FR2641285A1 - Gene de la glucose-6-phosphate deshydrogenase, plasmide et microorganisme le contenant et procede de preparation de la glucose-6-phosphate deshydrogenase - Google Patents

Abstract

Gène de glucose-6-phosphate déshydrogénase. Du DNA codant pour la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1. Produit de diagnostic.

Description

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Gène de la glucose-6-phosphate déshydrogénase, plasmide et microorganisme le contenant et procédé de préparation de la

glucose-6-phosphate déshydrogénase.

La présente invention est relative à un nouveau gène de la glucose-6phosphate déshydrogénase et à un procédé de préparation de la glucose-6phosphate déshydrogénase en

utilisant ce gène.

La glucose-6-phosphate déshydrogénase, qui peut être abrégée ci-après en G6PDH, est une enzyme qui catalyse

une réaction enzymatique pour donner du gluconolactone-6-

phosphate et la forme réduite de NAD(P), c'est-à-dire NAD(P) H, à partir de glucose-6-phosphate et de NAD ou de NADP que l'on appelle ci-après NAD(P). L'enzyme est largement répandue dans les règnes animal et végétal et on observe sa grande activité dans la glande cortico-surrénale, dans la rate et dans la glande mammaire pendant l'allaitement au sein parmi d'autres tissus animaux. Comme enzymes de ce genre réputées avoir été purifiées, on connait celles qui suivent: G6PDH provenant de la glande mammaire [J. Biol. Chem. 236, pages 754 à 758 (1961)]; G6PDH dérivée du foie [Biochem. J. 55, pages 400 à 408 (1953)]; G6PDH provenant des globules rouges

[J. Biol. Chem. 224, pages 1047 à 1064 (1957), Meth.

Enzymol., 9, pages 126 à 131 (1966) et J. Biol. Chem. 241, pages 4966 à 4976 (1966)]; G6PDH provenant de la levure de bière [J. Biol. Chem. 216, pages 67 à 79 (1955)]; G6PDH de Candida utilis [Z. physiol. Chem., 350, pages 626 à 634

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(1969), et Biochim. Biophys. Acta; 191, pages 509 à 516 (1969)]; G6PDH provenant de Leuconostoc mesenteroides,

Azotobacter vinelandii et Pseudomonas fluorescens [Meth.

Enzymol. 1, pages 328 à 335 (1955)] (Enzyme Handbook, pages 20 et 21, édition Asakura, 1984, troisième édition revue de la première édition). On connaît aussi G6PDH provenant de certaines bactéries appartenant au genre Bacillus, comme décrit dans Arch. Microbiol., 98, pages 275 à 287 (1974) et à

la demande de brevet publiée au Japon sous le No 43079/1988.

On a indiqué également la séquence des nucleotides du gène de la G6PDH humaine et celle du gène de la G6PDH du rat dans Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 83, pages 4157 à 4161 (1986) et

dans Nucleic Acids Research 16, page 7746 (1988).

G6PDH utilisée couramment comme enzyme pour le dosage de la créatinekinase pour diagnostiquer l'infarctus myocardique est une enzyme extrêmement utile. G6PDH, quand on l'utilise comme réactif du diagnostic, doit avoir une bonne

stabilité à long terme ainsi qu'une bonne stabilité thermi-

que. Il existe des problèmes pour préparer classiquement la G6PDH en utilisant des bactéries en produisant. En effet, la productivité en G6PDH de ces bactéries en produisant est si faible qu'il est difficile d'obtenir une grande quantité de l'enzyme à bas prix et d'éliminer les enzymes polluantes, par

exemple la NAD(P)H oxydase et la lactate déshydrogénase.

Après des recherches intenses, on a réussi à résou-

dre les problèmes mentionnés ci-dessus en isolant et en puri-

fiant, à partir de la bactérie définie ci-dessus appartenant au genre Bacillus, un gène codant pour la séquence d'acides aminés du polypeptide constituant G6PDH et en déterminant spécifiquement la structure primaire du DNA et celle de la

séquence d'acides aminés constituant cette enzyme. Il se con-

firme que la séquence de nucleotides du DNA et que la séquen-

ce d'acides aminés suivant l'invention sont des substances nouvelles parce qu'elles diffèrent, par leur constitution et par leur homologie, des séquences de nucleotides des gènes du

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G6PDH humain et du G6PDH de rat et par leurs séquences d'aci-

des aminés mentionnées ci-dessus.

Au dessin annexé: La figure 1 représente la séquence d'acides aminés du polypeptide constituant G6PDH. La figure 2 représente la séquence de DNA codant pour la séquence d'acides aminés du polypeptide constituant

G6PDH.

La figure 3 représente une carte de coupure du

plasmide pG6PDHl par des enzymes de restriction.

La présente invention vise: - un DNA codant pour la séquence d'acides aminés représentée à partir de son extrémité N à la figure 1; - un plasmide caractérisé en ce qu'il a un DNA codant pour la séquence d'acide aminés représentée à partir de son extrémité N à la figure 1; - un microorganisme transformé caractérisé en ce

qu'il porte un plasmide ayant un DNA qui code pour la séquen-

ce d'acides aminés représentée à partir de son extrémité N à la figure 1 et qui est étranger à un hôte; - un procédé de préparation de glucose-6phosphate déshydrogénase, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un microorganisme transformé portant un

plasmide ayant un DNA qui code pour la séquence d'acides ami-

nés représentée à partir de son extrémité N à la figure 1, et qui est étranger à un hôte, afin d'exprimer l'information génétique du DNA, et à recueillir la glucose-6-phosphate déshydrogenas de la culture; - un polypeptide composé de la séquence d'acides

aminés représentée à partir de son extrémité N à la figure 1.

Suivant l'invention, la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 peut contenir des radicaux d'acides aminés ou des radicaux de polypeptide à l'extrémité N et à l'extrémité C et elle peut également contenir un ou plusieurs radicaux acides aminés en amont de Thr à l'extrémité N, le ou

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les résidus d'acides aminés étant Met ou un peptide signal; elle peut également contenir ou plusieurs radicaux d'acides aminés en aval d'Ile à l'extrémité C. Le nouveau DNA codant pour la séquence d'acides aminés représentée à la figure 1 peut être un DNA comprenant une série de n'importe quels codons correspondant à chaque

acide aminé constituant la séquence d'acides aminés, y com-

pris les radicaux d'acides aminés ou les radicaux de polypep-

tide à l'extrémité N et à l'extrémité C. Ce DNA est représenté par du DNA ayant la séquence de nucléotides représentée à partir de son extrémité 5' à la figure 2. Ce DNA peut être un DNA ayant un ou plusieurs codons codant pour les acides aminés en amont de l'extrémité ', pourvu que les codons soient autres que TAA, TAG et TGA. De préférence, le DNA peut avoir un codon ATG ou un codon

d'initiation, à l'exception de 1'ATG, ou des codons corres-

pondant à un peptide signal. En aval d'ATA, à l'extrémité 3', le DNA peut avoir un ou plusieurs codons codant pour des acides aminés ou un codon de traduction de terminaison; en outre, dans le cas o le DNA a un ou plusieurs codons codant pour des acides aminés à l'extrémité 3', le DNA peut avoir de

préférence un codon de traduction de terminaison à l'extrémi-

té 3' du codon codant pour l'acide aminé.

