JP3271157B2 - 新規な抗体、それを含むレニン活性物質及びそれを用いたプロレニン測定試薬 - Google Patents
新規な抗体、それを含むレニン活性物質及びそれを用いたプロレニン測定試薬Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトプロレニンと
結合して免疫複合物を形成しうる新規なヒトプロレニン
のプロフラグメント（以下ｐｆと略す）のＮ末端ペプチ
ド抗体、その抗体がヒトプロレニンと結合して形成され
たレニン活性物質及びそれらを用いた測定試薬に関する
ものである。
結合して免疫複合物を形成しうる新規なヒトプロレニン
のプロフラグメント（以下ｐｆと略す）のＮ末端ペプチ
ド抗体、その抗体がヒトプロレニンと結合して形成され
たレニン活性物質及びそれらを用いた測定試薬に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】プロレニンは、主として腎臓において、
完熟型レニンの前駆体すなわち完熟型レニンに４３個の
アミノ酸単位からなるプロフラグメントが結合したもの
として産生される酵素活性を示さない物質であり、糖尿
病患者が血管障害症を合併すると、その重症度に応じて
血中のヒトプロレニン値が上昇し、治療が成功するとこ
の上昇した血中ヒトプロレニン値が低下することから、
血中ヒトプロレニン値は糖尿病性血管障害のマーカーと
して提案されている［ザ・ニューイングランド・ジャー
ナル・オブ・メディスン（Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅ
ｄ．），第３１２巻，第１４１２〜１４１７ページ（１
９８５）、「東女医大誌」，第６０巻，第３４２〜３５
０ページ（１９９０）、「クリニカル・インベスティゲ
ータ（Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．）」，第７１巻，
第３〜６ページ（１９９３）］。
完熟型レニンの前駆体すなわち完熟型レニンに４３個の
アミノ酸単位からなるプロフラグメントが結合したもの
として産生される酵素活性を示さない物質であり、糖尿
病患者が血管障害症を合併すると、その重症度に応じて
血中のヒトプロレニン値が上昇し、治療が成功するとこ
の上昇した血中ヒトプロレニン値が低下することから、
血中ヒトプロレニン値は糖尿病性血管障害のマーカーと
して提案されている［ザ・ニューイングランド・ジャー
ナル・オブ・メディスン（Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅ
ｄ．），第３１２巻，第１４１２〜１４１７ページ（１
９８５）、「東女医大誌」，第６０巻，第３４２〜３５
０ページ（１９９０）、「クリニカル・インベスティゲ
ータ（Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．）」，第７１巻，
第３〜６ページ（１９９３）］。
【０００３】このため、ヒト血漿中のプロレニン値を測
定する方法がこれまでにいくつか提案されているが、ヒ
ト血漿中には酵素タンパクとしての完熟型レニンと完熟
型レニンの前駆体で酵素学的に不活性なヒトプロレニン
が存在するため、血漿中のヒトプロレニンをあらかじめ
低温下で酸により部分的に活性化し、トリプシンを用い
て完熟型レニンに変換したのち総レニン量を酵素学的方
法で、総レニン活性量として、あるいは免疫学的方法で
総活性レニン量として求め、別にレニン活性量を酵素学
的方法又は活性レニン量を免疫学的方法で求め、前者と
後者との差としてヒトプロレニン量を算出するという間
接的な手段をとらなければならなかった。
定する方法がこれまでにいくつか提案されているが、ヒ
ト血漿中には酵素タンパクとしての完熟型レニンと完熟
型レニンの前駆体で酵素学的に不活性なヒトプロレニン
が存在するため、血漿中のヒトプロレニンをあらかじめ
低温下で酸により部分的に活性化し、トリプシンを用い
て完熟型レニンに変換したのち総レニン量を酵素学的方
法で、総レニン活性量として、あるいは免疫学的方法で
総活性レニン量として求め、別にレニン活性量を酵素学
的方法又は活性レニン量を免疫学的方法で求め、前者と
後者との差としてヒトプロレニン量を算出するという間
接的な手段をとらなければならなかった。
【０００４】なお、ここで完熟型レニンとは、プロレニ
ンのプロフラグメント部がプロセッシング酵素により切
り離された構造体で、酵素活性部位が開放されているの
でレニン活性を示すものであり、またレニン活性とは、
酵素タンパクである完熟型レニンの本質的機能の酵素活
性能すなわちレニン基質（アンジオテンシノーゲン）に
特異的に作用してアンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）を産
出する性能である。
ンのプロフラグメント部がプロセッシング酵素により切
り離された構造体で、酵素活性部位が開放されているの
でレニン活性を示すものであり、またレニン活性とは、
酵素タンパクである完熟型レニンの本質的機能の酵素活
性能すなわちレニン基質（アンジオテンシノーゲン）に
特異的に作用してアンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）を産
出する性能である。
【０００５】ところで、最近不活性なヒトプロレニンが
低分子レニン阻害剤と結合することを利用してこれを開
放型構造に変換する方法が見出された結果、レニン活性
部位近傍を特異的に認識するモノクローナル抗体とヒト
プロレニン及び完熟型レニンの両者を認識するモノクロ
ーナル抗体を用いた免疫学的方法により総活性レニン量
を測定することが可能となり、またレニン阻害剤を添加
することなく活性レニン量を測定し、総活性レニン量と
の差からヒトプロレニン量を算出する方法が開発された
［「クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．）」，第４２巻，第１０５１〜１０６３ページ（１
９９６）］。この方法は、従来のトリプシン活性化酵素
学的総レニン活性測定法（トリプシン活性化法）に比
べ、トリプシンによるヒトプロレニン及び完熟型レニン
の過度の分解を抑制しうるという利点があり、またトリ
プシン活性化法との相関も良好であるが、血中プロレニ
ン値が上昇する糖尿病症例では活性レニン値が真正のレ
ニン活性値より高く与えられるという欠点がある。しか
もこの方法においては、総活性レニン量と活性レニン量
とをその都度測定しなければならないという煩雑さもあ
る。
低分子レニン阻害剤と結合することを利用してこれを開
放型構造に変換する方法が見出された結果、レニン活性
部位近傍を特異的に認識するモノクローナル抗体とヒト
プロレニン及び完熟型レニンの両者を認識するモノクロ
ーナル抗体を用いた免疫学的方法により総活性レニン量
を測定することが可能となり、またレニン阻害剤を添加
することなく活性レニン量を測定し、総活性レニン量と
の差からヒトプロレニン量を算出する方法が開発された
［「クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ
ｍ．）」，第４２巻，第１０５１〜１０６３ページ（１
９９６）］。この方法は、従来のトリプシン活性化酵素
学的総レニン活性測定法（トリプシン活性化法）に比
べ、トリプシンによるヒトプロレニン及び完熟型レニン
の過度の分解を抑制しうるという利点があり、またトリ
プシン活性化法との相関も良好であるが、血中プロレニ
ン値が上昇する糖尿病症例では活性レニン値が真正のレ
ニン活性値より高く与えられるという欠点がある。しか
もこの方法においては、総活性レニン量と活性レニン量
とをその都度測定しなければならないという煩雑さもあ
る。
【０００６】そのほか、直接法として、ヒトプロレニン
のｐｆのＣ端部すなわち２９〜４３番目のアミノ酸単位
を抗原として認識するモノクローナル抗体とヒトプロレ
ニン及び完熟型レニンの両者を認識するレニンモノクロ
ーナル抗体を利用する免疫学的測定法も知られている
［「ジャーナル・オブ・クリニカルエンドクリノロジー
・アンド・メタボリズム（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．），第７５巻，第６１７〜６２
３ページ（１９９２）」］。
のｐｆのＣ端部すなわち２９〜４３番目のアミノ酸単位
を抗原として認識するモノクローナル抗体とヒトプロレ
ニン及び完熟型レニンの両者を認識するレニンモノクロ
ーナル抗体を利用する免疫学的測定法も知られている
［「ジャーナル・オブ・クリニカルエンドクリノロジー
・アンド・メタボリズム（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．），第７５巻，第６１７〜６２
３ページ（１９９２）」］。
【０００７】この方法は、トリプシン活性化法と非常に
よい相関性を示す上に、健常人の血中プロレニン値の測
定にも利用しうるほどの高い感度を有するという長所が
あるが、測定値がトリプシン活性化法に比べ約８０％と
低い値を示す傾向があり、特にヒトプロレニン値が高い
疾患においてこの傾向が大きくなる上に、レニンモノク
ローナル抗体の認識部位が不明であるという欠点を有し
ている。
よい相関性を示す上に、健常人の血中プロレニン値の測
定にも利用しうるほどの高い感度を有するという長所が
あるが、測定値がトリプシン活性化法に比べ約８０％と
低い値を示す傾向があり、特にヒトプロレニン値が高い
疾患においてこの傾向が大きくなる上に、レニンモノク
ローナル抗体の認識部位が不明であるという欠点を有し
ている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のトリプシン活性化法、レニン阻害剤を用いる活性
化総活性レニン測定による間接的ヒトプロレニン測定法
及びヒトプロレニンのｐｆＣ末端部を抗原として認識す
