JPH02257876A - 変異バチルス・ブレビス及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、菌体外に極著量の蛋白質を生産する新規な変
異バチルＸ−プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉ
ｓ）及びその形質転換体もしくはその利用に関するもの
である。

更に詳細には、遺伝子組換えにおける宿主菌としての新
規な変異バチルス・ブレビスに関するものである。

また１本発明は、ヒト唾液服α−アミラーゼ遺伝子（ｈ
ＡＭＹ）を含有するＤＮＡを保持する変異バチルス・ブ
レビスおよびそれらを用いたヒト唾液腺α−アミラーゼ
の製造法に関するものである。また。

本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｓｕ
ｌｆｕｒｏ　ｅｎｅｓ由来のβ−アミラーゼ遺伝子（Ｒ
ＡＭ”／）を含有するＤＮＡを保持する変異バチルス・
ブレビスおよびそれらを用いたＣ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ＋
ａ　ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏ　ｅｎｅｓβ−アミラ
ーゼの製造法に関するものである。

（従来の技術） 従来、多くの組換ＤＮＡの研究は大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１
ｔ）を用いてなされており、すでに多くの異種遺伝子が
大腸菌内で発現されている。しかし、この方法では１発
現された遺伝子産物が菌体内に蓄積されるために目的と
する物質の菌体からの抽出およびその抽出液からの精製
に多大の時間と労力を要するだけでなく、目的とする物
質を完全な形で純粋に得ることは容易ではなかった。

一方、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌は古くから種
々の菌体外酵素の生産菌として工業的に利用されてきて
おり、これら菌体外酵素の遺伝子のプロモーターおよび
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ領域をクローニン
グし、その下流に目的とする蛋白質の構造遺伝子を連結
し、これをバチルス属菌に導入すれば、目的とする蛋白
質を遺伝子産物として菌体外へ分泌させることが可能に
なると考えられる。

バチルス属菌においては、分泌される蛋白質はアミノ末
端側におよそ２０〜３０アミノ酸残基からなるシグナル
ペプチドを持つ前駆体として合成されたのち、この部分
がシグナルペプチダーゼによって切断されて、成熟した
蛋白質になると考えられており、すでにバチルス・アミ
ロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ
ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα−アミラーゼ遺伝子（
１，Ｐａ１ｖａら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、　２２．２２
９（１９８３））、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒ＋＊ｉｓ）のベニシ
リナーゼ遺伝子（Ｓ、　Ｃｈａｎｇら、モレキュラー・
クローニング・アンド・ジーン・レギュレーション・イ
ン・バチライ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　
ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　１ｎ１３ａ
ｃｉｌｌｉ）、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　６
５９頁、　１９８２年〕、バチルス・サチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝
子（ＨｌＹａｍａｚａｋｉら、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１５６
．３２７（１９８３））がクローン化され、これらのシ
グナルペプチドを利用した異種蛋白質の分泌が報告され
ている。

上記した異種蛋白質の分泌生産には、主にバチルス・サ
チルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）が宿主
として用いられているが、この微生物は菌体外プロテア
ーゼを多量に生産するため１組み換えＤＮＡ技術を用い
て分泌された異種蛋白質は分解を受け、その蓄積量は著
しく減少する。

これに対し、鵜高らはバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）にはプロテアーゼをほとんど生
産しない菌株が多いことを見い出し、その１菌株バチル
ス・ブレビス４７［ＦＥＲＭ　Ｐ−７２２４；特開昭６
０−５８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８３号公
報参照］の主要菌体外蛋白質［）１．　Ｙａｍａｇａｔ
ａら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。

