JP3426599B2 - 薬物担体としてのヘモグロビン - Google Patents

薬物担体としてのヘモグロビン

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願の説明 Hoffman and Nagai,07/194,338、1988年5月10日出
願、現在米国特許第5,028,588号、Somatogen,Inc.所有
の特許発明は代用血液としての酸素親和性突然変異ヘモ
グロビン、ならびにα、βグロビン非赤芽細胞[nonery
throid cell]の発現に関する。HoffmanとNagai,1989年
12月1日出願、米国特許出願第07/443950号は、ある種
のジシステインが付加されたヘモグロビン突然変異体に
ついて開示する。これは出願第07/194338号の一部継続
出願である。Hoffmanらの、米国特許出願第07/671,707
号、1990年5月10日出願は、酵母におけるヘモグロビン
の発現、αグロビン、βグロビンのポリシストロニック
同時発現、生物学に活性な四量体ヘモグロビンのインビ
ボ会合[assembly]、ジアルファグロビンおよびジベー
タグロビンの偽二量体の産生と増大された血管内保持力
のある偽四量体ヘモグロビンの会合におけるそれら偽二
量体の使用法について記載している。Hoffmanらの、199
1年11月8日出願の「ヘモグロビン及びその類似体の産
生ならびに使用法」と題する米国特許出願第07/789179
号、Atty.Docket No.HOFFMAN5B−USAは、第07/671707号
の一部継続出願であるが、ヘモグロビンのモノシステイ
ン突然変異体ならびに八量体その他の偽二量体などを利
用して構築した多量体ヘモグロビンの産生ならびに使用
法について記載している。上記した出願に言及して本明
細書中に取り込むものとする。
発明の背景 発明の分野 本発明は血液中に薬物を制御して放出することに関す
る。
従来技術 多くの薬剤[pharmaceuticals]は腎臓のクリアラン
ス、あるいは急速な代謝にため血流中にあって比較的短
い半減期しかもたない。このことは特に、約50,000〜7
0,000ダルトンという腎臓濾過限界より小さなポリペプ
チド型薬剤にについて真実である。最近では多くの製薬
会社や研究所などが人体中における薬効期間を延ばすこ
とを目的に膨大な時間と経費を投入している。患者が薬
物をより少なくしか取らないことには非常に多くのメリ
ットがある。例えば、よりよい服従性[compliance]、
人体中濃度の予測可能性、投与直後の急激な薬物投与か
ら受ける副作用のすくないことなのである。特に予防薬
的に、あるいは長期間に亙って投与されるようなものに
あっては、薬物治療はもし少なくて済むものなら、患者
にとって容易に受け入れられるものとなる。
非経口投与される薬物治療にとって、あらゆる注射は
感染の危険や一種の苦痛を伴うものである。多くの患者
が種々の薬物を継続的または頻繁に注射される必要があ
るためだけで入院させられている現状もある。もし薬物
投与がこれまでより少ない回数で済むなら、治療費の一
部は不要となろう。
人体からの薬物の急激な消失の問題を克服するため、
患者がより長い時間服用効果を享受することができるよ
うに1回に非常に多量の服用量を投与することがある。
しかしそのような多量の服用量はより明確な有害効果を
もたらす場合がある。
あるいは遅溶出性または難分解性の助剤を薬物に交ぜ
混ませることもある。梅毒感染や連鎖球菌感染の処置
に、あるいはリウマチ熱の予防処置として、アンモニウ
ムステラート[ammonium sterate]中に入れた少量ドー
ズの[low−dose]ペニシリンを使うことはその1例で
ある。ワクチンの効力を高めるためにフロイントアジュ
バントを使うことも1例である。N−(2−ヒドロキシ
プロピル)メタクリルアミドコポリマーのようなポリマ
ーも候補に挙げられている(Seymourら、British Journ
al of Cancer、63(6):859−66(1991)))。薬物と
担体[carrier]とのゆるいイオン−イオン結合を薬剤
の遅放出に利用することが米国特許第4374932号に記載
されている。薬剤のあるもの、例えば避妊剤[contrace
ptives]などは、何カ月、何年というような長期間に亙
る非常に緩慢な放出をさせるため、担体に強固に結合さ
れている。同期間に毎日ピルを取り続けるよりも患者は
楽なのでこのようなものの方が喜ばれる。そのほか遅効
性にする手段はインシュリンポンプ[insulin pump]で
ある。
臨床医は、主要成分である薬物の排出速度もしくは代
謝速度を遅らせるだけの目的で、別の薬物を同時に投与
するまでしてみて長期的投薬の正しいことを確認してい
る。人体中の高ドーズ[high−dose]のペニシリンその
他の類似の化合物の半減期を延ばすという唯一の目的
で、プロベネシドを投与することが、ここ数十年、淋疾
その他の疾病の標準的処置であった。
薬効増強を目的に薬学者[medicinal chemists]が化
合物構造を改変する研究をしてきたように、薬理学者は
人体における化合物の滞留(レジデンシー)[residenc
y]を増強させるため改変を研究している。この古い例
はよく知られた薬剤のアセチルサリチル酸(アスピリ
ン)で、これはサリチル酸の誘導体より長い半減期をも
つ。薬物がある特定の血清タンパク質にもっと容易に結
合するように、そしてそれによって人体中で半減期を延
ばすように、薬物設計することも研究の1法である。し
かし薬剤の全部が簡単に改変できるようなものではな
く、臨床医は単純な薬物改変だけで実現可能なものより
高い滞留時間を達成することを望んでいるのである。
ポリペプチドの薬剤は特別な問題を投げかけている。
代謝ならびに腎臓クリアランスという従来の化学的薬物
に認められる問題に加えて、種々の体液はカルボキシ−
およびアミノ−ペプチダーゼは勿論、血清ジペプチジル
ペプチダーゼIVのようなエンドペプチダーゼを含有して
いる。これら体液は多くの治療薬ペプチドを急速に劣化
することができるもので、これらペプチドの多くはフリ
ーペプチド[free peptide]での半減期(T1/2)は分
単位である。肝臓による取り込み[uptke by the live
r]および親油性[lipophilicity]はポリペプチドをそ
の作用部位から除去するように作用する。(Brogerら、
Regulatory Peptides、Supplemen 4:8(1985)) ポリペプチド薬物を誘導体化[derivatize]すれば分
解速度を減速することができよう。例えばN−アシル化
はアミノペプチダーゼの作用を阻止し得るものであり、
多くのカルボキシ末端の修飾がカルボキシペプチダーゼ
を制限することを目的に提案されてきた。さらにアミノ
酸の種々の類似体を使用すること、異常な側鎖部分のあ
るものや非ペプチド結合のもの、あるいはD−アミノ酸
の類似体が、プロテオリシス(タンパク分解)を抑制す
るものとして提案されている。
生命体と両立性の[biocompatable]緩慢放出性[slo
w release]ポリマーを、ある一定期間ペプチド放出さ
せるのに使うことができる。注射可能なポリ−(D,L)
乳酸/グリコール酸のコポリマーマイクロスフェア(小
球)[microspheres]が経口投与の場合の緩慢なポリペ
プチド放出に使われている。ポリエチレングリコールお
よび多糖のマトリックスも同様な理由で使われている
(Hilbert,Trends in Biotechnology,9(1):11−17
(1991)および欧州特許出願第381719号)。外科的に埋
め込まれたポリ無水物[polianhydride]のディスクま
たは「半球体」[hemispheres]が、100日間を超える期
間に亙って大きなタンパク質を緩慢に放出させるのに使
われている。舌下、口内吸収、および粘液による表面デ
リバリー[surface delivery]のような他の薬物運搬法
(ドラッグデリバリー)も多くの可能性ある薬剤を使っ
て試みられたが、緩慢放出効果はなお不十分であった。
生物学的に活性なポリペプチドは、欧州特許出願第41
3622号及びRettenmaierら、Gynecol.Oncol.,27(1):3
4−43(1987)に記載されているように、開裂不可の[n
on−cleavable]リンカーを介してアルブミンに化学的
に結合することができる。エリスロポエイチンのような
生物学的に活性な物質がアルブミン上に吸収させられた
りアルブミンと複合体を作ったりしている(米国特許第
4,879,272号及び第3,980,764号)。その他多数のポリペ
プチドやタンパク質が薬物運搬系(ドラッグデリバリー
システム)として提案されてきた。例えばフィブロネク
チンの一部分(日本特許第3123799号及び第1261398号、
1991年5月27日、1989年10月18日)、膜タンパク質(ド
イツ特許第3938953号)、エラスターゼの組換え部分(W
olfsonら、Protein Engineering、4(3):313−317
(1991))、(複数種の)レクチンの組合せ(欧州特許
出願第337799号)、コラーゲン(米国特許第4,291,013
号及び第4,849,141号)、種々の血清タンパク質および
血清組成物(米国特許第4868158号、第4843856号第2
欄、第3行および第4918008号)、抗体およびそのフラ
グメント(米国特許第4,474,893号;Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、85(11):3990−3994(1988);欧州特許出願第
396387号およびPCT出願第91/09134号)その他の標的タ
ンパク質(欧州特許出願第238645号)がある。
非古典的な[non−traditional]ペプチドも薬物担体
として使われている。Toothらはアミド、エステルその
他の不安定リンクを使って薬物運搬性を向上するため、
ペプチドに脂肪化合物を結合することによって膜溶解性
[membrane solubility]を高めようと試みた。同様な
方法が米国特許第4,497,932号及び第4,540,564号でも使
われている。偽ポリアミノ酸のアミノ酸側鎖にある官能
基に薬物を付加することが試みられたこともある(Lang
er,Ibid.,p113)。
炭水化物その他の高分子もタンパク質薬物担体として
使われている。(Fujitaら、Journal of Controlled Re
lease、11(1−3):149−156(1990)) 薬物は種々の担体と次のようなさまざまな方法で結び
付けられている。例えば吸収、捕捉[entrapment]、化
学的結合、ならびにリポソームまたは小包内でのものが
ある。ある種の担体は人体にゆっくりと吸収され、それ
によってその担体が分解するにしたがって薬物が放出さ
れる。おそらく最も安定しているのは担体薬剤に薬物を
化学的に結合するものであろう。しかしその結合があま
りに強すぎるときは薬物が自由な機能を有する形になっ
て放出されることがなくなる。たくさんの結合形[link
age]が採用されている。例えば酸に不安定で光に不安
定な架橋[bridges]がある(欧州特許出願第185762
号、第191772号)。グルタチオン、システイン、ホモシ