Le DNA codant pour la séquence des acides aminés représentée à la figure 1 ou le DNA représenté à la figure 2 peuvent être obtenus de la manière suivante: on coupe le DNA, isolé et purifié à partir de la bactérie produisant le G6PDH, sous la forme d'un donneur du gène de G6PDH, par ultrasons ou par des enzymes de restriction et ensuite on le lie et on le cyclise à ses deux extrémités franches, ou à ses deux extrémités cohésives, par une DNA ligase, à un plasmide,

de préférence un vecteur d'expression linéarisé par coupure.

Après avoir transféré le plasmide recombinant obtenu dans une bactérie hôte apte à répliquer le DNA, on cultive la bactérie ayant le plasmide recombinant qui est obtenu par sélection en

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utilisant un marqueur du vecteur et l'activité de G6PDH comme -

indicateurs. On peut recueillir le DNA en tant que gène du G6PDH à partir du plasmide recombinant isolé et purifié à

partir de la culture de bactérie.

Comme bactérie pour un donneur de DNA, on préfère utiliser Bacillus sp. HT-3 ayant les propriétés taxonomiques suivantes, déposé sous le nom de FERM BP-2172 à l'Agency of Industriel Science and Technology, the Fermentation Research Institute.

La souche de Bacillus sp. HT-3, décrite ci-dessus, a les pro-

priétés taxonomiques suivantes: I. Caractéristiques de croissance

1. Milieu incliné normal gélosé. Présente une bonne crois-

sance filamenteuse. Donne une couleur blanc grisatre. Ne don-

ne pas de colorants solubles.

2. Plaque gélosée normale

Forme des colonies circulaires et leur circonfé-

rence est entièrement convexe. La colonie est d'un blanc gri-

sâtre. Elle ne produit pas de colorant soluble.

3. Milieu lacté BCP

On n'observe pas de changement.

4. Milieu liquide (peptone-eau) Présente une bonne croissance avec une turbidité uniforme. II. Propriétés morphologiques Le bacille avec sa région circonférentielle ronde ou un peu incurvée se présente seul ou à deux par chaine, ou

parfois sous la forme d'une chaîne courte, des cellules ana-

logues à des tétards et des cellules sphéroïdales étant pré-

sentes simultanément. Cellule en forme de bâtonnet: dimen-

sions de 0,5 à 0,8 jm x 2,0 à 3,0 Mm; cellule coccobacilli-

forme, dimension de 1,4 pm; en outre, des spores indogènes se forment à la circonférence ou à la sous-circonférence d'une cellule en forme de bâtonnet, mais les spores ne font

pas gonfler la cellule. Peritriche et mobile.

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III. Caractéristiques physiologiques et biochimiques Prise du Gram; + Réaction sur KOH; Formation de capsule; Coloration à l'acide; Test OF; 0 (oxydé)

Croissance dans des conditions anaérobie; -

Croissance dans des conditions aérobie; + Température de croissance 52 C; +

45 C; +

37 C;

pH de croissance 9,0; -

8,0; +

,2; +

4,7; -

Résistance au sel O % +

% +

Production de catalase; + Production d'oxydase; + Production d'uréase (SSR); Production d'uréase (Chris); (+) Production d'indol; Sulfure d'hydrogène (papier à

l'acétate de plomb); -

Production d'acétoïne;

Test MR; -

Réduction de nitrate; + Réaction de dénitrification; Décomposition de la gélatine; Décomposition d'hydrates de carbone; + Décomposition de la caséine; (+) Décomposition de l'esculine; + Décomposition de la cellulose; Décomposition de la tyrosine; (+)

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Test d'efficacité (milieu de Shimmons) Citrates; Maléates; Malates; Gluconates; Propionates; Malonates; Succinates; Test d'efficacité (milieu de Christensen) Citrates; Maléates; Malates; Gluconates; Propionates; Malonates; Succinates;

Production de gaz à partir de glucose; -

Production d'acide à partir de sucre (NH4H2PO4 utilisé comme source de N)

Adonitol; -

L(+)-arabinose; + Cellobiose; +

Durcitol; -

Mésoerythritol; Fructose; + Galactose; + Glucose; + Glycérine; + Inositol; + Inuline; Lactose; Maltose; + Mannitol; +

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Mannose; + Mélézitose; + Mélibiose; + Raffinose; + L(+)-rhamnose; Dribose; + Salicine; + L-sorbose; Sorbitol; Hydrate de carbone; + Saccharose; + Tréharose; + Xylose; +

(+ positif; (+) faiblement positif; - négatif).

IV. Propriétés principales de la présente souche bactérienne

La présente souche bactérienne est un bacillus pre-

nant le gram de circonférence ronde qui se présente sous la forme d'une chaîne unique ou d'une chaîne courte; la souche

est classée parmi les bactéries formant des spores et possé-

dant une aptitude à produire de la catalase. La souche décom-

pose le glucose par oxydation pour donner des acides.

V. Identification de la présente souche bactérienne La présente souche bactérienne est identifiée comme appartenant au genre Bacillus en fonction de ses propriétés principales, à savoir de prise du gram, de production de catalase et de formation de spores et est dénommée souche Bacillus sp. HT-3 en ayant été déposée à l'Agency of Industrial Science and Technology, the Fermentation Research

Institute sous la désignation FERM BP-2172.

