JPH10248572A - 改変ザルコシンオキシダーゼおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】蛋白工学的手法によるプロリンに対する反応性
が低下した改変ザルコシンオキシダーゼの遺伝子操作技
術による大量生産方法及びクレアチニン測定試薬として
の利用方法の提供。 【解決手段】ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白
質を構成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸
を付加、欠失、挿入あるいは置換により変異させた蛋白
質であって、プロリンに対する反応性が改変前の蛋白質
に比して低下したものであることを特徴とする改変ザル
コシンオキシダーゼおよびその製法ならびに該酵素を使
用するクレアチンまたはクレアチニン測定試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、ザルコシンオキシ
ダーゼ活性を有する蛋白質を蛋白工学的手法により改変
することにより得られる、プロリンに対する反応性が改
変前の野生型ザルコシンオキシダーゼに比して低下した
改変ザルコシンオキシダーゼ、および該酵素の製造法お
よびその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、ザルコシンオキシダーゼ（EC
1.5.3.1）は、臨床的に筋疾患、腎疾患の診断の指標と
なっている体液中のクレアチン、クレアチニンの測定用
酵素として、他の酵素、例えばクレアチニンアミドヒド
ロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ペルオキ
シダーゼと共に使用されている。ザルコシンオキシダー
ゼはその基質であるザルコシンに水、酸素の存在下で作
用して、グリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素
を生成する。

【０００３】このようなザルコシンオキシダーゼは、バ
チルス属（特開昭54-52789号公報）、コリネバクテリウ
ム属（J. Biochem. 89, 599 (1981)）、シリンドロカル
ボン属（特開昭56-92790号公報）、シュードモナス属
（特開昭60-43379号公報）等の細菌が生産することが知
られている。とりわけ、アースロバクター・エスピーＴ
Ｅ１８２６(FERM P-10637)の生産するザルコシンオキシ
ダーゼは、従来のザルコシンオキシダーゼよりも熱安定
性に優れ、かつ、Ｋｍ値の小さい実用的な酵素であるこ
とが既に知られている（特開平2-265478号公報）。

【０００４】本発明者らは、既に、アースロバクター・
エスピーＴＥ１８２６(FERM P-10637)より抽出した染色
体ＤＮＡよりザルコシンオキシダーゼ遺伝子の単離に成
功し、そのＤＮＡの全構造を決定し（Journal of Ferme
ntation and BioengineeringVol.75 No.4 pp239-244 (1
993))、該ザルコシンオキシダーゼを遺伝子工学的手法
によって形質転換体に高生産させることに成功し、高純
度なザルコシンオキシダーゼを安価に大量供給すること
を可能にしている（特開平6-113840号公報）。

【０００５】しかしながら、ザルコシンオキシダーゼは
アミノ酸の１種であるプロリンにも低いレベルではある
が、反応性を示すことが知られている（例えば、特開平
5-115281号公報）。しかし、プロリン、特にＬ−プロリ
ンは生体を構成する蛋白質の１成分であり、体液中に存
在する可能性があるため、体液中のクレアチン、クレア
チニンの測定の際に正誤差を生じる原因となり得る。実
際、大澤らはクレアチニン測定用試薬における問題点と
して、該試薬中に含まれるザルコシンオキシダーゼのプ
ロリンに対する反応性を挙げている（例えば臨床科学、
20,144-152(1991)、生物試料分析、17,332-337(1994)参
照）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、野生型ザルコ
シンオキシダーゼのプロリンに対する反応性を低下させ
ることが望まれていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために種々検討した結果、ザルコシンオキシ
ダーゼ活性を有する蛋白質を蛋白工学的手法により改変
することで、プロリンに対する反応性が野生型ザルコシ
ンオキシダーゼに比して低下した改変ザルコシンオキシ
ダーゼを造成することが可能であることを見いだした。

【０００８】すなわち、本発明は、ザルコシンオキシダ
ーゼ活性を有する蛋白質を構成するアミノ酸配列の少な
くとも１個のアミノ酸を付加、欠失、挿入あるいは置換
により変異させた蛋白質であって、プロリンに対する反
応性が改変前の蛋白質に比して低下したものであること
を特徴とする改変ザルコシンオキシダーゼである。

