JP2695942B2 - エタノール生成物の製造方法 - Google Patents

エタノール生成物の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はエタノールの製造法、特に再生できる担体材
料に結合した固定化酵母を使用するアルコール飲料の製
造法に関する。酵母の固定は醗酵容器自体で行なうこと
ができるので、固定化中の汚染の危険を最少にする。
従来の技術 醗酵は有史以前に始まつた技術である。しかし、パス
ツールがブドウ酒醗酵に関する彼の研究を公刊し、変敗
理由を分析し、ブドウ酒製造に対する適切な処理を規定
したのはやつと1866年であつた。
伝統的に、醗酵はすべての果実や漿果に存在する野生
酵母により行なう。純粋培養酵母による醗酵は良品質の
ブドウ酒をいつでも製造できるので今日ではごく普通に
行なわれる。ブドウ酒製造のこれらすべての一般的面お
よび酵母の特徴はＨ−JRehmおよびG.Reed編集の「Biote
chnology」第５巻、Food and Feed Production with Mi
croorganism,Verlag ChemieおよびG.Reed編集の「Indus
trial Microbiology」４版，第９章,1982にPrescottお
よびDunnにより提示される。
伝統的バツチ醗酵は時間がかかる。通常、ブドウ酒製
造においてアルコール醗酵に要する時間は一般に少なく
とも20〜50日を要する。懸濁酵母による連続方法はこの
工程を促進すると考えられるが、微生物汚染のない状態
で操作しおよび維持することは難しい。さらに、醗酵速
度を促進するために、醗酵中の酵母細胞濃度を増加しな
ければならないが、他方ではエタノールによる阻害は最
少にしなければならない。バツチ醗酵では、例えはリン
ゴジユースの場合、酵母細胞濃度は１〜２×108細胞/ml
リンゴ液である。
例えば一層高い酵母細胞濃度はカラムに充填した適当
な担体に酵母を固定化することにより得ることができ
る。醗酵液が固定化酵母を充填したカラムを通過する場
合、反応器の液容量と接触する酵母細胞数は非常に増加
する。接触面積が大きい程、醗酵は速くなる。カラム反
応器もエタノールによる阻害を減少する。エタノール含
有生成物が酵母層から連続的に除去されるからである。
この減少は理想的プラグフロー状態が達成される場合が
最大である。
酵母細胞をアルギン酸カルシウムに包埋できることは
公知であり、形成固定化酵母を使用して醗酵を早めるこ
とができる。多数の参考文献は実験室規模で適用できる
ようにこの技術について記載する。しかし、この技術を
工業化するためにかなりの努力もなされてきた。もつと
も知られているものの１つは日本の協和醗酵のものであ
り、アルギネート固定化酵母をエタノール生産供給原料
に使用する。
工業的規模の操作では、アルギネート包埋法に伴なう
主な困難は粒子の形成方法である。これは酵母スラリー
およびアルギン酸ナトリウム溶液を一緒に混合する生産
現場で行なわなければならない。次にこの溶液をカルシ
ウム塩溶液に供給する場合、アルギネートは沈澱し、同
時に酵母細胞を沈澱粒子内に吸蔵する。粒子は通例小滴
／ビーズ形である。
アルギネート包埋酵母を利用する方法プラントはこれ
らのビーズを製造するために特に設計した装置を有しな
ければならない。さらに、野生微生物により酵母が汚染
する潜在的危険がある。アルコール飲料フレーバの生成
が重要である場合（例えば、ビール、ブドウ酒、リンゴ
酒および同種の生成物）、この問題は特に重大である。
工業用／燃料エタノールの製造では、汚染の基準は生産
性に影響するとはいえ飲料における程重要ではない。
工業的規模で使用するアルギネートビーズに対する第
２の主な困難はビーズの物理的強度にある。ビーズは軟
かく、容易に圧縮できる。大きな醗酵カラムの操作には
問題があり、急速な下方への処理流は取扱いが困難であ
る。他方、醗酵における代表的上方流様式はビーズを非
常に磨耗する。又、加圧下に圧縮可能材料を使つて反応
器を下方に作動するのは実際に不可能である。
包埋法による第３の困難は、ビーズ内で基質が酵母と
接触する場合に、基質の接近性が減速するという拡散の
限界である。
最後に糸が汚染、又は他では妨害されて連続操作を中
断しなければならない場合、全ロツトのカラム材料（酵
母を含むアルギネート）は廃棄しなければならない。再
使用はできない。
発明が解決しようとする課題 本発明の目的はカラム材料を現場で形成することを必
要としない連続カラム醗酵方法を開発することである。
別の目的は汚染源を除去する方法を開発することであ
る。尚別の目的は圧に耐えることができるタイプの方法
を開発することである。本発明の尚別の方法は担体材料
