JP3426599B2 - 薬物担体としてのヘモグロビン - Google Patents
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Description
願、現在米国特許第5,028,588号、Somatogen,Inc.所有
の特許発明は代用血液としての酸素親和性突然変異ヘモ
グロビン、ならびにα、βグロビン非赤芽細胞[nonery
throid cell]の発現に関する。HoffmanとNagai,1989年
12月1日出願、米国特許出願第07/443950号は、ある種
のジシステインが付加されたヘモグロビン突然変異体に
ついて開示する。これは出願第07/194338号の一部継続
出願である。Hoffmanらの、米国特許出願第07/671,707
号、1990年5月10日出願は、酵母におけるヘモグロビン
の発現、αグロビン、βグロビンのポリシストロニック
同時発現、生物学に活性な四量体ヘモグロビンのインビ
ボ会合[assembly]、ジアルファグロビンおよびジベー
タグロビンの偽二量体の産生と増大された血管内保持力
のある偽四量体ヘモグロビンの会合におけるそれら偽二
量体の使用法について記載している。Hoffmanらの、199
1年11月8日出願の「ヘモグロビン及びその類似体の産
生ならびに使用法」と題する米国特許出願第07/789179
号、Atty.Docket No.HOFFMAN5B−USAは、第07/671707号
の一部継続出願であるが、ヘモグロビンのモノシステイ
ン突然変異体ならびに八量体その他の偽二量体などを利
用して構築した多量体ヘモグロビンの産生ならびに使用
法について記載している。上記した出願に言及して本明
細書中に取り込むものとする。
る。
ス、あるいは急速な代謝にため血流中にあって比較的短
い半減期しかもたない。このことは特に、約50,000〜7
0,000ダルトンという腎臓濾過限界より小さなポリペプ
チド型薬剤にについて真実である。最近では多くの製薬
会社や研究所などが人体中における薬効期間を延ばすこ
とを目的に膨大な時間と経費を投入している。患者が薬
物をより少なくしか取らないことには非常に多くのメリ
ットがある。例えば、よりよい服従性[compliance]、
人体中濃度の予測可能性、投与直後の急激な薬物投与か
ら受ける副作用のすくないことなのである。特に予防薬
的に、あるいは長期間に亙って投与されるようなものに
あっては、薬物治療はもし少なくて済むものなら、患者
にとって容易に受け入れられるものとなる。
感染の危険や一種の苦痛を伴うものである。多くの患者
が種々の薬物を継続的または頻繁に注射される必要があ
るためだけで入院させられている現状もある。もし薬物
投与がこれまでより少ない回数で済むなら、治療費の一
部は不要となろう。
患者がより長い時間服用効果を享受することができるよ
うに1回に非常に多量の服用量を投与することがある。
しかしそのような多量の服用量はより明確な有害効果を
もたらす場合がある。
混ませることもある。梅毒感染や連鎖球菌感染の処置
に、あるいはリウマチ熱の予防処置として、アンモニウ
ムステラート[ammonium sterate]中に入れた少量ドー
ズの[low−dose]ペニシリンを使うことはその1例で
ある。ワクチンの効力を高めるためにフロイントアジュ
バントを使うことも1例である。N−(2−ヒドロキシ
プロピル)メタクリルアミドコポリマーのようなポリマ
ーも候補に挙げられている(Seymourら、British Journ
al of Cancer、63(6):859−66(1991)))。薬物と
担体[carrier]とのゆるいイオン−イオン結合を薬剤
の遅放出に利用することが米国特許第4374932号に記載
されている。薬剤のあるもの、例えば避妊剤[contrace
ptives]などは、何カ月、何年というような長期間に亙
る非常に緩慢な放出をさせるため、担体に強固に結合さ
れている。同期間に毎日ピルを取り続けるよりも患者は
楽なのでこのようなものの方が喜ばれる。そのほか遅効
性にする手段はインシュリンポンプ[insulin pump]で
ある。
謝速度を遅らせるだけの目的で、別の薬物を同時に投与
するまでしてみて長期的投薬の正しいことを確認してい
る。人体中の高ドーズ[high−dose]のペニシリンその
他の類似の化合物の半減期を延ばすという唯一の目的
で、プロベネシドを投与することが、ここ数十年、淋疾
その他の疾病の標準的処置であった。
合物構造を改変する研究をしてきたように、薬理学者は
人体における化合物の滞留(レジデンシー)[residenc
y]を増強させるため改変を研究している。この古い例
はよく知られた薬剤のアセチルサリチル酸(アスピリ
ン)で、これはサリチル酸の誘導体より長い半減期をも
つ。薬物がある特定の血清タンパク質にもっと容易に結
合するように、そしてそれによって人体中で半減期を延
ばすように、薬物設計することも研究の1法である。し
かし薬剤の全部が簡単に改変できるようなものではな
く、臨床医は単純な薬物改変だけで実現可能なものより
高い滞留時間を達成することを望んでいるのである。
代謝ならびに腎臓クリアランスという従来の化学的薬物
に認められる問題に加えて、種々の体液はカルボキシ−
およびアミノ−ペプチダーゼは勿論、血清ジペプチジル
ペプチダーゼIVのようなエンドペプチダーゼを含有して
いる。これら体液は多くの治療薬ペプチドを急速に劣化
することができるもので、これらペプチドの多くはフリ
ーペプチド[free peptide]での半減期(T1/2)は分
単位である。肝臓による取り込み[uptke by the live
r]および親油性[lipophilicity]はポリペプチドをそ
の作用部位から除去するように作用する。(Brogerら、
Regulatory Peptides、Supplemen 4:8(1985)) ポリペプチド薬物を誘導体化[derivatize]すれば分
解速度を減速することができよう。例えばN−アシル化
はアミノペプチダーゼの作用を阻止し得るものであり、
多くのカルボキシ末端の修飾がカルボキシペプチダーゼ
を制限することを目的に提案されてきた。さらにアミノ
酸の種々の類似体を使用すること、異常な側鎖部分のあ
るものや非ペプチド結合のもの、あるいはD−アミノ酸
の類似体が、プロテオリシス(タンパク分解)を抑制す
るものとして提案されている。
w release]ポリマーを、ある一定期間ペプチド放出さ
せるのに使うことができる。注射可能なポリ−(D,L)
乳酸/グリコール酸のコポリマーマイクロスフェア(小
球)[microspheres]が経口投与の場合の緩慢なポリペ
プチド放出に使われている。ポリエチレングリコールお
よび多糖のマトリックスも同様な理由で使われている
(Hilbert,Trends in Biotechnology,9(1):11−17
(1991)および欧州特許出願第381719号)。外科的に埋
め込まれたポリ無水物[polianhydride]のディスクま
たは「半球体」[hemispheres]が、100日間を超える期
間に亙って大きなタンパク質を緩慢に放出させるのに使
われている。舌下、口内吸収、および粘液による表面デ
リバリー[surface delivery]のような他の薬物運搬法
(ドラッグデリバリー)も多くの可能性ある薬剤を使っ
て試みられたが、緩慢放出効果はなお不十分であった。
3622号及びRettenmaierら、Gynecol.Oncol.,27(1):3
4−43(1987)に記載されているように、開裂不可の[n
on−cleavable]リンカーを介してアルブミンに化学的
に結合することができる。エリスロポエイチンのような
生物学的に活性な物質がアルブミン上に吸収させられた
りアルブミンと複合体を作ったりしている(米国特許第
4,879,272号及び第3,980,764号)。その他多数のポリペ
プチドやタンパク質が薬物運搬系(ドラッグデリバリー
システム)として提案されてきた。例えばフィブロネク
チンの一部分(日本特許第3123799号及び第1261398号、
1991年5月27日、1989年10月18日)、膜タンパク質(ド
イツ特許第3938953号)、エラスターゼの組換え部分(W
olfsonら、Protein Engineering、4(3):313−317
(1991))、(複数種の)レクチンの組合せ(欧州特許
出願第337799号)、コラーゲン(米国特許第4,291,013
号及び第4,849,141号)、種々の血清タンパク質および
血清組成物(米国特許第4868158号、第4843856号第2
欄、第3行および第4918008号)、抗体およびそのフラ
グメント(米国特許第4,474,893号;Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、85(11):3990−3994(1988);欧州特許出願第
396387号およびPCT出願第91/09134号)その他の標的タ
ンパク質(欧州特許出願第238645号)がある。
として使われている。Toothらはアミド、エステルその
他の不安定リンクを使って薬物運搬性を向上するため、
ペプチドに脂肪化合物を結合することによって膜溶解性
[membrane solubility]を高めようと試みた。同様な
方法が米国特許第4,497,932号及び第4,540,564号でも使
われている。偽ポリアミノ酸のアミノ酸側鎖にある官能
基に薬物を付加することが試みられたこともある(Lang
er,Ibid.,p113)。
使われている。(Fujitaら、Journal of Controlled Re
lease、11(1−3):149−156(1990)) 薬物は種々の担体と次のようなさまざまな方法で結び
付けられている。例えば吸収、捕捉[entrapment]、化
学的結合、ならびにリポソームまたは小包内でのものが
ある。ある種の担体は人体にゆっくりと吸収され、それ
によってその担体が分解するにしたがって薬物が放出さ
れる。おそらく最も安定しているのは担体薬剤に薬物を
化学的に結合するものであろう。しかしその結合があま
りに強すぎるときは薬物が自由な機能を有する形になっ
