JP3244627B2 - 組換え肥満(ob)蛋白 - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、肥満及び関連疾患
の治療、予防及び制御に有用な組換え肥満(ob)蛋白
(タンパク質)に関する。
の治療、予防及び制御に有用な組換え肥満(ob)蛋白
(タンパク質)に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】肥満
は、西洋社会で最も普通の栄養障害であると報告されて
いる〔Zhang, Y.ら, Nature 372, 425-432 (1994)〕。
成人アメリカ人10人中3人以上は、理想体重より少な
くとも20%重い〔Zhang, Y. ら, 上記文献〕。体重増
加は、II型糖尿病(即ち、非インスリン依存型糖尿
病)、高血圧及び高脂血症のような重要な医学的疾患に
関連するため、公衆保健上の問題である〔Grundy, S.M.
及びBarnett, Disease-a-Mouth 36, 645-696 (1990)
〕。体重は生理学的に調節されており、肥満(及びそ
の関連症状又は疾患)は部分的にこの調節の混乱によ
る、という証拠がある〔Zhang, Y. ら, 上記文献〕。
は、西洋社会で最も普通の栄養障害であると報告されて
いる〔Zhang, Y.ら, Nature 372, 425-432 (1994)〕。
成人アメリカ人10人中3人以上は、理想体重より少な
くとも20%重い〔Zhang, Y. ら, 上記文献〕。体重増
加は、II型糖尿病(即ち、非インスリン依存型糖尿
病)、高血圧及び高脂血症のような重要な医学的疾患に
関連するため、公衆保健上の問題である〔Grundy, S.M.
及びBarnett, Disease-a-Mouth 36, 645-696 (1990)
〕。体重は生理学的に調節されており、肥満(及びそ
の関連症状又は疾患)は部分的にこの調節の混乱によ
る、という証拠がある〔Zhang, Y. ら, 上記文献〕。
【0003】齧歯類において、肥満表現型をもたらす7
つの単一遺伝子突然変異が記載されており、その内5つ
はマウスに存在する。これら7つの齧歯類モデルの中
で、最も集中して研究されているものの1つは、195
0年に同定された、マウスにおける肥満(obese)(o
b)遺伝子突然変異である〔Ingalls, A.M. ら, J. Her
ed. 41, 317-318 (1950)〕。このob遺伝子突然変異に
ついて同型接合のマウスは、ヒトにおける病的肥満に類
似した症候群の一部としての異常な肥満で、II型糖尿病
を発症し、かつ過食症で低代謝性である〔Friedman J.
M. ら, Genomics 11,1054-1062 (1991) 〕。このob遺
伝子は、マウス第6染色体の基部に位置し、脂肪組織で
発現される蛋白(即ち、ob蛋白)をコードする〔Zhan
g, Y. ら, 上記文献〕。ob遺伝子突然変異について同
型接合のマウスは、このob蛋白をほとんど又は全然産
生せず、したがって体重の調節が障害されて肥満に至
る。
つの単一遺伝子突然変異が記載されており、その内5つ
はマウスに存在する。これら7つの齧歯類モデルの中
で、最も集中して研究されているものの1つは、195
0年に同定された、マウスにおける肥満(obese)(o
b)遺伝子突然変異である〔Ingalls, A.M. ら, J. Her
ed. 41, 317-318 (1950)〕。このob遺伝子突然変異に
ついて同型接合のマウスは、ヒトにおける病的肥満に類
似した症候群の一部としての異常な肥満で、II型糖尿病
を発症し、かつ過食症で低代謝性である〔Friedman J.
M. ら, Genomics 11,1054-1062 (1991) 〕。このob遺
伝子は、マウス第6染色体の基部に位置し、脂肪組織で
発現される蛋白(即ち、ob蛋白)をコードする〔Zhan
g, Y. ら, 上記文献〕。ob遺伝子突然変異について同
型接合のマウスは、このob蛋白をほとんど又は全然産
生せず、したがって体重の調節が障害されて肥満に至
る。
【0004】このマウス又はヒトob蛋白は、対応する
ob遺伝子に欠陥又は突然変異(これらの欠陥又は突然
変異は、体重を調節するob蛋白の産生及び/又は機能
を防止し、又はそれに干渉する)のある患者に投与する
ことができる。したがってこれらの蛋白は、ヒト及び動
物における肥満、及びその関連疾患及び症状を制御し、
予防又は治療するためのホルモン様物質として使用する
ことができる。
ob遺伝子に欠陥又は突然変異(これらの欠陥又は突然
変異は、体重を調節するob蛋白の産生及び/又は機能
を防止し、又はそれに干渉する)のある患者に投与する
ことができる。したがってこれらの蛋白は、ヒト及び動
物における肥満、及びその関連疾患及び症状を制御し、
予防又は治療するためのホルモン様物質として使用する
ことができる。
【0005】このようにマウス又はヒトob蛋白を使用
するために、これらの蛋白は、頻繁な投薬で、種々の経
路(例えば、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下)により
注射で投与することができる。注射で頻繁に投与される
ため、マウス又はヒトob蛋白が、好適には均質になる
まで、精製されること、夾雑蛋白物質を含まないこと、
及び可溶性で生物学的に活性な形で組換えにより発現さ
れることが重要である。注射用薬剤中に存在する夾雑物
が、しばしば毒性副作用又は有害な免疫応答を引き起こ
しうることは、当業者には広く知られている。
するために、これらの蛋白は、頻繁な投薬で、種々の経