【０００９】また、本発明は配列表の配列番号１に記載
されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を他のアミノ酸
をコードする遺伝子にて置換した遺伝子を組み込んだ発
現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換
体を培養し、該培養物からプロリンに対する反応性が改
変前の蛋白質に比して低下した改変ザルコシンオキシダ
ーゼを採取することを特徴とする改変ザルコシンオキシ
ダーゼの製造法である。

【００１０】さらに、本発明は上記プロリンに対する反
応性が改変前のタンパク質に比して低下した改変ザルコ
シンオキシダーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、
ペルオキシダーゼおよび過酸化水素検出試薬を含むクレ
アチン測定用試薬である。

【００１１】また、本発明は上記プロリンに対する反応
性が改変前のタンパク質に比して低下した改変ザルコシ
ンオキシダーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ク
レアチンアミジノヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼおよ
び過酸化水素検出試薬を含むクレアチニン測定用試薬で
ある。

【００１２】

【発明の実施態様】本発明の改変される前のザルコシン
オキシダーゼとしては、特に限定されるものではない
が、例えば、バチルス属由来のザルコシンオキシダー
ゼ、シュードモナス属由来のザルコシンオキシダーゼな
どが挙げられる。

【００１３】本発明ではその１例として、アースロバク
ター・エスピーＴＥ１８２６(FERMP-10637)のザルコシ
ンオキシダーゼ（特開平2-265478号公報、特開平6-1138
40号公報、Journal of Fermentation and Bioengineeri
ng Vol.75 No.4 pp239-244 (1993) に記載）を用いた。
アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６由来のザルコ
シンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列表の配列番号
１に示す。また、これらのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ配列を、配列表の配列番号３に示す。

【００１４】本発明の改変ザルコシンオキシダーゼは、
ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を構成する
アミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸を付加、欠
失、挿入あるいは置換により変異させた蛋白質であっ
て、プロリンに対する反応性が改変前の蛋白質に比して
低下したものである。プロリンに対する反応性とは、本
来の基質であるザルコシンを基質とした際の酵素活性に
対する、プロリンを基質とした酵素活性の割合として定
義される。本発明ではプロリンに対する反応性が改変前
の蛋白質に比して低下したものであるが、その低下の程
度は、約７０％以下である。

【００１５】本発明の一実施態様としては、ザルコシン
オキシダーゼ活性を有する蛋白質を構成するアミノ酸配
列の少なくとも１個のアミノ酸が、他のアミノ酸に置換
してなる改変ザルコシンオキシダーゼがある。

【００１６】さらに、本発明の一実施態様としては、配
列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の第３４５
番目のフェニルアラニンが、他のアミノ酸に置換された
アミノ酸配列（配列表、配列番号２）を有する蛋白質で
ある。

【００１７】また、本発明の一実施態様としては、他の
アミノ酸がアラニン、グリシン、バリンあるいはイソロ
イシンである改変ザルコシンオキシダーゼがある。

【００１８】さらに、具体的な実施態様としては下記理
化学的性質を有する改変ザルコシンオキシダーゼがあ
る。 作用：水および酸素の存在下にザルコシンに作用して、
グリシン、ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成す
る。 至適ｐＨ：７．５〜８．５ 至適温度：４０〜５０℃ 安定ｐＨ：６．５〜９．０（２５℃、２４時間処理） 安定温度：５０℃以下（ｐＨ７．５、１０分間処理） 基質特異性：プロリンに対する反応性が、改変前のタン
パク質に比べて、７０％以下である。 分子量：約４３ＫＤａ アミノ酸配列：配列表の配列番号２に記載される。

【００１９】本発明の改変ザルコシンオキシダーゼは、
以下に示す手順で製造することが可能である。まず、ザ
ルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を構成するア
ミノ酸配列を改変する方法としては、通常、行われる遺
伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、ザルコ
シンオキシダーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有す
るＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特
定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白
質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の
塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキ
ット（TransformerTM ；Clonetech 製，EXOIII/Mung Be
an Deletion Kit ；Stratagene製）などを使用するか、
またはＰＣＲの利用が挙げられる。

【００２０】作成された改変蛋白質の遺伝情報を有する
ＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物
中に移入され、改変蛋白質を生産する形質転換体とな
る。この際のプラスミドとしては、例えばエシェリヒア
・コリーを宿主微生物とする場合には、pBluescript 、
ｐＵＣ１８などが使用できる。また、他の細菌、例えば
バチルス属細菌を宿主とする場合には、ｐＵＢ１１０、
ｐＨＹ３００ＰＬＫなどが使用できる。宿主微生物とし
ては、例えばエシェリヒア・コリー W3110，エシェリヒ
ア・コリーC600，エシェリヒア・コリーJM109,エシェリ
ヒア・コリー DH5αなどが利用できる。他の宿主微生物
としては、バチルス属細菌やシュードモナス属細菌など
が使用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する
方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属
する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組
換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することがで
き、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。

