JP6276694B2 - アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド - Google Patents
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Description
(1)各ドメインにおけるCドメインの29位に対応するアミノ酸残基が、
Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Ser、Asp、Glu、Arg、His、または、Metのいずれかである、
(2)各ドメインにおけるCドメインの33位に対応するアミノ酸残基が、
Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、His、または、Metのいずれかである、
(3)各ドメインにおけるCドメインの36位に対応するアミノ酸残基が、
Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、His、または、Metのいずれかである、
(4)各ドメインにおけるCドメインの37位に対応するアミノ酸残基が、
Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、His、または、Metのいずれかである、
の少なくとも1つの変異を導入したアミノ酸配列であることが好ましい。
Gln−9、Gln−10、Phe−13、Tyr−14、Leu−17、Pro−20、Asn−21、Leu−22、Gln−26、Arg−27、Phe−30、Ile−31、Leu−34、Pro−38、Ser−39、Leu−45、Leu−51、Asn−52、Gln−55、およびPro−57(残基番号はCドメインに対応する)のうち、90%以上が保持されており、かつ、変異導入前のアミノ酸配列と比較した配列同一性が80%以上であることが好ましい。
Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Ser、Asp、Glu、Arg、His、または、Metのいずれかである、
(2)各ドメインにおけるCドメインの33位に対応するアミノ酸残基が、
Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、His、または、Metのいずれかである、
(3)各ドメインにおけるCドメインの36位に対応するアミノ酸残基が、
Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、His、または、Metのいずれかである、
(4)各ドメインにおけるCドメインの37位に対応するアミノ酸残基が、
Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、His、または、Metのいずれかである。
(5)各ドメインにおけるCドメインの29位に対応するアミノ酸残基が、
Ala、Glu、または、Argのいずれかである、
(6)各ドメインにおけるCドメインの33位に対応するアミノ酸残基が、
Leu、Thr、または、Gluのいずれかである、
(7)各ドメインにおけるCドメインの36位に対応するアミノ酸残基が、
Ile、または、Argのいずれかである、
(8)各ドメインにおけるCドメインの37位に対応するアミノ酸残基が、
Leu、Ile、Glu、Arg、または、Hisのいずれかである。
リガンドの発現プラスミド調製
C末端のLys−58を除くLys残基を別のアミノ酸に置換したプロテインAのCドメイン変異体(C−K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R.1d、配列番号7)をもとに、アフィニティーリガンドを設計した。本実施例では、このドメインを5個連結したC−K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R.5d(配列番号8)、4個連結したC−K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R.4d(配列番号9)、および、連結した4個のC末端側に位置するドメインのみLys−58をArgに置換した配列番号9の単残基変異体C−K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R(C末K58R).4d(配列番号10)を、アフィニティーリガンドとして利用することとし、その発現プラスミドを以下の手順で調製した。
リガンドの発現・精製
実施例1で得られた発現プラスミドを用いて、ブレビバチルス・チョウシネンシスFY−1株の形質転換を行った。形質転換は、公知の方法による電気導入法にて実施した(「Biosci.Biotech.Biochem.」、1997年、61号、202−203頁)。なお、ブレビバチルス・チョウシネンシスFY−1株は、ブレビバチルス・チョウシネンシスHPD31−OK株(特開平6−296485号公報)に変異処理をして得られたPhe・Tyr要求性株である。
リガンドのヒト免疫グロブリンに対する親和性の解析
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーBiacore 3000(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)を用いて、実施例2で取得したリガンドの、免疫グロブリンとの親和性を解析した。ヒト血漿から分画したヒト免疫グロブリンG製剤(以後は、ヒトIgGと記する)をセンサーチップに固定化し、実施例2で取得したリガンドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。
リガンドを担体に固定化したアフィニティー分離マトリックスの試作
カップリング目的官能基をアミノ基とする市販のリガンド固定化用カップリングカラムを利用して、実施例2で得られたリガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスを作製した。
試作アフィニティー分離マトリックスのヒトIgG結合容量評価
試作アフィニティー分離マトリックスのヒトIgG結合容量を評価するために、アフィニティークロマトグラフィー実験による抗体dBC測定を行った。