て放出されることがなくなる。たくさんの結合形[link
age]が採用されている。例えば酸に不安定で光に不安
定な架橋[bridges]がある(欧州特許出願第185762
号、第191772号)。グルタチオン、システイン、ホモシ
ステイン、およびγ−グルタミルシステインのような還
元剤の血清中での低濃度存在によってジスルフィド結合
は血液中でゆっくりと開裂[cleaved]される。エステ
ル結合およびペプチド結合は酸性状態またはアルカリ性
状態で、またはタンパク質分解で開裂できるが、これら
は全て人体の各所で生起することができるものである。
質があるから、これら薬物のどれ一つとして血流中に特
異的に制限されてはいない。また、運搬系(デリバリー
システム)からの治療薬の放出は殆ど制御できないこと
なので、また、付加の状態はランダムで化学的に均一に
限定されているものではないのが殆どである。しかも担
体に接合[conjugate]される薬物量を押し込めること
[consrain]は、担体分子に多数の無制御な活性部位が
あるので、困難である。このように単分散形成は上記の
ような担体では不可能である。これらすべてのファクタ
ーが目的薬物の放出のされ方を変えているのである。
搬するために種々の担体が使われているが、血液からの
急速なクリアランスがあるため問題となっている。アル
ブミンのように比較的長く続く担体(米国特許第4,042,
677号)が試用されているが、アルブミンは局在特異性
がないから、血流から「漏れ」てしまい理想的な撮像か
らは程遠いものとなる。
に関する。ヘモグロビンは部位特異的に修飾することが
できる内因性[endogenous」の高分子量タンパク質で、
組換え技術を使って発現させることができるから、薬物
の安定性を向上させ血管内保持力[intravascular rete
ntion]を強化することによって薬物運搬をコントロー
ルするのに使うことができるヘモグロビン様タンパク質
をもった特殊な新規の接合体[conjugates]を選択的に
設計することができる。しかもヘモグロビン様分子およ
びリンカー分子への接合部位[conjugation site]を適
切に選択することによって、薬物のインビボ挙動を特別
に制御することができる。これまで使われている種々の
薬物担体とは違って、本発明ではあらゆる薬物の担体と
して、特に血清タンパク質ではない薬物の担体として、
あるいは正常ヒトヘモグロビンのそれより短時間の血管
内保持力しかない血清タンパク質の薬物の担体として、
ヘモグロビンを使用することを考察している。ペプチド
性薬物[peptide drugs]は、遊離形で[in free for
m]タンパク質の加水分解に感受性なので[susceptibil
ity]、このような運搬に特に優れている。この薬物運
搬系(ドラッグデリバリーシステム)は血流中における
薬物に安定性および緩慢放出性を提供するものである。
期は数時間のオーダーであるから、本発明は薬物運搬維
持にとって特に有益で、血清半減期が1時間未満のペプ
チド性薬物には特に有益である。しかし本発明はそのよ
うな薬物の運搬にだけ限定されるものではなく、特にヘ
モグロビンの半減期は遅緩ハプトグロビン結合の突然変
異によって引き延ばされるのであるから限定されない。
ではなく血液中に普通に存在するので、薬物−ヘモグロ
ビン接合体はタンパク質担体中でよりも血流中での方が
よりよく保持されるであろうと期待される。体内を移動
するアルブミンその他のタンパク質は、薬物の放出速度
を変更する原因となると考えられる各臓器ごとの著しい
環境変化にさらされている。これに対して血液は静脈血
液、動脈血液間の酸素圧差[oxygen tension differenc
es]を除けば比較的均一である。また、ある種の薬物は
特定の組織に対して他の組織に対するより毒性である。
血液中に薬物を、それがゆっくり放出されるまで集中さ
せて維持することにより、過去に観察された毒性の問題
の多くを回避することができよう。また、遊離した組換
えヘモグロビンを高い濃度で血液中に得ることができる
ので、低い効力の薬物を投与することが有効となる。
することにも関する。立体的要素、電気的微環境、ヘモ
グロビンの身体内局在部位[physical locaiton]、リ
ンカーの長さ、標的分子の付加部位などについて考察し
てヘモグロビンへの薬物の付加部位を慎重に選択するこ
とは、内因性排出[endogenous removal]メカニズムか
ら薬物を保護することを向上させることになる。
同時的な運搬にも関する。化学療法剤[chemotherapeut
ic agents]は酸素存在下での方が効果的である。化学
療法で患者を処置後にパーフルオロカーボン[perfluor
ocarbons]を投与することが提案されているが、これは
酸素を剥奪された腫瘍の内部が酸素を得れば化学療法剤
の作用を助けるであろうと期待されているからである。
本発明は、酸素を追加的に供給するだけでなく、多量の
酸素を放出するのに使われるもので、薬物が実質的にそ
れと同時に、例えば化学療法剤の効果を向上させるもの
である。
するための造影剤を提供することも目的とする。
グロビンより劣っている。これまで十分に考えられたこ
とがない点の一つは、アルブミンが34個のシステインを
もっており、したがって自然におりたたまれたアルブミ
ン中のこれらシステインは17個のジスルフィド結合に関
与していることである。もしアルブミンが遺伝子工学で
作られた細胞中に発現され天然源に依存しなくても済む
ようになったら、そのポリペプチドはヒト細胞中で実際
されているように必ずしもおりたたまれる必要はなくな
るであろう。ジスルフィド結合形成のトポロジー[topo
logy]は分子ごとに異なり、多分散組成となっている。
ある分子は不安定で、接合された薬物を初期に放出する
であろう。
れるなら、いくつかは薬物に架橋し、ほかは別のアルブ
ミンシステインに架橋するということになろう。ここで
もまた無数の異形[variants]が生起される。あるもの
は急速に分解するであろうが、ほかのあるものは薬物を
あまりに保護してしまうので、必要な時に放出しないと
いうようなことが起こるであろう。ロット間の一致がな
くなるのである。
2つは各βグロビンサブユニットに、1つは各αグロビ
ンサブユニットにある。この四量体が変性させられない
限り、β93システインだけが試薬に反応し、このシステ
インは薬物設計者が希望するように、架橋部位として使
うか、あるいはそれをセリン、アラニンまたはトレオニ
ンのような類似のアミノ酸で置き換えることで中和す
る。アルブミンの多数のシステインが安定性に影響する
ことなく[中和」されることはあまりないことである。
り、その数は部位特異的突然変異生成[mutagenesis]
でコントロールすることができるので、ヘモグロビンは
アルブミンよりずっと有利である。
ンカーを介して、ヘモグロビン様タンパク質に会合[as
sociate]することによって、運搬及び/又は安定化す
る系に関する。以下に本発明の要素であるリガンド、ヘ
モグロビン及びリンカーにつき詳細に述べる。
造的にも機能的にも種々多様である。合成薬剤[synthe
tic drugs]、核酸、ポリマー、その他のタンパク質、
特にポリペプチドまたはオリゴペプチドなどを含む実質
的にあらゆる有機化合物が、ヘモグロビンに会合または
結合して、安定化、緩慢放出化、血管系またはヘモグロ
ビンの分解に通常関与している組織(肝臓、腎臓、脾
臓)への局在化[localization]に貢献している。なお
本明細書で「薬物」(drug)との用語は例としてのもの
であって限定的に解されてはならない。
ヘモグロビンに結合するペプチド性薬物として使うこと
ができる。次に挙げたリストは代表的なものであって可
能な薬物をもらさず挙げたものではない。そこに示され
たペプチドは、ペプチドの治療薬としての可能性[pote
ntial]を示すために試験された化合物のずっと多大な
セットから取られた僅かな例にすぎない。しかし接合
[conjugation]に先立ちこれらペプチドの類似体を構
築するのであるが、これら類似体はヘモグロビンによる
適切なる運搬にとって必要な修飾された付加部位、リン
カーの腕、スペーサーその他のエレメントをもたらすよ
うに構築する。
ら得られる類似のペプチドは、ペプチド化学に通常の知
識を有する者であれば容易に合成することができる。し
かし本発明はペプチド型薬物の運搬だけに限定的に解さ
れるべきものではない。
b/III a受容体−フィブリノーゲン相互反応によって仲
介される血小板凝集[platelet aggregation]を阻止す
る。マウスの抗血栓症アッセイのIC50は14μMである。
は上記と同様に10μMのIC50で血小板凝集を阻害する。
血漿アミノペプチダーゼに対してN−アセチル化により
安定化される。
体。下付きのDはD−アミノ酸で、Chaはシクロヘキシ
ルアラニンである。この化合物はヒトα−トロンビンの
合成インヒビター(阻害剤)でIC50は29nMである。これ
はまたマウスの抗凝血剤[anticoagulant]としても有
効である。この化合物は肝臓で除去されるから、Hbのよ
うな大きな分子に付加し、それから緩慢に放出すること
は血清の半減期を劇的に延ばすことができる。
の化合物は4μMのIC50で冠状動脈内注射によりイヌに
おける血栓形成を阻害する。この化合物はアミノ末端シ
ステインを介してヘモグロビンにリンクされる。
timetastics] 1.Pr−HWA−VdAH(Me)L−OMeまたはその類似体。この
化合物はスイス3Td繊維芽細胞のボンベシンで賦活され
る突然変異生成のアンタゴニストとしてIC50値3.3nMで
ある。そのラットにおける半減期は皮下投与で2.5時間
である。この薬物はガストリン放出ペプチドの、また小
細胞肺ガンにおける作用増殖因子[an autocrine growt
h factor]の、潜在的なアンタゴニストとして開発され
た。より長い期間での作用が好ましいのである。
またはその類似体。この化合物はガストリン放出ペプチ
ドの結合を抑制することにつきIC50が0.8nMで、繊維芽
細胞によるチミジンの取り込みを抑制することにつき5.
