JPH06153965A - 組換えdnaを有するシュードモナス属菌及びそれを用いるリパーゼの製造法 - Google Patents
組換えdnaを有するシュードモナス属菌及びそれを用いるリパーゼの製造法Info
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Abstract
菌の遺伝子組換えにより生産性の改良を目的とする。 【構成】界面活性剤耐性リパーゼ生産菌であるシュード
モナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)A-0727のリ
パーゼ遺伝子をクローニングし、該リパーゼ遺伝子を導
入したプラスミドベクターを作製し、これをシュードモ
ナス属菌に保持せしめる、該シュードモナス属菌栄養培
地で培養することによりリパーゼを大量生産せしめる。
Description
ゼ遺伝子を含む組換えDNA、それを含むシュードモナ
ス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法に関する。
薬、食品の分野のみならず、油脂の加工、臨床診断薬、
洗剤、有機化合物の不斉合成及び分解等の医薬、食品以
外の工業分野でも広く利用されている。
リパーゼを利用するに際しては、主としてシュードモナ
ス(Pseudomonas)属の産生するリパーゼが用いられて
おり、更に又、例えば、特開平3-87187号記載のシュー
ドモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)M-12-33、
特開平3-47079号記載のシュードモナス・エスピー(Ps
eudomonas sp.)KWI-56及びJ. Bacteriol.,173巻、559-
567(1991)記載のシュードモナス・セパシア(Pseudom
onas cepacia)DSM-3959等のシュードモナス(Pseudomo
nas)属の産生するリパーゼにおいては、組換えDNA
技術を利用してその生産性が高められている。
のリパーゼは、界面活性剤に対して影響を受け易いとい
う欠点があり、界面活性剤の共存下でリパーゼを使用す
る洗剤用、臨床検査用、不斉合成及び分解等の工業分野
においては、より優れたリパーゼ、即ち、界面活性剤に
対する耐性の高いリパーゼの安価な供給が望まれてい
る。
らは、界面活性剤に対する耐性の高いリパーゼの生産菌
を自然界より求め、鋭意検討の結果、目的に合うところ
の1菌株を得た。本菌株の菌学的性質は下記のとおりで
ある。
かで薄い、黄白色半透明 (2)肉汁寒天斜面培養:直状、周縁はなめらかで生育
は普通、凸円状、薄黄白色でやや光沢あり (3)肉汁液体培養:生育は普通、表面に薄膜形成、濁
りあり (4)肉汁ゼラチン穿刺培養:生育は普通、液化は漏斗
状 (5)リトマスミルク:ややアルカリ性、リトマスを還
元する、液化するがわずかに沈澱を形成する
地) (9)無機窒素源の利用:硝酸塩は利用されないがアン
モニウム塩を利用する (10)色素の生成 キング(King)A培地:淡黄色素 キング(King)B培地:淡褐色水溶性色素 (11)ツィーン(Tween)80分解:陽性 (12)カゼイン分解:陽性 (13)PHB蓄積:陽性 (14)ウレアーゼ:陰性 (15)オキシダーゼ:陽性 (16)カタラーゼ:陽性 (17)アルギニンジヒドロラーゼ:陰性 (18)リジンデカルボキシラーゼ:陽性 (19)オルニチンデカルボキシラーゼ:陽性 (20)アシルアミダーゼ:陽性 (21)生育pH:5.0〜9.0 (22)生育温度:12〜41℃ (23)酸素に対する態度:好気性 (24)O−Fテスト:酸化的(Oxidative) (25)糖類からの酸及びガスの生成 イ)酸の生成:表1に示す
デタミネイティブ・バクテリオロジー第8版〔Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology 8巻(1974
年)〕,バージーズ・マニュアル・オブ・システマチッ
ク・バクテリオロジー第1巻〔Bergey's Systematic Ba
cteriology 1巻(1984年)〕,ロバート・イー(Rober
t E.)等のグラム・ネガティブ・オルガニズムズ・アン
・アプローチ・ツー・アイデンティフィケーション(Gr
am-negative organisms an approach to identificatio
n)ガイド・ツー・プリサンプティブ・アイデンティフ
ィケーション〔Guide to presumptive identification
(1983年)〕,コワンズ・マニュアル・フォー・ザ・ア
イデンティフィケーション・オブ・メディカル・バクテ
