CN116380882A - 一种肾素磁微粒化学发光检测试剂盒、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种肾素磁微粒化学发光检测试剂盒、制备方法及应用,本发明试剂盒包含一种对肾素和活性位点开放的肾素原具有较高的反应活性,而对活性位点关闭的肾素原无反应活性的抗肾素活性位点抗体,极大提高了对“活性肾素”的检测特异性,同时本发明试剂盒对肾素和活性位点开放的肾素原还具有较高的检测灵敏度、准确度、精密度,以及较低的检测限。
Description
技术领域
本发明属于磁微粒化学发光检测试剂盒技术领域,具体涉及一种肾素磁微粒化学发光检测试剂盒、制备方法及应用。
背景技术
肾素(Renin),也被称为血管紧张素原酶,是肾小球旁器(也称球旁复合体)的球旁颗粒细胞释放的一种蛋白水解酶,能催化血管紧张素原转化为血管紧张素I,是肾素-血管紧张素-醛固酮***的组成部分。正常人体内肾素的含量较低,主要以肾素原的形式存在,肾素原包括有活性的肾素原和无活性的肾素原,其中有活性的肾素原含量仅为无活性的肾素原含量的十分之一。肾素原较肾素多66个氨基酸,正常生理条件下,肾素原的活性结合位点处于关闭状态,不具有催化能力。当动脉血压降低、循环减少、交感神经兴奋时,肾素原在内肽酶的作用下被激活为开放的肾素原或肾素,两者活性位点均被打开,具有生理活性。肾素分泌后经肾静脉进入血液,能催化肝脏分泌进入血浆中的血管紧张素原转变成血管紧张素I,血管紧张素I形成几秒钟之内,被血液和肺组织中的血管紧张素转换酶降解,生成血管紧张素II,血管紧张素II刺激肾上腺皮质球状带分泌的醛固酮的量增加、增加肾小管对NaCl和水的重吸收。血管紧张素II还可被氨基肽酶水解为血管紧张素III。这三种血管紧张素均有生物活性,其中血管紧张素II、III的生物活性较强,而后者在血浆中的浓度较低,故以血管紧张素II的生物活性最强。血管紧张素原和转换酶等经常存在于血浆中,而“活性肾素”(本文指代肾素和活性位点开放的肾素原,下同)的释放是决定血浆中血管紧张素浓度的关键性条件,其对调节人体血压及钾钠离子的代谢和肾脏的正常生理功能具有重要的作用。
肾素作为原发性醛固酮增多症最常用筛查指标之一,已广泛应用于临床,特别是门诊开展肾素含量的测定可以很大程度上提高该病检出率使部分患者得到早期诊断和治疗。
现有市面上针对肾素的检测方法主要为两种,分别为肾素活性和肾素浓度,肾素活性检测为传统方法,其原理为通过测定单位时间单位体积内血管紧张素原转变为血管紧张素I的数量从而间接测定血浆中的活性肾素水平,其会受血管紧张素原浓度、样品预处理、培养时间、pH值或其他因素的影响,从而导致不同的操作人员、不同厂商的检测试剂之间的检测结果差异很大。肾素浓度的检测为近年来新建立起来的检测肾素含量的方法,该方法不受血管紧张素原浓度的影响,操作简便,检测速度快,能实现高通量检测,稳定性和重复性好,易于标准化。
肾素浓度的检测是采用抗原抗体之间的特异性反应原理,常见的检测方法有酶联免疫吸附法、放射免疫分析法和化学免疫分析发光法。但考虑到肾素在人体内的含量极低,目前临床上使用的肾素检测试剂盒普遍存在灵敏度偏低,低值样本之间肾素含量检测无区分,同时受限于针对“活性肾素”特异性抗体的开发难度,绝大部分肾素检测试剂中用到的抗体大多是针对总肾素(包含肾素及活性位点开放肾素原和活性位点关闭肾素原)的抗体,而非针对肾素和活性位点开放肾素原的抗体。而在人体内无活性肾素原的含量远高于肾素和有活性的肾素原,且无活性肾素原对肾脏功能评价及相关疾病的鉴别诊断并无帮助作用,因此如采用针对总肾素的抗体进行检测,会导致对“活性肾素”的检测造成干扰,从而影响肾素测定结果在临床应用上的准确性。截止目前市场上缺乏灵敏度高、能够准确检测“活性肾素”的肾素检测试剂,尤其是低值样本测试结果稳定且精密度高的全自动化检验试剂。