る抗体を利用する直接免疫測定法がもつ欠点を克服し、
糖尿病性血管障害の発症を正確かつ簡単に検知しうるプ
ロレニン測定試薬を提供することを目的としてなされた
ものである。
従来のトリプシン活性化法、レニン阻害剤を用いる活性
化総活性レニン測定による間接的ヒトプロレニン測定法
及びヒトプロレニンのｐｆＣ末端部を抗原として認識す
る抗体を利用する直接免疫測定法がもつ欠点を克服し、
糖尿病性血管障害の発症を正確かつ簡単に検知しうるプ
ロレニン測定試薬を提供することを目的としてなされた
ものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、先に４３
個のアミノ酸単位からなるヒトプロレニンのｐｆ部位を
特異的に認識する抗体を用いたヒトプロレニン測定試薬
を開発したが（特開平８−２８５８５２号公報）、さら
に研究を重ねた結果、ヒトプロレニンのｐｆＮ末端の１
〜１５個のアミノ酸単位からなるペプチドを抗原として
特異的に認識する高親和性の抗体を得ることにはじめて
成功し、かつこのｐｆＮ末端抗体がヒトプロレニンと結
合してレニン活性物質を形成し、これにＡｎｇＩ競合酵
素免疫測定法［「クリニカル・アンド・エスペリメンタ
ル・ハイパーテンション−セオリーアンドプラクティス
（Ｃｌｉｎ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒ Ｈｙｐｅｒ．−Ｔｈ
ｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」，第Ａ１２
巻，第８３〜９５ページ（１９９０）］を利用すれば血
中プロレニン値を正確に測定しうることを見出し、この
知見に基づいて本発明をなすに至った。
個のアミノ酸単位からなるヒトプロレニンのｐｆ部位を
特異的に認識する抗体を用いたヒトプロレニン測定試薬
を開発したが（特開平８−２８５８５２号公報）、さら
に研究を重ねた結果、ヒトプロレニンのｐｆＮ末端の１
〜１５個のアミノ酸単位からなるペプチドを抗原として
特異的に認識する高親和性の抗体を得ることにはじめて
成功し、かつこのｐｆＮ末端抗体がヒトプロレニンと結
合してレニン活性物質を形成し、これにＡｎｇＩ競合酵
素免疫測定法［「クリニカル・アンド・エスペリメンタ
ル・ハイパーテンション−セオリーアンドプラクティス
（Ｃｌｉｎ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒ Ｈｙｐｅｒ．−Ｔｈ
ｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」，第Ａ１２
巻，第８３〜９５ページ（１９９０）］を利用すれば血
中プロレニン値を正確に測定しうることを見出し、この
知見に基づいて本発明をなすに至った。
【００１０】すなわち、本発明は、ヒトプロレニンプロ
フラグメントのＮ末端ペプチド中少なくとも１番目のロ
イシンから１５番目のアルギニンまでのアミノ酸単位を
含むペプチドを抗原として特異的に認識することを特徴
とするヒトプロレニンのｐｆＮ末端ペプチド抗体、この
抗体とヒトプロレニンとの結合体からなるレニン活性物
質及びこれらを活性成分としたプロレニン測定試薬を提
供するものである。
フラグメントのＮ末端ペプチド中少なくとも１番目のロ
イシンから１５番目のアルギニンまでのアミノ酸単位を
含むペプチドを抗原として特異的に認識することを特徴
とするヒトプロレニンのｐｆＮ末端ペプチド抗体、この
抗体とヒトプロレニンとの結合体からなるレニン活性物
質及びこれらを活性成分としたプロレニン測定試薬を提
供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明のヒトプロレニンのｐｆＮ
末端ペプチド抗体は、例えば次のようにして調製するこ
とができる。すなわち、先ずヒトプロレニンのｐｆＮ末
端ペプチドに相当するアミノ酸単位Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
からなるペプチドを固相ペプチド合成したのち、これを
架橋剤例えばマレイミド化合物を用いてキャリアータン
パク例えばウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、キー
ホールリンペットヘモシアニンなどと結合させ免疫抗原
とする。
末端ペプチド抗体は、例えば次のようにして調製するこ
とができる。すなわち、先ずヒトプロレニンのｐｆＮ末
端ペプチドに相当するアミノ酸単位Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
からなるペプチドを固相ペプチド合成したのち、これを
架橋剤例えばマレイミド化合物を用いてキャリアータン
パク例えばウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、キー
ホールリンペットヘモシアニンなどと結合させ免疫抗原
とする。
【００１２】次いで、それぞれの免疫抗原をフロイント
の完全アジュバントとよく混合し、成熟家兎（体重約
２．５ｋｇ）に投与し、免疫する。この免疫操作は２週
間間隔で行い、５回目以降に耳周縁静脈より少量採血
し、その抗体価を調べ、十分に抗体価が上昇した時点で
全採血を行い、抗血清を得る。次にこの抗血清を塩析
し、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー処理するこ
とにより、ｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧが得られる。
この際、家兎に免疫抗原を免疫してポリクローナル抗体
を得る代りに、これまで知られている方法に従い、免疫
抗原をマウスに免疫してモノクローナル抗体を調製する
こともできる。
の完全アジュバントとよく混合し、成熟家兎（体重約
２．５ｋｇ）に投与し、免疫する。この免疫操作は２週
間間隔で行い、５回目以降に耳周縁静脈より少量採血
し、その抗体価を調べ、十分に抗体価が上昇した時点で
全採血を行い、抗血清を得る。次にこの抗血清を塩析
し、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー処理するこ
とにより、ｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧが得られる。
この際、家兎に免疫抗原を免疫してポリクローナル抗体
を得る代りに、これまで知られている方法に従い、免疫
抗原をマウスに免疫してモノクローナル抗体を調製する
こともできる。
【００１３】前記のようにして得たｐｆＮ末端ペプチド
抗体ＩｇＧについて２８０ｎｍの吸光度に基づきタンパ
ク量（ＩｇＧ分子量１５０，０００として）を算出した
ところ２．６ｍｇ／ｍｌであった。このｐｆＮ末端ペプ
チド抗体は、ヒトプロレニンに対し、高い親和性を示
し、またｐｆＮ末端部に対し特異的に作用する抗体であ
る。
抗体ＩｇＧについて２８０ｎｍの吸光度に基づきタンパ
ク量（ＩｇＧ分子量１５０，０００として）を算出した
ところ２．６ｍｇ／ｍｌであった。このｐｆＮ末端ペプ
チド抗体は、ヒトプロレニンに対し、高い親和性を示
し、またｐｆＮ末端部に対し特異的に作用する抗体であ
る。
【００１４】次に、このｐｆＮ末端ペプチド抗体をヒト
プロレニンと結合させると、酵素活性すなわちレニン活
性を示す物質が得られる。このレニン活性物質は例えば
以下のようにして調製することができる。
プロレニンと結合させると、酵素活性すなわちレニン活
性を示す物質が得られる。このレニン活性物質は例えば
以下のようにして調製することができる。
【００１５】すなわち、先ずヒトプロレニン液に、ウシ
血清を含む生理的食塩水で希釈したｐｆＮ末端ペプチド
抗体を加え、４℃の温度において１６〜２４時間反応さ
せる。次いでこの反応液に、ヒトレニン基質として羊ア
ンジオテンシノーゲン液を加え３７℃において１５分間
反応させたのち、氷冷して反応を停止させる。
血清を含む生理的食塩水で希釈したｐｆＮ末端ペプチド
抗体を加え、４℃の温度において１６〜２４時間反応さ
せる。次いでこの反応液に、ヒトレニン基質として羊ア
ンジオテンシノーゲン液を加え３７℃において１５分間
反応させたのち、氷冷して反応を停止させる。
【００１６】このようにして得たレニン活性物質につい
て、そのＡｎｇＩ産生能力をヒトプロレニンをトリプシ
ンで活性化したものと対比させて測定したところ、ｐｆ
Ｎ末端ペプチド抗体はその希釈度に対応してレニン活性
が変化することが分った。
て、そのＡｎｇＩ産生能力をヒトプロレニンをトリプシ
ンで活性化したものと対比させて測定したところ、ｐｆ
Ｎ末端ペプチド抗体はその希釈度に対応してレニン活性
が変化することが分った。
【００１７】すなわち、図１は、本発明のヒトプロレニ
ンｐｆＮ末端ペプチド抗体の例について、それをヒトプ
ロレニンと反応させた際における濃度と反応液の吸光度
（ＯＤ４５０ｎｍ）との関係を示すグラフであるが、こ
の図より本発明のヒトプロレニンｐｆＮ末端ペプチド抗
体は、ヒトプロレニンに対し高い親和性を示すことが分
る。また、図２は、本発明のヒトプロレニンｐｆＮ末端
ペプチド抗体をｐｆＮ末端合成ペプチドと混合したとき
のペプチド濃度と吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）との関係を
示すグラフであるが、この図より、ヒトプロレニンとヒ
トプロレニンｐｆＮ末端ペプチド抗体との結合は、ｐｆ
Ｎ末端合成ペプチドにより完全に阻害されること、すな
わちヒトプロレニンに対し、特異的な作用を示すことが
分る。
ンｐｆＮ末端ペプチド抗体の例について、それをヒトプ
ロレニンと反応させた際における濃度と反応液の吸光度
（ＯＤ４５０ｎｍ）との関係を示すグラフであるが、こ
の図より本発明のヒトプロレニンｐｆＮ末端ペプチド抗
体は、ヒトプロレニンに対し高い親和性を示すことが分
る。また、図２は、本発明のヒトプロレニンｐｆＮ末端
