JP3410128B2 - 組換えｄｎａを有するシュードモナス属菌及びそれを用いるリパーゼの製造法 - Google Patents
組換えｄｎａを有するシュードモナス属菌及びそれを用いるリパーゼの製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はリパーゼ遺伝子、リパー
ゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ、それを含むシュードモナ
ス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法に関する。
ゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ、それを含むシュードモナ
ス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法に関する。
【０００２】リパーゼは脂質を加水分解する酵素で、医
薬、食品の分野のみならず、油脂の加工、臨床診断薬、
洗剤、有機化合物の不斉合成及び分解等の医薬、食品以
外の工業分野でも広く利用されている。
薬、食品の分野のみならず、油脂の加工、臨床診断薬、
洗剤、有機化合物の不斉合成及び分解等の医薬、食品以
外の工業分野でも広く利用されている。
【０００３】
【従来の技術】これまで、医薬、食品以外の工業分野で
リパーゼを利用するに際しては、主としてシュードモナ
ス（Pseudomonas）属の産生するリパーゼが用いられて
おり、更に又、例えば、特開平３-87187号記載のシュー
ドモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）M-12-33、
特開平３-47079号記載のシュードモナス・エスピー（Ps
eudomonas sp.）KWI-56及びJ. Bacteriol.,173巻、559-
567（1991）記載のシュードモナス・セパシア（Pseudom
onas cepacia）DSM-3959等のシュードモナス（Pseudomo
nas）属の産生するリパーゼにおいては、組換えＤＮＡ
技術を利用してその生産性が高められている。
リパーゼを利用するに際しては、主としてシュードモナ
ス（Pseudomonas）属の産生するリパーゼが用いられて
おり、更に又、例えば、特開平３-87187号記載のシュー
ドモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）M-12-33、
特開平３-47079号記載のシュードモナス・エスピー（Ps
eudomonas sp.）KWI-56及びJ. Bacteriol.,173巻、559-
567（1991）記載のシュードモナス・セパシア（Pseudom
onas cepacia）DSM-3959等のシュードモナス（Pseudomo
nas）属の産生するリパーゼにおいては、組換えＤＮＡ
技術を利用してその生産性が高められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの既存
のリパーゼは、界面活性剤に対して影響を受け易いとい
う欠点があり、界面活性剤の共存下でリパーゼを使用す
る洗剤用、臨床検査用、不斉合成及び分解等の工業分野
においては、より優れたリパーゼ、即ち、界面活性剤に
対する耐性の高いリパーゼの安価な供給が望まれてい
る。
のリパーゼは、界面活性剤に対して影響を受け易いとい
う欠点があり、界面活性剤の共存下でリパーゼを使用す
る洗剤用、臨床検査用、不斉合成及び分解等の工業分野
においては、より優れたリパーゼ、即ち、界面活性剤に
対する耐性の高いリパーゼの安価な供給が望まれてい
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで、まず、本発明者
らは、界面活性剤に対する耐性の高いリパーゼの生産菌
を自然界より求め、鋭意検討の結果、目的に合うところ
の１菌株を得た。本菌株の菌学的性質は下記のとおりで
ある。
らは、界面活性剤に対する耐性の高いリパーゼの生産菌
を自然界より求め、鋭意検討の結果、目的に合うところ
の１菌株を得た。本菌株の菌学的性質は下記のとおりで
ある。
【０００６】（ａ）形態
（１）桿菌（0.6×2.0）μ
（２）単独または短連鎖
（３）運動性あり、極多毛
（４）胞子なし
（５）グラム染色：陰性
（６）抗酸性：陰性
（７）多形性：なし
【０００７】（ｂ）生育状態
（１）肉汁寒天平板培養：円形、凸円状、表面はなめら
かで薄い、黄白色半透明 （２）肉汁寒天斜面培養：直状、周縁はなめらかで生育
は普通、凸円状、薄黄白色でやや光沢あり （３）肉汁液体培養：生育は普通、表面に薄膜形成、濁
りあり （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通、液化は漏斗
状 （５）リトマスミルク：ややアルカリ性、リトマスを還
元する、液化するがわずかに沈澱を形成する
かで薄い、黄白色半透明 （２）肉汁寒天斜面培養：直状、周縁はなめらかで生育
は普通、凸円状、薄黄白色でやや光沢あり （３）肉汁液体培養：生育は普通、表面に薄膜形成、濁
りあり （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通、液化は漏斗
状 （５）リトマスミルク：ややアルカリ性、リトマスを還
元する、液化するがわずかに沈澱を形成する
【０００８】（ｃ）生育性
（１）マッコンキー（MacConkey）培地：生育
（２）ＫＣＮ培地：生育しない
（３）ＳＳ寒天培地：生育しない
【０００９】（ｄ）生理的性質
（１）硝酸塩の還元：陰性
（２）脱窒反応：陰性
（３）ＭＲテスト：陰性
（４）ＶＰテスト：陰性
（５）インドールの生成：陰性
（６）硫化水素の生成：陰性
（７）デンプンの加水分解：陰性
（８）クエン酸の利用：陽性（シモンズ、クエン酸培
地） （９）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用されないがアン