Le DNA est obtenu à partir d'une bactérie servant de donneur de gène, comme il suit. Par exemple, une espèce

quelconque des bactéries servant de donneurs décrites ci-

dessus peut être cultivée sous agitation, dans un milieu

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liquide, dans des conditions aérées pendant 1 à 3 jours envi-

ron et le milieu de culture obtenu est centrifugé pour recueillir la bactérie, puis on fait suivre d'une lyse pour préparer un lysat contenant le gène de G6PDH. On effectue un traitement par des enzymes de solubilisation de la paroi cel- lulaire, telles que le lysozyme et la fglucanase, pour lyser les bactéries et, si nécessaire, on peut également utiliser en association des enzymes telles qu'une protéase, etc. et des agents tensio-actifs tels que du laurylsulfate de sodium;

en outre, on peut également utiliser une congélation-

décongélation telle qu'indiquée au brevet du Royaume-Uni de GrandeBretagne et d'Irlande 2 196 018, ou un traitement à la presse de French, comme procédé de rupture physique de la

paroi cellulaire, en association avec le procédé de solubili-

sation mentionné ci-dessus.

Pour isoler et pour purifier le DNA du lysat obtenu de cette façon, on le soumet à une combinaison convenable des

procédes suivants, par exemple à un traitement de déprotéi-

néisation avec extraction au phénol, un traitement par une

protéase, un traitement par une ribonucléase, une précipita-

tion à l'alcool, une centrifugation, etc. par des procédés classiques. Le procédé de rupture du DNA bactérien isolé et

purifié englobe le traitement par des ultrasons et un traite-

ment par des enzymes de restriction, de préférence par une enzyme de restriction et, plus particulièrement, par une enzyme de restriction de type II, telle que EcoRI, HindIII et BamHI, qui modifie les séquences spécifiques de nucléotides,

de sorte que le fragment de DNA obtenu puisse être lié faci-

lement à un vecteur.

Comme vecteurs, on préfère ceux obtenus à partir de

phages ou de plasmides aptes à proliférer d'une manière auto-

nome en vue d'une recombinaison génétique.

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Comme vecteurs provenant de phages, on peut utili-

ser Àgt. ÀC et Àgt. XB dans le cas d'Escherichia coli comme

bactérie hôte.

Comme vecteurs de plasmide, on peut utiliser pBR 322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13, pUC18, pUCl9, etc., dans le cas d'Escherichia coli servant de bactérie hôte, tandis qu'on peut utiliser pUB110, pC194, etc. dans le cas de Bacillus subtilis servant de bactérie hôte. En outre, on peut utiliser un vecteur navette qui peut se répliquer d'une manière autonome en deux ou en plusieurs types de bactéries

hôtes, telles qu'Escherichia coli et Sacchromyces cerevisiae.

On peut, de préférence, soumettre ces vecteurs à une diges-

tion avec les mêmes enzymes de restriction que celles utili-

sées pour la coupure du DNA bactérien servant de donneur du

gène de G6PDH, pour obtenir des fragments de vecteur.

Pour réunir des fragments bactériens de DNA à des fragments de vecteur, on peut effectuer un procédé connu, tel que le procédé utilisant une DNA ligase; c'est ainsi, par exemple, qu'après hybridation des extrémités cohésives des

fragments bactériens de DNA avec ceux des fragments de vec-

teur, une DNA ligase convenable agit de manière à donner un DNA recombinant composé des fragments bactériens de DNA et des fragments de vecteur. Si nécessaire, les fragments de DNA

et les fragments de vecteur sont, après hybridation, transfé-

rés ensuite dans une bactérie hôte pour donner un DNA recom-

binant en utilisant une DNA ligase présente dans les orga-

nismes vivants.

On peut utiliser toute bactérie hôte dans laquelle

le DNA recombinant peut croître d'une manière stable et auto-

nome et dans laquelle les propriétés du DNA étranger peuvent être exprimées; on peut utiliser par exemple Escherichia coli DH1; Escherichia coli HB101, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600, etc. parmi les espèces de bactéries

hôtes appartenant à Escherichia coli.

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Les procédés d'introduction du DNA recombinant dans -

une bactérie hôte peuvent englober un procédé utilisant l'ion calcium dans le cas de la bactérie appartenant au genre

Escherichia, tandis que dans le cas de la bactérie apparte-

nant au genre Bacillus, on peut utiliser le procédé de cel- lule compétente et le procédé de fusion-transfert par voie électrique, pour introduire un DNA recombinant liposomique dans une cellule hôte protoplaste. On peut également choisir

le procédé par micro-injection.

On peut étudier la présence de DNA recombinant dans une bactérie hôte en utilisant un marqueur du vecteur ayant le DNA recombinant visé, tel qu'un marqueur résistant aux médicaments et une bactérie susceptible d'exprimer G6PDH, par exemple une bactérie qui croît dans un milieu sélectif pour le marqueur résistant aux médicaments et qui donne du G6PDH,

peut être choisie de préférence en utilisant des colorants.

La relation quantitative utilisée en général dans

la manipulation génétique ci-dessus est, par exemple, la sui-

vante: on utilise une enzyme de restriction à raison de 1 à

10 U, une ligase à raison de 300 U et d'autres enzymes à rai-

son de 1 à 10 U, pour 0,1 à 10 Mg chacun du DNA provenant de

la bactérie servant de donneur et du DNA du plasmide.

La bactérie, obtenue ainsi sous la forme d'une bac-

térie transformée, par exemple la bactérie appartenant à Escherichia coli et, d'une manière plus large, au genre Escherichia, est susceptible de produire une grande quantité de G6PDH d'une manière stable en étant cultivée dans un milieu nutritif. Comme exemple spécifique du microorganisme transformé, le DNA représenté à la figure 2 est inséré dans le plasmide pACYC184 [voir J. Bacteriol. 134, 1141 (1981)], transforme la bactérie hôte Escherichia coli DH1 [voir T. Maniatis., et coll., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982), 504-506], puis la bactérie choisie, susceptible de

produire G6PDH, est définie comme Escherichia coli DH1.

pG6PDHl déposée sous le nom de FERM BP-2174 à l'Agency of

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Industrial Science and Technology, the Fermentation Research Institute. Le DNA recombinant une fois sélectionné de cette façon peut être isolé facilement de la bactérie transformée ayant le DNA recombinant, puis il peut être introduit dans d'autres bactéries hôtes. En outre, le DNA recombinant est coupé par des enzymes de restriction de manière à sortir le DNA codant pour la séquence d'acides aminés du polypeptide constituant le G6PDH, suivie d'une ligature avec l'extrémité du vecteur linéarisé obtenu par la digestion, de la même façon que décrit ci-dessus, pour préparer un DNA recombinant

ayant une caractéristique nouvelle. On peut également intro-

duire facilement le nouveau DNA recombinant dans d'autres

bactéries hôtes.