【００２１】こうして得られた形質転換体である微生物
は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変蛋白
質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物
の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件
を選択すればよく、通常、多くの場合は液体培養で行う
が、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培
地の栄養源としては、微生物の培養に通常、用いられる
ものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭
素化合物であればよく、例えばグルコ−ス、シュークロ
ース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、
ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能
な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ
抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、
硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マ
ンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタ
ミンなどが必要に応じて使用される。

【００２２】培養温度は菌が発育し、改変蛋白質を生産
する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの
場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は
条件によって多少異なるが、改変蛋白質が最高収量に達
する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよ
く、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発
育し、改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、
特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。

【００２３】培養物中の改変蛋白質を生産する菌体を含
む培養液を、そのまま採取し利用することもできるが、
一般には常法に従って、改変蛋白質が培養液中に存在す
る場合は濾過、遠心分離などにより、改変蛋白質含有溶
液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変蛋白
質が菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾
過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次い
で、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素
的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレー
ト剤及びまたは界面活性剤を添加して改変蛋白質を可溶
化し、水溶液として分離採取する。

【００２４】このようにして得られた改変蛋白質含有溶
液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機
溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどに
よる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱
処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或い
はゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィーにより、精製された改変ザルコシン
オキシダーゼを得ることができる。

【００２５】本発明のクレアチン測定用試薬は、上記プ
ロリンに対する反応性が改変前のタンパク質に比して低
下した改変ザルコシンオキシダーゼ、クレアチンアミジ
ノヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素検
出試薬を含む。また、本発明のクレアチニン測定用試薬
は、上記プロリンに対する反応性が改変前のタンパク質
に比して低下した改変ザルコシンオキシダーゼ、クレア
チニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素検出試薬を
含む。クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンア
ミジノヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼとしては、従来
から公知のものを使用することができる。また、過酸化
水素検出試薬とは、改変ザルコシンオキシダーゼにより
生成した過酸化水素をペルオキシダーゼとともに測定す
る試薬であり、例え４−アミノアンチピリンとフェノー
ル誘導体またはアニリン誘導体がある。本発明ではこれ
らの過酸化水素測定試薬に限定されない。

【００２６】これらの試薬を用いて、クレアチンまたは
クレアチニンを測定する方法は、従来、公知の方法であ
る。本発明の測定試薬では、改変ザルコシンオキシダー
ゼがプロリンに対する反応性が改変前の蛋白質に比して
低下したものであることから、体液中のプロリンの影響
を受けることなく、正確、かつ、簡単にこれらの成分を
測定することが可能となる。

【００２７】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、ザルコシンオキシダーゼ活性の測定は以
下のように行なった。すなわち、４８ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ緩衝液(pH8.0) 、９５ｍＭザルコシン、０．４７ｍＭ
４−アミノアンチピリン、２．０ｍＭフェノール、0.
045%トリトンＸ−１００、４．５Ｕ／ｍｌペルオキシダ
ーゼ中で、酵素を３７℃，１０分反応させ、５００ｎｍ
における吸光度を測定する。酵素活性の１単位（Ｕ）
は、この条件下で１分間当たり１マイクロモルの過酸化
水素を生成する酵素量とした。また、Ｌ−プロリンに対
する反応性は、上記組成中のザルコシンをＬ−プロリン
に置き換えた際の活性の相対比として測定した。

【００２８】実施例１ ザルコシンオキシダーゼの改変 ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有する組換え体プ
ラスミド、pSAOEP3 をジャーナル・オブ・ファーメンテ
ーション・アンド・バイオエンジニアリング(Journal o
f Fermentation and Bioengineering) Vol.75 No.4 pp2
39-244 (1993)に記載の方法に従い、以下のようにして
調製した。まず、アースロバクター・エスピーＴＥ１８
２６(FERM P-10637)の染色体ＤＮＡを次の方法で分離し
た。同菌株を１００ｍｌの２×ＹＴ培地（1.6%ポリペプ
トン、1%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム(pH7.2))で３
７℃一晩振盪培養後、遠心(8000rpm、10分) により集菌
した。１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含んだ溶液で菌体を洗浄した後、２０％シュ
ークロース、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス塩酸(pH
7.6) を含んだ溶液５ｍｌに懸濁させ、０．５ｍｌのリ
ゾチーム溶液(100mg/ml)を加えて、３７℃、３０分間保
温した。次いで１１ｍｌの１％ラウロイルサルコシン
酸、０．１Ｍ ＥＤＴＡ(pH9.6) を含む溶液を加えた。