モニウム塩を利用する （10）色素の生成 キング（King）Ａ培地：淡黄色素 キング（King）Ｂ培地：淡褐色水溶性色素 （11）ツィーン（Tween）80分解：陽性 （12）カゼイン分解：陽性 （13）ＰＨＢ蓄積：陽性 （14）ウレアーゼ：陰性 （15）オキシダーゼ：陽性 （16）カタラーゼ：陽性 （17）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性 （18）リジンデカルボキシラーゼ：陽性 （19）オルニチンデカルボキシラーゼ：陽性 （20）アシルアミダーゼ：陽性 （21）生育pH：5.0〜9.0 （22）生育温度：12〜41℃ （23）酸素に対する態度：好気性 （24）Ｏ−Ｆテスト：酸化的（Oxidative） （25）糖類からの酸及びガスの生成 イ）酸の生成：表１に示す
地） （９）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用されないがアン
モニウム塩を利用する （10）色素の生成 キング（King）Ａ培地：淡黄色素 キング（King）Ｂ培地：淡褐色水溶性色素 （11）ツィーン（Tween）80分解：陽性 （12）カゼイン分解：陽性 （13）ＰＨＢ蓄積：陽性 （14）ウレアーゼ：陰性 （15）オキシダーゼ：陽性 （16）カタラーゼ：陽性 （17）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性 （18）リジンデカルボキシラーゼ：陽性 （19）オルニチンデカルボキシラーゼ：陽性 （20）アシルアミダーゼ：陽性 （21）生育pH：5.0〜9.0 （22）生育温度：12〜41℃ （23）酸素に対する態度：好気性 （24）Ｏ−Ｆテスト：酸化的（Oxidative） （25）糖類からの酸及びガスの生成 イ）酸の生成：表１に示す
【００１０】
【表１】
【００１１】ロ）ガスの生成：陰性
以上の菌学的諸性質をバージーズ・マニュアル・オブ・
デタミネイティブ・バクテリオロジー第８版〔Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology ８巻（1974
年）〕，バージーズ・マニュアル・オブ・システマチッ
ク・バクテリオロジー第１巻〔Bergey's Systematic Ba
cteriology １巻（1984年）〕，ロバート・イー（Rober
t E.）等のグラム・ネガティブ・オルガニズムズ・アン
・アプローチ・ツー・アイデンティフィケーション（Gr
am-negative organisms an approach to identificatio
n）ガイド・ツー・プリサンプティブ・アイデンティフ
ィケーション〔Guide to presumptive identification
（1983年）〕，コワンズ・マニュアル・フォー・ザ・ア
イデンティフィケーション・オブ・メディカル・バクテ
リア（Cowan's Manual for the identification of med
ical bacteria（1974年）〕の記載と対比するとシュー
ドモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）と一致す
ることから、本菌株はシュードモナス・セパシア（Pseu
domonas cepacia）A-0727と命名され、微工研菌寄第132
72号（FERM-P No13272）として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。
デタミネイティブ・バクテリオロジー第８版〔Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology ８巻（1974
年）〕，バージーズ・マニュアル・オブ・システマチッ
ク・バクテリオロジー第１巻〔Bergey's Systematic Ba
cteriology １巻（1984年）〕，ロバート・イー（Rober
t E.）等のグラム・ネガティブ・オルガニズムズ・アン
・アプローチ・ツー・アイデンティフィケーション（Gr
am-negative organisms an approach to identificatio
n）ガイド・ツー・プリサンプティブ・アイデンティフ
ィケーション〔Guide to presumptive identification
（1983年）〕，コワンズ・マニュアル・フォー・ザ・ア
イデンティフィケーション・オブ・メディカル・バクテ
リア（Cowan's Manual for the identification of med
ical bacteria（1974年）〕の記載と対比するとシュー
ドモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）と一致す
ることから、本菌株はシュードモナス・セパシア（Pseu
domonas cepacia）A-0727と命名され、微工研菌寄第132
72号（FERM-P No13272）として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。
【００１２】次に、本発明者らは、本菌株より、リパー
ゼ遺伝子をクローニングし、該リパーゼ遺伝子が新規遺
伝子であることを見いだすと共に、更に該リパーゼ遺伝
子を導入したプラスミドベクターを作製し、これをシュ
ードモナス属菌に保持せしめることによって、シュード
モナス属菌にリパーゼを大量生産せしめることに成功
し、界面活性剤に耐性のあるリパーゼを安価に供給する
ことができ、本発明を完成したものである。
ゼ遺伝子をクローニングし、該リパーゼ遺伝子が新規遺
伝子であることを見いだすと共に、更に該リパーゼ遺伝
子を導入したプラスミドベクターを作製し、これをシュ
ードモナス属菌に保持せしめることによって、シュード
モナス属菌にリパーゼを大量生産せしめることに成功
し、界面活性剤に耐性のあるリパーゼを安価に供給する
ことができ、本発明を完成したものである。
【００１３】以下、本発明を詳細に説明する。
（１）染色体ＤＮＡの調製法
シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）A-0
727株をＬＢ培地（トリプトン 1.0％，酵母エキス 0.5
％，塩化ナトリウム 1.0％）で30℃にて一晩好気的に培
養する。菌体を集菌後、斎藤，三浦の方法〔Biochim. B
iophys. Acta.，72巻、619〜629（1963）〕等、公知の