肾素能够调节人体血压及钾钠离子的代谢和维持肾脏的正常生理功能,同时也在原发性醛固酮增多症、肾脏功能评价等疾病的预防监控和治疗方面存在着巨大的应用潜力。为了克服现有检测技术中存在的固有缺陷,建立一种灵敏度满足要求、能够对“活性肾素”进行精确检测且能实现大批量检测肾素的方法学是非常有必要的。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明目的在于提供一种肾素磁微粒化学发光检测试剂盒、制备方法及应用,本发明试剂盒能够特异性检测“活性肾素”即肾素和活性位点打开的肾素原,且具有较高的检测灵敏度、准确度、精密度和较低的检测限。
基于上述目的,本发明采用的技术方案如下:
第一方面,本发明提供一种抗肾素活性位点抗体,所述抗肾素活性位点抗体特异性识别肾素和活性位点开放的肾素原,所述抗肾素活性位点抗体特异性识别肾素分子氨基酸序列中的第25位至第50位氨基酸序列和活性位点开放的肾素原分子氨基酸序列中第91位至116位氨基酸序列。
优选地,所述抗肾素活性位点抗体的氨基酸序列为:GIGTPPQTFKVVFDTGSSNVWVPSSK(SEQ ID NO.1)。
本发明提供的抗肾素活性位点抗体能够与“活性肾素”即肾素和活性位点开放的肾素原特异性结合,并不与无活性的肾素原及活性位点关闭的肾素原结合,对“活性肾素”具有较高的识别特异性。
第二方面,本发明提供上述抗肾素活性位点抗体在肾素和活性位点开放的肾素原检测中的应用。
第三方面,本发明提供一种肾素磁微粒化学发光检测试剂盒,所述肾素磁微粒化学发光检测试剂盒用于肾素和活性位点开放的肾素原的检测,所述试剂盒包括生物素标记的上述抗肾素活性位点抗体。
本发明试剂盒利用抗肾素活性位点抗体能够特异性结合肾素和活性位点开放的肾素原,而不与无活性的肾素原及活性位点封闭的肾素原相结合,极大提高了试剂盒对“活性肾素”的检测特异性。
优选地,所述试剂盒还包括链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物、抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子、酶促发光底物和样本裂解液。
本发明试剂盒的检测原理为:利用样本裂解液将待测样本中的肾素抗原进行裂解,使其抗原位点充分暴露,样本中的肾素抗原与包被在磁微粒子上的抗肾素单克隆抗体反应形成磁微粒-肾素单克隆抗体-肾素抗原的复合物,磁微粒-肾素单克隆抗体-肾素抗原的复合物与生物素标记的抗肾素活性位点抗体反应,形成磁微粒-肾素单克隆抗体-肾素抗原-肾素活性位点抗体-生物素的复合物,该复合物与链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物反应,形成磁微粒-肾素单克隆抗体-肾素抗原-肾素活性位点抗体-生物素-链霉亲和素-碱性磷酸酶的复合物,检测该复合物的RLU值,并基于肾素浓度与RLU值的标准曲线,计算得到待测样本中“活性肾素”的浓度。
同时本发明试剂盒基于一个链霉亲和素分子结合四个生物素分子的原理实现多个磁微粒-抗体-抗原-抗体-生物素-链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物结构在一定空间范围内的复合交联,从而达到信号值循环放大的目的,进而提高了本发明试剂盒的检测灵敏度。
优选地,酶促发光底物为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷(简称:AMPPD)。
第四方面,本发明提供一种肾素磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法,包括生物素标记的抗肾素活性位点抗体、链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物、抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子和样本裂解液的制备;
其中,生物素标记的抗肾素活性位点抗体的制备方法包括如下步骤:
(1)将生物素-N-琥珀酰亚胺基酯溶解于二甲基亚砜,配制成生物素-N琥珀酰亚胺基酯溶液;
(2)将抗肾素活性位点抗体加入生物素-N-琥珀酰亚胺基酯溶液进行反应,得到连接产物,连接产物经纯化获得生物素标记的抗肾素活性位点抗体。
优选地,抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子的制备方法包括如下步骤:
