JP5294673B2 - 改変微生物 - Google Patents
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Description
が含まれ、Cドメインには、SecA2量体形成及びSecY相互作用領域と、大腸菌SecB結合領域相同領域が含まれており、両ドメインをまたぐようにATP結合領域II(ABS II)が存在していることが明らかにされている。
しかしながら、SecAの一部のアミノ酸残基を欠失させることについては何ら報告されていない。
Olmos-Soto J, Contreras-Flores R. Genetic system constructedto overproduce and secrete proinsulin in Bacillus subtilis. Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Sep;62(4):369-73. Vitikainen M, Hyyrylainen HL, Kivimaki A, Kontinen VP, Sarvas M. Secretion of heterologous proteins in Bacillus subtilis can be improved by engineering cell components affecting post-translocational protein folding and degradation. J Appl Microbiol. 2005;99(2):363-75.
SecAは、分泌タンパク質の菌体外への分泌に関与する因子であり、SecAを欠失した場合はタンパク質の生産が減少することは勿論、細胞自体が死んでしまうことから、当該分泌機構に必要不可欠な因子であると考えられていた。従って、SecAのアミノ酸残基の一部を欠失させた場合に、タンパク質の分泌生産能が向上したことは、全く予想外のことである。
1)secAのカルボキシル末端側の60〜80個のアミノ酸が欠失するように遺伝子改変された改変微生物。
2)上記改変微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
3)上記組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
SecAは、分泌タンパク質の菌体外への分泌に関与する因子であり、SecAを欠失した場合はタンパク質の生産が減少することは勿論、細胞自体が死んでしまうことから、当該分泌機構に必要不可欠な因子であると考えられていた。従って、SecAのアミノ酸残基の一部を欠失させた場合に、タンパク質の分泌生産能が向上したことは、全く予想外のことである。
SecAは、細菌においてタンパク質輸送経路に関する因子(タンパク質)の一つであり、膜透過チャネル(SecY/SecE/SecG)と共同で分泌タンパク質を菌体外に分泌するための機能を持つ。枯草菌SecA(841アミノ酸、分子量95.3KDa)は、2つのドメインであるNドメインとCドメインから構成され、Nドメインには、ATP結合領域I(ABS I)とシグナルペプチド結合領域が含まれる。一方、Cドメインには、SecA2量体形成及びSecY相互作用領域と、大腸菌SecB結合領域相同領域が含まれており、両ドメインをまたぐようにATP結合領域II(ABS II)が存在していることが知られている。
枯草菌のSecA又はこれと機能的に等価なタンパク質とは、具体的には以下の(A)〜(C)に示すタンパク質を意味する。
(A)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つSecAと同様の機能を有するタンパク質
(C)配列番号2に示されるアミノ酸配列と80%以上同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つSecAと同様の機能を有するタンパク質
(a)配列番号1に示される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つSecAと同様の機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号1で示される塩基配列と80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つSecAと同様の機能を有するタンパク質をコードするDNA
当該DNAは、自然界から得ることも可能ではあるが、さらに部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することもできる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[Mutan-super Express Km キット(タカラ)]等を用いて変異を導入し調製することができる。
枯草菌の場合、SecAは841個のアミノ酸(配列番号2)から構成されるが、配列番号2においてアミノ酸番号820〜841番のアミノ酸を欠失すること(「N819」ともいう)、又は781〜841番のアミノ酸を欠失すること(「N780」ともいう)が好ましく、特にアミノ酸番号781〜841番のアミノ酸を欠失すること(N780)が好ましい。