ステイン、およびγ−グルタミルシステインのような還
元剤の血清中での低濃度存在によってジスルフィド結合
は血液中でゆっくりと開裂[cleaved]される。エステ
ル結合およびペプチド結合は酸性状態またはアルカリ性
状態で、またはタンパク質分解で開裂できるが、これら
は全て人体の各所で生起することができるものである。
しかしタンパク質の多くは血管外空間に「漏れ」る性
質があるから、これら薬物のどれ一つとして血流中に特
異的に制限されてはいない。また、運搬系(デリバリー
システム)からの治療薬の放出は殆ど制御できないこと
なので、また、付加の状態はランダムで化学的に均一に
限定されているものではないのが殆どである。しかも担
体に接合[conjugate]される薬物量を押し込めること
[consrain]は、担体分子に多数の無制御な活性部位が
あるので、困難である。このように単分散形成は上記の
ような担体では不可能である。これらすべてのファクタ
ーが目的薬物の放出のされ方を変えているのである。
撮像分野にも同様な問題がある。トレーサー物質を運
搬するために種々の担体が使われているが、血液からの
急速なクリアランスがあるため問題となっている。アル
ブミンのように比較的長く続く担体(米国特許第4,042,
677号)が試用されているが、アルブミンは局在特異性
がないから、血流から「漏れ」てしまい理想的な撮像か
らは程遠いものとなる。
発明の概要 本発明はヘモグロビンを薬物担体として利用すること
に関する。ヘモグロビンは部位特異的に修飾することが
できる内因性[endogenous」の高分子量タンパク質で、
組換え技術を使って発現させることができるから、薬物
の安定性を向上させ血管内保持力[intravascular rete
ntion]を強化することによって薬物運搬をコントロー
ルするのに使うことができるヘモグロビン様タンパク質
をもった特殊な新規の接合体[conjugates]を選択的に
設計することができる。しかもヘモグロビン様分子およ
びリンカー分子への接合部位[conjugation site]を適
切に選択することによって、薬物のインビボ挙動を特別
に制御することができる。これまで使われている種々の
薬物担体とは違って、本発明ではあらゆる薬物の担体と
して、特に血清タンパク質ではない薬物の担体として、
あるいは正常ヒトヘモグロビンのそれより短時間の血管
内保持力しかない血清タンパク質の薬物の担体として、
ヘモグロビンを使用することを考察している。ペプチド
性薬物[peptide drugs]は、遊離形で[in free for
m]タンパク質の加水分解に感受性なので[susceptibil
ity]、このような運搬に特に優れている。この薬物運
搬系(ドラッグデリバリーシステム)は血流中における
薬物に安定性および緩慢放出性を提供するものである。
突然変異体ヘモグロビンから普通得られる血管内半減
期は数時間のオーダーであるから、本発明は薬物運搬維
持にとって特に有益で、血清半減期が1時間未満のペプ
チド性薬物には特に有益である。しかし本発明はそのよ
うな薬物の運搬にだけ限定されるものではなく、特にヘ
モグロビンの半減期は遅緩ハプトグロビン結合の突然変
異によって引き延ばされるのであるから限定されない。
ヘモグロビンは(赤血球老化の結果として)組織内に
ではなく血液中に普通に存在するので、薬物−ヘモグロ
ビン接合体はタンパク質担体中でよりも血流中での方が
よりよく保持されるであろうと期待される。体内を移動
するアルブミンその他のタンパク質は、薬物の放出速度
を変更する原因となると考えられる各臓器ごとの著しい
環境変化にさらされている。これに対して血液は静脈血
液、動脈血液間の酸素圧差[oxygen tension differenc
es]を除けば比較的均一である。また、ある種の薬物は
特定の組織に対して他の組織に対するより毒性である。
血液中に薬物を、それがゆっくり放出されるまで集中さ
せて維持することにより、過去に観察された毒性の問題
の多くを回避することができよう。また、遊離した組換
えヘモグロビンを高い濃度で血液中に得ることができる
ので、低い効力の薬物を投与することが有効となる。
本発明はまた、生物学的に活性な分子を分解から保護
することにも関する。立体的要素、電気的微環境、ヘモ
グロビンの身体内局在部位[physical locaiton]、リ
ンカーの長さ、標的分子の付加部位などについて考察し
てヘモグロビンへの薬物の付加部位を慎重に選択するこ
とは、内因性排出[endogenous removal]メカニズムか
ら薬物を保護することを向上させることになる。
本発明はまた、生物学的に活性な化合物と酸素のほぼ
同時的な運搬にも関する。化学療法剤[chemotherapeut
ic agents]は酸素存在下での方が効果的である。化学
療法で患者を処置後にパーフルオロカーボン[perfluor
ocarbons]を投与することが提案されているが、これは
酸素を剥奪された腫瘍の内部が酸素を得れば化学療法剤
の作用を助けるであろうと期待されているからである。
本発明は、酸素を追加的に供給するだけでなく、多量の
酸素を放出するのに使われるもので、薬物が実質的にそ
れと同時に、例えば化学療法剤の効果を向上させるもの
である。
また本発明は、さまざまな組織中を流れる血液を測定
するための造影剤を提供することも目的とする。
薬物担体としてアルブミンは、いくつかの観点でヘモ
グロビンより劣っている。これまで十分に考えられたこ
とがない点の一つは、アルブミンが34個のシステインを
もっており、したがって自然におりたたまれたアルブミ
ン中のこれらシステインは17個のジスルフィド結合に関
与していることである。もしアルブミンが遺伝子工学で
作られた細胞中に発現され天然源に依存しなくても済む
ようになったら、そのポリペプチドはヒト細胞中で実際
されているように必ずしもおりたたまれる必要はなくな
るであろう。ジスルフィド結合形成のトポロジー[topo
logy]は分子ごとに異なり、多分散組成となっている。
ある分子は不安定で、接合された薬物を初期に放出する
であろう。
アルブミンのシステインが架橋可能な部位として使わ
れるなら、いくつかは薬物に架橋し、ほかは別のアルブ
ミンシステインに架橋するということになろう。ここで
もまた無数の異形[variants]が生起される。あるもの
は急速に分解するであろうが、ほかのあるものは薬物を
あまりに保護してしまうので、必要な時に放出しないと
いうようなことが起こるであろう。ロット間の一致がな
くなるのである。
各ヘモグロビン四量体には6つのシステインがある。
2つは各βグロビンサブユニットに、1つは各αグロビ
ンサブユニットにある。この四量体が変性させられない
限り、β93システインだけが試薬に反応し、このシステ
インは薬物設計者が希望するように、架橋部位として使
うか、あるいはそれをセリン、アラニンまたはトレオニ
ンのような類似のアミノ酸で置き換えることで中和す
る。アルブミンの多数のシステインが安定性に影響する
ことなく[中和」されることはあまりないことである。
ヘモグロビンは反応性チオールを僅かながら有してお
り、その数は部位特異的突然変異生成[mutagenesis]
でコントロールすることができるので、ヘモグロビンは
アルブミンよりずっと有利である。
好ましい実施例の詳細な説明 本発明は薬物のようなリガンドを、場合によってはリ
ンカーを介して、ヘモグロビン様タンパク質に会合[as
sociate]することによって、運搬及び/又は安定化す
る系に関する。以下に本発明の要素であるリガンド、ヘ
モグロビン及びリンカーにつき詳細に述べる。
リガンド ヘモグロビンに結合する化学物質[chemicals]は構
造的にも機能的にも種々多様である。合成薬剤[synthe
tic drugs]、核酸、ポリマー、その他のタンパク質、
特にポリペプチドまたはオリゴペプチドなどを含む実質
的にあらゆる有機化合物が、ヘモグロビンに会合または
結合して、安定化、緩慢放出化、血管系またはヘモグロ
ビンの分解に通常関与している組織(肝臓、腎臓、脾
臓)への局在化[localization]に貢献している。なお
本明細書で「薬物」(drug)との用語は例としてのもの
であって限定的に解されてはならない。
バイオアクティブ[bioactive]な多数のペプチドを
ヘモグロビンに結合するペプチド性薬物として使うこと
ができる。次に挙げたリストは代表的なものであって可
能な薬物をもらさず挙げたものではない。そこに示され
たペプチドは、ペプチドの治療薬としての可能性[pote
ntial]を示すために試験された化合物のずっと多大な
セットから取られた僅かな例にすぎない。しかし接合
[conjugation]に先立ちこれらペプチドの類似体を構
築するのであるが、これら類似体はヘモグロビンによる
適切なる運搬にとって必要な修飾された付加部位、リン
カーの腕、スペーサーその他のエレメントをもたらすよ
うに構築する。
これらのペプチド、またはこれら以外の同じ分類内か
ら得られる類似のペプチドは、ペプチド化学に通常の知
識を有する者であれば容易に合成することができる。し
かし本発明はペプチド型薬物の運搬だけに限定的に解さ
れるべきものではない。
A.抗血栓剤[antithrombotics] 1.RGDWまたはその類似体。このペプチドは血小板GP II
b/III a受容体−フィブリノーゲン相互反応によって仲
介される血小板凝集[platelet aggregation]を阻止す
る。マウスの抗血栓症アッセイのIC50は14μMである。
2.Ac−RGDY(Me)−NH2またはその類似体。この化合物
は上記と同様に10μMのIC50で血小板凝集を阻害する。
血漿アミノペプチダーゼに対してN−アセチル化により
安定化される。
3.N−スクシニル−YEPIPEEAA−Cha−EDまたはその類似
体。下付きのDはD−アミノ酸で、Chaはシクロヘキシ
ルアラニンである。この化合物はヒトα−トロンビンの
合成インヒビター(阻害剤)でIC50は29nMである。これ
はまたマウスの抗凝血剤[anticoagulant]としても有
効である。この化合物は肝臓で除去されるから、Hbのよ
うな大きな分子に付加し、それから緩慢に放出すること
は血清の半減期を劇的に延ばすことができる。
4.Ac−CRGD−ペニシラミン−NH2またはその類似体。こ
の化合物は4μMのIC50で冠状動脈内注射によりイヌに
おける血栓形成を阻害する。この化合物はアミノ末端シ
ステインを介してヘモグロビンにリンクされる。
B.抗増殖剤[antiproliferatives]または抗転移剤[an
timetastics] 1.Pr−HWA−VdAH(Me)L−OMeまたはその類似体。この
化合物はスイス3Td繊維芽細胞のボンベシンで賦活され
る突然変異生成のアンタゴニストとしてIC50値3.3nMで
ある。そのラットにおける半減期は皮下投与で2.5時間
である。この薬物はガストリン放出ペプチドの、また小
細胞肺ガンにおける作用増殖因子[an autocrine growt
h factor]の、潜在的なアンタゴニストとして開発され
た。より長い期間での作用が好ましいのである。
2.(D−p−Cl−phe)−QWAVGH(β−leu)−M−NH2
またはその類似体。この化合物はガストリン放出ペプチ
ドの結合を抑制することにつきIC50が0.8nMで、繊維芽
細胞によるチミジンの取り込みを抑制することにつき5.