On peut sélectionner le DNA recombinant et le vec-

teur contenant le DNA recombinant par hybridisation par colo-

nies, en utilisant un échantillon préparé sur une séquence partielle de nucleotides du DNA codant pour la séquence

d'acides aminés représentée à la figure 1 ou du DNA représen-

té à la figure 2.

On peut modifier le G6PDH suivant l'invention, par rapport à son peptide, en utilisant une technique connue de

manipulation génétique et le DNA obtenu codant pour la mutéi-

ne représente un gène artificiel variant engendré à partir du gène de G6PDH, suivant l'invention, par génie génétique; le gène artificiel variant peut être obtenu en utilisant diverses techniques du génie génétique telles que le procédé de conversion de base à site spécifique et le remplacement d'un fragment spécifique de DNA du gène visé, pour obtenir un

fragment artificiel de variant. Parmi certains gènes artifi-

ciels variants ainsi obtenus, un DNA de mutation de G6PDH

ayant des caractéristiques particulièrement bonnes est intro-

duit finalement dans un vecteur pour créer un DNA recombi-

nant, puis l'introduction du DNA recombinant obtenu permet de produire une mutéine de G6PDH. Des exemples particuliers de

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vecteurs qui contiennent du DNA codant pour G6PDH peuvent englober un plasmide (désigné par pG6PDH) provenant de Escherichia coli DH1. G6PDH. La carte de coupure du plasmide

pG6PDH est comme indiquée à la figure 3.

On détermine la séquence de nucléotides du DNA

codant pour la séquence d'acides aminés du polypeptide cons-

titutif du G6PDH ainsi obtenu par les procédés ci-dessus, par le procédé au didéoxy décrit dans Science, 214, 1205-1210 (1981), tandis que l'on évalue et on détermine la séquence

des acides aminés du polypeptide constituant le G6PDH à par-

tir de la séquence des nucleotides. En variante, on détermine la séquence des acides aminés à l'extrémité N du polypeptide du G6PDH qui a été cultivé et purifié par le procédé décrit ci-après, par un séquenceur de protéines en phase liquide (système BECKMAN 890ME, fabriqué par Beckmann, Co., Ltd.). On confirme ensuite que la séquence d'acides aminés correspond, au moins à l'extrémité N du G6PDH, à la séquence partielle

d'acides aminés déterminée par estimation.

Le procédé de préparation du G6PDH à partir de la bactérie transformée consiste à cultiver le microorganisme ou

la bactérie transformée dans un milieu de culture, pour pro-

duire le G6PDH dans une bactérie ou dans un bouillon de cul-

ture, à recueillir la bactérie par un procédé de filtration

ou de centrifugation du bouillon de culture après que la cul-

ture est achevée, à rompre ensuite mécaniquement ou enzymati-

quement la bactérie, par exemple en utilisant du lysozyme,

tout en ajoutant, si nécessaire, de l'acide éthylènediamino-

tétraacétique et/ou un agent tensio-actif convenable et à isoler et à recueillir le G6PDH en solution-tampon. On peut concentrer la solution de G6PDH obtenue, alors qu'en variante

on peut la traiter par fractionnement par du sulfate d'ammo-

nium, par filtration de gel, par chromatographie d'absorp-

tion, y compris la chromatographie par affinité et la chroma-

tographie par échange d'ion, pour obtenir le G6PDH en une

grande pureté.

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Dans le cas o l'on sélectionne une bactérie hôte convenable, telle que Escherichia coli, en particulier, on

peut ajouter de préférence un processus de chauffage au pro-

cédé ci-dessus. C'est ainsi, par exemple, qu'un traitement du bouillon de culture et de la bactérie solubilisée et rompu à C pendant 16 heures permet de réaliser une purification

extrêmement simplifiée du G6PDH et permet, en outre, d'élimi-

ner de manière efficace des enzymes polluantes éventuelles qui peuvent poser des problèmes lorsqu'on utilise le G6PDH

pour le diagnostic clinique. On obtient du G6PDH ayant d'ex-

cellentes propriétés, sans que l'on puisse détecter l'influ-

ence d'enzymes polluantes. Les enzymes polluantes peuvent englober de la NAD(P)H oxydase, de la lactate déshydrogénase,

de la glucose isomérase, de l'ATPase, de l'alkaline phospha-

tase, de la phosphoglucomutase, le l'hexose-6-phosphate iso-

mérase, de la NAD(P) nucléosidase, de la malate déshydrogéna-

se, de la succinate déshydrogénase, etc. Pour la NAD(P)H oxy-

dase et la lactate déshydrogénase, qui sont difficiles à éli-

miner et qui posent problème lorsqu'on utilise G6PDH pour le diagnostic clinique, l'invention procure du G6PDH dans lequel l'activité de chacune de la NAD(P)H oxydase et de la lactate déshydrogénase est de 0,0001 unité ou inférieure à cette

valeur pour 100 unités de G6PDH.

Les conditions de culture de la bactérie telles que transformées peuvent être sélectionnées en fonction de ses exigences physiologiques en matière de nutrilites. On peut,

habituellement, effectuer une culture liquide dans de nom-

breux cas. Une culture avec forte aération et sous agitation est préférable. Comme nutrilites, on peut utiliser ceux que

l'on emploie d'une manière routinière pour la culture de bac-

téries. Comme source de carbone, on peut utiliser n'importe quel hydrate de carbone qui peut être métabolisé, par exemple

le glucose, le saccharose, le lactose, le maltose, le fruc-

tose, le miel, etc.; comme source d'azote, on peut utiliser n'importe quel composé azoté, par exemple de la peptone, du

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bouillon de viande, de l'extrait de levure, de l'hydrolysat de caséine, etc. On peut en outre utiliser, si nécessaire,

des sels tels que des phosphates, des carbonates, des sul-

fates, des sels de magnésium, de calcium, de potassium, de fer, de manganèse, de zinc, etc., des acides aminés particu-

liers, des vitamines particulières.

On peut modifier de manière convenable la tempéra-

ture de culture dans la plage o la bactérie peut croître, pour produire du G6PDH, de préférence en opérant entre 20 et

42 C environ dans le cas d'Escherichia coli. La durée de cul-

ture varie plus ou moins en fonction des conditions de cul-

* ture, mais habituellement elle est de 12 à 48 heures quand la culture est achevée à un instant déterminé o l'on estime

avoir atteint le rendement maximum en G6PDH. On peut égale-

ment modifier, de manière adéquate, le pH du milieu de cul-

ture dans la plage o la bactérie peut croître pour produire

du G6PDH, de préférence dans la plage de 6,0 à 8,0.

