A-DeBakey IIIb型と、Stanford B-DeBakey IIIa型と、Stanford B-DeBakey IIIb型の急性大動脈解離の鑑別用試薬であって、Ｈ−ＦＡＢＰを認識する抗体を含む試薬と組合せて用いることを特徴とする試薬、 [5] Stanford A-DeBakey type I, Stanford A-DeBakey type II, Stanford A-DeBakey type IIIb, Stanford B-DeBakey type IIIa, and Stanford B-DeBakey IIIb containing antibodies that recognize D-dimers Reagent for distinguishing type of acute aortic dissection, which is used in combination with a reagent containing an antibody that recognizes H-FABP,
［６］Ｈ−ＦＡＢＰを認識する抗体を含む、Stanford A-DeBakey I型と、Stanford A-DeBakey II型と、Stanford A-DeBakey IIIb型と、Stanford B-DeBakey IIIa型と、Stanford B-DeBakey IIIb型の急性大動脈解離の鑑別用試薬であって、Ｄ−ダイマーを認識する抗体を含む試薬と組合せて用いることを特徴とする試薬、 [6] Stanford A-DeBakey type I, Stanford A-DeBakey type II, Stanford A-DeBakey type IIIb, Stanford B-DeBakey type IIIa, and Stanford B-DeBakey IIIb containing antibodies that recognize H-FABP A reagent for distinguishing acute type aortic dissection, which is used in combination with a reagent containing an antibody that recognizes D-dimer,
［７］Ｄ−ダイマーを認識する抗体を含む試薬およびＨ−ＦＡＢＰを認識する抗体を含む試薬を含んでなる、Stanford A-DeBakey I型と、Stanford A-DeBakey II型と、Stanford A-DeBakey IIIb型と、Stanford B-DeBakey IIIa型と、Stanford B-DeBakey IIIb型の急性大動脈解離の鑑別用キット、 [7] Stanford A-DeBakey type I, Stanford A-DeBakey type II, and Stanford A-DeBakey IIIb comprising a reagent containing an antibody recognizing D-dimer and a reagent containing an antibody recognizing H-FABP Type, Stanford B-DeBakey IIIa type, Stanford B-DeBakey IIIb type aortic dissection differentiation kit,
［８］上記［７］に記載の鑑別用キット及び該キットに関する記載物を含む商業パッケージであって、該記載物および／または該パッケージに、該キットは、Stanford A-DeBakey I型と、Stanford A-DeBakey II型と、Stanford A-DeBakey IIIb型と、Stanford B-DeBakey IIIa型と、Stanford B-DeBakey IIIb型の急性大動脈解離の鑑別の用途に使用できる、または使用すべきであることが記載されている商業パッケージ。 [8] A commercial package including the identification kit according to [7] and a description related to the kit, wherein the description and / or the package includes a Stanford A-DeBakey type I, a Stanford A-DeBakey type II, Stanford A-DeBakey type IIIb, Stanford B-DeBakey type IIIa, and Stanford B-DeBakey type IIIb can be used or should be used to differentiate acute aortic dissection Have been commercial package.
上記本発明の鑑別方法は、急性大動脈解離をStanford-DeBakey分類による各病型に鑑別する際の各種検査（例えば、コンピューター断層撮影など）の中の一つとして実施され、測定された血液中の生化学的マーカー（すなわち、Ｄ−ダイマー及びＨ−ＦＡＢＰ）濃度が、鑑別のための判断材料の一つとして利用される。 The discrimination method of the present invention is carried out as one of various tests (for example, computed tomography, etc.) when differentiating acute aortic dissection into each disease type according to the Stanford-DeBakey classification. Biochemical marker (ie, D-dimer and H-FABP) concentrations are used as one of the judgment materials for discrimination.
また、上記本発明の鑑別用試薬、キット又は商業パッケージの使用は、本発明の鑑別方法と同一の効果を奏するものである。 In addition, the use of the above-described discrimination reagent, kit or commercial package of the present invention has the same effect as the discrimination method of the present invention.
本発明は、急性大動脈解離が疑われるヒトから分離された血液中のＤ−ダイマー濃度およびＨ−ＦＡＢＰ濃度に基づいて、Stanford A-DeBakey I型、Stanford A-DeBakey II型、Stanford A-DeBakey IIIb型、Stanford B-DeBakey IIIa型またはStanford B-DeBakey IIIb型の病型の中のいずれの急性大動脈解離を発症しているか、又はいずれの急性大動脈解離も発症していないかを判断する急性大動脈解離の鑑別方法に関する。 The present invention is based on the concentrations of D-dimer and H-FABP in blood isolated from humans suspected of having acute aortic dissection based on Stanford A-DeBakey type I, Stanford A-DeBakey type II, Stanford A-DeBakey IIIb. Aortic dissection to determine which acute aortic dissection has occurred in any of the types, Stanford B-DeBakey IIIa or Stanford B-DeBakey IIIb, or which has not developed any acute aortic dissection It is related with the discrimination method.
急性大動脈解離（Acute Aortic Dissection）は、大動脈壁を構成する中膜が解離し、内膜側と外膜側に裂けている病態を特徴とする疾患である。なお、大動脈壁は組織学的に血管内腔側から順に、内膜、中膜および外膜から構成される。 Acute Aortic Dissection is a disease characterized by a pathological condition in which the media that forms the aortic wall is dissociated and split into the intima and epicardium. The aortic wall is histologically composed of an intima, a media, and an adventitia in order from the blood vessel lumen side.
本疾患の典型的な初発症状は突然に生じる激烈な胸痛であり、この症状は一般に胸痛発作と呼ばれている。胸痛発作における痛みは、急性大動脈解離の発症部位の大きさによっては胸部には限局せず、背部にまで拡大し胸背部痛の様相を呈することもある。なお、このような痛みは大動脈壁が裂けることに起因する、と一般的には理解されている。 A typical first symptom of the disease is sudden and severe chest pain, commonly referred to as a chest pain attack. Pain in a chest pain attack is not limited to the chest, depending on the size of the site of acute aortic dissection, and may extend to the back to present chest-back pain. It is generally understood that such pain is caused by tearing of the aortic wall.
急性大動脈解離は、解離の発症部位や解離の大きさ等によって治療方法、予後などが異なる。従って、急性大動脈解離の治療方針決定のために各種の病型分類が行われる。 The treatment method and prognosis of acute aortic dissection differ depending on the site of dissection and the magnitude of dissociation. Therefore, various disease type classifications are performed to determine a treatment policy for acute aortic dissection.
Stanford分類は、急性大動脈解離の病型分類の代表的なものであり、急性大動脈解離症例のうち、解離が心臓から頚部に至る上行大動脈に存在する症例を「Stanford A型」、解離が上行大動脈には存在しない症例を「Stanford B型」と分類するものである。この分類によれば、急性大動脈解離は前記２つのいずれかの病型に分類される。 The Stanford classification is a representative type of acute aortic dissection. Among the cases of acute aortic dissection, the case where the dissection is present in the ascending aorta from the heart to the neck is “Stanford type A”, and the dissection is ascending aorta. Cases that do not exist are classified as “Stanford type B”. According to this classification, acute aortic dissection is classified into one of the above two types.