を再生し、再使用できる方法を開発することである。そ
れ以上の目的は少なくとも最低約５％アルコールを約１
層容積／日のような適度な速度でアルコールを製造する
方法を開発することである。
課題を解決するための手段 これらおよび他の目的はエタノール生成物の主要製造
方法を指向する本発明により達成される。本方法によれ
ば、酵母醗酵性溶解炭水化物を含有する水性基質をアニ
オン交換性を有する担体に固定した酵母と接触させる。
接触は好ましくは担体に固定した酵母の充填層反応器に
水性基質を通すことによつて達成できる。しかし、流動
層反応器に固定化酵母を使用することによつても達成で
きる。
酵母−担体組み合せは多孔性担体の表面に結合した酵
母から成る。担体は実質的に非圧縮性である。これは連
続的多孔性マトリツクス、又は別法はくぼみを有し、又
は網状、多孔性粒子から成る。マトリツクス又は粒子は
順次個個の微粒子又は微小繊維から成る。この担体構造
は酵母細胞を担持する最高表面積を供する。担体の単位
容積当り生成する高い酵母細胞数は急速醗酵を可能にす
る。
担体の顆粒又はマトリツクス特性は微粒子又は微小繊
維を相互にゆるく結合し、フエルト状にし、織り、粘着
し又は顆粒化（以下結合）する。結合は各個微粒子又は
微小繊維間のいくつかの接触点で化学的、粘着的又は機
械的結合を定着させることにより達成する。化学的結合
はこれらの点で化学的架橋結合反応を生じさせ達成す
る。粘着的結合は熱可塑性樹脂のような付加的成分の使
用により微小繊維又は微粒子を顆粒化又は粘着させるこ
とにより達成する。機械的結合は接触点で繊維をからま
せ又は結ぶことにより、又はこれらの表面をからみ合せ
て粒子を連結することにより達成する。後者の形態で
は、マトリツクスは管に充填した綿毛又は濾紙のような
連続構造を反応体全体に含む。次に、これらの最終形で
は、粒子は分離し、個個になる。
微小繊維又は微粒子を所望する粗い表面の微小繊維又
は微粒子に形成できる任意のアニオン交換物質から成
る。これらの物質は天然セルロース又は再生セルロース
又は誘導体のレーヨンを含み、フエノールホルムアルデ
ヒド樹脂のような合成アニオン交換樹脂およびアガロー
ス又はデキストリンをベースとするアニオン交換樹脂な
どによりアニオン交換性を供する。好ましい担体は化学
的に修飾してアニオン交換性を供するセルロース又はレ
ーヨンから誘導した多孔性、顆粒アニオン交換樹脂であ
る。特に好ましい態様はポリスチレンと顆粒を形成する
ことにより粘着結合したジエチルアミノエチレン置換セ
ルロースの微小繊維又は微粒子を含む。
プラス荷電樹脂とマイナス荷電酵母細胞間に働く電力
は主として酵母細胞が樹脂表面に結合する原因となると
信じられる。この結合は酵母の実質的浸出を最少にし、
その上酵母と水性培地間の接触を緊密にする。
出発材料として使用する水性基質は少なくとも水およ
び加水分解澱粉、蔗糖、グルコース、フラクトース、マ
ルトース又はマルトトリオース（ラクトースおよびキシ
ロース）のような醗酵性炭水化物から成る。糖濃度はア
ルコールを連続生産するのに十分であるが、酵母の醗酵
活性が完全に阻害される程高くはない。
本発明方法によれば、醗酵により形成する二酸化炭素
を含む工程パラメータを制御することは重要である。二
酸化炭素は流体生成物流に維持でき、又は除去できる。
好ましい方法では、シリーズのカラムを使用し、カラム
の排出流からガスを除去するのにその相互連絡を利用す
る。カラムの相互連絡タツプをすべて使用する場合、炭
酸飽和しない生成物を形成する。カラムを加圧下に維持
することにより炭酸飽和生成物を生成できる。しかし、
カラム圧は酵母の醗酵を実質的に減少する程高くするこ
とはできない。容易な日常的作業により一般に少なくと
も約14バールのこの限度を確定できる。
圧の他に、他の工程パラメータを変えてエタノール生
産量および生成物の味に影響を与えることができる。こ
れらのパラメータはカラム温度、水性基質供給割合、カ
ラム滞留時間、カラム内の基質流の方向（重力方向に又
は重力に対し）、流れ方向の周期的反転、酵母菌株、酵
母濃度および水性基質中の酵母の栄養物を含む。これら
のパラメータに対する適当な範囲は−２〜40℃の温度、
供給割合0.01〜10反応器層容積（BV）／時間、0.1/100
時間の滞留時間および酵母濃度109〜1012酵母細胞／
担体を含む。Saccharomyces又はCandidaのような酵母は
使用できる。一般に、これらのパラメータは調整により
0.05〜15％のエタノール濃度を生産する。
本発明の好ましい方法では、顆粒状担体のスラリーを
最初にカラムに入れ、担体を充填カラムに定着させる。
担体は熱苛性アルカリによる洗滌のような、それ自体既
知の方法により滅菌する。無菌希酸溶液により中和し、