Pour utiliser le G6PDH présent dans le bouillon de

culture, on prend le bouillon de culture contenant la bacté-

rie tel qu'il est. Quand le bouillon de culture contient du G6PDH, on le sépare en la solution contenant du G6PDH et en

les cellules bactériennes par filtration et par centrifuga-

tion. Quand le G6PDH est contenu dans les cellules, on isole la bactérie du bouillon de culture obtenu, par exemple par

filtration ou par centrifugation, puis on la rompt mécanique-

ment ou enzymatiquement en utilisant du lysozyme; si néces-

saire, on peut ajouter un agent chélatant tel que de l'acide éthylènediaminetétracétique et/ou un agent tensio-actif pour solubiliser le G6PDH, pour l'isoler et pour le recueillir

dans une solution-tampon.

On laisse précipiter la solution ainsi obtenue, contenant du G6PDH, avec concentration sous pression réduite,

concentration de membrane, processus de relargage en utili-

sant du sulfate d'ammonium ou du sulfate de sodium, ou pro-

cédé de précipitation fractionné en utilisant des solvants

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organiques hydrophiles, par exemple du méthanol, de l'éthanol et de l'acétone. On dissout ensuite le précipité dans de l'eau et on dialyse contre une membrane semi-perméable, pour éliminer les impuretés de bas poids moléculaire. On concentre en outre -la solution contenant du G6PDH et purifiée par fil- tration de gel en utilisant des agents adsorbants ou des

agents de filtration par gel, une chromatographie d'adsorp-

tion telle qu'une chromatographie d'affinité, une chromato-

graphie d'échange d'ion, etc., en procédant sous pression réduite et onlyophilise jusqu'à obtention de G6PDH sous une

forme purifiée.

Le G6PDH ayant par exemple les propriétés suivantes

est l'un des G6PDH obtenus de la manière mentionnée ci-

dessus. (1) Dosage d'activité 1. Dosage de l'activité de G6PDH Solution de réaction Tampon au phosphate 0,2 M (pH 7,5) 0,2 ml BSA (albumine sérique du boeuf) 10 % 0,05 ml Triton X-100 1% 0,1 ml NADP 10 mM 0,1 ml Diaphorase 100 U/ml 0,05 ml NBT 0,25 % 0,1 ml Glucose-6-phosphate 0,2 ml Eau distillée 0,2 ml Protocole opératoire On met la solution de réaction (1,0 ml) ayant la composition ci-dessus dans un tube à essai et on la porte d'abord à 37 C pendant 3 minutes, puis on ajoute 20.l d'une solution d'enzyme contenant du G6PDH. On abandonne le mélange à 37oC pendant 10 minutes, pour effectuer une réaction. On met fin à la réaction par addition de 2,0 ml de HCl 0,1 N et on mesure l'absorbance à 550 nm. L'activité du G6PDH qui

oxyde 1 gmole de glucose-6-phosphate en gluconolactone-6-

phosphate par minute est définie comme 1 unité (U).

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2. Dosage de l'activité de la NAD(P)H oxydase Solution de réaction Tampon HC1 tris 80 mM (pH 8,5) 0,5 ml NAD(P)H 0,6 mM 0,5 ml Protocole opératoire. On met la solution de réaction (1,0 ml) ayant la composition ci-dessus dans une cellule en quartz de 2,0 ml et

on fait incuber à 370C pendant 5 minutes. A la solution obte-

nue, on ajoute sous agitation 0,2 ml de la solution de G6PDH dont la concentration a été ajustée à 5000 U/ml, puis on mesure périodiquement la diminution de A340 (A A) à 37 C. On définit comme 1 unité (U) l'activité de la NAD(P)H oxydase

qui fait diminuer le NAD(P)H à une vitesse de 1 Mmole/minute.

A A 1 1,2

U/ml = x x -

T 6,22 0,2

T; durée de réaction 6,22; coefficient d'extinction millimolaire de NAD(P) H

à 340 nm (cm2/gmole).

3. Dosage de l'activité de la lactate déshydrogénase Solution de réaction Tampon HCl-tris 0,2 M (pH 8,5) 0,2 ml Pyruvate de sodium 0,1 M 0,1 ml NAD(P)H 3 mM 0,1 ml Eau distillée 0,6 ml

Protocole opératoire.

On met la solution de réaction (1,0 ml) ayant la composition ci-dessus dans une cellule en quartz de 2,0 ml et on laisse incuber à 37 C pendant 5 minutes. A la solution obtenue, on ajoute sous agitation 0,2 ml de la solution G6PDH dont la concentration a été ajustée à 5000 U/ml, puis on

mesure la réduction de puis on mesure périodiquement la dimi-

nution de A340 (A A) à 37 C. on définit comme 1 unité (U)

18 2641285

l'activité de la lactate déshydrogénase NAD(P)H, qui diminue

le NAD(P)H à une vitesse de 1 gmole/minute.

A A 1 1,2

U/ml = x x

T 6,22 0,2

T; durée de réaction 6,22; coefficient d'extinction millimolaire de NAD(P) H

à 340 nm (cm2/mole).

(2) Propriétés physico-chimiques (a) Action enzymatique: catalyse la réaction enzymatique donnant du gluconolactone-6-phosphate et du NAD(P)H à partir

de glucose-6-phosphate et de NAD(P).

(b) Spécificité au substrat; agit au moins sur le glucose-

6-phosphate. Substrat Activité relative (%) Glucose-6-phosphate 100 Mannose-6-phosphate 38,5 Galactose-6-phosphate 19,3 Fructose-6-phosphate 0 Glucose-l-phosphate 0 Glucosamine-6-phosphate 0 Acide 6- phosphogluconique 0 Coenzyme valeur Km (mM) NADP environ 8,3 x 10-3 NAD environ 1,2

(c) pH optimum; 8 à 9.

Des solutions-tampons ayant des pH différents sont utilisées pour mesurer un pH optimum par le procédé de dosage enzymatique mentionné ci-dessus. Les résultats montrent que

le pH optimum est compris entre 8 et 9.

(d) Point isométrique; 6,1 0,6.

On utilise l'électrophorèse donnant le point iso-

électrique en utilisant AMPHOLINE PAGPLATE (marque de fabrique) fabriqué par LKB Co. Ltd., pour déterminer le point

19 2641285

isoélectrique. Les résultats montrent que le point isoélec-

trique est pI 6,1 0,6.

(e) Stabilité thermique; stable à un traitement à 650C

environ pendant 15 minutes.

Quand on traite un échantillon de G6PDH dans un

tampon de HCl-tris à 40 mM d'un pH de 7,5 à diverses tempéra-

tures, pendant 15 minutes, l'activité subsiste à 100 % envi-

ron à 65 C ou à une température inférieure et à 70 % environ

à 700C.