もう一つの代表的な病型分類であるDeBakey分類によれば、急性大動脈解離は、上行大動脈にエントリー（発症起点部位）があり大動脈弓部以下にまで解離がおよぶ「DeBakey I型」、上行大動脈に解離が限局する「DeBakey II型」、下行大動脈にエントリーがあり腹部大動脈に解離がおよばない「DeBakey IIIa型」、下行大動脈にエントリーがあり腹部大動脈に解離がおよぶ「DeBakey IIIb型」の４つの病型に分類される。 According to DeBakey classification, which is another typical disease type classification, acute aortic dissection is “DeBakey type I”, where there is an entry in the ascending aorta (onset site) and the dissection extends below the aortic arch. There are four types: "DeBakey type II", where dissociation is limited, "DeBakey type IIIa", which has entry in the descending aorta and does not affect dissection in the abdominal aorta, and "DeBakey IIIb type", which has entry in the descending aorta and dissociates in the abdominal aorta Classified as disease type.
従って、本発明で用いられるStanford-DeBakey分類によれば、急性大動脈解離は、以下の６つの病型に分類される。 Therefore, according to the Stanford-DeBakey classification used in the present invention, acute aortic dissection is classified into the following six types.
Stanford A-DeBakey I型；上行大動脈に解離がある症例であって、上行大動脈にエントリーがあり、大動脈弓部以下にまで解離がおよぶ症例。 Stanford A-DeBakey type I: A case with dissection in the ascending aorta, an entry in the ascending aorta, and dissection up to the aortic arch.
Stanford A-DeBakey II型；上行大動脈に解離がある症例であって、上行大動脈に解離が限局する症例。 Stanford A-DeBakey type II; a case where the ascending aorta is dissociated and the ascending aorta is dissociated locally.
Stanford A-DeBakey IIIa型；上行大動脈に解離がある症例であって、下行大動脈にエントリーがあり、腹部大動脈に解離がおよばない症例。 Stanford type A-DeBakey IIIa; a case with dissection in the ascending aorta, entry in the descending aorta, and no dissection in the abdominal aorta.
Stanford A-DeBakey IIIb型；上行大動脈に解離がある症例であって、下行大動脈にエントリーがあり、腹部大動脈に解離がおよぶ症例。 Stanford Type A-DeBakey IIIb; a case with dissection in the ascending aorta, entry in the descending aorta, and dissection in the abdominal aorta.
Stanford B-DeBakey IIIa型；上行大動脈に解離がない症例であって、下行大動脈にエントリーがあり、腹部大動脈に解離がおよばない症例。 Stanford B-DeBakey type IIIa; a case where the ascending aorta has no dissociation, an entry in the descending aorta, and a dissection in the abdominal aorta does not occur.
Stanford B-DeBakey IIIb型；上行大動脈に解離がない症例であって、下行大動脈にエントリーがあり、腹部大動脈に解離がおよぶ症例。 Stanford type B-DeBakey IIIb; a case where the ascending aorta has no dissociation, an entry in the descending aorta and a dissection in the abdominal aorta.
なお、以上の６病型のうち、Stanford A-DeBakey IIIa型の病型に属する急性大動脈解離症例の発生は稀である。 Of the above 6 types, the occurrence of acute aortic dissection belonging to the Stanford A-DeBakey IIIa type is rare.
本発明において、血液中のＤ−ダイマー濃度の測定は、特に制限されず何れの方法によっても行なうことができる。なお、本明細書において「濃度の測定」には、濃度を定量的に測定することのみならず、一定範囲内の濃度を半定量的に測定すること、及び一定濃度以上のＤ−ダイマーの存否を定性的に検出することの何れもが含まれる。 In the present invention, the measurement of the D-dimer concentration in blood is not particularly limited, and can be performed by any method. In the present specification, “concentration measurement” includes not only quantitative measurement of concentration, but also semi-quantitative measurement of concentration within a certain range, and the presence or absence of D-dimer above a certain concentration. Any of these is qualitatively detected.
血液中のＤ−ダイマー濃度を測定する方法として、例えば、免疫化学的方法、ＨＰＬＣ法等の各種クロマトグラフィー法などが挙げられ、その中でも特に、Ｄ−ダイマーを認識する抗体（以下「抗Ｄ−ダイマー抗体」ということもある）を使用する免疫化学的方法により測定するのが好ましい。 Examples of the method for measuring the D-dimer concentration in blood include various chromatographic methods such as an immunochemical method and HPLC method, and among them, an antibody that recognizes D-dimer (hereinafter referred to as “anti-D-”). It is preferably measured by an immunochemical method using a “dimer antibody”.
血液中のＤ−ダイマー濃度の測定に使用される免疫化学的方法としては、特に制限はなく、従来公知の例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、ラテックス凝集法、免疫クロマト法、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、抗原抗体複合体形成に伴う濁度を測定する比濁法、抗体固相膜電極を利用し抗原との結合による電位変化を検出する酵素センサー電極法、免疫電気泳動法、ウエスタンブロット法などが挙げられる。これらの中でも、ＥＩＡ法、ラテックス凝集法または免疫クロマト法によってＤ−ダイマー濃度を測定するのが好ましい。 There is no restriction | limiting in particular as an immunochemical method used for the measurement of the D-dimer density | concentration in blood, For example, a conventionally well-known enzyme immunoassay method (EIA method), latex agglutination method, immunochromatography method, radioimmunoassay Method (RIA method), fluorescent immunoassay method (FIA method), luminescence immunoassay method, spin immunoassay method, turbidimetric method for measuring turbidity associated with antigen-antibody complex formation, antigen using antibody solid phase membrane electrode An enzyme sensor electrode method, an immunoelectrophoresis method, a Western blot method, and the like that detect a potential change due to binding to the enzyme. Among these, it is preferable to measure the D-dimer concentration by EIA method, latex aggregation method or immunochromatography method.
ＥＩＡ法には、酵素標識抗原と検体中の抗原とを競合させる競合法と、競合させることのない非競合法があるが、これらの方法の中でも、２種類の抗体、特にモノクローナル抗体を用いた、非競合法の一種であるサンドイッチ酵素結合免疫固相測定法（サンドイッチＥＬＩＳＡ法）が抗原（Ｄ−ダイマー）に対する特異性および検出操作の容易性において特に好ましい。 The EIA method includes a competitive method for competing an enzyme-labeled antigen and an antigen in a sample, and a non-competitive method that does not allow competition. Among these methods, two types of antibodies, particularly monoclonal antibodies, were used. A sandwich enzyme-linked immunosorbent solid phase assay (sandwich ELISA method), which is a kind of non-competitive method, is particularly preferable in terms of specificity to an antigen (D-dimer) and ease of detection.
サンドイッチＥＬＩＳＡ法によれば、Ｄ−ダイマーに存在する異なったエピトープを認識する２種類の抗体、すなわち固相化抗Ｄ−ダイマー抗体と酵素標識抗Ｄ−ダイマー抗体との間に、Ｄ−ダイマーを挟み込む（サンドイッチ）ことによってＤ−ダイマー濃度を測定することができる。すなわち、固相化抗体によって捕捉されたＤ−ダイマーと結合した標識抗体の酵素量を測ることにより、Ｄ−ダイマー濃度を測定することができる。 According to the sandwich ELISA method, a D-dimer is detected between two types of antibodies that recognize different epitopes present in the D-dimer, namely, an immobilized anti-D-dimer antibody and an enzyme-labeled anti-D-dimer antibody. The D-dimer concentration can be measured by sandwiching (sandwich). That is, the D-dimer concentration can be measured by measuring the amount of enzyme of the labeled antibody bound to the D-dimer captured by the immobilized antibody.
また、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の一種としてアビジン−ビオチン反応を利用した方法もある。本法によれば、血液中のＤ−ダイマーを固相化抗Ｄ−ダイマー抗体でもって捕捉し、捕捉されたＤ−ダイマーとビオチンで標識した抗Ｄ−ダイマー抗体との間で抗原抗体反応を行わせ、次に、酵素標識ストレプトアビジンを加えることによって、以下、前記と同様にしてＤ−ダイマー濃度を測定することができる。 There is also a method using an avidin-biotin reaction as a kind of sandwich ELISA method. According to this method, D-dimer in blood is captured with an immobilized anti-D-dimer antibody, and an antigen-antibody reaction is performed between the captured D-dimer and an anti-D-dimer antibody labeled with biotin. Next, by adding enzyme-labeled streptavidin, the D-dimer concentration can be measured in the same manner as described above.