路(例えば、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下)により
注射で投与することができる。注射で頻繁に投与される
ため、マウス又はヒトob蛋白が、好適には均質になる
まで、精製されること、夾雑蛋白物質を含まないこと、
及び可溶性で生物学的に活性な形で組換えにより発現さ
れることが重要である。注射用薬剤中に存在する夾雑物
が、しばしば毒性副作用又は有害な免疫応答を引き起こ
しうることは、当業者には広く知られている。
【0006】マウスob遺伝子配列は、Zhang, Y. らの
上記文献で開示されているが、マウスob蛋白又はその
ヒト対応物を発現させる方法は報告されておらず、まし
てこれらの蛋白を、均質になるまで精製することができ
る生物学的に活性で可溶性の状態で製造する方法は報告
されていない。したがって、均質で、可溶性で、かつ生
物学的に活性な状態でマウス又はヒトob蛋白を発現さ
せ製造することが、重要であり、かつ本発明の目的であ
る。
上記文献で開示されているが、マウスob蛋白又はその
ヒト対応物を発現させる方法は報告されておらず、まし
てこれらの蛋白を、均質になるまで精製することができ
る生物学的に活性で可溶性の状態で製造する方法は報告
されていない。したがって、均質で、可溶性で、かつ生
物学的に活性な状態でマウス又はヒトob蛋白を発現さ
せ製造することが、重要であり、かつ本発明の目的であ
る。
【0007】
【課題を解決するための手段】組換えヒト及びマウスo
b蛋白は、生物学的に活性で可溶性の状態で発現させる
ことができ、そして肥満、並びにII型糖尿病、高血圧、
高脂血症などのようなその関連症状及び疾患を治療、予
防又は制御するために、患者に注射するのに適するよう
に均質になるまで精製することができることが発見され
た。
b蛋白は、生物学的に活性で可溶性の状態で発現させる
ことができ、そして肥満、並びにII型糖尿病、高血圧、
高脂血症などのようなその関連症状及び疾患を治療、予
防又は制御するために、患者に注射するのに適するよう
に均質になるまで精製することができることが発見され
た。
【0008】本発明により、ヒト及びマウスob蛋白
は、最初に大腸菌〔Escherichia coli(E. coli)〕用の
新規な発現ベクターを作成することにより、組換えによ
り生物学的に活性な形で製造し、均質になるまで精製す
ることができる。これらの発現ベクターは、プロモータ
ーとDNA配列を含有し、このDNA配列は、2つの部
分、大腸菌の外膜プロテインAのシグナルペプチド(即
ち、sOmpA)とヒト又はマウスob蛋白とを含む融
合蛋白をコードする。本発明により、生物学的に活性な
組換え型のマウス及びヒトob蛋白を製造するための次
の工程では、この発現ベクターを大腸菌宿主に挿入し、
これにより融合蛋白の効率的な発現と細胞周辺腔(即
ち、大腸菌の内膜と外膜の間)中へ移動させ、ここでシ
グナルペプチドをob蛋白から切り出させてob蛋白を
可溶性で生物学的に活性な形にさせる。次に、このob
蛋白を、宿主大腸菌細胞を冷浸透圧ショック処理に曝す
ことにより、可溶性で生物学的に活性な形で無細胞培地
中に効率的に分泌させ、ここでob蛋白を、陰イオン交
換クロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマト
グラフィー及びゲル濾過をこの順序で逐次実施すること
により、均質になるまで精製する。
は、最初に大腸菌〔Escherichia coli(E. coli)〕用の
新規な発現ベクターを作成することにより、組換えによ
り生物学的に活性な形で製造し、均質になるまで精製す
ることができる。これらの発現ベクターは、プロモータ
ーとDNA配列を含有し、このDNA配列は、2つの部
分、大腸菌の外膜プロテインAのシグナルペプチド(即
ち、sOmpA)とヒト又はマウスob蛋白とを含む融
合蛋白をコードする。本発明により、生物学的に活性な
組換え型のマウス及びヒトob蛋白を製造するための次
の工程では、この発現ベクターを大腸菌宿主に挿入し、
これにより融合蛋白の効率的な発現と細胞周辺腔(即
ち、大腸菌の内膜と外膜の間)中へ移動させ、ここでシ
グナルペプチドをob蛋白から切り出させてob蛋白を
可溶性で生物学的に活性な形にさせる。次に、このob
蛋白を、宿主大腸菌細胞を冷浸透圧ショック処理に曝す
ことにより、可溶性で生物学的に活性な形で無細胞培地
中に効率的に分泌させ、ここでob蛋白を、陰イオン交
換クロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマト
グラフィー及びゲル濾過をこの順序で逐次実施すること
により、均質になるまで精製する。
【0009】本発明はまた、1)sOmpAシグナルペ
プチドとヒト又はマウスob蛋白とを含む融合蛋白をコ
ードするDNA配列を含有する発現ベクター;2)この
ような発現ベクターによりトランスフェクション又は形
質転換された宿主生物;3)ヒトob蛋白をコードする
DNA;及び4)ob蛋白のポリエチレングリコール又
はポリプロピレングリコールコンジュゲートに関する。
プチドとヒト又はマウスob蛋白とを含む融合蛋白をコ
ードするDNA配列を含有する発現ベクター;2)この
ような発現ベクターによりトランスフェクション又は形
質転換された宿主生物;3)ヒトob蛋白をコードする
DNA;及び4)ob蛋白のポリエチレングリコール又
はポリプロピレングリコールコンジュゲートに関する。
【0010】更に本発明は、生物学的に活性で可溶性の
状態で組換えヒト及びマウスob蛋白を発現する方法、