【００２９】この懸濁液に臭化エチジウム溶液を０．５
％塩化セシウムを約１００％加え、撹拌混合し、55,000
rpm 、２０時間の超遠心でＤＮＡを分取した。分取した
ＤＮＡは、１０ｍＭトリス塩酸(pH8.0) 、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含んだ溶液（ＴＥ）で透析し、精製ＤＮＡ標品と
した。

【００３０】精製ＤＮＡ標品１μgを制限酵素 Sau3AI
（東洋紡製）で部分分解反応させ、２ｋｂｐ以上の断片
に分解した後、SalIII東洋紡製）で切断した、ｐＵＣ１
８０．５μg を用い、M.G.Loftusらの BACKFILLING法
（Biotechniques Vol12,No.2(1992))に従い、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼ（東洋紡製）１ユニットで１６℃、１２時
間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡは、Ha
nahan の方法により作成したエシェリヒア・コリーJM10
9 のコンピテントセルを用いて形質転換した。使用した
ＤＮＡ１μg 当たり約 1×10⁶ 個の形質転換体のコロニ
ーが得られた。得られたコロニーは５０μg/mlアンピシ
リン、０．５％ザルコシン、0.005%パラロースアニリン
および0.025%ソディウムハイドロジェンサルファイト入
りＬ培地（1%ポリペプトン，0.5%酵母エキス，0.5%塩化
ナトリウム）で３７℃、１８時間培養し、赤色コロニー
を指標にザルコシンオキシダーゼ遺伝子の入った組換え
ＤＮＡをスクリーニングした。

【００３１】その結果、約1,000 個のコロニーのうち１
株の割合で赤色を示すコロニーを得た。この中の１株が
保有するプラスミドには約８．７ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断
片が存在しており、このプラスミドをpSAO1 とした。次
いでpSAO1 より挿入ＤＮＡ断片を種々の制限酵素により
切断してｐＵＣ１８にサブクローニングし、約１．７ｋ
ｂｐの挿入ＤＮＡ断片を有するpSAOEP3 を得た。

【００３２】配列表の配列番号３にpSAOEP3 の挿入ＤＮ
Ａ断片のＤＮＡ配列を、配列表の配列番号１にpSAOEP3
の挿入ＤＮＡ断片中にコードされているザルコシンオキ
シダーゼのアミノ酸配列をそれぞれ記載している。該組
換えプラスミドpSAOEP3 を基に、配列表の配列番号５の
オリゴヌクレオチドとＤＮＡ中の塩基を変換するキット
であるTransformerTM (Clonetech製）を用い、Transfor
merTM のプロトコールに従い、変異処理操作を行った。
その結果、配列表の配列番号１記載の第３４５番目のフ
ェニルアラニンがアラニンに置換された改変蛋白質 F34
5A（配列表の配列番号２記載）の遺伝情報を有するＤＮ
Ａを保持するプラスミドを作成した。

【００３３】該改変ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報
を有するＤＮＡを種々の制限酵素で切断してサブクロー
ンを調製し、常法に従い、シーケンシング・キット（SE
QUENING PRO 7-deaza-dGTP kit、東洋紡製）を用いて塩
基配列を決定し、改変されていることを確認した。該改
変ザルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するＤＮＡを
保持する組換え体プラスミドでエシェリヒアコリーJM10
9 のコンピテントセルを形質転換し、形質転換体をそれ
ぞれ得た。

【００３４】実施例２ 形質転換体の培養と改変蛋白質
の精製 ２×ＹＴ培地（1.6%ポリペプトン、1%酵母エキス、0.5%
塩化ナトリウム(pH7.2))５０ｍｌを５００ｍｌフラスコ
に分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い放
冷後、別途無菌濾過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン
（ナカライテスク製）を０．１％添加した。この培地に
上記と同一組成の培地で、予め３７℃で１８時間振盪培
養した形質転換体の培養液１ｍｌを接種し、３７℃で通
気撹拌培養した。