１６９、１２３９（１９８７）、塚越規弘、日本農芸化
学会誌、６１、６８（１９８７）および特開昭６２−２
０１５８３号公報にそれぞれ　“ｏｕｔｅｒ　ｗａｌｌ
　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｍ１ｄｄｌｅ　ｗａｌｌｐ
ｒｏｔｅｉｎ”、パ菌体外主要蛋白質″および″細胞表
層蛋白質″として記載されている。〕遺伝子のプロモー
ターおよび該主要菌体外蛋白質の一種であるＭＶ蛋白質
（ｍｉｄｄｌｅ　ｗａｌｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナ
ルペプチドをコードする領域を用いて分泌ベクターを作
製し１本菌株を宿主としてα−アミラーゼ〔特開昭６２
−２０１５８３号公報、Ｈ，Ｙａｍａｇａｔａら、Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６９．１２３９（１９ｇ
？））やブタペプシノーゲン（鵜ル重三１日本農芸化学
会昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ８３７−８３８　；
塚越規弘１日本農芸化学会誌、６１．６８（１９８７）
）の分泌生産に成功している。

（発明が解決しようとする問題点） 前記の様に、バチルス・ブレビスを宿主として用いる異
種蛋白質の分泌生産の試みは種々行われ大腸菌、枯草菌
等と比べ非常に効率のよい系であることがわかった。

しかしながら、蛋白質の生産量については一定限度で留
っており、産業上ではより著量の蛋白質を生産する宿主
が求められるのである。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは１、更に効率のよいバチルス・ブレビスを
宿主菌として用いる異種蛋白質の分泌生産系を創製すべ
く鋭意研究を重ねたところ、バチルス・ブレビス４７　
（ＦＯＲＭ　Ｐ−７２２４）を変異剤で処理することに
より、非常に優れた菌体を創製するに至った・ 本発明は、菌体外に極著量の蛋白質を生産する新規な変
異バチルス・ブレビスを提供することにある。

また、本発明は、新規な変異バチルス・ブレビスを宿主
として用いるヒト唾液腺α−アミラーゼの新規製造法を
提供することにある。

更に、本発明は、新規な変異バチルス・ブレビスを宿主
として用いる Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏ
ｇｅｎｅｓ由来のβ−アミラーゼの新規製造法を提供す
ることにある。

本発明者らは、異種蛋白質を効率よく分泌生産する宿主
菌を提供すべく鋭意研究を重ねたところ。

バチルス・ブレビス４７　（ＦＥＲＭ　Ｐ−７２２４）
をニトロソグアニジン処理することにより、親株である
バチルス・ブレビス４７より以上に、培養物中に極著量
の蛋白質を分泌生産する能力を有する新規な変異菌を創
製することに成功し本発明を完成した。

すなわち本発明は （１）菌体外に極著量の蛋白質を生産する変異バチルス
・ブレビス。

（２）菌体外に極著量の蛋白質を生産する変異バチルス
・ブレビスからなる遺伝子組換における宿主菌。

（３）プロモータ領域を含有するＤＮＡの３′末端にヒ
ト唾液腺α−アミラーゼをコードするＤＮＡを結合せし
めた菌体外に極著量の蛋白質を生産する変異バチルス・
ブレビス。

（４）プロモータ領域を含有するＤＮＡの３′末端にＣ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇ
ｅｎｅｓ由来のβ−アミラーゼをコードするＤＮＡを結
合させたＤＮＡを保持せしめた菌体外に極著量の蛋白質
を生産する変異バチルス・ブレビス。

（５）第３項の変異バチルス・ブレビスを培地に培養し
、培養物中にヒト唾液腺α−アミラーゼを生成、蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とするヒト唾液腺α−
アミラーゼの製造法。

（６）第４項の変異バチルス・ブレビスを培地に培養し
、培養物中に Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏ
ｇｅｎｅｓ由来のβ−アミラーゼを生成、蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とするＣ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ
＋ａ　ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅｓ由来のβ
−アミラーゼの製造法。

である。

バチルス・ブレビス４７を変異させる方法としては、微
生物に変異を誘発させる方法であればどのような手段を
用いてもよいが、例えば紫外線照射、ガンマ−線照射ま
たは、ニトロソグアニジンのような薬剤で処理する等が
挙げられる。