及び動物及びヒトへの投与に適している精製された均質
な形でこれらの蛋白を製造する方法に関する。
状態で組換えヒト及びマウスob蛋白を発現する方法、
及び動物及びヒトへの投与に適している精製された均質
な形でこれらの蛋白を製造する方法に関する。
【0011】本発明のマウスob蛋白を発現させ製造す
る方法は、Zhang, Y. らの上記文献により報告されたマ
ウスob遺伝子〔この遺伝子の配列は、本明細書で配列
番号1として同定される702塩基対(bp)のヌクレオ
チド配列である〕を利用して達成される。このマウスo
b遺伝子配列は、501bpのコード配列、即ちヌクレオ
チド36の開始コドンから開始してヌクレオチド537
の終止コドンで終わる読み取り枠(ORF)を含み、
3′及び5′末端の両方に非翻訳配列を有する。このO
RFは、ヌクレオチド36〜98の63bpのシグナルペ
プチドを含有する。
る方法は、Zhang, Y. らの上記文献により報告されたマ
ウスob遺伝子〔この遺伝子の配列は、本明細書で配列
番号1として同定される702塩基対(bp)のヌクレオ
チド配列である〕を利用して達成される。このマウスo
b遺伝子配列は、501bpのコード配列、即ちヌクレオ
チド36の開始コドンから開始してヌクレオチド537
の終止コドンで終わる読み取り枠(ORF)を含み、
3′及び5′末端の両方に非翻訳配列を有する。このO
RFは、ヌクレオチド36〜98の63bpのシグナルペ
プチドを含有する。
【0012】このマウスob遺伝子配列(配列番号1)
は、アミノ酸配列が長さ167アミノ酸で、配列番号2
として同定されるマウスob蛋白(加えてそのシグナル
ペプチド)をコードする。配列番号2のこの蛋白におい
て、最初の21アミノ酸はマウスob蛋白のシグナル配
列を表す。成熟マウスob蛋白(そのシグナル配列を含
まない)は、アミノ酸22(Val)からアミノ酸16
7(Cys)にわたり、配列番号3で表される。
は、アミノ酸配列が長さ167アミノ酸で、配列番号2
として同定されるマウスob蛋白(加えてそのシグナル
ペプチド)をコードする。配列番号2のこの蛋白におい
て、最初の21アミノ酸はマウスob蛋白のシグナル配
列を表す。成熟マウスob蛋白(そのシグナル配列を含
まない)は、アミノ酸22(Val)からアミノ酸16
7(Cys)にわたり、配列番号3で表される。
【0013】本発明のヒトob蛋白を発現させ製造する
方法は、ヒトob遺伝子を利用して達成される。この遺
伝子の配列は、本明細書で配列番号4として同定される
690bpのヌクレオチド配列である。
方法は、ヒトob遺伝子を利用して達成される。この遺
伝子の配列は、本明細書で配列番号4として同定される
690bpのヌクレオチド配列である。
【0014】Zhang, Y. らの上記文献は、ヒトob遺伝
子をマウスob遺伝子と高度に相同な遺伝子として報告
しており、1)ヒト脂肪組織から誘導されたクローンの
cDNAライブラリーをスクリーニングし、2)ヒトo
b遺伝子を有するクローンを同定し、そして3)ヒトo
b遺伝子を単離し、配列決定するために利用可能であ
る、マウスob遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプロ
ーブを使用する従来法を開示している。従来法により配
列決定すると、このヒトob遺伝子配列は、配列番号4
のヌクレオチド配列を有するものと決定される。
子をマウスob遺伝子と高度に相同な遺伝子として報告
しており、1)ヒト脂肪組織から誘導されたクローンの
cDNAライブラリーをスクリーニングし、2)ヒトo
b遺伝子を有するクローンを同定し、そして3)ヒトo
b遺伝子を単離し、配列決定するために利用可能であ
る、マウスob遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプロ
ーブを使用する従来法を開示している。従来法により配
列決定すると、このヒトob遺伝子配列は、配列番号4
のヌクレオチド配列を有するものと決定される。
【0015】マウスob遺伝子の場合のように、ヒトo
b遺伝子は、501bpのコード配列、即ちヌクレオチド
37の開始コドンから開始してヌクレオチド538の終
止コドンで終わる読み取り枠(ORF)を含み、3′及
び5′末端の両方に非翻訳配列を有する。このORF
は、ヌクレオチド37〜99に63bpのシグナル配列を
有する。
b遺伝子は、501bpのコード配列、即ちヌクレオチド
37の開始コドンから開始してヌクレオチド538の終
止コドンで終わる読み取り枠(ORF)を含み、3′及
び5′末端の両方に非翻訳配列を有する。このORF
は、ヌクレオチド37〜99に63bpのシグナル配列を
有する。
【0016】このヒトob遺伝子配列(配列番号4)
は、ヒトob蛋白とそのシグナル配列とをコードし、そ
のアミノ酸配列は長さ167アミノ酸であり、配列番号
5として同定される。長さ167アミノ酸のこの蛋白の
最初の21アミノ酸は、シグナル配列を表す。成熟ヒト
ob蛋白(そのシグナル配列を含まない)は、アミノ酸
22(Val)からアミノ酸167(Cys)にわた
り、配列番号6で表される。
は、ヒトob蛋白とそのシグナル配列とをコードし、そ
のアミノ酸配列は長さ167アミノ酸であり、配列番号
5として同定される。長さ167アミノ酸のこの蛋白の
最初の21アミノ酸は、シグナル配列を表す。成熟ヒト
ob蛋白(そのシグナル配列を含まない)は、アミノ酸
22(Val)からアミノ酸167(Cys)にわた
り、配列番号6で表される。
【0017】Zhang, Y. らの上記文献は、マウス及びヒ
トob蛋白が84%同一であることを報告している。Zh