2nMである。同様な類似体は胸腺除去マウス[athymic m
ice]に植付けた腫瘍を小さくするのが認められた。
VGHLM−OMeまたはそれらの類似体。この化合物はテンジ
クネズミ細葉細胞癌[acini]からのボンベシン放出の
抑制、ならびにスイス3T3繊維芽細胞の増殖の抑制につ
き、IC50が243と29nM、及び2nMと0.167nMである。N−
プロピルアミドの類似体をラットに100nmol/kg注射した
所、ボンベシン刺激による膵臓アミラーゼ放出を60分間
阻害した。
ンビボでの肺腫瘍転移を阻害する。血液中のペプチド持
続性[persistence]を増大する条件としては、例えば
血管内反復注射、薬効[efficacy]の増大がある。Saik
iら、Cancer Res.,49:p.3815,(1989)。ラミニン配列Y
IGSRとの同時注射も薬効をさらに増大することができ
る。ヨウ素化されたペプチドの約97%が1時間で血液か
ら除去[cleared]された。
0メラノーマ細胞の転移を阻止する。Humphriesら、J.Cl
in.Invest.,81:p.782(1988)。ペプチド(循環半減期
8分)の6マイクロモル(2.9mg)は、14日後に数えた
とき転移を90%阻止する。
化合物はマウスのメラノーマ転移を阻止する。このペプ
チドは基底膜においてラミニンに結合する腫瘍細胞ラミ
ニン受容体のアンタゴニストとして設計された。
この化合物はヒト血漿レニンの抑制につきインビトロIC
50が0.02nMである。
似体 1.HWDAWFDK−NH2またはその類似体。この化合物はニワ
トリ、子ヒツジ、ウシ、ブタ、アカゲザルに効力のある
成長ホルモンを放出するペプチドである。ブタにおい
て、成長ホルモンの基線値は低く、長期に亙って安定し
ている。本発明の薬物担体化合物なしに単独で投与した
所、静脈内、皮下、または鼻内の注射は血漿成長ホルモ
ンのレベル(約45〜75ng/ml血漿)をさまざまな時間帯
で(概して約1時間後におさまったが)、急激に増加さ
せた。服用量は3〜30μg/kg(血管内注射)ないし25〜
100μg/kg(皮下注射)または0.5mg/kg(経口投与)と
した。経時的に増加するレベルは、向上した生物学的効
果をもたらすであろう。これと同じペプチドも治療薬と
してヒトに使用されることが仮定される。Yellinら、Ib
id.,p.214(1990) 2.V2、A15、L27子ウシGRF(1〜29)−NH2 I2、A15、L
27−子ウシGRF(1-29)−NH2またはその類似体。これらの
ペプチドは非常に効果が高く、また長期に継続性で(11
〜16倍)、血漿ジペプチジルペプチダーゼIVに耐性の子
ウシ成長ホルモン放出因子の類似体である。これらは親
ペプチドよりもインビボ、インステアで[in steers]
より活性であるが、これはより長い血漿半減期および向
上された内在性効力[intrinsic potency]によるもの
と考えられる。
exigenics]としての。
H2またはその類似体。この化合物は、おそらくA型CCK
受容体に結合して飽和しようとしている食欲減退効果の
あるCCK−8類似体である。膵臓、脳幹、幽門型A受容
体への結合IC50は、0.4〜1.4nMである。ラットモデルに
おける食欲減退の服用量しきい値は0.05nmol/kgであ
る。これらの類似体のインビボ長期継続性服用は重大な
副作用のない減量計画に効果的に作用するであろう。
ディングアッセイ[feeding assay]におけるED50は腹
膜内で1mg/kgである。CCK−B受容体の700倍選択性があ
る高親和性アゴニストが最後から2番目の位置にN−メ
チルaspを使って開発された。これを満腹誘導薬物とし
て試験用に上記アンタゴニストの配列と結合させること
ができる。
例、ポテンシャル鎮痛薬として。
PenはD−ペニシラミンである。これはμ受容体よりも
δ受容体を選択する環状エンケファリン類似体である。
この選択性は明らかに、モルヒネのような化合物に特有
のマイナスの副作用を回避するものである。N−末端2,
6−ジメチルチロシン環状四量体[4−mers]および五
量体[5−mers]、デルトルフィンI(YDAFDVVG−N
H2)、及び効力あるδアゴニストとして環状HCDFPenDの
代わりとなるPhe3も使うことができる。
化合物はμに対するδ受容体の選択性をもち、また上記
類似体はμ受容体結合に対しては全く不活性である。し
かしδ受容体への結合性は減少しているように考えられ
る(ラット脳結合実験におけるEC50は100〜200nM)。デ
ルトルフィンのより強い効力の類似体を、EC50が0.36nM
である、ser4に対するasp4の置き換えも含めて、使うこ
とができる。
の化合物は3000〜4000倍もμ受容体よりもδ受容体に対
する選択性がある。その作用はそれらをC−末端テトラ
ペプチドに局在化するようである。
似体。このペプチドは11,000倍もδ受容体より末梢μ受
容体への選択性があり、末梢κ受容体には結合せず、pH
7.4でネット+2〜+3電荷があるため血液/脳隔壁[b
lood/brain barrier]を通過することができないようで
ある。このようにこれはモルヒネと殆ど同じ効力で鎮痛
を誘導し(尤もそれほど効力持続性はないが)、末梢抗
侵害剤[peripheral antinociceptive]の機能を立派に
果たすものと考えられる。(Burgenderら、Eur.J.Clin.
Invest.,18;420−4(1988))そのような末梢的作用の
ため、呼吸機能低下[respiratory depression]および
依存症のような主要な副作用にも襲われないと考えられ
る。
62〜3、1991年に記載されている。
は、ウイルスのアッセンブリや複製に必須のタンパク質
に、gagとgag−pol前駆体タンパク質をプロセッシング
する過程に関与する。インヒビターはHIVの細胞DNAへの
組込みを阻止するものと考えられ、初期的な臨床実験段
階にある。本発明の運搬系を使ってこれらインヒビター
を長期に亙りエイズ患者の血液中に緩慢放出させること
はエイズの増殖を妨げ、ほかの薬剤による感染細胞への
攻撃を可能にする。薬剤として注射されたヘモグロビン
結合インヒビターにとって何週間というレンジの非常に
長い半減期は有利なことであろう。
て、あるいは疾病予防法として植物動物の双方に使われ
ている。成長促進剤、殺虫剤、除草剤、食品防腐剤、局
部洗浄剤、獣医用薬剤などが安定剤及び/又は緩慢放出
剤としてヘモグロビンを採用できる。
接合できるもので、複合体溶液の適当量でその薬物の効
果量を供給するのに十分なだけ血液中に溶解し、所望の
臨床効果を達成するのに必要なだけ長期間に亙ってその
薬物を運搬できるものでなければならない。それはまた
その適用されるヒトまたは動物に対して非免疫的[non
−immunogenic]でなければならない。調剤者[formula
tor]が薬物を予め決定してある部位に所望時間の放出
特性を保持して結合することができ、所望の薬物:担体
モル比を達成するように、好ましくはこの運搬剤は制御
可能に結合できるものがよい。また、薬物が組織にあま
りに早期に運搬されてしまわないように、担体は本質的
に血管系から漏れ出ることがないものであることが好ま
しい。さらに運搬剤は薬物の作用部位に酸素を運ぶこと
ができるように、酸素に可逆的に結合するものであるこ
とが場合によっては好ましい。
る。ヘモグロビンは酸素を呼吸面[respiratory surfac
es]で取り込み内部組織に運ぶ酸素結合タンパク質であ
る。別の実施例では血管内薬物運搬剤はグロビン、例え
ばミオグロビンである。
物への結合のため、チオールのある薬物、あるいはチオ
ール特異性架橋剤と反応できる表面システインまたは凹
部システインの残基を特徴とする部位特異性の突然変異
生成で修飾することができる。ヘモグロビンは一つの四
量体につき二つしか反応性システインをもっていないの
で(β93で)、結合される薬物分子数、および結合部位
は容易にコントロールすることができる。ヘモグロビン
は免疫系にも十分耐えることができる。子ウシヘモグロ
ビンはヒトに問題なく利用されている。データは不完全
であるが、血管系からのヘモグロビン漏出はアルブミン
の場合よりも相当に少ないと信じられる。ヘモグロビン
はまた大きなタンパク質なので、インタクト(完全)な
四量体であるが、腎臓[revialではなくrenal]の濾過
を逃れる。一方それは食作用および類似のメカニズムに
よって除去されるには小さすぎる。(ヘモグロビンは二
量体への解離およびハプトグロビンによる結合に一層の
耐性をもつように修飾することができる)。最後にヘモ
グロビンは可逆的に酸素に結合する。こうした特徴は、
各々単独でも組合せても、血管内の薬物運搬剤にとって
好ましいものである。
られている。我々はここでBunn and Forget,eds.Hemogl
obin:Molecular,Genetic and Clinical Aspects(W.B.S
AUNDERS CO.,Philadelphia,PA:1986)、及びFermi and
Perutz “Hemoglobin and Myoglobin"、in Phillips an
d Richards,Atlas of Molecular Structures in Biolog
y(Clarendon Press:1981)を引用して本明細書の一部
として組み込むものとする。
b A(二つのα鎖と二つのβ鎖でできているのでα2β
2と呼ばれている)である。α鎖は141のアミノ酸でで
きている。ヘム(フェロプロトポルフィリンIX)グルー
プの鉄原子はhis 87(「基部に近い[proximal]ヒスチ
ジン」)のイミダゾルに共有結合している。β鎖は146
残基の長さ(図12)でヘムはそれにhis 92で結合してい
る。
々のアミノ酸の側鎖にある何らかの修飾を同定すること
で決定される。鎖の局部的屈曲[local bending]はそ
の二次構造である。ヘモグロビン分子の三次構造はアミ
ノ酸残基の立体的関係に帰するが、四次構造はサブユニ
ット(鎖)が一緒にパックされたそのされ方に帰せられ
る。ヘモグロビン分子の三次および四次構造はヘモグロ
ビン結晶のX線回折分析によって判定することができ、
