NL8901174A - Hemoglobine-preparaat en gebruik daarvan. - Google Patents

Description

Titel: Hemoglobine-preparaat en gebruik daarvan

Achtergrond van de uitvinding

Hemoglobineoplossingen zijn potentieel toepasbaar bij de (gewonde) mens als zuurstofdragende plasma expander in die situaties, waar de vulling van het vaatstelsel en de zuurstof-transportcapaciteit van het bloed onvoldoende zijn. Het voordeel boven erytrocyten of bloed is dat de oplossingen universeel toepasbaar zijn zonder typering van bloedgroepen. Een tweede voordeel is dat de hemoglobineoplossingen langer bewaard kunnen worden. Voor dit doel is het echter noodzakelijk om hemoglobine uit erytrocyten zodanig te bereiden en te modificeren dat de drie voornaamste problemen van hemoglobineoplossingen geminimaliseerd worden. Deze drie problemen zijn: 1) de aanwezigheid van resten membraanfragmenten (stroma) afkomstig van erytrocyten.

2) de hoge intrinsieke zuurstofaffiniteit buiten het milieu van de erytrocyt.

3) de korte verblijftijd in de circulatie, doordat (gedissocieerd) hemoglobine snel uit het vaatstelsel verdwijnt door lekkage via de nieren.

ad 1) Reeds in 1967 is door Rabiner een bereiding van hemoglobineoplossingen beschreven, waarbij stroma door filtratie en centrifugeren werd verwijderd, waardoor eerder waargenomen stollingsproblemen in de nieren van honden vermeden konden worden (J. Expl. Med. 126, 1127-1142 (1967). Later zou blijken dat deze methode van stromaverwijdering niet toereikend zou zijn om alle bijwerkingen te voorkomen.

ad 2) In 1972 is door Benesch et al. (Biochemistry 11, 3576-3582 (1972)) beschreven dat door covalente binding van pyridoxaal 5-fosfaat (PLP) aan hemoglobine een duidelijke verlaging van de zuurstofaffiniteit bewerkstelligd kan worden. Door deze permanente binding wordt voorkomen dat PLP het in de circulatie geinfundeerde vrije hemoglobine kan verlaten, zoals met 2,3-di-fosfoglyceraat (2,3-DPG) het geval zou zijn. PLP

kan op verschillende plaatsen aan een van de β-globine ketens in de 2,3-DPG bindingsholte gebonden zijn.

ad 3) Door hemoglobine te polymeriseren kan de verblijftijd in de circulatie verlengd worden. Dit is beschreven door Mazur et al. (ÜS patent 3,925/344 (1975)) met (m)ethyl-glutarimidaat, -succinimidaat en -suberimidaat, etc. en door Bonsen et al. (ÜS patents 4,001,200, 4,001,401, 4,053,590 en 4,061,736 (1977)) o.a. met diverse dialdehyden, met name glutaaraldehyde. Een probleem van deze modificaties van hemoglobine is dat de zuurstofaffiniteit sterk toeneemt, waardoor de zuurstofafgifte in vivo aan de weefsels niet optimaal kan zijn. Bonhard et al. (OS patents 4,136,093 en 4,336,248 (1979)) hebben door hemoglobine zowel te koppelen met PLP als te polymeriseren met glutaaraldehyde een (overigens slechts geringe) verbetering van de zuurstof-affiniteit verkregen in combinatie met een verlenging van de verblijftijd. Rausch et al. (WO 88/03408) beschrijven polymerisatie van runderhemoglobine, waarvan een lange circulatietijd in proefdieren is aangetoond. Het verschil in species zal echter toediening bij de mens in de weg staan.

Ondanks al deze verbeteringen durfde men nog niet aan klinische toepassing te denken, aangezien toediening van kleine hoeveelheden hemoglobineoplossing aan gezonde vrijwilligers toxische effecten te zien gaf (Savitsky et al., Clin; Pharmacol. Ther. 23, 73-80 (1978)). Recent is echter door de groep van Moss een vergelijkbare dosis aan gezonde vrijwilligers toegediend, waarbij geen bijwerkingen zijn waargenomen. De hierbij gebruikte hemoglobineoplossing is een polymerisatieprodukt van HbPLP, analoog aan het produkt volgens Bonhard, maar verbeterd zoals beschreven in WO 87/07832 (Sehgal et al.). Volgens dit patent moet niet omgezet hemoglobine uit het polymerisatiemengsel worden verwijderd (ter voorkoming van negatieve effecten op de nierfunctie), hetgeen bereikt wordt middels ultrafiltratie, gelfiltratie en affiniteitschromatografie.

Een andere benadering om de verblijftijd in de circulatie te verlengen en de zuurstofaffiniteit te verlagen is intramoleculaire crosslinking. Hierdoor wordt dissociatie van tetrameer Hb in dimeren en lekkage door de nieren voorkomen. Dat crosslinken van de β-ketens de verblijftijd verlengt, is door Bunn et al. het eerst aangetoond met bis-(N-maleido-methyl)ether (J. Exp. Med. 129, 909-934 (1969)). Deze modificatie leidde echter tot een sterke verhoging van de zuurstofaffiniteit. Door Bakker et al. (Adv. Exp. Med. Biol. 180, 345-356 (1985)) is aangetoond dat middels koppeling met 2-nor-2-formylpyridoxaal 5-fosfaat (NFPLP; zie formule 1 van het formuleblad), zoals beschreven door Benesch et al.

(Biochem. Biophys. Res. Commun. 63, 1123-1129 (1975)) zowel een langere verblijftijd als een lagere zuurstofaffiniteit gerealiseerd worden. Walder et al. gebruiken diaspirine verbindingen voor de koppeling van α-globine ketens (US patents 4,598,604 en 4,600,531 (1986)). De zuurstofaffiniteit van hun koppelingsprodukt is gelijk aan die van erytrocyten en de verblijftijd in de circulatie is met een factor 3 verlengd. Bucci et al. (US patent 4,584,130 (1986)) koppelen hemoglobine intramoleculair met negatief geladen organische reagentia. Kavanaugh et al. gebruiken het bifunctionele reagens 4,4*— diisothiocyanostilbeen-2,2'-disulfonaat (Biochemistry 27, 1804-1808 (1988)). Hun koppelingsprodukt heeft een fysiologische zuurstofaffiniteit, maar wordt in geringe opbrengst verkregen.