ang, Y. らの上記文献はまた、マウス及びヒト蛋白の変
異体が存在し、このような変異体の1つは、両方の種で
グルタミン49の欠失を特徴とすることを報告してい
る。マウス脂肪組織及びヒト脂肪組織から誘導したライ
ブラリー中の約30%のcDNAクローンは、コドン4
9を失っている〔Zhang,Y. ら, 上記文献〕。
トob蛋白が84%同一であることを報告している。Zh
ang, Y. らの上記文献はまた、マウス及びヒト蛋白の変
異体が存在し、このような変異体の1つは、両方の種で
グルタミン49の欠失を特徴とすることを報告してい
る。マウス脂肪組織及びヒト脂肪組織から誘導したライ
ブラリー中の約30%のcDNAクローンは、コドン4
9を失っている〔Zhang,Y. ら, 上記文献〕。
【0018】下記の用語は、以下に述べる定義を有す
る: 「マウスob蛋白(mob)」は、その生物学的性質
が、肥満又はその関連症状及び疾患を治療、制御又は予
防することに関連する、配列番号3の蛋白に関する。具
体的には、マウスob蛋白は、配列番号3のアミノ酸配
列に実質的に相同なアミノ酸配列を有し、更に下記の生
物学的活性を有する、任意の蛋白又はポリペプチドを含
むものと定義される: 1)16〜18時間絶食させた、体重が少なくとも30
グラムの成熟肥満ob/obマウスに、Haley 及びMcCo
rmick, Brit. J. Pharmacol. 12, 12-15 (1957) の方法
を使用して20μg 以下の用量で脳室内(ICV)注射
によりその蛋白又はポリペプチドを投与するとき、その
蛋白又はポリペプチドが: (a)5時間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注
射した対照マウスに比較して50%低下させ(食物摂取
を低下させるED50);かつ (b)ICV注射から24時間の間の体重増加を、賦形
剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも50%低
下させる(体重増加を低下させるED50); 又は 2)絶食させていない、体重が少なくとも30グラムの
成熟ob/obマウスに、20μg 以下の全1日用量
で、1週間、1日に2回、明相の開始時点と暗相の3時
間の時点で、その蛋白又はポリペプチドを腹腔内(I
P)投与するとき、その蛋白又はポリペプチドが: (a)5及び24時間食物摂取を、賦形剤を注射した対
照マウスに比較して少なくとも20%低下させ(食物摂
取を低下させるED20);かつ (b)最初のIP注射から24時間の間の体重増加を、
賦形剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも20
%低下させる(体重増加を低下させるED20)。
る: 「マウスob蛋白(mob)」は、その生物学的性質
が、肥満又はその関連症状及び疾患を治療、制御又は予
防することに関連する、配列番号3の蛋白に関する。具
体的には、マウスob蛋白は、配列番号3のアミノ酸配
列に実質的に相同なアミノ酸配列を有し、更に下記の生
物学的活性を有する、任意の蛋白又はポリペプチドを含
むものと定義される: 1)16〜18時間絶食させた、体重が少なくとも30
グラムの成熟肥満ob/obマウスに、Haley 及びMcCo
rmick, Brit. J. Pharmacol. 12, 12-15 (1957) の方法
を使用して20μg 以下の用量で脳室内(ICV)注射
によりその蛋白又はポリペプチドを投与するとき、その
蛋白又はポリペプチドが: (a)5時間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注
射した対照マウスに比較して50%低下させ(食物摂取
を低下させるED50);かつ (b)ICV注射から24時間の間の体重増加を、賦形
剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも50%低
下させる(体重増加を低下させるED50); 又は 2)絶食させていない、体重が少なくとも30グラムの
成熟ob/obマウスに、20μg 以下の全1日用量
で、1週間、1日に2回、明相の開始時点と暗相の3時
間の時点で、その蛋白又はポリペプチドを腹腔内(I
P)投与するとき、その蛋白又はポリペプチドが: (a)5及び24時間食物摂取を、賦形剤を注射した対
照マウスに比較して少なくとも20%低下させ(食物摂
取を低下させるED20);かつ (b)最初のIP注射から24時間の間の体重増加を、
賦形剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも20
%低下させる(体重増加を低下させるED20)。
【0019】本明細書で使用されるマウスob蛋白とい
う用語は、例えば部位特異的突然変異誘発により、意図
的に改変された蛋白、又は偶発的に突然変異により改変
された蛋白を含む。
う用語は、例えば部位特異的突然変異誘発により、意図
的に改変された蛋白、又は偶発的に突然変異により改変
された蛋白を含む。
【0020】「ヒトob蛋白(hob)」は、その生物
学的性質が、肥満又はその関連症状及び疾患を治療、制
御又は予防することに関連する、配列番号6のアミノ酸
配列の蛋白に関する。具体的には、ヒトob蛋白は、配
列番号6のアミノ酸配列に実質的に相同なアミノ酸配列
を有し、更に下記の生物学的活性を有する、任意の蛋白
又はポリペプチドを含むものと定義される: 1)16〜18時間絶食させた、体重が少なくとも30
グラムの成熟肥満ob/obマウスに、Haley 及びMcCo