ペプチド抗体をｐｆＮ末端合成ペプチドと混合したとき
のペプチド濃度と吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）との関係を
示すグラフであるが、この図より、ヒトプロレニンとヒ
トプロレニンｐｆＮ末端ペプチド抗体との結合は、ｐｆ
Ｎ末端合成ペプチドにより完全に阻害されること、すな
わちヒトプロレニンに対し、特異的な作用を示すことが
分る。
【００１８】次に、図３はヒトプロレニンと本発明のヒ
トプロレニンｐｆＮ末端ペプチド抗体とを反応させた結
合体の１例についてのレニン活性を、ヒトプロレニンを
トリプシンで活性化したレニン活性を１００％とした相
対値により、抗体希釈倍数の関数として示した棒グラフ
であって、これによると上記の結合体がレニン活性を発
現し、しかもこの活性はヒトプロレニンｐｆＮ末端ペプ
チド抗体の使用量に依存することが分る。
トプロレニンｐｆＮ末端ペプチド抗体とを反応させた結
合体の１例についてのレニン活性を、ヒトプロレニンを
トリプシンで活性化したレニン活性を１００％とした相
対値により、抗体希釈倍数の関数として示した棒グラフ
であって、これによると上記の結合体がレニン活性を発
現し、しかもこの活性はヒトプロレニンｐｆＮ末端ペプ
チド抗体の使用量に依存することが分る。
【００１９】また、ヒトプロレニンｐｆＮ末端ペプチド
抗体ＩｇＧとヒトプロレニンとの結合体をゲルろ過高速
液体クロマトグラフィーを用いて分画し、各分画の酵素
活性を測定したところ、図４の実線に示す結果が得られ
た。同様にヒトプロレニンをゲルろ過し、ｐｆＮ末端ペ
プチド抗体及び酵素標識プロテインＡを用いて酵素免疫
測定した結果を図４の破線として示す。
抗体ＩｇＧとヒトプロレニンとの結合体をゲルろ過高速
液体クロマトグラフィーを用いて分画し、各分画の酵素
活性を測定したところ、図４の実線に示す結果が得られ
た。同様にヒトプロレニンをゲルろ過し、ｐｆＮ末端ペ
プチド抗体及び酵素標識プロテインＡを用いて酵素免疫
測定した結果を図４の破線として示す。
【００２０】この図４と図５（溶出時間と分子量との関
係を示すグラフ）から明らかなように結合体の酵素活性
の大部分は溶出時間１２〜１２．５分の分画で認めら
れ、酵素免疫測定によるヒトプロレニンは溶出時間１
６．５〜１７分の分画で認められた。このことから、ヒ
トプロレニン（分子量４３〜５０ＫＤ）とヒトプロレニ
ンｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧ（分子量１５０ＫＤ）
との結合体（分子量２００〜２４０ＫＤ）が酵素活性を
発現していることが分る。
係を示すグラフ）から明らかなように結合体の酵素活性
の大部分は溶出時間１２〜１２．５分の分画で認めら
れ、酵素免疫測定によるヒトプロレニンは溶出時間１
６．５〜１７分の分画で認められた。このことから、ヒ
トプロレニン（分子量４３〜５０ＫＤ）とヒトプロレニ
ンｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧ（分子量１５０ＫＤ）
との結合体（分子量２００〜２４０ＫＤ）が酵素活性を
発現していることが分る。
【００２１】さらに、図６は、前記結合体を用いて、ヒ
トプロレニンを測定した値と、トリプシン活性化法によ
り測定した値との相関関係を示すグラフであるが、これ
によると、両者は非常に良好な相関性（γ＝０．９８
６）を示すことが分る。この結合体をプロレニン測定試
薬として用い、濃度の異なるヒトプロレニンの測定試験
を行ったところ、図７に示すようにヒトプロレニン量１
２．５〜４００ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間の範囲で直
線性を示した。また、高、中、低濃度のヒトプロレニン
血清を希釈用ヒト血清で希釈し、前記結合体を測定試薬
として酵素活性を測定したところ、図８に示すように、
いずれも原点を通る直線性を示した。
トプロレニンを測定した値と、トリプシン活性化法によ
り測定した値との相関関係を示すグラフであるが、これ
によると、両者は非常に良好な相関性（γ＝０．９８
６）を示すことが分る。この結合体をプロレニン測定試
薬として用い、濃度の異なるヒトプロレニンの測定試験
を行ったところ、図７に示すようにヒトプロレニン量１
２．５〜４００ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間の範囲で直
線性を示した。また、高、中、低濃度のヒトプロレニン
血清を希釈用ヒト血清で希釈し、前記結合体を測定試薬
として酵素活性を測定したところ、図８に示すように、
いずれも原点を通る直線性を示した。
【００２２】これらの測定試験についての同時再現性
（ｎ＝７）の異なった濃度での変動係数は１．８〜５．
５％、日差再現性（ｎ＝５）の変動係数は３．８〜７．
５％であり、いずれも良好な再現性を示した。
（ｎ＝７）の異なった濃度での変動係数は１．８〜５．
５％、日差再現性（ｎ＝５）の変動係数は３．８〜７．
５％であり、いずれも良好な再現性を示した。
【００２３】以上の結果より、本発明のヒトプロレニン
ｐｆＮ末端ペプチド抗体は、ヒトプロレニンに高い親和
性を示し、しかもｐｆＮ末端部に対し特異的に作用する
こと、この抗体とヒトプロレニンとの結合体は酵素活性
を有し、それが濃度変化とよく相関していること、した
がってプロレニン測定試薬として有用であることが分
る。
ｐｆＮ末端ペプチド抗体は、ヒトプロレニンに高い親和
性を示し、しかもｐｆＮ末端部に対し特異的に作用する
こと、この抗体とヒトプロレニンとの結合体は酵素活性
を有し、それが濃度変化とよく相関していること、した
がってプロレニン測定試薬として有用であることが分
る。
【００２４】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに詳細に説明
するが、本発明はこれによってなんら限定されるもので
はない。なお、各例で使用した試薬は以下の方法で調製
し、またプロレニンの単位表示は、ＡｎｇＩ産生能を基
準として行った。
するが、本発明はこれによってなんら限定されるもので
はない。なお、各例で使用した試薬は以下の方法で調製
し、またプロレニンの単位表示は、ＡｎｇＩ産生能を基
準として行った。
【００２５】（１）発色試薬；テトラメチルベンチジン
（以下ＴＭＢと略す）を５．５ｍＭ濃度で酢酸緩衝液
（ｐＨ６．５）に溶解して調製。 （２）アンジオテンシノーゲン試薬；両側腎臓を摘出し
た羊から手術後４８時間目に採血し、直ちに分離した血
清を凍結乾燥し、この乾燥物２０ｍｇを、ジイソプロピ
ルフロロホスフェート（以下ＤＦＰと略す）１０ミリモ
ル及びＥＤＴＡ１０ミリモルを含むｐＨ６．５の０．２
Ｍ−リン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略す）１リットルに溶
解して調製。 （３）洗浄用緩衝液；ＰＢＳ生理食塩水に、０．０５％
濃度でＴｗｅｅｎ２０を加えて調製。 （４）希釈用ヒト血清；正常ヒト血清（株式会社日本生
物材料センター製）を、完熟型レニン及びヒトプロレニ
ンの両方を認識する抗体を用いてアフィニティクロマト
グラフィー処理し、完熟型レニン及びヒトプロレニンを
吸着させ、５６℃で３０分間非動化処理して調製。
（以下ＴＭＢと略す）を５．５ｍＭ濃度で酢酸緩衝液
（ｐＨ６．５）に溶解して調製。 （２）アンジオテンシノーゲン試薬；両側腎臓を摘出し
た羊から手術後４８時間目に採血し、直ちに分離した血
清を凍結乾燥し、この乾燥物２０ｍｇを、ジイソプロピ
ルフロロホスフェート（以下ＤＦＰと略す）１０ミリモ
ル及びＥＤＴＡ１０ミリモルを含むｐＨ６．５の０．２
Ｍ−リン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略す）１リットルに溶
解して調製。 （３）洗浄用緩衝液；ＰＢＳ生理食塩水に、０．０５％
濃度でＴｗｅｅｎ２０を加えて調製。 （４）希釈用ヒト血清；正常ヒト血清（株式会社日本生
物材料センター製）を、完熟型レニン及びヒトプロレニ
ンの両方を認識する抗体を用いてアフィニティクロマト
グラフィー処理し、完熟型レニン及びヒトプロレニンを
吸着させ、５６℃で３０分間非動化処理して調製。
【００２６】参考例１（γ‐ヒトプロレニン原液の調
製） 村上らの方法［「ジャーナル・オブ・ハイパーテンショ
ンズ（Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．」，第４巻，第Ｓ３８
８〜Ｓ３９０ページ（１９８６）］に従って、ヒト腎由
来のプロレニンのＣＤＮＡを発現ベクターに導入し、チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞（以下ＣＨＯ細胞と略
記）に組み込んだものを、牛胎児血清１０％を含有する
ダルベッコ変法イーグル培地で培養し、ＣＨＯ細胞が十
分に生育した時点で無血清培地と変換することによりγ
‐ヒトプロレニンを含む培養上清を得る。
製） 村上らの方法［「ジャーナル・オブ・ハイパーテンショ
ンズ（Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．」，第４巻，第Ｓ３８
８〜Ｓ３９０ページ（１９８６）］に従って、ヒト腎由
来のプロレニンのＣＤＮＡを発現ベクターに導入し、チ
ャイニーズハムスター卵巣細胞（以下ＣＨＯ細胞と略
記）に組み込んだものを、牛胎児血清１０％を含有する
ダルベッコ変法イーグル培地で培養し、ＣＨＯ細胞が十
分に生育した時点で無血清培地と変換することによりγ
‐ヒトプロレニンを含む培養上清を得る。
【００２７】このようにして得たＣＨＯ培養上清を５ミ
リモル−ＥＤＴＡを含むＰＢＳ生理食塩水で透析したの
ち、γ‐ヒトプロレニン濃度を２００μｇ ＡｎｇＩ／
ｍｌ・時間に調整することによりγ‐プロレニン原液を
調製する。このものは４℃において保存される。
