JP3433807B2 - 新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードするｄｎａを保有する発現ベクターを組み込んだバチルス・ブレビスを用いる有用物質の製造法 - Google Patents
新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードするｄｎａを保有する発現ベクターを組み込んだバチルス・ブレビスを用いる有用物質の製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、バイオテクノロジーに
関するものであり、更に詳細には本発明は、新規アミノ
酸配列、該アミノ酸配列をコードするＤＮＡを保有する
発現ベクターに外来遺伝子を結合してなるプラスミドを
組み込んだバチルス・ブレビスを培養し、培養物中に外
来遺伝子を生成蓄積せしめこれを採取することを特徴と
する該産物の製造法に関する。
関するものであり、更に詳細には本発明は、新規アミノ
酸配列、該アミノ酸配列をコードするＤＮＡを保有する
発現ベクターに外来遺伝子を結合してなるプラスミドを
組み込んだバチルス・ブレビスを培養し、培養物中に外
来遺伝子を生成蓄積せしめこれを採取することを特徴と
する該産物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】鵜高らはバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）にはプロテアーゼを生産しな
い菌株が多いことを見いだし、その１菌株バチルス・ブ
レビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４：特開昭６０−５
８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８９号公報参
照）の主要菌体外タンパク質［Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９（１
９８７）：塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１，６８
（１９８７）及び特開昭６２−２０１５８３号公報にそ
れぞれ“ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎ
ｄ ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ”、“菌
体外タンパク質”として記載されている］遺伝子のプロ
モーター及び該主要菌体外タンパク質の１種であるＭＷ
タンパク質（ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）のシグナルペプチドをコードする領域を用いて分泌
ベクターを作製し、本菌株を宿主としたα−アミラーゼ
（特開昭６２−２０１５８３号公報、Ｈ．Ｙａｍａｇａ
ｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９
（１９８７）やブタペプシノーゲン（鵜高重三、日本農
芸化学会昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ８３７−８３
８；塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１，６８（１９８
７））の分泌生産に成功している。
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）にはプロテアーゼを生産しな
い菌株が多いことを見いだし、その１菌株バチルス・ブ
レビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４：特開昭６０−５
８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８９号公報参
照）の主要菌体外タンパク質［Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９（１
９８７）：塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１，６８
（１９８７）及び特開昭６２−２０１５８３号公報にそ
れぞれ“ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎ
ｄ ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ”、“菌
体外タンパク質”として記載されている］遺伝子のプロ
モーター及び該主要菌体外タンパク質の１種であるＭＷ
タンパク質（ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）のシグナルペプチドをコードする領域を用いて分泌
ベクターを作製し、本菌株を宿主としたα−アミラーゼ
（特開昭６２−２０１５８３号公報、Ｈ．Ｙａｍａｇａ
ｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９
（１９８７）やブタペプシノーゲン（鵜高重三、日本農
芸化学会昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ８３７−８３
８；塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１，６８（１９８