(1)将抗肾素单克隆抗体、磁珠于缓冲液混合得抗肾素单克隆抗体和磁珠混合液;
(2)向抗肾素单克隆抗体和磁珠混合液中加入(NH4)2SO4溶液进行磁珠包被抗肾素单克隆抗体反应,反应后加入封闭液对包被抗肾素单克隆抗体的磁珠进行封闭,再经清洗制得抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子。
优选地,链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物的制备方法包括如下步骤:
(1)将链霉亲和素经活化剂处理,得到活化的链霉亲和素;
(2)将碱性磷酸酶经活化剂处理,得到活化的碱性磷酸酶;
(3)将活化或未经活化的碱性磷酸酶与活化的链霉亲和素混合反应,制得链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物。
优选地,样本裂解液的制备方法包括如下步骤:
将氨基丁三醇(TRIS)、表面活性剂、吐温-20和防腐剂分散于水中制得样本裂解液。
第五方面,本发明提供上述肾素磁微粒化学发光检测试剂盒在原发性醛固酮增多症指标检测、肾脏功能评价指标检测中的应用。
肾素作为原发性醛固酮增多症最常用筛查指标之一,同时肾素还具有调节人体血压及钾钠离子的代谢和维持肾脏的正常生理功能,本发明试剂盒对肾素具有较高的检测特异性,因而在原发性醛固酮增多症指标检测、肾脏功能评价指标检测中具有较高的应用前景。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
(1)本发明请求保护一种抗肾素活性位点抗体,该抗体对“活性肾素”如肾素和活性位点开放的肾素原具有较高的反应活性,而对活性位点关闭的肾素原无反应活性。本发明试剂盒采用生物素标记的抗肾素活性位点抗体,能够特异性识别“活性肾素”,提高了对“活性肾素”的检测准确度。
(2)本发明试剂盒利用样本裂解液将待测样本中的肾素抗原进行裂解,使其抗原位点充分暴露,依次与抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子、生物素标记的抗肾素活性位点抗体、链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物反应形成磁微粒-肾素单克隆抗体-肾素抗原-肾素活性位点抗体-生物素-链霉亲和素-碱性磷酸酶的复合物,基于酶循环增益的检测方法,通过将样本与检测试剂之间进行多次循环反应以放大反应信号,提高检测灵敏度。
(3)本发明试剂盒采用特定的样本裂解液对待检血液样本进行预处理,使待检样本中肾素的抗原结构充分暴露,提升肾素抗体与肾素之间的结合效率,进一步提高试剂盒的检测灵敏度。
(4)本发明试剂盒对肾素和活性位点开放的肾素原具有较高的检测特异性,较高的检测灵敏度、准确度、精密度,以及较低的检测限。
附图说明
图1为肾素国际标准品的检测标准曲线;
图2为本发明试剂盒对天然肾素抗原/活性位点开放或被关闭后的肾素原检测能力效果的对比图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本发明提供的肾素磁微粒化学发光检测试剂盒中所用抗肾素活性位点抗体由我司自行制备,其氨基酸序列为GIGTPPQTFKVVFDTGSSNVWVPSSK(SEQ ID NO.1);其余材料或试剂均可由市场购得。其中,全自动化学发光免疫分析仪是由深圳市泰乐德医疗有限公司自行研制的VIT700全自动化学发光免疫分析仪。
实施例1
本实施例提供一种肾素磁微粒化学发光检测试剂盒,包括如下试剂:链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物、生物素标记的抗肾素活性位点抗体、抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子工作液、清洗缓冲液、酶促发光底物液和样本裂解液;上述试剂的制备方法如下:
1、链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物的制备方法