ラテックス凝集法は、抗体感作ラテックス粒子と抗原との凝集反応を利用した免疫化学的方法である。この方法によるＤ−ダイマー濃度の測定は、抗Ｄ−ダイマー抗体感作ラテックス粒子と検体血液中のＤ−ダイマーとを免疫反応せしめ、その結果生じたラテックス粒子の凝集の程度を測定することにより実施できる。 The latex agglutination method is an immunochemical method using an agglutination reaction between antibody-sensitized latex particles and an antigen. The measurement of D-dimer concentration by this method is performed by immunoreacting anti-D-dimer antibody-sensitized latex particles with D-dimer in the sample blood and measuring the degree of aggregation of the resulting latex particles. it can.
また、免疫クロマト法は全ての免疫化学反応系がシート状のキャリア上に保持されており、血液の添加のみで操作が完了する方法である。本法によるＤ−ダイマーの濃度測定の要領は、次のとおりである。まず、検体たる血液がキャリアに滴下されると、血液中のＤ−ダイマーとキャリア上に配置された標識物（金コロイド等）で標識された抗Ｄ−ダイマー抗体とが免疫反応し、その結果、免疫複合体が生成される。この複合体がキャリア上を展開してゆき、その特定箇所に固相化された別のエピトープを認識する抗Ｄ−ダイマー抗体に捕捉されると標識物が集積し、その集積度合いを肉眼で観察することによって、Ｄ−ダイマー濃度を測定することができる。 In the immunochromatography method, all immunochemical reaction systems are held on a sheet-like carrier, and the operation is completed only by adding blood. The procedure for measuring the concentration of D-dimer by this method is as follows. First, when blood as a specimen is dropped onto a carrier, D-dimer in the blood and an anti-D-dimer antibody labeled with a label (eg gold colloid) arranged on the carrier undergo an immunoreaction, and as a result An immune complex is produced. When this complex develops on the carrier and is captured by an anti-D-dimer antibody that recognizes another epitope solid-phased at a specific location, the labeled substance accumulates and the degree of accumulation is observed with the naked eye. By doing this, the D-dimer concentration can be measured.
免疫クロマト法の実施には特別な測定機器は不要であり、病院外での判定や、救急などの迅速な判定が求められる場合には有利な方法である。本方法は一定の濃度以上のＤ−ダイマーの存在を定性的に検出するのに特に適しており、後述するカットオフ値をあらかじめ定めた場合には、カットオフ値以上のＤ−ダイマーを検出すれば陽性の結果が、また、カットオフ値未満であれば陰性の結果が出るように容易に設定することができる。 The implementation of immunochromatography does not require a special measuring instrument, and is an advantageous method when a quick judgment such as judgment outside the hospital or emergency is required. This method is particularly suitable for qualitatively detecting the presence of a D-dimer above a certain concentration. When a cutoff value described later is determined in advance, a D-dimer above the cutoff value can be detected. It can be easily set so that a positive result is obtained if it is less than the cut-off value and a negative result is obtained.
なお、血液中のＤ−ダイマー濃度の測定を目的とする上記サンドイッチＥＬＩＳＡ法やラテックス凝集法などの免疫化学的方法は既に公知であり、これらの方法を利用したＤ−ダイマーの測定試薬は後述のとおり市販されている。これらの試薬を使用すれば、血液中のＤ−ダイマー濃度の測定は容易に実施することができる。 In addition, immunochemical methods such as the above-mentioned sandwich ELISA method and latex agglutination method for measuring the D-dimer concentration in blood are already known, and D-dimer measurement reagents using these methods are described later. Are commercially available. If these reagents are used, the measurement of D-dimer concentration in blood can be easily performed.
一方、血液中のＨ−ＦＡＢＰ濃度の測定も、これまでに述べたＤ−ダイマー濃度を測定する方法と同様にして実施できる。 On the other hand, the measurement of H-FABP concentration in blood can also be performed in the same manner as the method for measuring the D-dimer concentration described above.
これらの測定方法の中でも、Ｄ−ダイマー濃度の測定の場合と同様に、Ｈ−ＦＡＢＰを認識する抗体（以下「抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体」ということもある）を使用する免疫化学的方法によって測定するのが好ましく、特に、ＥＩＡ法、ラテックス凝集法、免疫クロマト法によって濃度を測定するのが好ましい。 Among these measurement methods, similarly to the measurement of D-dimer concentration, measurement is performed by an immunochemical method using an antibody recognizing H-FABP (hereinafter sometimes referred to as “anti-H-FABP antibody”). In particular, it is preferable to measure the concentration by EIA method, latex agglutination method, and immunochromatography.
なお、血液中のＨ−ＦＡＢＰ濃度の測定を目的とするサンドイッチＥＬＩＳＡ法やイムノクロマト法などの免疫化学的方法は、後述するように既に公知であり、これらの方法を利用したＨ−ＦＡＢＰの測定試薬が市販されている。これらの試薬を使用すれば、血液中のＨ−ＦＡＢＰ濃度の測定は容易に実施することができる。 In addition, immunochemical methods such as sandwich ELISA and immunochromatography for measuring the concentration of H-FABP in blood are already known as described later, and a reagent for measuring H-FABP using these methods. Is commercially available. If these reagents are used, the measurement of H-FABP concentration in blood can be easily performed.
本発明において、検体として使用される血液としては、全血、血清、血漿のいずれであってもよく、これらは、ヒトから採取した血液を常法に従って処理することで、適宜、得ることができる。 In the present invention, blood used as a specimen may be whole blood, serum, or plasma, and these can be appropriately obtained by processing blood collected from a human according to a conventional method. .
以上のようにして測定された血液中のＤ−ダイマー濃度及びＨ−ＦＡＢＰ濃度の両方を、例えば、予め求めておいたStanford-DeBakey分類の各病型を発症している多数の患者の平均値や分布と比較することによって、どの病型に属する可能性が高いのかを判断し、各病型の鑑別を行うことができる。 Both the D-dimer concentration and the H-FABP concentration in the blood measured as described above are, for example, the average values of a large number of patients who have developed each of the Stanford-DeBakey classifications. By comparing with or distribution, it is possible to determine which disease type is most likely to belong to, and to distinguish each disease type.
また、測定された両マーカーの濃度の組合せがいずれの病型の平均値等とも乖離している場合には、いずれの急性大動脈解離も発症していない可能性が高いと判断できる。例えば、臨床症状等から急性大動脈解離が疑われ、本発明の鑑別方法によっていずれの急性大動脈解離も発症していない、と判断された場合にそのヒトが発症している可能性のある代表的な疾患として、急性心筋梗塞が挙げられる。 Moreover, when the measured combination of the concentrations of both markers deviates from the average value of any disease type or the like, it can be determined that there is a high possibility that any acute aortic dissection has not occurred. For example, a representative representative of a person who may have developed an acute aortic dissection based on clinical symptoms, etc., when it is determined that any acute aortic dissection has not occurred by the differentiation method of the present invention. The disease includes acute myocardial infarction.
急性心筋梗塞は急性大動脈解離と同様に激烈な胸痛（胸痛発作）を主訴とする疾患であり、この両者は共通する臨床症状から「二大胸痛疾患」と呼ばれている。 Acute myocardial infarction is a disease whose main complaint is severe chest pain (chest pain attack), similar to acute aortic dissection, and both are called “two major chest pain diseases” because of common clinical symptoms.