De modificatie, die de fysiologische situatie het dichtst benaderd, is de koppeling met NFPLP of later genoemde analoge verbindingen. Dit leidde tot koppeling van de β-ketens via valine-1 van de eerste β-keten en lysine-87 van de tweede β-keten (Arnone et al., J. Mol. Biol. 115, 627-642 (1977)). Het NFPLP is covalent gebonden en is permanent aanwezig op de plaats waar 2,3-DPG in de erytrocyten de zuurstofaffiniteit beïnvloedt. Deze β-keten koppeling is het eerst beschreven door Benesch et al. in 1975 en verder uitgewerkt door Van der Plas et al. (J. Lab. Clin. Med. 108, 253-260 (1986), Transfusion 27, 425-430 (1987), Transfusion 28, 525-530 (1988)). Laatstgenoemden vonden een sterk verlaagde zuurstofaffiniteit, hetgeen onder de meest voorkomende condities een goede zuurstofafgifte garandeert. De verblijftijd in de circulatie is met een factor 3 verlengd (Bleeker et al., J. Lab. Clin. Med. 108, 448-455 (1986)). Het gecrosslinkte hemoglobine (HbNFPLP) laat echter om de volgende redenen als plasma expander met zuurstoftransportcapaciteit te wensen over: 1) de halfwaardetijd in de circulatie van de mens zal ongeveer 8 uur bedragen, terwijl 24 uur wenselijk is en 2) de zuurstoftransportcapaciteit zal niet meer dan de helft kunnen zijn van normaal bloed, omdat het vrije hemoglobine slechts in een concentratie van maximaal 6-7 g/100 ml in de circulatie aanwezig kan zijn in verband met de colloid-osmotische druk.

Volgens de uitvinding is nu gevonden, dat deze problemen opgeheven kunnen worden door het HbNFPLP te polymeriseren. De uitvinding verenigt in zich een groot aantal van eerdergenoemde verbeteringen. Gebleken is dat in plaats van nfplp ook bis-pyridoxaalpolyfosfaat verbindingen met formule 2 van het formuleblad, zoals recent door Benesch en Kwong beschreven is (Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 9-14 (1988)), als uitgangsstof voor het beschreven polymerisatieprodukt kunnen dienen. Het gemodificeerde hemoglobine volgens de uitvinding wordt kortheidshalve aangeduid met poly HbXip, waarin "Hb" op hemoglobine duidt,"ΧΙβ" op een intramoleculaire crosslinking via de β-ketens duidt (bijvoorbeeld door middel van NFPLP of door middel van bis-pyridoxaalpolyfosfaten) en "poly" aangeeft dat het intramoleculair gecrosslinkte hemoglobine gepolymeri-seerd is.

Gedetailleerde beschrijving va.n_.de.- uitvinding

Het produkt van deze uitvinding is een bloedvervangings-middel dat bestaat uit een gecrosslinkte, gepolymeriseerde, humane hemoglobineoplossing. Humaan hemoglobine is een tetrameer, dat is opgebouwd uit twee identieke a-polypeptide ketens en twee identieke β-ketens, welke niet-covalent aan elkaar gebonden zijn. De tetrameer kan snel dissociëren in twee a, β-dimeren. Dissociatie in a,a- en β,β-dimeren of in eten β-monomeren vindt onder fysiologische omstandigheden niet plaats. Om die dissociatie in a,β-dimeren en daarmee lekkage door de nieren te voorkomen, is het hemoglobine eerst zodanig gemodificeerd dat het een covalente, intramoleculaire crosslink tussen de β-ketens bevat. De modificatie komt tot stand middels een reactie van gedeoxygeneerd hemoglobine met een water-oplosbaar, bifunctioneel reagens, zoals eerder genoemd NFPLP of een van de bis-pyridoxaalpolyfosfaat verbindingen. Na het aldus gemodificeerde hemoglobine met een ionenwisselaarskolom gezuiverd te hebben, vertoont het niet alleen een toegenomen verblijftijd in dé circulatie maar ook een sterk afgenomen zuurstofaffiniteit. Door het gemodificeerde hemoglobine vervolgens te polymeriseren wordt de zuurstofaffiniteit weer gecorrigeerd naar een bijna fysiologische waarde. Bovendien neemt de verblijftijd in de circulatie van het gecrosslinkte, gepolymeriseerde hemoglobine (polyHbX^) sterk toe. Het polymeriseren gebeurt met een polymeriserend reagens, bij voorkeur glutaaraldehyde. Tijdens dit proces wordt de molecuulgewichtsverdeling geanalyseerd middels gelpermeatiechromatografie. De opeenvolgende stappen in het produktieproces zullen nu meer in detail aan de orde komen.

Het uitgangsmateriaal voor de produktie van de hier beschreven uitvinding is vers, humaan bloed, dat gescreend is op hepatitis B en HIV. Hieruit worden erytrocyten geïsoleerd door het plasma te verwijderen via centrifugatie, de leucocyten via adsorptie aan een leucocytenfilter (Cellselect, NPBI) en de trombocyten door het verwijderen van de "buffy-coat", waarna de erytrocyten nog driemaal worden gewassen met 0,9% NaCl. De gezuiverde, steriele erytrocyten zijn het uitgangsmateriaal voor het eigenlijke proces, dat in zijn geheel uitgevoerd wordt tussen 2°C en 10°C, met uitzondering van de koppeling, welke bij kamertemperatuur geschiedt. Na afloop van elke afzonderlijke stap van het produktieproces wordt het al dan niet gemodificeerde hemoglobine steeds gesteriliseerd via filtratie over een steriel 0.2 μη filter (Millipore).

De erytrocyten kunnen gelyseerd worden door toevoeging van minimaal twee volumina gedestilleerd water. Voor het scheiden van de hemoglobine en de restanten van de rode cellen (stroma) wordt cross-flow ultrafiltratie in een Pellicon systeem (Millipore) toegepast. Bij voorkeur echter, worden de erytrocyten in eenzelfde Pellicon systeem gedialyseerd tegen een hypotone, fosfaat gebufferde zoutoplossing, waardoor de rode cellen zodanig zwellen dat het hemoglobine naar buiten kan lekken. Aangezien de erytrocyten bij deze procedure nagenoeg intact blijven, zal de aldus verkregen hemoglobine-oplossing minder celdebris (membraan-fragmenten, fosfolipiden) bevatten.