本实施例提供了链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物的两种不同的制备方法,具体如下:
(1)链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物的第一种制备方法
称取3mg链霉亲和素,室温溶解于0.6mL含有0.15%EDTA·2Na的0.1M PBS(pH=7.5)缓冲液中,溶解后的终浓度为5mg/mL,称取2mg活化剂琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(简称:SMCC)室温溶解于0.4mL二甲基亚砜中,溶解后的终浓度为5mg/mL。向上述链霉亲和素溶液中加入60μLSMCC溶液,进行活化反应,室温混匀反应60min,得到活化后的链霉亲和素;将碱性磷酸酶采用含有0.15%EDTA·2Na的0.1M PBS(pH=7.5)缓冲液稀释至5mg/ml,称取2mg活化剂Traut’s reagent室温溶解于0.4mL含有0.15%EDTA·2Na的0.1M PBS(pH=7.5)缓冲液中,溶解后的终浓度为5mg/mL,向上述碱性磷酸酶溶液中加入35μL Traut’s reagent溶液,进行活化反应,室温混匀反应60min,得到活化后的碱性磷酸酶。将上述活化后的链霉亲和素与活化后碱性磷酸酶混匀并4℃过夜反应15h,即得到链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物。采用0.05M、pH=6.0的MES缓冲液(含1%的牛血清白蛋白、0.9%的氯化钠、0.1%的吐温-20,0.05%的生物防腐剂Proclin300)将上述链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物配制成0.1~5μg/ml的工作液,置于2-8℃下保存备用。所述链霉亲和素-碱性磷酸酶工作液还可以是0.2μg/ml,或0.3μg/ml,或0.5μg/ml,或0.8μg/ml或更优选为0.4μg/ml。
(2)链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物的第二种制备方法
称取3mg链霉亲和素,室温溶解于0.30mL 0.1M MES(pH=5.0)缓冲液中,溶解后的终浓度为10mg/mL,称取3mg活化剂EDC室温溶解于0.3mL 0.1M MES(pH=5.0)中,溶解后的终浓度为10mg/mL。向上述链霉亲和素溶液中加入30μLEDC溶液,进行活化反应,室温混匀反应15min,得到活化后的链霉亲和素;将碱性磷酸酶采用0.30mL 0.1M MES(pH=5.0)缓冲液)缓冲液稀释至10mg/mL,将0.6mL碱性磷酸酶加入至活化后的链霉亲和素溶液中,室温混匀反应2h,即得到链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物。采用0.05M、pH=6.0的MES缓冲液(含1%的牛血清白蛋白、0.9%的氯化钠、0.1%的吐温-20,0.05%的生物防腐剂Proclin300)将上述链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物配制成0.2~5μg/ml的工作液,置于2-8℃下保存备用。所述链霉亲和素-碱性磷酸酶工作液还可以是0.5μg/ml,或1.0μg/ml,或2.0μg/ml,或3.0μg/ml或更优选为2.5μg/ml。
2、生物素标记的抗肾素活性位点抗体的制备方法
本发明试剂盒所用抗肾素活性位点抗体的氨基酸序列为:GIGTPPQTFKVVFDTGSSNVWVPSSK,该抗肾素活性位点抗体能够靶向识别肾素分子氨基酸序列中第25位至第50位氨基酸序列和识别活性位点开放肾素原分子氨基酸序列中第91位至第116位氨基酸序列。