例えば、後記実施例に記載されている急性大動脈解離の患者59名の血液中Ｈ−ＦＡＢＰ濃度の平均値及びＤ−ダイマー濃度の平均値はそれぞれ、
Stanford A-DeBakey I型(n=16)が18.3 ng/mL及び60.5 μg/mLであり、
Stanford A-DeBakey II型(n=7)が27.8 ng/mL及び7.2 μg/mLであり、
Stanford A-DeBakey IIIb型(n=9)が11.8 ng/mL及び53.8 μg/mLであり、
Stanford B-DeBakey IIIa型(n=11)が5.0 ng/mL及び3.6 μg/mLであり、
Stanford B-DeBakey IIIb型(n=16)が8.4 ng/mL及び31.1 μg/mLである。
For example, the average value of H-FABP concentration and the average value of D-dimer concentration in the blood of 59 patients with acute aortic dissection described in Examples below are
Stanford A-DeBakey type I (n = 16) is 18.3 ng / mL and 60.5 μg / mL,
Stanford A-DeBakey type II (n = 7) is 27.8 ng / mL and 7.2 μg / mL,
Stanford A-DeBakey IIIb type (n = 9) is 11.8 ng / mL and 53.8 μg / mL,
Stanford B-DeBakey IIIa type (n = 11) is 5.0 ng / mL and 3.6 μg / mL,
Stanford B-DeBakey IIIb type (n = 16) is 8.4 ng / mL and 31.1 μg / mL.
なお、後記実施例において対照とした心筋梗塞患者43名の血液中Ｈ−ＦＡＢＰ濃度、及びＤ−ダイマー濃度の平均値はそれぞれ、63.7 ng/mL及び0.5 μg/mLであった。 In addition, the average values of H-FABP concentration and D-dimer concentration in blood of 43 patients with myocardial infarction as controls in Examples described later were 63.7 ng / mL and 0.5 μg / mL, respectively.
上記に示すように、Ｄ−ダイマー濃度及びＨ−ＦＡＢＰ濃度の両方を組合せて検討した場合に、各病型間で、そのパターンが大きく相違していた。 As shown above, when both D-dimer concentration and H-FABP concentration were examined in combination, the pattern was greatly different between each disease type.
また、各マーカーのカットオフ値を予め設定し、測定された血液中の各マーカーの濃度と前記カットオフ値とを比較して、各病型の発症の可能性を判断することにより、本発明の鑑別方法を実施することもできる。 In addition, by setting the cutoff value of each marker in advance, comparing the measured concentration of each marker in the blood with the cutoff value, and determining the possibility of the onset of each disease type, the present invention It is also possible to carry out the discrimination method.
なお、「カットオフ値」は、その値を基準として疾患の判定をした場合に、高い診断感度（有病正診率）及び高い診断特異度（無病正診率）の両方を満足できる値である。 The “cut-off value” is a value that can satisfy both high diagnostic sensitivity (prevalence of correct diagnosis) and high diagnostic specificity (prevalence of non-diagnostic diagnosis) when a disease is determined based on that value. is there.
例えば、Ｈ−ＦＡＢＰについていえば、Stanford A型急性大動脈解離を発症している患者で高い陽性（カットオフ値以上）率を示し、かつ、Stanford B型急性大動脈解離を発症している患者で高い陰性（カットオフ値未満）率を示す血液中のＨ−ＦＡＢＰ濃度をカットオフ値として設定することができる。 For example, with regard to H-FABP, patients who have developed Stanford type A acute aortic dissection have a high positive (cutoff value or higher) rate, and those who have developed Stanford type B acute aortic dissection are high. The H-FABP concentration in blood showing a negative (less than cut-off value) rate can be set as the cut-off value.
カットオフ値の算出方法は、この分野において周知である。前記Ｈ−ＦＡＢＰの場合、例えば、多数のStanford A型急性大動脈解離患者及びStanford B型急性心筋梗塞患者の血液中のＨ−ＦＡＢＰ濃度を測定し、測定された各濃度における、診断感度および診断特異度を求め、これらの値に基づき、市販の解析ソフトを使用してＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を作成する。そして、診断感度と診断特異度が可能な限り１００％に近いときのＨ−ＦＡＢＰ濃度を求めて、その値をカットオフ値とすることができる。また、例えば、検出された各濃度における診断効率（全症例数に対する、有病正診症例と無病正診症例の合計数の割合）を求め、最も高い診断効率が算出される濃度をカットオフ値とすることもできる。 The calculation method of the cut-off value is well known in this field. In the case of the H-FABP, for example, the H-FABP concentration in the blood of a large number of patients with Stanford type A acute aortic dissection and Stanford type B acute myocardial infarction is measured, and the diagnostic sensitivity and diagnostic specificity at each measured concentration are measured. Based on these values, a ROC (Receiver Operating Characteristic) curve is created using commercially available analysis software. Then, the H-FABP concentration when the diagnostic sensitivity and diagnostic specificity are as close to 100% as possible is obtained, and the value can be used as a cutoff value. In addition, for example, the diagnostic efficiency at each detected concentration (the ratio of the total number of diseased and non-diagnosed correct cases to the total number of cases) is determined, and the concentration at which the highest diagnostic efficiency is calculated is cut off. It can also be.
同一の検体を対象とした場合でも、各マーカーの測定値は使用する測定方法や試薬によって異なることもあるので、カットオフ値は使用する測定方法や試薬ごとに設定する必要がある。 Even when the same specimen is targeted, the measurement value of each marker may differ depending on the measurement method and reagent used, and therefore the cut-off value must be set for each measurement method and reagent used.
前記のとおり、Stanford A型とStanford B型の間でＨ−ＦＡＢＰ濃度が大きく異なることから、本発明は、Stanford A型とStanford B-DeBakey IIIa型とStanford B-DeBakey IIIb型の急性大動脈解離の鑑別方法又はStanford B型とStanford A-DeBakey I型とStanford
A-DeBakey II型とStanford A-DeBakey IIIa型の急性大動脈解離の鑑別方法の形態であっても良い。
As described above, since the H-FABP concentration is significantly different between Stanford A type and Stanford B type, the present invention relates to acute aortic dissection of Stanford A type, Stanford B-DeBakey IIIa type, and Stanford B-DeBakey IIIb type. Identification method or Stanford B type and Stanford A-DeBakey I type and Stanford
It may be in the form of a method for differentiating acute aortic dissection between A-DeBakey type II and Stanford A-DeBakey type IIIa.
本発明の鑑別方法は、心臓血管系疾患の公知の一般的な臨床検査方法、例えば、胸部単純Ｘ線撮影、超音波断層撮影、コンピューター断層撮影などと併用して実施され、これらの検査結果が総合的に判断されて急性大動脈解離の病型鑑別は行われる。 The differentiation method of the present invention is carried out in combination with known general clinical examination methods for cardiovascular diseases, for example, chest X-ray photography, ultrasonic tomography, computed tomography, etc. Judgment of the type of acute aortic dissection is performed comprehensively.
本発明は、Ｄ−ダイマーを認識する抗体を含む、Stanford A-DeBakey I型と、Stanford
A-DeBakey II型と、Stanford A-DeBakey IIIb型と、Stanford B-DeBakey IIIa型と、Stanford B-DeBakey IIIb型の急性大動脈解離の鑑別用試薬であって、Ｈ−ＦＡＢＰを認識する抗体を含む試薬と組合せて用いることを特徴とする試薬、に関する。
The present invention relates to a Stanford A-DeBakey type I containing an antibody that recognizes D-dimer, and Stanford.