７））の分泌生産に成功している。
【０００３】また、高木らは、バチルス・ブレビスの中
でプロテアーゼを菌体外に生産しない菌株バチルス・ブ
レビスＨＰＤ３１（なお、この菌株は本明細書における
バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８
７）と同一菌株である）を分離し、これを宿主として耐
熱性α−アミラーゼの高分泌生産（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５８，２７７９−２３８０（１９８
９））や、山形らによるヒトＥＧＦの高分泌生産（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６，３
５８９−３５９３（１９８９））に成功している。
でプロテアーゼを菌体外に生産しない菌株バチルス・ブ
レビスＨＰＤ３１（なお、この菌株は本明細書における
バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８
７）と同一菌株である）を分離し、これを宿主として耐
熱性α−アミラーゼの高分泌生産（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５８，２７７９−２３８０（１９８
９））や、山形らによるヒトＥＧＦの高分泌生産（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６，３
５８９−３５９３（１９８９））に成功している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】バチルス・ブレビスを
宿主菌とする外来遺伝子産物の生産性は、大腸菌や枯草
菌を宿主菌とする系に比べ飛躍的に向上している。従来
バチルス・ブレビスを宿主菌とし外来遺伝子産物を分泌
発現させるためには、バチルス・ブレビスで複製可能な
ベクターが用いられ、更にプロモーター、その下流には
ＳＤ配列、翻訳開始コドンＡＴＧから始まる分泌シグナ
ル配列の後に外来遺伝子を接続している。しかし、外来
遺伝子の種類によっては、この様な従来技術の適用のみ
では外来遺伝子産物の分泌発現量が非常に少ないことも
みとめられ、産業上適用するためにはもう一段の技術開
発が要望されていた。
宿主菌とする外来遺伝子産物の生産性は、大腸菌や枯草
菌を宿主菌とする系に比べ飛躍的に向上している。従来
バチルス・ブレビスを宿主菌とし外来遺伝子産物を分泌
発現させるためには、バチルス・ブレビスで複製可能な
ベクターが用いられ、更にプロモーター、その下流には
ＳＤ配列、翻訳開始コドンＡＴＧから始まる分泌シグナ
ル配列の後に外来遺伝子を接続している。しかし、外来
遺伝子の種類によっては、この様な従来技術の適用のみ
では外来遺伝子産物の分泌発現量が非常に少ないことも
みとめられ、産業上適用するためにはもう一段の技術開
発が要望されていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らはバチルス・
ブレビスで従来技術では分泌発現生産が困難であった外
来遺伝子産物の分泌発現を可能にするため鋭意検討を行
った。その結果ＭＷタンパク質のシグナルペプチドの塩
基性領域、疎水性領域及び切断点付近のアミノ酸を改変
することによって従来分泌発現が困難であった外来遺伝
子産物の分泌生産が大幅に改善されることがわかり、バ
チルス・ブレビスに適した新規シグナルペプチドの開発
に成功し本発明を完成した。
ブレビスで従来技術では分泌発現生産が困難であった外
来遺伝子産物の分泌発現を可能にするため鋭意検討を行
った。その結果ＭＷタンパク質のシグナルペプチドの塩
基性領域、疎水性領域及び切断点付近のアミノ酸を改変
することによって従来分泌発現が困難であった外来遺伝
子産物の分泌生産が大幅に改善されることがわかり、バ
チルス・ブレビスに適した新規シグナルペプチドの開発
に成功し本発明を完成した。
【０００６】すなわち本発明は、従来、バチルス・ブレ
ビスで分泌発現が困難であった外来遺伝子産物の分泌発
現に適し、しかも効率良く分泌発現させるためのシグナ
ルペプチドの改変に関するものである。また更に本発明
は、新規アミノ酸配列をコードするＤＮＡに外来遺伝子
を結合してなるベクターを組み込んだバチルス・ブレビ
スを培養し、培養液中に外来遺伝子産物を生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする該産物の製造法で
ある。以下本発明について詳しく説明する。
ビスで分泌発現が困難であった外来遺伝子産物の分泌発
現に適し、しかも効率良く分泌発現させるためのシグナ
ルペプチドの改変に関するものである。また更に本発明
は、新規アミノ酸配列をコードするＤＮＡに外来遺伝子
を結合してなるベクターを組み込んだバチルス・ブレビ
スを培養し、培養液中に外来遺伝子産物を生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする該産物の製造法で
ある。以下本発明について詳しく説明する。
【０００７】本発明は、下記の表１、表２に示される配
列表の配列番号１、配列番号２で示される新規アミノ酸
配列に関するものであるが、該アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡの塩基配列は、上記アミノ酸配列をコードする
ものであれば、いずれの塩基配列でもよい。