(f) Stabilité au pH; stable à un pH de 6 à 8 (à 70 C pen-

dant 15 minutes).

Comme tampons d'essai du pH, on utilise un tampon de DMG (acide diméthylglutarique) 40 mM dans une plage de pH de 4,5 à 6,5; un tampon au phosphate à 40 mM dans une plage de pH de 6,0 à 8,0; un tampon à l'HCltris à 40 mM dans une

plage de 7,0 à 9,0.

(g) Masse moléculaire; environ 270.000.

On détermine la masse moléculaire par chromatogra-

phie sur colonne sur TSK-Gel G3000 SW. On utilise les pro-

téines suivantes comme protéines de référence: Ovalbumine 45.000 Albumine sérique du boeuf 67.000 Aldorase (du muscle du lapin) 150.000 Catalase (du foie de veau) 210.000 On étudie, comparativement, la masse moléculaire mesurée avec la séquence d'acides aminés du G6PDH et on estime que le G6PDH suivant l'invention existe sous la forme

d'un corps associé des polypeptides de 4 à 6.

(h) Inhibiteur; l'activité est inhibée par la présence de Mn2+, Cu2+ Al3+

Dans le présent mémoire, on utilise les abrévia-

tions suivantes pour l'aminoacide, le peptide, l'acide

2641285

nucléique, et autres. Tous les aminoacides représentent leur forme L. DNA: acide désoxyribonucléique RNA: acide ribonucléique A: adénine T: thymine G: guanine C: cytosine Ala: alanine Arg: arginine Asn: aspargine Asp: acide aspartique Cys: cystéine Gln: glutamine Glu: acide glutamique Gly: glycine His: histidine Ile: isoleucine Leu: leucine Lys: lysine Met: méthionine Phe: phénylalanine Pro: proline Ser: sérine Thr: thréonine Trp: tryptophane Tyr: tyrosine Val: valine Les exemples suivants illustrent l'invention qui

n'est pas limitée à ceux-ci.

Exemple 1

Isolement du DNA chromosomique.

- 21 2J41285

On isole du DNA chromosomique, par le procédé sui-

vant, à partir de la souche Bacillus sp. HT-3 définie comme étant FERM BP2172. On cultive la souche bactérienne sous agitation dans 150 ml du milieu à base de bouillon normal, à 500C pendant une nuit, on centrifuge à 3000 tours/minute pen-

dant 10 minutes et on récolte. On ajoute, aux cellules récol-

tées, une solution de lysozyme dans 5 ml de solution conte-

nant 10 mg de lysozyme/ml et contenant 10 % de saccharose, 50

mM de tampon HCl-tris (pH 8,0), et 50 mM d'acide éthylènedia-

minotétracétique et on maintient à 37 C pendant 15 minutes, puis on fait suivre de l'addition de 1 ml d'une solution de

SDS (dodécylsulfate de sodium) à 10 %. A la suspension obte-

nue, on ajoute un volume égal d'une solution mixte de chloro-

forme et de phénol (1:1) et on mélange sous agitation, puis on fait suivre d'une centrifugation à 10.000 tours/minute pendant 3 minutes, de manière à séparer une phase aqueuse d'une phase de solvant. Sur la phase aqueuse séparée, on met un volume double d'éthanol et on isole le DNA alors qu'il est enroulé autour d'une tige de verre, en agitant peu à peu avec la tige de verre. On dissout le DNA isolé dans 10 ml de la solution contenant le tampon d'HCl-tris à 10 mM (pH 8,0) et 1 mM d'acide éthylènediaminetétracétique (cette solution est abrégée, ci-après, en TE), pour le traiter par un volume identique d'une solution mixte de chloroforme et de phénol

(1:1) et on centrifuge pour séparer une phase aqueuse.

Ensuite, on ajoute un volume double d'éthanol à la phase

aqueuse séparée et on reprend le même mode opératoire que ci-

dessus pour isoler à nouveau du DNA, que l'on solubilise dans

2 ml de TE.

Exemple 2

Isolement du DNA du plasmide pACYC184.

On cultive Escherichia coli pM191, possédant pACYC184 (voir J. Bacteriol. 134, 1441 (981); ATCC 37033), sous agitation dans 1 litre du milieu BHI (produit de Difco

Laboratories). Quand la turbidité du milieu atteint une den-

22 264128S

sité optique660 de 1,0, on y ajoute de la spectinomycine jusqu'à une concentration finale de 300 Mg/ml et on continue à agiter à 37 C pendant 16 heures. On recueille les cellules bactériennes par centrifugation à 300 tours/minute pendant 10 minutes, puis on les traite, pour préparer le DNA du plasmide

par les procédés au lysozime-SDS et au chlorure de césium-

bromure d'éthidium décrits par Maniatis dans Molecular

Cloning, pages 86 à 94, Cold Spring Harbor (1982).

Exemple 3

Construction du plasmide pG6PDH 1 ayant le gène G6PDH.

(i) On mélange le DNA chromosomique (2 il; 0,5 g environ) de la souche de Bacillus sp. HT-3 préparée à

l'exemple 1, à 1 4l d'un tampon de coupure ayant une concen-

tration dix fois plus grande que celle qu'il a quand on effectue une réaction enzymatique [100 mM d'HCl-tris (pH

8,0), 70 mM de MgCl2, 1,0 M de KCl, 70 mM de mercaptoétha-

nol], 1 il de 3 unités/ml de MboI (fabriqué par Takara, Co.) et 6 il d'eau, et on coupe à 37 C pendant 1 heure. On coupe le DNA du plasmide pACYC184 (0,3 g environ) préparé en variante par du BamHI, en suivant la même technique, puis on ajoute 0,6 unité de phosphatase alcaline pour laisser incuber

à 65 C pendant 1 heure. On mélange les deux solutions conte-

nant, chacune, du DNA coupé, puis on y ajoute un dixième en volume d'acétate de sodium 3 M. On traite la solution obtenue par une solution d'un mélange de chloroforme et de phénol d'un volume identique au volume total de la solution obtenue

et on centrifuge, pour séparer une solution aqueuse à laquel-

le on ajoute deux fois son volume d'éthanol et on centrifuge pour précipiter du DNA. On sèche le DNA sous pression réduite et on le dissout dans 89 4l d'eau, puis on fait suivre d'une addition et d'un mélange de 10 4l d'un tampon de ligature, en

une concentration dix fois plus importante, composée d'HCl-

tris 0,5 M (pH 7,6), de MgCl2 0,1 M; de dithiothréithol 1,0 M, de spermidine 10 mM et d'ATP 10 mM, avec 1 Ml (175 unités) de T4 DNA ligase (fabriquée par TAkara, Co.). On maintient la

23 2641285

solution de DNA obtenue à 4 C pendant une nuit. On traite la -

solution de DNA par du chloroforme et par du phénol et on sépare un précipité éthanolique que l'on sèche sous pression

réduite et que l'on redissout dans 10 Al de TE.