バチルス・ブレビス４７の変異処理に当って、異種蛋白
質をコードする遺伝子が挿入されたプラスミドをバチル
ス・ブレビス４７に保持したまま処理してもよい。

異種蛋白質をコードする遺伝子を変異バチルス・ブレビ
スで発現させる為のプロモーターとしては。

バチルス・ブレビスで機能するものであればいずれでも
よいが、バチルス・ブレビス由来のプロモーターが好ま
しく、例えばバチルス・ブレビス４７の主要菌体外蛋白
質である細胞壁蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げ
られる。該プロモーターは１種または２種以上含有され
ていてもよい。

プロモーター領域を含有するＤＮＡは、上記プロモータ
ー以外に、、　ＳＤ配列、翻訳開始コドンなどを有して
いることが必要であり、さらに主要菌体外蛋白質遺伝子
の一部を有していてもよい。

また本発明において、異種蛋白質を変異バチルス・ブレ
ビスの菌体内、菌体外のいずれに蓄積されてもよいが、
異種蛋白質の分離精製を容易にし。

また生産量を増大させるためには、菌体外に異種蛋白質
を蓄積させることが好ましい、この場合、プロモーター
領域を含有するＤＮＡには、該ＤＮＡの３′末端側にシ
グナルペプチドをコードする領域が含まれる。

シグナルペプチドとしては、異種蛋白質を変異バチルス
・ブレビスの菌体外に分泌発現させるものであればいず
れでもよく１例えばバチルス・ブレビス４７の細胞壁蛋
白質遺伝子のシグナルペプチドなどが挙げられる。

遺伝子の発現に用いる発現ベクターとしては変異バチル
ス・ブレビスで機能するものであればいずれでもよいが
１例えば参考例で得られるプラスミドが挙げられる。

上記のＤＮＡを用いて作製した発現プラスミドとしては
、バチルス・ブレビスで機能するものであればいずれで
もよく、具体的には後述する実施例１で得られるプラス
ミドｐｌ（ＡＭＹ５実施例２で得られるプラスミドｐＨ
５＾５などが挙げられる。

これらのプラスミドを構築する方法としては、例えばモ
レキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュ
アル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ＡＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）
に記載の方法などが挙げられ、一方、プラスミドの構築
に用いる宿主としては、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、バ
チルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ
）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖ
ｉｓ）に属する微生物であればいずれでもよく、例えば
大腸菌ＨＢＩＯＩ、大腸菌り旧、バチルス・サチルスＲ
Ｍ１４１（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　［５ｇ、　
１０５４（１９８４））、バチルス・ブレビス４７　（
ＦＥＢＮ　Ｐ−７２２４）、バチルス・ブレビス４７Ｋ
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２３０８）などが挙げられる。

遺伝子の発現に用いる宿主としては、具体的にはバチル
ス・ブレビス４７Ｋ　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２３０８）が
好適に用いられる。

バチルス・ブレビスを形質転換する方法は公知の方法で
よく１例えばＴａｋａｈａｓｈｉらの方法〔Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５６．１１３０（１９８３
））あるいはＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎの方法〔モレキュ
ラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏ１．
　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）、　１６８゜１１１（１９
７９））などが挙げられる。

得られる形質転換体の培養に用いる培地は、形質転換体
が生育して目的とする蛋白質を産生じうるちのであれば
いかなるものでもよい。

該培地に含有される炭素源としては、例えばグルコース
、シュークロース、グリセロール、でん粉、デキストリ
ン、糖蜜、尿素、有機酸などが用いられる。該培地に含
有される窒素源としては、カゼイン、ポリペプトン、肉
エキス、酵母エキス。

カザミノ酸、グリシンなどのアミノ酸類、ＮＺ−アミン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用゛いら
れる。その他、塩化カリウム、リン酸−カリウム、リン
酸二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなど
の無機塩が必要に応じて培地に加えられる。また、糖と
無機窒素源を主とする合成培地を用いて培養してもよい
。栄養要求性を示す菌株を用いる場合には、その生育に
必要な栄養物質を培地に添加すればよい、該栄養物質と
しては、アミノ酸類、ビタミン類、核酸塩基類などが挙
げられる。

また、培養に際して必要があれば、培地に抗生’物質（
例、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコ
ール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリンなど）が加え
られる。さらに必要により、消泡剤（例、大豆油、ラー
ド油など）を培地に加えてもよい。