試作した4ドメイン型のアフィニティー分離マトリックスの評価結果を表4に示す。
試作した3ドメイン型のアフィニティー分離マトリックスの評価結果を表5に示す。
C−G29A/S33E.5d
担体への固定化時に、図1の(1)の形態で固定化される5ドメイン型のリガンドを参照用リガンドとして取得し、該リガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスを調製した。
C−K04R/K07R/G29A/S33L/K35R/K42R/K49R/K50R/(C末以外K58R).3d
担体への固定化時に、図1の(2)の形態で固定化される3ドメイン型のリガンドを参照用リガンドとして取得し、該リガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスを調製した。
マトリックス用セルロースビーズの作製
(1)セルロース分散液Bの作製
旭化成ケミカルズ社製局方セルロースPH−F20JP(メジアン粒径:21μm)76gと蒸留水800gを混合し、攪拌しながら4℃に調整した。次いで設定温度と攪拌を維持しながら4℃に調整したアルカリ水溶液Aを400g投入し、30分間攪拌した。
4℃に調整されたセルロース分散液B1276gと、4℃に調整したオルトジクロロベンゼン7801gと、4℃に調整したソルビタンモノオレエート(span80相当品)78gを混合し、ディスクタービン(Rushton turbine)翼2枚を取り付けたステンレス容器内にて460rpm(Pv値:5.0kW/m3)で4℃、15分間攪拌し、エマルションを作製した。設定温度と攪拌を維持しながら4℃に調整されたメタノール592gを凝固溶媒として加えた。また凝固溶媒の添加所要時間は5秒であった。その後、攪拌数と設定温度を維持しながら30分間攪拌した。加圧濾過を行った後、洗浄液としてメタノール3000gを用いて洗浄を行い、次いで3000gの水で洗浄を行い、多孔質セルロースビーズを得た。多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズは、38μmと90μmの篩を用いて湿式分級した。
上記多孔質セルロースビーズ20体積部に蒸留水を加えて30体積部とし、反応容器に移した。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールEX−314(ナガセケムテックス社製)を2.3重量部投入し、40℃に調整しながら攪拌を続けた。40℃に調整後、30分間攪拌した。次いで、2N NaOH水溶液7.1体積部を用意し、1時間に1/4ずつ加えた。この間、温度を40℃に維持し、攪拌も継続した。最後の1/4量を添加後、同温度で1時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過をしながら、ビーズの20倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋1回ビーズを得た。
リガンドをセルロースビーズに固定化したアフィニティー分離マトリックス試作例
実施例6で得られた架橋多孔質セルロースビーズ3.5mLを遠沈管に入れ、RO水を加えて、全量を6mLとした。これを25℃にてミックスローターMR−3(アズワン社製)上に取り付けた後、撹拌した。次に過ヨウ素酸ナトリウム(和光純薬工業社製)をRO水に溶解した、11.16mg/mLの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を2.0mL加え、25℃で1時間撹拌した。反応後、グラスフィルター(シバタ社製 11GP100)上で、濾液の電気伝導度が1μS/cm以下となるまでRO水で洗浄し、ホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを得た。洗浄濾液の電気伝導度は、導電率計ECTester10 Pure+(EUTECH INSTRUMENTS社製)で測定した。
セルロースベースのアフィニティー分離マトリックスのヒトIgG結合容量評価
実施例7で試作したアフィニティー分離マトリックスのヒトIgG結合容量を評価するために、アフィニティークロマトグラフィー実験による抗体dBC測定を行った。
リガンドのリーク量の測定
リガンドのリーク量を評価するために、実施例4で得られたアフィニティー分離マトリックスを用いて、ヒトIgGを該マトリックスに添加し酸性溶液で溶出した後の、IgG溶出液に含まれるリガンドの量を測定した。クロマトシステムとしてAKTAexplorer 100を用いた。フラクションコレクターに15mlの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておいた。実施例5と同様にしてIgGを溶出させ、溶出液を回収した。
C−G29A/S33E.5dをセルロースビーズに固定化したアフィニティー分離マトリックス
比較例1で得られたC−G29A/S33E.5dを、以下の手法にて、セルロースビーズに固定化したアフィニティー分離マトリックスを取得した。実施例7と同様にしてホルミル化担体を作製し、得られたホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズ3.5mLをグラスフィルター(シバタ社製 11GP100)上で、pH12の0.25Mクエン酸 バッファー(和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、水酸化ナトリウム、RO水を用いて調製)で置換した。pH12の0.25Mクエン酸バッファーを用い、置換後のホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを、遠沈管に入れ、総体積量7.5mLとなるように液量を調整した。ここに、C−G29A/S33E.5d溶液(66.7mg/mL)を0.63g加えた後、6℃にて23時間、ミックスローターMR−3を用い、攪拌させながら反応した。
C−K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R/(C末以外K58R).5dをアガロースベースの担体に固定化したアフィニティー分離マトリックス
担体への固定化時に、図1の(2)の形態で固定化される5ドメイン型のリガンドを参照用リガンドとして取得し、該リガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスを調製した。