取0.5mg的抗肾素活性位点抗体,采用0.2M、pH=7.4的PBS缓冲液稀释至1mg/ml。称取1mg的生物素-N-琥珀酰亚胺基酯,室温溶解于1ml的二甲基亚砜中,溶解后的终浓度为1mg/ml。向抗肾素活性位点抗体中加入5μl的10mg/ml的生物素-N-琥珀酰亚胺基酯,室温反应1h。反应完成采用Sephadex G-25凝胶层析柱纯化上述连接产物,获得的最终产物为生物素标记的抗肾素活性位点抗体。采用0.02M、pH=7.4的PBS缓冲液(含0.5%的牛血清白蛋白、0.9%的氯化钠、0.1%的吐温-20和0.05%的生物防腐剂Proclin300)将上述生物素标记的抗肾素活性位点抗体配制成0.2~3μg/ml的工作液,置于2-8℃下保存备用。所述的生物素标记的抗肾素活性位点抗体的工作液浓度还可以是0.5μg/ml,或0.8μg/ml,或2μg/ml,或更优选为1μg/ml。
3、抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子工作液的制备方法
本实施例提供了抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子工作液的两种不同的制备方法,具体如下:
(1)抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子工作液的第一种制备方法
取0.2mg的抗肾素单克隆抗体,采用0.1M、pH=9.5的硼酸盐缓冲液稀释至1mg/ml,取5mg磺基磁珠(外购)采用0.1M、pH=9.5的硼酸盐缓冲液在高磁力的磁板上清洗3次,清洗完成后采用0.1M、pH=9.5的硼酸盐缓冲液配制成20mg/ml,将两者进行混合,并加入3M的(NH4)2SO4溶液400μl,37℃混匀过夜反应18h。反应完成后采用0.2M、pH=7.4的PBS缓冲液(含2%的牛血清白蛋白、1%甘氨酸)对磁微粒子进行封闭,37℃混匀反应4h。反应完成后采用0.2M、pH=7.4的PBS缓冲液在高磁力的磁板上清洗5次,洗去未结合的其他物质,即获得了抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子。使用0.02M、pH=7.4的PBS缓冲液(含0.5%的牛血清白蛋白、0.9%的氯化钠、0.1%的吐温-20,0.05%的生物防腐剂Proclin300)将上述抗肾素单克隆抗体-磺基磁珠微粒子配制成0.1~1mg/ml的工作液,置于2-8℃下保存备用。所述的抗肾素单克隆抗体-磺基磁珠微粒子的工作液浓度还可以是0.2mg/ml,或0.3mg/ml,或0.5mg/ml,或0.8mg/ml或更优选为0.25mg/ml。
(2)抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子工作液的第二种制备方法
用0.1M、pH=7.4的PBS缓冲液将环氧基磁珠配制成40mg/ml的环氧基磁珠吸附工作液,向其中加入抗肾素单克隆抗体,并加入3M的(NH4)2SO4溶液400μl,37℃反应4h,反应完成后洗去未结合的其他物质,并采用封闭液进行37℃过夜封闭,即获得抗肾素抗体包被的环氧基磁珠,用0.1M、pH=7.4的PBS缓冲液将所述抗肾素抗体包被的环氧基磁珠配置成抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子工作液。其中,封闭液为0.05M、pH=7.4的TRIS缓冲液,所述TRIS缓冲液还含1%的牛血清白蛋白和0.1%吐温-20。
4、清洗缓冲液的制备方法
称取Na2HPO4·12H2O 14.32g、NaH2PO4·2H2O 1.56g、NaCl 9g、吐温-20 5g、表面活性剂S9 2g、防腐剂PC300 0.5g于烧杯中,加入0.8L纯化水进行混匀,调节pH至7.5,最后定容至1L,置于2-8℃下保存备用。
5、酶促发光底物液的制备方法
量取100mL的金刚烷AMPPD底物液,采用0.02M、pH=9.0的PBS缓冲液稀释10倍,用于作为酶促发光底物液,置于2-8℃下保存备用。
6、样本裂解液的制备方法
称取TRIS 6.05g、表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(简称:CTAB)5g、吐温-205g、防腐剂PC300 0.5g于烧杯中,加入0.8L纯化水进行混匀,调节pH至8.0,最后定容至1L,置于2-8℃下保存备用。