培地の初発ｐＨは５．０〜９．０であり、さらに好まし
くは６．５〜７．５である。

培養温度は通常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４
℃〜３７℃であり、培養時間は通常１６〜１６６時間。

さらに好ましくは２４〜９６時間である。

培養終了後、それ自体公知の方法、例えば遠心分離、ろ
過など、で菌体と上清とを分離する。

培養上清中の異種蛋白質は、通常の蛋白質精製法、例え
ば塩析、等電点沈澱、ゲルろ過、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ハイドロキシアパタイト、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣ等）などにしたがって
精製され、目的とする異種蛋白質を得ることが出来る。

本発明における新規なバチルス・ブレビス４７には、遺
伝子組換えによる生産物を効率よく菌体外に分泌するこ
とが出来ることにより、遺伝子組換えにおける宿主菌と
してきわめてすぐれたものである。

次に本発明の製造例及び実施例を説明する。

製造例 ヒト唾液腺アミラーゼｃＤＮＡを含むプラスミドＰＨＡ
ＭＹ５の構築 Ｙ、　　ＮａＫａ＋ｍｕｒａ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　
Ｇａｎｇ、　　２８（１９８４）２６３−２７０に示し
た方法により、ヒト唾液腺から抽出した園ＲＮＡよりｃ
ＤＮＡが作製され、ヒト唾液腺α−アミラーゼ（ｈＡＭ
Ｙ）ｃＤＮＡ全領域がプラスミドｐＢＲ３２２に挿入さ
れたプラスミドＰＨＳ＾７、ｐＨ５Ａ１５が構築された
。更に、ｈＡＭＹ遺伝子領域以外をできるだけ取り除い
たプラスミドｐＢＲ５Ｘが構築された。このプラスミド
上のｈＡＭＹ　ｃＤＮＡのシグナルペプチド切断部位に
存在するＢａｎ　ｎ部位をＢａｎ１ｌにより切断し、Ｔ
４−ＤＮＡポリメラーゼで処理後ＢａｍＨＩリンカ−を
付加した（、）ｌＡＭＹ２）。

ｐＨＡＭＹ２　ＤＮＡをＸｈｏＩテ切断しｈＡＭＹ　ｃ
ＤＮＡを含む断片を、プラスミドｐ）１１１　（Ｓ、　
Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ。

Ｂ、　Ｖｅｉｓｂｌｕｍ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、、　１５０８０４（１９８２））のＰｖｕ　ｎ部位に
５ａＱＩリンカ−を付加したプラスミドｐＲＵ１０１の
５ａＱ１部位に挿入し、Ｔａｋａｈａｓｈｉの方法〔ム
Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．．１５６．１１３０（１９８３）
）によりＢ、　ｂｒｅｖｉｓ４７−５に導入した（ρＦ
ＩＡＭＹ３）。

次にｐＨＡＭＹ３のＢａｍｌｌＩ部位にＢ、　ｂｒｅｖ
ｉｓ　４７のＭｌｉｌＰ遺伝子のプロモータ一部位を含
む６００ｂｐ　Ａｌ１ｕＩ断片〔■。

Ｙａｍａｇａｔａ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、、　１６９．１２３９（１９８７））をＢａ
ｍＨＩリンカ−を付加後ＢａｍＨＩで切断した６００ｂ
Ｐ断片をｈＡＭＹ遺伝子と方向が同じとなるように挿入
しＰＩＩＡＭＹ４を得た。

一方、ｐＢＲ５ＸをＲａｎ　ＩＩで切断し、Ｔ４　ＤＮ
Ａポリメラーゼで処理後ＭＶＰ遺伝子のシグナルペプチ
ドをコードする部分から分離した１（ｐａＩ−Ｆｎｕ４
ＨＩ断片（Ｋｌａｎｏｖ　ｆｒａｇｍｅｎｔ処理）を挿
入し、プラスミドＰＨＫＩを得り、ｐＨＹｌ上ノＭＶＰ
遺伝子トｈＡＭＹ遺伝子の連結部分の塩基配列はｐＨＫ
　１よりＸｈｏＩ−Ｂｇｆｌ　ＩＩ　３３０ｂｐ断片を
分離しＰυＣ１１８ＢａｍＨＩ−３ａＱＩ部位にサブク
ローン化した後決定した。その連結部分の塩基配列を下
記に記した。