2nMである。同様な類似体は胸腺除去マウス[athymic m
ice]に植付けた腫瘍を小さくするのが認められた。
3.[D−phe6]−QWAVGHLM−NH2及び[D−phe6]−QWA
VGHLM−OMeまたはそれらの類似体。この化合物はテンジ
クネズミ細葉細胞癌[acini]からのボンベシン放出の
抑制、ならびにスイス3T3繊維芽細胞の増殖の抑制につ
き、IC50が243と29nM、及び2nMと0.167nMである。N−
プロピルアミドの類似体をラットに100nmol/kg注射した
所、ボンベシン刺激による膵臓アミラーゼ放出を60分間
阻害した。
4.RGDポリマーまたはその類似体。これらの化合物はイ
ンビボでの肺腫瘍転移を阻害する。血液中のペプチド持
続性[persistence]を増大する条件としては、例えば
血管内反復注射、薬効[efficacy]の増大がある。Saik
iら、Cancer Res.,49:p.3815,(1989)。ラミニン配列Y
IGSRとの同時注射も薬効をさらに増大することができ
る。ヨウ素化されたペプチドの約97%が1時間で血液か
ら除去[cleared]された。
5.GRGDSまたはその類似体。この化合物はネズミB16−F1
0メラノーマ細胞の転移を阻止する。Humphriesら、J.Cl
in.Invest.,81:p.782(1988)。ペプチド(循環半減期
8分)の6マイクロモル(2.9mg)は、14日後に数えた
とき転移を90%阻止する。
6.[p−NH2]−FIGSR−アミドまたはその類似体。この
化合物はマウスのメラノーマ転移を阻止する。このペプ
チドは基底膜においてラミニンに結合する腫瘍細胞ラミ
ニン受容体のアンタゴニストとして設計された。
C.抗高血圧剤−レニンインヒビター 1.Boc−HPFHL−CH(OH)−CH2−VIHまたはその類似体。
この化合物はヒト血漿レニンの抑制につきインビトロIC
50が0.02nMである。
D.ヒト、子ウシまたはヒツジ成長ホルモン放出因子の類
似体 1.HWDAWFDK−NH2またはその類似体。この化合物はニワ
トリ、子ヒツジ、ウシ、ブタ、アカゲザルに効力のある
成長ホルモンを放出するペプチドである。ブタにおい
て、成長ホルモンの基線値は低く、長期に亙って安定し
ている。本発明の薬物担体化合物なしに単独で投与した
所、静脈内、皮下、または鼻内の注射は血漿成長ホルモ
ンのレベル(約45〜75ng/ml血漿)をさまざまな時間帯
で(概して約1時間後におさまったが)、急激に増加さ
せた。服用量は3〜30μg/kg(血管内注射)ないし25〜
100μg/kg(皮下注射)または0.5mg/kg(経口投与)と
した。経時的に増加するレベルは、向上した生物学的効
果をもたらすであろう。これと同じペプチドも治療薬と
してヒトに使用されることが仮定される。Yellinら、Ib
id.,p.214(1990) 2.V2、A15、L27子ウシGRF(1〜29)−NH2 I2、A15、L
27−子ウシGRF(1-29)−NH2またはその類似体。これらの
ペプチドは非常に効果が高く、また長期に継続性で(11
〜16倍)、血漿ジペプチジルペプチダーゼIVに耐性の子
ウシ成長ホルモン放出因子の類似体である。これらは親
ペプチドよりもインビボ、インステアで[in steers]
より活性であるが、これはより長い血漿半減期および向
上された内在性効力[intrinsic potency]によるもの
と考えられる。
E.コレシストキニン類似体。例、食欲減退性物質[anor
exigenics]としての。
1.DY(SO3)MGWMDF−NH2またはDY(SO3)NleGWNleDF−N
H2またはその類似体。この化合物は、おそらくA型CCK
受容体に結合して飽和しようとしている食欲減退効果の
あるCCK−8類似体である。膵臓、脳幹、幽門型A受容
体への結合IC50は、0.4〜1.4nMである。ラットモデルに
おける食欲減退の服用量しきい値は0.05nmol/kgであ
る。これらの類似体のインビボ長期継続性服用は重大な
副作用のない減量計画に効果的に作用するであろう。
2.Ac−YD(SO3)MGWMDF−NH2またはその類似体。フィー
ディングアッセイ[feeding assay]におけるED50は腹
膜内で1mg/kgである。CCK−B受容体の700倍選択性があ
る高親和性アゴニストが最後から2番目の位置にN−メ
チルaspを使って開発された。これを満腹誘導薬物とし
て試験用に上記アンタゴニストの配列と結合させること
ができる。
F.δ選択性またはμ選択性のエンケファリン類似体。
例、ポテンシャル鎮痛薬として。
1.環状OppugnDGFPrnD[DPDPE]またはその類似体。D−
PenはD−ペニシラミンである。これはμ受容体よりも
δ受容体を選択する環状エンケファリン類似体である。
この選択性は明らかに、モルヒネのような化合物に特有
のマイナスの副作用を回避するものである。N−末端2,
6−ジメチルチロシン環状四量体[4−mers]および五
量体[5−mers]、デルトルフィンI(YDAFDVVG−N
H2)、及び効力あるδアゴニストとして環状HCDFPenD
代わりとなるPhe3も使うことができる。
2.Phe3またはleu3−DPDPEまたはそれらの類似体。この
化合物はμに対するδ受容体の選択性をもち、また上記
類似体はμ受容体結合に対しては全く不活性である。し
かしδ受容体への結合性は減少しているように考えられ
る(ラット脳結合実験におけるEC50は100〜200nM)。デ
ルトルフィンのより強い効力の類似体を、EC50が0.36nM
である、ser4に対するasp4の置き換えも含めて、使うこ
とができる。
3.YADFEVVG(デルトルフィンB)またはその類似体。こ
の化合物は3000〜4000倍もμ受容体よりもδ受容体に対
する選択性がある。その作用はそれらをC−末端テトラ
ペプチドに局在化するようである。
4.YRDFK−NH2、デルモフィン類似体、またはそれらの類
似体。このペプチドは11,000倍もδ受容体より末梢μ受
容体への選択性があり、末梢κ受容体には結合せず、pH
7.4でネット+2〜+3電荷があるため血液/脳隔壁[b
lood/brain barrier]を通過することができないようで
ある。このようにこれはモルヒネと殆ど同じ効力で鎮痛
を誘導し(尤もそれほど効力持続性はないが)、末梢抗
侵害剤[peripheral antinociceptive]の機能を立派に
果たすものと考えられる。(Burgenderら、Eur.J.Clin.
Invest.,18;420−4(1988))そのような末梢的作用の
ため、呼吸機能低下[respiratory depression]および
依存症のような主要な副作用にも襲われないと考えられ
る。
G.血管収縮薬 1.エピネフリン 2.アンギオテンシンII 3.神経ペプチドY 4.ニューロテンシン 5.アルギニン バソプレシン H.血管拡張薬 1.心房性Na利尿因子[atrial natriuretic factor] 2.アンギオテンシン変換酵素インヒビター 3.レニンインヒビター 4.バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド 5.エンドセリン−1 I.抗エイズ薬物 現在有効なエイズ薬品の簡単な概観はSienceの253、2
62〜3、1991年に記載されている。
1. HIVプロテアーゼインヒビター。HIVプロテアーゼ
は、ウイルスのアッセンブリや複製に必須のタンパク質
に、gagとgag−pol前駆体タンパク質をプロセッシング
する過程に関与する。インヒビターはHIVの細胞DNAへの
組込みを阻止するものと考えられ、初期的な臨床実験段
階にある。本発明の運搬系を使ってこれらインヒビター
を長期に亙りエイズ患者の血液中に緩慢放出させること
はエイズの増殖を妨げ、ほかの薬剤による感染細胞への
攻撃を可能にする。薬剤として注射されたヘモグロビン
結合インヒビターにとって何週間というレンジの非常に
長い半減期は有利なことであろう。
J.非(ヒト薬物)リガンド 農業分野ではヘモグロビン安定化化合物が治療法とし
て、あるいは疾病予防法として植物動物の双方に使われ
ている。成長促進剤、殺虫剤、除草剤、食品防腐剤、局
部洗浄剤、獣医用薬剤などが安定剤及び/又は緩慢放出
剤としてヘモグロビンを採用できる。
ヘモグロビン 効果的な血管内の薬物運搬剤は広範囲の薬物に容易に
接合できるもので、複合体溶液の適当量でその薬物の効
果量を供給するのに十分なだけ血液中に溶解し、所望の
臨床効果を達成するのに必要なだけ長期間に亙ってその
薬物を運搬できるものでなければならない。それはまた
その適用されるヒトまたは動物に対して非免疫的[non
−immunogenic]でなければならない。調剤者[formula
tor]が薬物を予め決定してある部位に所望時間の放出
特性を保持して結合することができ、所望の薬物:担体
モル比を達成するように、好ましくはこの運搬剤は制御
可能に結合できるものがよい。また、薬物が組織にあま
りに早期に運搬されてしまわないように、担体は本質的
に血管系から漏れ出ることがないものであることが好ま
しい。さらに運搬剤は薬物の作用部位に酸素を運ぶこと
ができるように、酸素に可逆的に結合するものであるこ
とが場合によっては好ましい。
1実施例では、血管内薬物運搬剤はヘモグロビンであ
る。ヘモグロビンは酸素を呼吸面[respiratory surfac
es]で取り込み内部組織に運ぶ酸素結合タンパク質であ
る。別の実施例では血管内薬物運搬剤はグロビン、例え
ばミオグロビンである。
ヘモグロビンは水性溶媒中に高度に溶解性である。薬
物への結合のため、チオールのある薬物、あるいはチオ
ール特異性架橋剤と反応できる表面システインまたは凹
部システインの残基を特徴とする部位特異性の突然変異
生成で修飾することができる。ヘモグロビンは一つの四
量体につき二つしか反応性システインをもっていないの
で(β93で)、結合される薬物分子数、および結合部位
は容易にコントロールすることができる。ヘモグロビン
は免疫系にも十分耐えることができる。子ウシヘモグロ
ビンはヒトに問題なく利用されている。データは不完全
であるが、血管系からのヘモグロビン漏出はアルブミン
の場合よりも相当に少ないと信じられる。ヘモグロビン
はまた大きなタンパク質なので、インタクト(完全)な
四量体であるが、腎臓[revialではなくrenal]の濾過
を逃れる。一方それは食作用および類似のメカニズムに
よって除去されるには小さすぎる。(ヘモグロビンは二
量体への解離およびハプトグロビンによる結合に一層の
耐性をもつように修飾することができる)。最後にヘモ
グロビンは可逆的に酸素に結合する。こうした特徴は、
各々単独でも組合せても、血管内の薬物運搬剤にとって
好ましいものである。
通常の[conventional]ヘモグロビンの構造はよく知
られている。我々はここでBunn and Forget,eds.Hemogl
obin:Molecular,Genetic and Clinical Aspects(W.B.S
AUNDERS CO.,Philadelphia,PA:1986)、及びFermi and
Perutz “Hemoglobin and Myoglobin"、in Phillips an
d Richards,Atlas of Molecular Structures in Biolog
y(Clarendon Press:1981)を引用して本明細書の一部
として組み込むものとする。
普通の大人のヒト溶血物[hemolysate]の約92%はHg