リモル−ＥＤＴＡを含むＰＢＳ生理食塩水で透析したの
ち、γ‐ヒトプロレニン濃度を２００μｇ ＡｎｇＩ／
ｍｌ・時間に調整することによりγ‐プロレニン原液を
調製する。このものは４℃において保存される。
【００２８】参考例２（酵素標識ＡｎｇＩの調製） 西洋ワサビペルオキシダーゼ５ｍｇを０．２モル−ＰＢ
Ｓ５００μｌに溶解した溶液中に、２．５％グルタルア
ルデヒド溶液１ｍｌを激しくかきまぜながら滴下する。
滴下終了後、２５℃において３０分間かきまぜたのち、
氷冷下、メンブレンフィルター（ザルトリウス社製）を
用いて約１００μｌに濃縮し、過剰のグルタルアルデヒ
ドをゲルろ過して除き、酵素分画を回収する。
Ｓ５００μｌに溶解した溶液中に、２．５％グルタルア
ルデヒド溶液１ｍｌを激しくかきまぜながら滴下する。
滴下終了後、２５℃において３０分間かきまぜたのち、
氷冷下、メンブレンフィルター（ザルトリウス社製）を
用いて約１００μｌに濃縮し、過剰のグルタルアルデヒ
ドをゲルろ過して除き、酵素分画を回収する。
【００２９】次いで、この溶液をさらに濃縮したのち、
合成ＡｎｇＩペプチド１ｍｇを精製水１ｍｌに溶解した
溶液１３０μｌを加え、３０℃において２時間反応させ
る。次いで０．２モル−リジン水溶液１００μｌを加え
て反応を停止させたのち、反応液を１００μｌに濃縮し
て再びゲルろ過して未反応のＡｎｇＩを除き、所望の酵
素標識ＡｎｇＩ液を得る。
合成ＡｎｇＩペプチド１ｍｇを精製水１ｍｌに溶解した
溶液１３０μｌを加え、３０℃において２時間反応させ
る。次いで０．２モル−リジン水溶液１００μｌを加え
て反応を停止させたのち、反応液を１００μｌに濃縮し
て再びゲルろ過して未反応のＡｎｇＩを除き、所望の酵
素標識ＡｎｇＩ液を得る。
【００３０】このようにして得た酵素標識ＡｎｇＩ液に
牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）を濃度０．１％
になるように加えて酵素標識ＡｎｇＩ原液とし、−８０
℃で保存する。この酵素標識ＡｎｇＩ原液を使用する場
合には、０．１％ＢＳＡ、０．１モル−ＮａＣｌ及び
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３０００倍に
希釈して用いる。
牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）を濃度０．１％
になるように加えて酵素標識ＡｎｇＩ原液とし、−８０
℃で保存する。この酵素標識ＡｎｇＩ原液を使用する場
合には、０．１％ＢＳＡ、０．１モル−ＮａＣｌ及び
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３０００倍に
希釈して用いる。
【００３１】参考例３（ＡｎｇＩ抗体の調製） 合成ＡｎｇＩペプチド（ペプチド研製）６．８ｍｇを
０．２モルＰＢＳ１ｍｌに溶解し、この中へｍ‐マレイ
ミドベンゾイル‐Ｎ‐アンヒドロサクシイミドエステル
（以下ＭＢＳと略す）３．４ｍｇをテトラヒドロフラン
０．５ｍｌに溶解した溶液を滴下する。次いで、この溶
液を３０℃において３０分間反応させたのち、窒素ガス
をバブリングさせてテトラヒドロフランを追い出し、残
留液に塩化メチレン５ｍｌを加えてかきまぜ、遠心分離
してＡｎｇＩ−ＭＢＳ溶液を水層として分離する。次い
でＢＳＡ１０ｍｇを０．１モルＥＤＴＡを含む６モル濃
度の尿素溶液５００μｌに溶解し、水素化ホウ素ナトリ
ウム２０ｍｇを加え、さらにｎ‐ブタノール１００μｌ
を消泡剤として加え、３０分間静置したのち０．２モル
ＰＢＳ１ｍｌとアセトン０．４ｍｌを加え還元ＢＳＡを
得る。前記のＡｎｇＩ−ＭＢＳ溶液と還元ＢＳＡを混合
し、３７℃において２時間反応させたのち、ＰＢＳで透
析し未反応のＡｎｇＩを除去する。これを免疫抗原とし
て用い免疫処理することによりＡｎｇＩ抗血清が得られ
る。
０．２モルＰＢＳ１ｍｌに溶解し、この中へｍ‐マレイ
ミドベンゾイル‐Ｎ‐アンヒドロサクシイミドエステル
（以下ＭＢＳと略す）３．４ｍｇをテトラヒドロフラン
０．５ｍｌに溶解した溶液を滴下する。次いで、この溶
液を３０℃において３０分間反応させたのち、窒素ガス
をバブリングさせてテトラヒドロフランを追い出し、残
留液に塩化メチレン５ｍｌを加えてかきまぜ、遠心分離
してＡｎｇＩ−ＭＢＳ溶液を水層として分離する。次い
でＢＳＡ１０ｍｇを０．１モルＥＤＴＡを含む６モル濃
度の尿素溶液５００μｌに溶解し、水素化ホウ素ナトリ
ウム２０ｍｇを加え、さらにｎ‐ブタノール１００μｌ
を消泡剤として加え、３０分間静置したのち０．２モル
ＰＢＳ１ｍｌとアセトン０．４ｍｌを加え還元ＢＳＡを
得る。前記のＡｎｇＩ−ＭＢＳ溶液と還元ＢＳＡを混合
し、３７℃において２時間反応させたのち、ＰＢＳで透
析し未反応のＡｎｇＩを除去する。これを免疫抗原とし
て用い免疫処理することによりＡｎｇＩ抗血清が得られ
る。
【００３２】参考例４（ＡｎｇＩ抗体プレートの調製） 参考例３で得たＡｎｇＩ抗血清を０．０５モル炭酸緩衝
液（ｐＨ９．６）で５，０００倍に希釈する。この希釈
液１００μｌを免疫測定用マイクロプレート（ヌンク社
製、マキシソープ９６穴）の各穴に分注し、４℃におい
て１６〜２４時間静置する。その後で、この希釈液を捨
て、１％カゼインを含むＰＢＳ生理食塩水２００μｌず
つを分注して、４℃において少なくとも１６時間静置
し、ＡｎｇＩ抗体を固定化する。このものは４℃におい
て保存する。
液（ｐＨ９．６）で５，０００倍に希釈する。この希釈
液１００μｌを免疫測定用マイクロプレート（ヌンク社
製、マキシソープ９６穴）の各穴に分注し、４℃におい
て１６〜２４時間静置する。その後で、この希釈液を捨
て、１％カゼインを含むＰＢＳ生理食塩水２００μｌず
つを分注して、４℃において少なくとも１６時間静置
し、ＡｎｇＩ抗体を固定化する。このものは４℃におい
て保存する。
【００３３】実施例１ ヘモシアニン１６ｍｇを０．１モルＰＢＳ（ｐＨ７．
２）１ｍｌに溶解し、この溶液にＮ‐（γ‐マレイミド
ブチロオキシ）サクシイミドのジメチルホルムアミド溶
液（１５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加え、室温で３時間
反応させる。反応終了後、反応液をセファデックスＧ−
２５カラムに通して、未反応のＮ‐（γ‐マレイミドブ
チロオキシ）サクシイミドを除去する。次いで、反応生
成物を０．１モルＰＢＳ（ｐＨ６．０）で溶出し、その
溶出液に、保護基を脱離したプロレニンのｐｆＮ末端の
第１番目から第１５番目のアミノ酸単位からなる合成ペ
プチド（ペプチド研製）１０ｍｇを加え、室温で３時間
反応させることにより、プロレニンのｐｆＮ末端合成ペ
プチドヘモシアニン結合体（免疫抗原）を得る。この溶
液を動物に免疫するまで−８０℃で保存する。
２）１ｍｌに溶解し、この溶液にＮ‐（γ‐マレイミド
ブチロオキシ）サクシイミドのジメチルホルムアミド溶
液（１５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加え、室温で３時間
反応させる。反応終了後、反応液をセファデックスＧ−
２５カラムに通して、未反応のＮ‐（γ‐マレイミドブ
チロオキシ）サクシイミドを除去する。次いで、反応生
成物を０．１モルＰＢＳ（ｐＨ６．０）で溶出し、その
溶出液に、保護基を脱離したプロレニンのｐｆＮ末端の
第１番目から第１５番目のアミノ酸単位からなる合成ペ
プチド（ペプチド研製）１０ｍｇを加え、室温で３時間
反応させることにより、プロレニンのｐｆＮ末端合成ペ
プチドヘモシアニン結合体（免疫抗原）を得る。この溶
液を動物に免疫するまで−８０℃で保存する。
【００３４】この免疫抗原を生理食塩水でタンパク濃度
１ｍｇ／ｍｌに調整したのち、等量のフロインドの完全
アジュバントとよく混和し、ニュージーランドホワイト
種のウサギ（体重約２．５ｋｇ）の皮下に全量を数か所
に分けて注射する。以後、免疫抗原量を初回の半量、２
週間間隔で７回同様に免疫する。最終免疫後、常法によ
り全採血して抗血清を得る。この抗血清は、０．１モル
ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に対して透析したのち、濃縮し、
生理食塩水１リットル中アジ化ナトリウム（ＮａＮ3）
１００ｇを溶かした溶液１００分の１容を添加して、４
℃において保存する。
１ｍｇ／ｍｌに調整したのち、等量のフロインドの完全
アジュバントとよく混和し、ニュージーランドホワイト
種のウサギ（体重約２．５ｋｇ）の皮下に全量を数か所
に分けて注射する。以後、免疫抗原量を初回の半量、２
週間間隔で７回同様に免疫する。最終免疫後、常法によ
り全採血して抗血清を得る。この抗血清は、０．１モル
ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に対して透析したのち、濃縮し、
生理食塩水１リットル中アジ化ナトリウム（ＮａＮ3）
１００ｇを溶かした溶液１００分の１容を添加して、４
℃において保存する。
【００３５】前記の抗血清１ｍｌを硫酸ナトリウムによ
り塩析し、生じた沈殿を１７．５ミリモルＰＢＳ（ｐＨ
６．３）に溶解し、同じＰＢＳで１晩透析したのち、同
じＰＢＳで平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに流速
０．３〜０．５ｍｌ／分で通し、２８０ｎｍの吸収を示
す分画を捕集する。この分画を０．１モルＰＢＳ（ｐＨ
７．０）に対して透析し、セントリコン−３０（アミコ
ン社製）で濃縮したのち、前記した濃度１００ｇ／ｌの
アジ化ナトリウム溶液を１００分の１容の割合で添加し
て、４℃において保存する。このようにして得たｐｆＮ
末端ペプチド抗体ＩｇＧについて、２８０ｎｍの吸光度
からタンパク量（ＩｇＧ分子量１５０，０００として）
を算出すると、２．６ｍｇ／ｍｌであった。
り塩析し、生じた沈殿を１７．５ミリモルＰＢＳ（ｐＨ
６．３）に溶解し、同じＰＢＳで１晩透析したのち、同