無菌水によりすすいだ後、酵母が担体粒子に結合し、固
定化するように酵母液を流す。この前処理後、酵母カラ
ムは上記のように使用する。
本発明のさらに好ましい方法では、消費性のエタノー
ル生成物を製造する。この生成物はブドウ酒、清酒、ア
ルコール果実飲料、漿果飲料、植物飲料、その炭酸処理
変型酒、ビール、又は上記生成物の低アルコール変型飲
料である。
消耗生成物の製造に使用する水性基質は果実、漿果又
は植物ジユース又は抽出物、麦芽汁、加水分解植物材
料、又は天然又は合成起源由来の醗酵性糖を含有する水
性シラツプのような起源由来である。ジユースは果実、
漿果又は植物からの搾汁液である。抽出物は果実、漿果
又は植物を水と伴せ、磨砕、加熱、圧搾、混合などによ
り処理して製造した液である。加水分解植物材料は酸、
酵素又は自己加水分解のような技術によるセルロース、
ヘミセルロースおよび／又は澱粉由来の材料である。
本発明の別の方法は例えば0.2容量％より少ないアル
コールを含有するような低アルコール飲料の製造を指向
する。本方法によれば、実施化工程および酵母担体材料
は主要生産方法のものと同じである。しかし、糖含量お
よび水性基質の供給割合は修正して「低アルコール」生
産を供する。供給割合はアルコール濃度を所望値に減少
する程度に増加する。又温度を降下することにより醗酵
は減速する。糖濃度も飲料は過度に甘くはないが、アル
コール醗酵に対し十分な糖が存在するように適度に調整
する。上記の工程パラメータを連続的に調整することに
より所望アルコールレベルを選択できる。
本発明はさらに任意形の担体および酵母の組み合せを
指向する。好ましい形態は上記のようにその場所で製造
したものおよび乾燥組み合せを含む。無菌条件の乾燥組
み合せは包装し、醗酵工場に輸送し、使用に対し水性栄
養物に浸漬して再構成することできる。別法では乾燥形
は家庭用に対して包装できる。
図面は固定化酵母カラムの製造工程図である。図面は
水和容器１、固定化酵母反応器２、滅菌液容器３、中和
酸容器４、酵母スラリー容器５、基質容器６、二酸化炭
素分離口７、受け器８、および圧解放バルブ９を示す。
本発明は上記のように非圧縮性かつ滅菌性の酵母−担
体系に基づいている。酵母−担体系の製造に使用する担
体の特に好ましい例はポリスチレンにより顆粒化した顆
粒状DEAE−セルロース（弱アニオン交換体）である。こ
の担体は商品として入手でき、固定化酵素、代表的には
イソメラーゼに対し周知である（米国特許第4,355,117
号明細書、この担体に関し詳細記載、を参照）。図面に
描写した酵母−担体系の好ましい製造方法では、乾燥担
体を水和容器１で水和し、カラム反応器２にポンプで送
る。好ましいDEAEセルロース担体は酸およびアルカリ媒
体に安定で、100℃までの温度に耐性である。従つて、
例えば熱苛性アルカリによりカラムで容易に滅菌でき
る。他の樹脂は同様に適当に滅菌できる。
担体上への酵母固定は熱稀苛性アルカリ３による担体
の滅菌後達成される。次に担体層２は水ですすぎ、担体
層を通して適当な稀酸４をポンプで送つて中和する。最
後に担体層は滅菌水ですすぐ。固定化は培養活性酵母ス
ラリー５を反応器２にポンプで送つて行なう。担体は酵
母を吸着する。酵母細胞は担体が最適表面形を有するの
で担体表面に結合する。
好ましくは、酵母細胞は担体上で生育して約109〜10
12細胞／担体間の密度を供する。約109細胞密度は特
に好ましい。この密度は十分な酵素活性を供するに足り
るもので水性基質の糖をエタノールに実質的に転換しな
ければならない。
容器６からの基質は底部又は上部入口を通して反応器
にポンプで送る。流速を調整することにより醗酵レベル
を制御できる。流速が遅いことは（約1BV/日）担体と基
質間の接触時間が長いことで、従つて高アルコールレベ
ルを意味する。早い流速はアルコールレベルを低下す
る。反応器は大気圧下に底部入口から供給を行なうこと
ができ、二酸化炭素は分離口７を通して自由に系から分
離される。生成物は受け器８に集め、最終瓶詰前に濾過
などによりさらに処理する。
系を加圧下に操作する場合、基質６は担体層を充填形
に保持し、こうしてプラグフローに到達するために上部
入口から供給する。醗酵割合は適用圧が形成二酸化炭素
を溶解して保持するのに十分な高さであるように（流速
により）制御する。最終生成物が二酸化炭素を含むもの
以外は受け器のバルブ９を通して圧を解放する。圧およ
び適度の限度に溶解二酸化炭素を保持するために、２個
又はそれ以上の同じ反応器２をシリーズで備え、各反応
器間の過剰の二酸化炭素を放出することが得策である。
担体は材料の色沢が均一に輝くまで熱苛性アルカリを
担体層に供給して再生することができる。次いで担体は