列表の配列番号１、配列番号２で示される新規アミノ酸
配列に関するものであるが、該アミノ酸配列をコードす
るＤＮＡの塩基配列は、上記アミノ酸配列をコードする
ものであれば、いずれの塩基配列でもよい。
【０００８】
【表１】
【０００９】
【表２】
【００１０】本発明の新規アミノ酸配列、該アミノ酸配
列をコードしベクターに挿入されるＤＮＡの調製は既知
のＤＮＡ合成方法（Ｉｔａｋｕｒａ，Ｋ．，Ｊ．Ｊ．Ｒ
ｏｓｓｉ，ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｗａｌｌａｃｅ．Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，３２３（１９８
４））が用いられるが、バチルス・ブレビス４７のＭＷ
タンパク質のシグナルペプチドのＤＮＡ配列を用いて調
製することも出来る。例えば、部位特異的変異によりＭ
ＷＰシグナルの塩基性領域にリジン、アルギニン等の塩
基性アミノ酸を０〜３個付加したり、疎水性領域にロイ
シン、イソロイシン、バリン、アラニン等の疎水性アミ
ノ酸を２〜１０個挿入、又は切断点付近のアミノ酸を他
のアミノ酸と置換したりして調製できる。本発明のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを保有するベクターとして
は、バチルス・ブレビス中で複製可能なものであればい
ずれでもよいが、例えば、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日
本農芸化学会誌、６１，６６９（１９８７））より調製
されたｐＮＵ２１０（ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ，９
（２），（１９９２））またはその派生体等が用いられ
る。宿主内に安定に保持されるためには、抗生物質等に
対する耐性遺伝子（例えばエリスロマイシン耐性等）を
保有させることも出来る。
列をコードしベクターに挿入されるＤＮＡの調製は既知
のＤＮＡ合成方法（Ｉｔａｋｕｒａ，Ｋ．，Ｊ．Ｊ．Ｒ
ｏｓｓｉ，ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｗａｌｌａｃｅ．Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３，３２３（１９８
４））が用いられるが、バチルス・ブレビス４７のＭＷ
タンパク質のシグナルペプチドのＤＮＡ配列を用いて調
製することも出来る。例えば、部位特異的変異によりＭ
ＷＰシグナルの塩基性領域にリジン、アルギニン等の塩
基性アミノ酸を０〜３個付加したり、疎水性領域にロイ
シン、イソロイシン、バリン、アラニン等の疎水性アミ
ノ酸を２〜１０個挿入、又は切断点付近のアミノ酸を他
のアミノ酸と置換したりして調製できる。本発明のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを保有するベクターとして
は、バチルス・ブレビス中で複製可能なものであればい
ずれでもよいが、例えば、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日
本農芸化学会誌、６１，６６９（１９８７））より調製
されたｐＮＵ２１０（ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ，９
（２），（１９９２））またはその派生体等が用いられ
る。宿主内に安定に保持されるためには、抗生物質等に
対する耐性遺伝子（例えばエリスロマイシン耐性等）を
保有させることも出来る。
【００１１】プロモーター、ＳＤ配列をコードする遺伝
子としては、宿主内で機能するものであればいずれでも
良いが、バチルス・ブレビス４７またはバチルス・ブレ
ビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）由来のプロ
モーター、ＳＤ配列をコードする遺伝子を用いるのが好
ましい。
子としては、宿主内で機能するものであればいずれでも
良いが、バチルス・ブレビス４７またはバチルス・ブレ
ビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）由来のプロ
モーター、ＳＤ配列をコードする遺伝子を用いるのが好
ましい。
【００１２】例えば、本発明のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡをバチルス・ブレビス４７由来のＭＷＰプロモ
ーター、ＳＤ配列がコードされる遺伝子下流に連結する
ことにより、より効果的に外来遺伝子産物の分泌発現を
高めることが出来る。
るＤＮＡをバチルス・ブレビス４７由来のＭＷＰプロモ
ーター、ＳＤ配列がコードされる遺伝子下流に連結する
ことにより、より効果的に外来遺伝子産物の分泌発現を
高めることが出来る。
【００１３】この様にして構築された発現ベクターの新
規アミノ酸配列をコードするＤＮＡの下流に連結する外
来遺伝子は宿主菌で発現可能な遺伝子であればいずれで
もよく、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト唾液腺
アミラーゼ、タイ、サケ、マス、ハマチ、ヒラメ等の魚
類成長ホルモン等（特開昭６０−２１４７９８号、特開
昭６３−１５２９８５号、特開平２−２３８８４号等）
が挙げられる。
規アミノ酸配列をコードするＤＮＡの下流に連結する外
来遺伝子は宿主菌で発現可能な遺伝子であればいずれで