じＰＢＳで平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに流速
０．３〜０．５ｍｌ／分で通し、２８０ｎｍの吸収を示
す分画を捕集する。この分画を０．１モルＰＢＳ（ｐＨ
７．０）に対して透析し、セントリコン−３０（アミコ
ン社製）で濃縮したのち、前記した濃度１００ｇ／ｌの
アジ化ナトリウム溶液を１００分の１容の割合で添加し
て、４℃において保存する。このようにして得たｐｆＮ
末端ペプチド抗体ＩｇＧについて、２８０ｎｍの吸光度
からタンパク量（ＩｇＧ分子量１５０，０００として）
を算出すると、２．６ｍｇ／ｍｌであった。
【００３６】次にこのようにして得たｐｆＮ末端ペプチ
ド抗体ＩｇＧのヒトプロレニンに対する結合能力を以下
のようにして測定する。すなわち、参考例１で得たγ‐
ヒトプロレニン原液（２００μｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時
間）を、０．０５モル炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で、濃
度が１μｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間になるように希釈
し、この希釈液を免疫測定用マイクロプレート（ヌンク
社製、ポリソープ９６穴）の各穴に分注し、４℃で１６
時間以上静置したのち、この希釈液を捨てる。次いで、
この穴に１％カゼインを含むＰＢＳ生理食塩水（ｐＨ
７．４）２００μｌを加え、４℃において１６時間以上
静置し、プロレニン固定化マイクロプレートを作製し、
４℃に保存する。
ド抗体ＩｇＧのヒトプロレニンに対する結合能力を以下
のようにして測定する。すなわち、参考例１で得たγ‐
ヒトプロレニン原液（２００μｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時
間）を、０．０５モル炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で、濃
度が１μｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間になるように希釈
し、この希釈液を免疫測定用マイクロプレート（ヌンク
社製、ポリソープ９６穴）の各穴に分注し、４℃で１６
時間以上静置したのち、この希釈液を捨てる。次いで、
この穴に１％カゼインを含むＰＢＳ生理食塩水（ｐＨ
７．４）２００μｌを加え、４℃において１６時間以上
静置し、プロレニン固定化マイクロプレートを作製し、
４℃に保存する。
【００３７】次に、前記のｐｆＮ末端ペプチド抗体Ｉｇ
Ｇを、０．１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含むＰＢＳ生理食塩水（ｐＨ７．２）で１０〜１０9倍
に希釈した各段階希釈液１００μｌを、このプロレニン
固定化マイクロプレートの各穴に注入し、室温で２時間
反応させたのち、ペルオキシダーゼ標識プロテインＡ
（ザイム・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド製）
を、０．１％ＢＳＡ、０．１モルＮａＣｌ及び０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４０００倍に希釈した
液１００μｌを加えて、さらに室温で２時間反応させ
る。反応終了後この液を捨て、プレートを、洗浄用緩衝
液３００μｌで５回洗浄する。
Ｇを、０．１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含むＰＢＳ生理食塩水（ｐＨ７．２）で１０〜１０9倍
に希釈した各段階希釈液１００μｌを、このプロレニン
固定化マイクロプレートの各穴に注入し、室温で２時間
反応させたのち、ペルオキシダーゼ標識プロテインＡ
（ザイム・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド製）
を、０．１％ＢＳＡ、０．１モルＮａＣｌ及び０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４０００倍に希釈した
液１００μｌを加えて、さらに室温で２時間反応させ
る。反応終了後この液を捨て、プレートを、洗浄用緩衝
液３００μｌで５回洗浄する。
【００３８】次いで、各穴に発色試薬１５０μｌを加
え、３７℃で５分間静置したのち、さらに０．０３％過
酸化水素水５０μｌを加え、３７℃において３０分間反
応させる。
え、３７℃で５分間静置したのち、さらに０．０３％過
酸化水素水５０μｌを加え、３７℃において３０分間反
応させる。
【００３９】最後に２モル硫酸１００μｌを加えて反応
を停止させたのち、マイクロプレート・リーダー（モレ
キュラー・デバイス社製）を用いてＯＤ４５０ｎｍの吸
光度を測定する。その結果をグラフとして図１に示す。
この図から明らかなようにｐｆＮ末端ペプチド抗体Ｉｇ
Ｇは、ヒトプロレニンと高い親和性を示す。
を停止させたのち、マイクロプレート・リーダー（モレ
キュラー・デバイス社製）を用いてＯＤ４５０ｎｍの吸
光度を測定する。その結果をグラフとして図１に示す。
この図から明らかなようにｐｆＮ末端ペプチド抗体Ｉｇ
Ｇは、ヒトプロレニンと高い親和性を示す。
【００４０】次にｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧの特異
性を調べるために、以下の阻害試験を行う。前記の抗原
調製に用いたｐｆＮ末端合成ペプチド１ｍｇを、ＢＳ
Ａ、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ生理食塩水１ｍｌに溶
解し、同じＰＢＳ生理食塩水で１０〜１０7倍に希釈し
て希釈系列液を調製する。次いでこの各希釈系列液５０
０μｌにｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧ１０μｌを加
え、各液から１００μｌずつをとってプロレニン固定化
マイクロプレートの各穴に注入し、室温で２時間反応さ
せる。
性を調べるために、以下の阻害試験を行う。前記の抗原
調製に用いたｐｆＮ末端合成ペプチド１ｍｇを、ＢＳ
Ａ、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ生理食塩水１ｍｌに溶
解し、同じＰＢＳ生理食塩水で１０〜１０7倍に希釈し
て希釈系列液を調製する。次いでこの各希釈系列液５０
０μｌにｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧ１０μｌを加
え、各液から１００μｌずつをとってプロレニン固定化
マイクロプレートの各穴に注入し、室温で２時間反応さ
せる。
【００４１】反応終了後、洗浄用緩衝液３００μｌで５
回洗浄し、次いでペルオキシダーゼ標識プロテインＡ液
１００μｌを加えて抗体価測定と同様にしてＯＤ４５０
ｎｍの吸光度を測定する。その結果をグラフとして図２
に示す。この図から、ｐｆＮ末端ペプチド抗体とヒトプ
ロレニンとの抗原抗体反応は、抗原であるｐｆＮ末端合
成ペプチドにより完全に阻害されることすなわちｐｆＮ
末端ペプチド抗体は抗原特異性を有することが分る。
回洗浄し、次いでペルオキシダーゼ標識プロテインＡ液
１００μｌを加えて抗体価測定と同様にしてＯＤ４５０
ｎｍの吸光度を測定する。その結果をグラフとして図２
に示す。この図から、ｐｆＮ末端ペプチド抗体とヒトプ
ロレニンとの抗原抗体反応は、抗原であるｐｆＮ末端合
成ペプチドにより完全に阻害されることすなわちｐｆＮ
末端ペプチド抗体は抗原特異性を有することが分る。
【００４２】実施例２ 参考例１で得たＣＨＯ培養上清を０．１％ＢＳＡを含む
ＰＢＳ生理食塩水（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈した液
２００μｌに、ｐｆＮ末端ペプチド抗血清を０．１％Ｂ
ＳＡを含むＰＢＳ生理食塩水（ｐＨ７．６）で１０〜１
０6倍に希釈した抗血清液各４０μｌを加え、４℃にお
いて１６時間反応させる。次いで、この反応液のそれぞ
れ５０μｌに、アンジオテンシノーゲン試薬１５０μｌ
を加え、３７℃において３０分間反応させる。
ＰＢＳ生理食塩水（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈した液
２００μｌに、ｐｆＮ末端ペプチド抗血清を０．１％Ｂ
ＳＡを含むＰＢＳ生理食塩水（ｐＨ７．６）で１０〜１
０6倍に希釈した抗血清液各４０μｌを加え、４℃にお
いて１６時間反応させる。次いで、この反応液のそれぞ
れ５０μｌに、アンジオテンシノーゲン試薬１５０μｌ
を加え、３７℃において３０分間反応させる。
【００４３】次に、前記の反応液１００μｌを参考例４
で得たＡｎｇＩ抗体固定化マイクロプレートに分取し、
これに参考例２で得た酵素標識ＡｎｇＩ１００μｌを加
え、４℃で２時間反応させる。反応終了後、洗浄用緩衝
液３００μｌで３回洗浄したのち、発色試薬１５０μｌ
を加えて、３７℃で５分間静置し、さらに０．０３％過
酸化水素水５０μｌを加え、３７℃で３０分間反応させ
て発色させる。
で得たＡｎｇＩ抗体固定化マイクロプレートに分取し、
これに参考例２で得た酵素標識ＡｎｇＩ１００μｌを加
え、４℃で２時間反応させる。反応終了後、洗浄用緩衝
液３００μｌで３回洗浄したのち、発色試薬１５０μｌ
を加えて、３７℃で５分間静置し、さらに０．０３％過
酸化水素水５０μｌを加え、３７℃で３０分間反応させ
て発色させる。
【００４４】最後に２モル硫酸１００μｌを加えて反応
を停止させ、マイクロプレート・リーダーを用いてＯＤ
４５０ｎｍの吸光度を測定する。別途、参考例１で得た
ＣＨＯ培養上清希釈液２００μｌにウシ膵臓由来トリプ
シン（シグマ社製）１ｍｇを１ミリモル塩酸１ｍｌに溶
解した液５μｌを加え、２５℃において１０分間反応さ