b A(二つのα鎖と二つのβ鎖でできているのでα2β
2と呼ばれている)である。α鎖は141のアミノ酸でで
きている。ヘム(フェロプロトポルフィリンIX)グルー
プの鉄原子はhis 87(「基部に近い[proximal]ヒスチ
ジン」)のイミダゾルに共有結合している。β鎖は146
残基の長さ(図12)でヘムはそれにhis 92で結合してい
る。
ポリペプチドの一次構造はそのアミノ酸配列および個
々のアミノ酸の側鎖にある何らかの修飾を同定すること
で決定される。鎖の局部的屈曲[local bending]はそ
の二次構造である。ヘモグロビン分子の三次構造はアミ
ノ酸残基の立体的関係に帰するが、四次構造はサブユニ
ット(鎖)が一緒にパックされたそのされ方に帰せられ
る。ヘモグロビン分子の三次および四次構造はヘモグロ
ビン結晶のX線回折分析によって判定することができ、
それによってその分子の原子の三次元位置を計算するこ
とができる。
ヘモグロビンは通常、約180日という寿命の赤血球中
に保持されている。赤血球が老化して死ぬと、ヘモグロ
ビンを血流中へ放出する。そこでヘモグロビンはα−β
二量体に解離する。これら二量体は腎臓濾過により、あ
るいはハプトグロビン結合の結果除去される。こうして
産生した複合体は血清半減期約10〜30分で、肝臓のクッ
パー細胞にある受容体によって即座に取り込まれ、そこ
で代謝される。ヘモグロビンはその他のメカニズムでも
血清から取り除かれる、例えば遊離したヘモグロビンの
肝臓の実質[parenchymal]細胞による取り込みがあ
る。
本願における「ヘモグロビン」の用語は、関連分子の
ファミリーを指す。ヘモグロビンは(ヒトを含む)あら
ゆる動物源から単離することができ、組換え生物(トラ
ンスジェニック動物を含む)または化学合成によって人
工的に産生することができる。
特許請求の範囲の目的のために、ここで「ヘモグロビ
ン」または「ヘモグロビン様タンパク質」とは、一つま
たは二つ以上のヘム補欠分子族を有する酸素結合タンパ
ク質をいう。好ましくはそれは(a)二つのαグロビン
様ポリペプチド及び二つのβグロビン様ポリペプチド、
(b)一つのジアルファグロビン様ポリペプチド及び二
つのβグロビン様ポリペプチド、(c)二つのαグロビ
ン様ポリペプチド及び一つのジベータグロビン様ポリペ
プチド、(d)一つのジアルファグロビン様ポリペプチ
ド及び一つのジベータグロビン様ポリペプチド、(e)
一つの融合α/βグロビン様ポリペプチド及び個別のα
グロビン様ポリペプチドとβグロビン様ポリペプチド、
または(f)二つの融合α/βグロビン様ポリペプチ
ド、からなる一つまたは二つ以上のヘテロ四量体であ
る。一つの四量体のポリペプチドはもう一つの四量体の
ポリペプチドに架橋されるか遺伝子的に融合されてもよ
い。ヘモグロビンは、四つ以上のグロビンサブユニット
またはドメインでできているときは、多量体[multimer
ic]であると言う。ここで「多量体」[multimeric]と
は、八量体[octameric]ヘモグロビン(二つのリンク
された四量体[tetramer]を含み)、その他の高次の多
量体[multimers]をいう。
ヒトαグロビン様のドメインまたはポリペプチドは生
ヒトαグロビンまたは生配列とは一つまたは二つ以上が
置き換えられたり、欠失されたり、挿入されて、違って
いるその突然変異体であるが、残りはヒトαグロビンと
実質的に相同(後に定義する)な、ヘムを取り込み[in
corporate]βグロビンと会合[associate]することが
できるものである。βグロビン様ドメインまたはポリペ
プチドは類似体として定義される。ヒトαまたはβグロ
ビンと十分相同な動物ヘモグロビンまたはその突然変異
体のサブユニットは、「ヒトαまたはβグロビン様ドメ
インまたはポリペプチド」という言葉に包含される。例
えば子ウシヘモグロビンのサブユニットはこの言葉の範
囲内である。α−及びβ−グロビン様ポリペプチドは集
合的に「グロビン」と呼ばれることもある。便宜上「ポ
リペプチド」の言葉はより長いポリペプチド鎖の単一の
鎖[a unitary chain]またはドメイン[a domein]を
いうものとする。
「遺伝子的融合ヘモグロビン][genetically fused
hemoglobin]とは、少なくとも一つの「遺伝子的に融合
されたグロビン様ポリペプチド」(グロビン偽オリゴマ
ー)を有するヘモグロビン様タンパク質で、グロビン様
ポリペプチドは同一または異なる二つまたは三つ以上の
グロビン様ドメインからなる。ジアルファグロビン様ポ
リペプチドとは、第一のα−グロビン様ポリペプチド
(ドメイン)の正常[normal]C−末端と第二のα−グ
ロビン様ポリペプチド(ドメイン)の正常N−末端との
間のペプチド結合でつながった二つのαグロビン様ポリ
ペプチド配列(ドメイン)を必須の要件として構成され
る。これら二つの配列は直接つなげられるか、または一
つまたは二つ以上のアミノ酸のペプチドリンカーを介し
てつなげられる。「ペプチド結合」の言葉は、これら両
可能性を包含する。ペプチド結合以外のN−末端及びC
−末端で架橋(例えばDIDSにより)されたαグロビン鎖
はジアルファグロビンではない。ジベータグロビン様ポ
リペプチドは好ましくはβグロビンと一緒におりたたむ
ことができ、ヘムを取り込んで機能を有するヘモグロビ
ン様タンパク質を形成する。ジベータグロビン様ポリペ
プチドは類似体と定義される。成分ドメインの一つだけ
が突然変異しているジアルファまたはジベータグロビン
様ポリペプチドは「非対称的」と呼ばれる。
αグロビン様配列がペプチド結合によってβグロビン
様配列につなげられている「α/βグロビン様偽二量
体」を産生することも可能である。この「α/βグロビ
ン様ポリペプチド」およびジアルファ、ジベータグロビ
ン様ポリペプチドは、集合的に「偽二量体グロビン様ポ
リペプチド」または「ジグロビン」[diglobins]と呼
ぶ。さらに拡大して、ジアルファ、ジベータ、またはα
/βグロビン様ポリペプチドからなるヘモグロビン様タ
ンパク質も「偽四量体」である。
ジアルファヘモグロビンは二量体に解離しないが、そ
れでも血流からクリヤ[clear]される。尤も正常ヘモ
グロビンの場合より緩慢であるが。
ポリペプチドが実質的にα(またはβ)グロビンに相
同であるか否かを判定するには、配列の類似性[sequen
ce similarity]が重要、しかし非必須的、な判断基準
となる。配列類似性は従来のアルゴリズムで判定され
る。すなわち典型的には最適合致を達成するために僅か
な数のギャップの導入を許容するものである。好ましく
は本発明のαグロビン様ポリペプチドまたはドメイン
は、野生型ヒトαグロビンと少なくとも約75%の配列同
一性をもつ。しかしこれより小さい配列同一性のポリペ
プチドも、もしそれがたまたま生起し得る配列同一性よ
り大きなものであって、αグロビンの特徴的な高次構造
ならびに類似する生物学的活性を有するものであるな
ら、なおαグロビンと「実質的に相同」と考えることが
できる。比較してみると、Artemiaのヘム結合ドメイン
は一次配列類似性は27%以下であるが、それらの保存さ
れた残基の周囲およびほかのヘモグロビンに保存されて
いる残基の周囲のヘム結合ドメインの整列[alignmen
t](すなわち、ヘムの接触及びらせんセグメント同士
の関係の決定に含まれる)は、Artemiaドメインがクラ
シカルなグロビンヘリックスA〜Hを対応するターンに
もっており、またその他の種々の保存されたグロビンフ
ァミリーの残基をももっていることを示唆しているの
で、ミオグロビンと相同と考えられる。また、セリンプ
ロテアーゼインヒビターには、30%という少ない配列類
似性しかないペア[pairs of members]のある相同と認
められるタンパク質のファミリーがある。
α鎖およびβ鎖の両方に変化がある100を優に超すヒ
トヘモグロビンの突然変異体が知られている。これら突
然変異体の多くのものの酸素結合、その他ヘモグロビン
特性に及ぼす効果も知られている。ヒトαグロビン、β
グロビンは84カ所で相違する。さらにグロビン配列上の
種間に見られる異形[interspecies variations]につ
いても深く研究されている。Dickerson,Hemoglobin:Str
ucture,Function,Evolution and Pathology,ch.3(198
3)は1982年に次のように報告している。60種の知られ
ている脊椎動物のαグロビンは141カ所中23カ所で同じ
残基をもつが、66種の脊椎動物のβグロビンは146個の
アミノ酸の20個が同一であると。上記60種の脊椎動物の
ミオグロビンは、グロビンファミリーに属するが、153
カ所中27で不変のアミノ酸をもっていた。ここで哺乳類
だけについて考察すれば、不変のアミノ酸はαグロビン
につき50/141、βグロビンにつき51/146、ミオグロビン
につき71/153である。不変の箇所は分子の活性中心、つ
まりヘム凹部およびサブユニット同士の接触部、周りに
集中している。可変アミノ酸のうちのあるものは考察対
象の種の小さなフラクションだけがコンセンサス配列部
分から分岐するものとなっている。
ヒトαグロビンと選択したその他の脊椎動物のαグロ
ビンとの間の全体的相違数は、次の通りである。アカゲ
ザル(4)、ウシ(17)、カモノハシ(39)、ニワトリ
(35)、ヒトゼータ(胎児)(61)、コイ(71)、サメ
(88)。無脊椎動物グロビンについては分岐は海水ヤツ
メウサギ(113)、軟体動物(124)、Glycera(グリセ
ラ)(海アカミミズ)(124)、及び、Chironomus(キ
ロノマス)(ユスリカ)(131)。βグロビンファミリ
ーについてみると、その他の脊椎動物βグロビンからヒ
トβグロビンが違う点は、アカゲザル(8)、ヒトδグ
ロビン(10)、ウシβグロビン(25)、ウシγグロビン
(33)、ヒトγグロビン(39)、ヒトεグロビン(3
6)、カモノハシ(34)、ニワトリ(45)、サメ(9
6)、海水ヤツメウサギ(123)、軟体動物(127)、グ
リセラ(125)、及び、キロノマス(128)。
これらの相違の多くは誤解を招くおそれがある。とい
うのは可変アミノ酸[variable amino acids]は機能的
に同等な1アミノ酸を別のアミノ酸の「保存的交換」
[conservative substitutiosn]として発現するにすぎ
ないからである。「保守的交換」とはヘムを取り込みα
グロビンサブユニットとβグロビンサブユニットと関係
して、その定義された内容を維持しつつ可逆的に酸素と
結合する四量体(または偽四量体)ヘモグロビン様タン
パク質を形成する、グロビン様ポリペプチド(またはド
メイン)の能力を改廃しない交換をいう。次に挙げるよ
うなソースがこうした保守的交換(および削除と挿入)
を同定するのに使われる。
(a)官能的ヘモグロビン突然変異体に関するデータ
(100以上の突然変異体が存在) (b)脊椎動物、特に哺乳類、αグロビンおよびβグロ
ビンの配列上の種類[sequence variations]に関する
データ (c)脊椎動物、特に哺乳類、ミオグロビンの配列上の
種類に関するデータ (d)脊椎動物と無脊椎動物のグロビン間の配列上の種
類、または無脊椎動物グロビンの配列上の種類、に関す
るデータ (e)ヒトヘモグロビンならびにその他の酸素結合タン
パク質の三次構造に関するデータ、および同構造に及ぼ
す配列変化の効果を予測する分子モデルソフトウエア (f)相同タンパク質のファミリーの構成員間に見られ
るアミノ酸変化の頻度に関するデータ(グロビンファミ