rmick の上記文献の方法を使用して20μg 以下の用量
でその蛋白又はポリペプチドをICV投与するとき、そ
の蛋白又はポリペプチドが: (a)5時間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注
射した対照マウスに比較して50%低下させ(食物摂取
を低下させるED50);かつ (b)ICV注射から24時間の間の体重増加を、賦形
剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも50%低
下させる(体重増加を低下させるED50); 又は 2)絶食させていない、体重が少なくとも30グラムの
成熟ob/obマウスに、20μg 以下の全1日用量
で、1週間、1日に2回、明相の開始時点と暗相の3時
間の時点で、蛋白又はポリペプチドをIP投与すると
き、その蛋白又はポリペプチドが: (a)5及び24時間食物摂取を、賦形剤を注射した対
照マウスに比較して少なくとも20%低下させ(食物摂
取を低下させるED20);かつ (b)最初のIP注射から24時間の間の体重増加を、
賦形剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも20
%低下させる(体重増加を低下させるED20)。
学的性質が、肥満又はその関連症状及び疾患を治療、制
御又は予防することに関連する、配列番号6のアミノ酸
配列の蛋白に関する。具体的には、ヒトob蛋白は、配
列番号6のアミノ酸配列に実質的に相同なアミノ酸配列
を有し、更に下記の生物学的活性を有する、任意の蛋白
又はポリペプチドを含むものと定義される: 1)16〜18時間絶食させた、体重が少なくとも30
グラムの成熟肥満ob/obマウスに、Haley 及びMcCo
rmick の上記文献の方法を使用して20μg 以下の用量
でその蛋白又はポリペプチドをICV投与するとき、そ
の蛋白又はポリペプチドが: (a)5時間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注
射した対照マウスに比較して50%低下させ(食物摂取
を低下させるED50);かつ (b)ICV注射から24時間の間の体重増加を、賦形
剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも50%低
下させる(体重増加を低下させるED50); 又は 2)絶食させていない、体重が少なくとも30グラムの
成熟ob/obマウスに、20μg 以下の全1日用量
で、1週間、1日に2回、明相の開始時点と暗相の3時
間の時点で、蛋白又はポリペプチドをIP投与すると
き、その蛋白又はポリペプチドが: (a)5及び24時間食物摂取を、賦形剤を注射した対
照マウスに比較して少なくとも20%低下させ(食物摂
取を低下させるED20);かつ (b)最初のIP注射から24時間の間の体重増加を、
賦形剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも20
%低下させる(体重増加を低下させるED20)。
【0021】本明細書で使用されるヒトob蛋白という
用語は、例えば部位特異的突然変異誘発により、意図的
に改変された蛋白、又は偶発的に突然変異により改変さ
れた蛋白を含む。
用語は、例えば部位特異的突然変異誘発により、意図的
に改変された蛋白、又は偶発的に突然変異により改変さ
れた蛋白を含む。
【0022】核酸及びアミノ酸配列の両方について当て
はまりうる「実質的に相同」とは、特定の対象配列、例
えば突然変異配列が、1つ以上の置換、欠失又は付加に
より基準配列とは異なるが、その正味の効果は基準配列
と対象配列との間の不都合な機能的相違点を引き起こさ
ないことを意味する。本発明の目的のためには、95%
以上の相同性、同等の生物学的性質、及び同等の発現特
性を有する配列は、実質的に相同であると考えられる。
相同性の決定の目的のためには、成熟配列の端を切り取
った型(truncation)は無視すべきである。相同性の程
度が低く、同等な生物活性、及び同等の発現特性を有す
る配列は、実質的に等価物と考えられる。一般に、相同
なDNA配列は、中程度のストリンジェンシー(string
ency)の標準的ハイブリダイゼーション条件下で交差ハ
イブリダイゼーションにより同定することができる。
はまりうる「実質的に相同」とは、特定の対象配列、例
えば突然変異配列が、1つ以上の置換、欠失又は付加に
より基準配列とは異なるが、その正味の効果は基準配列
と対象配列との間の不都合な機能的相違点を引き起こさ
ないことを意味する。本発明の目的のためには、95%
以上の相同性、同等の生物学的性質、及び同等の発現特
性を有する配列は、実質的に相同であると考えられる。
相同性の決定の目的のためには、成熟配列の端を切り取
った型(truncation)は無視すべきである。相同性の程
度が低く、同等な生物活性、及び同等の発現特性を有す
る配列は、実質的に等価物と考えられる。一般に、相同
なDNA配列は、中程度のストリンジェンシー(string
ency)の標準的ハイブリダイゼーション条件下で交差ハ
イブリダイゼーションにより同定することができる。
【0023】マウス又はヒトob蛋白の「断片(フラグ
メント)」は、マウス又はヒトob蛋白の部分又は断片
のアミノ酸配列を有する任意の蛋白又はポリペプチドを
意味し、これは各々マウス又はヒトob蛋白の生物学的
活性を有する。断片は、マウス又はヒトob蛋白の分解
により製造されるか又は当該分野でごく普通の方法によ
り化学合成により製造される蛋白又はポリペプチドを含
む。
メント)」は、マウス又はヒトob蛋白の部分又は断片