De synthese van de reagentia, welke voor de specifieke intramoleculaire koppeling van het hemoglobine zorgen, is een organisch-chemische procedure, die in het geval van NFPLP uit vijf stappen bestaat, waarbij wordt uitgegaan van pyridoxaal-hydrochloride. In de eerste stap wordt het N-atoom van dit molecuul geoxideerd, terwijl in de tweede stap omlegging van het zuurstof naar de nabijgelegen methylgroep plaatsvindt. In de derde stap wordt de aldus verkregen alcohol tot een aldehyde geoxideerd. In de vierde stap worden de beide aldehydegroepen gekoppeld met toluidine tot het 2-nor-2-formylpyridoxaal-bistoluidine. Dit levert bescherming van de aldehydegroepen in de laatste, vijfde stap van de synthese, de fosforylering van de methylalcoholgroep van het molecuul met polyfosforzuur. Na afsplitsing van de toluidinegroepen door hydrolyse wordt het ontstane NFPLP met behulp van een kationenwisselaarskolom gescheiden van anorganisch fosfaat.

Voor de synthese van bispyridoxaalpolyfosfaten wordt eerst het tetrabutylammoniumzout (TBA) van PLP in reactie gebracht met difenylfosfochloridaat (DPPC, Aldrich). Aan het ruwe reactieprodukt wordt het TBA-zout van het gewenste fosfaat toegevoegd. Het reactiemengsel wordt gescheiden op een anionwisselaarskolom (Dowexl~X8), met een gradiënt van 0 tot 0,2 molair LiCl in een 0,01 molair HC1 oplossing als 1oopmiddel.

Het stroma-vrije hemoglobine wordt gekoppeld met NFPLP of een bis-pyridoxaalpolyfosfaat verbinding in een molaire ratio variërend van 1:1 tot 1:2. De koppelingsreactie vindt plaats in een tris-hydrochloride buffer met een eindconcentratie van ongeveer 0,1 molair en een pH van ongeveer 7,0. De hemo-globineoplossing wordt eerst volledig gedeoxygeneerd, hetgeen kan geschieden in een roterende fles, waar stikstof of een ander inert gas wordt ingeleid. Bij voorkeur echter, wordt er gebruik gemaakt van een gas exchanger (Endotronics), waarbij het rondpompen van de hemoglobine door slangen geschiedt, die nagenoeg impermeabel zijn voor zuurstof (Tygon). Door een overmaat van een reducerend reagens, bij voorkeur natrium boorhydride (Merck), aan het koppelingsmengsel toe te voegen, wordt de crosslink irreversibel en de binding covalent. Een typisch voorbeeld van een analyse van een koppelingsmengsel met behulp van ionenwisselaarschromatografie (MonoQ,

Pharmacia) is in figuur la weergegeven. Het gekoppelde hemoglobine wordt in het Pellicon systeem tegen een tris-hydrochloride buffer met een concentratie van ongeveer 0,1 molair en een pH van ongeveer 8,3 gedialyseerd om de overmaat reagentia te verwijderen en de juiste omstandigheden te creëren voor de volgende stap in het proces, de zuivering.

Het gekoppelde hemoglobine (HbX^) wordt gezuiverd met ionenwisselaarschromatografie. Op een kolom gevuld met anionenwisselaar van het tertiair amine type, bij voorkeur diethylaminoethyl-A50, diethylaminoethyl-Sephacel of diethylaminoethyl-Sepharose (Pharmacia) wordt HbXlp gescheiden van ongekoppeld hemoglobine met behulp van een lineaire zoutgradient, waarmee de kolom geëlueerd wordt. De zout-gradient bestaat uit een oplopende concentratie van natrium-chloride van 0 tot ongeveer 0,1 molair in de genoemde tris buffer me een pH van 8,3. Detectie van hemoglobine gebeurt spectrofotometrisch in een doorstroomcuvet. Het gezuiverde HbXlp wordt afzonderlijk van het andere eluaat opgevangen via een automatisch aangestuurde kraan (Pharmacia). Een typisch voorbeeld van een analyse van het gezuiverde HbXip is in figuur 1b weergegeven. Door deze zuiveringsstap is er een eenduidig produkt verkregen en vindt er in het produkt tevens een aanzienlijke reductie plaats van mogelijk toxische stoffen, zoals membraanfragmenten van de erytrocyt, endotoxine en virale antigenen, voor zover deze aanwezig zijn in het stroma-vrije hemoglobine.

Vervolgens wordt het gezuiverde HbXip gepolymeriseerd met bij voorkeur glutaaraldehyde (Sigma), hetgeen plaatsvindt met behulp van een nierdialyse filter (Andante, Organon Tecknika). Een dergelijk filter bestaat uit een groot aantal "hollow fibers" van een semi-permeabel membraan, waardoor kleine moleculen, zoals water, zouten en ook glutaaraldehyde, vrij heen en weer kunnen migreren, terwijl grote moleculen, zoals hemoglobine, dat niet kunnen. Zo wordt de mogelijkheid geschapen om de snelheid van de polymerisatiereaktie in de hand te houden, doordat het glutaaraldehyde in kleine porties geleidelijk aan het hemoglobine toegevoegd kan worden. De tijdsduur van de reaktie en de hoeveelheid toegevoegd glutaaraldehyde is afhankelijk van de hoeveelheid HbXip en de gewenste molecuulgewichtsverdeling van het eindprodukt. Het polymeriseren levert een mengsel van produkten op dat geanalyseerd kan worden met gelpermeatiechromatografie (Superose 12, Pharmacia). Met een dergelijke analysemethode kan het mengsel gescheiden worden in mono-, di-, tri-, tetra-en polymeren. De verhouding van deze verschillende polymeren in het eindprodukt is afhankelijk van de duur en de snelheid van de reaktie. Zo kan het mengsel in de volgende verhoudingen variëren (percentages van het totaal):