リーに限定せずに)。例えばSchulz and Schirmer,Prin
ciples of Protein Structure(Springer−Verlag:197
9)Creighton,Proteins:Structure and Molecular Prop
erties(W.H.Freeman:1983)の表1−2参照。
(a)〜(d)のデータは同族の[cognate]タンパ
ク質中の変更部位における耐性[tolerable]突然変異
を決定するのにきわめて有益であり、また同分子のその
他の類似部位における耐性突然変異を同定するのに有効
である。カテゴリー(f)のデータによれば、次の交換
群[exchange groups]が認められるが、その中でのア
ミノ酸の置換はしばしば保守的である。
I 小さな脂肪族の無極性または微弱極性の残基−Ala,
Ser,Thr(Pro,Gly) II 負荷電した残基およびそれらのアミド−Asn,Asp,Gl
u,Gln III 正電荷の残基−His,Arg,Lys IV 大きな脂肪族の無極性残基−Met,Leu,Ile,Val(Cy
s) V 大きな芳香族残基−Phe,Tyr,Trp 3つの残基が括弧で括られているが、これはタンパク
質構造においてそれらには特殊な役割があるからであ
る。Glyは側鎖のない唯一の残基だからその鎖に対する
柔軟性[flexibility]を有する。Proは鎖をしっかりと
制約する普通にみられない幾何学的形を有している。Cy
sはタンパク質をして特定のおりたたみに保持するジス
ルフィド結合に参加することができる。SchulzとSchime
rが上記I、IIを合併したことに注意されたい。またTyr
は、水素結合の可能性を有しているから、Ser,Thrなど
と一種の親類関係[kinship]になっていることにも注
意されたい。
一般に(タンパクの)機能は表面の残基における突然
変異によってあまり影響を受けない、少なくともヘム凹
部またはサブユニット接触のいずれにも関係しなかった
ものは影響されていない。また、フリーのアミノ末端ま
たはカルボキシ末端は勿論、αヘリックスを接続する
「ループ」は、欠失や挿入により大きな耐性を有してい
る。
ヘモグロビンに結合させた薬物を動物に投与するとき
は、その動物にとって有意に抗原とならない[not sign
ificantly antigenic]ヘモグロビンを使うことが好ま
しい。しかしヘモグロビンの型[the type of hemoglob
in]は、そのようなヘモグロビンを動物に使わない場合
でも適切にその薬剤[the chemical]を安定化すること
ができるのであればそれほど問題でない。また厳密に要
求されるものではないが、そのヘモグロビンは酸素結合
能を保持していることが好ましい。
ヘモグロビンは多くの源から容易に調達できる。屠殺
場は血液という形で現在、安い肥料として販売している
が、大量のヘモグロビンを供給する。もし動物の特定の
種あるいは品種が一定の用途に最適のヘモグロビンを提
供してくれるものであるなら、その目的でその特定の生
物を生育して必要な血液を得ることができる。ヒトの血
液銀行は一定の保存期間を経過した人血は捨て去ること
が義務付けられている。これもまた大量のヘモグロビン
供給源である。血液からヘモグロビンを分離する技術は
周知の通りである。どんな標準的技術でも使用可能であ
る。
動物源から取り出すほかに、所望のヘモグロビンのサ
ブユニットをコードする遺伝子をクローニングし、適当
な発現ベクターに入れ、そして微生物、動物、あるいは
植物、あるいはまた培養した動物や植物の細胞や組織の
ような有機体に挿入して得ることもできる。こうした有
機体は標準的組換えDNA技術で産生できる。Liebhaber
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77;7053−7058(1980)M
arottaら、Journal of Biological Chemistry,252;5040
−5053(1977)によりヒトαグロビン遺伝子およびβグ
ロビン遺伝子もクローニングされている。野生型および
突然変異α、βグロビンの各々を発現させる技術、また
機能を有するヘモグロビンにそれらを組込む[assembly
into]技術については、既述の関連文献中に記載され
ている。
ヘモグロビンA0は二つのαグロビンサブユニット(α
、α)と二つのβグロビンサブユニット(β、β
)からなるヘテロ四量体[heterotetramer]である。
αとα、またはβとβ間に配列上の相違はな
い。脱酸素した(「デオキシ」、または「tense」の
「T」)状態では、サブユニットは四面体を形成する。
αβおよびα、βのインターフェイスは酸素結
合している間比較的固定されてはいるが、かなり流動的
である。酸素化(「オキシ」または「relaxed」の
「R」)状態では、サブユニット間の距離が増える。サ
ブユニットはファンデルワールス力、水素結合、デオキ
シHgbでは塩橋により非共有結合されている。ヘモグロ
ビンはαβおよびα、βの二量体へ解離するこ
とが知られている。これらの二量体は腎臓の濾過作用に
より血流から除去される。ヘモグロビンの血管内保持
[intravascular retention]は、例えば一つの四量体
のサブユニット、または複数の四量体間のサブユニット
の化学的架橋で、改善されている。
これら関連出願に記載されているように、二つの非共
有結合で結合したサブユニットが二つの酸素結合ドメイ
ンをもつ一つの偽二量体ポリペプチドで交換され[repl
aced]、直接または一つもしくは二つ以上のアミノ酸の
リンカーを介して結合されることにより、偽四量体ヘモ
グロビンを産生することができる。この偽二量体ポリペ
プチドは適当な融合遺伝子から発現することができる。
こうして二つのαグロビン遺伝子が一つの「ジアルファ
グロビン」遺伝子へ融合され、あるいは二つのβグロビ
ン遺伝子が一つの「ジベータグロビン」遺伝子へ融合さ
れ、あるいはαグロビン遺伝子とβグロビン遺伝子とが
一つの「αβ」グロビン偽二量体遺伝子に融合される。
二つまたはそれ以上のグロビン鎖を融合することの長
所は、HOFFMAN 5Bに示されているように、両方の鎖では
なく一つの鎖を選択的に突然変異させることができるこ
とにある。これは、等モルの薬物とヘモグロビンが最終
製品に認められるように目的とする薬物にただ一つの付
加部位しか付与しないことを可能にする。
別の方法はヘモグロビン分子に無数の付加部位をもた
せる方法である。この方法は結合される薬品の一層多く
の量を安定化することができ、またおそらく結合された
薬物の放出速度に相違をもたせることができる。
ヘモグロビンはこれまで種々の技術で修飾されてい
る。これら技術のいずれかを本発明の薬物・ヘモグロビ
ン接合体のヘモグロビン成分の調製に使うことができ
る。かかる修飾の例は、米国特許第4,412,989号、第4,3
01,144号、第4,670,417号、第4,321,259号、第4,473,56
3号、第4,710,488号、第4,650,786号、第4,336,248号、
第4,598,064号、第4,600,531号及び第4,377,512号など
に見られる。半合成ヘモグロビンを合成する目的で、個
々のグロビン鎖が修飾形で再調製されている。(Luisi
ら、Nature、320;555−556(1986)Nagaiら、Nature、3
29;858−860(1987))グロビン鎖の重合、グリコシル
化、ペジレーション[pegylation]、リポソームまたは
細胞膜へのカプセル化のような他の修飾も考案されてい
る。
組換えDNAを発現させることによって産生したヘモグ
ロビンもまた簡単に修飾することができる。グロビン遺
伝子に部位特異的突然変異を起こす標準的技術を用いる
ことによって、得ようとするグロビン鎖中のアミノ酸を
加えたり、欠失したり、変更したり組合せたりすること
ができる。(Kruseら、Biotechniques、6;338−339(19
88)Zollerら、Methods in Enzymology、100;468−500
(1987)は最近例)。修飾された箇所を目的薬物の付着
部位とすることができる。そしてこれは薬物がヘモグロ
ビン分子に結合されるべき場所ならびに場所数を変える
ことになる。目的の薬物がそれ自身ポリペプチドである
場合は、それをグロビン鎖に付加して薬物・ヘモグロビ
ン接合体[conjugate]にしてもよい。
化学的に架橋されたヘモグロビン、またはαサブユニ
ット(ジアルファHgb)もしくはβサブユニット(ジベ
ータHgb)を遺伝子的に融合した突然変異ヘモグロビン
は、ハプトグロビン結合を抑制するから血管内保持を向
上することができる。おそらくはヘモグロビン四量体の
呼吸[breathing]により、ジアルファヘモグロビンは
なおハプトグロビン結合されているが、その速度は、血
流中に数時間残るジアルファHgbであるA0のそれよりず
っと遅い。薬物運搬をするのにヘモグロビンに対するハ
プトグロビン結合を嫌うときは、この技術を使うことが
できる。
ヘモグロビンまたはそのフラグメントのどれでもヘモ
グロビン自体の生物学的活性[biological activity]
を変更するために修飾することができる。米国特許第5,
028,588号は代用血液として酸素低親和性突然変異体を
使用することを開示している。かかる修飾分子を薬物に
結合させて、本発明の薬物・ヘモグロビン接合体を形成
することもできる。
リガンドのヘモグロビンへの結合 リガンドは次の条件を満足するものである。すなわ
ち、a)直接、間接に共有結合できること、b)水素結
合、ファンデルワールス力、または疎水性相互作用で直
接、間接に非共有結合できること、c)ヘモグロビンの
三次元ネットワークまたはそのヘモグロビンに関連ある
トラップ手段によって物理的にトラップできること、以
上。対合[coupling]は直接に行われても、あるいは薬
物とヘモグロビンの双方に関連あるリンカー部分もしく
は中間の結合分子によって間接に行われてもよい。
共有結合による付加:1実施例ではリガンドがヘモグロ
ビンに共有結合で付加される。この付加はヘモグロビン
の官能基とリガンドの官能基を直接に反応させるか、ま
たは同一官能基を有する[homofunctional]もしくは異
なる官能基を有する[heterofunctional]架橋剤ととも
にリガンドとヘモグロビンを同時的または順次的に反応
させることによって行う。もしリガンドまたはヘモグロ
ビンが所望の官能基を欠如しているときは、そのリガン
ドまたはヘモグロビンをデリビタイゼーション(誘導体
化)[derivitization]することによって行う。
ヘモグロビンの好ましい付加部位としては、ジスルフ
ィド結合を形成することができるシステイン、および薬
物と反応してエステル、ペプチドその他の結合を形成す
ることができるアスパラギン酸やリジンのようなフリー
なカルボン酸またはアミン部分[amine moiety]をもつ
アミノ酸がある。
ジスルフィド結合:付加形成のためにジスルフィド結
合を利用することは特に好ましい。ジスルフィド結合は
ヘモグロビンのシステイン残基のチオール側の基[thio
l side group]とリガンドのチオール基との間に形成す
ることができる。ジスルフィド結合の長所は、それが血
清に内因性の[endogenous]還元剤によって徐々に還元
されるから、リガンドされた薬物を血流中に緩慢に放出
することができることである。ジスルフィド結合形成の
ための試薬および条件は当業者によく知られていること