のアミノ酸配列を有する任意の蛋白又はポリペプチドを
意味し、これは各々マウス又はヒトob蛋白の生物学的
活性を有する。断片は、マウス又はヒトob蛋白の分解
により製造されるか又は当該分野でごく普通の方法によ
り化学合成により製造される蛋白又はポリペプチドを含
む。
【0024】ob蛋白又はその断片は、ヒトを含む哺乳
動物へのこの蛋白又は断片の投与が哺乳動物において食
物摂取を低下させ、かつ体重増加の速度を低下させる場
合、「生物学的に活性」である。ヒト又はマウスob蛋
白のこのような生物学的活性の測定は、1つ以上の種の
哺乳動物、特にob/obマウスで、このような目的の
ために利用される従来法の周知の試験により行うことが
できる。このような生物学的活性を明らかにするために
使用することができるこれらの試験の幾つかを、本明細
書に記載する。本明細書に記載されるようにob/ob
マウスにおけるICV試験により生物学的活性を測定す
る場合、ヒト又はマウスob蛋白は、好適には、20μ
g 以下の、食物摂取を低下させるED50と、20μg 以
下の、体重増加を低下させるED50とを有する。あるい
は、本明細書に記載されるようにob/obマウスにお
けるIP試験によりヒト又はマウスob蛋白の生物学的
活性を測定する場合、ヒト又はマウスob蛋白は、好適
には、20μg 以下の、食物摂取を低下させるED
20と、20μg 以下の、体重増加を低下させるED20と
を有する。一般に、上記生物学的活性を示す断片が好ま
しい。
動物へのこの蛋白又は断片の投与が哺乳動物において食
物摂取を低下させ、かつ体重増加の速度を低下させる場
合、「生物学的に活性」である。ヒト又はマウスob蛋
白のこのような生物学的活性の測定は、1つ以上の種の
哺乳動物、特にob/obマウスで、このような目的の
ために利用される従来法の周知の試験により行うことが
できる。このような生物学的活性を明らかにするために
使用することができるこれらの試験の幾つかを、本明細
書に記載する。本明細書に記載されるようにob/ob
マウスにおけるICV試験により生物学的活性を測定す
る場合、ヒト又はマウスob蛋白は、好適には、20μ
g 以下の、食物摂取を低下させるED50と、20μg 以
下の、体重増加を低下させるED50とを有する。あるい
は、本明細書に記載されるようにob/obマウスにお
けるIP試験によりヒト又はマウスob蛋白の生物学的
活性を測定する場合、ヒト又はマウスob蛋白は、好適
には、20μg 以下の、食物摂取を低下させるED
20と、20μg 以下の、体重増加を低下させるED20と
を有する。一般に、上記生物学的活性を示す断片が好ま
しい。
【0025】「レプリコン」は、インビボ(生体内)で
DNA複製の自律性単位として機能する、即ちそれ自体
の制御下で複製可能なあらゆる遺伝要素(例えば、プラ
スミド、染色体、ウイルス)である。
DNA複製の自律性単位として機能する、即ちそれ自体
の制御下で複製可能なあらゆる遺伝要素(例えば、プラ
スミド、染色体、ウイルス)である。
【0026】「発現ベクター」は、結合したセグメント
の複製が行われるように別のDNAセグメントを結合さ
せてもよい、プラスミド、ファージ又はコスミドのよう
なレプリコンである。これは、(1)遺伝子発現におい
て調節的役割を有する遺伝要素又は要素類(例えば、プ
ロモーター又はエンハンサー)、(2)mRNAに転写
されて蛋白に翻訳される構造又はコード配列、及び
(3)適切な転写開始及び終結配列の構築物(アセンブ
リー)を含む転写単位よりなる。
の複製が行われるように別のDNAセグメントを結合さ
せてもよい、プラスミド、ファージ又はコスミドのよう
なレプリコンである。これは、(1)遺伝子発現におい
て調節的役割を有する遺伝要素又は要素類(例えば、プ
ロモーター又はエンハンサー)、(2)mRNAに転写
されて蛋白に翻訳される構造又はコード配列、及び
(3)適切な転写開始及び終結配列の構築物(アセンブ
リー)を含む転写単位よりなる。
【0027】「クローン」は、元の長さのDNAから誘
導され、しばしばプラスミドが関与する遺伝子工学技術
を使用して細菌又はウイルスにより産生されるDNA分
子の群である。
導され、しばしばプラスミドが関与する遺伝子工学技術
を使用して細菌又はウイルスにより産生されるDNA分
子の群である。
【0028】「シグナル配列」は、発現されるべき蛋白
のコード配列の開始点(5′末端)に位置する核酸配列
である。このシグナル配列は、新規に合成される蛋白の
N末端にシグナルペプチドをコードする。このシグナル
ペプチドは、宿主細胞に、この蛋白を宿主細胞膜に向け
て又はこれを通って移動させるよう指示し、そしてこの
シグナルペプチドは、通常このような移動中に切り出さ
れる。
のコード配列の開始点(5′末端)に位置する核酸配列
である。このシグナル配列は、新規に合成される蛋白の
N末端にシグナルペプチドをコードする。このシグナル
ペプチドは、宿主細胞に、この蛋白を宿主細胞膜に向け
て又はこれを通って移動させるよう指示し、そしてこの
シグナルペプチドは、通常このような移動中に切り出さ
れる。
【0029】「開始コドン」は、蛋白のコード配列中の
通常5′末端に位置する、通常ATGであるコドンであ
り、蛋白配列の最初のアミノ酸を示す。
通常5′末端に位置する、通常ATGであるコドンであ
り、蛋白配列の最初のアミノ酸を示す。
【0030】「終止コドン」は、通常蛋白のコード配列
の3′末端に位置するナンセンスコドンであり、成長す
るポリペプチド鎖の終わりを示す。
の3′末端に位置するナンセンスコドンであり、成長す
るポリペプチド鎖の終わりを示す。