【００３５】培養液より改変蛋白質を、ジャーナル・オ
ブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニア
リング(Journal of Fermentation and Bioengineering)
Vol.75 No.4 pp239-244 (1993) 記載のザルコシンオキ
シダーゼの精製法に従い、超音波破砕、除核酸処理、硫
酸アンモニウム塩析、DEAE-Sephadex カラムクロマトグ
ラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーの工程を
順次、実施し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にて単一のバンドを形成するまで精製した。

【００３６】実施例３ 改変蛋白質の評価 精製された改変ザルコシンオキシダーゼと野生型ザルコ
シンオキシダーゼの、Ｌ−プロリンに対する反応性をザ
ルコシンに対する反応性を比較した。その結果を表１に
示す。

【００３７】

【表１】

【００３８】表１から明らかなように、改変ザルコシン
オキシダーゼ F345AのＬ−プロリンに対する反応性は、
野生型ザルコシンオキシダーゼのＬ−プロリンに対する
反応性より低下していることを示している。また、ザル
コシンに対する絶対的な反応性を表す比活性は、野生型
ザルコシンオキシダーゼが約２０Ｕ／ｍｇであるのに対
し、改変ザルコシンオキシダーゼ F345Aは約１８Ｕ／ｇ
ｍｇとほとんど遜色なかった。すなわち、改変ザルコシ
ンオキシダーゼは絶対的な酵素性能をほとんど損なうこ
となく、Ｌ−プロリンに対する反応性が野生型ザルコシ
ンオキシダーゼより低下していることが明らかとなっ
た。なお、他の性質は野性型ザルコシンオキシダーゼと
ほぼ、同じ性質であった。

【００３９】

【発明の効果】本発明によって、ザルコシンオキシダー
ゼ活性を有する蛋白質を蛋白工学的手法を用いて改変
し、プロリンに対する反応性が低下した改変ザルコシン
オキシダーゼを供給することが可能となった。本発明の
改変ザルコシンオキシダーゼは、細菌の系での遺伝子操
作技術による大量生産を実施することができる。また、
本発明の改変ザルコシンオキシダーゼを臨床的に筋疾
患、腎疾患の診断の指標となっている体液中のクレアチ
ン、クレアチニンの測定用酵素として、プロリンの影響
を受けることなく、検体中のクレアチン、クレアチニン
の量を正確，迅速に測定するために使用することができ
る。

【００４０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３８９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：アースロバクター・エスピー(Arthrobacter S
P.) 株名：ＴＥ１８２６ 配列 Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 10 15 Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr 20 25 30 Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His 35 40 45 Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr 50 55 60 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys 65 70 75 80 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly 85 90 95 Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys 100 105 110 Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys 115 120 125 Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu 130 135 140 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145 150 155 160 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val 165 170 175 Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr 180 185 190 Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn 195 200 205 Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr 210 215 220 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225 230 235 240 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr 245 250 255 Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His 260 265 270 Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly 275 280 285 Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr 290 295 300 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305 310 315 320 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe 325 330 335 Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe 340 345 350 Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys 355 360 365 Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys 370 375 380 Gln Lys Glu Thr Ile 385 389

【００４１】配列番号：２ 配列の長さ：３８９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 他の情報： Ｘａａはフェニルアラニン以外のアミノ酸を示す。 起源 生物名：アースロバクター・エスピー(Arthrobacter S
P.) 株名：ＴＥ１８２６ 配列 Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 10 15 Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr 20 25 30 Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His 35 40 45 Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr 50 55 60 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys 65 70 75 80 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly 85 90 95 Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys 100 105 110 Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys 115 120 125 Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu 130 135 140 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145 150 155 160 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val 165 170 175 Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr 180 185 190 Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn 195 200 205 Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr 210 215 220 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225 230 235 240 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr 245 250 255 Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His 260 265 270 Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly 275 280 285 Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr 290 295 300 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305 310 315 320 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe 325 330 335 Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Xaa Ser Gly His Gly Phe Lys Phe 340 345 350 Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys 355 360 365 Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys 370 375 380 Gln Lys Glu Thr Ile 385 389