(ii) On cultive la souche d'Escherichia Coli DH1 dans la phase de croissance logarithmique dans 100 ml du milieu BHI (la souche est obtenue auprès de l'Institut National de Génétique au Japon; son numéro de stockage est ME8569; ATCC 33849). On la recueille par centrifugation à

10.000 tours/minute pendant 2 minutes et on la met en suspen-

sion dans 40 ml d'une solution refroidie par de la glace et contenant 30 mM d'acétate de potassium (pH 5,8), 100 mM de

RbCl, 10 mM de CaCl2, 50 mM de MnCl2 et 15 % de glycérine.

Apres l'avoir maintenue à 0 C pendant 5 minutes, on centri-

fuge la solution et on jette la couche surnageante. Le préci-

pité recueilli est remis en suspension dans 4 ml de la solu-

tion contenant 10 mM de tampon MOPS (fabriqué par Dohtite

Co.) (pH 6,5), 75 mM de CaCl2, 10 mM de RbCl et 15 % de gly-

cérine et on laisse au repos à 0 C pendant 15 minutes. On

utilise les cellules obtenues comme cellules compétentes.

(iii) A 200 jil de la suspension de cellules, on ajoute 10 41 de la solution de DNA préparée en (i) et on abandonne à 0 C pendant 30 minutes, puis on fait suivre de

l'addition de 1 ml du milieu BHI. On étale la solution obte-

nue de 100 Al sur une plaque gélosée de BHI contenant 25 pg/ml de chloramphénicol et on effectue une culture à 37 C

pendant une nuit pour produire des microorganismes transfor-

més. On réplique les microorganismes transformés sur une plaque de gélose de titration (elle est composée de 4 ml de tampon au phosphate 1 M (pH 6, 5), de 1 ml de Triton X-100 à %, de 1 ml de NADP à 100 mM, de 1 ml de diaphorase à 500 U/ml, de 2,5 ml de NBT à 1 %, de 2 ml de glucose-6phosphate 1 M, de 1,5 g de gélose et de 88,5 ml d'eau distillée), et on

observe sa variation de couleur à la température ambiante.

24 2641285

La bactérie transformée forme des colonies en un nombre de 4500 environ. On trouve qu'une colonie, parmi les 4500 environ, vire au bleu d'une manière plus intense que d'autres colonies et on définit cette souche bactérienne comme la souche Escherichia coli DH1. pG6PDH1, FERM 2174. Apres isolement et purification, on cultive la bactérie dans le milieu BHI à 37 C pendant une nuit pour examiner son potentiel de production de G6PDH que l'on trouve être de 18

U/ml qui représente l'activité de G6PDH.

On isole le plasmide possédé par la souche bacté-

rienne par le mode opératoire de l'exemple 2 et on le définit comme étant pG6PDHl contenant le gène G6PDH et le gène pACYC 184.

Exemple 4

Cartographie de pG6PDH1 et détermination de la séquence des

nucleotides du gène G6PDH.

On prépare du DNA du plasmide pG6PDH1 à partir de

la souche Escherichia coli DH1. pG6PDH1 par le même proto-

cole opératoire que pour pACYC 184.

On prépare la carte de coupure du DNA du plasmide pG6PDHl par des enzymes de restriction, EcoRI, ClAI, EcoRV, HindIII, BglII, SphI, NrUI, HpaI, MluI, NcoI, ApaLI et XbaI (les enzymes de restriction sont toutes des produits de Takara, Co.). Les résultats obtenus sont indiqués à la figure 3. La séquence des nucleotides du DNA contenant le gène G6PDH est déterminée par le procédé di-déoxy en utilisant le phage M13 [Science 214, pages 1205 à 1210 (1981)]. La séquence des acides aminés et la séquence des nucleotides du gène de

structure G6PDH sont indiquées aux figures 1 et 2, respecti-

vement.

Exemple 5

Production de G6PDH On cultive la souche Esterichia coli DH1. pG6PDH1 dans 4 litres du milieu BHI (Difco Laboratories) contenant 30 pg/ml de chloramphénicol (Sankyo Pharmaceuticals, Co.) dans

264125

un fermenteur à 37 C pendant 18 heures et on effectue une récolte par centrifugation à 5000 tours à la minute pendant

minutes.

On lave les bactéries récoltées par 1 litre de tam-

pon au phosphate à 20 mM (pH 7,0) et on les met en suspension dans 500 ml d'un tampon au phosphate à 200 mM (pH 7,0). A la

suspension obtenue, on ajoute du lysozyme, de l'acide éthylé-

nediaminotétracétique disodique et du Triton X-100 jusqu'à

des concentrations finales de 1 mg/ml, 2 mM et 0,1 %, respec-

tivement, puis on laisse au repos à 37 C pendant 30 minutes en faisant suivre d'un ajustement du pH à 7,0, puis on traite en portant à 60 C pendant 6 heures et on centrifuge à 5000 tours à la minute pendant 15 minutes pour séparer 420 ml de

la couche surnageante (l'activité du G6PDH est de 162 U/ml).

A la couche surnageante, on ajoute 840 ml d'acétone et l'on fait suivre d'une centrifugation à 5000 tours à la minute pendant 15 minutes pour séparer le précipité que l'on remet en suspension dans 500 ml d'un tampon au phosphate à 20 mM

(pH 7,0) et que l'on centrifuge à 5000 tours à la minute pen-

dant 15 minutes, ce qui permet de séparer 480 ml de la couche

surnageante (l'activité du G6PDH est de 114 U/ml). On effec-

tue une chromatographie par échange d'ion sur une colonne de

DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals, Co.) tampon-

née par un tampon au phosphate à 20 mM (pH 7,0), pour frac-

tionner des fractions actives que l'on réunit et que l'on dessale en utilisant un tubage en cellulose sans couture pour obtenir 300 ml d'une enzyme. Son activité de G6PDH est de 148 U/ml.

Exemple comparatif 1: Exemple classique.