リア(Cowan's Manual for the identification of med
ical bacteria(1974年)〕の記載と対比するとシュー
ドモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)と一致す
ることから、本菌株はシュードモナス・セパシア(Pseu
domonas cepacia)A-0727と命名され、微工研菌寄第132
72号(FERM-P No13272)として工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。
ゼ遺伝子をクローニングし、該リパーゼ遺伝子が新規遺
伝子であることを見いだすと共に、更に該リパーゼ遺伝
子を導入したプラスミドベクターを作製し、これをシュ
ードモナス属菌に保持せしめることによって、シュード
モナス属菌にリパーゼを大量生産せしめることに成功
し、界面活性剤に耐性のあるリパーゼを安価に供給する
ことができ、本発明を完成したものである。
727株をLB培地(トリプトン 1.0%,酵母エキス 0.5
%,塩化ナトリウム 1.0%)で30℃にて一晩好気的に培
養する。菌体を集菌後、斎藤,三浦の方法〔Biochim. B
iophys. Acta.,72巻、619〜629(1963)〕等、公知の
方法を利用して染色体DNAを抽出、精製してDNAを
得る。
の挿入及び形質転換の方法 プラスミドベクターは宿主内で複製可能な、既知の制限
酵素切断部位を持ち、薬剤耐性等の選択マーカーを持つ
ベクター、例えば広宿主域プラスミドベクターRSF101
0,R16679,R1162等にカナマイシンやクロラムフェニコ
ール等の薬剤耐性遺伝子を導入したプラスミドベクター
を利用し、該プラスミドベクターDNAをHindIII等の
制限酵素で切断し、同じ制限酵素で切断、精製した染色
体DNAをリガーゼ等を用いた公知の方法により連結
し、組換えプラスミドを得、該組換えプラスミドを用い
てシュードモナス属菌、例えば、シュードモナス・セパ
シア(Pseudomonas cepacia)、シュードモナス・プチ
ダ(Pseudomonas putida)等を塩化カルシウム法、塩化
ルビジウム法、エレクトロポレーション法等の方法を利
用して形質転換する。
の選択分離方法 ポリビニルアルコールで乳化したトリブチリン,トリオ
レイン等のトリグリセリドを含み、所定濃度の抗生物質
を有する寒天培地を用い、形質転換した菌の中から該寒
天培地において大きなクリアーゾーンを形成する菌株を
分離することにより、リパーゼ遺伝子を含む菌を選択分
離し、ついで、この菌からアルカリ法、ボイリング法等
公知の方法を用いてリパーゼ遺伝子を含むプラスミドD
NAを得、更に、本発明のプラスミドDNAを導入して
得られたシュードモナス属菌を用いてリパーゼを生産す
る。
子のアミノ酸配列と既知のシュードモナス属菌由来の各
種リパーゼの構造遺伝子のアミノ酸配列を比較し、図1
に示す。尚、本願リパーゼ構造遺伝子は、全配列を表示
し、他のリパーゼ構造遺伝子については、本願リパーゼ
構造遺伝子と異なる部分のみを表示した。そしてアミノ
酸は、1文字標記で表した。
遺伝子と他のリパーゼ遺伝子との相同性は、シュードモ
ナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)M-12-33由来が
95%であり、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas
sp.)KWI-56由来及びシュードモナス・セパシア(Pseud
omonas cepacia)DSM-3959由来が何れも92.4%となって
いる事が分かる。しかしながら、95%と最も相同性の高
いシュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)M
-12-33由来のリパーゼ遺伝子と本願のリパーゼ遺伝子と
を比較した場合でも、アミノ酸数にして16の置換が認め
られる。
ーブ油75mlを混合乳化した基質溶液5mlと0.2Mマッキ
ルバイン緩衝液(pH7)4mlを平底試験管にとり、37
℃、5分間予温する。これに試料溶液1mlを加え良く振
り混ぜ、直ちに37℃、30分間放置する。30分後にアセト
ン・エタノール混液(1:1)10mlを加え良く振り混ぜ
る。これに0.05N水酸化ナトリウム溶液10ml及びアセト
ン・エタノール混液(1:1)10mlを加え、更にフェノ
ールフタレイン試液2滴を加えて窒素ガスを液面に吹き
つけながら、スターラーにて攪拌しつつ、0.05N塩酸で
pH10.00まで滴定する。ブランク値は試料溶液の代わり
に精製水を用い、同様操作する。酵素力価は1分間に1