【0031】「読み取り枠(ORF)」は、適切な調節
配列の制御下に置かれると、インビトロ(試験管内)又
はインビボ(生体内)で細胞中でアミノ酸配列をコード
する二本鎖DNA中の、コドントリプレットの線状配列
である。ORFの境界は、5′末端の開始コドンと3′
末端の終止コドンとにより決定される。これは「コード
配列」とも呼ばれる。
配列の制御下に置かれると、インビトロ(試験管内)又
はインビボ(生体内)で細胞中でアミノ酸配列をコード
する二本鎖DNA中の、コドントリプレットの線状配列
である。ORFの境界は、5′末端の開始コドンと3′
末端の終止コドンとにより決定される。これは「コード
配列」とも呼ばれる。
【0032】「プロモーター配列」は、細胞中でRNA
ポリメラーゼと結合し、下流(3′方向)の1つ以上の
構造遺伝子の読み取り枠の転写を開始させることのでき
るDNA調節領域である。このプロモーター配列は、通
常シグナル配列又は読み取り枠の5′末端に位置し、バ
ックグラウンドを上回る検出可能なレベルでポリペプチ
ドの転写を開始するのに必要な最低数の塩基又は要素を
含むように5′方向に上流に伸びている。
ポリメラーゼと結合し、下流(3′方向)の1つ以上の
構造遺伝子の読み取り枠の転写を開始させることのでき
るDNA調節領域である。このプロモーター配列は、通
常シグナル配列又は読み取り枠の5′末端に位置し、バ
ックグラウンドを上回る検出可能なレベルでポリペプチ
ドの転写を開始するのに必要な最低数の塩基又は要素を
含むように5′方向に上流に伸びている。
【0033】コード配列又はORFは、RNAポリメラ
ーゼがコード配列をmRNAに転写する場合、プロモー
ター配列の「制御下」にある。
ーゼがコード配列をmRNAに転写する場合、プロモー
ター配列の「制御下」にある。
【0034】Aを含む組成物(ここで、Aは、単一のポ
リペプチドである)は、例えばポリアクリルアミドゲル
の染色のような従来法により検出するとき、検出可能な
量の夾雑蛋白又は他の内因性物質がない場合、Aについ
て「均質」である。本発明の目的のためには、均質とい
う用語は、組成物の少なくとも95重量%が単一の蛋白
又はポリペプチドである場合、その単一の蛋白又はポリ
ペプチドを含む組成物のことをいう。
リペプチドである)は、例えばポリアクリルアミドゲル
の染色のような従来法により検出するとき、検出可能な
量の夾雑蛋白又は他の内因性物質がない場合、Aについ
て「均質」である。本発明の目的のためには、均質とい
う用語は、組成物の少なくとも95重量%が単一の蛋白
又はポリペプチドである場合、その単一の蛋白又はポリ
ペプチドを含む組成物のことをいう。
【0035】下記の工程は、ヒト及びマウスob蛋白
を、生物学的に活性で可溶性の無細胞状態で、他の哺乳
動物の蛋白を含まず、ここからob蛋白を均質になるま
で精製することができるように、組換えにより発現させ
る方法を略述している。これらの工程は、実施例で詳細
に例示する。
を、生物学的に活性で可溶性の無細胞状態で、他の哺乳
動物の蛋白を含まず、ここからob蛋白を均質になるま
で精製することができるように、組換えにより発現させ
る方法を略述している。これらの工程は、実施例で詳細
に例示する。
【0036】1)マウス及びヒトob遺伝子の入手:
マウスob蛋白とその天然のシグナル配列とをコードす
るcDNA(配列番号1)は、Zhang, Y. らの上記文献
に発表されている。このマウスcDNAは、従来法によ
り、単離され、オリゴデオキシヌクレオチドDNAプラ
イマーを使用してPCR法により増幅された。これらの
DNAプライマーとこれらを得るための方法は、Zhang,
Y. らの上記文献に記載されている。
マウスob蛋白とその天然のシグナル配列とをコードす
るcDNA(配列番号1)は、Zhang, Y. らの上記文献
に発表されている。このマウスcDNAは、従来法によ
り、単離され、オリゴデオキシヌクレオチドDNAプラ
イマーを使用してPCR法により増幅された。これらの
DNAプライマーとこれらを得るための方法は、Zhang,
Y. らの上記文献に記載されている。
【0037】ヒトob蛋白とその天然のシグナル配列と
をコードするcDNA(配列番号4)は、マウスob遺
伝子を得るためにZhang, Y. らの上記文献で使用された
ものと同じオリゴデオキシヌクレオチドDNAプライマ
ーを使用して得られる。従来法により、このヒトcDN
Aは、ヒト脂肪細胞組織由来RNAから作成されたラム
ダファージcDNAライブラリーから単離された。
をコードするcDNA(配列番号4)は、マウスob遺
伝子を得るためにZhang, Y. らの上記文献で使用された
ものと同じオリゴデオキシヌクレオチドDNAプライマ
ーを使用して得られる。従来法により、このヒトcDN
Aは、ヒト脂肪細胞組織由来RNAから作成されたラム
ダファージcDNAライブラリーから単離された。
【0038】ヒト又はマウスobのcDNAは、cDN
Aライブラリーから得ることができるだけでなく、他の
従来法、例えば化学合成により、又は目的の細胞から精
製したゲノムDNA若しくはその断片のクローニングに
より得ることもできる。これらの手順は、Sambrookらの
「DNAクローニング:実際的アプローチ(DNA Clonin
g: A Practical Approach)」第I及び第II巻、D.N. Glo
ver 編、1985年、MRLPress, Ltd. 刊、オックスフォー
ド、英国; Benton及びDavis, Science 196, 180-182 (1
977); 及びGrunstein 及びHogness, Proc. Natl. Acad.