である。この目的で置換または挿入によってシステイン
をヘモグロビン中に導入することができる。
ジスルフィド結合の安定性の調節:薬物運搬または薬
品放出速度はヘモグロビン鎖のどこにリンクされている
かにより左右される立体的因子[steric factor]およ
び電気的因子の双方の影響を受ける。薬品をより緩慢に
放出させるため、ジスルフィド結合の生化学的還元[re
duction]を阻害するように薬物のチオールをバルキー
な(かさのある)化学部分[bulky chemical moiety]
で囲む[flank]ことができる。例えばペプチド性薬物
の場合には、トリプトファンまたはβナフチルアラニン
のようなバルキーな残基の近傍に架橋可能なシステイン
をもたせてもよい。モノクローナル抗体とリシンA鎖間
のジスルフィド結合の半減期はマウスで6.7時間と測定
されている(Thorpeら、Cancer Research、48;6496(19
88))。しかし硫黄1個の次にα−メチル置換基[subs
tituent]が立体的に阻害されたジスルフィド結合を使
うときは、6.3倍長い半減期が認められた。同じ置換基
を本発明にも用いることができる。
あるいはヘモグロビンシステインを分岐した箇所の次
のグロビン鎖の真ん中の二つの鎖の間の裂け目[creav
e]に部分的に隠すか、またはアスパラギン酸とかグル
タミン酸のような負荷電の残基によって包囲することに
よって負荷電の還元化合物を反発させることができる。
これら技術のすべては還元環境中でジスルフィド結合の
半減期を分子運動学的[kinetically]に引き延ばすた
め使用することができる。ヘモグロビンに鎖付加される
一定の薬品およびその薬品の所望の半減期が、どのよう
な組合せで使用するべきかを決定する。これは実験反復
して容易に得ることができる。
選択する薬物のほかにも、ヘモグロビン分子に還元剤
または酸化剤を架橋させることができる。もし還元剤を
架橋するなら、薬物放出の初期の速度は遅いであろう
が、還元剤が放出されてしまえばジスルフィド結合に攻
撃することによって薬物放出速度を加速することになろ
う。放出されてしまった酸化剤は逆の効果をもたらすで
あろう。
薬物放出のプロフィル[profile]は、同じまたは異
なるヘモグロビン分子にさまざまなアクセッシビリティ
(反応性)[accessibility]の薬物を異なる部位に攻
撃させることでも修飾することができる。
ヘモグロビン分子に付加する部位:1実施例では付加部
位は、リガンドがそこをより容易に攻撃できるようにヘ
モグロビン分子の外側にされている。付加されたリガン
ドは向上された半減期をもっており、ヘモグロビンに結
合しても活性を維持する。あるいはその薬品の分解を保
護すること、及び/又はその薬物に一層長い半減期をも
たらしめること、を望むときは、そのヘモグロビン分子
に対するアクセッシビリティが比較的小さい部位を使え
ばよい。
表面システイン:システインをヘモグロビン様タンパ
ク質中に導入するのには種々の部位を使うことができ
る。
部位を選択するに当たって必要な基準は(1)突然変
異が機能に影響するものでないこと、(2)側鎖がオキ
シまたはデオキシ構造で水にアクセッシブルであるこ
と、(3)その部位がたたまれた[folded]タンパク質
の表面に存在すること、(4)側鎖のスルフヒドリルが
分子の内部に向かってよりも表面から離れるように外方
に伸びていること、(5)その部位がR→T遷移[R→
T transition]に直接関与しない分子の部分中にあるこ
と、(6)その変化が強固に固定される箇所をもたない
分子部分にあること(かかる領域は一般に判然としない
X線回折パターンを示す)、(7)その突然変異が局部
的二次構造を破壊するものでないこと、つまりフォール
ディング[refolding]の問題を引き起こすおそれがあ
るpro→cysの突然変異を回避するものであること、
(8)もし可能ならser→cysまたはala→cysのような保
守的変化であること、以上である。突然変異は必ずしも
上述のこと全てを満足するものでなくてもよい。例えば
R→T遷移(上記5参照)に関与する部位を予想して
も、P50(上記1参照)の有利な変化を重視することも
ある。最も重要な点はその突然変異が、架橋形成の前後
を問わず酸素結合性を改廃するものでないこと、また、
システインが所望の架橋反応に参加できるだけのアクセ
ッシビリティを有することである。
α表面上の候補部位は下記のものを含む。
β面上のβ部位としては下記のものを含む。
これらの部位で既に突然変異を示した自然発生的突然
変異体は多数存在する。次の通りである。
表面または近表面でのシステイン突然変異は一般に、
ヘモグロビン偽四量体の機能に重要な影響を与えるよう
なものではないと考えられている。システイン突然変異
はαヘリックスを有意に不安定化する[destabilize]
ものとは考えられておらず、また表面残基はヘモグロビ
ンの酸素結合特性に直接関与しないと考えられている。
ほとんどの表面残基はかなりな運動[motion]にさらさ
れるのでしっかりと束縛されない。またタンパク質の呼
吸運動があるため、システインの側鎖は必ずしもジスル
フィド結合形成にアクセッシブルなように溶液中に直接
向くようにしなければならないものでもない。
ジスルフィド結合を保護するための突然変異:血清に
おいて、ジスルフィド結合はグルタチオンのような内因
性[endogenous]チオールによって還元される。これら
反応のメカニズムは実際の還元種のようなチオレートの
陰イオン[the thiolate anion]に関係している(Crei
ghton,T.E.(1978)Prog.Biophys.Molec.Biol.、33:259
−260;Creighton,T.E.(1975)J.Mol.Biol.、96:767;Cr
eighton,T.E.(1977)J.Mol.Biol.、113:313)。このよ
うに還元速度はジスルフィド結合近傍分子の静電気環境
の関数であろう。ジスルフィドが負の静電気環境中に存
在するときは、チオレート陰イオンの反発があるため、
還元速度はより遅くなると予想される。グルタチオンの
場合には、もっと無反応な中間的なプロトン化された分
子種[the unreactive transient protonated spies]
がネットの負電荷をもち反発されるので、ジスルフィド
還元速度を一層遅らせるであろう。
したがって負荷電された表面残基に近い所にあるジア
ルファまたはジベータヘモグロビンの表面のまたは表面
に近いアミノ酸残基は1つのシステイン突然変異の場所
としてよい選択である。そのような2つのシステイン間
の最初のジスルフィド結合の形成も、システイン周辺の
2つのヘモグロビン分子の負電荷間における反発のた
め、遅いのであるが、その反応はインビトロ形成反応中
の高い濃度の塩または高いpHの使用で促進することがで
きる。デオキシ条件下でレドックス緩衝液中で行なわれ
れば、その反応は温度上昇につれて促進されるであろ
う。
負荷電残基に最も近いcys突然変異に好ましい部位 αser49 asp47近辺;自然発生のser49からargへの変異
は正常酸素親和性を有する。
αhis20 glu23近辺;自然発生のhis20からtyr,gln,arg
への変異は知られている有害特性を何ももっていない。
αlys16 glu116近辺;自然発生のlysからgluへの変異
は正常酸素親和性をもっている。
αhis50 glu30近辺;自然発生のhis50からaspへの変異
は知られている有害特性を何ももっていない。
βthr50 asp52近辺;自然発生のthr50からlysへの変異
は知られている有害特性を何ももっていない。
βlys65 asp21近辺 βasn19 asp21近辺 凹部[crevice]システイン突然変異体:クレビス−
システインヘモグロビン突然変異体も関心のあるもの
で、部位特異的突然変異(形成)によって調製される。
得られた突然変異凹部システインは薬物にジスルフィド
結合される。凹部壁は血清還元剤による薬物−ヘモグロ
ビンジスルフィド結合に対しての攻撃を立体的に[ster
ically]阻害する。
かかる凹部がヘモグロビンのデオキシ構造に存在す
る。この構造中では凹部の底および側部(αleu34、α4
0lys、β132lys、またはα37proのように、いずれもcys
に突然変異させる)の残基の置換が付加部位をデオキシ
構造から非常に遅い放出にする。例えばデオキシ構造の
表面は、α34leu→cys突然変異がデオキシA0中の裂目
[a cleft]に深く埋め込まれたジスルフィドを形成す
ることを暗示している。(αlys139がハプトグロビン結
合に関与していることが示唆されるが(J.Biol.Chem.25
4.7265,1969)、それはまた裂目中に僅かながら入って
いる。
ヘモグロビンのオキシ構造中の凹部はそれよりずっと
浅く、ペプチドまたは薬物をオキシヘモグロビンに結び
付けている[anchoring]ジスルフィド結合が還元体に
よりよくアクセッシブルであることを示唆している。こ
のようにデオキシヘモグロビンの凹部システインに結合
した薬物の放出速度はその構造がデオキシ状態にある時
間割合によってコントロールすることができるもので、
ヘモグロビンのP50の関数となっている。
別の凹部はデオキシヘモグロビンの中央部にある穴
[the hole]である。この穴中の各残基のシステインへ
の突然変異は、その突然変異体へのペプチドまたは薬物
−ジスルフィド結合の還元による放出速度を著しく遅く
する。かかる付加部位はここに付加されたペプチドが攻
撃を受けたときタンパク質加水分解ら保護され易くする
というもう一つの利点をもつ。かかる突然変異の部位と
してはαlys99、thr134、およびβarg104、his143、lys
82、そしてans139などがある。これらの突然変異は一つ
以上のペプチドをそのヘモグロビンに付加するために組
合わすことができる。
この穴中には高い正電荷濃度があるから、負荷はその
ペプチドに一つまたは二つ以上の付加電部分を追加する
ことによって安定化させられ得る。N−またはC−末端
Cysをもち最初の三つまたは四つのアミノ酸中にかさ高
な残基のない線状[linear]ペプチドが、この穴に適合
する可能性が最も高いものである。
酸素低親和性突然変異:デオキシコンフォメーション
はシステイン突然変異体に酸素低親和性(高P50)突然
変異を導入することによって安定化することができる。
その結果得られるヘモグロビンの親和性が低ければ低い
ほど、薬物の放出速度は遅くなる。このメカニズムは肺
の血管系のような高い酸素分圧の組織における薬物放出
速度をより選択的にできるようにする。
ヘモグロビンの親和性を減少させる突然変異の候補と
しては、例えば、Presbyterian突然変異(純ヘモグロビ
ンのP50の測定値は35mmHg)、β67val→ile(24.7mmHg
のP50)、ヘモグロビンKansas(約20mmHgaのP50)、ヘ
モグロビンJ−Cairo(15mmHgaのP50)、ヘモグロビンT
itusville(P50=16mmHga)、ヘモグロビンBeth Israel
(全血=88mmHgaのP50)がある。これらの突然変異の組
合せも低い酸素親和性の突然変異体も産生するものと考
えられる。((注)の記号が付いている箇所について
は次を参照せよ。Bunn and Forget、Hemoglobin:Molecu
lar,Genetic and Clinical Aspects、1986.Philadelphi