マイクロモルの脂肪酸を生成するときを1単位とする。
的に説明するが、本願発明は、これらによって何等限定
されるものではない。 試験例1 シュードモナス・セパシア(Pseudomonas ce
pacia)A-0727を大豆油2.0%、ペプトン 0.5%(Difco
社製)、ビーフ・イクストラクト 0.3%(Difco社
製)、KH2PO4 0.1%、MgSO4・7H2O 0.02%、FeSO4・7H2
O 0.001%、アデカノール1滴よりなる液体培地で、30
℃、3日間振とう培養し、遠心分離によりリパーゼ活性
21u/mlの培養上清を得、得られた培養上清を希釈し
て、酵素液として使用し、本菌株の生産するリパーゼに
対する各種界面活性剤の影響を調べ、その結果を表2に
示す。尚、対照としては、シュードモナス・セパシア
(Pseudomonas cepasia)M-12-33株由来のリパーゼを用
いた。
るリパーゼ(A-0727リパーゼ)は、対照のリパーゼ(M-
12-33リパーゼ)に比較して、界面活性剤のトリトンX-1
00やソデウム・ドデシルサルフェートによる阻害が小さ
いことが分かる。
727株をLB培地で、30℃にて一晩好気的に振とう培養
を行い、集菌後、斎藤,三浦法によるDNA抽出法によ
り染色体DNAを抽出・精製し、染色体DNA 5.0mgを
得た。
素PstIで切断し、末端をヌクレアーゼS1処理及びクレノ
ウフラグメントで処理後、8.1Kb断片を抽出し、一方、p
UC-4K(Pharmacia製)4.63μgから同様の操作によりカ
ナマイシン耐性遺伝子を含む1.4Kb断片を調製し、両者
をT4−DNAリガーゼで連結した後、大腸菌C600株を
形式転換してカナマイシン耐性株を得、該カナマイシン
耐性株よりプラスミドを調製し、PstI非分解性のプラス
ミドを選択して制限酵素HpaIで分解した。尚、プラスミ
ドの調製は、大腸菌C600株よりマニアチスらの、モルキ
ュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル
〔Maniatis et al,Molecular Cloning a laboratory m
anual.,92巻〜94巻(1981)〕に記載の方法により行っ
た。
を制限酵素HindIIIで切断した後、クレノウフラグメン
トで処理し、アガロースゲル電気泳動後、2.7Kb断片を
抽出し、前者と合した後、T4−DNAリガーゼで連結
し、大腸菌C600株を形質転換してアンピシリン及びカナ
マイシン耐性株を得、該耐性菌からプラスミドを抽出
後、制限酵素SacIで分解し、セルフライゲーションを行
ってマルチプルクローニングサイトの導入されたプラス
ミドベクターpFL200を作製した。
マンハイム社製)1μgを制限酵素HhaIで切断後、ヌク
レアーゼS1処理及びクレノウフラグメントで処理し、
アガロースゲル電気泳動後、クロラムフェニコール耐性
遺伝子を含む約1.4Kb断片を抽出し、予め制限酵素SmaI
で切断したプラスミドpUC18と混合後、T4−DNAリ
ガーゼで連結し、大腸菌C600株を形質転換し、クロラム
フェニコール耐性株を選択し、プラスミドDNAを抽出
し、制限酵素BamHI、KpnIで分解後、約1.4KbDNA断片
を採取し、一方、0.5μg pFL200も同じ制限酵素BamHI、
KpnIで分解して前記DNA断片と混合した後、T4−D
NAリガーゼで連結し、大腸菌C600株を形質転換してク
ロラムフェニコール、カナマイシン2剤耐性株を選択
し、耐性菌よりプラスミドを抽出し、プラスミドベクタ
ーpFL210と命名した。
の挿入 上記染色体DNA 4.7μgをとり、制限酵素HindIIIを加
え、37℃で5分間反応させて、部分的に切断し、一方、
プラスミドpFL210 2.0μgに制限酵素HindIIIを加え、37
℃で2時間反応させ、完全に切断したプラスミドDNA
にアルカリ性ホスファターゼを加え、脱リン酸化し、切
断した染色体DNAとプラスミドベクターDNAを混合
し、DNAリガーゼを加えて一夜反応させてDNA鎖の
連結反応を行った。
選択、分離する際、宿主はハロー欠損株が便利であるの
で、シュードモナス・セパシア(Pseudomonascepacia)
M-12-33株(FERM-P No.9871)をニトロソグアニジン処
理して得たハローを形成しない変異株HWIOを使用した。
エレクトロポレーション法が非常に有効なことを見い出
しており、本発明においても同様に実施した。
対数増殖期(OD660=0.4)になるまで培養し、冷却後、
10,000rpm、5分間遠心分離を行い集菌し、菌体を10ml
の272mMシュークロース,0.7mMリン酸ナトリウム緩衝液
(pH 7.4)で洗浄し、再び遠心分離した後、同緩衝液