üiteindelijk zal het hele mengsel uit grote polymeren bestaan, tenzij de reactie tijdig wordt gestopt. Dit kan geschieden door een overmaat lysine aan het reactiemengsel toe te voegen, waardoor de nog aanwezige vrije aldehyd-groepen worden geblokkeerd en de polymerisatie stopt. Door nu een reducerend reagens, bij voorkeur natrium boorhydride, toe te voegen worden de crosslinks covalent. Zo kan een stabiel eindprodukt worden verkregen. Bij de bepaling van de optimale polymerisatiegraad van het eindprodukt (poly-HbXip) moet rekening gehouden worden met de verblijftijd in de circulatie, maar ook met de effecten van het polymeriseren op de colloid-osmotische druk en viscositeit van polyHbXlp. Bij een gelijke Hb-concentratie zal met een toenemende polymerisatiegraad de colloid-osmotische druk afnemen, de viscositeit echter zal toenemen. In figuur 2 is een typisch voorbeeld van een gelfiltratiepatroon van polyHbXip gegeven. Het eindprodukt bestaat bij voorkeur voor ongeveer 10% uit polymeren, voor 40% uit tetra-/tri-meren, voor 20% uit dimeren en voor 30% uit monomeren. Een dergelijke polymerisatiegraad zorgt ervoor, dat de verblijftijd van polyHbX^ in de circulatie van ratten ongeveer met een factor 7 verlengd wordt vergeleken met ongemodificeerd hemoglobine. De colloid-osmotische druk is dan zodanig verlaagd dat onder fysiologische omstandigheden een concentratie van 10 g/100 ml mogelijk is en de viscositeit stijgt slechts licht tot een waarde vergelijkbaar met die van plasma (zie figuur 3 en 4) . Het molecuulgewicht van monomeer Hb is 68 kD; de verschillende polymeren zijn daar een veelvoud van. De polymeerfractie elueert met het void volume van de kolom, welke routinematig gebruikt wordt voor de gelfiltratie analyses. Uit analyses op kolommen met een ander bereik in scheidend vermogen is gebleken dat het molecuulgewicht van de polymeerfractie van polyHbXip tussen de 300 en 600 kD ligt. Uit de verhouding van de verschillende polymeren in polyHbXip kan i het gemiddeld molecuulgewicht van het eindprodukt afgeleid worden en zal ongeveer liggen tussen 160 en 270 kD, in het bijzonder tussen de 160 en 220 kD, hoewel het gemiddelde molecuulgewicht mag variëren van 140 tot 380 kD. Het gemiddeld polymeer in polyHbXip heeft dus een grootte, die tussen dimeer en trimeer in ligt. De monomeerfractie in het eindprodukt bedraagt 30%, maar hoeft er niet uit verwijderd te worden, aangezien het hemoglobine intramoleculair gekoppeld is en zodoende niet nefrotoxisch is.

Voordelen yan_<fe, .vityinding

De alhier beschreven uitvinding heeft de volgende voordelen ten opzichte van bestaande produkten: 1) Een eerste voordeel betreft het tussenprodukt HbXip.

Dit wordt verkregen door éénduidige koppeling van een dialdehyde aan beide β-ketens van Hb. HbXip wordt gevormd met een opbrengst van minstens 70% en kan door een enkele zuiveringsstap met een ionenwisselaar gescheiden worden van niet omgezet, nefrotoxisch Hb. Koppeling van Hb met PLP levert 4-6 produkten op, waarvan slechts 25% hoofdprodukt.

2) PolyHbXip is een mengsel van polymeren dat ook nog niet-gepolymeriseerd HbXip bevat. Een belangrijk voordeel is dat dit laatste niet verwijderd hoeft te worden. Hbxlp kan namelijk door de intramoleculaire crosslink niet in dimeren dissociëren, zodat het niet door de nier gefiltreerd wordt en geen aanleiding geeft tot nefrotoxiciteit. Dit is in tegenstelling tot bijvoorbeeld polyHbPLP, waarvan het niet-gepolymeriseerde HbPLP wel nefrotoxisch is, zodat het noodzakelijk is om dit zorgvuldig te verwijderen via ingewikkelde zuiveringsstappen. Door dit gegeven zal het produktieproces van polyHbNFPLP eenvoudiger zijn en het rendement dus hoger.

3) De zuurstofaffiniteit van polyHbXlp is lager dan die van polyHbPLP (Sehgal), zodat in vivo een betere zuurstof-afgifte moet kunnen plaatsvinden.

4) Voor de bereiding wordt uitgegaan van humane erytrocytensuspensies, die door filtratie en centrifugeren gezuiverd worden van leukocyten, trombocyten en plasma-eiwitten, waardoor verontreiniging met metabolieten en andere stoffen uit deze fracties vermeden wordt.

5) De stromaverwijdering uit de hemoglobineoplossingen wordt gemeten aan de hand van het fosfolipidegehalte en het membraan-antigeen glycoforine-α. Het fosfolipidegehalte is lager dan 4 μg/g Hb (erytrocyten: 9 mg/g Hb) . De hoeveelheid glycophorine-α is minder dan 0,01% van wat in erytrocyten aanwezig is.

6) PolyHbXip kan bereid worden in de volgende verhouding: 30% monomeer, 20% dimeer, 40% tri-/tetrameer en 10% polymeer. Dan heeft genoemde oplossing een iso-oncotische hemoglobine-concentratie van 10 g/100 ml en een relatieve viscositeit lager dan 2 ten opzichte van water. Voor polyHbPLP is door Bonhard beschreven dat een hemoglobinegehalte van maximaal 8 g/100 ml te behalen is, terwijl het produkt van Sehgal reeds bij 8 g/100 ml een viscositeit van 3 cp bezit.

7) Er is reeds een goed inzicht in de afbraak van HbNFPLP, hetgeen voor de inschatting van mogelijke bijwerkingen van belang is. Gebleken is dat er geen stapeling van HbNFPLP in lever of nieren plaatsvindt (Bleeker et al., J.

Lab. Clin. Med, 113, 151-161 (1989)). Er is aangetoond dat het koppelingsmolecuul, NFPLP, in 8 dagen hoofdzakelijk in urine en faeces is uitgescheiden.

8) Door een aantal maatregelen en stappen in het produktieproces wordt eventuele contaminatie met virussen vrijwel uitgesloten: onder meer door het screenen van donoren, toepassing van leucocytenfiltratie en ionenwisselaarschroma tografie van het koppelingsmengsel.

ygccfreeldsn

De uitvinding zal nu aan de hand van de volgende voorbeelden verder worden toegelicht. Het is echter van belang in te zien dat deze voorbeelden voor illustratieve doeleinden gegeven worden en de nawerkbaarheid van de uitvinding belichten, maar geenszins de definitieve condities van de verschillende stappen van het produktieproces inhouden en de volledige scope van de uitvinding behelzen. Alle handelingen worden verricht onder steriele condities (GMP-normen) en alle produktiestappen worden uitgevoerd bij ongeveer 5°C en onder atmosferische druk, uitgezonderd de koppelingsreaktie, die bij kamertemperatuur wordt gedaan.

VQQriaséld,.!