a:W.B.Saunders,p.615) 非常に低い酸素親和性のあるヘモグロビンを形成する
別の方法としては、ヘモグロビンのR状態からT状態へ
の遷移に移行するサブユニットインターフェイスを結ぶ
ジスルフィド結合を挿入することがある。α1−β2イ
ンターフェイスを結ぶT状態において形成されるジスル
フィドはそのT(デオキシ)状態を安定化し、こうして
タンパク質のP50を減少させる。かかるジスルフィド結
合の1例は、デオキシ構造を調べて分かったのだが、α
96val→cysおよびβ101glu→cysの突然変異がもたらさ
れる。
ジスルフィド形成のいくつかの幾何学判断基準を満足
する他の例が得られた。(7.4Å以下のCα−Cα距
離、3.3〜4.6ÅのCβ−Cβ距離、Cα2、Cβ2およ
びCβ1間の角度とCα1、Cβ1およびCβ2間の角
度は53〜180度、であることが下に示されている.(Bal
ajiら、Biochem.Biophys.Res.Comm.160,109−114,198
9)。これらには次のものがある。β37trp→cysおよび
α92arg→cys;βarg40→cysおよびαarg92→cysおよび
βhis97→cysおよびαthr41→cys.T状態の最大安定性を
得るため、これらの突然変異をβおよびαの両ドメイン
中に導入させなければならない。もしこれらのジスルフ
ィド結合が形成されたら、その構造はデオキシ構造に固
定される。得られるP50はおそらく非常に高いものとな
ろう(100mmHg以上)。
ハプトグロビン結合を抑制する突然変異:ハプトグロ
ビン結合を阻止する位置にある分子の表面に存在するジ
スルフィド結合を形成するシステインも可能である。分
子グラフックスは所望の薬品に結合される組換えヘモグ
ロビンがハプトグロビン結合を防止するには、lys90ま
たはala82のようなαlys139周りの残基がシステインへ
の突然変異にとって都合のよい候補であることを示唆し
ている。システインに突然変異されるのに好ましい残基
としては、α1、6、74、85、89、93、118、120〜12
7、138〜141、およびβ2、11〜25、31〜40、そして131
〜146がある。最初と最後の二領域はβ鎖の表面上もし
くは表面近傍にある。これらのヘモグロビンはハプトグ
ロビン結合の初速度[initialrate]抑制を目的とし
て、薬物運搬のためペプチドを付加することによってハ
プトグロビンの蛍光消光[fluorescence quenching]を
観察してチェックすることができる(HwangとGreer,J.B
iol.Chem.254,2265,(1979)) ヘモグロビンとの架橋のためのリガンドの誘導体化:
結合されるべきリガンドが自然状態でフリーなスルフヒ
ドリル基もしくは類似の付加部分[attachment moiet
y]をもたないものであるときは、リガンドはそのよう
な部分に付けられるように修飾される。安定化されるべ
き薬物がポリペプチド性薬物の場合を例に述べると、ア
ミノ末端、カルボキシ末端、またはシステイン内部の付
加は固相ペプチド(Merrifield)合成によって容易に行
うことができる。また標的リガンドがあまり長くないと
きとか担体のヘモグロビンから何らかの方法で分離され
ていなければならないときは、適した結合アミノ酸がそ
の付加部位に付けられる。例えばポリプロリンリンカー
がヘモグロビンとポリペプチド間のジスルフィド結合の
後に設計することができる。アミノ酸リンカーテイル
[linker tails]の付加は内因性プロテアーゼ分解に対
する感受性を減少させてポリペプチド性薬物の安定性を
向上させるであろう。D−アミノ酸鎖またはポリプロリ
ン鎖のような適切な「二次リンカー」が考えられる。
ジスルフィド結合を得るのに好ましい方法は次のよう
な薬物の作用[function]である。
一つのシステインのある直鎖状ペプチド性薬物:薬物
のCysとヘモグロビンのCysとの間にジスルフィド結合を
形成する。
一つもシステインがない直鎖状ペプチド性薬物:例え
ば下記方法のいずれかを使って薬物中にシステインを導
入する。(a)薬物のN−末端またはC−末端にCysを
付ける(グリシンスペーサーを一つまたは二つ以上使う
か使わないで);(b)薬物ペプチド配列の重要でない
残基をcysで交換する;(C)cysをペプチドのlys−ε
−NH2基から離れた分岐として付加する。導入されたCys
をヘモグロビンCysにジスルフィド結合する。
自然発生的ジスルフィドのある環状ペプチド:次の方
法で行うことができる。即ち(a)N−またはC−末端
にcys(Npys)を付加するか、あるいは環中のあまり重
要でない残基をCysと交換する; または(b)還元不能な環を構築しN−末端またはC
−末端にcysを入れるか、環中であまり重要でないアミ
ノ酸を交換する。この場合には還元可能なジスルフィド
(−S−S−)結合が、例えば(1)チオエーテル(−
S−)、(2)ラクタム((K)−NHCO−(D))また
は(3)メチレン(−(CH2)m)構造で交換される。
非ペプチド性薬物:薬物がフリーなチオールを含有し
ているときは、これはヘモグロビンシステインのチオー
ルと反応するであろう。もし反応しなかったら、その薬
物はフリーなチオールを有するように合成して修飾され
なければならない。チオール基でヒドリル基を交換する
ことも可能であるし、薬物にチオールのある部分を付加
することも好ましい。
どんな修飾が薬物に対してなされるにせよ、その修飾
されていない薬物の生物学的作用を保持するように架橋
が選択されることが望ましい。薬物は一旦放出されるよ
うになれば活性である限り、ヘモグロビンに結合させら
れているときも活性であることが要求されるものではな
い。
非ジスルフィド結合:インビボ還元剤は担体からペプ
チドを遊離させる[liberate]ように作用するから、ま
た外因性の[exogeneous]還元剤は半減期を調節するよ
うに同時投与することができるから、ジスルフィド結合
が好ましいのであるが、不安定な結合または可逆的会合
[association]も使うことができる。直接合成によっ
て得たハロアセチル−ペプチドまたはハロアセチル−化
合物でシステインをアルキル化することにより、ペプチ
ドおよびその他の有機化合物をヘモグロビンに付加する
ことができる。二官能的架橋も薬品をヘモグロビン鎖に
結合するのに使うことができる。さらに別の例は酸性ま
たはアルカリ性の環境下で開裂されるエステル結合に関
する。所望の薬品を放出できるようにするため、血清プ
ロテアーゼのため一定のプロテアーゼ開裂部位をリンカ
ーとして使うことができる。周囲の微環境は部位特異的
な突然変異生成または化学的修飾によって所望の放出速
度を得るように修飾される。
融合タンパク質:リガンドがポリペプチドまたはオリ
ゴペプチドであるときは、融合タンパク質の形でリガン
ド−ヘモグロビン接合体[conjugate]を産生すること
ができる。そこではリガンドはα及び/又はβグロビン
鎖中にその新しいドメインとして組み込まれる。リガン
ドはヘリックス間ループ[interhelix loop]に挿入さ
れるか、グロビンD−ヘリックスのような非必須的構造
[a non−essential structure]を交換するものでもよ
い。このリガンドはグリシンのような一つまたは二つ以
上のアミノ酸のペプチドリンカーでキメラグロビン鎖の
残部に付けることもできる。
非共有結合的付加:別の実施例ではリガンドとヘモグ
ロビンは非共有結合的に付加される。付加は、リガンド
を分子に付加し、その分子はヘモグロビン中に吸収され
るというように間接的に行われる。例えば薬物を抗ヘモ
グロビン抗体に結合し(共有結合または非共有結合的
に)、後者を非共有結合的にそのヘモグロビン分子に結
合させることができる。アビジン/ビオチン結合もそれ
ら二つのうちの一つをヘモグロビンへ、他の一つをリガ
ンドへ結合するために使うことができる。またその薬物
をヘモグロビンに自然に結合するハプトグロビンに結合
させることもできる。結合部位のあるハプトグロビンの
フラグメントも付加部位として利用できる。こうした会
合[associations]は薬品使用の場でなされず予め行わ
れているのが好ましいが、その場で行うことでもよい。
非共有結合の会合は直接に、例えば水素結合およびヘ
モグロビンをリガンドに会合させる疎水力によって、形
成してもよい。例えば部位特異的突然変異生成を使って
多数の疎水性アミノ酸を互いに近づけさせ所望の薬品の
疎水部分の付着[attachment]を促すようにしてもよ
い。ここで相互に近づけるとはアミノ酸が鎖中で近接し
ていることを意味するものではなく、二次構造、三次構
造、または四次構造により分子全体が二つの別々のアミ
ノ酸を近くに配置している状態を言う。
その他:理想的には動物中の薬剤の半減期は、一定期
間作用することを望む薬物、例えばペプチドTのような
ものにつき、少なくとも数日である。しかし薬物のより
短期間での運搬が望まれるときは、例えば組織プラスミ
ノーゲン活性化因子のような、ヘモグロビン運搬ベヒク
ルは別のものを選択するのがよいであろう。そこで薬物
の有効濃度を引き延ばすため各々別々の半減期をもつ二
つの異なるタイプの結合または異なるヘモグロビン担体
を使うことが好ましい。これは2回の投与、二つの異な
るヘモグロビン安定剤か、または所望の薬品を付加させ
るための部位が複数の非同一なものである1つのヘモグ
ロビン担体の1回の投与を含む。安定化組成物は一つま
たは二つ以上の追加的薬品を包含していてもよい。
組成物およびその用途 本発明は薬物−ヘモグロビン接合体を用いた、種々の
疾病の予防処置および治療のための薬剤学上の組成物な
らびに調合物を提供するものである。本発明の組成物は
必要に応じて哺乳類を処置するのに使う従来の固形また
は液体薬品調合剤(例えば錠剤、カプセル、注射液また
は経口投与溶液)中に組み込むことができる。本発明の
薬剤学的調合剤は、有効成分単独または他の活性剤もし
くは不活性剤と組合せられた、本発明の薬物・ヘモグロ
ビン接合体の有効量を含む。例えば非経口的治療組成物
は0.1%〜90%の薬物−ヘモグロビン接合体を含有する
滅菌等張食塩水溶液としてなる。人に投与される薬剤学
的量は、薬物−ヘモグロビン接合体の0.001マイクロモ
ラー〜1ミリモラーの血液濃度となるに十分なものであ
る。個々の服用量中に含まれる実際の成分の単位内容
[unit content]は、それ自体で有効量をなすものであ
る必要はない。必要な有効量は複数の錠剤、カプセルな
どの投与によって達成することができる。
本発明による調合は薬剤学的に許容される担体、希釈
剤、賦形剤、塩、その他の当業者に知られた物質、など
の不活性成分を追加含有していてもよくそのどれを選択
するかは利用される用量[dosage]次第で違ってくる。
本発明の薬剤学的組成物は経口、エアゾール、皮膚吸
収[transdermal adsorption]、粘膜経由吸収、または
注射など従来ある手段で供給される。非経口投与が好ま
しく、特に静脈内または動脈内投与がよい。
もう一つの好ましい実施例はヘモグロビンを診断用造
影剤の担体として使うことである。この診断薬は放射性
造影診断用として放射性であってもよい。合成中に、あ
るいは別途後でヘモグロビンに結合させて放射性原子含
有の分子(99mTe,55Feなど)をヘモグロビンに組み込み
ことができる。テクネチウム−99mは、短い半減期と検
知容易な信号のため今日よく使われている放射性剤であ
るが、本発明にとっても好ましい実施例である。磁気共
鳴映像を行うについては何らかの常磁性エレメントがヘ