A-DeBakey type II, Stanford A-DeBakey type IIIb, Stanford B-DeBakey type IIIa, and Stanford B-DeBakey type IIIb acute aortic dissection reagents, including antibodies that recognize H-FABP The present invention relates to a reagent characterized by being used in combination with a reagent.
前記急性大動脈解離の鑑別用試薬は、本発明の鑑別方法の実施において、免疫化学的方法によりＤ−ダイマー濃度を測定する場合に好適に使用することができる。 The reagent for discrimination of acute aortic dissection can be suitably used when the D-dimer concentration is measured by an immunochemical method in carrying out the discrimination method of the present invention.
前記試薬に含まれる抗Ｄ−ダイマー抗体は、ヒトから分離された血液中に存在するＤ−ダイマーを認識し、Ｄ−ダイマーとの特異的な免疫反応性を有するものであれば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでも良い。両者のうち、抗体の安定供給の点において、また、Ｄ−ダイマーに対する高い特異性及び均一性の点においてモノクローナル抗体が好ましい。 As long as the anti-D-dimer antibody contained in the reagent recognizes D-dimer present in blood separated from human and has specific immunoreactivity with D-dimer, polyclonal antibody or Any of monoclonal antibodies may be used. Of these, the monoclonal antibody is preferable in terms of stable supply of the antibody and high specificity and homogeneity with respect to the D-dimer.
このような抗Ｄ−ダイマー抗体は公知の手段により製造することができ、遊離の状態、標識された状態または固相化された状態で前記試薬に含まれる。 Such an anti-D-dimer antibody can be produced by a known means, and is contained in the reagent in a free state, a labeled state or a solid phase.
ポリクローナル抗体は、常法によりヒトの血液から分離・精製されたＤ−ダイマーを適当なアジュバントとともにマウス、ラット、ウサギなどの動物に免疫し、血液を採取して公知の処理をなすことにより製造することができる。 Polyclonal antibodies are produced by immunizing animals such as mice, rats, rabbits and the like with D-dimers separated and purified from human blood by a conventional method, collecting blood and performing known treatments. be able to.
また、モノクローナル抗体は、このように免疫された動物の脾臓細胞を採取し、ミルシュタインらの方法によりミエローマ細胞との細胞融合、抗体産生細胞スクリーニング及びクローニング等を行い、抗Ｄ−ダイマー抗体を産生する細胞株を樹立し、これを培養することにより製造することができる。ここで、免疫抗原として使用されるＤ−ダイマーは、必ずしもヒトの血液中に存在する天然のＤ−ダイマーである必要はなく、遺伝子工学的手法により得られる組換え型Ｄ−ダイマーやそれらの同効物（断片）であってもよい。 Monoclonal antibodies can be obtained by collecting spleen cells of animals immunized in this way and performing cell fusion with myeloma cells, antibody-producing cell screening, cloning, etc. by the method of Milstein et al. To produce anti-D-dimer antibodies. Cell lines can be established and cultured. Here, the D-dimer used as an immunizing antigen does not necessarily need to be a natural D-dimer present in human blood, but a recombinant D-dimer obtained by genetic engineering techniques or their equivalents. It may be an effect (fragment).
Ｄ−ダイマー濃度の測定に、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用する場合、かくして得られた抗Ｄ−ダイマー抗体は、固相化抗Ｄ−ダイマー抗体及び酵素標識抗Ｄ−ダイマー抗体の形態で前記試薬に含まれる。 When the sandwich ELISA method is employed for measuring the D-dimer concentration, the anti-D-dimer antibody thus obtained is contained in the reagent in the form of a solid-phased anti-D-dimer antibody and an enzyme-labeled anti-D-dimer antibody. It is.
固相化抗Ｄ−ダイマー抗体は、前述のようにして得られた抗Ｄ−ダイマー抗体を固相（例えば、マイクロプレートウェルやプラスチックビーズ）に結合させることにより製造することができる。固相への結合は、通常、抗体をクエン酸緩衝液等の適当な緩衝液に溶解し、固相表面と抗体溶液を適当な時間（１〜２日）接触させることにより行うことができる。 The solid-phased anti-D-dimer antibody can be produced by binding the anti-D-dimer antibody obtained as described above to a solid phase (for example, a microplate well or plastic beads). The binding to the solid phase can be usually performed by dissolving the antibody in an appropriate buffer solution such as a citrate buffer and bringing the surface of the solid phase and the antibody solution into contact for an appropriate time (1 to 2 days).
さらに、非特異的吸着や非特異的反応を抑制するために、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）や牛ミルク蛋白等のリン酸緩衝溶液を固相と接触させ、抗体によってコートされなかった固相表面部分を前記ＢＳＡや牛ミルク蛋白等でブロッキングすることが一般的に行われる。 Furthermore, in order to suppress non-specific adsorption or non-specific reaction, a phosphate buffer solution such as bovine serum albumin (BSA) or bovine milk protein is brought into contact with the solid phase, and the solid surface portion not coated with the antibody Is generally blocked with BSA, bovine milk protein or the like.
酵素標識抗Ｄ−ダイマー抗体は、上記固相化された抗体とは異なるエピトープを認識する抗Ｄ−ダイマー抗体と酵素とを結合（標識）させることにより製造できる。該抗体を標識する酵素としては、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。これらの酵素と抗Ｄ−ダイマー抗体との結合はそれ自体公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、マレイミド法などにより行うことができる。 The enzyme-labeled anti-D-dimer antibody can be produced by binding (labeling) an anti-D-dimer antibody that recognizes an epitope different from that of the above-described immobilized antibody and an enzyme. Examples of the enzyme that labels the antibody include alkaline phosphatase, glucose oxidase, peroxidase, and β-galactosidase. The binding between these enzymes and the anti-D-dimer antibody can be performed by a method known per se, for example, glutaraldehyde method, maleimide method and the like.
また、ＥＬＩＳＡ法においてアビジン−ビオチン反応を利用する場合、前記試薬に含まれるビオチン標識抗Ｄ−ダイマー抗体は、例えば、市販のビオチン標識化キットを使用することにより製造できる。 When an avidin-biotin reaction is used in the ELISA method, the biotin-labeled anti-D-dimer antibody contained in the reagent can be produced, for example, by using a commercially available biotin labeling kit.
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施する場合、前記抗Ｄ−ダイマー抗体以外に必要に応じて、標準物質、洗浄液、酵素活性測定用試薬（基質剤、基質溶解液、反応停止液等）、酵素標識ストレプトアビジン（アビジン−ビオチン反応を利用する場合）などが使用される。従って、本発明の抗Ｄ−ダイマー抗体を含む鑑別用試薬は、抗Ｄ−ダイマー抗体以外にこれらを構成試薬として有するキットの形態であってもよい。 When the sandwich ELISA method is performed, in addition to the anti-D-dimer antibody, a standard substance, a washing solution, a reagent for enzyme activity measurement (substrate agent, substrate solution, reaction stop solution, etc.), enzyme-labeled streptavidin ( And avidin-biotin reaction are used. Therefore, the differentiation reagent containing the anti-D-dimer antibody of the present invention may be in the form of a kit having these as constituent reagents in addition to the anti-D-dimer antibody.
前記基質剤としては、選択した標識酵素に応じて適当なものが選ばれる。例えば、酵素としてパーオキシダーゼを選択した場合においては、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）などが使用され、アルカリフォスファターゼを選択した場合においては、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）などが使用される。また、反応停止液、基質溶解液についても、選択した酵素に応じて、従来公知のものを特に制限なく適宜使用することができる。 As the substrate agent, an appropriate one is selected according to the selected labeling enzyme. For example, when peroxidase is selected as the enzyme, o-phenylenediamine (OPD), tetramethylbenzidine (TMB), or the like is used. When alkaline phosphatase is selected, p-nitrophenyl phosphate (PNPP) is used. Etc. are used. As the reaction stop solution and substrate solution, conventionally known ones can be appropriately used without particular limitation depending on the selected enzyme.