それによってその分子の原子の三次元位置を計算するこ
とができる。
に保持されている。赤血球が老化して死ぬと、ヘモグロ
ビンを血流中へ放出する。そこでヘモグロビンはα−β
二量体に解離する。これら二量体は腎臓濾過により、あ
るいはハプトグロビン結合の結果除去される。こうして
産生した複合体は血清半減期約10〜30分で、肝臓のクッ
パー細胞にある受容体によって即座に取り込まれ、そこ
で代謝される。ヘモグロビンはその他のメカニズムでも
血清から取り除かれる、例えば遊離したヘモグロビンの
肝臓の実質[parenchymal]細胞による取り込みがあ
る。
ファミリーを指す。ヘモグロビンは(ヒトを含む)あら
ゆる動物源から単離することができ、組換え生物(トラ
ンスジェニック動物を含む)または化学合成によって人
工的に産生することができる。
ン」または「ヘモグロビン様タンパク質」とは、一つま
たは二つ以上のヘム補欠分子族を有する酸素結合タンパ
ク質をいう。好ましくはそれは(a)二つのαグロビン
様ポリペプチド及び二つのβグロビン様ポリペプチド、
(b)一つのジアルファグロビン様ポリペプチド及び二
つのβグロビン様ポリペプチド、(c)二つのαグロビ
ン様ポリペプチド及び一つのジベータグロビン様ポリペ
プチド、(d)一つのジアルファグロビン様ポリペプチ
ド及び一つのジベータグロビン様ポリペプチド、(e)
一つの融合α/βグロビン様ポリペプチド及び個別のα
グロビン様ポリペプチドとβグロビン様ポリペプチド、
または(f)二つの融合α/βグロビン様ポリペプチ
ド、からなる一つまたは二つ以上のヘテロ四量体であ
る。一つの四量体のポリペプチドはもう一つの四量体の
ポリペプチドに架橋されるか遺伝子的に融合されてもよ
い。ヘモグロビンは、四つ以上のグロビンサブユニット
またはドメインでできているときは、多量体[multimer
ic]であると言う。ここで「多量体」[multimeric]と
は、八量体[octameric]ヘモグロビン(二つのリンク
された四量体[tetramer]を含み)、その他の高次の多
量体[multimers]をいう。
ヒトαグロビンまたは生配列とは一つまたは二つ以上が
置き換えられたり、欠失されたり、挿入されて、違って
いるその突然変異体であるが、残りはヒトαグロビンと
実質的に相同(後に定義する)な、ヘムを取り込み[in
corporate]βグロビンと会合[associate]することが
できるものである。βグロビン様ドメインまたはポリペ
プチドは類似体として定義される。ヒトαまたはβグロ
ビンと十分相同な動物ヘモグロビンまたはその突然変異
体のサブユニットは、「ヒトαまたはβグロビン様ドメ
インまたはポリペプチド」という言葉に包含される。例
えば子ウシヘモグロビンのサブユニットはこの言葉の範
囲内である。α−及びβ−グロビン様ポリペプチドは集
合的に「グロビン」と呼ばれることもある。便宜上「ポ
リペプチド」の言葉はより長いポリペプチド鎖の単一の
鎖[a unitary chain]またはドメイン[a domein]を
いうものとする。
hemoglobin]とは、少なくとも一つの「遺伝子的に融合
されたグロビン様ポリペプチド」(グロビン偽オリゴマ
ー)を有するヘモグロビン様タンパク質で、グロビン様
ポリペプチドは同一または異なる二つまたは三つ以上の
グロビン様ドメインからなる。ジアルファグロビン様ポ
リペプチドとは、第一のα−グロビン様ポリペプチド
(ドメイン)の正常[normal]C−末端と第二のα−グ
ロビン様ポリペプチド(ドメイン)の正常N−末端との
間のペプチド結合でつながった二つのαグロビン様ポリ
ペプチド配列(ドメイン)を必須の要件として構成され
る。これら二つの配列は直接つなげられるか、または一
つまたは二つ以上のアミノ酸のペプチドリンカーを介し
てつなげられる。「ペプチド結合」の言葉は、これら両
可能性を包含する。ペプチド結合以外のN−末端及びC
−末端で架橋(例えばDIDSにより)されたαグロビン鎖
はジアルファグロビンではない。ジベータグロビン様ポ
リペプチドは好ましくはβグロビンと一緒におりたたむ
ことができ、ヘムを取り込んで機能を有するヘモグロビ
ン様タンパク質を形成する。ジベータグロビン様ポリペ
プチドは類似体と定義される。成分ドメインの一つだけ
が突然変異しているジアルファまたはジベータグロビン
様ポリペプチドは「非対称的」と呼ばれる。
様配列につなげられている「α/βグロビン様偽二量
体」を産生することも可能である。この「α/βグロビ
ン様ポリペプチド」およびジアルファ、ジベータグロビ
ン様ポリペプチドは、集合的に「偽二量体グロビン様ポ
リペプチド」または「ジグロビン」[diglobins]と呼
ぶ。さらに拡大して、ジアルファ、ジベータ、またはα
/βグロビン様ポリペプチドからなるヘモグロビン様タ
ンパク質も「偽四量体」である。
れでも血流からクリヤ[clear]される。尤も正常ヘモ
グロビンの場合より緩慢であるが。
同であるか否かを判定するには、配列の類似性[sequen
ce similarity]が重要、しかし非必須的、な判断基準
となる。配列類似性は従来のアルゴリズムで判定され
る。すなわち典型的には最適合致を達成するために僅か
な数のギャップの導入を許容するものである。好ましく
は本発明のαグロビン様ポリペプチドまたはドメイン
は、野生型ヒトαグロビンと少なくとも約75%の配列同
一性をもつ。しかしこれより小さい配列同一性のポリペ
プチドも、もしそれがたまたま生起し得る配列同一性よ
り大きなものであって、αグロビンの特徴的な高次構造
ならびに類似する生物学的活性を有するものであるな
ら、なおαグロビンと「実質的に相同」と考えることが
できる。比較してみると、Artemiaのヘム結合ドメイン
は一次配列類似性は27%以下であるが、それらの保存さ
れた残基の周囲およびほかのヘモグロビンに保存されて
いる残基の周囲のヘム結合ドメインの整列[alignmen
t](すなわち、ヘムの接触及びらせんセグメント同士
の関係の決定に含まれる)は、Artemiaドメインがクラ
シカルなグロビンヘリックスA〜Hを対応するターンに
もっており、またその他の種々の保存されたグロビンフ
ァミリーの残基をももっていることを示唆しているの
で、ミオグロビンと相同と考えられる。また、セリンプ
ロテアーゼインヒビターには、30%という少ない配列類
似性しかないペア[pairs of members]のある相同と認
められるタンパク質のファミリーがある。
トヘモグロビンの突然変異体が知られている。これら突
然変異体の多くのものの酸素結合、その他ヘモグロビン
特性に及ぼす効果も知られている。ヒトαグロビン、β
グロビンは84カ所で相違する。さらにグロビン配列上の
種間に見られる異形[interspecies variations]につ
いても深く研究されている。Dickerson,Hemoglobin:Str
ucture,Function,Evolution and Pathology,ch.3(198
3)は1982年に次のように報告している。60種の知られ
ている脊椎動物のαグロビンは141カ所中23カ所で同じ
残基をもつが、66種の脊椎動物のβグロビンは146個の
アミノ酸の20個が同一であると。上記60種の脊椎動物の
ミオグロビンは、グロビンファミリーに属するが、153
カ所中27で不変のアミノ酸をもっていた。ここで哺乳類
だけについて考察すれば、不変のアミノ酸はαグロビン
につき50/141、βグロビンにつき51/146、ミオグロビン
につき71/153である。不変の箇所は分子の活性中心、つ
まりヘム凹部およびサブユニット同士の接触部、周りに
集中している。可変アミノ酸のうちのあるものは考察対
象の種の小さなフラクションだけがコンセンサス配列部
分から分岐するものとなっている。
ビンとの間の全体的相違数は、次の通りである。アカゲ
ザル(4)、ウシ(17)、カモノハシ(39)、ニワトリ
(35)、ヒトゼータ(胎児)(61)、コイ(71)、サメ
(88)。無脊椎動物グロビンについては分岐は海水ヤツ
メウサギ(113)、軟体動物(124)、Glycera(グリセ
ラ)(海アカミミズ)(124)、及び、Chironomus(キ
ロノマス)(ユスリカ)(131)。βグロビンファミリ
ーについてみると、その他の脊椎動物βグロビンからヒ
トβグロビンが違う点は、アカゲザル(8)、ヒトδグ
ロビン(10)、ウシβグロビン(25)、ウシγグロビン
(33)、ヒトγグロビン(39)、ヒトεグロビン(3
6)、カモノハシ(34)、ニワトリ(45)、サメ(9
6)、海水ヤツメウサギ(123)、軟体動物(127)、グ
リセラ(125)、及び、キロノマス(128)。
うのは可変アミノ酸[variable amino acids]は機能的
に同等な1アミノ酸を別のアミノ酸の「保存的交換」
[conservative substitutiosn]として発現するにすぎ
ないからである。「保守的交換」とはヘムを取り込みα
グロビンサブユニットとβグロビンサブユニットと関係
して、その定義された内容を維持しつつ可逆的に酸素と
結合する四量体(または偽四量体)ヘモグロビン様タン
パク質を形成する、グロビン様ポリペプチド(またはド
メイン)の能力を改廃しない交換をいう。次に挙げるよ
うなソースがこうした保守的交換(および削除と挿入)
を同定するのに使われる。
(100以上の突然変異体が存在) (b)脊椎動物、特に哺乳類、αグロビンおよびβグロ
ビンの配列上の種類[sequence variations]に関する
データ (c)脊椎動物、特に哺乳類、ミオグロビンの配列上の
種類に関するデータ (d)脊椎動物と無脊椎動物のグロビン間の配列上の種
類、または無脊椎動物グロビンの配列上の種類、に関す
るデータ (e)ヒトヘモグロビンならびにその他の酸素結合タン
パク質の三次構造に関するデータ、および同構造に及ぼ
す配列変化の効果を予測する分子モデルソフトウエア (f)相同タンパク質のファミリーの構成員間に見られ
るアミノ酸変化の頻度に関するデータ(グロビンファミ
リーに限定せずに)。例えばSchulz and Schirmer,Prin
ciples of Protein Structure(Springer−Verlag:197