PPlgfeKEgliE

A. Bereiding van een stroma-vrije hemoglobineoplossing

Vers humaan bloed wordt ontdaan van plasma via centrifugatie, van leucocyten via een leucocytenfilter en van thrombocyten door verwijdering van de buffy-coat. De eenheden rode bloedcellen worden driemaal gewassen in steriele plastic zakken met 0,5 liter 0,9% NaCl en gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 3200 rpm. De gewassen erytrocyten ("packed cells") van 8 eenheden worden gepoold en gesuspendeerd in 4 volumina van een met 0,01 molair fosfaat gebufferde 0,1 molair NaCl oplossing, hetgeen resulteert in een 6-8 liter suspensie met een hematocriet van 20-30%. Deze suspensie wordt in het Pellicon systeem, voorzien van een 0,45 μπι cut-off HVLP-cassette (Millipore), gedialyseerd eerst tegen ongeveer 5 liter van de fosfaat gebufferde 0,1 molair NaCl oplossing en vervolgens tegen een fosfaat gebufferde 0,05 molair NaCl oplossing. Wanneer het hemoglobine uit de cellen begint te lekken, wordt het filtraat opgevangen. Gewoonlijk wordt ongeveer 15 tot 20 liter filtraat verzameld en daarna geconcentreerd in hetzelfde Pellicon systeem maar nu voorzien van een 10.000 dalton cut-off PTGC-cassette. Het ultrafiltraat heeft dan een hemoglobineconcentratie van 10 tot 20 g/100 ml en wordt via filtratie gesteriliseerd. De opbrengst aan stroma-vrije hemoglobineoplossing bedraagt 80-90% en het methemoglobinegehalte is lager dan 1%. Het fosfolipidgehalte in de hemoglobineoplossing is lager dan 4 μg/g Hb.

B. Synthese van NFPLP

Dit is een 5-staps-synthese, waarbij men uitgaat van pyridoxaalhydrochloride (Merck).

1. De synthese van het N-oxide.

a. 200 g pyridoxaalhydrochloride wordt opgelost in 2 1 ethanol (96%) en aan de kook gebracht. Na 1 uur refluxen wordt de oplossing gekoeld en wordt een equivalent natriumbicarbonaat (84 g) voorzichtig toegevoegd. De oplossing wordt 30 minuten onder refluxen gekookt. Het zoutneerslag wordt gefiltreerd over "Celite Hyflo-Super-Cel" (hyflo, Merck) en gespoeld met een kleine hoeveelheid ethanol (96%). De ethanolische oplossing wordt verder gebruikt voor reactie b.

b. De oplossing van de pyridoxaalethylacetaal wordt gekoeld tot -30°C met CC>2/aceton. Gedurende een half uur wordt onder roeren een oplossing van 345 g methachloorperbenzoëzuur (Aldrich) in 1 1 ethanol (-10°C) toegevoegd. Het lichtgele reactiemengsel wordt gedurende 40 uur bij -30°C weggezet. Het N-oxide kristalliseert uit in witte kristallen, wordt afgefiltreerd en gewassen met ether.

2. De omlegging van het N-oxide.

a. 35 g N-oxide en 100 g trifulorazijnzuuranhydride (Aldrich) worden gekoeld tot -30°C. Het trifluorazijnzuur wordt langzaam op het vaste N-oxide gedruppeld en de suspensie wordt gedurende 12-24 uur bij kamertemperatuur geroerd. Daarna wordt de donkerrode oplossing gehydrolyseerd met 40 ml 2 molair HC1 en 1 uur gerefluxed.

b. Na indampen wordt het residu in een minimale hoeveelheid methanol opgelost en wordt tetrahydrofuraan (THF) toegevoegd totdat de oplossing troebel wordt. Kristallisatie gebeurt overnacht bij -30°C.

3. De oxydatie met bruinsteen.

6 Gram van het HCl-zout wordt opgelost in een mengsel van 50 ml methanol en 200 ml THF. 25 Gram geactiveerde mangaandioxide (Merck) wordt toegevoegd en het mengsel wordt 12-24 uur geroerd bij kamertemperatuur. De reactie wordt gevolgd met dunnelaag chromatografie (TLC, Merck) met een loopmiddel van chloroform/methanol (95/5). Het bruinsteen en het ontstane mangaanchloride worden gefiltreerd over hyflo en gewassen met methanol. Aan het filtraat wordt kiezelgel toegevoegd en daarna ingedampt. De kiezelgel wordt geelueerd met achtereenvolgens 800 ml chloroform en 500 ml chloroform/-methanol 97,5/2,5. De oplossing wordt ingedampt.

4. De bereiding 2-nor-2-formylpyridoxal-bistoluidine.

4 Gram 2-nor-2-formylpyridoxaal wordt gehydrolyseerd in kokend water tot het vrije dialdehyde. De reactie wordt gevolgd met TLC. De oplossing wordt langzaam in een oplossing van 6,6 g p-toluidine (Merck) in 100 ml methanol gegoten en gekookt onder refluxen tot de oplossing troebel wordt.· Na afkoeling tot kamertemperatuur wordt de oplossing overnacht bij +4°C gezet. Het oranje neerslag dat ontstaat, wordt afgefiltreerd en gewassen met koude droge ether.

5. De fosforylering.

Polyfosforzuur (PPA) wordt gemaakt uit een mengsel van 10 g P2O5 en 13 g H3PO4. 15 ml PPA wordt toegevoegd aan 1,5 g bistoluidine. Het reactiemengsel wordt gedurende 1 uur bij 60°C geroerd, afgesloten van lucht. Daarna wordt er 7,5 ml 0,1 N HC1 toegevoegd. Dit reactiemengsel wordt gedurende 15 min. geroerd bij 60°C. Het donkerpaarse mengsel wordt op een kolom gebracht, gevuld met een kationenwisselaar (Biorad 50Wx80; H-vorm, 200-300 mesh) en geelueerd met gedestilleerd water. Het eluaat wordt opgevangen in 10 ml fracties.

Met de Molybdaat test (W.C.Hulsman, thesis 1958,

Amsterdam) wordt gemeten welke fracties vrij fosforzuur bevatten. De fracties, die organisch fosfaat bevatten (A415 in 1M fosfaatbuffer (pH=7) in 1:100 verdunning > 0.1 absorptie eenheid) worden gepoold. Het NFPLP wordt als pool in het donker bij +4°C bewaard.