方法を利用して染色体ＤＮＡを抽出、精製してＤＮＡを
得る。
727株をＬＢ培地（トリプトン 1.0％，酵母エキス 0.5
％，塩化ナトリウム 1.0％）で30℃にて一晩好気的に培
養する。菌体を集菌後、斎藤，三浦の方法〔Biochim. B
iophys. Acta.，72巻、619〜629（1963）〕等、公知の
方法を利用して染色体ＤＮＡを抽出、精製してＤＮＡを
得る。
【００１４】（２）ＤＮＡ断片のプラスミドベクターへ
の挿入及び形質転換の方法 プラスミドベクターは宿主内で複製可能な、既知の制限
酵素切断部位を持ち、薬剤耐性等の選択マーカーを持つ
ベクター、例えば広宿主域プラスミドベクターRSF101
0，R16679，R1162等にカナマイシンやクロラムフェニコ
ール等の薬剤耐性遺伝子を導入したプラスミドベクター
を利用し、該プラスミドベクターＤＮＡをHindIII等の
制限酵素で切断し、同じ制限酵素で切断、精製した染色
体ＤＮＡをリガーゼ等を用いた公知の方法により連結
し、組換えプラスミドを得、該組換えプラスミドを用い
てシュードモナス属菌、例えば、シュードモナス・セパ
シア（Pseudomonas cepacia）、シュードモナス・プチ
ダ（Pseudomonas putida）等を塩化カルシウム法、塩化
ルビジウム法、エレクトロポレーション法等の方法を利
用して形質転換する。
の挿入及び形質転換の方法 プラスミドベクターは宿主内で複製可能な、既知の制限
酵素切断部位を持ち、薬剤耐性等の選択マーカーを持つ
ベクター、例えば広宿主域プラスミドベクターRSF101
0，R16679，R1162等にカナマイシンやクロラムフェニコ
ール等の薬剤耐性遺伝子を導入したプラスミドベクター
を利用し、該プラスミドベクターＤＮＡをHindIII等の
制限酵素で切断し、同じ制限酵素で切断、精製した染色
体ＤＮＡをリガーゼ等を用いた公知の方法により連結
し、組換えプラスミドを得、該組換えプラスミドを用い
てシュードモナス属菌、例えば、シュードモナス・セパ
シア（Pseudomonas cepacia）、シュードモナス・プチ
ダ（Pseudomonas putida）等を塩化カルシウム法、塩化
ルビジウム法、エレクトロポレーション法等の方法を利
用して形質転換する。
【００１５】（３）リパーゼ生産能を有する形質転換菌
の選択分離方法 ポリビニルアルコールで乳化したトリブチリン，トリオ
レイン等のトリグリセリドを含み、所定濃度の抗生物質
を有する寒天培地を用い、形質転換した菌の中から該寒
天培地において大きなクリアーゾーンを形成する菌株を
分離することにより、リパーゼ遺伝子を含む菌を選択分
離し、ついで、この菌からアルカリ法、ボイリング法等
公知の方法を用いてリパーゼ遺伝子を含むプラスミドＤ
ＮＡを得、更に、本発明のプラスミドＤＮＡを導入して
得られたシュードモナス属菌を用いてリパーゼを生産す
る。
の選択分離方法 ポリビニルアルコールで乳化したトリブチリン，トリオ
レイン等のトリグリセリドを含み、所定濃度の抗生物質
を有する寒天培地を用い、形質転換した菌の中から該寒
天培地において大きなクリアーゾーンを形成する菌株を
分離することにより、リパーゼ遺伝子を含む菌を選択分
離し、ついで、この菌からアルカリ法、ボイリング法等
公知の方法を用いてリパーゼ遺伝子を含むプラスミドＤ
ＮＡを得、更に、本発明のプラスミドＤＮＡを導入して
得られたシュードモナス属菌を用いてリパーゼを生産す
る。
【００１６】こうして得られた本願リパーゼの構造遺伝
子のアミノ酸配列と既知のシュードモナス属菌由来の各
種リパーゼの構造遺伝子のアミノ酸配列を比較し、図１
に示す。尚、本願リパーゼ構造遺伝子は、全配列を表示
し、他のリパーゼ構造遺伝子については、本願リパーゼ
構造遺伝子と異なる部分のみを表示した。そしてアミノ
酸は、１文字標記で表した。
子のアミノ酸配列と既知のシュードモナス属菌由来の各
種リパーゼの構造遺伝子のアミノ酸配列を比較し、図１
に示す。尚、本願リパーゼ構造遺伝子は、全配列を表示
し、他のリパーゼ構造遺伝子については、本願リパーゼ
構造遺伝子と異なる部分のみを表示した。そしてアミノ
酸は、１文字標記で表した。
【００１７】図１より明らかなように、本願のリパーゼ
遺伝子と他のリパーゼ遺伝子との相同性は、シュードモ
ナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）M-12-33由来が
95％であり、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas
sp.）KWI-56由来及びシュードモナス・セパシア（Pseud
omonas cepacia）DSM-3959由来が何れも92.4％となって
いる事が分かる。しかしながら、95％と最も相同性の高
いシュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）M
-12-33由来のリパーゼ遺伝子と本願のリパーゼ遺伝子と
を比較した場合でも、アミノ酸数にして16の置換が認め
られる。
遺伝子と他のリパーゼ遺伝子との相同性は、シュードモ
ナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）M-12-33由来が
95％であり、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas
sp.）KWI-56由来及びシュードモナス・セパシア（Pseud
omonas cepacia）DSM-3959由来が何れも92.4％となって
いる事が分かる。しかしながら、95％と最も相同性の高
いシュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）M
-12-33由来のリパーゼ遺伝子と本願のリパーゼ遺伝子と
を比較した場合でも、アミノ酸数にして16の置換が認め
られる。
【００１８】リパーゼ活性測定法
２％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）溶液225mlとオリ
ーブ油75mlを混合乳化した基質溶液５mlと0.2Ｍマッキ
ルバイン緩衝液（pH７）４mlを平底試験管にとり、37
℃、５分間予温する。これに試料溶液１mlを加え良く振
り混ぜ、直ちに37℃、30分間放置する。30分後にアセト