实施例2
本实施例提供一种用肾素磁微粒化学发光检测试剂盒检测样品中肾素含量的方法,具体包括如下步骤:
(1)吸取100μl的待检样品或标准品与50μl样本裂解液进行37℃反应2min,对样本中的肾素抗原进行裂解,使其抗原位点充分暴露出来;
(2)反应完成后吸取裂解后的样本至50μl的抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子工作液进行37℃反应2min,样本中的肾素抗原与包被在磁微粒上的肾素抗体进行反应,肾素抗原被结合在磁微粒上,形成磁微粒-肾素抗体-肾素抗原的复合物结构;
(3)反应完成后将上述反应物加入磁场中进行磁分离,磁分离完成后继续加入50μl生物素标记的抗肾素活性位点抗体进行37℃反应2min,形成磁微粒-肾素抗体-肾素抗原-肾素活性位点抗体-生物素的复合物结构;
(4)反应完成后将上述反应物加入磁场中进行磁分离,磁分离完成后继续加入50μl链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物进行37℃反应2min,形成磁微粒-肾素抗体-肾素抗原-肾素活性位点抗体-生物素-链霉亲和素-碱性磷酸酶的复合物结构,此为一轮反应;
(5)反应完成后加入清洗缓冲液并引入磁场并进行清洗,洗去未被磁场吸附的多余组分;
(6)清洗完成后加入酶促发光底物液反应并进行检测并获得测试结果。
如果(6)中磁微粒-肾素抗体-肾素抗原-肾素活性位点抗体-生物素-链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物的检测反应信号值或浓度值无法达到检测要求,则继续通过磁分离重复以上(2)-(4)步骤进行多轮反应后再进行(5)-(6)步骤的检测,上述多轮反应的反应次数,理论上可以进行无数次的循环,直到达到满足测试要求,一般可以是1次,或3次,或5次,或更优选为2次。
上述检测是在泰乐德医疗有限公司自行研制的VIT700全自动化学发光免疫分析仪上进行检测。也可以将本发明试剂盒中所述各试剂预先分装至泰乐德医疗有限公司的自制的试剂条中,并压膜分好制备成成品试剂。检测时只需在试剂条的样本孔中加入待检样本或标准品并加载至泰乐德医疗有限公司自行研制的VIT700全自动化学发光免疫分析仪上,即可实现仪器对样本中肾素含量的全自动检测。
技术效果说明,本发明所提供的肾素检测方法及检测试剂盒,创造性地开发出一种可应用于化学发光免疫分析技术的肾素检测方法学,所述试剂盒所应用酶循环增益反应原理和使用针对肾素活性位点的抗体为本发明独创,此检测方案基于一个链霉亲和素分子结合四个生物素分子的原理实现多个磁微粒-抗体-抗原-抗体-生物素-链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物结构在一定空间范围内的复合交联,从而达到信号值循环放大的目的,进而提高了试剂的灵敏度,此外采用特定的样本裂解液对样本进行预处理,使样本中肾素的抗原结构充分暴露,提升肾素抗体与肾素之间的结合效率,从而进一步提升试剂的灵敏度;本发明所制备出的试剂盒对于肾素及活性位点开放的肾素原的检测具有较高的检测灵敏度。
实施例3
本实施例依据实施例1所述试剂盒以及实施例2所述试剂盒的使用方法,构建本发明试剂盒对肾素WHO国际标准品的检测标准曲线。
采用不含肾素抗原的健康人血清将肾素WHO国际标准品配制成0μIU/mL、2.0μIU/mL、5.0μIU/mL、20.0μIU/mL、50.0μIU/mL、100.0μIU/mL、250.0μIU/mL和500.0μIU/mL的标准品工作液,采用实施例1所述肾素检测试剂进行检测,并依据肾素WHO国际标准品浓度及其检测的相对信号值,绘制标准曲线,标准曲线如图1所示,采用四参数拟合所得标准曲线数学公式为:Y=(a-d)/[1+(x/c)b]+d,其中a=3221.61,b=1.0881,c=1.10271e+07,d=4.66957e+10。
实施例4