なお、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＤ−ダイマーの測定試薬が多数販売されており（例えば、ベーリンガーマンハイム社「アセラクロムＤダイマー」（商品名）、富士レビオ社「ダイマーテストＥＩＡ」（商品名）など）、これらの試薬を本発明の鑑別用試薬として使用することもできる。 In addition, many measuring reagents for D-dimer by sandwich ELISA method are sold (for example, Boehringer Mannheim "Acerachrome D dimer" (trade name), Fujirebio "Dimer Test EIA" (trade name), etc.) These reagents can also be used as the discrimination reagent of the present invention.
Ｄ−ダイマー濃度の測定にラテックス凝集法を採用する場合、抗Ｄ−ダイマー抗体は、ラテックス感作抗Ｄ−ダイマー抗体の形態で本発明の試薬に含まれる。ラテックス粒子と抗Ｄ−ダイマー抗体との感作（結合）は、この分野で公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカルボジイミドやグルタルアルデヒド等を用いる方法）や物理吸着法により成すことができる。 When the latex agglutination method is employed for measuring the D-dimer concentration, the anti-D-dimer antibody is included in the reagent of the present invention in the form of a latex-sensitized anti-D-dimer antibody. Sensitization (binding) between latex particles and anti-D-dimer antibody can be performed by a method known in this field, for example, a chemical bonding method (a method using carbodiimide or glutaraldehyde as a crosslinking agent) or a physical adsorption method. it can.
ラテックス凝集法を実施する場合、上記ラテックス感作抗体以外に必要に応じて、希釈安定化緩衝液、標準抗原などが使用される。従って、本発明の抗Ｄ−ダイマー抗体を含む鑑別用試薬は、抗Ｄ−ダイマー抗体以外にこれらを構成試薬として有するキットの形態であってもよい。 When carrying out the latex agglutination method, a dilution stabilizing buffer, a standard antigen or the like is used as necessary in addition to the latex-sensitized antibody. Therefore, the differentiation reagent containing the anti-D-dimer antibody of the present invention may be in the form of a kit having these as constituent reagents in addition to the anti-D-dimer antibody.
なお、ラテックス凝集法によるＤ−ダイマーの測定試薬が多数販売されており（例えば、ダイアヤトロン社「エルピアエースＤ−Ｄダイマー」（商品名）、日本ロッシュ社「コアグソルＤ−ダイマー」（商品名）など）、これらの試薬を本発明の鑑別用試薬として使用することもできる。 Many reagents for measuring D-dimer by the latex agglutination method are available (for example, Diatron "Elpier Ace DD-dimer" (trade name), Nippon Roche "Coagsol D-dimer" (trade name), etc. ), And these reagents can also be used as the reagent for identification of the present invention.
Ｄ−ダイマー濃度の測定に免疫クロマト法を採用する場合、抗Ｄ−ダイマー抗体は、固相化抗Ｄ−ダイマー抗体及び標識抗Ｄ−ダイマー抗体の形態で本発明の鑑別用試薬に含まれる。標識抗Ｄ−ダイマー抗体における標識物として、この分野において公知のものを適宜使用することができるが、その中でも金コロイドを使用するのが好ましい。 When employing an immunochromatography method for measuring the D-dimer concentration, the anti-D-dimer antibody is included in the differentiation reagent of the present invention in the form of a solid-phased anti-D-dimer antibody and a labeled anti-D-dimer antibody. As a labeled product in the labeled anti-D-dimer antibody, those known in this field can be appropriately used, and among them, it is preferable to use a gold colloid.
このような免疫クロマト法による本発明の鑑別用試薬は、例えば、後述する免疫クロマト法によるＨ−ＦＡＢＰ測定試薬の製造方法が記載されている“Clinical Biochemistry ”34 (2001), p.257-263、を参考にして製造することができる。 The differentiation reagent of the present invention by such immunochromatography is, for example, “Clinical Biochemistry” 34 (2001), p.257-263, which describes a method for producing an H-FABP measurement reagent by immunochromatography described later. , Can be produced with reference to.
本発明の抗Ｄ−ダイマー抗体を含む急性大動脈解離の鑑別用試薬は、抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体を含む試薬と組合せて用いることを特徴とするものである。当該抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体を含む試薬は、後述する本発明の抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体を含む鑑別用試薬とその構成は同じであり、免疫化学的方法により血液中のＨ−ＦＡＢＰ濃度を測定する試薬である。 The reagent for distinguishing acute aortic dissection containing the anti-D-dimer antibody of the present invention is characterized by being used in combination with a reagent containing an anti-H-FABP antibody. The reagent containing the anti-H-FABP antibody has the same configuration as that of the differentiation reagent containing the anti-H-FABP antibody of the present invention described later, and a reagent for measuring the H-FABP concentration in blood by an immunochemical method It is.
本発明は、Ｈ−ＦＡＢＰを認識する抗体を含む、Stanford A-DeBakey I型と、StanfordA-DeBakey II型と、Stanford A-DeBakey IIIb型と、Stanford B-DeBakey IIIa型と、Stanford B-DeBakey IIIb型の急性大動脈解離の鑑別用試薬であって、Ｄ−ダイマーを認識する抗体を含む試薬と組合せて用いることを特徴とする試薬、に関する。 The present invention relates to a Stanford A-DeBakey type I, a Stanford A-DeBakey type II, a Stanford A-DeBakey type IIIb type, a Stanford B-DeBakey type IIIa type, and a Stanford B-DeBakey type IIIb containing an antibody that recognizes H-FABP. The present invention relates to a reagent for identifying a type of acute aortic dissection, which is used in combination with a reagent containing an antibody that recognizes D-dimer.
前記抗Ｈ−ＦＡＢＰを含む鑑別用試薬は、本発明の鑑別方法の実施において、免疫化学的方法によりＨ−ＦＡＢＰ濃度を測定する場合に好適に使用することができ、これまでに記載した抗Ｄ−ダイマー抗体を含む鑑別用試薬の場合と同様にして公知の方法に従い製造することができる。 The discrimination reagent containing the anti-H-FABP can be suitably used when measuring the H-FABP concentration by an immunochemical method in carrying out the discrimination method of the present invention. -It can be produced according to a known method in the same manner as in the case of a differentiation reagent containing a dimer antibody.
例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＨ−ＦＡＢＰの測定試薬の具体的な製造方法は“Journal of Immunological Methods”178 (1995), p.99-111に、ラテックス凝集法による測定試薬については“Clinical Chemistry ”44, No.7, 1998, p.1564-1567や特開平４−３１７６２号公報に、また、免疫クロマト法による測定試薬については前記“Clinical Biochemistry” 34 (2001), p.257-263に記載されている。 For example, a specific method for producing a measuring reagent for H-FABP by sandwich ELISA is described in “Journal of Immunological Methods” 178 (1995), p. 99-111, and a measuring reagent for latex agglutination is “Clinical Chemistry” 44 , No. 7, 1998, p. 1564-1567 and JP-A-4-31762, and the measurement reagent by immunochromatography is described in “Clinical Biochemistry” 34 (2001), p. 257-263. ing.