9)Creighton,Proteins:Structure and Molecular Prop
erties(W.H.Freeman:1983)の表1−2参照。
ク質中の変更部位における耐性[tolerable]突然変異
を決定するのにきわめて有益であり、また同分子のその
他の類似部位における耐性突然変異を同定するのに有効
である。カテゴリー(f)のデータによれば、次の交換
群[exchange groups]が認められるが、その中でのア
ミノ酸の置換はしばしば保守的である。
Ser,Thr(Pro,Gly) II 負荷電した残基およびそれらのアミド−Asn,Asp,Gl
u,Gln III 正電荷の残基−His,Arg,Lys IV 大きな脂肪族の無極性残基−Met,Leu,Ile,Val(Cy
s) V 大きな芳香族残基−Phe,Tyr,Trp 3つの残基が括弧で括られているが、これはタンパク
質構造においてそれらには特殊な役割があるからであ
る。Glyは側鎖のない唯一の残基だからその鎖に対する
柔軟性[flexibility]を有する。Proは鎖をしっかりと
制約する普通にみられない幾何学的形を有している。Cy
sはタンパク質をして特定のおりたたみに保持するジス
ルフィド結合に参加することができる。SchulzとSchime
rが上記I、IIを合併したことに注意されたい。またTyr
は、水素結合の可能性を有しているから、Ser,Thrなど
と一種の親類関係[kinship]になっていることにも注
意されたい。
変異によってあまり影響を受けない、少なくともヘム凹
部またはサブユニット接触のいずれにも関係しなかった
ものは影響されていない。また、フリーのアミノ末端ま
たはカルボキシ末端は勿論、αヘリックスを接続する
「ループ」は、欠失や挿入により大きな耐性を有してい
る。
は、その動物にとって有意に抗原とならない[not sign
ificantly antigenic]ヘモグロビンを使うことが好ま
しい。しかしヘモグロビンの型[the type of hemoglob
in]は、そのようなヘモグロビンを動物に使わない場合
でも適切にその薬剤[the chemical]を安定化すること
ができるのであればそれほど問題でない。また厳密に要
求されるものではないが、そのヘモグロビンは酸素結合
能を保持していることが好ましい。
場は血液という形で現在、安い肥料として販売している
が、大量のヘモグロビンを供給する。もし動物の特定の
種あるいは品種が一定の用途に最適のヘモグロビンを提
供してくれるものであるなら、その目的でその特定の生
物を生育して必要な血液を得ることができる。ヒトの血
液銀行は一定の保存期間を経過した人血は捨て去ること
が義務付けられている。これもまた大量のヘモグロビン
供給源である。血液からヘモグロビンを分離する技術は
周知の通りである。どんな標準的技術でも使用可能であ
る。
ブユニットをコードする遺伝子をクローニングし、適当
な発現ベクターに入れ、そして微生物、動物、あるいは
植物、あるいはまた培養した動物や植物の細胞や組織の
ような有機体に挿入して得ることもできる。こうした有
機体は標準的組換えDNA技術で産生できる。Liebhaber
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77;7053−7058(1980)M
arottaら、Journal of Biological Chemistry,252;5040
−5053(1977)によりヒトαグロビン遺伝子およびβグ
ロビン遺伝子もクローニングされている。野生型および
突然変異α、βグロビンの各々を発現させる技術、また
機能を有するヘモグロビンにそれらを組込む[assembly
into]技術については、既述の関連文献中に記載され
ている。
1、α2)と二つのβグロビンサブユニット(β1、β
2)からなるヘテロ四量体[heterotetramer]である。
α1とα2、またはβ1とβ2間に配列上の相違はな
い。脱酸素した(「デオキシ」、または「tense」の
「T」)状態では、サブユニットは四面体を形成する。
α1β1およびα2、β2のインターフェイスは酸素結
合している間比較的固定されてはいるが、かなり流動的
である。酸素化(「オキシ」または「relaxed」の
「R」)状態では、サブユニット間の距離が増える。サ
ブユニットはファンデルワールス力、水素結合、デオキ
シHgbでは塩橋により非共有結合されている。ヘモグロ
ビンはα1β1およびα2、β2の二量体へ解離するこ
とが知られている。これらの二量体は腎臓の濾過作用に
より血流から除去される。ヘモグロビンの血管内保持
[intravascular retention]は、例えば一つの四量体
のサブユニット、または複数の四量体間のサブユニット
の化学的架橋で、改善されている。
有結合で結合したサブユニットが二つの酸素結合ドメイ
ンをもつ一つの偽二量体ポリペプチドで交換され[repl
aced]、直接または一つもしくは二つ以上のアミノ酸の
リンカーを介して結合されることにより、偽四量体ヘモ
グロビンを産生することができる。この偽二量体ポリペ
プチドは適当な融合遺伝子から発現することができる。
こうして二つのαグロビン遺伝子が一つの「ジアルファ
グロビン」遺伝子へ融合され、あるいは二つのβグロビ
ン遺伝子が一つの「ジベータグロビン」遺伝子へ融合さ
れ、あるいはαグロビン遺伝子とβグロビン遺伝子とが
一つの「αβ」グロビン偽二量体遺伝子に融合される。
所は、HOFFMAN 5Bに示されているように、両方の鎖では
なく一つの鎖を選択的に突然変異させることができるこ
とにある。これは、等モルの薬物とヘモグロビンが最終
製品に認められるように目的とする薬物にただ一つの付
加部位しか付与しないことを可能にする。
せる方法である。この方法は結合される薬品の一層多く
の量を安定化することができ、またおそらく結合された
薬物の放出速度に相違をもたせることができる。
る。これら技術のいずれかを本発明の薬物・ヘモグロビ
ン接合体のヘモグロビン成分の調製に使うことができ
る。かかる修飾の例は、米国特許第4,412,989号、第4,3
01,144号、第4,670,417号、第4,321,259号、第4,473,56
3号、第4,710,488号、第4,650,786号、第4,336,248号、
第4,598,064号、第4,600,531号及び第4,377,512号など
に見られる。半合成ヘモグロビンを合成する目的で、個
々のグロビン鎖が修飾形で再調製されている。(Luisi
ら、Nature、320;555−556(1986)Nagaiら、Nature、3
29;858−860(1987))グロビン鎖の重合、グリコシル
化、ペジレーション[pegylation]、リポソームまたは
細胞膜へのカプセル化のような他の修飾も考案されてい
る。
ロビンもまた簡単に修飾することができる。グロビン遺
伝子に部位特異的突然変異を起こす標準的技術を用いる
ことによって、得ようとするグロビン鎖中のアミノ酸を
加えたり、欠失したり、変更したり組合せたりすること
ができる。(Kruseら、Biotechniques、6;338−339(19
88)Zollerら、Methods in Enzymology、100;468−500
(1987)は最近例)。修飾された箇所を目的薬物の付着
部位とすることができる。そしてこれは薬物がヘモグロ
ビン分子に結合されるべき場所ならびに場所数を変える
ことになる。目的の薬物がそれ自身ポリペプチドである
場合は、それをグロビン鎖に付加して薬物・ヘモグロビ
ン接合体[conjugate]にしてもよい。
ット(ジアルファHgb)もしくはβサブユニット(ジベ
ータHgb)を遺伝子的に融合した突然変異ヘモグロビン
は、ハプトグロビン結合を抑制するから血管内保持を向
上することができる。おそらくはヘモグロビン四量体の
呼吸[breathing]により、ジアルファヘモグロビンは
なおハプトグロビン結合されているが、その速度は、血
流中に数時間残るジアルファHgbであるA0のそれよりず
っと遅い。薬物運搬をするのにヘモグロビンに対するハ
プトグロビン結合を嫌うときは、この技術を使うことが
できる。
グロビン自体の生物学的活性[biological activity]
を変更するために修飾することができる。米国特許第5,
028,588号は代用血液として酸素低親和性突然変異体を
使用することを開示している。かかる修飾分子を薬物に
結合させて、本発明の薬物・ヘモグロビン接合体を形成
することもできる。
ち、a)直接、間接に共有結合できること、b)水素結
合、ファンデルワールス力、または疎水性相互作用で直
接、間接に非共有結合できること、c)ヘモグロビンの
三次元ネットワークまたはそのヘモグロビンに関連ある
トラップ手段によって物理的にトラップできること、以
上。対合[coupling]は直接に行われても、あるいは薬
物とヘモグロビンの双方に関連あるリンカー部分もしく
は中間の結合分子によって間接に行われてもよい。
ビンに共有結合で付加される。この付加はヘモグロビン
の官能基とリガンドの官能基を直接に反応させるか、ま
たは同一官能基を有する[homofunctional]もしくは異
なる官能基を有する[heterofunctional]架橋剤ととも
にリガンドとヘモグロビンを同時的または順次的に反応
させることによって行う。もしリガンドまたはヘモグロ
ビンが所望の官能基を欠如しているときは、そのリガン
ドまたはヘモグロビンをデリビタイゼーション(誘導体
化)[derivitization]することによって行う。
ィド結合を形成することができるシステイン、および薬
物と反応してエステル、ペプチドその他の結合を形成す
ることができるアスパラギン酸やリジンのようなフリー
なカルボン酸またはアミン部分[amine moiety]をもつ
アミノ酸がある。
合を利用することは特に好ましい。ジスルフィド結合は
ヘモグロビンのシステイン残基のチオール側の基[thio
l side group]とリガンドのチオール基との間に形成す
ることができる。ジスルフィド結合の長所は、それが血
清に内因性の[endogenous]還元剤によって徐々に還元
されるから、リガンドされた薬物を血流中に緩慢に放出
することができることである。ジスルフィド結合形成の