Claims (19)
- プロテインAのE、D、A、B、およびCドメインから選択されるいずれかのドメインに由来し、全てのLys(リジン残基)にアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を2以上含み、
前記アミノ酸配列同士がリンカーによって連結されており、かつ、
少なくとも1つのリンカーがLys(リジン残基)またはCys(システイン残基)を含むことを特徴とするタンパク質。 - 少なくとも1つのリンカーがLysを含む、請求項1に記載のタンパク質。
- 置換変異導入前のアミノ酸配列が、
配列番号1〜5のいずれかのアミノ酸配列、または、
配列番号1〜5のいずれかのアミノ酸配列に、下記(1)〜(4):
(1)配列番号1〜5のいずれかにおけるCドメインの29位に対応するアミノ酸残基が、
Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Ser、Asp、Glu、Arg、His、または、Metのいずれかである、
(2)配列番号1〜5のいずれかにおけるCドメインの33位に対応するアミノ酸残基が、
Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、His、または、Metのいずれかである、
(3)配列番号1〜5のいずれかにおけるCドメインの36位に対応するアミノ酸残基が、
Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、His、または、Metのいずれかである、
(4)配列番号1〜5のいずれかにおけるCドメインの37位に対応するアミノ酸残基が、
Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、His、または、Metのいずれかである、
の少なくとも1つの変異を導入したアミノ酸配列である、請求項1または2に記載のタンパク質。 - 全てのLysに導入されるアミノ酸置換変異の半数以上が、Argへの置換変異である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 全てのLysに導入されるアミノ酸置換変異の全てが、Argへの置換変異である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 以下に示すアミノ酸残基;
Gln−9、Gln−10、Phe−13、Tyr−14、Leu−17、Pro−20、Asn−21、Leu−22、Gln−26、Arg−27、Phe−30、Ile−31、Leu−34、Pro−38、Ser−39、Leu−45、Leu−51、Asn−52、Gln−55、およびPro−57(残基番号はCドメインに対応する)のうち、90%以上が保持されており、かつ、配列番号5のアミノ酸配列と比較した配列同一性が80%以上である、請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質。 - 少なくとも一方の末端にLysまたはCysを有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 少なくとも一方の末端にLysを有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質をコードするDNA。
- 請求項9に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項10に記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
- 請求項9に記載のDNA若しくは請求項10に記載のベクターを用いた無細胞タンパク質合成系、または、請求項11に記載の形質転換体を用いる、請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質の製造方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質がアフィニティーリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化された、アフィニティー分離マトリックス。
- 免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質に結合することを特徴とする、請求項13に記載のアフィニティー分離マトリックス。
- 免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質が免疫グロブリンG、または、免疫グロブリンG誘導体である、請求項14に記載のアフィニティー分離マトリックス。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質をアフィニティーリガンドとして水不溶性の基材からなる担体に固定化することからなる、請求項13〜15のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスの製造方法。
- 請求項13〜15のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスに免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質を吸着させることを含む、免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質の精製方法。
- 同一の標的分子に対する2以上の結合ドメインをリンカーによって連結して得られるアフィニティーリガンドを、担体に固定化することからなるアフィニティー分離マトリックスの製造方法であって、
アフィニティーリガンドを、少なくとも1つのリンカーに含まれる少なくとも1つのアミノ酸残基を介して、結合ドメインのコア領域を介さず、担体に固定化することを含む、アフィニティー分離マトリックスの製造方法。 - さらに、アフィニティーリガンドを、N末端領域および/またはC末端領域を介して担体に固定化することを含む、請求項18に記載のアフィニティー分離マトリックスの製造方法。
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