枯草菌のSecAは、そのカルボキシル末端側に、CTD領域(C-Terminal region Domain;J.B.C.(2004)279(21)p22490-22497参照)をもつ。CTD領域のC末端の22個のアミノ酸は大腸菌SecB結合領域相同領域であり、当該領域のN末端側には、アミノ酸61個のCTL領域(C-Terminal Terminal Linker;Science(2002)297(5589)p2018-2026参照)と呼ばれている領域が存在する。この領域は、枯草菌において、シグナル認識粒子(SRP)の構成成分であるFfh(Fifty Four Homologue, SRP54相同因子)と結合する領域である。Ffh結合領域にあたるCTL領域は、アミノ酸番号781−819番の領域である。
従って、本発明の遺伝子改変には、これらの各領域又はこれらと相同な領域を単独或いは複数組み合わせて欠失するようにすることが包含され、このうち、Ffh結合領域又はその相同領域を欠失するような遺伝子改変が好ましい。
SecA部分欠失用DNA断片は、secA遺伝子の3'末端側の遺伝子領域を一部改変した遺伝子配列である。両末端に少なくとも1個の制限酵素部位を含んでいる。制限酵素部位を利用して、このDNA断片を常法により例えば枯草菌ゲノムDNAを鋳型にして制限酵素部位を含んだプライマーを用いたPCR反応で増幅して調製することができる。また、DNA断片の3'末端側のプライマーには、欠失したいSecAタンパク質のC末端領域をコードする遺伝子のすぐ上流に終始コドンをコードする遺伝子配列を挿入している。
この断片を枯草菌等の形質転換可能なグラム陽性菌へ形質転換することで相同組換えを可能とするpDH88等のインテグレーションベクターのマルチクローニング部位に挿入してプラスミドを構築する。
このプラスミドを枯草菌等に導入して相同組換えを行うことで該プラスミドが染色体に組み込まれた株(SecA部分欠失株)を得ることができる。取得した株の染色体上の遺伝子構成は、図1aに示すとおりである。挿入株は、欠失したい領域の前に存在する終止コドンにより、染色体上から発現するSecAタンパク質の翻訳は、途中で停止するため、希望のSecAC末欠失タンパク質のみを発現することができる。
生理活性ペプチドとしては、例えば、B型肝炎ウィルス、C型肝炎ウィルス、HIV、インフルエンザ等の病原性ウィルスゲノムにコードされるタンパク質、Gタンパク質共役型受容体、成長因子(血小板増殖因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子等)、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、アルブミン、ヒト成長ホルモン等が挙げられる。
また、産業用酵素としては、酸化還元酵素(Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が挙げられ、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。
ここで、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno(SD)配列(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974))に相当する部位である。
(1)使用菌株
枯草菌(バチルス・サブチリス)マーバーグ168trpC2株(KunstらNature1997)
枯草菌SAN819株(N819);耐性マーカー(クロラムフェニコール)
枯草菌SAN780株(N780);耐性マーカー(クロラムフェニコール)
大腸菌(エシェリヒア・コリ)C600株(タカラバイオ)
大腸菌(エシェリヒア・コリ)JM109株(タカラバイオ)
pDH88;ヘナーら(Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Jan;81(2):439-43.)、耐性マーカー(アンピシリン、クロラムフェニコール)
pHKK1101;耐性マーカー(アンピシリン、クロラムフェニコール)、SecA部分欠失株(SAN819株)作成用組換えベクター
pHKK1002;耐性マーカー(アンピシリン、クロラムフェニコール)、SecA部分欠失株(SAN780株)作成用組換えベクター
pWH1520;MoBiTec社、耐性マーカー(アンピシリン、テトラサイクリン)
pHKK3200;耐性マーカー(アンピシリン、テトラサイクリン)、挿入遺伝子(アミラーゼAmyEシグナルペプチド及びプロ領域
pHKK3201;耐性マーカー(アンピシリン、テトラサイクリン)、挿入遺伝子(アミラーゼAmyEシグナルペプチド及びプロ領域とIFNα成熟体の融合タンパク質
pHKK3202;耐性マーカー(アンピシリン、テトラサイクリン)、挿入遺伝子(アミラーゼAmyEシグナルペプチド及びプロ領域とIFNβ成熟体の融合タンパク質
L培地;バクトトリプトン(Difco)1%、イーストエクスラクト(Difco)0.5%、NaCl0.5%(和光)