また大日本製薬株式会社から、血液中のＨ−ＦＡＢＰの測定試薬が販売されており（免疫クロマト試薬「ラピチェック（登録商標）Ｈ−ＦＡＢＰ」、サンドイッチＥＬＩＳＡ試薬「マーキット（登録商標）Ｍ Ｈ−ＦＡＢＰ」）、これらの試薬を本発明の鑑別用試薬として使用することもできる。 In addition, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. sells a reagent for measuring H-FABP in blood (immunochromatography reagent “RAPYCHECK (registered trademark) H-FABP”, sandwich ELISA reagent “MERKIT® (registered trademark) MH- FABP "), these reagents can also be used as the reagent for identification of the present invention.
本発明の抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体を含む急性大動脈解離の鑑別用試薬は、抗Ｄ−ダイマー抗体を含む試薬と組合せて用いることを特徴とするものである。当該抗Ｄ−ダイマー抗体を含む試薬は、前述の本発明の抗Ｄ−ダイマー抗体を含む鑑別用試薬とその構成は同じであり、免疫化学的方法により血液中のＤ−ダイマー濃度を測定する試薬である。 The reagent for distinguishing acute aortic dissection containing the anti-H-FABP antibody of the present invention is characterized by being used in combination with a reagent containing an anti-D-dimer antibody. The reagent containing the anti-D-dimer antibody has the same configuration as that of the above-described reagent for detection containing the anti-D-dimer antibody of the present invention, and is a reagent for measuring the concentration of D-dimer in blood by an immunochemical method. It is.
本発明は、抗Ｄ−ダイマー抗体を含む試薬および抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体を含む試薬を含んでなる、Stanford A-DeBakey I型と、Stanford A-DeBakey II型と、Stanford A-DeBakey IIIb型と、Stanford B-DeBakey IIIa型と、Stanford B-DeBakey IIIb型の急性大動脈解離の鑑別用キット、に関する。 The present invention includes a Stanford A-DeBakey type I, a Stanford A-DeBakey type II, a Stanford A-DeBakey type IIIb type, comprising a reagent containing an anti-D-dimer antibody and a reagent containing an anti-H-FABP antibody. The present invention relates to a kit for differentiation of Stanford B-DeBakey IIIa type and Stanford B-DeBakey IIIb type acute aortic dissection.
前記鑑別用キットは、本発明の鑑別方法の実施において、免疫化学的方法により血液中のＤ−ダイマー濃度及びＨ−ＦＡＢＰ濃度を測定する場合に好適に使用することができる。 The discrimination kit can be suitably used when the D-dimer concentration and H-FABP concentration in blood are measured by an immunochemical method in carrying out the discrimination method of the present invention.
かかる本発明の鑑別用キットに含まれる抗Ｄ−ダイマー抗体を含む試薬、および抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体を含む試薬は、各抗体を含む前記鑑別用試薬とその構成は同じであり、それぞれ、免疫化学的方法により血液中のＤ−ダイマー濃度を測定する試薬およびＨ−ＦＡＢＰ濃度を測定する試薬である。 The reagent containing the anti-D-dimer antibody and the reagent containing the anti-H-FABP antibody contained in the differentiation kit of the present invention have the same configuration as the above-described differentiation reagent containing each antibody, A reagent for measuring the concentration of D-dimer in blood and a reagent for measuring the concentration of H-FABP.
これらの試薬は、各々別個独立した形態で該キットに含まれるのが一般的であるが、例えば特開平８−５６３５号公報や特開２０００−２９２４２７号公報に記載されているような、複数の抗原を同時に検出できる試薬として製造した場合には、該キットは抗Ｄ−ダイマー抗体及び抗Ｈ−ＦＡＢＰ抗体を同時に含む単一の試薬の形態であっても良い。 These reagents are generally included in the kit in separate and independent forms. For example, a plurality of reagents such as those described in JP-A-8-5635 and JP-A-2000-292427 can be used. When manufactured as a reagent capable of simultaneously detecting an antigen, the kit may be in the form of a single reagent containing an anti-D-dimer antibody and an anti-H-FABP antibody simultaneously.
本発明の鑑別用キットは、実際の医療現場において、商業パッケージの形態で提供される。かかる商業パッケージは本発明の鑑別用キット及び該キットに関する記載物（添付文書）を含み、前記記載物および／または前記商業パッケージには、本発明の鑑別用キットはStanford A-DeBakey I型と、Stanford A-DeBakey II型と、Stanford A-DeBakey IIIb型と、Stanford B-DeBakey IIIa型と、Stanford B-DeBakey IIIb型の急性大動脈解離の鑑別の用途に使用できる、または使用すべきであることが記載されている。 The differentiation kit of the present invention is provided in the form of a commercial package in an actual medical field. Such a commercial package includes the identification kit of the present invention and a description (package insert) relating to the kit. In the description and / or the commercial package, the identification kit of the present invention is a Stanford A-DeBakey type I, Stanford A-DeBakey II, Stanford A-DeBakey IIIb, Stanford B-DeBakey IIIa, and Stanford B-DeBakey IIIb can be used or should be used for differentiation of acute aortic dissection Are listed.
以下、実施例に基いて本発明をさらに具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples.
実施例１；急性大動脈解離患者の血液中Ｄ−ダイマー濃度及びＨ−ＦＡＢＰ濃度の測定（対照：急性心筋梗塞患者）Example 1: Measurement of blood D-dimer concentration and H-FABP concentration in patients with acute aortic dissection (control: patients with acute myocardial infarction)
胸痛（胸背部痛含む）を訴えて来院した患者のうち急性大動脈解離を発症していると確定診断された５９症例（Stanford A-DeBakey I型;16例、Stanford A-DeBakey II型;7例、Stanford A-DeBakey IIIb型;9例、Stanford B-DeBakey IIIa型;11例、Stanford B-DeBakey IIIb型;16例）の血液中Ｄ−ダイマー濃度及びＨ−ＦＡＢＰ濃度を以下のようにして測定した。対照として急性心筋梗塞患者の血液中の両マーカーを同様にして測定した。 59 patients (Stanford A-DeBakey type I; 16 cases, Stanford A-DeBakey type II; 7 cases) who were diagnosed as having acute aortic dissection among patients who complained of chest pain (including chest back pain) , Stanford A-DeBakey IIIb type; 9 cases, Stanford B-DeBakey IIIa type; 11 cases, Stanford B-DeBakey IIIb type; 16 cases) blood D-dimer concentration and H-FABP concentration were measured as follows did. As a control, both markers in the blood of patients with acute myocardial infarction were measured in the same manner.
なお、これらの患者からはインフォームドコンセントを取得した。 Informed consent was obtained from these patients.