ン・エタノール混液（１：１）10mlを加え良く振り混ぜ
る。これに0.05Ｎ水酸化ナトリウム溶液10ml及びアセト
ン・エタノール混液（１：１）10mlを加え、更にフェノ
ールフタレイン試液２滴を加えて窒素ガスを液面に吹き
つけながら、スターラーにて攪拌しつつ、0.05Ｎ塩酸で
pH10.00まで滴定する。ブランク値は試料溶液の代わり
に精製水を用い、同様操作する。酵素力価は１分間に１
マイクロモルの脂肪酸を生成するときを１単位とする。
ーブ油75mlを混合乳化した基質溶液５mlと0.2Ｍマッキ
ルバイン緩衝液（pH７）４mlを平底試験管にとり、37
℃、５分間予温する。これに試料溶液１mlを加え良く振
り混ぜ、直ちに37℃、30分間放置する。30分後にアセト
ン・エタノール混液（１：１）10mlを加え良く振り混ぜ
る。これに0.05Ｎ水酸化ナトリウム溶液10ml及びアセト
ン・エタノール混液（１：１）10mlを加え、更にフェノ
ールフタレイン試液２滴を加えて窒素ガスを液面に吹き
つけながら、スターラーにて攪拌しつつ、0.05Ｎ塩酸で
pH10.00まで滴定する。ブランク値は試料溶液の代わり
に精製水を用い、同様操作する。酵素力価は１分間に１
マイクロモルの脂肪酸を生成するときを１単位とする。
【００１９】以下に、試験例、実施例にて本発明を具体
的に説明するが、本願発明は、これらによって何等限定
されるものではない。 試験例１ シュードモナス・セパシア（Pseudomonas ce
pacia）A-0727を大豆油2.0％、ペプトン 0.5％（Difco
社製）、ビーフ・イクストラクト 0.3％（Difco社
製）、KH2PO4 0.1％、MgSO4・7H2O 0.02％、FeSO4・7H2
O 0.001％、アデカノール１滴よりなる液体培地で、30
℃、３日間振とう培養し、遠心分離によりリパーゼ活性
21u／mlの培養上清を得、得られた培養上清を希釈し
て、酵素液として使用し、本菌株の生産するリパーゼに
対する各種界面活性剤の影響を調べ、その結果を表２に
示す。尚、対照としては、シュードモナス・セパシア
（Pseudomonas cepasia）M-12-33株由来のリパーゼを用
いた。
的に説明するが、本願発明は、これらによって何等限定
されるものではない。 試験例１ シュードモナス・セパシア（Pseudomonas ce
pacia）A-0727を大豆油2.0％、ペプトン 0.5％（Difco
社製）、ビーフ・イクストラクト 0.3％（Difco社
製）、KH2PO4 0.1％、MgSO4・7H2O 0.02％、FeSO4・7H2
O 0.001％、アデカノール１滴よりなる液体培地で、30
℃、３日間振とう培養し、遠心分離によりリパーゼ活性
21u／mlの培養上清を得、得られた培養上清を希釈し
て、酵素液として使用し、本菌株の生産するリパーゼに
対する各種界面活性剤の影響を調べ、その結果を表２に
示す。尚、対照としては、シュードモナス・セパシア
（Pseudomonas cepasia）M-12-33株由来のリパーゼを用
いた。
【００２０】
【表２】
【００２１】表２より明らかなように、本菌株の生産す
るリパーゼ（A-0727リパーゼ）は、対照のリパーゼ（M-
12-33リパーゼ）に比較して、界面活性剤のトリトンX-1
00やソデウム・ドデシルサルフェートによる阻害が小さ
いことが分かる。
るリパーゼ（A-0727リパーゼ）は、対照のリパーゼ（M-
12-33リパーゼ）に比較して、界面活性剤のトリトンX-1
00やソデウム・ドデシルサルフェートによる阻害が小さ
いことが分かる。
【００２２】
実施例１
（１）染色体ＤＮＡの調製
シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）A-0
727株をＬＢ培地で、30℃にて一晩好気的に振とう培養
を行い、集菌後、斎藤，三浦法によるＤＮＡ抽出法によ
り染色体ＤＮＡを抽出・精製し、染色体ＤＮＡ 5.0mgを
得た。
727株をＬＢ培地で、30℃にて一晩好気的に振とう培養
を行い、集菌後、斎藤，三浦法によるＤＮＡ抽出法によ
り染色体ＤＮＡを抽出・精製し、染色体ＤＮＡ 5.0mgを
得た。
【００２３】（２）ベクターpFL210の調製
広宿主域プラスミドベクターRSF1010 2.75μgを制限酵
素PstIで切断し、末端をヌクレアーゼS1処理及びクレノ
ウフラグメントで処理後、8.1Kb断片を抽出し、一方、p
UC-4K（Pharmacia製）4.63μgから同様の操作によりカ
ナマイシン耐性遺伝子を含む1.4Kb断片を調製し、両者
をＴ４−ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌C600株を
形式転換してカナマイシン耐性株を得、該カナマイシン
耐性株よりプラスミドを調製し、PstI非分解性のプラス
ミドを選択して制限酵素HpaIで分解した。尚、プラスミ
ドの調製は、大腸菌C600株よりマニアチスらの、モルキ
ュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル
〔Maniatis et al，Molecular Cloning a laboratory m
anual.，92巻〜94巻（1981）〕に記載の方法により行っ
た。
素PstIで切断し、末端をヌクレアーゼS1処理及びクレノ
ウフラグメントで処理後、8.1Kb断片を抽出し、一方、p
UC-4K（Pharmacia製）4.63μgから同様の操作によりカ
ナマイシン耐性遺伝子を含む1.4Kb断片を調製し、両者
をＴ４−ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌C600株を
形式転換してカナマイシン耐性株を得、該カナマイシン
耐性株よりプラスミドを調製し、PstI非分解性のプラス
ミドを選択して制限酵素HpaIで分解した。尚、プラスミ
ドの調製は、大腸菌C600株よりマニアチスらの、モルキ
ュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル
〔Maniatis et al，Molecular Cloning a laboratory m
anual.，92巻〜94巻（1981）〕に記載の方法により行っ
た。