もよく、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト唾液腺
アミラーゼ、タイ、サケ、マス、ハマチ、ヒラメ等の魚
類成長ホルモン等（特開昭６０−２１４７９８号、特開
昭６３−１５２９８５号、特開平２−２３８８４号等）
が挙げられる。
【００１４】プラスミドを構築する方法としては、常法
が適宜用いられ、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（１９８２）に記載の方法などが例示される。
が適宜用いられ、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（１９８２）に記載の方法などが例示される。
【００１５】発現ベクターのプロモーター、それに続く
本発明のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の下流側
に目的とする外来遺伝子を常法に従って挿入し、バチル
ス・ブレビスを形質転換すれば、従来分泌発現が困難で
あった外来遺伝子産物の分泌発現が可能な形質転換体を
得ることが出来る。
本発明のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の下流側
に目的とする外来遺伝子を常法に従って挿入し、バチル
ス・ブレビスを形質転換すれば、従来分泌発現が困難で
あった外来遺伝子産物の分泌発現が可能な形質転換体を
得ることが出来る。
【００１６】外来遺伝子を組み込んだベクターで形質転
換するバチルス・ブレビスとしては、ベクター、プロモ
ーターが発現可能なバチルス・ブレビスであればいずれ
でもよく、例えば、バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ
Ｐ−７２２４）、バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１０８７）などが挙げられる。
換するバチルス・ブレビスとしては、ベクター、プロモ
ーターが発現可能なバチルス・ブレビスであればいずれ
でもよく、例えば、バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ
Ｐ−７２２４）、バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１０８７）などが挙げられる。
【００１７】バチルス・ブレビスを形質転換する方法
は、公知の方法でよく、例えばＴａｋａｈａｓｈｉらの
方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１３０
（１９８３））またはＴａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９−３１００
（１９８９））等が例示される。
は、公知の方法でよく、例えばＴａｋａｈａｓｈｉらの
方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１３０
（１９８３））またはＴａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９−３１００
（１９８９））等が例示される。
【００１８】得られた形質転換体の培養に用いる培地
は、形質転換体が生育して目的とする外来遺伝子産物を
生産しうるものであれば如何なるものでもよい。
は、形質転換体が生育して目的とする外来遺伝子産物を
生産しうるものであれば如何なるものでもよい。
【００１９】該培地に含有される炭素源としては、例え
ばグルコース、グリセロール、澱粉、デキストリン、糖
蜜、尿素、有機酸等が考えられる。該培地に含有される
窒素源としては、カゼイン、ポリペプトン、肉エキス、
酵母エキス、カザミノ酸、グリシンなどの有機窒素源、
硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源
などが用いられる。また、糖と無機窒素源を主とする合
成培地を用いて培養しても良い。栄養要求性を示す菌
は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよ
い。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核
酸、塩類などが挙げられる。
ばグルコース、グリセロール、澱粉、デキストリン、糖
蜜、尿素、有機酸等が考えられる。該培地に含有される
窒素源としては、カゼイン、ポリペプトン、肉エキス、
酵母エキス、カザミノ酸、グリシンなどの有機窒素源、
硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源
などが用いられる。また、糖と無機窒素源を主とする合
成培地を用いて培養しても良い。栄養要求性を示す菌
は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよ
い。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核
酸、塩類などが挙げられる。
【００２０】また、培養に際して必要があれば、培地に
抗生物質例えばエリスロマイシン、ネオマイシンなどが
加えられる。更に必要により、消泡剤、例えば大豆油、
ラード油各種界面活性剤などを培地に加えても良い。培
地の初発ｐＨは５．０〜９．０、更に好ましくは６．５
〜７．５である。培養温度は通常１５℃〜４２℃、更に