ための試薬および条件は当業者によく知られていること
である。この目的で置換または挿入によってシステイン
をヘモグロビン中に導入することができる。
品放出速度はヘモグロビン鎖のどこにリンクされている
かにより左右される立体的因子[steric factor]およ
び電気的因子の双方の影響を受ける。薬品をより緩慢に
放出させるため、ジスルフィド結合の生化学的還元[re
duction]を阻害するように薬物のチオールをバルキー
な(かさのある)化学部分[bulky chemical moiety]
で囲む[flank]ことができる。例えばペプチド性薬物
の場合には、トリプトファンまたはβナフチルアラニン
のようなバルキーな残基の近傍に架橋可能なシステイン
をもたせてもよい。モノクローナル抗体とリシンA鎖間
のジスルフィド結合の半減期はマウスで6.7時間と測定
されている(Thorpeら、Cancer Research、48;6496(19
88))。しかし硫黄1個の次にα−メチル置換基[subs
tituent]が立体的に阻害されたジスルフィド結合を使
うときは、6.3倍長い半減期が認められた。同じ置換基
を本発明にも用いることができる。
のグロビン鎖の真ん中の二つの鎖の間の裂け目[creav
e]に部分的に隠すか、またはアスパラギン酸とかグル
タミン酸のような負荷電の残基によって包囲することに
よって負荷電の還元化合物を反発させることができる。
これら技術のすべては還元環境中でジスルフィド結合の
半減期を分子運動学的[kinetically]に引き延ばすた
め使用することができる。ヘモグロビンに鎖付加される
一定の薬品およびその薬品の所望の半減期が、どのよう
な組合せで使用するべきかを決定する。これは実験反復
して容易に得ることができる。
または酸化剤を架橋させることができる。もし還元剤を
架橋するなら、薬物放出の初期の速度は遅いであろう
が、還元剤が放出されてしまえばジスルフィド結合に攻
撃することによって薬物放出速度を加速することになろ
う。放出されてしまった酸化剤は逆の効果をもたらすで
あろう。
なるヘモグロビン分子にさまざまなアクセッシビリティ
(反応性)[accessibility]の薬物を異なる部位に攻
撃させることでも修飾することができる。
位は、リガンドがそこをより容易に攻撃できるようにヘ
モグロビン分子の外側にされている。付加されたリガン
ドは向上された半減期をもっており、ヘモグロビンに結
合しても活性を維持する。あるいはその薬品の分解を保
護すること、及び/又はその薬物に一層長い半減期をも
たらしめること、を望むときは、そのヘモグロビン分子
に対するアクセッシビリティが比較的小さい部位を使え
ばよい。
ク質中に導入するのには種々の部位を使うことができ
る。
異が機能に影響するものでないこと、(2)側鎖がオキ
シまたはデオキシ構造で水にアクセッシブルであるこ
と、(3)その部位がたたまれた[folded]タンパク質
の表面に存在すること、(4)側鎖のスルフヒドリルが
分子の内部に向かってよりも表面から離れるように外方
に伸びていること、(5)その部位がR→T遷移[R→
T transition]に直接関与しない分子の部分中にあるこ
と、(6)その変化が強固に固定される箇所をもたない
分子部分にあること(かかる領域は一般に判然としない
X線回折パターンを示す)、(7)その突然変異が局部
的二次構造を破壊するものでないこと、つまりフォール
ディング[refolding]の問題を引き起こすおそれがあ
るpro→cysの突然変異を回避するものであること、
(8)もし可能ならser→cysまたはala→cysのような保
守的変化であること、以上である。突然変異は必ずしも
上述のこと全てを満足するものでなくてもよい。例えば
R→T遷移(上記5参照)に関与する部位を予想して
も、P50(上記1参照)の有利な変化を重視することも
ある。最も重要な点はその突然変異が、架橋形成の前後
を問わず酸素結合性を改廃するものでないこと、また、
システインが所望の架橋反応に参加できるだけのアクセ
ッシビリティを有することである。
変異体は多数存在する。次の通りである。
ヘモグロビン偽四量体の機能に重要な影響を与えるよう
なものではないと考えられている。システイン突然変異
はαヘリックスを有意に不安定化する[destabilize]
ものとは考えられておらず、また表面残基はヘモグロビ
ンの酸素結合特性に直接関与しないと考えられている。
ほとんどの表面残基はかなりな運動[motion]にさらさ
れるのでしっかりと束縛されない。またタンパク質の呼
吸運動があるため、システインの側鎖は必ずしもジスル
フィド結合形成にアクセッシブルなように溶液中に直接
向くようにしなければならないものでもない。
おいて、ジスルフィド結合はグルタチオンのような内因
性[endogenous]チオールによって還元される。これら
反応のメカニズムは実際の還元種のようなチオレートの
陰イオン[the thiolate anion]に関係している(Crei
ghton,T.E.(1978)Prog.Biophys.Molec.Biol.、33:259
−260;Creighton,T.E.(1975)J.Mol.Biol.、96:767;Cr
eighton,T.E.(1977)J.Mol.Biol.、113:313)。このよ
うに還元速度はジスルフィド結合近傍分子の静電気環境
の関数であろう。ジスルフィドが負の静電気環境中に存
在するときは、チオレート陰イオンの反発があるため、
還元速度はより遅くなると予想される。グルタチオンの
場合には、もっと無反応な中間的なプロトン化された分
子種[the unreactive transient protonated spies]
がネットの負電荷をもち反発されるので、ジスルフィド
還元速度を一層遅らせるであろう。
ルファまたはジベータヘモグロビンの表面のまたは表面
に近いアミノ酸残基は1つのシステイン突然変異の場所
としてよい選択である。そのような2つのシステイン間
の最初のジスルフィド結合の形成も、システイン周辺の
2つのヘモグロビン分子の負電荷間における反発のた
め、遅いのであるが、その反応はインビトロ形成反応中
の高い濃度の塩または高いpHの使用で促進することがで
きる。デオキシ条件下でレドックス緩衝液中で行なわれ
れば、その反応は温度上昇につれて促進されるであろ
う。
は正常酸素親和性を有する。
への変異は知られている有害特性を何ももっていない。
は正常酸素親和性をもっている。
は知られている有害特性を何ももっていない。
は知られている有害特性を何ももっていない。
システインヘモグロビン突然変異体も関心のあるもの
で、部位特異的突然変異(形成)によって調製される。
得られた突然変異凹部システインは薬物にジスルフィド
結合される。凹部壁は血清還元剤による薬物−ヘモグロ
ビンジスルフィド結合に対しての攻撃を立体的に[ster
ically]阻害する。
る。この構造中では凹部の底および側部(αleu34、α4
0lys、β132lys、またはα37proのように、いずれもcys
に突然変異させる)の残基の置換が付加部位をデオキシ
構造から非常に遅い放出にする。例えばデオキシ構造の
表面は、α34leu→cys突然変異がデオキシA0中の裂目
[a cleft]に深く埋め込まれたジスルフィドを形成す
ることを暗示している。(αlys139がハプトグロビン結
合に関与していることが示唆されるが(J.Biol.Chem.25
4.7265,1969)、それはまた裂目中に僅かながら入って
いる。
浅く、ペプチドまたは薬物をオキシヘモグロビンに結び
付けている[anchoring]ジスルフィド結合が還元体に
よりよくアクセッシブルであることを示唆している。こ
のようにデオキシヘモグロビンの凹部システインに結合
した薬物の放出速度はその構造がデオキシ状態にある時
間割合によってコントロールすることができるもので、
ヘモグロビンのP50の関数となっている。
[the hole]である。この穴中の各残基のシステインへ
の突然変異は、その突然変異体へのペプチドまたは薬物
−ジスルフィド結合の還元による放出速度を著しく遅く
する。かかる付加部位はここに付加されたペプチドが攻
撃を受けたときタンパク質加水分解ら保護され易くする
というもう一つの利点をもつ。かかる突然変異の部位と
してはαlys99、thr134、およびβarg104、his143、lys
82、そしてans139などがある。これらの突然変異は一つ
以上のペプチドをそのヘモグロビンに付加するために組
合わすことができる。
ペプチドに一つまたは二つ以上の付加電部分を追加する
ことによって安定化させられ得る。N−またはC−末端
Cysをもち最初の三つまたは四つのアミノ酸中にかさ高
な残基のない線状[linear]ペプチドが、この穴に適合
する可能性が最も高いものである。
はシステイン突然変異体に酸素低親和性(高P50)突然
変異を導入することによって安定化することができる。
その結果得られるヘモグロビンの親和性が低ければ低い
ほど、薬物の放出速度は遅くなる。このメカニズムは肺
の血管系のような高い酸素分圧の組織における薬物放出
速度をより選択的にできるようにする。
しては、例えば、Presbyterian突然変異(純ヘモグロビ
ンのP50の測定値は35mmHg)、β67val→ile(24.7mmHg
のP50)、ヘモグロビンKansas(約20mmHgaのP50)、ヘ
モグロビンJ−Cairo(15mmHgaのP50)、ヘモグロビンT
itusville(P50=16mmHga)、ヘモグロビンBeth Israel
(全血=88mmHgaのP50)がある。これらの突然変異の組
合せも低い酸素親和性の突然変異体も産生するものと考
えられる。((注)aの記号が付いている箇所について
は次を参照せよ。Bunn and Forget、Hemoglobin:Molecu
lar,Genetic and Clinical Aspects、1986.Philadelphi
a:W.B.Saunders,p.615) 非常に低い酸素親和性のあるヘモグロビンを形成する
別の方法としては、ヘモグロビンのR状態からT状態へ
の遷移に移行するサブユニットインターフェイスを結ぶ
ジスルフィド結合を挿入することがある。α1−β2イ