５’　・−・−・ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴＣＴＴＴ　ＴＧ
Ｇ　ＴＴＧ　ＣＴＴ　ＴＴＣＡＣＣＡＴＴ　ＧＧＧして
いた。アミラーゼの測定は斎藤の方法（Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈ、　Ｂｉｏｐｈｙ、　１５５．２９０−２９
８（１９７３）によった。

ＴＡＴπ℃・・・・・・・・・ ＰＨＡＭＹ４をＡｐａＬＩ、ＢｄＩｔで切断し、小断片
を除去しｐＨＫ　１のＡｐａＬＩ−ＢｇＱ　ＩＩ小断片
に置き換えることによりｐＨ５Ａ１５を得た。

実施例Ｉ Ｂ、　ｂｒｅｖｉｓ　４７にの創製 製造例で得たｐ）ｌＡＭＹ５　（ｈＡＭＹ　（ヒト唾液
腺アミラーゼ）遺伝子を含むプラスミド）を導入したＢ
、−ｂｒｅｖｉｓ　４７　（対数増殖期の）を５０ｍＭ
　ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７）中でニト
ロソグアニジン処理（生存率約ｌＯ％）し、さらに数時
間培養した後可溶性デンプンを含む寒天培地に散布した
。生じたコロニーについてＫＩ−Ｉ、で染色を行い、そ
の周囲の透明域（ハロー）の著しるしく大きいものを分
離し。

これを変異株４７にとした。本変異株のｈＡＭＹ生産量
は、表１に示す如く、親株に比べて５倍以上上昇本変異
株の特徴は長期間（７〜８日）の培養においても培地中
のｈＡＭＹ量が徐々に増加しつづける点にある。また培
養後期における培地ｐＨは比較的上昇しに＜＜、培養開
始後２４ｈにグルコース（３％）を添加することにより
Ｐ）Ｉを７．５〜８に抑えることができた。本変異株の
生育はやや温度感受性となっている（４２℃では生育が
抑えられる）。

変異株からプラスミドを除去するには、変異株をニトロ
ソグアニジン処理し、レプリカ法によりエリスロマイシ
ン感受性でｈＡＭＹを生産しない株（Ｂ。

ｂｒｅｖｉｓ　４７Ｋ）を分離することができた。

本菌株をバチルスプレビス４７にとして微工研にＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−２３０８で寄託されている。

また、Ｂ、　ｂｒｅｖｉｓ　４７にの形態、生理学的性
質は第２表に示す通りである。

第２表 Ｂ、ｂｒｅｖｉｓ　　４７に の形態・生理学的性質 実施例２ Ｂ、　ｂｒｅｖｉｓ　４フＫによるヒト唾液腺アミラー
ゼの分泌生産 ＭＶＰ遺伝子のプロモータ一部位を含む発現分泌ベクタ
ーｐＮυ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌、６１、
６６９−６７６（１９８７））及びｐＨＫ１をＨｉｎｄ
　ｍ、ＡｐａＬＩで切断し、後者のｈＡＭＹ遺伝子を含
む断片を前者のＨｉｎｄｌｌｌ、　ＡｐａＬＩ部位間に
挿入し、　ＰＨ５Ａ５を得。

Ｔａｋａｈａｓｈｉの方法によりＢ、　ｂｒｅｖｉｓ　
４７Ｋ、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２３０８に導入した。