C. Koppeling van NFPLP aan het stroma-vrije hemoglobine

De stroma-vrije hemoglobineoplossing wordt in het Pellicon systeem gedialyseerd tegen 10 volumina van 0,1 molair tris-hydrochloride oplossing met een pH van 7,0. Gewoonlijk wordt ongeveer 1 liter 10 g/100 ml hemoglobine gekopppeld, maar het volume is eenvoudig op te schalen. De hemoglobineoplossing met een pH variërend van 6,9 tot 7,1 wordt gedeoxygeneerd met behulp van een membraan gas exchanger, waar stikstofgas doorheen wordt geleid met een snelheid van 2 1/min. De hemoglobineoplossing wordt door de gas exhanger gepompt vanuit een gesloten reservoir met een snelheid van 0,5 1/min (Sarns pomp). Binnen 1 uur is de zuurstof verwijderd, hetgeen gecontroleerd wordt aan de hand van een zuurstofsaturatie meting (lager dan 5%, gemeten met multicomponent analyse op een diode array speetrofotometer (Hewlitt-Packard)). De hemoglobine kan eventueel ook gedeoxygeneerd worden in een afgesloten, roterende fles met een volume van 10 liter,waar stikstof ingeleid wordt. Deze procedure levert hetzelfde resultaat op wat betreft het gehalte aan deoxyHb, maar duurt drie tot vijfmaal zolang.

Aan de gedeoxygeneerde hemoglobineoplossing in het reservoir wordt langzaam een gedeoxygeneerde, waterige oplossing van NFPLP toegevoegd. De molaire ratio ten opzichte van hemoglobine kan variëren van 1:1 tot 2:1. Meestal wordt een kleine overmaat van NFPLP toegevoegd. De reactieduur is minimaal 1 uur. Daarna wordt een 20-voudige overmaat van natrium boorhydride bij het koppelingsmengsel gedaan. Het natrium boorhydride is opgelost in 30 tot 50 ml van een 0,001-molair KOH-oplossing, die ook gedeoxygeneerd wordt. Aangezien er in het reservoir ook stikstof ingeleid kan worden, levert de gasvorming, die optreedt bij de reductie, geen probleem op en wordt dus samen met de stikstof afgevoerd. Na afloop van de reactie wordt de overmaat reagentia verwijderd door dialyse en het koppelingsmengsel via filtratie gesteriliseerd. De maximale opbrengst aan gekoppeld hemoglobine bedraagt 60 tot 70%, hetgeen bepaald kan worden met de integratie van de pieken van een chromatogram, dat verkregen wordt bij een FPLC analyse van het mengsel op een ionenwisselaarskolom (zie figuur la). Met toenemende zoutconcentratie wordt eerst Hb en vervolgens HbNFPLP van de kolom geelueerd.

D Zuivering van HbNFPLP

Het koppelingsmengsel wordt na afloop van de reactie gedialyseerd tegen 10 volumina van de startbuffer van de ionenwisselaars-chromatografie, een 0,1 molair tris-hydrochloride buffer met een pH van 8,3. Een kolom van 25 bij 5 cm wordt gevuld met diethylamino-ethyl-Sephacel in startbuffer en geelueerd met minimaal 5 kolomvolumina van die startbuffer met een snelheid van 2 ml/min (Cenco pomp). Vervolgens wordt 200 ml van het koppelingsmengsel van maximaal 10 g/100 ml op de kolom gebracht en daarna met minimaal 1 kolomvolume startbuffer geelueerd. De kolom wordt dan geelueerd met een gradiënt van 0 tot 0,1 molair NaCl in ongeveer 3 liter startbuffer. Analyse van de verschillende fracties vindt spectrófotometrisch plaats via een doorstroomcuvet bij 540 nm. De verschillende fracties (ongekoppeld Hb en HbNFPLP) kunnen via een automatisch aangestuurde kraan apart van het overige eluaat worden opgevangen. Het gezuiverde HbNFPLP wordt geconcentreerd in het Pellicon systeem (PTGC cassette) en via filtratie gesteriliseerd. Analyse van het gezuiverde produkt geschiedt met FPLC-ionenwisselaarschromatografie (zie figuur lb). Het aldus verkregen HbNFPLP is voor meer dan 95% zuiver. De opbrengst aan HbNFPLP na deze kolomzuivering bedraagt 40 tot 50% van het koppelingsmengsel en dat komt overeen met 70 tot 80% van het gekoppelde produkt.

E. Polymerisatie van HbNFPLP

Het gezuiverde HbNFPLP wordt gepolymeriseerd met behulp van een nierdialyse filter. De HbNFPLP oplossing wordt door de kunstnier gepompt vanuit een reservoir met een snelheid van 0,3 1/min, terwijl als dialysaat fosfaat gebufferde NaCl oplossing (PBS) met een snelheid van 0,5 1/min wordt rondgepompt (Sarns pompen). Aan het dialysaat wordt stapsgewijs steeds 1 ml 25% glutaaraldehyde toegevoegd en de snelheid van de polymerisatiereactie wordt gevolgd aan de hand van gelfiltratie-analyses. De hoeveelheid glutaaraldehyde, die nodig is om een bepaalde polymerisatiegraad te bereiken, is afhankelijk van de hoeveelheid en de concentratie van de gebruikte HbNFPLP oplossing. Een typisch voorbeeld van een gelfiltratie-analyse van een eindprodukt is weergegeven in figuur 2. Het eindprodukt bestaat in dit geval uit 10% polymeer, 40% tetra/trimeer, 20% dimeer en 30% monomeer, hetgeen de gewenste verhouding is, maar in principe is de polymerisatiegraad afhankelijk van de reactieduur. Uitgaande van een 0,5 liter 5 g/100 ml HbNFPLP is minimaal 5 ml 25% glutaaraldehyde nodig om een dergelijk eindstadium als in figuur 2 binnen een redelijke tijdsduur (enkele uren) te bereiken. Er wordt dan per mol hemoglobine minimaal 8 mol glutaaraldehyde toegevoegd. De reactie kan gestopt worden door ten opzichte van glutaaraldehyde een 10-voudige overmaat van een 1 molair lysine oplossing met een pH van ongeveer 7,0 aan het reservoir toe te voegen. Tevens wordt het dialysaat eruit gepompt en vervangen door nieuwe PBS. Hierna wordt de dialyse enkele uren voortgezet en kan het polyHbNFPLP door enige malen het dialysaat te vervangen in iedere gewenste buffer gebracht worden, voor wisseltransfusies bij voorkeur in nier-dialysebuffer. Om te voorkomen dat het aldus geproduceerde polyHbNFPLP soms langzaam verder polymeriseert in de daaropvolgende maanden, is het aan te raden om na het stoppen van de polymerisatiereactie met lysine ook nog een ten opzichte van glutaaraldehyde equimolaire hoeveelheid natrium boorhydride aan het polymerisatiemengsel toe te voegen, zodat er sprake kan zijn van een stabiel eindprodukt. Na dialyse wordt het polyHbNFPLP eventueel geconcentreerd en door filtratie gesteriliseerd. De opbrengst van de polymerisatie-reaktie bedraagt vrijwel 100% en het methemoglobinegehalte in het eindprodukt is lager dan 5% (multicomponent analyse). Het fosfolipidgehalte wordt bepaald door fosfolipiden te extraheren uit de polyHbNFPLP oplossing met behulp van chloroform en methanol. Het extract wordt behandeld met perchloorzuur en het vrijgekomen fosfaat vormt een komplex met aromoniummolybdaat en malachietgroen (Merck), waarvan de absorptie bij 630 nm wordt gemeten. Het gehalte in het eindprodukt is minder dan 1 μg/g Hb, hetgeen nog een reductie met een factor 4 ten opzichte van de stroma-vrije hemoglobine-oplossing betekent. De hoeveelheid glycophorine-α in het eindprodukt ligt beneden de detectiegrens van de bepaling voor dit erytrocytmembraanantigeen (radioimmunoassay met monoklonaal antilichaam), hetgeen een waarde weerspiegelt, die lager ligt dan 0,01% van wat in erytrocyten aanwezig is. Het endotoxinegehalte wordt bepaald met de Limulus test (Bleeker et al., in Progress in Clinical and Biological Research, vol. 189: Bacterial Endotoxins, 293-302 (1985), eds. ten Cate et al.) en is voor polyHbNFPLP lager dan 2 EU/g Hb.