ンターフェイスを結ぶT状態において形成されるジスル
フィドはそのT(デオキシ)状態を安定化し、こうして
タンパク質のP50を減少させる。かかるジスルフィド結
合の1例は、デオキシ構造を調べて分かったのだが、α
96val→cysおよびβ101glu→cysの突然変異がもたらさ
れる。
する他の例が得られた。(7.4Å以下のCα−Cα距
離、3.3〜4.6ÅのCβ−Cβ距離、Cα2、Cβ2およ
びCβ1間の角度とCα1、Cβ1およびCβ2間の角
度は53〜180度、であることが下に示されている.(Bal
ajiら、Biochem.Biophys.Res.Comm.160,109−114,198
9)。これらには次のものがある。β37trp→cysおよび
α92arg→cys;βarg40→cysおよびαarg92→cysおよび
βhis97→cysおよびαthr41→cys.T状態の最大安定性を
得るため、これらの突然変異をβおよびαの両ドメイン
中に導入させなければならない。もしこれらのジスルフ
ィド結合が形成されたら、その構造はデオキシ構造に固
定される。得られるP50はおそらく非常に高いものとな
ろう(100mmHg以上)。
ビン結合を阻止する位置にある分子の表面に存在するジ
スルフィド結合を形成するシステインも可能である。分
子グラフックスは所望の薬品に結合される組換えヘモグ
ロビンがハプトグロビン結合を防止するには、lys90ま
たはala82のようなαlys139周りの残基がシステインへ
の突然変異にとって都合のよい候補であることを示唆し
ている。システインに突然変異されるのに好ましい残基
としては、α1、6、74、85、89、93、118、120〜12
7、138〜141、およびβ2、11〜25、31〜40、そして131
〜146がある。最初と最後の二領域はβ鎖の表面上もし
くは表面近傍にある。これらのヘモグロビンはハプトグ
ロビン結合の初速度[initialrate]抑制を目的とし
て、薬物運搬のためペプチドを付加することによってハ
プトグロビンの蛍光消光[fluorescence quenching]を
観察してチェックすることができる(HwangとGreer,J.B
iol.Chem.254,2265,(1979)) ヘモグロビンとの架橋のためのリガンドの誘導体化:
結合されるべきリガンドが自然状態でフリーなスルフヒ
ドリル基もしくは類似の付加部分[attachment moiet
y]をもたないものであるときは、リガンドはそのよう
な部分に付けられるように修飾される。安定化されるべ
き薬物がポリペプチド性薬物の場合を例に述べると、ア
ミノ末端、カルボキシ末端、またはシステイン内部の付
加は固相ペプチド(Merrifield)合成によって容易に行
うことができる。また標的リガンドがあまり長くないと
きとか担体のヘモグロビンから何らかの方法で分離され
ていなければならないときは、適した結合アミノ酸がそ
の付加部位に付けられる。例えばポリプロリンリンカー
がヘモグロビンとポリペプチド間のジスルフィド結合の
後に設計することができる。アミノ酸リンカーテイル
[linker tails]の付加は内因性プロテアーゼ分解に対
する感受性を減少させてポリペプチド性薬物の安定性を
向上させるであろう。D−アミノ酸鎖またはポリプロリ
ン鎖のような適切な「二次リンカー」が考えられる。
な薬物の作用[function]である。
のCysとヘモグロビンのCysとの間にジスルフィド結合を
形成する。
ば下記方法のいずれかを使って薬物中にシステインを導
入する。(a)薬物のN−末端またはC−末端にCysを
付ける(グリシンスペーサーを一つまたは二つ以上使う
か使わないで);(b)薬物ペプチド配列の重要でない
残基をcysで交換する;(C)cysをペプチドのlys−ε
−NH2基から離れた分岐として付加する。導入されたCys
をヘモグロビンCysにジスルフィド結合する。
法で行うことができる。即ち(a)N−またはC−末端
にcys(Npys)を付加するか、あるいは環中のあまり重
要でない残基をCysと交換する; または(b)還元不能な環を構築しN−末端またはC
−末端にcysを入れるか、環中であまり重要でないアミ
ノ酸を交換する。この場合には還元可能なジスルフィド
(−S−S−)結合が、例えば(1)チオエーテル(−
S−)、(2)ラクタム((K)−NHCO−(D))また
は(3)メチレン(−(CH2)m)構造で交換される。
ているときは、これはヘモグロビンシステインのチオー
ルと反応するであろう。もし反応しなかったら、その薬
物はフリーなチオールを有するように合成して修飾され
なければならない。チオール基でヒドリル基を交換する
ことも可能であるし、薬物にチオールのある部分を付加
することも好ましい。
されていない薬物の生物学的作用を保持するように架橋
が選択されることが望ましい。薬物は一旦放出されるよ
うになれば活性である限り、ヘモグロビンに結合させら
れているときも活性であることが要求されるものではな
い。
チドを遊離させる[liberate]ように作用するから、ま
た外因性の[exogeneous]還元剤は半減期を調節するよ
うに同時投与することができるから、ジスルフィド結合
が好ましいのであるが、不安定な結合または可逆的会合
[association]も使うことができる。直接合成によっ
て得たハロアセチル−ペプチドまたはハロアセチル−化
合物でシステインをアルキル化することにより、ペプチ
ドおよびその他の有機化合物をヘモグロビンに付加する
ことができる。二官能的架橋も薬品をヘモグロビン鎖に
結合するのに使うことができる。さらに別の例は酸性ま
たはアルカリ性の環境下で開裂されるエステル結合に関
する。所望の薬品を放出できるようにするため、血清プ
ロテアーゼのため一定のプロテアーゼ開裂部位をリンカ
ーとして使うことができる。周囲の微環境は部位特異的
な突然変異生成または化学的修飾によって所望の放出速
度を得るように修飾される。
ゴペプチドであるときは、融合タンパク質の形でリガン
ド−ヘモグロビン接合体[conjugate]を産生すること
ができる。そこではリガンドはα及び/又はβグロビン
鎖中にその新しいドメインとして組み込まれる。リガン
ドはヘリックス間ループ[interhelix loop]に挿入さ
れるか、グロビンD−ヘリックスのような非必須的構造
[a non−essential structure]を交換するものでもよ
い。このリガンドはグリシンのような一つまたは二つ以
上のアミノ酸のペプチドリンカーでキメラグロビン鎖の
残部に付けることもできる。
ロビンは非共有結合的に付加される。付加は、リガンド
を分子に付加し、その分子はヘモグロビン中に吸収され
るというように間接的に行われる。例えば薬物を抗ヘモ
グロビン抗体に結合し(共有結合または非共有結合的
に)、後者を非共有結合的にそのヘモグロビン分子に結
合させることができる。アビジン/ビオチン結合もそれ
ら二つのうちの一つをヘモグロビンへ、他の一つをリガ
ンドへ結合するために使うことができる。またその薬物
をヘモグロビンに自然に結合するハプトグロビンに結合
させることもできる。結合部位のあるハプトグロビンの
フラグメントも付加部位として利用できる。こうした会
合[associations]は薬品使用の場でなされず予め行わ
れているのが好ましいが、その場で行うことでもよい。
モグロビンをリガンドに会合させる疎水力によって、形
成してもよい。例えば部位特異的突然変異生成を使って
多数の疎水性アミノ酸を互いに近づけさせ所望の薬品の
疎水部分の付着[attachment]を促すようにしてもよ
い。ここで相互に近づけるとはアミノ酸が鎖中で近接し
ていることを意味するものではなく、二次構造、三次構
造、または四次構造により分子全体が二つの別々のアミ
ノ酸を近くに配置している状態を言う。
間作用することを望む薬物、例えばペプチドTのような
ものにつき、少なくとも数日である。しかし薬物のより
短期間での運搬が望まれるときは、例えば組織プラスミ
ノーゲン活性化因子のような、ヘモグロビン運搬ベヒク
ルは別のものを選択するのがよいであろう。そこで薬物
の有効濃度を引き延ばすため各々別々の半減期をもつ二
つの異なるタイプの結合または異なるヘモグロビン担体
を使うことが好ましい。これは2回の投与、二つの異な
るヘモグロビン安定剤か、または所望の薬品を付加させ
るための部位が複数の非同一なものである1つのヘモグ
ロビン担体の1回の投与を含む。安定化組成物は一つま
たは二つ以上の追加的薬品を包含していてもよい。
疾病の予防処置および治療のための薬剤学上の組成物な
らびに調合物を提供するものである。本発明の組成物は
必要に応じて哺乳類を処置するのに使う従来の固形また
は液体薬品調合剤(例えば錠剤、カプセル、注射液また
は経口投与溶液)中に組み込むことができる。本発明の
薬剤学的調合剤は、有効成分単独または他の活性剤もし
くは不活性剤と組合せられた、本発明の薬物・ヘモグロ
ビン接合体の有効量を含む。例えば非経口的治療組成物
は0.1%〜90%の薬物−ヘモグロビン接合体を含有する
滅菌等張食塩水溶液としてなる。人に投与される薬剤学
的量は、薬物−ヘモグロビン接合体の0.001マイクロモ
ラー〜1ミリモラーの血液濃度となるに十分なものであ
る。個々の服用量中に含まれる実際の成分の単位内容
[unit content]は、それ自体で有効量をなすものであ
る必要はない。必要な有効量は複数の錠剤、カプセルな
どの投与によって達成することができる。
剤、賦形剤、塩、その他の当業者に知られた物質、など
の不活性成分を追加含有していてもよくそのどれを選択
するかは利用される用量[dosage]次第で違ってくる。
収[transdermal adsorption]、粘膜経由吸収、または
注射など従来ある手段で供給される。非経口投与が好ま
しく、特に静脈内または動脈内投与がよい。
影剤の担体として使うことである。この診断薬は放射性
造影診断用として放射性であってもよい。合成中に、あ
るいは別途後でヘモグロビンに結合させて放射性原子含
有の分子(99mTe,55Feなど)をヘモグロビンに組み込み
ことができる。テクネチウム−99mは、短い半減期と検
知容易な信号のため今日よく使われている放射性剤であ
るが、本発明にとっても好ましい実施例である。磁気共