せたのち、大豆由来トリプシン阻害剤（シグマ社製）２
ｍｇを０．２モルＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍｌに溶解し
た液５μｌを加えてトリプシンの酵素反応を停止させる
ことにより、ヒトプロレニンを完熟型レニンに変換させ
ておく。
を停止させ、マイクロプレート・リーダーを用いてＯＤ
４５０ｎｍの吸光度を測定する。別途、参考例１で得た
ＣＨＯ培養上清希釈液２００μｌにウシ膵臓由来トリプ
シン（シグマ社製）１ｍｇを１ミリモル塩酸１ｍｌに溶
解した液５μｌを加え、２５℃において１０分間反応さ
せたのち、大豆由来トリプシン阻害剤（シグマ社製）２
ｍｇを０．２モルＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍｌに溶解し
た液５μｌを加えてトリプシンの酵素反応を停止させる
ことにより、ヒトプロレニンを完熟型レニンに変換させ
ておく。
【００４５】次にこの反応液１００μｌをＡｎｇＩ抗体
固定化マイクロプレートに分注し、前記した方法により
ＡｎｇＩ測定を行う。このようにして得た結果を、ヒト
プロレニンのトリプシンによる活性化能（ＡｎｇＩ産生
量）を１００％としたときのｐｆＮ末端ペプチド抗体に
よる相対的活性化率として図３に示す。この図から明ら
かなように、ｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧとヒトプロ
レニンとの結合体における活性化能は用量依存性を示
す。
固定化マイクロプレートに分注し、前記した方法により
ＡｎｇＩ測定を行う。このようにして得た結果を、ヒト
プロレニンのトリプシンによる活性化能（ＡｎｇＩ産生
量）を１００％としたときのｐｆＮ末端ペプチド抗体に
よる相対的活性化率として図３に示す。この図から明ら
かなように、ｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧとヒトプロ
レニンとの結合体における活性化能は用量依存性を示
す。
【００４６】実施例３ γ‐ヒトプロレニン希釈液（８００ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍ
ｌ・時間）２μｌに、実施例１で得たｐｆＮ末端ペプチ
ド抗体ＩｇＧ ２００μｌを加え、さらに５ミリモルＥ
ＤＴＡを含むＰＢＳ生理食塩水を加えて、総量５００μ
ｌにしたものを４℃において２４時間反応させることに
よりヒトプロレニンとｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧと
の結合体を生成させる。
ｌ・時間）２μｌに、実施例１で得たｐｆＮ末端ペプチ
ド抗体ＩｇＧ ２００μｌを加え、さらに５ミリモルＥ
ＤＴＡを含むＰＢＳ生理食塩水を加えて、総量５００μ
ｌにしたものを４℃において２４時間反応させることに
よりヒトプロレニンとｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧと
の結合体を生成させる。
【００４７】この反応液１００μｌをゲルろ過高速液体
クロマトグラフィー（東ソー株式会社製、商品記号ＴＳ
Ｋ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＸＬ）に通し、５ミリモルＥ
ＤＴＡを含むＰＢＳ生理食塩水を展開液とし、０．６ｍ
ｌ／分の速度で展開し、溶出液を０．３ｍｌごとに分取
する。
クロマトグラフィー（東ソー株式会社製、商品記号ＴＳ
Ｋ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＸＬ）に通し、５ミリモルＥ
ＤＴＡを含むＰＢＳ生理食塩水を展開液とし、０．６ｍ
ｌ／分の速度で展開し、溶出液を０．３ｍｌごとに分取
する。
【００４８】各フラクション５０μｌにレニン基質とし
てアンジオテンシノーゲン試薬５０μｌを加え、３７℃
において１５分間反応させてＡｎｇＩを産生させたの
ち、直ちに氷上に移し、０．１％ＢＳＡ、０．１モルＮ
ａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ１５
０μｌを加えて総量を２５０μｌとする。
てアンジオテンシノーゲン試薬５０μｌを加え、３７℃
において１５分間反応させてＡｎｇＩを産生させたの
ち、直ちに氷上に移し、０．１％ＢＳＡ、０．１モルＮ
ａＣｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ１５
０μｌを加えて総量を２５０μｌとする。
【００４９】次いで、この反応液１００μｌずつをＡｎ
ｇＩ抗体固定化プレートの各穴に分注し、これに参考例
２で得た酵素標識ＡｎｇＩ液１００μｌずつを加え、４
℃で２時間反応させたのち、プレートを洗浄用緩衝液３
００μｌで３回洗浄する。次に、この反応生成物に発色
試薬１５０μｌを加え、２５℃で５分間静置したのち、
０．０３％過酸化水素水５０μｌを加え、２５℃におい
て３０分間反応させる。
ｇＩ抗体固定化プレートの各穴に分注し、これに参考例
２で得た酵素標識ＡｎｇＩ液１００μｌずつを加え、４
℃で２時間反応させたのち、プレートを洗浄用緩衝液３
００μｌで３回洗浄する。次に、この反応生成物に発色
試薬１５０μｌを加え、２５℃で５分間静置したのち、
０．０３％過酸化水素水５０μｌを加え、２５℃におい
て３０分間反応させる。
【００５０】最後に２モル硫酸１００μｌを加えて反応
を停止させ、マイクロプレート・リーダーを用いてＯＤ
４５０ｎｍの吸光度を測定する。この結果を図４に実線
グラフとして示す。このグラフから明らかなように、溶
出時間１２〜１２．５分のフラクションにおいて、大部
分のレニン活性（ＡｎｇＩ産生能）が認められる。
を停止させ、マイクロプレート・リーダーを用いてＯＤ
４５０ｎｍの吸光度を測定する。この結果を図４に実線
グラフとして示す。このグラフから明らかなように、溶
出時間１２〜１２．５分のフラクションにおいて、大部
分のレニン活性（ＡｎｇＩ産生能）が認められる。
【００５１】対照としてγ‐ヒトプロレニン希釈液（８
００ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間）１００μｌにおい
て、同じ条件でゲルろ過を行い、各分取液から１００μ
ｌを分取し、ｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧの結合実験
の場合と同様にして処理し、ペルオキシダーゼ標識プロ
テインＡ、発色試薬及び０．０３％過酸化水素水を加え
て反応させたのち、マイクロプレート・リーダーを用い
てＯＤ４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を、図
４に破線グラフで示す。このグラフから明らかなよう
に、免疫測定法によるプロレニンを示すフラクション
は、ほとんど１６．５〜１７分の間に溶出した。
００ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間）１００μｌにおい
て、同じ条件でゲルろ過を行い、各分取液から１００μ
ｌを分取し、ｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧの結合実験
の場合と同様にして処理し、ペルオキシダーゼ標識プロ
テインＡ、発色試薬及び０．０３％過酸化水素水を加え
て反応させたのち、マイクロプレート・リーダーを用い
てＯＤ４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を、図
４に破線グラフで示す。このグラフから明らかなよう
に、免疫測定法によるプロレニンを示すフラクション
は、ほとんど１６．５〜１７分の間に溶出した。
【００５２】さらに、溶出時間と分子量の関係を調べる
ために、分子量マーカー（サーバ社製）を同じ条件でゲ
ルろ過したところ、図５に示されるように、プロレニン
は卵白アルブミン（分子量４５ＫＤ）よりやや大きい約
４３〜５０ＫＤの分子量であること及びプロレニンとｐ
ｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧ（分子量１５０ＫＤ）との
結合体の分子量は２００〜２４０ＫＤであることが分っ
た。以上のことから明らかなように、プロレニンとｐｆ
Ｎ末端ペプチド抗体とは抗原抗体反応により免疫複合物
を生成すると酵素活性（レニン活性）を示し、レニン基
質（アンジオテンシノーゲン）を分解してＡｎｇＩを産
生する。
ために、分子量マーカー（サーバ社製）を同じ条件でゲ
ルろ過したところ、図５に示されるように、プロレニン
は卵白アルブミン（分子量４５ＫＤ）よりやや大きい約
４３〜５０ＫＤの分子量であること及びプロレニンとｐ
ｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧ（分子量１５０ＫＤ）との
結合体の分子量は２００〜２４０ＫＤであることが分っ
た。以上のことから明らかなように、プロレニンとｐｆ
Ｎ末端ペプチド抗体とは抗原抗体反応により免疫複合物
を生成すると酵素活性（レニン活性）を示し、レニン基
質（アンジオテンシノーゲン）を分解してＡｎｇＩを産
生する。
【００５３】実施例４ プロレニン液（２００ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間）を
希釈用ヒト血清で等倍希釈系列を作製し、各希釈液から
１００μｌずつを分取し、２組の試料を準備する。次
に、２組の中の一方について、公知のトリプシン活性化
法により、ＡｎｇＩ産生量を算出し、他方について実施
例３で得たヒトプロレニンとｐｆＮ末端ペプチド抗体と
の結合体を用いて、ＡｎｇＩ産出量を算出する。図６は
このようにして得た両者の算出値の相関グラフである
が、これから分るように両者の間には、良好な相関性
（γ2＝０．９７２）が認められる。