F Biofysische karakterisering van polyHbNFPLP

Polymerisatie beïnvloedt enkele eigenschappen van de hemoglobineoplossing, die belangrijk zijn bij het gebruik als bloedvervangingsmiddel: de colloid-osmotische druk, de viscositeit en de zuurstofaffiniteit.

1. Colloid-osmotische druk

Bij verdergaande polymerisatie daalt de colloid-osmotische druk, die de oplossing kan veroorzaken. Figuur 3a laat het verband zien tussen de concentratie en de colloid-osmotische druk voor verschillende hemoglobineoplossingen. De colloid-osmotische druk is bepaald met een druktransducer (Statham P23Db) over een ultrafilter membraan. De concentratie is fotometrisch bepaald. De horizontale stippellijn geeft de colloid-osmotische druk van humaan plasma aan. Zo valt te zien dat de iso-oncotische concentratie (dat is de concentratie, waarbij de oplossing dezelfde colloid-osmotische druk heeft als plasma) van ongemodificeerd hemoglobine (Hb) 7 g/100 ml bedraagt. Door polymerisatie wordt de iso-oncotische concen tratie verhoogd tot ongeveer 9 g/100 ml voor polyHbNFPLP zonder grote polymeren en tot ongeveer 11 g/100 ml voor polyHbNFPLP waarin 45% grotere polymeren ontstaan zijn. Deze hogere iso-oncotische concentratie betekent dat bij transfusie een hogere plasmaconcentratie bereikt kan worden zonder risico van overvulling van het vaatstelsel.

2. Viscositeit

Figuur 3b laat voor dezelfde hemoglobineoplossingen het verband tussen concentratie en viscositeit zien. De relatieve viscositeit is gemeten met een Ostwald viscosimeter. Deze grafiek laat de keerzijde van het polymeriseren zien: de verhoging van de viscositeit. Bij een lage polymerisatiegraad (polyHbNFPLP 0,40,20,40) is deze verhoging echter nog zo gering dat de relatieve viscositeit bij de 9 g/100 ml 1,5 bedraagt en dus nog altijd lager dan die van plasma is. Bij hogere polymerisatiegraad (polyHbNFPLP 45,30,10,15) is bij 11 g/100 ml een relatieve viscositeit van 4 gevonden, een waarde die gelijk is aan die voor vol bloed. Dit betekent dat de viscositeit van polyHbNFPLP acceptabel blijft, als niet verder gepolymeriseerd wordt dan tot 45% polymeren (molecuul-gewicht tussen 300 en 600 kD).

3. Zuurstof-affiniteit

De zuurstofbindende eigenschappen zijn onderzocht met een zuurstof-dissociatiecurve analyser (DCA, Radiometer), onder fysiologische condities van pH, pC02 en temperatuur. Figuur 4 toont de metingen van ongemodificeerd hemoglobine (Hb),

HbNFPLP en polyHbNFPLP. Het 50% verzadigingspunt, de p50 van polyHbNFPLP ligt bij een p02 van 22 mm Hg en is daarmee vrijwel gelijk aan de p50 van vol bloed (26 mm Hg). Er is een duidelijke verbetering ten opzichte van de ongemodificeerde hemoglobineoplossing (p50:14 mm Hg) en HbNFPLP (p50:45 mm Hg) opgetreden.

G In-vivo karakteristieken van polyHbNFPLP

1. Verblijftijd in circulatie

De verblijftijd in de circulatie is onderzocht in ratten na vervanging van 50% van het bloed door een hemoglobine- oplossing. Figuur 5 toont de plasmaverdwijncurve van poly-HbNFPLP met 30-40% polymeren, in vergelijking met die van een ongemodificeerde hemoglobineoplossing (Hb) en een hemoglobine-oplossing gemodificeerd door alleen intramoleculaire crosslinking met NFPLP. Het moment, waarop de plasma concentratie gehalveerd is (T50%), ligt voor Hb op ongeveer 2 uur. Intramoleculaire crosslinking verbetert de T50% met een factor 3. Na polymerisatie is de T50% toegenomen met een factor 7 ten opzichte van Hb. Op grond van literatuurgegevens over onderzoek met verschillende hemoglobineoplossingen in verschillende proefdieren, waaronder apen, wordt voor polyHbNFPLP in de mens een verblijftijd van meer dan 24 uur verwacht.