pHが約10に達するまで水ですすぎ、適当な稀酸を担体層
を通してポンプで送ることにより中和する。最後に担体
は滅菌水ですすぐ。
担体は酵母の生育および水性基質との接触に対し適当
な環境を供するために重要である。顆粒化DEAE−セルロ
ースのような非圧縮性アニオン交換担体はアルギネート
ビーズのような軟質のゲル状担体に比較していくつかの
有利性を有する。これらの特性は一層少ないマスの移送
問題、一層容易な固定化、一層早い開始の早さ、一層容
易な増加、再生能力の大きな改良および担体の長い寿命
を含む。
実験室規模の試験で、ゲル状担体、すなわちアルギネ
ートビーズおよび本発明の好ましい担体、すなわちDEAE
−セルロース顆粒を比較した。DEAE−セルロースから製
造した担体はエタノール生産に使用するには一層容器
で、多くの基質について一層望ましい生産能力を有し
た。これらの要素は処理中酵母と水性基質間の一層良好
な接触を示唆する。
本発明の限定としてのつもりはないが、本発明による
固定化酵母と担体の相互作用様式は収量の増加を説明で
きると信じられる。電子顕微鏡写真は、アルギネートビ
ーズでは酵母はコロニーで生育し、そのうちのいくつか
はアルギネート層を通してビーズ表面に生育することを
示す。酵母は恐らくアルギネートビーズの「活性部位」
として作用するものであろう。顕微鏡写真はDEAE−セル
ロース顆粒は多孔性で、微小繊維の網状マトリツクスで
あることを示す。この構造により水性基質は顆粒の内側
で酵母細胞を生育させることができる。こうして、酵母
は微小繊維の内部および外部ポケツトにむしろゆるく、
別別に生育し、これらの個個の細胞はカラムの「活性醗
酵部位」として作用する。従つて、単位担体表面積につ
き一層多い酵母細胞は本発明の担体を使用する場合醗酵
に利用できる。
顆粒状DEAE−セルロースのような担体の表面上への酵
母細胞固定化の機作は多くの利点を与える。第一に酵母
細胞は実質的にすべてが担体の表面上にある。こうし
て、細胞は溶液に自由に懸濁しているかのように作用す
る。
第二に、実質的に拡散限界がなく、醗酵性流体基質は
酵母と自由に接触できる。又酵母が生存に必要とする栄
養物は妨害がなく必要物から入手することができ、担体
粒子の内部に透過する。
第三に、本発明による担体の性質は酵母細胞の固定が
カラム内のその場所で行なうことができるので容易に出
発でき、再生できる。この処理は汚染の危険を少なく
し、全体的に系の状態を改良する。さらに、カラムは容
易に再生でき、これは重要な経済的利点である。再生は
住住化学的不純物により又は水性微生物汚染の汚染又は
固定化酵母自体の突然変異による汚染があるので得策で
ある。例えば、DEAE−セルロースのような担体から製造
したカラム反応器を再生するために、消費カラムは洗滌
し、熱苛性アルカリ溶液又は水中の有機剤のような別の
滅菌媒体により滅菌することができる。洗滌、中和後、
担体は再整備、再固定の準備ができる。パイロツト規模
の試験では、このようなカラムは再生の必要なく少なく
とも13週利用した。実験室規模では、同じカラムは約30
週利用した。
一般に、担体を含む全体の反応器系は上記処理により
滅菌できる。無菌培養酵母を担体層を通してポンプで送
り、又は溶離させる場合、野生菌株又は細菌による酵母
／担体汚染の危険は最少である。酵母はカラムに付着す
る場合（適当な装填量は約109〜1012酵母細胞／担体
である）、カラムはリン酸アンモニウムおよび糖の水性
培地のような栄養溶液を約日間反応器にゆつくりポンプ
で送ることによりさらに状態を整えることができる。こ
の処理により酵母は最高密度まで繁殖できる。
本発明により使用するすべての酵母−担体系で一般に
真実であるように、好ましい担体の具体例の１つ、顆粒
状DEAE−セルロースは非圧縮性（非膨潤性）である。こ
の性質は醗酵の実施方法に関し種種変化できる。
通常の大気圧下で、反応器／連続醗酵容器は次のよう
に操作できる。基質は反応器の底部から供給し、醗酵中
形成するCO2は担体層から自由に放散させる。しかし、
この技術では、理想的プラグフロー状態には到達できな
い（CO2の泡は常に層をかき乱す）、そして後混合はエ
タノールの生産を妨害し、こうして生産性が低下する。
本発明の非−圧縮性担体系は二酸化炭素を溶解状態に
維持するために加圧下に操作することもできる。カラム
は下方流条件およびこの充填層形で操作することもで
き、理想的プラグフローに達する。
数個の加圧カラムをシリーズで操作し高圧を避けるこ
ともできる。シリーズ配列は最終生成物に高濃度のアル
コールを望む場合特に有用である。この方法はカラムの
充填特性を崩壊させる。すなわち通路を形成する二酸化
炭素の有害な放出なしに下方流様式で操作できる。カラ