モグロビン担体のラベル標識として有用である。媒体と
しての血液の特性があるため、プロトンはラベルとして
好ましくない。もし不十分な造影剤がヘモグロビン担体
に付着することがあれば、ジエチレントリアミノペンタ
酢酸のようなキレート化剤をNMR応答造影剤をヘモグロ
ビンに化学結合するのに使うことができる。陽電子放出
断層撮影法のために炭素−11その他の適当な原子をヘモ
グロビン鎖中に、それの合成中に直接組み込むか、また
は適当な薬品をヘモグロビンに結合することができる。
本発明の造影剤はどんな組織の視覚化でも、例えば腫
瘍、血管開通、動的な心筋あるいは脳スキャニングの静
電気的映像化に使うことができる。過去に使われたこと
がある担体とは異なりヘモグロビンは血流中に自然に保
持されるから、鮮明な映像をもたらすことができる。
具体的な実施例について上記したことは第三者が現時
点で公知の知識を用いて容易に改変しあるいは直接採用
してさまざまに応用することができるから、かかる採用
および改変は本発明の要旨から離れることなく開示され
た本発明の実施例と均等なものであると解釈されるべき
である。またここに用いた用語は発明を説明するための
ものであって発明の範囲を制限するためのものではない
ことも了解されたい。
本願中に記載の引例文献ならびに特許および出願はこ
こに組み込むものとする。
例1 アンギオテンシンIIは自然発生の短命な(3〜4
分)、しかし強力な血管収縮ペプチドである。このペプ
チドの治療適用はそのインビボ短半減期のためこれまで
開発されたことはない。尤もこのペプチドの臨床使用は
現在の治療法より有意な長所があるのである。例えば一
般に使われている血管収縮薬のエピネフリンは全身血圧
および心拍数の双方に作用するので、マイナスの副作用
を誘発することがある。しかしアンギオテンシンIIはヴ
ェーサルトーン(血管音)[vasal tone]にしか作用せ
ず、したがって心拍増加の付加的な負担をかけずに血圧
だけを増やさなければならないような事情のときに利用
することができる。
アンギオテンシンIIは直鎖状のオクタペプチド(DRVY
IHPF−COO−)である。最初の関心はヘモグロビンの運
搬にとっても適している適切な効果がある類似体の合成
であった。標準的boc−ベンジル工程を使い、C4逆相ク
ロマトグラフィで精製して、八つの異なるペプチドが合
成された。N−末端、C−末端またはペプチドの本体
[body]につきさまざまな修飾が施されシステイン残基
の付加が及ぼす薬効上の効果を判定しようと試みられ
た。選択した類似体の中にはアミノ末端がN−アセチル
システインを付加(チオール結合するため)することで
修飾し、続いてグリシンを(生の薬物部分により柔軟な
結合を与えるため)付加した。さらに、アンギオテンシ
ンIIの二次受容体によるクリアランスを避けるためArg2
→Lysの突然変異を生の薬物部分に生起させた。用量反
応(ドーズ・レスポンス)曲線がラットで各類似体につ
き集められた。選択した類似体は血管収縮効果につき10
倍だけしか減少を示さず、したがって将来使用ができ
る。
Hoffmanら、WO88/09179に記載の既知の偽四量体ヘモ
グロビン突然変異体(αD75C)SGE1.1が発現され当業者
に知られている技術で精製された。SGE1.1はジアルファ
グロビン(正常αグロビンにグリシンで付加されたdes
−Val−αグロビン)と、Presbyterian(β108Asn→Ly
s)突然変異のある二つのβグロビンからなる。突然変
異D75C(つまり表面アスパラギン酸のシステインへの)
は目的のペプチドとのジスルフィド結合を形成すること
ができた。その突然変異の周りの領域は電気的に中性
で、立体的に開放領域であり、したがって比較的内因性
の血清還元剤による攻撃に敏感であろう。一つのアンギ
オテンシンII分子が各ヘモグロビン分子に結合[coupl
e]され(1ペプチド性薬物:1偽四量体)、半減期デー
タをラットにつき集めた。ヘモグロビン−類似体接合体
はフリーの類似体より有意に向上した半減期をもってい
た(ラットで測定した場合、類似体+接合体の全身運搬
時間は約60分:フリーのアンギオテンシンII類似体では
1.25分)。さらに、類似体−接合体反応(例えば、血圧
のベースラインレベルまでの戻り)の消滅[decay]後
に還元剤ジチオスライトールを投与すると、血圧上昇お
よびさらに引き延ばされた放出が認められた。これはペ
プチド−ヘモグロビンジスルフィド結合の還元[reduct
ion]が担体からの薬物の放出メカニズムであることを
示唆している。すべてのデータは速成耐性[tachyphyla
xis]及び/又は徐脈[bradycardia]を避けるためアト
ロピンの共存投与をして集めたことを申し添える。
例2 上記と同じ実験セットで、別のヘモグロビン突然変異
体につき行った。ここで選択したヘモグロビンは別の表
面α鎖突然変異体、αLys16Cysである。例1に記載のヘ
モグロビン突然変異体とは違ってシステインに交換され
るリジンはオキシ構造のカルボキシレート[carboxylat
e]から3.56Å離れて位置し、デオキシ構造では3.8Å離
れて位置していて、Cysを負電荷環境下にした。このヘ
モグロビン−類似体接合体の半減期は、上記例1のもの
が60分であったのに対し、200分であった。しかも大量
のジチオスライトールを投与しても有意に向上した、つ
まり引き延ばされた運搬とならなった。したがって類似
体とヘモグロビンα鎖間のジスルフィド結合の局部にお
ける電荷環境は内因性血清還元剤の攻撃を抑制したもの
と考えられる。
例3 心房性Na利尿因子[artrial natriuretic factor]
(ANF)の環状類似体を調製して、システインに交換し
たヘモグロビンに接合した。ラットANFは配列のある28
量体[28mer]ペプチドホルモンである。心房拡張のと
きの増加に応答して心臓中の心房細胞によりANFが放出
される。そのNa利尿効果および利尿効果[diuretic eff
ect]により血液中の電解質バランスを統制し、平滑筋
を弛緩させる。カスクラチャー[casclature]では、こ
れは血管の弛緩および血圧上昇につながる。フリーANF
の血清半減期は1〜2分であるから、心房ペプチダーゼ
によって腎臓細管の不活性フラグメント中へ、またクリ
アランス受容体との結合によって、ホルモンの開裂[cr
eavage]で調節される[mediate]。フリー類似体も同
様な血清半減期をもつ。
野生型ANF(wtANF)のアミノ酸配列およびその類似体
(ANF')の配列は次の通りである。
野生型ANFの太字Cのシステインはジスルフィド結合で
リンクされている。ANF'のアンダーラインされた(K)
のリジンと(D)のアスパラギン酸はラクタム(−NHC
(=O)−)結合でリンクされている。ANF'のシステイ
ンはN−アセチル基とニトロピリジンスルフェニル基を
もつように修飾されている。野生型ANFから取り除かれ
た残基はその活性に必須のものではなく、その除去は合
成を簡素化する。N−末端システインはもちろんヘモグ
ロビンとの架橋に用いられる。ラクタム環はもとのジス
ルフィド結合を置き換えたが、これは架橋や放出には関
与しない。挿入されたグリシンはプロテアーゼ耐性を増
すためである。
類似体ANF'の調製は示されたアミノ酸配列の固相合成
から始まった。システインは既に付加されているNPys基
で付加された。システインチオールはbocで保護され、
セリンヒドロキシルは−O−ベンジルで、リジンのεア
ミノ基はFMOCで、アルギニンはtos(トルエンスルホニ
ル)で、一番目のアスパラギン酸は、シクロメチルエス
テルで、第二のアスパラギン酸はフルオレニルメチルエ
ステルで、各々保護された。Lys−4とAsp−14を選択的
に脱保護するのにはピリジンを使った。その側鎖を、HB
TU{2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−y1)−1,1,3,
3−テトラメチルウロニウムヘクサフルオロホスフェー
ト}およびDMFに溶かしたヒドロキシベンゾトリアゾー
ルを3回加えて環化した。N末端boc基を除去するには
トリフルオロ酢酸を使い、システインを無水酢酸でN−
アセチル化した[N−acetylated]。ペプチドをHFでリ
ジンから切断した。なお、このHFはNPysを除き全ての保
護基を除去した。当該類似体をC−4逆相HPLCで精製
し、2:1のペプチド:Hb中にSGE1.1のD&%C突然変異体
を2時間混合撹拌し類似体をSGE1.1のD&%C突然変異
体に付加し、GFCで本件接合体を単離した。
ANF類似体をSGE1.1のD75C突然変異体にジスルフィド
結合し、接合体(119mgのD75C突然変異体と、2.9mgのAN
F類似体;Hgbの1モル当たり0.78モルのANF類似体)をオ
ス250gラットに投与すると(徐脈を予防するためアトロ
ピンの継続的注入をしながら)、最初に明確になったの
は約30分後であったが、平均全身血圧は約100分間に亙
って徐々に降下した(最大減少量=32mmHg)。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) A61K 47/48 A61K 38/00 A61K 47/42 C07K 1/10 C07K 14/805 BIOSIS(STN) CAPLUS(STN) MEDLINE(STN) EMBASE(STN)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】(a)アルブミン以外の所望の薬物、およ
    び(b)ヘモグロビン様タンパク質を含む複合体であっ
    て、前記複合体は生理学的条件下で、前記薬物を治療上
    活性な形態で放出することができる複合体。
  2. 【請求項2】前記薬物がペプチド性薬物である請求項1
    記載の複合体。
  3. 【請求項3】前記薬物が非ペプチド性薬物である請求項
    1記載の複合体。
  4. 【請求項4】(a)アルブミン以外の所望のペプチド性
    薬物、および(b)ヘモグロビン様タンパク質を含む複
    合体であって、前記複合体は、ヘモグロビン様タンパク
    質のグロビン様ドメインと結合したペプチド性薬物から
    実質的に成る融合タンパク質を含むことを特徴とする複
    合体。
  5. 【請求項5】前記ペプチド性薬物は、グロビン様ドメイ
    ンのらせんループ中に挿入されていることを特徴とする
    請求項4記載の複合体。
  6. 【請求項6】前記ヘモグロビン様タンパク質は、二又は
    それ以上のグロビン様ドメインを有する偽オリゴマーを
    含むことを特徴とする請求項1〜5の何れか−項に記載
    の複合体。
  7. 【請求項7】前記ヘモグロビン様タンパク質は正常ヒト
    ヘモグロビンAoに比べて、αまたはβグロビン様サブユ
    ニットにおいて一または二以上の突然変異を含み、前記
    突然変異は、(a)非システイン残基から架橋できるシ
    ステイン残基への置換、(b)ヘモグロビン様タンパク
    質の酸素親和性を増加させる突然変異、および、(c)
    ヘモグロビン様タンパク質の酸素親和性を減少させる突
    然変異から成る群から選択されるものであることを特徴
    とする請求項1〜6の何れか一項に記載の複合体。
  8. 【請求項8】請求項1〜7の何れか一項に記載の複合体
    を含むヒトの疾病または疾患の治療に用いる組成物。
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