（１）Ｄ−ダイマー濃度の測定
ラテックス凝集法を測定原理とするＤ−ダイマー測定試薬「ＳＴＡライアテストＤ−ダイマー」（商品名、ロッシュダイアグノステイックス社製）を使用して以下のとおり測定した。なおこの試薬の基準値は４００ｎｇ／ｍＬである。
病院搬入時に患者の静脈から市販のクエン酸ナトリウム採血管（インセパック−Ｃ凝固検査用（積水化学工業）、３．１３％クエン酸ナトリウム０．２ｍＬ含有）に１．８ｍＬの全血を採取した。その後、採血管を緩やかに転倒混和し、３０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離した。遠心分離後の採血管をそのままＤ−ダイマー測定自動装置であるＳＴＡ（ロシュダイアグノステイックス社製）にセットし、分析した。Ｄ−ダイマーの測定には上記測定試薬を用いた。分析条件は、検体血液量５０μＬ、緩衝液（上記Ｄ−ダイマー検出試薬に添付の試薬１；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン １１．５ｍｇ／ｍＬ，アジ化ナトリウム １ｍｇ／ｍＬ，ＮａＣｌ ２３．５ｍｇ／ｍＬ，メチルパラオキシ安息香酸［防腐剤］０．９５ｍｇ／ｍＬ）１００μＬ、上記Ｄ−ダイマー測定試薬用のＳＴＡ機器用希釈液５０μＬ、ラテックス感作抗Ｄ−ダイマー抗体液（上記Ｄ−ダイマー検出試薬に添付の試薬２；抗ヒトＤ−ダイマーマウスモノクローナル抗体５５μｇ／ｍＬ，ラテックス０．６５ｍｇ／ｍＬ，ウシ血清アルブミン ３ｍｇ／ｍＬ，メチルパラオキシ安息香酸［防腐剤］０．９５ｍｇ／ｍＬ，アジ化ナトリウム １ｍｇ／ｍＬ）１５０μＬを自動的に添加し、分析時間２４０秒、反応温度３７℃で測定した。この測定試薬の検量線範囲はＤ−ダイマー濃度０．２〜４．０μｇ／ｍＬであり、この濃度範囲を超える高値検体は再検査の対象とした。高値検体は前記ＳＴＡ機器用希釈液で予め所定の希釈倍数で希釈し、再度ＳＴＡ装置に掛けて検体中のＤ−ダイマー濃度を測定した。Ｄ−ダイマーの測定値はオンラインでコンピューター処理及び管理された。
(1) Measurement of D-dimer concentration Measured as follows using a D-dimer measurement reagent “STA Riatest D-dimer” (trade name, manufactured by Roche Diagnostics Co., Ltd.) based on the latex aggregation method. did. The reference value for this reagent is 400 ng / mL.
At the time of delivery to the hospital, 1.8 mL of whole blood was collected from a patient's vein into a commercially available sodium citrate blood collection tube (for Insepack-C coagulation test (Sekisui Chemical Co., Ltd., 3.13% sodium citrate containing 0.2 mL)). Thereafter, the blood collection tube was gently mixed by inversion and centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes at room temperature. The collected blood tube after centrifugation was set as it was on STA (Roche Diagnostics), which was an automatic D-dimer measurement device, and analyzed. The measurement reagent was used for the measurement of D-dimer. Analytical conditions were as follows: specimen blood volume 50 μL, buffer (reagent 1 attached to the above D-dimer detection reagent; tris (hydroxymethyl) aminomethane 11.5 mg / mL, sodium azide 1 mg / mL, NaCl 23.5 mg / mL , Methyl paraoxybenzoic acid [preservative] 0.95 mg / mL) 100 μL, 50 μL of STA device dilution for the D-dimer measurement reagent, latex-sensitized anti-D-dimer antibody solution (attached to the D-dimer detection reagent) Reagent 2; anti-human D-dimer mouse monoclonal antibody 55 μg / mL, latex 0.65 mg / mL, bovine serum albumin 3 mg / mL, methyl paraoxybenzoic acid [preservative] 0.95 mg / mL, sodium azide 1 mg / mL ) 150 μL was automatically added and the measurement was performed at an analysis time of 240 seconds and a reaction temperature of 37 ° C. . The calibration curve range of this measurement reagent was D-dimer concentration of 0.2 to 4.0 μg / mL, and high-value samples exceeding this concentration range were subjected to retesting. The high-value sample was diluted in advance with the above-mentioned diluent for STA equipment at a predetermined dilution factor, and applied again to the STA apparatus to measure the D-dimer concentration in the sample. D-dimer measurements were computer processed and managed online.
（２）Ｈ−ＦＡＢＰ濃度の測定
前記（１）と同様にして採取した血液を３０００ｒｐｍで遠心分離し、血漿分画を得た。この血漿分画をＨ−ＦＡＢＰ測定用ＥＬＩＳＡの検体とした。Ｈ−ＦＡＢＰ測定用ＥＬＩＳＡは市販の「マーキットＭ Ｈ−ＦＡＢＰ」（大日本製薬株式会社）を用いた。予め本ＥＬＩＳＡキットに添付されている検体分注プレートにキット緩衝液７０μＬを分注し、そこに先に得た血清あるいは血漿を７０μＬ分注し、撹拌後その１００μＬを、抗ヒトＨ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体を固相化した抗体結合プレートに添加し、２５℃で３０分間静置することにより検体中のＨ−ＦＡＢＰを抗体と反応させた。上記キットに添付の洗浄液３００μＬで各ウェルを３回洗浄した後、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗ヒトＨ−ＦＡＢＰモノクローナル抗体を添加し、２５℃で３０分間静置することにより固相化抗体に捕捉されたＨ−ＦＡＢＰに標識抗体を反応させた。前記と同様に洗浄し過剰の酵素標識抗体を除いた後、基質液（ｏ−フェニレンジアミン／過酸化水素）を各ウェルに１００μＬ添加し、２５℃で１５分間酵素反応した。その後、反応停止液を１００μＬ添加した。撹拌後、各ウェルの吸光度を主波長４９２ｎｍ（副波長６２０ｎｍ）で測定した。同様に操作したＨ−ＦＡＢＰ標準溶液で得られた吸光度を基に標準曲線を作成し、検体中のＨ−ＦＡＢＰ濃度を求めた。
(2) Measurement of H-FABP concentration Blood collected in the same manner as in (1) was centrifuged at 3000 rpm to obtain a plasma fraction. This plasma fraction was used as a sample for ELISA for H-FABP measurement. Commercially available “Merkit MH-FABP” (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was used as the ELISA for H-FABP measurement. In advance, 70 μL of the kit buffer solution is dispensed onto the sample dispensing plate attached to the ELISA kit in advance, 70 μL of the serum or plasma obtained previously is dispensed thereto, and after stirring, 100 μL of the serum or plasma is anti-human H-FABP monoclonal. The antibody was added to the immobilized antibody-binding plate and left at 25 ° C. for 30 minutes to react H-FABP in the sample with the antibody. Each well was washed 3 times with 300 μL of the washing solution attached to the kit, and then horseradish peroxidase-labeled anti-human H-FABP monoclonal antibody was added and left at 25 ° C. for 30 minutes to be captured by the immobilized antibody. The labeled antibody was reacted with H-FABP. After washing and removing the excess enzyme-labeled antibody in the same manner as described above, 100 μL of a substrate solution (o-phenylenediamine / hydrogen peroxide) was added to each well, and the enzyme reaction was carried out at 25 ° C. for 15 minutes. Thereafter, 100 μL of a reaction stop solution was added. After stirring, the absorbance of each well was measured at a main wavelength of 492 nm (subwavelength 620 nm). A standard curve was prepared based on the absorbance obtained with the H-FABP standard solution operated in the same manner, and the concentration of H-FABP in the sample was determined.
（３）測定結果
測定結果は下記［表１］に示すとおりであり、血液中のＤ−ダイマー濃度とＨ−ＦＡＢＰ濃度の両方の値を組合せて検討すると、各病型の間において、そのパターンが大きく相違していた。
(3) Measurement results The measurement results are as shown in [Table 1] below. When the combination of both the D-dimer concentration and the H-FABP concentration in the blood is examined, the pattern of each disease type There was a big difference.
本発明の急性大動脈解離の鑑別方法及び鑑別用キット等を使用すれば、血液中の生化学的マーカーの濃度を測定すことによって、Stanford-DeBakey分類による急性大動脈解離の各病型の中、どの病型を発症している可能性が高いのかを判断することができる。
By using the method for distinguishing acute aortic dissection and the differentiation kit of the present invention, by measuring the concentration of biochemical markers in blood, it is possible to determine which of the various types of acute aortic dissection according to the Stanford-DeBakey classification. It is possible to determine whether or not there is a high possibility of developing the disease type.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108181471A (en) * | 2017-12-15 | 2018-06-19 | 新疆医科大学第附属医院 | A kind of detection marker of dissection of aorta and marker appraisal procedure |
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