好ましくは２４℃〜３７℃であり、培養時間は通常１６
〜１６６時間、更に好ましくは２４〜９６時間である。
抗生物質例えばエリスロマイシン、ネオマイシンなどが
加えられる。更に必要により、消泡剤、例えば大豆油、
ラード油各種界面活性剤などを培地に加えても良い。培
地の初発ｐＨは５．０〜９．０、更に好ましくは６．５
〜７．５である。培養温度は通常１５℃〜４２℃、更に
好ましくは２４℃〜３７℃であり、培養時間は通常１６
〜１６６時間、更に好ましくは２４〜９６時間である。
【００２１】本発明によれば、形質転換体を上記のよう
にして培養することによって、培養物、つまり菌体及び
培養液に著量のヒトインターロイキン２などの外来遺伝
子産物が効率的に生成、蓄積されるので、培養終了後、
それ自体公知の方法、例えば遠心分離、濾過などで菌体
と上清とを分離し、それぞれから常法に従って外来遺伝
子産物を分離精製することができる。
にして培養することによって、培養物、つまり菌体及び
培養液に著量のヒトインターロイキン２などの外来遺伝
子産物が効率的に生成、蓄積されるので、培養終了後、
それ自体公知の方法、例えば遠心分離、濾過などで菌体
と上清とを分離し、それぞれから常法に従って外来遺伝
子産物を分離精製することができる。
【００２２】また、形質転換するバチルス・ブレビスと
しては、バチルス・ブレビスであればいずれでもよい
が、好適にはバチルス・ブレビス４７または、バチルス
・ブレビスＨ１０２が使用される。これらは、トリス−
ＰＥＧ法または電気パルス法によって容易に形質転換す
ることが出来るのみでなく、目的とする産物を菌体外に
生産するというすぐれた性質を有しているので、上記の
ようにして得られた培養上清に含まれる外来遺伝子産物
を容易に得ることが出来る。
しては、バチルス・ブレビスであればいずれでもよい
が、好適にはバチルス・ブレビス４７または、バチルス
・ブレビスＨ１０２が使用される。これらは、トリス−
ＰＥＧ法または電気パルス法によって容易に形質転換す
ることが出来るのみでなく、目的とする産物を菌体外に
生産するというすぐれた性質を有しているので、上記の
ようにして得られた培養上清に含まれる外来遺伝子産物
を容易に得ることが出来る。
【００２３】以下、本発明を実施例により更に詳しく説
明する。
明する。
【００２４】
【実施例１ ＭＷＰシグナル配列を置換及び変換したベ
クターの調製】
クターの調製】
【００２５】（１） プラスミドＭ１３ＭＷＰの構築
ｐＮＵ２１０を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII（宝
酒造社製）で消化し、得られた約３３０ｂｐのＤＮＡ断
片を、プラスミドＭ１３ｍｐ１８をＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎ
ｄIIIで消化したものに挿入し、プラスミドＭ１３ＭＷ
Ｐを得た。ＭＷＰプロモーターからシグナル配列までの
塩基配列は図１に示した。
酒造社製）で消化し、得られた約３３０ｂｐのＤＮＡ断
片を、プラスミドＭ１３ｍｐ１８をＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎ
ｄIIIで消化したものに挿入し、プラスミドＭ１３ＭＷ
Ｐを得た。ＭＷＰプロモーターからシグナル配列までの
塩基配列は図１に示した。
【００２６】（２） プラスミドＭ１３Ｒ２の構築
前記で得たＭ１３ＭＷＰ一本鎖ＤＮＡを鋳型として、合
成プライマーＲ２（図２）を用いて部位特異的変異を行
った。部位特異的変異はアマーシャムキット（Ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ，Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）によった。次にＤＮＡの塩基配列を確
認し、得られた目的のプラスミドをＭ１３Ｒ２とした。
成プライマーＲ２（図２）を用いて部位特異的変異を行
った。部位特異的変異はアマーシャムキット（Ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ，Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）によった。次にＤＮＡの塩基配列を確
認し、得られた目的のプラスミドをＭ１３Ｒ２とした。
【００２７】（３） プラスミドＭ１３Ｌ４の構築
プラスミドＭ１３ＭＷＰ一本鎖ＤＮＡを鋳型として、合
成プライマーＬ４（図２）を用いて実施例１−（２）と
同様の方法にてプラスミドＭ１３Ｌ４を得た。
成プライマーＬ４（図２）を用いて実施例１−（２）と
同様の方法にてプラスミドＭ１３Ｌ４を得た。
【００２８】（４） プラスミドＭ１３Ｌ４ＰＡの構築
前記で得られたプラスミドＭ１３Ｌ４一本鎖ＤＮＡを鋳
型として、合成プライマーＰＡ（図２）を用いて実施例
１−（２）と同様の方法にてプラスミドＭ１３Ｌ４ＰＡ
を得た。本シグナル配列（Ｌ４ＰＡ）は図１に示した。
型として、合成プライマーＰＡ（図２）を用いて実施例
１−（２）と同様の方法にてプラスミドＭ１３Ｌ４ＰＡ
を得た。本シグナル配列（Ｌ４ＰＡ）は図１に示した。
【００２９】（５） プラスミドＭ１３Ｌ４ＭＮの構築
プラスミドＭ１３Ｌ４一本鎖ＤＮＡを鋳型として、合成
プライマーＭＮ（図２）を用いて実施例１−（２）と同
様の方法にてプラスミドＭ１３Ｌ４ＭＮを得た。
プライマーＭＮ（図２）を用いて実施例１−（２）と同
様の方法にてプラスミドＭ１３Ｌ４ＭＮを得た。