ム間で、二酸化炭素は流れから分離する。反応器の寸法
は特別の流動化および二酸化炭素−分離空間を全く必要
としないので一層小さく保持できる。
基本的に任意の醗酵性流体基質はエタノール生成物の
生産に対する供給材料として使用できるが、固定化酵母
カラムに供給前に顆粒状不純物はすべて濾別することを
条件とする。代表的基質の例は： （ｉ）麦芽汁 （ii）果実ジユース （iii）漿果ジユース （iv）糖シラツプ （ｖ）澱粉シラツプ （vi）植物材料からの任意の加水分解物 （vii）任意の果実、漿果、麦芽又は同様の抽出物によ
りフレーバ付与した糖シラツプ である。
代表的全糖濃度は基本原料により当初および添加糖の
双方を含む100〜250g/である。酵母栄養物（リン、窒
素源などを含む）は初めの原料に有利である限りバラン
スするために必要である。勿論、糖濃度はどの位のアル
コール量を、およびどの位の甘味を最終生成物が有する
ことを期待するかにより広く変化できる。天然フレー
バ、油などを含有することもできる。糖は少なくとも１
重量％から醗酵作用を阻害する量（例えば、約30〜40重
量％）まで、好ましくは培地全重量に対し約４〜25重量
％の濃度で含む。
カラムを通る水性基質の流速はエタノール生産能力が
流速に依存するので重要なパラメータである。流速は担
体に結合して残存する酵母細胞数を決定することも分つ
た。高流速では、酵母細胞の流出は増加する。従つて、
エタノール生産は基質処理量の割合のみでなく固定化系
に結合した細胞数にも依存する。流速が高くなり過ぎる
と、エタノール生産は不完全および／又は不適当にな
る。流速を調整することにより、代表的には水性基質全
容量に対し0.05〜15容量％の濃度を求めることにより、
エタノール濃度を調整できる。流速を調整することによ
り、醗酵容器にはこの範囲内のエタノール濃度を得るこ
とができる。
担体材料に結合して残留する酵母細胞量は低流速で比
較的安定であるらしく、酵母の生育および細胞の浸出が
バランスしていることを示唆する。高流速では浸出は増
加するが、流速が減少すると細胞数は再び通常レベルに
戻る。流速は自己分解を避けるために十分に高くして死
亡細胞を浸出させるべきである。固定化酵母カラムの操
作中、酵母は水性基質の醗酵性糖により生育性を維持す
る。
固定化酵母カラム反応器は上記のように加圧できる。
操作圧はカラム内に二酸化炭素を溶解保持し、固定化酵
母カラムを通してCO2泡抹の可能な通路形成を避けるた
めに十分な高さであるべきである。代表的高さは14バー
ルである。
適当な温度は伝統的バツチ醗酵方法で使用するもので
ある。０〜40℃、好ましくは10〜35℃の範囲である。こ
の温度は加熱ジヤケツトによりカラムを加温し、又は環
境的に調節した室にカラムを維持し、又は冷却により維
持できる。勿論、酵母は有利に使用できるある程度の熱
を発現する。圧は操作温度により選択する。
醗酵後、溶離エタノール生成物は貯蔵温度に冷却し、
通例の醗酵後処理、例えば、濾過、殺菌および包装に対
し緩衝タンクに集める。
上記エタノール生産系は伝統的醗酵方法により一層早
く、一層有利な系であり、伝統的醗酵方法から形成する
味に等しい許容しうる味を有する生成物を生産する。醗
酵に必要な時間は本発明により週からおよそ時間まで減
少し、本方法の連続性と共に、工業的アルコール又はア
ルコール飲料生産において時間および経費の節約に対し
莫大な可能性を供する。
次例は本発明の多数の側面をさらに説明する。しか
し、十分に上記に特徴化したように例は本発明の限定又
は特性化としての意味を有するものではない。
例１ カラム反応器の調製 Finnish Sugar Co.Ltd.,による米国特許第4,355,117
号明細書により製造した、315〜840μｍ又は470〜840μ
ｍの粒度を有する顆粒状DEAE−セルロース（GDC）を担
体として使用した。すべての試験では、担体を満たし、
滅菌し、GDCを扱かう次の方法に従つてそこに酵母を固
定した： 図面を引用すると、水和容器１は最初に水を半分満た
す。ミキサーを動かし、乾燥担体（GDC）を容器１に移
した。水和が完了すると、（約５時間）固定化酵母反応
器２に水を半分満たし、水和容器１からの担体水スラリ
ーは反応器２に移した。反応器の水レベルを維持するた
めに、反応器の底部バルブは反応器への流入および流出
流が畧畧同じであるように調整した。次いで反応器の担
体は反応器２に熱稀苛性アルカリ３をポンプで通すこと
により滅菌した。次に担体層は水ですすぎ、反応器２の
担体層に適当な酸４をポンプで通すことによつて中和
し、最後に担体層を無菌水ですすいだ。
酵母スラリーは容器５で製造した。次に酵母スラリー
は約１〜４時間で担体層をポンプで通し、それによつて