【００２４】一方、プラスミドpUC19（宝酒造製）1μg
を制限酵素HindIIIで切断した後、クレノウフラグメン
トで処理し、アガロースゲル電気泳動後、2.7Kb断片を
抽出し、前者と合した後、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼで連結
し、大腸菌C600株を形質転換してアンピシリン及びカナ
マイシン耐性株を得、該耐性菌からプラスミドを抽出
後、制限酵素SacIで分解し、セルフライゲーションを行
ってマルチプルクローニングサイトの導入されたプラス
ミドベクターpFL200を作製した。
を制限酵素HindIIIで切断した後、クレノウフラグメン
トで処理し、アガロースゲル電気泳動後、2.7Kb断片を
抽出し、前者と合した後、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼで連結
し、大腸菌C600株を形質転換してアンピシリン及びカナ
マイシン耐性株を得、該耐性菌からプラスミドを抽出
後、制限酵素SacIで分解し、セルフライゲーションを行
ってマルチプルクローニングサイトの導入されたプラス
ミドベクターpFL200を作製した。
【００２５】更に、プラスミドpBR328（ベーリンガー・
マンハイム社製）１μgを制限酵素HhaIで切断後、ヌク
レアーゼＳ１処理及びクレノウフラグメントで処理し、
アガロースゲル電気泳動後、クロラムフェニコール耐性
遺伝子を含む約1.4Kb断片を抽出し、予め制限酵素SmaI
で切断したプラスミドpUC18と混合後、Ｔ４−ＤＮＡリ
ガーゼで連結し、大腸菌C600株を形質転換し、クロラム
フェニコール耐性株を選択し、プラスミドＤＮＡを抽出
し、制限酵素BamHI、KpnIで分解後、約1.4KbＤＮＡ断片
を採取し、一方、0.5μg pFL200も同じ制限酵素BamHI、
KpnIで分解して前記ＤＮＡ断片と混合した後、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼで連結し、大腸菌C600株を形質転換してク
ロラムフェニコール、カナマイシン２剤耐性株を選択
し、耐性菌よりプラスミドを抽出し、プラスミドベクタ
ーpFL210と命名した。
マンハイム社製）１μgを制限酵素HhaIで切断後、ヌク
レアーゼＳ１処理及びクレノウフラグメントで処理し、
アガロースゲル電気泳動後、クロラムフェニコール耐性
遺伝子を含む約1.4Kb断片を抽出し、予め制限酵素SmaI
で切断したプラスミドpUC18と混合後、Ｔ４−ＤＮＡリ
ガーゼで連結し、大腸菌C600株を形質転換し、クロラム
フェニコール耐性株を選択し、プラスミドＤＮＡを抽出
し、制限酵素BamHI、KpnIで分解後、約1.4KbＤＮＡ断片
を採取し、一方、0.5μg pFL200も同じ制限酵素BamHI、
KpnIで分解して前記ＤＮＡ断片と混合した後、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼで連結し、大腸菌C600株を形質転換してク
ロラムフェニコール、カナマイシン２剤耐性株を選択
し、耐性菌よりプラスミドを抽出し、プラスミドベクタ
ーpFL210と命名した。
【００２６】（３）ＤＮＡ断片のプラスミドベクターへ
の挿入 上記染色体ＤＮＡ 4.7μgをとり、制限酵素HindIIIを加
え、37℃で５分間反応させて、部分的に切断し、一方、
プラスミドpFL210 2.0μgに制限酵素HindIIIを加え、37
℃で２時間反応させ、完全に切断したプラスミドＤＮＡ
にアルカリ性ホスファターゼを加え、脱リン酸化し、切
断した染色体ＤＮＡとプラスミドベクターＤＮＡを混合
し、ＤＮＡリガーゼを加えて一夜反応させてＤＮＡ鎖の
連結反応を行った。
の挿入 上記染色体ＤＮＡ 4.7μgをとり、制限酵素HindIIIを加
え、37℃で５分間反応させて、部分的に切断し、一方、
プラスミドpFL210 2.0μgに制限酵素HindIIIを加え、37
℃で２時間反応させ、完全に切断したプラスミドＤＮＡ
にアルカリ性ホスファターゼを加え、脱リン酸化し、切
断した染色体ＤＮＡとプラスミドベクターＤＮＡを混合
し、ＤＮＡリガーゼを加えて一夜反応させてＤＮＡ鎖の
連結反応を行った。
【００２７】（４）プラスミドによる形質転換
前述のトリオレインを含む寒天培地でリパーゼ遺伝子を
選択、分離する際、宿主はハロー欠損株が便利であるの
で、シュードモナス・セパシア（Pseudomonascepacia）
M-12-33株（FERM-P No.9871）をニトロソグアニジン処
理して得たハローを形成しない変異株HWIOを使用した。
選択、分離する際、宿主はハロー欠損株が便利であるの
で、シュードモナス・セパシア（Pseudomonascepacia）
M-12-33株（FERM-P No.9871）をニトロソグアニジン処
理して得たハローを形成しない変異株HWIOを使用した。
【００２８】又、本発明者らは、該菌株の形質転換に、
エレクトロポレーション法が非常に有効なことを見い出
しており、本発明においても同様に実施した。
エレクトロポレーション法が非常に有効なことを見い出
しており、本発明においても同様に実施した。
【００２９】即ち、該菌株をＬＢ培地20mlで、30℃にて
対数増殖期（OD660＝0.4）になるまで培養し、冷却後、
10,000rpm、５分間遠心分離を行い集菌し、菌体を10ml
の272mMシュークロース，0.7mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH 7.4）で洗浄し、再び遠心分離した後、同緩衝液
0.8mlに懸濁し、連結した組換え体ＤＮＡを加え、6,250
Ｖ／cmのパルスをかけ、ＬＢ培地 5.6mlを加え、30℃に
て２時間振とう培養し形質転換株を得た。
対数増殖期（OD660＝0.4）になるまで培養し、冷却後、
10,000rpm、５分間遠心分離を行い集菌し、菌体を10ml
の272mMシュークロース，0.7mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH 7.4）で洗浄し、再び遠心分離した後、同緩衝液
0.8mlに懸濁し、連結した組換え体ＤＮＡを加え、6,250
Ｖ／cmのパルスをかけ、ＬＢ培地 5.6mlを加え、30℃に
て２時間振とう培養し形質転換株を得た。