２％ポリペプトン、０．５％肉エキス、０．４％酵母エ
キス、１％グルコース、　　２ｍＭ　ＣａＣＱ、、　１
０μｇ／鱈エリスロマイシンｐＨ７，０よりなる培地に
Ｂ、　ｂｒｅｖｉｓ４７Ｋ　（ｐＨ３Ａ５）を３７℃で
振盪培養し２４時間後にグルコースを３％添加して更に
培養を続けた。培養５日後の培養濾液のアミラーゼ活性
は２，９５０ＬＩ／ｖｓＱを示し比活性から２２ｔａｇ
／　Ｑのヒト唾液腺アミラーゼを生産した。同じプラス
ミドを保持する親株Ｂ、　ｂｒｅｖｉｓ　４７を同じ培
養条件で培養したところ、培養５日後の培養濾液のアミ
ラーゼ活性は２５００／ＳＲ（約２ｓｇ／　１　）の唾
液腺アミラーゼを生産した。このことから変異株Ｂ、　
ｂｒｅｖｉｓ　４７には親株の約１１倍の唾液腺アミラ
ーゼを生産した。一方、酵母、枯草菌を宿主菌として同
じ＜　ＰＨ５Ａ５を導入し、唾液腺アミラーゼの分泌生
産を試みたが、培養液中にはほとんどアミラーゼ活性は
検出されなかった。。

実施例３ Ｂ、　ｂｒｅｖｉｓ　４７ＫによるＣｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍｔｈｅｒ＋ｍｏｓｕｌｆｕｒｏ　ｅｎｅｓｉｓのβ
−アミラーゼの製造法Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅ
ｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏ　ｅｎｅｓｉｓのβ−アミラーゼ
構造遺伝子をＭＶＰプロモータ、シグナル配列の後に直
接連結してプラスミドＰＭＭ２を得た。

Ｃ１，ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏ　ｅｎｅｓｉｓのβ
−アミラーゼのクローニング方法、塩基配列、その遺伝
子を含むプラスミドｐＮＫ　１は、Ｋｉｔａｍｏｔｏ　
ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１７０．５８４８−５
８５４（１９８８）及び特願昭６３−４３７０８に示さ
れている。

プラスミドｐＮＫ　１をＭｆＪＩＩで部分的に切断して
得られた３、６ｋｂ断片を、Ｂ、　ｂｒｅｖｉｓ用の分
泌発現ベクターＰＮＵ２００のＢａｍＨＩ部位に挿入し
、そのつながりの方向性を確認してプラスミドｐＭＭ１
を得た０次に。

下記の４種のＤＮＡを合成後、各々の合成りＮＡをリン
酸化し、４種を混合し１００℃３分、６０℃１０分、３
７”ＣＩＯ分間温度処理しＤＮＡをアニーリングした。

プラスミドｐＮＫ　１よりβ−アミラーゼのＮ末端側を
コードするＡｖａ■−ＭｆｌＩ　１．２ｋｂ断片を分離
した。

ＰＢＲ３２２のＮｒｕＩ−Ｂａｉ＋ＨＩ部位に下記に示
した合成りＮＡを挿入したｐ、ＢＲ−ＡＮを作製した。

Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａ
ｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ＰｈｅＬｙｓ　Ｖａｌ　　Ｐｈ
ａ　Ｖａｌ　Ｍａｔ　Ｇｌｙ３′ （Ａｖａ　ＩＩ　） この合成により得たＤＮＡ配列はＭＶＰシグナル配列の
Ｃ末端側の部位に相当し、塩基配列を一部変えることに
より制限酵素Ｎｃｏ１．　ＰｓｔＩ切断点を導入したも
のである。しかし、この配列から翻訳されたシグナルペ
プチドのアミノ酸配列はオリジナルのシグナルペプチド
のアミノ酸配列と全く同じになるように設計されている
。

ｐＢＲ−ＡＮのＮｃｏＩとＢａａ＋）ＩＩ部位の間に、
先に得た合成りＮＡ４種をアニーリングしたＤＮＡ断片
、及びＰＮＫＩ＾ｖａＩＩ−ＭｆｆｌＩ　１．２ｋｂ断
片を挿入しｐＢＲＡＮ−ＢＮを得た。