酵母を担体上に吸着させた。こうして酵母は担体上に固
定した。反応器２は基本的に醗酵の準備を終了した。
例２ リンゴジユースの醗酵 酵母はバツチ醗酵で行なつたように培養し、約500ml
の各担体層は例１記載の酵母細胞量により製造した。
担体は0.315〜0.840mmの粒度を有した。
酵母がカラム（直径50mmおよび高さ250〜300mm）の担
体層上に吸着直後、基質は１層容積／日の流速で供給を
開始した。基質は殺菌りんごジユースで、1g/のリン
酸アンモニウムを酵母栄養物として添加した。全糖濃度
は糖をりんごジユースに添加して220g/に調整した。
醗酵はゆつくり始まり、３週後エタノールは約4.5％で
あつた。
例３ 粒度0.470〜0.840mmの担体を装填したカラムを使用し
て例２を反復した。50日の操作後、流速を約0.8層容積
／日に減少し、これは次週中エタノールレベルを５％か
ら７〜８％に直ちに増加した。
例４ 巾が広く、長さが短かい（直径75mmおよび高さ152m
m）カラムを使用して例３を反復した。担体層を滅菌
し、洗滌し、中和（メタ重亜流酸ナトリウム）して、酵
母固定化は実質的に一層高濃度の酵母細胞により行なつ
た:500mlのGDCに対し１億５千万個の細胞/mlを含む600m
lの酵母スラリーを使用した。カラムからの漏出は500万
個の細胞/mlで、従つて、全固定化量は９×1010細胞で
あつた。これは２×109細胞/mlGDC又は５×109細胞/gGD
Cに等しい。
りんごジユース基質を供給する前に、カラムは酵母栄
養物含有基質溶液により１日処理した。醗酵は例２およ
び３と比較した場合急速に始まり、第２日にエタノール
レベルは既に８％であつた。流速は１層容積／日で、栄
養物レベルは1g/ジユースであつた。いくらかの材料
は二酸化炭素還流によりこのカラムから逸出した。
３週後流速の減少はアルコールレベルを再度上昇させ
た。1.5ケ月後、栄養物レベルを2g/に上げ、これはア
ルコールレベルをさらに上昇させ、操作の第３月中系は
約10％エタノールレベルで安定した。
例５ 例４を８反応器を使用して反復した。反応器は排出
口ラインにスクリーンプレートを有しGDC粒子をすべて
保留するように組み立てた。系は１週内に10％エタノー
ルレベルに安定化した。８反応器からの生成物部分は
さらに第２の500mlカラムを供給してエタノールレベル
を増加した。
すべての試験は室温（20〜23℃）で行なつた。第２反
応器は二酸化炭素を溶解して保持するに十分な高さの圧
下に操作する場合、泡立つシヤンペンタイプの生成物を
得た。醗酵時と同じ圧下に瓶詰する場合、これは第２醗
酵（瓶中で）を不必要とし、こうして「シヤンペン」方
法の複雑性を軽減する。
例６ 主要ビール醗酵 カラムの調製および酵母固定化は例１記載の方法に従
つて行つた。500mlの担体層は二酸化炭素の分離を容易
にするために上端の広いガラスカラムに充填した。麦芽
汁を醗酵カラムの底部に供給した。酵母細胞濃度は109
細胞/gGDCに調整した。
ラガービール醸造に対する伝統的麦芽汁を供給材料と
して使用した。麦芽汁は18kgの大麦麦芽から製造し（ピ
ルズナータイプ）、最終容積100の最終麦芽汁（12.0
゜Ｐ）を得た。水および醸造用麦芽の混合物は48℃で15
分、63℃で30分、72℃で20分静止し、磨砕の終りに78℃
で予定した浸出法により１個の容器で磨砕した。
麦芽汁は麦芽汁濾過器で清澄化し、78℃の水で２回す
すいだ。麦芽汁は約90分かまで煮沸した。ホツプペレツ
トを煮沸の初めに添加した（アルフア酸の全量は約10g
であつた）。煮沸中形成する沈澱は渦巻中で分離した。
清澄化麦芽汁はプレート熱交換機で100℃から10℃に冷
却した。
麦芽汁の組成は次の通りであつた： 初めの抽出物 12.0 ゜プラトー 色 10.0 ゜EBC 苦味 25 EBU pH 5.3 見掛減衰割合 85％ しかし、麦芽汁の組成は次のように変化できる： 初めの抽出物 ６〜18゜プラトー pH 4.5〜5.5 見掛減衰割合 65〜100％ 反応器カラムにおける麦芽汁の醗酵はゆつくり始まつ
た。１週間の操作後、１層容積／日供給割合より少ない
割合で許容しうるビールを製造することができた、カラ
ム挙動は例２および例３のブドウ酒反応器のものと同じ
であつた。
例７ 清酒の醗酵 低アルコール清酒（日本の米酒）を製造した。カラム
を製造し、酵母は例１に示す方法に従つて固定化した。
基質を製造するために、米は最初に蒸し、アルフアミ
ラーゼおよびアミログルコシダーゼにより加水分解して
液化した。形成加水分解物はすべての機械的不純物およ
び未加水分解残留物を除去するために濾過した。基質は
カラムに供給した場合グルコース濃度が23％であるよう
に最後に稀釈した。カラムは約500mlの担体カラムを有