【００３０】こうして連結した組換えＤＮＡを、エレク
トロポレーション法にてHWIO株を形質転換し、100μg／
mlクロラムフェニコール、0.2％トリオレインを含む選
択培地にまき、ハロー形成株12株を得た。
トロポレーション法にてHWIO株を形質転換し、100μg／
mlクロラムフェニコール、0.2％トリオレインを含む選
択培地にまき、ハロー形成株12株を得た。
【００３１】（５）リパーゼ遺伝子を含む形質転換株の
同定 前記ハロー形成株12株よりプラスミドを抽出し、制限酵
素HindIII及びEcoRIで切断、アガロース電気泳動で挿入
されたＤＮＡ断片の解析を行ない、HindIIIでは唯一の
約９KbＤＮＡ断片の挿入が示され、EcoRIでは数本のＤ
ＮＡ断片からなる２種のタイプに分けられる事が示され
た。即ち、これら２種タイプのプラスミドの制限酵素地
図を作成した結果から方向性の異なる唯一のＤＮＡ断片
が挿入された２種のプラスミドである事が確認された。
同定 前記ハロー形成株12株よりプラスミドを抽出し、制限酵
素HindIII及びEcoRIで切断、アガロース電気泳動で挿入
されたＤＮＡ断片の解析を行ない、HindIIIでは唯一の
約９KbＤＮＡ断片の挿入が示され、EcoRIでは数本のＤ
ＮＡ断片からなる２種のタイプに分けられる事が示され
た。即ち、これら２種タイプのプラスミドの制限酵素地
図を作成した結果から方向性の異なる唯一のＤＮＡ断片
が挿入された２種のプラスミドである事が確認された。
【００３２】２種プラスミドをそれぞれpLPA1及びpLPA2
と命名し、pLPA1の制限酵素地図を図２に示す。
と命名し、pLPA1の制限酵素地図を図２に示す。
【００３３】（リパーゼ遺伝子の解析）リパーゼ遺伝子
を含むと考えられる約９KbのＤＮＡ断片を各種制限酵素
により切断し、各ＤＮＡ断片をpFL210にサブクローニン
グして、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepa
cia）HW10株を形質転換させ、前記と同様にしてトリオ
レイン培地におけるハロー形成の有無を調べた。
を含むと考えられる約９KbのＤＮＡ断片を各種制限酵素
により切断し、各ＤＮＡ断片をpFL210にサブクローニン
グして、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepa
cia）HW10株を形質転換させ、前記と同様にしてトリオ
レイン培地におけるハロー形成の有無を調べた。
【００３４】リパーゼ生産のためには2.5Kb BglII-StuI
断片以上のＤＮＡ断片が必要なことが示され、本発明者
らは、本ＤＮＡ断片の全塩基配列をＤＮＡシーケンサー
373Ａ〔アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosy
stems）社製〕を使用して決定した。そして、このＤＮ
Ａ断片中にリパーゼ遺伝子の含まれる事が判明し、その
推定されるリパーゼのアミノ酸配列は、配列表の配列番
号：１に示される。
断片以上のＤＮＡ断片が必要なことが示され、本発明者
らは、本ＤＮＡ断片の全塩基配列をＤＮＡシーケンサー
373Ａ〔アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosy
stems）社製〕を使用して決定した。そして、このＤＮ
Ａ断片中にリパーゼ遺伝子の含まれる事が判明し、その
推定されるリパーゼのアミノ酸配列は、配列表の配列番
号：１に示される。
【００３５】（６）リパーゼの生産
前記リパーゼ遺伝子を含むプラスミドpLPA1でシュード
モナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）HW10株を形
質転換し、得られた形質転換株シュードモナス・セパシ
ア（Pseudomonas cepacia）HW10（pLPA1）を大豆油 2.0
％、ペプトン 0.5％（Difco社製）、ビーフ・イクスト
ラクト 0.3％（Difco社製）、KH2PO4 0.1％、MgSO4・7H
2O 0.02％、FeSO4・7H2O 0.001％、アデカノール１滴よ
りなる液体培地で、30℃、３日間振とう培養し、遠心分
離によりリパーゼ活性430u／mlの培養上清を得た（本形
質転換株の酵素生産能は親株Pseudomonas cepacia A-07
27株のリパーゼ生産の約20倍であった。）。
モナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）HW10株を形
質転換し、得られた形質転換株シュードモナス・セパシ
ア（Pseudomonas cepacia）HW10（pLPA1）を大豆油 2.0
％、ペプトン 0.5％（Difco社製）、ビーフ・イクスト
ラクト 0.3％（Difco社製）、KH2PO4 0.1％、MgSO4・7H
2O 0.02％、FeSO4・7H2O 0.001％、アデカノール１滴よ
りなる液体培地で、30℃、３日間振とう培養し、遠心分
離によりリパーゼ活性430u／mlの培養上清を得た（本形
質転換株の酵素生産能は親株Pseudomonas cepacia A-07
27株のリパーゼ生産の約20倍であった。）。
【００３６】
【発明の効果】本発明は、自然界より得られた、界面活
性剤に耐性を有するリパーゼ生産菌株シュードモナス・
セパシア（Pseudomonas cepacia）A-0727のリパーゼ遺
伝子をクローニングし、該遺伝子をプラスミドに導入
し、シュードモナス属菌に形質転換したものであり、本
形質転換株を培養することにより、広範囲の工業分野に
おける有用な界面活性剤耐性のリパーゼを安価に提供す
ることができる。
性剤に耐性を有するリパーゼ生産菌株シュードモナス・
セパシア（Pseudomonas cepacia）A-0727のリパーゼ遺
伝子をクローニングし、該遺伝子をプラスミドに導入
し、シュードモナス属菌に形質転換したものであり、本
形質転換株を培養することにより、広範囲の工業分野に
おける有用な界面活性剤耐性のリパーゼを安価に提供す
ることができる。
【００３７】
配列番号：１
配列の長さ：３２０
配列の型：アミノ酸
配列
Ala Asp Asn Tyr Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His 15