本实施例采用空白检出限的方法对本发明试剂盒的最低检测限进行检测分析,方法如下:
检测零浓度标准品(S0)20次,零浓度标准品即为不含肾素和肾素原的空白样本,得到20次测定结果的信号值(RLU),计算其平均值M和标准差SD,得出M+2SD所对应的RLU值,根据零浓度校准品与相邻浓度标准品之间的浓度与RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程,其中所述的相邻浓度标准品的肾素浓度为2μIU/mL,本实施例以含肾素0.5μIU/mL的标准品为S1,并检测该标准品对应的RLU值,将M+2SD所对应的RLU值带入上述一次方程中,计算得出对应的浓度,即最低检测限(LOB)。
空白检出限结果如表1所示,可见采用本发明肾素检测试剂的空白检出限仅为0.07μIU/mL,而正常健康人体内肾素含量分布的2.5%~97.5%参考范围置信区间如下:立位时为4.3μIU/mL~48.3μIU/mL;卧位时为2.2μIU/mL~38.9μIU/mL,由此可知,本发明肾素检测试剂的空白检出限远低于正常健康人体内肾素含量分布,表明本发明试剂盒的检测灵敏度满足临床检测需求。
在已授权专利CN108398423B《肾素化学发光检测试剂盒》的实施例四中,该同类产品的试剂盒对肾素样本检测的空白限仅为0.2402μIU/mL和0.2527μIU/mL,远高于本发明中的检测方法,由此可见,本发明试剂盒相对于现有技术具有更低的检测限,表明本发明试剂盒具有更优的检测灵敏度。
表1空白检出限结果
实施例5
本实施例以天然提取的肾素、活性位点开放的肾素原、活性位点开放的肾素原经肾素抑制剂处理后为检测对象,分析本发明试剂盒对“活性”肾素的正确识别能力,即本发明试剂盒对“活性”肾素的检测特异性。
试验结果如图2所示,本发明试剂盒对天然肾素和活性位点开放的肾素原均具有良好的识别能力,随着两者的理论浓度提升,测试的浓度也随之提升,呈现较优的剂量-反应曲线关系,而在活性位点开放的肾素原中加入肾素抑制剂后,由于活性位点被封闭,活性位点开放的肾素原转变为活性位点关闭的肾素原,而无法被本发明试剂盒检测到其含量。表明本发明试剂盒及检测方法只对“活性肾素”有明显的反应性并能够对其含量进行准确检测,对无活性的肾素原无检出,保证了测试结果的可靠性,对“活性”肾素具有较高的检测特异性。
实施例6
本实施例通过添加回收试验分析试剂盒的检测准确度,方法如下:
利用不含肾素的健康人血浆将肾素WHO国际标准品稀释至终浓度依次为0.0μIU/mL、1.0μIU/mL、50.0μIU/mL、400.0μIU/mL,依次形成空白、低浓度、中浓度、高浓度的血浆样本。利用本发明实施例2所述化学发光免疫分析检测方法和图1的标准品曲线,对上述空白、低浓度、中浓度、高浓度的血浆样本进行测试。
结果如表2所示,采用本发明肾素检测试剂测定不同浓度的肾素WHO国际标准品的血浆样本,其回收率在98.3%~103.1%之间,说明本发明所述肾素检测试剂可以用于样本中肾素的检测,并且结果准确度高。
表2配制血清样本中肾素测试结果
实施例7
本实施例基于如下方法对本发明试剂盒的检测精密度进行分析:
将所述肾素WHO国际标准品采用不含肾素的健康人血清稀释至终浓度依次为:5.0μIU/mL、80.0μIU/mL、250.0μIU/mL,形成低、中、高浓度的重复性样本。利用前述肾素的化学发光免疫分析检测方法和图1的标准品曲线,对上述低、中、高浓度的重复性样本进行重复10次测定,计算平均值和变异系数。
结果如表3所示,采用本发明肾素检测试剂测定不同浓度样品中的肾素的变异系数均小于5%,表明本发明试剂盒具有较高的检测精密度。
表3精密度测试结果
配制样本 | 低浓度样本 | 中浓度样本 | 高浓度样本 |
浓度(μIU/mL) | 5.0 | 80.0 | 250.0 |
测试1 | 4.87 | 82.32 | 241.62 |
测试2 | 4.91 | 77.50 | 255.82 |
测试3 | 5.12 | 81.56 | 245.27 |
测试4 | 4.72 | 75.32 | 254.35 |
测试5 | 4.90 | 76.69 | 250.03 |