2×L培地;バクトトリプトン(Difco)2%、イーストエクスラクト(Difco)1%、NaCl1%(和光)
抗生物質は以下の濃度で使用した、クロラムフェニコール15μg、アンピシリン50μg。pWH1520のもつキシロースプロモーターの誘導のため、キシロースは終濃度0.6%で使用した。イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)は、終濃度100μMで使用した。
(1)SecA部分欠失株作成用組換えベクター
枯草菌SAN819株及びSAN780株を作成するため、枯草菌168株の染色体を鋳型にプライマーsecAC−01 (gatcAAGCTTcccgggagaagagcgatatcttcgg(配列番号
3)、大文字がHindIII)とSecAC−02 (gatcagaTCTAGAttaaatctcagctttcatcacaaa(配列番号4)、大文字がXbaI、下線が挿入した終止コドン)を用いてPCRにて増幅したsecA遺伝子3'末端側360bpをpDH88のHindIII−XbaIサイトに導入し、pHKK1001を構築した。同様にプライマーsecAC−03(gatcAAGCTTcccgggagaagagcgatatcttcgg(配列番号5)、大文字がHindIII)とsecAC−04(gatcagaTCTAGAttagatatcaaccactttgcgaac(配列番号6)、大文字がXbaI、下線が挿入した終止コドン)を用いて、pHKK1002を構築した。
枯草菌SAN819は、プラスミドpHKK1001を枯草菌168株の染色体にキャンベル型に組み込むことにより取得した(図1a)。また、SAN780株もpHKK1002プラスミドを用いて同様の手法で取得した。SAN819及びSAN780の染色体上に正しく組み込まれたことは、サザンハイブリダイゼーション法により確認した。また、抗SecA抗体を用いてSAN819株及びSAN780株で発現するSecAのサイズを確認した(図1b)。
(2)により作成されたSAN819株及びSAN780株を用いて、生育への影響を観察した。培養液には、L液体培地、Lプレート培地、2×L液体培地を用い(いずれの場合も終濃度100μMIPTGを添加)、培養温度は、30℃、37℃、47℃のそれぞれの温度にて培養を行った。
その結果、いずれの条件においても枯草菌SAN819及びSAN780は、親株である枯草菌168株と変わらない生育を示した。
IPTGを添加しない場合、SecAの下流に存在し、SecAとオペロンを形成するprfB遺伝子の影響で生育に低下が見られた。
このことから、SecAのC末端領域であるCTD(C-Terminal region domain)領域は、枯草菌の生育に必須ではないことがわかった。
(1)異種タンパク質発現用ベクターの構築
異種タンパク質を菌体外に分泌させるためには、シグナル配列が必要になる。そこで、枯草菌アミラーゼ(amyE)タンパク質の持つシグナル配列及びプロ配列をもつ分泌タンパク質発現用基本ベクターpHKK3200を作成した。pHKK3200を作成するため、枯草菌168株の染色体を鋳型にプライマーamyESF−1(ggccACTAGTcttcaaaaaatcaaa(配列番号7)、大文字がSpeI)とamyESR−2(ggccGGTACCctcattcgatttgttcgc(配列番号8)、大文字がKpnI)を用いてPCRにて増幅したamyE遺伝子シグナル配列及びプロ配列のコード領域175bpをpWH1520のSpeI−KpnIサイトに導入し、pHKK3200を構築した。
インターフェロンα発現プラスミドを作成するため、pORF5−hIFN−α(インビボジェン)を鋳型にプライマーifnaF (ggccGGTACCctcctggtgctcagctgc(配列番号9)、大文字がKpnI)とifnaR(ggccGGATCCttttcattccttacttct(配列番号10)、大文字がBamHI)を用いてPCRにて増幅したifnα遺伝子成熟体領域を含む521bpをpHKK3200のKpnI−BamHIサイトに導入し、pHKK3201を構築した(図2a)b))。
また、同様の方法で、pORF−hIFNβ(インビボジェン)を鋳型にプライマーifnbF (ggccGGTACCatgagctacaactt(配列番号11)、大文字がKpnI)とifnbR (ggccGGATCCagctcagtttcggaggta(配列番号12)、大文字がBamHI)を用いてインターフェロンβ発現プラスミドpHKK3202を作成した。
形質転換法により、(1)で作成した、インターフェロンα発現ベクターpHKK3201及びインターフェロンβ発現プラスミドpHKK3202を、それぞれSAN780株及びSAN819株に取り込ませることによって、インターフェロン発現ベクター導入株を得た。
形質転換は、SPI培地及びSPII培地を用いてコンピテント法により行い、15μg/mLクロラムフェニコールを含むLB寒天培地に生育した菌株を形質転換体とした。
2×L培地(2%Tripton (Difco), 1% YeastExtract (Difco), 1% NaCl)培地を用いた。必要に応じてテトラサイクリン(和光)を最終濃度15μg/mLとなる様に添加した。培養は、前培養液を2%植菌し、30℃にて細胞増殖期中期(OD660=0.3)まで培養後、キシロースを最終濃度0.6%添加し、培養した。培養開始後24時間後で集菌し、培養液を得た。