0.8mlに懸濁し、連結した組換え体DNAを加え、6,250
V/cmのパルスをかけ、LB培地 5.6mlを加え、30℃に
て2時間振とう培養し形質転換株を得た。
トロポレーション法にてHWIO株を形質転換し、100μg/
mlクロラムフェニコール、0.2%トリオレインを含む選
択培地にまき、ハロー形成株12株を得た。
同定 前記ハロー形成株12株よりプラスミドを抽出し、制限酵
素HindIII及びEcoRIで切断、アガロース電気泳動で挿入
されたDNA断片の解析を行ない、HindIIIでは唯一の
約9KbDNA断片の挿入が示され、EcoRIでは数本のD
NA断片からなる2種のタイプに分けられる事が示され
た。即ち、これら2種タイプのプラスミドの制限酵素地
図を作成した結果から方向性の異なる唯一のDNA断片
が挿入された2種のプラスミドである事が確認された。
と命名し、pLPA1の制限酵素地図を図2に示す。
を含むと考えられる約9KbのDNA断片を各種制限酵素
により切断し、各DNA断片をpFL210にサブクローニン
グして、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepa
cia)HW10株を形質転換させ、前記と同様にしてトリオ
レイン培地におけるハロー形成の有無を調べた。
断片以上のDNA断片が必要なことが示され、本発明者
らは、本DNA断片の全塩基配列をDNAシーケンサー
373A〔アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosy
stems)社製〕を使用して決定した。そして、このDN
A断片中にリパーゼ遺伝子の含まれる事が判明し、その
推定されるリパーゼのアミノ酸配列は、配列表の配列番
号:1に示される。
モナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)HW10株を形
質転換し、得られた形質転換株シュードモナス・セパシ
ア(Pseudomonas cepacia)HW10(pLPA1)を大豆油 2.0
%、ペプトン 0.5%(Difco社製)、ビーフ・イクスト
ラクト 0.3%(Difco社製)、KH2PO4 0.1%、MgSO4・7H
2O 0.02%、FeSO4・7H2O 0.001%、アデカノール1滴よ
りなる液体培地で、30℃、3日間振とう培養し、遠心分
離によりリパーゼ活性430u/mlの培養上清を得た(本形
質転換株の酵素生産能は親株Pseudomonas cepacia A-07
27株のリパーゼ生産の約20倍であった。)。
性剤に耐性を有するリパーゼ生産菌株シュードモナス・
セパシア(Pseudomonas cepacia)A-0727のリパーゼ遺
伝子をクローニングし、該遺伝子をプラスミドに導入
し、シュードモナス属菌に形質転換したものであり、本
形質転換株を培養することにより、広範囲の工業分野に
おける有用な界面活性剤耐性のリパーゼを安価に提供す
ることができる。
リパーゼ構造遺伝子のアミノ酸配列を比較した図であ
り、図中(1)は、本願のシュードモナス・セパシア
(Pseudomonas cepacia)A-0727由来のもの、(2)
は、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepaci
a)M-12-33由来のもの、(3)は、シュードモナス・エ
スピー(Pseudomonas sp.)KWI-56由来のもの、(4)
は、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepaci
a)DSM-3959由来のものをそれぞれ示す。
すものである。
Claims (4)
- 【請求項1】配列表の配列番号:1で示されるアミノ酸
配列をコードするリパーゼ遺伝子。 - 【請求項2】配列表の配列番号:1で示されるアミノ酸
配列をコードするリパーゼ遺伝子をプラスミドに組み込
んだ組換えDNA。 - 【請求項3】シュードモナス属細胞内で発現し、配列表
の配列番号:1で示されるアミノ酸配列をコードするリ
パーゼ遺伝子をシュードモナス属菌細胞内で増殖し得る
プラスミドベクターに組み込んでなる組換えDNAを導
入したシュードモナス属菌。 - 【請求項4】配列表の配列番号:1で示されるアミノ酸
配列をコードするリパーゼ遺伝子をシュードモナス属細
胞内で増殖し得るプラスミドベクターに組み込んでなる
組換えDNAを導入したシュードモナス属菌を培養し、
培養物中にリパーゼを生成せしめ、これを採取すること
を特徴とするリパーゼの製造法。
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