Gly Leu Thr Gly Thr Asp Lys Tyr Ala Gly Val Leu Asp Tyr Trp 30
Tyr Gly Ile Gln Glu Asn Leu Gln Gln His Gly Ala Thr Val Tyr 45
Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly 60
Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr Val Lys Thr Val Leu Ala Ala 75
Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Val Gly His Ser Gln Gly Gly 90
Leu Thr Ser Arg Tyr Val Ala Ala Val Ala Pro Asp Leu Val Ala 105
Ser Val Thr Thr Ile Gly Thr Pro His Arg Gly Ser Glu Phe Ala 120
Asp Phe Val Gln Gly Val Leu Ala Tyr Asp Pro Thr Gly Leu Ser 135
Ser Thr Val Ile Ala Ala Phe Val Asn Val Phe Gly Ile Leu Thr 150
Ser Ser Ser His Asn Thr Asn Gln Asp Ala Leu Ala Ala Leu Lys 165
Thr Leu Thr Thr Ala Gln Ala Ala Thr Tyr Asn Gln Asn Tyr Pro 180
Ser Ala Gly Leu Gly Ala Ser Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Pro 195
Thr Glu Thr Val Gly Gly Asn Thr His Leu Leu Tyr Ser Trp Ala 210
Gly Thr Ala Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Leu Gly Val Thr Gly 225
Ala Thr Asp Thr Ser Thr Ile Pro Leu Val Asp Pro Ala Asn Val 240
Leu Asp Leu Ser Thr Leu Ala Leu Leu Gly Thr Gly Thr Val Met 255
Ile Asn Arg Ala Ser Gly Gln Asn Asp Gly Leu Val Ser Lys Cys 270
Ser Ala Leu Tyr Gly Lys Val Leu Ser Thr Ser Tyr Lys Trp Asn 285
His Ile Asp Glu Ile Asn Gln Leu Leu Gly Val Arg Gly Ala Tyr 300
Ala Glu Asp Pro Val Ala Val Ile Arg Thr His Ala Asn Arg Leu 315
Lys Leu Ala Gly Val 320
【図１】本願リパーゼ構造遺伝子のアミノ酸配列と他の
リパーゼ構造遺伝子のアミノ酸配列を比較した図であ
り、図中（１）は、本願のシュードモナス・セパシア
（Pseudomonas cepacia）A-0727由来のもの、（２）
は、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepaci
a）M-12-33由来のもの、（３）は、シュードモナス・エ
スピー（Pseudomonas sp.）KWI-56由来のもの、（４）
は、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepaci
a）DSM-3959由来のものをそれぞれ示す。
リパーゼ構造遺伝子のアミノ酸配列を比較した図であ
り、図中（１）は、本願のシュードモナス・セパシア
（Pseudomonas cepacia）A-0727由来のもの、（２）
は、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepaci
a）M-12-33由来のもの、（３）は、シュードモナス・エ
スピー（Pseudomonas sp.）KWI-56由来のもの、（４）
は、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepaci
a）DSM-3959由来のものをそれぞれ示す。
【図２】本願発明プラスミドpLPA 1の制限酵素地図を示
すものである。
すものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 9/20
Ｃ１２Ｒ 1:38）
(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:38）
(56)参考文献 特開 平３−47079（ＪＰ，Ａ)
特開 平３−87187（ＪＰ，Ａ)
特開 昭62−228279（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−39579（ＪＰ，Ａ)
特表 平４−505850（ＪＰ，Ａ)
欧州特許出願公開464944（ＥＰ，Ａ
１)
欧州特許出願公開407225（ＥＰ，Ａ
１)
国際公開91／000908（ＷＯ，Ａ１)
Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ Ｓ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏ
ｆ ａ ｌｉｐａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒ
ｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐ
ａｃｉａ： ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅ，Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ，1991，Ｖｏｌ．173，Ｎｏ.