On cultive Bacillus so. HT-3 (FERM BP-2172) dans 4

litres du milieu BHI (Difco Laboratories) dans un fermenta-

teur à bocal à 550 C pendant 18 heures et on effectue une récolte par centrifugation à 5000 tours à la minute pendant

minutes.

26 2641285

On lave les bactéries récoltées par 3 litre d'un

tampon au phosphate à 20 mM (pH 7,0) et on les met en suspen-

sion dans 500 ml d'un tampon au phosphate à 20 mM (pH 7,0). A la suspension obtenue, on ajoute du lysozyme, de l'acide éthylènediaminetétracétique disodique et du Triton X-100 jusqu'à des concentrations finales de 1 mg/ml, de 2 mM et de 0,1 % respectivement, puis on abandonne à 37 C pendant 30 minutes en faisant suivre d'un ajustement du pH à 7,0 avant

de traiter par chauffage à 600C pendant 6 heures et de cen-

trifuger à 5000 tours à la minutes pendant 15 minutes pour séparer 420 ml de la couche surnageante. On ajoute à celle-ci 840 ml d'acétone, puis on fait suivre d'une centrifugation à 5000 tours à la minute pendant 15 minutes pour séparer le précipité que l'on remet en suspension dans 500 ml de tampon au phosphate à 20 mM (pH 7,0) et que l'on centrifuge à 5000 tours à la minute pendant 15 minutes, ce qui provoque la séparation de 480 ml de la couche surnageante. On effectue

une chromatographie d'échange d'ion sur une colonne de DEAE-

Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals, Co.) tamponnée par un tampon au phosphate à 20 mM (pH 7,0) pour fractionner les

fractions actives que l'on réunit et que l'on dessale en uti-

lisant un tube en cellulose sans couture. On effectue une chromatographie sur une colonne d'octyl-Sepharose CL-4B (Pharmacia Fine Chemicals, Co.) tamponnée par du sulfate d'ammonium saturé à 30 % pour fractionner les fractions actives que l'on réunit et que l'on dessale en utilisant un

tube en cellulose sans couture. On effectue ensuite une chro-

matographie sur hydroxylapatite (KOKEN, Co.) pour fractionner les fractions actives que l'on réunit et que l'on dessale en utilisant un tube en cellulose sans couture. On effectue une chromatographie sur une colonne de blue-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals, Co.) pour fractionner les fractions actives que l'on réunit et que l'on dessale en utilisant un tube en

cellulose sans couture pour obtenir une enzyme.

27 2641235

On ajoute une petite quantité de BSA de qualité RIA (Sigma Co.) à chaque enzyme de l'exemple 5 et de l'exemple comparatif 1, et on lyophilise par le procédé classique. On mesure, comme indiqué dans les résultats suivants, l'activité du G6PDH, de la NAD(P)H oxydase (NAD(P)Hox) et de la lactate

déshydrogénase (LDH) des produits lyophilisés.

G6PDH(U/mg) NAD(P)Hox(U/mg) LDH(U/mg) Exemple 5 103,1 - * - *

Exemple

comparatif 87,3 0,026 0,017 * -: 0,0001 U ou inférieure à cette valeur pour 100 U de G6PDH Suivant l'invention, du DNA codant pour la séquence d'aminoacides représentée à la figure 1 ou du DNA représenté à la figure 2 et le microorganisme transformé possédant ce DNA sont utilisés pour le procédé de préparation de G6PDH à

grande échelle et avec stabilité, en cultivant le- microorga-

nisme transformé. Le G6PDH ayant une stabilité, à long terme, excellente et une bonne stabilité thermique est obtenue sans

que des enzymes polluantes posent des problèmes de diagnos-

tic.

28 2641285

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. DNA codant pour la séquence d'acides aminés

représentés à partir de son extrémité N à la figure 1.

2. DNA suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides du DNA est telle que

représentée à partir de son extrémité 5' à la figure 2.

3. Plasmide caractérisé en ce qu'il a un DNA codant pour la séquence d'acide aminés représentée à partir de son

extrémité N à la figure 1.

4. Microorganisme transformé, caractérisé en ce

qu'il porte un plasmide ayant un DNA qui code pourla séquen-

ce d'acides aminés représentée à partir de son extrémité N à

la figure 1 et qui est étranger à l'hôte.

5. Microorganisme transformé suivant la revendica-

tion 4, caractérisé en ce la bactérie appartenant au genre

Escherichia est une bactérie appartenant à Escherichia coli.

6. Microorganisme transformé suivant la revendica-

tion 5, caractérisé en ce que le microorganisme transformé est Escherichia coli DHl,pG6PDH déposé sous la référence FERM BP-2174 à the Agency of Industrial Science and Technology,

the Fermentation Research Institute.

7. Procédé de préparation de glucose-6-phosphate déshydrogénase, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un microorganisme transformé portant un plasmide ayant un DNA qui code pour la séquence d'acides

29 2641285

aminés représentée à partir de son extrémité N à la figure 1, et qui est étranger à un hôte, afin d'exprimer l'information génétique du DNA, et

à recueillir de la glucose-6-phosphate déshydrogé-

nase d'un bouillon de culture.

8. Procédé de préparation de glucose-6phosphate déshydrogénase, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver un microorganisme transformé portant un plasmide ayant un DNA représenté à partir de son extrémité 5' à la figure 2, pour exprimer l'information génétique du DNA, et

à recueillir de la glucose-6-phosphate déshydrogé-

nase d'un bouillon de culture.

9. Procédé de préparation de la glucose-6-phosphate déshydrogénase, suivant la revendication 7, caractérisé en ce que l'activité de chacun de la NAD(P)H oxydase et de la lactase déshydrogénase à titre d'enzymes polluantes dans la glucose-6-phosphate déshydrogénase est de 0,0001 unité ou est

inférieure à cette valeur pour 100 unités d'activité de glu-

cose-6-phosphate déshydrogénase et la glucose-6-phosphate déshydrogénase a au moins les propriétés physico-chimiques suivantes: (a) action enzymatique; catalyse une réaction enzymatique pour donner du gluconolactone-6-phosphate et du NAD(P)H à partir de glucose-6-phosphate et de NAD(P), (b) spécificité au substrat; a une spécificité au substrat au moins pour le glucose-6-phosphate, (c) pH optimum; 8 à 9, (d) point isoélectrique optimum; 6,1 0,6, (e) stabilité thermique; stable au traitement à C environ pendant 15 minutes, (f) stabilité au pH; stable à un pH de 6 à 8 (à

C pendant 15 minutes).

10. Polypeptide composé de la séquence d'acides

aminés représentée à partir de son extrémité N à la figure 1.