【００３０】（６） プラスミドＭ１３Ｌ５の構築
プラスミドＭ１３Ｌ４一本鎖ＤＮＡを鋳型として、合成
プライマーＬ５（図２）を用いて実施例１−（２）と同
様の方法にてプラスミドＭ１３Ｌ５を得た。
プライマーＬ５（図２）を用いて実施例１−（２）と同
様の方法にてプラスミドＭ１３Ｌ５を得た。
【００３１】（７） プラスミドＭ１３Ｌ６の構築
プラスミドＭ１３Ｌ４一本鎖ＤＮＡを鋳型として、合成
プライマーＬ６（図２）を用いて実施例１−（２）と同
様の方法にてプラスミドＭ１３Ｌ６を得た。
プライマーＬ６（図２）を用いて実施例１−（２）と同
様の方法にてプラスミドＭ１３Ｌ６を得た。
【００３２】（８） プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮの
構築 （２）で得たＭ１３Ｒ２をＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩで消化
し、得られた２２８ｂｐのＤＮＡ断片及び（５）で得た
Ｍ１３Ｌ４ＭＮをＨｐａＩ、ＨｉｎｄIIIで消化して得
られた１０８ｂｐのＤＮＡ断片とを、ｐＮＵ２１０をＥ
ｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIで消化したものに挿入しｐＮＵ
Ｒ２Ｌ４ＭＮを得た。本シグナル配列（Ｒ２Ｌ４ＭＮ）
を図１に示した。
構築 （２）で得たＭ１３Ｒ２をＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩで消化
し、得られた２２８ｂｐのＤＮＡ断片及び（５）で得た
Ｍ１３Ｌ４ＭＮをＨｐａＩ、ＨｉｎｄIIIで消化して得
られた１０８ｂｐのＤＮＡ断片とを、ｐＮＵ２１０をＥ
ｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIで消化したものに挿入しｐＮＵ
Ｒ２Ｌ４ＭＮを得た。本シグナル配列（Ｒ２Ｌ４ＭＮ）
を図１に示した。
【００３３】（９） プラスミドｐＮＵＬ４ＰＡの構築
（４）で得たＭ１３Ｌ４ＰＡをＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄII
Iで消化し得られた３３０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＮＵ２
１０をＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIで消化したものに挿入
しプラスミドｐＮＵＬ４ＰＡを得た。
Iで消化し得られた３３０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＮＵ２
１０をＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIで消化したものに挿入
しプラスミドｐＮＵＬ４ＰＡを得た。
【００３４】（１０） プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ５の構
築 （２）で得たＭ１３Ｒ２をＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩで消化
し、得られた２２８ｂｐのＤＮＡ断片を（６）で得たＭ
１３Ｌ５をＨｐａＩ、ＨｉｎｄIIIで消化し得られた１
１１ｂｐのＤＮＡ断片とを、ｐＮＵ２１０をＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｉｎｄIIIで消化したものに挿入しプラスミドｐ
ＮＵＲ２Ｌ５を得た。本シグナル配列（Ｒ２Ｌ５）は図
１に示した。
築 （２）で得たＭ１３Ｒ２をＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩで消化
し、得られた２２８ｂｐのＤＮＡ断片を（６）で得たＭ
１３Ｌ５をＨｐａＩ、ＨｉｎｄIIIで消化し得られた１
１１ｂｐのＤＮＡ断片とを、ｐＮＵ２１０をＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｉｎｄIIIで消化したものに挿入しプラスミドｐ
ＮＵＲ２Ｌ５を得た。本シグナル配列（Ｒ２Ｌ５）は図
１に示した。
【００３５】（１１） プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ６の構
築 （２）で得たＭ１３Ｒ２をＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩで消化
し、得られた２２８ｂｐのＤＮＡ断片を（７）で得たＭ
１３Ｌ６をＨｐａＩ、ＨｉｎｄIIIで消化し得られた１
１４ｂｐのＤＮＡ断片とをｐＮＵ２１０をＥｃｏＲＩ、
ＨｉｎｄIIIで消化したものに挿入しプラスミドｐＮＵ
Ｒ２Ｌ６を得た。本シグナル配列（Ｒ２Ｌ６）は図１に
示した。
築 （２）で得たＭ１３Ｒ２をＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩで消化
し、得られた２２８ｂｐのＤＮＡ断片を（７）で得たＭ
１３Ｌ６をＨｐａＩ、ＨｉｎｄIIIで消化し得られた１
１４ｂｐのＤＮＡ断片とをｐＮＵ２１０をＥｃｏＲＩ、
ＨｉｎｄIIIで消化したものに挿入しプラスミドｐＮＵ
Ｒ２Ｌ６を得た。本シグナル配列（Ｒ２Ｌ６）は図１に
示した。
【００３６】
【実施例２ ｈＩＬ２分泌ベクターの構築及び形質転換
体によるｈＩＬ２の分泌生産】ｈＩＬ２（ヒトインター