2.Toxiciteit voor de nier

Na vervanging van 50% van het bloedvolume door een hemoglobineoplossing bij ratten wordt 40% van de toegediende dosis uitgescheiden in de urine. Histochemisch onderzoek toont hierbij een sterke accumulatie van hemoglobine in de nieren aan, een duidelijke aanwijzing voor beperking van de nierfunctie. Na intramoleculaire crosslinking van de β-ketens wordt minder dan 5% van de dosis in de urine uitgescheiden, terwijl histochemisch onderzoek slechts minimale accumulatie van HbNFPLP laat zien. Het optreden van een nierfunctiestoornis door ΗΟΧίβ is daarom onwaarschijnlijk. Na een wisseltransfusie met polyHbNFPLP is hemoglobine noch in de urine, noch in de nieren zelf detecteerbaar. Een nierfunctiestoornis door intrarenale neerslagen van polyHbNFPLP is hiermee uitgesloten.

Voorbeeld 2 polyHb (.b.isPLJ Pa

De bereiding van polyHb(bisPL)P2 verloopt identiek aan die van polyHbNFPLP , zoals beschreven in voorbeeld 1, met uitzondering van de synthese van het koppelingsmolecuul. De karakteristieken van het eindprodukt (polyHb(bisPL)P2) zijn eveneens vrijwel identiek aan die van polyHbNFPLP. De synthese van (bisPL)P2 verloopt als volgt:

Na reactie van 0,002 mol PLP met 0,0025 mol DPPC wordt 0,004 mol PLP-TBA in 10 ml droge pyridine daaraan toegevoegd. Het reactiemengsel wordt na 1 nacht staan op een ionenwisselaarskolom gebracht en geelueerd met 0.01 molair HC1. (BisPL)P2 komt als eerste fractie van de kolom, gevolgd door PLP. Na neutralisatie wordt de fractie ingedampt; opbrengst 350 mg produkt (30%). UV-spectrum: maxima bij 294 en 335 nm in 0.1 molair HC1, 330 (s) en 391 nm in fosfaat buffer met een pH van 7, 308 en 391 nm in 0.1 molair NaOH.

Beschrijving van de figuren

Figuur 1

Chromatogrammen, verkregen me een anionenwisselaarskolom (MonoQ). Linker chromatogram (figuur la): mengsel van Hb (linker piek) en HbNFPLP (rechter piek) dat verkregen wordt na de koppelingsreactie van Hb met NFPLP. Rechter chromatogram (figuur lb): gezuiverd hoofdprodukt (HbNFPLP) uit het koppelingsmengsel.

Figuur 2

Polymeersamenstelling van polyHbNFPLP, bepaald met gelfiltratie over een Superose 12 kolom. Het elutiepatroon laat de volgende pieken zien: I - polymeren groter dan tetra-meer, II - tetrameren, III - trimeren, IV - dimeren, V - monomeren.

Figuur 3

Bovenste grafiek (figuur 3a): relatie tussen concentratie en colloid-osmotische druk van een ongemodificeerde hemoglobineoplossing (Hb) en een drietal, in verschillende mate gepolymeriseerde oplossingen van polyHbNFPLP. Van de polyHbNFPLP oplossingen is de polymeersamenstelling in procenten aangegeven (po: polymeren, t/t: tetra-/trimeren, di: dimeren, mo: monomeren). De horizontale stippellijn geeft de colloid-osmotische druk van humaan plasma aan.

Onderste grafiek (figuur 3b): relatie tussen concentratie en viscositeit van dezelfde hemoglobineoplossingen.

Figuur 4

Zuurstofdissociatie-curves, gemeten onder fysiologische condities van pH, pCC>2 en temperatuur, van een ongemodificeerde hemoglobineoplossing (Hb), HbNFPLP en polyHbNFPLP.

Figuur 5

Plasmaverdwijncurves van vrij hemoglobine in ratten na vervanging van 50% van het bloedvolume door: 1 - ongemodificeerd hemoglobine (Hb, n=5), 2 - HbNFPLP (n=3) en 3-polyHbNFPLP (n=3).

Claims (12)

1. Een in essentie stroma-vrij hemoglobine-preparaat, dat een intramoleculair via de β-ketens gecrosslinkt, gepolymeriseerd humaan hemoglobine omvat.

2. Hemoglobine-preparaat volgens conclusie 1, waarin het hemoglobine intramoleculair via de β-ketens gecrosslinkt is door een pyridoxaal 5-fosfaat derivaat met 2 aldehyde groepen.

3. Hemoglobine-preparaat volgens conclusie 1, waarin het hemoglobine intramoleculair via de β-ketens gecrosslinkt is door 2-nor-2-formylpyridoxaal 5-fosfaat met formule 1.

4. Hemoglobine-preparaat volgens conclusie 1, waarin het hemoglobine intramoleculair via de β-ketens gecrosslinkt is door een bis-pyridoxaalpolyfosfaat met formule 2, waarin R een zuurstofatoom, een orthofosfaatgroep, een pyrofosfaatgroep, een difosfaatrest, of een difosfonaatrest voorstelt.

5. Hemoglobine-preparaat volgens conclusie 1, waarin het hemoglobine gepolymeriseerd is met behulp van glutaaraldehyde.

6. Hemoglobine-preparaat volgens conclusie 1, waarin het hemoglobine gepolymeriseerdis tot een gemiddeld molecuulgewicht tussen 140 en 380 kD, bij voorkeur tussen 160 en 270 kD.

7. Hemoglobine-preparaat volgens conclusie 1, waarin het hemoglobine gepolymeriseerd is tot een mengsel, dat voor ten minste 40 %, bij voorkeur ten minste 50 % uit di-, tri- en tetrameren bestaat.

8. Hemoglobine-preparaat volgens conclusie 1, waarin tot ten hoogste 40 % van het hemoglobine als monomeer aanwezig is, maar in essentie geen dissocieerbaar monomeer aanwezig is.

9. Hemoglobine-preparaat volgens conclusie 1, gekenmerkt door een iso-oncotische hemoglobineconcentratie van groter dan 9 g/100 ml en een relatieve viscositeit van lager dan 4, bij voorkeur lager dan 2,5.

10. Hemoglobine-preparaat volgens conclusie 1, gekenmerkt door een zuurstofaffiniteit welke beantwoordt aan een p50 waarde van 19-24 mm Hg.

11. Hemoglobine-preparaat volgens conclusie 1 in de vorm van een farmaceutisch aanvaardbare oplossing of in de vorm van een gevriesdroogd preparaat.

12. Gebruik van een hemoglobine-preparaat volgens een der voorgaande conclusies als bloedvervangingsmiddel of bloedplasma expander, bijvoorbeeld in gevallen van anemie of van ernstig bloedverlies, alsmede als zuurstofdrager voor extracorporale circulatie, voor orgaanperfusie of voor weefselkweekdoeleinden.