した。カラムの直径は70mmで、担体の直径対高さ比は約
1:2であつた。比較をCa−アルギネート捕捉酵母により
行なつた。供給割合、パラメータおよび両醗酵の結果は
次表に示す。
例８ はちみつ酒醗酵 低アルコールはちみつ酒（伝統的スカンジナビア飲
料）を製造した。
醗酵割合は供給材料割合の調整により調整し、所要フ
レーバおよびアルコール含量を有する生成物を得た。
カラムの製造および酵母の固定化は例１記載の方法に
従つて行なつた。酵母細胞濃度は109細胞/gGDCを得るよ
うに調整した。
酵母の水性基質は次のように処方した： 結晶（白）糖 500 g はちみつ 125 g ソフト褐色糖 625 g ２個のレモンジユース 水 10 カラムは500mlの担体容積を有した。基質は底部に供
給した。初めの供給割合は１層容積/5〜10時間であつ
た。醗酵が安定化した後、供給材料割合は生成物のエタ
ノール含量および所望甘味により１層容積/1〜５時間に
調整した。エタノール含量は飲料の0.2〜2.0％w/wであ
つた。酵母の生育能力を維持するために、少量のリン酸
アンモニウム（10〜100ppm）を栄養物として添加した。
上記パラメータにより室温で製造を行なつた。固定化
酵母反応器は加圧下に一層低温で操作することもでき
る。その場合形成二酸化炭素は溶解し、二酸化炭素の最
終添加は回避できる。
上記基質の他に、他の原料も基質として使用すること
もできる。すべてが醗酵性糖、例えば麦芽、果実および
漿果を含有する。最終生成物のフレーバは原料、糖濃
度、および醗酵速度による。
例９ 数種の担体上の酵母固定化の実証 「Collection of Industrial Micro−organism at th
e Technical Research Center of Finland」（Collecti
on番号Ａ−75050）からの醸造家酵母をアニオン交換機
能を有する２種の樹脂上に固定化した。
樹脂は商標名SPEZYME GDC 220の顆粒状DEAEセルロー
スおよび商標名 DUOLITE A 568の合成アニオン交換樹脂であつた。
固定化は次の手順に従つて行なつた： 酵母は30℃で麦芽抽出液に48時間インキユベートし
た。樹脂は1M苛性ソーダにより洗滌して滅菌し、pH5.0
〜5.1に緩衝し、滅菌水で洗滌した。10gの樹脂の乾燥試
料はガラス焼結底部プレートを備えた20mmの上記と同じ
ガラスカラムにフラツシユした。100mlの酵母サスペン
ジヨンを３層容積／時間のおよその割合でカラムを重力
により通した。その後カラムは100mlの滅菌水で洗滌し
た。
固定化前および後の酵母サスペンジヨンの細胞濃度は
寒天プレート計数法により測定した。差から固定化細胞
数を計算した。樹脂1g当りの固定化細胞としての結果は
次の通りであつた： 樹 脂 酵母 提供 固定化 SPEZYME（商標） Ａ−75050 2.3×108 2.1×108 DUOLITE（商標） Ａ−75050 2.3×108 2.1×108 例10 担体の再生 試験に使用したDEAEセルロースカラムは材料の色沢が
均一に輝くまで熱（約60℃）苛性ソーダ溶液（２％苛性
ソーダ）をカラムを通して供給して再生した。カラムは
カラムを出る溶液のpHが約10になるまで滅菌水ですす
ぎ、ピロ亜硫酸ナトリウムにより約７のpHに中和した。
カラムは滅菌水ですすぎ、麦芽汁を満たし、酵母細胞
（約1010細胞／担体）を定着させ、細胞は24時間通気
麦芽汁の存在で生育し、基質の醗酵に対する用意が整つ
た。
【図面の簡単な説明】
第１図は固定化酵母カラムの製造工程図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 11/12 Ｃ１２Ｎ 11/12 (56)参考文献 特開 昭54−11288（ＪＰ，Ａ) 米国特許4355117（ＵＳ，Ａ) Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１, （1981） Ｐ．651〜656

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】第１製造工程において、醗酵可能な糖を含
    む水性基質を、連続多孔性マトリックス、又はぐぼみあ
    るいは網状の多孔性粒子から構成される実質的に非圧縮
    性担体の表面に固定化された酵母細胞を含有する反応器
    に通し、このマトリックスまたは粒子はゆるく結合した
    複数の微粒子又は微小繊維から形成される構造を有し、
    これらは化学的に、粘着的に又は機械的に個々の微粒子
    又は微小繊維間の少なくともいくつかの接触点で相互に
    結合し、この微粒子又は微小繊維はアニオン交換樹脂か