ロイキン２）遺伝子を有するプラスミドｐＩＬ−５０Ａ
（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＮＡＴＵＲＥ
３０２，３０５−３１０（１９８３））を制限酵素Ｈ
ｇｉＡＩ、ＤｒａＩで消化しｈＩＬ２遺伝子を保有する
ＤＮＡ断片を得た。次に実施例１−（１）で得たプラス
ミドｐＮＵ２１０及び実施例１−（８）、１−（９）、
１−（１０）、１−（１１）で得たプラスミドｐＮＵＲ
２Ｌ４ＭＮ、ｐＮＵＬ４ＰＡ、ｐＮＵＲ２Ｌ５、ｐＮＵ
Ｒ２Ｌ６をＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII（ｆｉｌｌ ｉｎ）
でそれぞれ消化し、前記で得たｈＩＬ２遺伝子を保有す
るＤＮＡ断片を挿入しプラスミドｐＮＵ２１０−ＩＬ２
及びｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮ−ＩＬ２、ｐＮＵＬ４ＰＡ−Ｉ
Ｌ２、ｐＮＵＲ２Ｌ５−ＩＬ２、ｐＮＵＲ２Ｌ６−ＩＬ
２を得た。
体によるｈＩＬ２の分泌生産】ｈＩＬ２（ヒトインター
ロイキン２）遺伝子を有するプラスミドｐＩＬ−５０Ａ
（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＮＡＴＵＲＥ
３０２，３０５−３１０（１９８３））を制限酵素Ｈ
ｇｉＡＩ、ＤｒａＩで消化しｈＩＬ２遺伝子を保有する
ＤＮＡ断片を得た。次に実施例１−（１）で得たプラス
ミドｐＮＵ２１０及び実施例１−（８）、１−（９）、
１−（１０）、１−（１１）で得たプラスミドｐＮＵＲ
２Ｌ４ＭＮ、ｐＮＵＬ４ＰＡ、ｐＮＵＲ２Ｌ５、ｐＮＵ
Ｒ２Ｌ６をＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII（ｆｉｌｌ ｉｎ）
でそれぞれ消化し、前記で得たｈＩＬ２遺伝子を保有す
るＤＮＡ断片を挿入しプラスミドｐＮＵ２１０−ＩＬ２
及びｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮ−ＩＬ２、ｐＮＵＬ４ＰＡ−Ｉ
Ｌ２、ｐＮＵＲ２Ｌ５−ＩＬ２、ｐＮＵＲ２Ｌ６−ＩＬ
２を得た。
【００３７】得られたプラスミドをそれぞれバチルス・
ブレビスＨ１０２へ形質転換し得られたバチルス・ブレ
ビスＨ１０２／ｐＮＵ２１０−ＩＬ２及び、バチルス・
ブレビスＨ１０２／ｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮ−ＩＬ２、バチ
ルス・ブレビスＨ１０２／ｐＮＵＬ４ＰＡ−ＩＬ２、バ
チルス・ブレビスＨ１０２／ｐＮＵＲ２Ｌ５−ＩＬ２、
バチルス・ブレビスＨ１０２／ｐＮＵＲ２Ｌ６−ＩＬ２
をＰＹ培地で３０℃、２日間振とう培養した。その上清
のｈＩＬ２の生産量はネイティブなＭＷＰシグナルペプ
チドを用いた場合にはほとんど生産されていないのに対
して、ＭＷＰシグナルペプチドを改変したものは４０ｍ
ｇ／ｌ以上であり、ｈＩＬ２を分泌生産させることがで
きた（下記の表３）。
ブレビスＨ１０２へ形質転換し得られたバチルス・ブレ
ビスＨ１０２／ｐＮＵ２１０−ＩＬ２及び、バチルス・
ブレビスＨ１０２／ｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮ−ＩＬ２、バチ
ルス・ブレビスＨ１０２／ｐＮＵＬ４ＰＡ−ＩＬ２、バ
チルス・ブレビスＨ１０２／ｐＮＵＲ２Ｌ５−ＩＬ２、
バチルス・ブレビスＨ１０２／ｐＮＵＲ２Ｌ６−ＩＬ２
をＰＹ培地で３０℃、２日間振とう培養した。その上清
のｈＩＬ２の生産量はネイティブなＭＷＰシグナルペプ
チドを用いた場合にはほとんど生産されていないのに対
して、ＭＷＰシグナルペプチドを改変したものは４０ｍ
ｇ／ｌ以上であり、ｈＩＬ２を分泌生産させることがで
きた（下記の表３）。
【００３８】
【表３】
【００３９】
【発明の効果】本発明によって新規なシグナルペプチド
が開発された。この新規シグナルペプチドは、バチルス
・ブレビスに特に好適なものであって、バチルス・ブレ
ビスで従来技術では分泌発現生産が困難であった外来遺
伝子についても、その分泌発現を可能にしたりその量を
高めたりすることを可能にするものである。したがって
本発明によれば、従来より有用性が高かったバチルス・
ブレビスを用いる各種生理活性物質生産システムを更に
効率化し、更に有用性を高めることができる。
が開発された。この新規シグナルペプチドは、バチルス
・ブレビスに特に好適なものであって、バチルス・ブレ
ビスで従来技術では分泌発現生産が困難であった外来遺
伝子についても、その分泌発現を可能にしたりその量を
高めたりすることを可能にするものである。したがって
本発明によれば、従来より有用性が高かったバチルス・
ブレビスを用いる各種生理活性物質生産システムを更に
効率化し、更に有用性を高めることができる。
【図１】本シグナル配列を図示したものである。
【図２】部位特異的変異に用いた合成プライマーを図示
したものである。
したものである。
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平２−31682（ＪＰ，Ａ)
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，Ｍａｒｃｈ
５ 1992，267（７），ｐ．4882−
4888
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，Ｆｅｂｒｕ
ａｒｙ 15 1990，265（５），ｐ.