测试6 | 4.85 | 78.85 | 244.02 |
测试7 | 5.03 | 83.98 | 253.13 |
测试8 | 5.27 | 84.73 | 237.11 |
测试9 | 5.30 | 81.19 | 267.34 |
测试10 | 4.58 | 82.93 | 242.28 |
测试均值(μIU/mL) | 4.95 | 80.51 | 249.10 |
变异系数(%) | 4.60% | 4.01% | 3.56% |
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种抗肾素活性位点抗体,其特征在于,所述抗肾素活性位点抗体特异性识别肾素和活性位点开放的肾素原,所述抗肾素活性位点抗体特异性识别肾素分子氨基酸序列中的第25位至第50位氨基酸序列和活性位点开放的肾素原分子氨基酸序列中第91位至116位氨基酸序列。
2.如权利要求1所述抗肾素活性位点抗体,其特征在于,所述抗肾素活性位点抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述抗肾素活性位点抗体在肾素和活性位点开放的肾素原检测中的应用。
4.一种肾素磁微粒化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述肾素磁微粒化学发光检测试剂盒用于肾素和活性位点开放的肾素原的检测,所述试剂盒包括生物素标记的权利要求1或2所述抗肾素活性位点抗体。
5.如权利要求4所述肾素磁微粒化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物、抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子、酶促发光底物和样本裂解液。
6.一种权利要求5所述肾素磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括生物素标记的抗肾素活性位点抗体、链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物、抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子和样本裂解液的制备;
其中,生物素标记的抗肾素活性位点抗体的制备方法包括如下步骤:
(1)将生物素-N-琥珀酰亚胺基酯溶解于二甲基亚砜,配制成生物素-N琥珀酰亚胺基酯溶液;
(2)将抗肾素活性位点抗体加入生物素-N-琥珀酰亚胺基酯溶液进行反应,得到连接产物,连接产物经纯化获得生物素标记的抗肾素活性位点抗体。
7.如权利要求6所述肾素磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子的制备方法包括如下步骤:
(1)将抗肾素单克隆抗体、磁珠于缓冲液混合得抗肾素单克隆抗体和磁珠混合液;
(2)向抗肾素单克隆抗体和磁珠混合液中加入(NH4)2SO4溶液进行磁珠包被抗肾素单克隆抗体反应,反应后加入封闭液对包被抗肾素单克隆抗体的磁珠进行封闭,再经清洗制得抗肾素单克隆抗体包被的磁微粒子。
8.如权利要求6所述肾素磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物的制备方法包括如下步骤:
(1)将链霉亲和素经活化剂处理,得到活化的链霉亲和素;
(2)将碱性磷酸酶经活化剂处理,得到活化的碱性磷酸酶;
(3)将活化或未经活化的碱性磷酸酶与活化的链霉亲和素混合反应,制得链霉亲和素-碱性磷酸酶连接物。
9.如权利要求6所述肾素磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法,其特征在于,所述样本裂解液的制备方法包括如下步骤:
将氨基丁三醇、表面活性剂、吐温-20和防腐剂分散于水中制得样本裂解液。
10.权利要求4或5所述肾素磁微粒化学发光检测试剂盒在原发性醛固酮增多症指标检测、肾脏功能评价指标检测中的应用。
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