【００４２】配列番号：３ 配列の長さ：１６７０ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 起源 生物名：アースロバクター・エスピー(Arthrobacter S
P.) 株名：ＴＥ１８２６ 配列 CTGCAGTTCT TCCTCCAGCT TTTGAATCCT CACGGTAACA TAAGATTGAA CATAATTTAA 60 ACTTTTGGCC GCCTTTGAAA CGCTGCCATA TTCAACTACC TTTTGAAAAA TCTGCAAATC 120 TTTAATTTCC AAGTATAATC ACTCCCAAAA CGTTCTTTTA CTACTAGCAC TAGAATATTT 180 CTAAAAGTGA TAGCTGCTAT CACTTTTAAG CATTTTACAT GATGGCCAAT AGGCCGTATG 240 ATGTAAATAG ATAATTAAGA AAATTCAAAT TACCTGTTTG AAAAAGGAGA GGAAACA 297 ATG AGT ATT AAA AAA GAT TAT GAT GTA ATT GTG GTT GGC GCT GGT TCC 345 Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 10 15 ATG GGA ATG GCA GCT GGG TAC TAT CTG TCT AAA CAA GGT GTT AAA ACA 393 Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr 20 25 30 CTA TTG GTA GAT TCA TTT CAT CCT CCC CAT ACA AAT GGC AGC CAT CAT 441 Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His 35 40 45 GGC GAT ACA CGG ATC ATT CGT CAC GCA TAT GGC GAA GGA AGA GAG TAT 489 Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr 50 55 60 GTA CCG TTT GCC TTG AGA GCA CAA GAG TTA TGG TAT GAA TTA GAA AAG 537 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys 65 70 75 80 GAG ACT CAT CAT AAA ATA TTT ACA AAA ACA GGT GTA CTC GTT TTT GGT 585 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly 85 90 95 CCT AAA GGA GAA GCT CCT TTC GTT GCC GAA ACA ATG GAA GCC GCA AAG 633 100 105 110 GAA CAT TCA TTA GAT GTT GAT TTA CTA GAA GGA AGT GAA ATA AAT AAG 681 Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys 115 120 125 CGT TGG CCA GGT GTA ACG GTT CCT GAG AAT TAT AAT GCT ATT TTT GAA 729 Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu 130 135 140 AAA AAT TCT GGT GTC TTA TTT AGT GAA AAT TGT ATT CGC GCT TAC CGT 777 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145 150 155 160 GAA TTG GCG GAA GCA AAT GGT GCG AAA GTT CTA ACG TAC ACA CCC GTT 825 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val 165 170 175 GAA GAT TTC GAG ATT GCC GAG GAC TTC GTC AAA ATC CAA ACC GCC TAT 873 Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr 180 185 190 GGC TCC TTT ACA GCC AGT AAA TTA ATT GTT AGC ATG GGC GCT TGG AAT 921 Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn 195 200 205 AGC AAA CTG CTA TCA AAA TTA AAT ATT GAA ATC CCA TTG CAG CCA TAC 969 Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr 210 215 220 CGT CAA GTT GTC GGA TTC TTC GAA TGT GAT GAA AAA AAA TAT AGC AAT 1017 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225 230 235 240 ACA CAT GGT TAT CCG GCG TTC ATG GTC GAA GTC CCA ACT GGC ATC TAT 1065 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr 245 250 255 TAC GGA TTT CCA AGC TTC GGC GGC TGC GGC TTG AAA ATA GGC TAT CAT 1113 Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His 260 265 270 ACG TAT GGT CAA AAA ATC GAT CCA GAT ACG ATT AAT CGT GAA TTT GGT 1161 Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly 275 280 285 ATT TAC CCG GAG GAT GAA GGG AAT ATT CGC AAA TTC CTG GAA ACA TAT 1209 Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr 290 295 300 ATG CCG GGA GCA ACC GGC GAA TTA AAA AGT GGG GCA GTT TGC ATG TAC 1257 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305 310 315 320 ACA AAA ACA CCT GAT GAG CAT TTC GTG ATT GAT TTA CAT CCT CAA TTC 1305 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe 325 330 335 TCG AAT GTC GCG ATT GCA GCC GGA TTC TCC GGA CAT GGG TTT AAA TTC 1353 Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe 340 345 350 TCA AGC GTA GTT GGT GAA ACA TTA AGT CAA TTA GCT GTA ACC GGT AAA 1401 Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys 355 360 365 ACA GAA CAC GAT ATT TCC ATC TTT TCA ATC AAT CGC CCT GCT TTA AAA 1449 Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys 370 375 380 CAA AAA GAA ACG ATT TAAAAACGCA AGCAAGCCGT ACATAAATTT CGATAGATAT 1504 Gln Lys Glu Thr Ile 385 TATGTACGGC TTACTTTATT TACAACTTAA AAATCTGCAT ATCAATCCTG TCCCTCTACT 1564G ATTGAAGCA CAAACTGTAC TTGAACGGCT TTTTTATTAA CTTGTAACGA TAACAGGAAC 1624GC TAAAATAA GAAGACCGCT GCATAAGAAT AGTACGGGAG GAATTC 1670