    ら構成され、但し白樺のチップは除外することを特徴と
    する、エタノール生成物の製造方法。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の実質的に非圧縮性担体の
    水性混合物を反応器に詰め、任意には詰めた反応器を滅
    菌し、担体に酵母ブロスを吸着させ、醗酵可能な糖を含
    有する水性基質を固定化酵母を含む反応器に供給し、つ
    いでエタノール生成物を回収する、請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】アニオン交換樹脂から構成される微粒子又
    は微小繊維は天然のあるいはアニオン交換能を供するよ
    うに再生されたセルロース誘導体からなる群から選択す
    る、請求項１又は２記載の方法。
  4. 【請求項４】微粒子又は微小繊維は粘着リンクにより結
    合されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の
    方法。
  5. 【請求項５】担体はポリスチレンにより顆粒化した微小
    繊維から形成する粒子を含み、アニオン交換樹脂はジエ
    チルアミノエチレン置換セルロースである、請求項１か
    ら３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】反応器内に充填した担体から固定化酵母材
    料を除去して反応器の醗酵能を再生させ、そして新しい
    酵母ブロスをカラムに通して、新しい酵母細胞を担体上
    に固定化させる、請求項１から５のいずれか１項記載の
    方法。
  7. 【請求項７】熱苛性アルカリをカラムに通して固定化酵
    母材料を除去し、カラムを水ですすぎ、カラムに希酸を
    通して中和し、そして新しい酵母ブロスをカラムに通
    す、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】順に連結し、かつ各反応器を出る流体から
    ガスを除去するための要素を有する複数の反応器に水性
    基質を通す、請求項１から７のいずれか１項に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】生成する二酸化炭素の実質的部分を溶解状
    態で維持するのに十分な圧で水性基質を反応器に通し
    て、炭酸飽和エタノール生成物を得る、請求項１から８
    のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】反応器に通す水性基質流は重力は反対方
    向にある、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】反応器に通す水性基質流を周期的に逆転
    させる、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】エタノール生成物製造用装置であって、 イ）連続多孔性マトリックス又はくぼみ、あるいは網状
    の多孔性粒子から構成される実質的に非圧縮性担体の表
    面に固定化させた酵母細胞を含有する反応器（２）、こ
    のマトリックス又は粒子はゆるく結合した複数の微粒子
    又は微小繊維から形成された構造を有し、これらは化学
    的、粘着的あるいは機械的に個々の微粒子又は微小繊維
    間の少なくともいくつかの接触点で相互に結合してお
    り、また微粒子あるいは微小繊維はアニオン交換樹脂か
    ら構成されるが、但し白樺のチップは除外し、この反応
    器（２）は ロ）反応器（２）にポンプ輸送する前に、乾燥担体を水
    和するための容器（１）、 ハ）反応器（２）に含まれる担体を滅菌するための滅菌
    液を含む容器（３）、 ニ）滅菌後担体を中和するための中和酸を含む容器
    （４）、 ホ）反応器（２）にポンプ輸送しかつ担体の表面に固定
    させる酵母スラリーを含む容器（５）、 へ）反応器（２）により処理させる基質を含む容器
    （６）、 ト）二酸化炭素分離口（７）、 チ）反応器（２）にて処理した後、最終生成物を受容す
    るための容器（８）、および リ）圧力開放バルブ（９）を配置してなる、装置。
  13. 【請求項１３】反応器（２）は順にいくつかの加圧した
    カラムを含む、請求項12記載の装置。
  14. 【請求項１４】流体から二酸化炭素を分離する装置をカ
    ラム間に置く、請求項13記載の装置。
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