鳴映像を行うについては何らかの常磁性エレメントがヘ
モグロビン担体のラベル標識として有用である。媒体と
しての血液の特性があるため、プロトンはラベルとして
好ましくない。もし不十分な造影剤がヘモグロビン担体
に付着することがあれば、ジエチレントリアミノペンタ
酢酸のようなキレート化剤をNMR応答造影剤をヘモグロ
ビンに化学結合するのに使うことができる。陽電子放出
断層撮影法のために炭素−11その他の適当な原子をヘモ
グロビン鎖中に、それの合成中に直接組み込むか、また
は適当な薬品をヘモグロビンに結合することができる。
本発明の造影剤はどんな組織の視覚化でも、例えば腫
瘍、血管開通、動的な心筋あるいは脳スキャニングの静
電気的映像化に使うことができる。過去に使われたこと
がある担体とは異なりヘモグロビンは血流中に自然に保
持されるから、鮮明な映像をもたらすことができる。
点で公知の知識を用いて容易に改変しあるいは直接採用
してさまざまに応用することができるから、かかる採用
および改変は本発明の要旨から離れることなく開示され
た本発明の実施例と均等なものであると解釈されるべき
である。またここに用いた用語は発明を説明するための
ものであって発明の範囲を制限するためのものではない
ことも了解されたい。
こに組み込むものとする。
分)、しかし強力な血管収縮ペプチドである。このペプ
チドの治療適用はそのインビボ短半減期のためこれまで
開発されたことはない。尤もこのペプチドの臨床使用は
現在の治療法より有意な長所があるのである。例えば一
般に使われている血管収縮薬のエピネフリンは全身血圧
および心拍数の双方に作用するので、マイナスの副作用
を誘発することがある。しかしアンギオテンシンIIはヴ
ェーサルトーン(血管音)[vasal tone]にしか作用せ
ず、したがって心拍増加の付加的な負担をかけずに血圧
だけを増やさなければならないような事情のときに利用
することができる。
IHPF−COO−)である。最初の関心はヘモグロビンの運
搬にとっても適している適切な効果がある類似体の合成
であった。標準的boc−ベンジル工程を使い、C4逆相ク
ロマトグラフィで精製して、八つの異なるペプチドが合
成された。N−末端、C−末端またはペプチドの本体
[body]につきさまざまな修飾が施されシステイン残基
の付加が及ぼす薬効上の効果を判定しようと試みられ
た。選択した類似体の中にはアミノ末端がN−アセチル
システインを付加(チオール結合するため)することで
修飾し、続いてグリシンを(生の薬物部分により柔軟な
結合を与えるため)付加した。さらに、アンギオテンシ
ンIIの二次受容体によるクリアランスを避けるためArg2
→Lysの突然変異を生の薬物部分に生起させた。用量反
応(ドーズ・レスポンス)曲線がラットで各類似体につ
き集められた。選択した類似体は血管収縮効果につき10
倍だけしか減少を示さず、したがって将来使用ができ
る。
グロビン突然変異体(αD75C)SGE1.1が発現され当業者
に知られている技術で精製された。SGE1.1はジアルファ
グロビン(正常αグロビンにグリシンで付加されたdes
−Val−αグロビン)と、Presbyterian(β108Asn→Ly
s)突然変異のある二つのβグロビンからなる。突然変
異D75C(つまり表面アスパラギン酸のシステインへの)
は目的のペプチドとのジスルフィド結合を形成すること
ができた。その突然変異の周りの領域は電気的に中性
で、立体的に開放領域であり、したがって比較的内因性
の血清還元剤による攻撃に敏感であろう。一つのアンギ
オテンシンII分子が各ヘモグロビン分子に結合[coupl
e]され(1ペプチド性薬物:1偽四量体)、半減期デー
タをラットにつき集めた。ヘモグロビン−類似体接合体
はフリーの類似体より有意に向上した半減期をもってい
た(ラットで測定した場合、類似体+接合体の全身運搬
時間は約60分:フリーのアンギオテンシンII類似体では
1.25分)。さらに、類似体−接合体反応(例えば、血圧
のベースラインレベルまでの戻り)の消滅[decay]後
に還元剤ジチオスライトールを投与すると、血圧上昇お
よびさらに引き延ばされた放出が認められた。これはペ
プチド−ヘモグロビンジスルフィド結合の還元[reduct
ion]が担体からの薬物の放出メカニズムであることを
示唆している。すべてのデータは速成耐性[tachyphyla
xis]及び/又は徐脈[bradycardia]を避けるためアト
ロピンの共存投与をして集めたことを申し添える。
体につき行った。ここで選択したヘモグロビンは別の表
面α鎖突然変異体、αLys16Cysである。例1に記載のヘ
モグロビン突然変異体とは違ってシステインに交換され
るリジンはオキシ構造のカルボキシレート[carboxylat
e]から3.56Å離れて位置し、デオキシ構造では3.8Å離
れて位置していて、Cysを負電荷環境下にした。このヘ
モグロビン−類似体接合体の半減期は、上記例1のもの
が60分であったのに対し、200分であった。しかも大量
のジチオスライトールを投与しても有意に向上した、つ
まり引き延ばされた運搬とならなった。したがって類似
体とヘモグロビンα鎖間のジスルフィド結合の局部にお
ける電荷環境は内因性血清還元剤の攻撃を抑制したもの
と考えられる。
(ANF)の環状類似体を調製して、システインに交換し
たヘモグロビンに接合した。ラットANFは配列のある28
量体[28mer]ペプチドホルモンである。心房拡張のと
きの増加に応答して心臓中の心房細胞によりANFが放出
される。そのNa利尿効果および利尿効果[diuretic eff
ect]により血液中の電解質バランスを統制し、平滑筋
を弛緩させる。カスクラチャー[casclature]では、こ
れは血管の弛緩および血圧上昇につながる。フリーANF
の血清半減期は1〜2分であるから、心房ペプチダーゼ
によって腎臓細管の不活性フラグメント中へ、またクリ
アランス受容体との結合によって、ホルモンの開裂[cr
eavage]で調節される[mediate]。フリー類似体も同
様な血清半減期をもつ。
(ANF')の配列は次の通りである。
リンクされている。ANF'のアンダーラインされた(K)
のリジンと(D)のアスパラギン酸はラクタム(−NHC
(=O)−)結合でリンクされている。ANF'のシステイ
ンはN−アセチル基とニトロピリジンスルフェニル基を
もつように修飾されている。野生型ANFから取り除かれ
た残基はその活性に必須のものではなく、その除去は合
成を簡素化する。N−末端システインはもちろんヘモグ
ロビンとの架橋に用いられる。ラクタム環はもとのジス
ルフィド結合を置き換えたが、これは架橋や放出には関
与しない。挿入されたグリシンはプロテアーゼ耐性を増
すためである。
から始まった。システインは既に付加されているNPys基
で付加された。システインチオールはbocで保護され、
セリンヒドロキシルは−O−ベンジルで、リジンのεア
ミノ基はFMOCで、アルギニンはtos(トルエンスルホニ
ル)で、一番目のアスパラギン酸は、シクロメチルエス
テルで、第二のアスパラギン酸はフルオレニルメチルエ
ステルで、各々保護された。Lys−4とAsp−14を選択的
に脱保護するのにはピリジンを使った。その側鎖を、HB
TU{2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−y1)−1,1,3,
3−テトラメチルウロニウムヘクサフルオロホスフェー
ト}およびDMFに溶かしたヒドロキシベンゾトリアゾー
ルを3回加えて環化した。N末端boc基を除去するには
トリフルオロ酢酸を使い、システインを無水酢酸でN−
アセチル化した[N−acetylated]。ペプチドをHFでリ
ジンから切断した。なお、このHFはNPysを除き全ての保
護基を除去した。当該類似体をC−4逆相HPLCで精製
し、2:1のペプチド:Hb中にSGE1.1のD&%C突然変異体
を2時間混合撹拌し類似体をSGE1.1のD&%C突然変異
体に付加し、GFCで本件接合体を単離した。
結合し、接合体(119mgのD75C突然変異体と、2.9mgのAN
F類似体;Hgbの1モル当たり0.78モルのANF類似体)をオ
ス250gラットに投与すると(徐脈を予防するためアトロ
ピンの継続的注入をしながら)、最初に明確になったの
は約30分後であったが、平均全身血圧は約100分間に亙
って徐々に降下した(最大減少量=32mmHg)。
Claims (8)
- 【請求項1】(a)アルブミン以外の所望の薬物、およ
び(b)ヘモグロビン様タンパク質を含む複合体であっ
て、前記複合体は生理学的条件下で、前記薬物を治療上
活性な形態で放出することができる複合体。 - 【請求項2】前記薬物がペプチド性薬物である請求項1
記載の複合体。 - 【請求項3】前記薬物が非ペプチド性薬物である請求項
1記載の複合体。 - 【請求項4】(a)アルブミン以外の所望のペプチド性
薬物、および(b)ヘモグロビン様タンパク質を含む複
合体であって、前記複合体は、ヘモグロビン様タンパク
質のグロビン様ドメインと結合したペプチド性薬物から
実質的に成る融合タンパク質を含むことを特徴とする複
合体。 - 【請求項5】前記ペプチド性薬物は、グロビン様ドメイ
ンのらせんループ中に挿入されていることを特徴とする
請求項4記載の複合体。 - 【請求項6】前記ヘモグロビン様タンパク質は、二又は
それ以上のグロビン様ドメインを有する偽オリゴマーを
含むことを特徴とする請求項1〜5の何れか−項に記載
の複合体。 - 【請求項7】前記ヘモグロビン様タンパク質は正常ヒト
ヘモグロビンAoに比べて、αまたはβグロビン様サブユ
ニットにおいて一または二以上の突然変異を含み、前記
突然変異は、(a)非システイン残基から架橋できるシ
ステイン残基への置換、(b)ヘモグロビン様タンパク
質の酸素親和性を増加させる突然変異、および、(c)
ヘモグロビン様タンパク質の酸素親和性を減少させる突
然変異から成る群から選択されるものであることを特徴
とする請求項1〜6の何れか一項に記載の複合体。 - 【請求項8】請求項1〜7の何れか一項に記載の複合体
を含むヒトの疾病または疾患の治療に用いる組成物。
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