希釈用ヒト血清で等倍希釈系列を作製し、各希釈液から
１００μｌずつを分取し、２組の試料を準備する。次
に、２組の中の一方について、公知のトリプシン活性化
法により、ＡｎｇＩ産生量を算出し、他方について実施
例３で得たヒトプロレニンとｐｆＮ末端ペプチド抗体と
の結合体を用いて、ＡｎｇＩ産出量を算出する。図６は
このようにして得た両者の算出値の相関グラフである
が、これから分るように両者の間には、良好な相関性
（γ2＝０．９７２）が認められる。
【００５４】次に、ヒトプロレニン液（４００ｎｇ Ａ
ｎｇＩ／ｍｌ・時間）を希釈用ヒト血清で等倍希釈系列
を作製し、各希釈液より１００μｌずつを分取して前記
の結合体を用いてＡｎｇＩ産生量を測定した。図７は、
プロレニン濃度とＡｎｇＩ産生量との関係を示すグラフ
であるが、これから明らかなように、ヒトプロレニン量
１２．５〜４００ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間の範囲で
両者は直線性を示す。
ｎｇＩ／ｍｌ・時間）を希釈用ヒト血清で等倍希釈系列
を作製し、各希釈液より１００μｌずつを分取して前記
の結合体を用いてＡｎｇＩ産生量を測定した。図７は、
プロレニン濃度とＡｎｇＩ産生量との関係を示すグラフ
であるが、これから明らかなように、ヒトプロレニン量
１２．５〜４００ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間の範囲で
両者は直線性を示す。
【００５５】また、希釈用ヒト血清により、（Ａ）高濃
度（５０３．２ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間）、（Ｂ）
中濃度（１６０．４ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間）及び
（Ｃ）低濃度（７０．６ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間）
の３種の濃度のヒトプロレニン液について等倍希釈系列
を作製し、各希釈液より１００μｌずつを分取して、こ
れらのそれぞれを前記の結合体を用いて酵素活性を測定
した。図８は、このようにして得た結果を示すグラフで
あるが、これから明らかなように各希釈曲線はいずれも
原点を通る直線性を示した。
度（５０３．２ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間）、（Ｂ）
中濃度（１６０．４ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間）及び
（Ｃ）低濃度（７０．６ｎｇ ＡｎｇＩ／ｍｌ・時間）
の３種の濃度のヒトプロレニン液について等倍希釈系列
を作製し、各希釈液より１００μｌずつを分取して、こ
れらのそれぞれを前記の結合体を用いて酵素活性を測定
した。図８は、このようにして得た結果を示すグラフで
あるが、これから明らかなように各希釈曲線はいずれも
原点を通る直線性を示した。
【００５６】試験例 実施例３で得たヒトプロレニンとｐｆＮ末端ペプチド抗
体との結合体を用いて、年令２０〜４０歳の健常成人男
子５名の血清中のプロレニン値を、実施例４と同様にし
て測定した。同時に同じ血清について従来のトリプシン
活性化法を用いて測定した。これらの測定値を表１に示
す。
体との結合体を用いて、年令２０〜４０歳の健常成人男
子５名の血清中のプロレニン値を、実施例４と同様にし
て測定した。同時に同じ血清について従来のトリプシン
活性化法を用いて測定した。これらの測定値を表１に示
す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【発明の効果】これまで作製に成功していなかった新規
ｐｆＮ末端ペプチド抗体を用いることにより、正確かつ
簡単に血清中のヒトプロレニン量を測定することができ
る。
ｐｆＮ末端ペプチド抗体を用いることにより、正確かつ
簡単に血清中のヒトプロレニン量を測定することができ
る。
【図１】 ヒトプロレニンとｐｆＮ末端ペプチド抗体Ｉ
ｇＧとを反応させたときのＩｇＧ濃度とヒトプロレニン
量との関係を示すグラフ。
ｇＧとを反応させたときのＩｇＧ濃度とヒトプロレニン
量との関係を示すグラフ。
【図２】 ヒトプロレニンｐｆＮ末端ペプチド抗体Ｉｇ
Ｇとの反応におけるｐｆＮ末端合成ペプチドの阻害作用
を示すグラフ。
Ｇとの反応におけるｐｆＮ末端合成ペプチドの阻害作用
を示すグラフ。
【図３】 ｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧとヒトプロレ
ニンとの結合体の活性化能の用量依存性を示すグラフ。
ニンとの結合体の活性化能の用量依存性を示すグラフ。
【図４】 ｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧのプロレニン
結合能とゲルろ過クロマトグラフィー溶出フラクション
との関係を示すグラフ。
結合能とゲルろ過クロマトグラフィー溶出フラクション
との関係を示すグラフ。
【図５】 プロレニンとｐｆＮ末端ペプチド抗体ＩｇＧ
との結合体の分子量を推定するための対比グラフ。
との結合体の分子量を推定するための対比グラフ。
【図６】 トリプシン活性化法と本願発明試薬を用いた
方法との相関性を示すグラフ。
方法との相関性を示すグラフ。
【図７】 プロレニン濃度とＡｎｇＩ産生量との関係を
示すグラフ。
示すグラフ。
【図８】 濃度の異なる３種のヒトプロレニンに対する
本発明試薬の酵素活性を示すグラフ。
本発明試薬の酵素活性を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石田 雄一 埼玉県北葛飾郡鷲宮町東大輪1947 ウエ ストハイツ ８−205 (72)発明者 羽田野 泰彦 北海道札幌市豊平区平岸４条11−４−11 −106 (56)参考文献 特開 平８−285852（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−87200（ＪＰ，Ａ) Ｙ．ＩＳＨＩＺＵＫＡ，Ｃｈａｒａｃ ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏ ｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｓｔ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｒｅ ｎｉｎ ｐｒｏｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ．，日本，Ｔｈｅ Ｊａ ｐａｎｅｓｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，1989年 ９月 ７ 日，Ｖｏｌ．106，Ｎｏ．３，ｐ．430− 435 Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｒｅｇｉｏｎ− ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕ ｎｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏ ｒ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｒｅｎｉｎ ａ ｎｄ Ｒｅｎｉｎ ｗｉｔｈ Ｕｓｅ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉ ｄｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓ. （1995），日本，Ｖｏｌ．16，Ｎｏ. ６，ｐ．363−370 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 19/00 C07K 14/47 C07K 16/00 - 16/46 C12N 9/48 - 9/76 G01N 33/573 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】 ヒトプロレニンプロフラグメントのＮ末
端ペプチド中１番目のロイシンから１５番目のアルギニ
ンまでのアミノ酸配列を認識し得る抗ヒトプロレニンプ
ロフラグメントペプチド抗体。 - 【請求項２】 ヒトプロレニンプロフラグメントのＮ末
端ペプチド中１番目のロイシンから１５番目のアルギニ
ンまでのアミノ酸配列のうち少なくとも抗原決定基を含
むアミノ酸配列を特異的に認識し得る抗ヒトプロレニン
プロフラグメントペプチド抗体。 - 【請求項３】 ヒトプロレニンプロフラグメントのＮ末
端ペプチド中少なくとも１番目のロイシンから１５番目
のアルギニンまでのアミノ酸単位を含むペプチドに結合
することによりヒトプロレニンを活性化し得る抗ヒトプ
ロレニンプロフラグメントペプチド抗体。 - 【請求項４】 ヒトプロレニンプロフラグメントのＮ末
端ペプチド中１番目のロイシンから１５番目のアルギニ
ンまでのアミノ酸配列に結合することによりヒトプロレ
ニンを活性化し得る抗ヒトプロレニンプロフラグメント
ペプチド抗体。 - 【請求項５】 ヒトプロレニンプロフラグメントのＮ末
端ペプチド中１番目のロイシンから１５番目のアルギニ
ンまでのアミノ酸配列のうち少なくとも抗原決定基を含
むアミノ酸配列に結合することによりヒトプロレニンを
活性化し得る抗ヒトプロレニンプロフラグメントペプチ
ド抗体。 - 【請求項６】 請求項１から５のいずれか１項に記載の
抗体とヒトプロレニンとの結合体からなるレニン活性物
質。 - 【請求項７】 請求項１から５のいずれか１項に記載の
抗体を活性化成分とすることを特徴とするプロレニン測
定試薬。 - 【請求項８】 請求項６に記載のレニン活性物質を活性
成分とすることを特徴とする測定試薬。 - 【請求項９】 ヒトプロレニンに、請求項１から５のい