ｐＢＲＡＮ−ＢＮよりＡｐａＬＩ−３ｐｈＩ断片（２７
０ｂＰ）を分離しｐＭＮｌのＡｐａＬＩ−ＳｐｈＩ部位
間に挿入し９ＭＭ２を得た。

９ＭＭ２のＭＶＰシグナル配列とβアミラーゼ遺伝子の
結合部の塩基配列をジデオキシ法にて決定した結果、下
記に示したように設計通りのつながりになっていた。

ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＧＴＣＧＴＴ　ＡＡＣＡＧＴ
　ＧＴＡ　ＴＴＧ　ＧＣＴ　ＡＧＴ　ＧＣＡ　ＣＴＣＭ
ｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅ
ｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ｔａｕ
ＧＣＡ　ＣＴｒ　ＡＣＴ　ＧＴｒ　ＧＣＴ　ＣＣＣＡＴ
Ｇ　ＧＣＴ　ＴｒＣ（ＥＣＴ　ＡＧＣＡＴＣＧＣＴＣＣ
Ａ　ＡＡＣＴＴＣＡＡＡ　Ｇ’ｒｒ　ＴｒＣＧＴＴ　Ａ
ＴＧ　ＧＧＴ　ＣＣＡ　ＴｒＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＧＴ
Ｃ・・・Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐ
ｈｅ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｕ　Ｌｙｓ　ＶａｌｐＭＭ２を保有するＢ、　ｂｒｅｖ
ｉｓ　４７にその親株Ｂ、　ｂｒｅｖｉｓ　４７のβ−
アミラーゼの生産性を検討した。

２％グルコース、１％ポリペプトン、０．５％肉エキス
、０．２％酵母エキス、１００μｇ／ｙａＱウラシル、
ｌＯμｇ／ＩＩＱエリスロマイシンよりなる培地１０ｔ
Ｑを１００ｍ＃容三角フラスコにいれ、３７℃で振盪培
養した。その結果を第１図に示したが本発明のＢ、　ｂ
ｒｅｖｉｓ　４７Ｋ　（９ＭＭ２）は培養７日目の培養
上清のβ−アミラーゼ活性は１．１０００／ａΩを示し
親株の約２．５倍の生産量を示した。なお、β−アミラ
ーゼ活性の測定はＤＮＳ法により５０ｍＭ酢酸バッファ
ー中で７０℃にて行った。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３において、　　Ｂ、　ｂｒｅｖｉｓ
　４７Ｋ（９ＭＭ２）とＢ、　ｂｒｅｖｉｓ　４フ（９
ＭＭ２）のＣ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ＋ｍｔｈｅｒｍｏｓｕ
ｌｆｕｒｏ　ｅｎｅｓｉｓ由来のβ−アミラーゼの分泌
量を比較した図である。 第　　１ 図

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）菌体外に極著量の蛋白質を生産する変異バチルス
   ・ブレビス。
2. （２）菌体外に極著量の蛋白質を生産する変異バチルス
   ・ブレビスからなる遺伝子組換における宿主菌。
3. （３）プロモータ領域を含有するＤＮＡの３′末端にヒ
   ト唾液腺α−アミラーゼをコードするＤＮＡを結合させ
   たＤＮＡを保持せしめた菌体外に極著量の蛋白質を生産
   する変異バチルス・ブレビス。
4. （４）プロモータ領域を含有するＤＮＡの３′末端に￥
   Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ￥　￥ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕ
   ｒｏｅｎｅｓ￥由来のβ−アミラーゼをコードするＤＮ
   Ａを結合させたＤＮＡを保持せしめた菌体外に極著量の
   蛋白質を生産する変異バチルス・ブレビス。
5. （５）第３項の変異バチルス・ブレビスを培地に培養し
   、培養物中にヒト唾液腺α−アミラーゼを生成、蓄積せ
   しめ、これを採取することを特徴とするヒト唾液腺α−
   アミラーゼの製造法。
6. （６）第４項の変異バチルス・ブレビスを培地に培養し
   、培養物中に Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏ
   ｇｅｎｅｓ由来のβ−アミラーゼを生成、蓄積せしめ、
   これを採取することを特徴とする￥Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
   ｕｍ￥　￥ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｏｅｎｅｓ￥由来
   のβ−アミラーゼの製造法。