２，ｐａｇｅｓ 559−567
Ｉｉｚｕｍｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ ａ ｌｉｐ
ａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｃｔｉｖａ
ｔｏｒ ｇｅｎ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，1991，Ｖｏｌ．55，Ｎ
ｏ．９，ｐａｇｅｓ 2349−2357
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00
C12N 1/21
C12N 9/20
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】トリトンＸ−１００耐性又はソデイムドデ
シルサルフェート 耐性を有するリパーゼの生産菌株シュ
ードモナス・セパシアＡ−０７２７由来であって、配列
表の配列番号：１のアミノ酸配列で示されるリパーゼ。 - 【請求項２】配列表の配列番号：１で示されるアミノ酸
配列をコードするトリトンＸ−１００耐性又はソデイム
ドデシルサルフェート耐性リパーゼ遺 伝子。 - 【請求項３】配列表の配列番号：１で示されるアミノ酸
配列をコードするトリトンＸ−１００耐性又はソデイム
ドデシルサルフェート耐性リパーゼ遺 伝子をプラスミ
ドに組み込んだ組換えＤＮＡ。 - 【請求項４】シュードモナス属細胞内で発現し、配列表
の配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードするト
リトンＸ−１００耐性又はソデイムド デシルサルフェ
ート耐性リパーゼ遺伝子をシュードモナス属細胞内で増
殖し 得るプラスミドベクターに組み込んでなる組換え
ＤＮＡを導入したシュード モナス属菌。 - 【請求項５】配列表の配列番号：１で示されるアミノ酸
配列をコードするトリトンＸ−１００耐性又はソデイム
ドデシルサルフェート耐性リパーゼ遺 伝子をシュード
モナス属細胞内で増殖し得るプラスミドベクターに組み
込ん でなる組換えＤＮＡを導入したシュードモナス属
菌を培養し、培養物中にリ パーゼを生成せしめ、これ
を採取することを特徴とするリパーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34122692A JP3410128B2 (ja) | 1992-11-27 | 1992-11-27 | 組換えｄｎａを有するシュードモナス属菌及びそれを用いるリパーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34122692A JP3410128B2 (ja) | 1992-11-27 | 1992-11-27 | 組換えｄｎａを有するシュードモナス属菌及びそれを用いるリパーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153965A JPH06153965A (ja) | 1994-06-03 |
| JP3410128B2 true JP3410128B2 (ja) | 2003-05-26 |
Family
ID=18344361
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34122692A Expired - Fee Related JP3410128B2 (ja) | 1992-11-27 | 1992-11-27 | 組換えｄｎａを有するシュードモナス属菌及びそれを用いるリパーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3410128B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010005003A1 (ja) | 2008-07-11 | 2010-01-14 | 住友化学株式会社 | （１ｓ，２ｒ）－２－クロロ－２－フルオロシクロプロパンカルボン酸の製造方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3855329B2 (ja) * | 1996-11-28 | 2006-12-06 | 住友化学株式会社 | エステラーゼ遺伝子及びその利用 |
| US6472189B1 (en) | 1996-11-28 | 2002-10-29 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Esterase gene and its use |
| DK0869185T5 (da) | 1997-03-03 | 2004-11-29 | Sumitomo Chemical Co | Fremstilling af en optisk aktiv sphingoid-forbindelse |
| JP6846577B1 (ja) * | 2019-08-01 | 2021-03-24 | 天野エンザイム株式会社 | 新規リパーゼ及びその用途 |
-
1992
- 1992-11-27 JP JP34122692A patent/JP3410128B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｉｉｚｕｍｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ ａ ｌｉｐａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｇｅｎ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，Ｖｏｌ．５５，Ｎｏ．９，ｐａｇｅｓ ２３４９−２３５７ |
| Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｉｐａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ： ｌｉｐａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９１，Ｖｏｌ．１７３，Ｎｏ．２，ｐａｇｅｓ ５５９−５６７ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010005003A1 (ja) | 2008-07-11 | 2010-01-14 | 住友化学株式会社 | （１ｓ，２ｒ）－２－クロロ－２－フルオロシクロプロパンカルボン酸の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06153965A (ja) | 1994-06-03 |
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