ずれか１項に記載の抗体を結合させることによりヒトプ
ロレニンを活性化することを特徴とするヒトプロレニン
の測定方法。
Priority Applications (18)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08853897A JP3271157B2 (ja) | 1997-04-07 | 1997-04-07 | 新規な抗体、それを含むレニン活性物質及びそれを用いたプロレニン測定試薬 |
| DE69800080T DE69800080T2 (de) | 1997-04-07 | 1998-03-31 | Antikörper gegen das Prorenin Profragment, reninaktive Substanz die diese enthält und Prorenintest die diese verwendet |
| ES98302495T ES2144328T3 (es) | 1997-04-07 | 1998-03-31 | Anticuerpo contra el profragmento de prorrenina, substancia con actividad de renina que contiene el mismo y ensayo de prorrenina que utiliza el mismo. |
| AT98302495T ATE189897T1 (de) | 1997-04-07 | 1998-03-31 | Antikörper gegen das prorenin profragment, reninaktive substanz die diese enthält und prorenintest die diese verwendet |
| EP98302495A EP0873999B1 (en) | 1997-04-07 | 1998-03-31 | Antibody to the prorenin profragment, renin-active substance containing the same and prorenin assay reagent using the same |
| AU59715/98A AU732018B2 (en) | 1997-04-07 | 1998-03-31 | Novel antibody, renin-active substance containing the same and prorenin assay reagent using the same |
| CNB981061222A CN1194017C (zh) | 1997-04-07 | 1998-04-01 | 新抗体,含有该抗体的肾素－活性物质和使用该抗体的前肾素检测试剂 |
| BR9801000-0A BR9801000A (pt) | 1997-04-07 | 1998-04-02 | Anticorpo, substância renina-ativa contendo o mesmo e reagente para ensaio de pro-renina usando o mesmo. |
| TW087105089A TW381179B (en) | 1997-04-07 | 1998-04-03 | Novel antibody, renin-active substance containing the same and prorenin assay reagent using the same |
| HU9800782A HUP9800782A3 (en) | 1997-04-07 | 1998-04-03 | Novel antibody, renin-active substance containing the same and prorenin assay reagent using the same |
| US09/054,260 US5945512A (en) | 1997-04-07 | 1998-04-03 | Prorenin antibody and renin-active substance containing the same |
| IDP980518A ID20535A (id) | 1997-04-07 | 1998-04-06 | Antibodi baru, substansi aktif-renin yang mengandung antibodi tersebut dan reagen penentuan kadar prorenin yang menggunakan antibodi tersebut |
| KR10-1998-0012023A KR100457445B1 (ko) | 1997-04-07 | 1998-04-06 | 신규한 항체, 이것을 함유하는 레닌활성물질 및 이것을 이용한 프로레닌 측정방법 |
| RU98106859/13A RU2198894C2 (ru) | 1997-04-07 | 1998-04-06 | Новое антитело, соединение с активностью ренина, содержащее новое антитело, и способ определения проренина с использованием нового антитела |
| CA002234204A CA2234204C (en) | 1997-04-07 | 1998-04-06 | Novel antibody, renin-active substance containing the same and prorenin assay reagent using the same |
| CZ981036A CZ103698A3 (cs) | 1997-04-07 | 1998-04-06 | Nová protilátka, renin-aktivní substance tuto protilátku obsahující, a použití této protilátky jako reakčního činidla k testování proreninu |
| ARP980101580A AR011214A1 (es) | 1997-04-07 | 1998-04-07 | Nuevo anticuerpo, sustancia activa de renina que contiene al mismo y reactivo de analisis de prorenina que utiliza el mismo antecedente de lainvencion |
| PL98325735A PL325735A1 (en) | 1997-04-07 | 1998-04-07 | Novel antibody, substance of resin-activity and a prorenin test reagent containing such antibody |
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|---|---|---|---|
| JP08853897A JP3271157B2 (ja) | 1997-04-07 | 1997-04-07 | 新規な抗体、それを含むレニン活性物質及びそれを用いたプロレニン測定試薬 |
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|---|---|
| JPH10279600A JPH10279600A (ja) | 1998-10-20 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08853897A Expired - Fee Related JP3271157B2 (ja) | 1997-04-07 | 1997-04-07 | 新規な抗体、それを含むレニン活性物質及びそれを用いたプロレニン測定試薬 |
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|---|---|
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| JP (1) | JP3271157B2 (ja) |
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| CN (1) | CN1194017C (ja) |
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| AU (1) | AU732018B2 (ja) |
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| CA (1) | CA2234204C (ja) |
| CZ (1) | CZ103698A3 (ja) |
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| Ｙ．ＩＳＨＩＺＵＫＡ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｓｔ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｒｅｎｉｎ ｐｒｏｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，日本，Ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９８９年 ９月 ７日，Ｖｏｌ．１０６，Ｎｏ．３，ｐ．４３０−４３５ |
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