【００４３】配列番号：４ 配列の長さ：１６７０ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 起源 生物名：アースロバクター・エスピー(Arthrobacter S
P.) 株名：ＴＥ１８２６ 他の情報: ＮはＡ又はＣ又はＧ又はＴもしくはＵを示す。 Ｘａａはフェニルアラニン以外のアミノ酸を示す。 配列 CTGCAGTTCT TCCTCCAGCT TTTGAATCCT CACGGTAACA TAAGATTGAA CATAATTTAA 60 ACTTTTGGCC GCCTTTGAAA CGCTGCCATA TTCAACTACC TTTTGAAAAA TCTGCAAATC 120 TTTAATTTCC AAGTATAATC ACTCCCAAAA CGTTCTTTTA CTACTAGCAC TAGAATATTT 180 CTAAAAGTGA TAGCTGCTAT CACTTTTAAG CATTTTACAT GATGGCCAAT AGGCCGTATG 240 ATGTAAATAG ATAATTAAGA AAATTCAAAT TACCTGTTTG AAAAAGGAGA GGAAACA 297 ATG AGT ATT AAA AAA GAT TAT GAT GTA ATT GTG GTT GGC GCT GGT TCC 345 Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 10 15 ATG GGA ATG GCA GCT GGG TAC TAT CTG TCT AAA CAA GGT GTT AAA ACA 393 Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr 20 25 30 CTA TTG GTA GAT TCA TTT CAT CCT CCC CAT ACA AAT GGC AGC CAT CAT 441 Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His 35 40 45 GGC GAT ACA CGG ATC ATT CGT CAC GCA TAT GGC GAA GGA AGA GAG TAT 489 Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr 50 55 60 GTA CCG TTT GCC TTG AGA GCA CAA GAG TTA TGG TAT GAA TTA GAA AAG 537 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys 65 70 75 80 GAG ACT CAT CAT AAA ATA TTT ACA AAA ACA GGT GTA CTC GTT TTT GGT 585 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly 85 90 95 CCT AAA GGA GAA GCT CCT TTC GTT GCC GAA ACA ATG GAA GCC GCA AAG 633 Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys 100 105 110 GAA CAT TCA TTA GAT GTT GAT TTA CTA GAA GGA AGT GAA ATA AAT AAG 681 Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys 115 120 125 CGT TGG CCA GGT GTA ACG GTT CCT GAG AAT TAT AAT GCT ATT TTT GAA 729 Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu 130 135 140 AAA AAT TCT GGT GTC TTA TTT AGT GAA AAT TGT ATT CGC GCT TAC CGT 777 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145 150 155 160 GAA TTG GCG GAA GCA AAT GGT GCG AAA GTT CTA ACG TAC ACA CCC GTT 825 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val 165 170 175 GAA GAT TTC GAG ATT GCC GAG GAC TTC GTC AAA ATC CAA ACC GCC TAT 873 Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr 180 185 190 GGC TCC TTT ACA GCC AGT AAA TTA ATT GTT AGC ATG GGC GCT TGG AAT 921 Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn 195 200 205 AGC AAA CTG CTA TCA AAA TTA AAT ATT GAA ATC CCA TTG CAG CCA TAC 969 Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr 210 215 220 CGT CAA GTT GTC GGA TTC TTC GAA TGT GAT GAA AAA AAA TAT AGC AAT 1017 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225 230 235 240 ACA CAT GGT TAT CCG GCG TTC ATG GTC GAA GTC CCA ACT GGC ATC TAT 1065 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr 245 250 255 TAC GGA TTT CCA AGC TTC GGC GGC TGC GGC TTG AAA ATA GGC TAT CAT 1113 Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His 260 265 270 ACG TAT GGT CAA AAA ATC GAT CCA GAT ACG ATT AAT CGT GAA TTT GGT 1161 Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly 275 280 285 ATT TAC CCG GAG GAT GAA GGG AAT ATT CGC AAA TTC CTG GAA ACA TAT 1209 Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr 290 295 300 ATG CCG GGA GCA ACC GGC GAA TTA AAA AGT GGG GCA GTT TGC ATG TAC 1257 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305 310 315 320 ACA AAA ACA CCT GAT GAG CAT TTC GTG ATT GAT TTA CAT CCT CAA TTC 1305 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe 325 330 335 TCG AAT GTC GCG ATT GCA GCC GGA NNN TCC GGA CAT GGG TTT AAA TTC 1353 Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Xaa Ser Gly His Gly Phe Lys Phe 340 345 350 TCA AGC GTA GTT GGT GAA ACA TTA AGT CAA TTA GCT GTA ACC GGT AAA 1401 Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys 355 360 365 ACA GAA CAC GAT ATT TCC ATC TTT TCA ATC AAT CGC CCT GCT TTA AAA 1449 Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys 370 375 380 CAA AAA GAA ACG ATT TAAAAACGCA AGCAAGCCGT ACATAAATTT CGATAGATAT 1504 Gln Lys Glu Thr Ile 385 TATGTACGGC TTACTTTATT TACAACTTAA AAATCTGCAT ATCAATCCTG TCCCTCTACT 1564 GATTGAAGCA CAAACTGTAC TTGAACGGCT TTTTTATTAA CTTGTAACGA TAACAGGAAC 1624