2873−2880
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，Ｍａｒｃｈ
15 1990，265（８），ｐ．4358−
4363
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 配列表の配列番号２（下記化１に示され
る）で示されるアミノ酸配列からなる新規ペプチド。 ［化１］ Met Lys Lys (Arg)n Val Val Asn Ser Val Leu (Leu)m Ala Ser 1 5 10 Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Ｘ1 Ｘ2 Ala Phe Ala 15 20 25 ただし、ｎ、ｍはそれぞれArgが０〜２個及びLeuが３〜
５個連続に配列することを示す。またＸ1はProまたはAl
a、Ｘ2はMetまたはAsnである。 - 【請求項２】 請求項１に記載のアミノ酸配列をコード
する遺伝子の直後に外来遺伝子を挿入したプラスミドを
保持するバチルス・ブレビスを培養することにより外来
遺伝子産物を培養物中に生成、蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とする該産物の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10389192A JP3433807B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | 新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードするｄｎａを保有する発現ベクターを組み込んだバチルス・ブレビスを用いる有用物質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10389192A JP3433807B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | 新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードするｄｎａを保有する発現ベクターを組み込んだバチルス・ブレビスを用いる有用物質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07170984A JPH07170984A (ja) | 1995-07-11 |
| JP3433807B2 true JP3433807B2 (ja) | 2003-08-04 |
Family
ID=14366052
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10389192A Expired - Lifetime JP3433807B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | 新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードするｄｎａを保有する発現ベクターを組み込んだバチルス・ブレビスを用いる有用物質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3433807B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3753945B2 (ja) | 2001-02-14 | 2006-03-08 | ヒゲタ醤油株式会社 | 大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクター |
| US8597908B2 (en) | 2004-07-06 | 2013-12-03 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
| JPWO2010110288A1 (ja) | 2009-03-24 | 2012-09-27 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド |
| KR101893225B1 (ko) | 2010-03-24 | 2018-08-29 | 가부시키가이샤 가네카 | 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 단백질 및 면역 글로불린 결합성의 친화성 리간드 |
| JP5933526B2 (ja) | 2011-03-25 | 2016-06-08 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド |
| US10065995B2 (en) | 2011-03-25 | 2018-09-04 | Kaneka Corporation | Protein for affinity-separation matrix |
| JP6276694B2 (ja) | 2012-09-21 | 2018-02-07 | 株式会社カネカ | アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド |
| WO2015034056A1 (ja) | 2013-09-06 | 2015-03-12 | 株式会社カネカ | アフィニティー分離マトリックス用分離能強化リガンド |
| MY190347A (en) | 2016-08-10 | 2022-04-15 | Spiber Inc | Production method for insoluble recombinant protein aggregate |
| US20190225646A1 (en) | 2016-10-03 | 2019-07-25 | Spiber Inc. | Method for Purifying Recombinant Protein |
| BR112020001627A2 (pt) | 2017-07-26 | 2020-07-21 | Spiber Inc. | fibroína modificada, ácido nucleico, vetor de expressão, hospedeiro, produto, fibra de fibroína artificialmente modificada, e, método para a produção de uma fibra de fibroína artificialmente modificada. |
| WO2020145363A1 (ja) | 2019-01-09 | 2020-07-16 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | 改変フィブロイン |
| CN113439087A (zh) | 2019-01-31 | 2021-09-24 | 丝芭博株式会社 | 重组蛋白的制备方法 |
| US20230128695A1 (en) | 2020-03-16 | 2023-04-27 | Spiber Inc. | Synthetic Polymer and Method for Producing Same, Molding Material, and Molded Body |
-
1992
- 1992-03-31 JP JP10389192A patent/JP3433807B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １５ １９９０，２６５（５），ｐ．２８７３−２８８０ |
| Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，Ｍａｒｃｈ １５ １９９０，２６５（８），ｐ．４３５８−４３６３ |
| Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，Ｍａｒｃｈ ５ １９９２，２６７（７），ｐ．４８８２−４８８８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07170984A (ja) | 1995-07-11 |
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