インターフェロンを含むサンプルは、ウエスタンブロッティング解析により検出し、検出バンドの濃淡を測定することで比較した。
1)ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティングは、セミドライシステム(バイオラッド)を用いて行った。SDS−PAGEによるタンパク質分離後、タンパク質をイモビロンPVDF膜(ミリポア)に転写した。タンパク質の検出は、ECL検出システム(アマシャム、現GEヘルスケア)を用いた。
抗インターフェロンα抗体及び抗インターフェロンβ抗体は、(PeproTech EC LTD)のものを使用した。HRP標識二次抗体は、アマシャム(現GEヘルスケア)のものを使用した。
培養24時間後、遠心分離により細胞を取り除いた培養液を、インターフェロンを含むサンプルとした。インターフェロンの誘導は、培養開始後、OD660=0.3到達時にキシロースを終濃度0.6%になるように添加することで行った。培養液を、動物細胞を用いてインターフェロン生理活性測定を行った。測定実験は、三菱BCLに委託して行われた。本実験で使用したインターフェロン発現ベクターより分泌されたインターフェロンは、生理活性を所持していた。
培養液をSDS−PAGE電気泳動により展開後、PVDF膜へブロッティングし、IFNα抗体(PeproTech EC LTD)を用いたウエスタンブロッティング法により検出した。分泌量の測定は、ウエスタンブロッティング法により検出したバンドの濃淡をNIH Image(National Institutes of Health, USA)により数値化し、野生株を宿主として用いた生産量をコントロールとして、変異株を宿主とした際の生産量を生産比で評価した。
SAN780株、SAN819株ともに親株168株よりもインターフェロンαの生産量が向上していた(図3)。また、インターフェロンβの生産性評価においても同様に生産量の向上が見られた(図4)。
SAN780株及び対照として枯草菌168株に、Bacillus属細菌KSM−S237株(FERMBP-7875)由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報参照)をコードするD N A断片(3 .1kb)が、シャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237をプロトプラスト形質転換法によって導入した。
これによって得られた形質転換株を5 mLのLB培地で30℃にて15時間振盪培養を行い、更にこの培養液0.6 mLを30 mLの2xL−マルトース培地(2%トリプトン、1 %酵母エキス、1 %塩化ナトリウム、7.5 %マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4 - 5水和物、15 ppmテトラサイクリン)に接種し、3 0℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を、上記特許文献に記載の方法、またはp-nitropheny l-β-cellotrioside(生化学工業)を基質として、pH7.0、温度30℃における吸光度(420nm)の変化を測定する方法により、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。結果を表1に示す。
Claims (4)
- SecAのカルボキシル末端側の60〜80個のアミノ酸が欠失するように遺伝子改変されたバチルス属細菌であって、
SecAが、以下の(A)〜(C)に示すタンパク質である改変バチルス属細菌。
(A)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(B)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ膜透過チャネル(SecY/SecE/SecG)と共同で分泌タンパク質を菌体外に分泌するための機能を有するタンパク質
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列と90%以上同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ膜透過チャネル(SecY/SecE/SecG)と共同で分泌タンパク質を菌体外に分泌するための機能を有するタンパク質。 - カルボキシル末端側のアミノ酸の欠失が、Ffh結合領域の欠失である請求項1記載の改変バチルス属細菌。
- 請求項1又は2記載の改変バチルス属細菌株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換えバチルス属細菌。
- 請求項3記載の組換えバチルス属細菌を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
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