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋
   白質を構成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ
   酸を付加、欠失、挿入あるいは置換により変異させた蛋
   白質であって、プロリンに対する反応性が改変前の蛋白
   質に比して低下したものであることを特徴とする改変ザ
   ルコシンオキシダーゼ。
2. 【請求項２】 ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋
   白質を構成するアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ
   酸が、他のアミノ酸に置換してなる請求項１記載の改変
   ザルコシンオキシダーゼ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に記載されるアミノ
   酸配列の第３４５番目のフェニルアラニンが、他のアミ
   ノ酸に置換されたアミノ酸配列（配列表の配列番号２）
   を有する蛋白質である請求項２記載の改変ザルコシンオ
   キシダーゼ。
4. 【請求項４】 他のアミノ酸がアラニン、グリシン、バ
   リンあるいはイソロイシンである請求項３記載の改変ザ
   ルコシンオキシダーゼ。
5. 【請求項５】 下記理化学的性質を有する改変ザルコシ
   ンオキシダーゼ。 作用：水および酸素の存在下にザルコシンに作用して、
   グリシン、ホルムアルデヒドおよ過酸化水素を生成す
   る。 至適ｐＨ：７．５〜８．５ 至適温度：４０〜５０℃ 安定ｐＨ：６．５〜９．０（２５℃、２４時間処理） 安定温度：５０℃以下（ｐＨ７．５、１０分間処理） 基質特異性：プロリンに対する反応性が、改変前のタン
   パク質に比べて、７０％以下である。 分子量：約４３ＫＤａ アミノ酸配列：配列表の配列番号２に記載される。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号１に記載されるアミノ
   酸配列をコードする遺伝子を他のアミノ酸をコードする
   遺伝子にて置換した遺伝子を組み込んだ発現ベクターで
   宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、
   該培養物からプロリンに対する反応性が改変前の蛋白質
   に比して低下した改変ザルコシンオキシダーゼを採取す
   ることを特徴とする改変ザルコシンオキシダーゼの製造
   法。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号１に記載されるアミノ
   酸配列の第３４５番目のフェニルアラニンをコードする
   遺伝子を他のアミノ酸をコードする遺伝子に置換した請
   求項６記載の改変ザルコシンオキシダーゼの製造法。
8. 【請求項８】 配列表の配列番号１に記載されるアミノ
   酸配列をコードする遺伝子を他のアミノ酸をコードする
   遺伝子にて置換した遺伝子が、配列表の配列番号４に記
   載されるＤＮＡ配列である請求項６記載の改変ザルコシ
   ンオキシダーゼの製造法。
9. 【請求項９】 請求項１〜５のいずれか１項に記載され
   るプロリンに対する反応性が改変前のタンパク質に比し
   て低下した改変ザルコシンオキシダーゼ、クレアチンア
   ミジノヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼおよび過酸化水
   素検出試薬を含むクレアチン測定用試薬。
10. 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれか１項に記載さ
    れるプロリンに対する反応性が改変前のタンパク質に比
    して低下した改変ザルコシンオキシダーゼ、クレアチニ
    ンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラー
    ゼ、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素検出試薬を含む
    クレアチニン測定用試薬。