Sci. 72, 3961-3965 (1975)に記載されている。cDN
Aライブラリーからヒト又はマウスobのcDNAを得
るためには、マウスob遺伝子を含有するマウス脂肪細
胞から単離したポリアデニル化RNAの逆転写により調
製したプライマーを使用して、Benton及びDavis の上記
文献、又はGrunstein 及びHogness の上記文献の方法に
より、従来のDNAハイブリダイゼーション法によりこ
のcDNAライブラリーをスクリーニングする。プライ
マーにハイブリダイズするクローンを、制限エンドヌク
レアーゼ切断、アガロースゲル電気泳動、及び電気泳動
したプライマーを含む更なるハイブリダイゼーション実
験(「サザンブロット」)により解析する。マウスcD
NAプローブにハイブリダイズした幾つかのクローンの
単離後、1つのクローンのハイブリダイズするセグメン
トをサブクローニングして、従来法により配列決定す
る。
Aライブラリーから得ることができるだけでなく、他の
従来法、例えば化学合成により、又は目的の細胞から精
製したゲノムDNA若しくはその断片のクローニングに
より得ることもできる。これらの手順は、Sambrookらの
「DNAクローニング:実際的アプローチ(DNA Clonin
g: A Practical Approach)」第I及び第II巻、D.N. Glo
ver 編、1985年、MRLPress, Ltd. 刊、オックスフォー
ド、英国; Benton及びDavis, Science 196, 180-182 (1
977); 及びGrunstein 及びHogness, Proc. Natl. Acad.
Sci. 72, 3961-3965 (1975)に記載されている。cDN
Aライブラリーからヒト又はマウスobのcDNAを得
るためには、マウスob遺伝子を含有するマウス脂肪細
胞から単離したポリアデニル化RNAの逆転写により調
製したプライマーを使用して、Benton及びDavis の上記
文献、又はGrunstein 及びHogness の上記文献の方法に
より、従来のDNAハイブリダイゼーション法によりこ
のcDNAライブラリーをスクリーニングする。プライ
マーにハイブリダイズするクローンを、制限エンドヌク
レアーゼ切断、アガロースゲル電気泳動、及び電気泳動
したプライマーを含む更なるハイブリダイゼーション実
験(「サザンブロット」)により解析する。マウスcD
NAプローブにハイブリダイズした幾つかのクローンの
単離後、1つのクローンのハイブリダイズするセグメン
トをサブクローニングして、従来法により配列決定す
る。
【0039】ゲノムDNA由来のクローンは、コード領
域に加えて調節及びイントロンDNA領域を含有する可
能性がある。cDNA由来のクローンはイントロン配列
を含有しない。ゲノムDNAからの遺伝子の分子クロー
ニングでは、DNA断片が生成され、この内の幾つかは
目的の遺伝子をコードする。このDNAを種々の制限酵
素を使用して特異的部位で切断することができる。ある
いは、マンガンの存在下でDNAseを使用してDNA
を断片化するか、又はDNAを、例えば音波処理のよう
に物理的に剪断することができる。次にこの線状DNA
断片を、標準的な方法(アガロース及びポリアクリルア
ミドゲル電気泳動及びカラムクロマトグラフィーを含む
がこれらに限定されない)により、サイズに応じて分離
することができる。
域に加えて調節及びイントロンDNA領域を含有する可
能性がある。cDNA由来のクローンはイントロン配列
を含有しない。ゲノムDNAからの遺伝子の分子クロー
ニングでは、DNA断片が生成され、この内の幾つかは
目的の遺伝子をコードする。このDNAを種々の制限酵
素を使用して特異的部位で切断することができる。ある
いは、マンガンの存在下でDNAseを使用してDNA
を断片化するか、又はDNAを、例えば音波処理のよう
に物理的に剪断することができる。次にこの線状DNA
断片を、標準的な方法(アガロース及びポリアクリルア
ミドゲル電気泳動及びカラムクロマトグラフィーを含む
がこれらに限定されない)により、サイズに応じて分離
することができる。
【0040】供給源が何であれ、ヒト又はマウスob遺
伝子は、当該分野で公知の方法により遺伝子を増やすた
めに適切なベクターに分子クローニングすることができ
る。任意の市販のベクターを使用することができる。例
えば、マウスcDNAは、pCDNA3ベクターに挿入
することができ、ヒトcDNAは、pBluescriptSK-
ベクターに挿入することができる。細菌宿主での使用に
適切なベクターは、Pouwels らの「クローニングベクタ
ー:実験室マニュアル(Cloning Vectors: A Laborator
y Manual)」、1985年、Elsevier刊、ニューヨークに記
載されている。代表的なものであるが非限定的な例とし
て、細菌での使用に有用なクローニングベクターは、周
知のクローニングベクターpBR322(ATCC37
017)から誘導された市販のプラスミドから誘導され
た細菌由来の複製起点と選択マーカーとを含むことがで
きる。このような市販のベクターとしては、例えばpK
K223−3〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ
(Pharmacia Fine Chemicals)、ウプサラ、スウェーデ
ン〕及びpGEM1〔プロメガ・バイオテク(Promega
Biotec)、マディソン、ウィスコンシン州、米国〕が挙
げられる。
伝子は、当該分野で公知の方法により遺伝子を増やすた
めに適切なベクターに分子クローニングすることができ
る。任意の市販のベクターを使用することができる。例
えば、マウスcDNAは、pCDNA3ベクターに挿入
することができ、ヒトcDNAは、pBluescriptSK-
ベクターに挿入することができる。細菌宿主での使用に
適切なベクターは、Pouwels らの「クローニングベクタ
ー:実験室マニュアル(Cloning Vectors: A Laborator
y Manual)」、1985年、Elsevier刊、ニューヨークに記
載されている。代表的なものであるが非限定的な例とし
て、細菌での使用に有用なクローニングベクターは、周
知のクローニングベクターpBR322(ATCC37
017)から誘導された市販のプラスミドから誘導され
た細菌由来の複製起点と選択マーカーとを含むことがで
きる。このような市販のベクターとしては、例えばpK
K223−3〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ
(Pharmacia Fine Chemicals)、ウプサラ、スウェーデ
ン〕及びpGEM1〔プロメガ・バイオテク(Promega
Biotec)、マディソン、ウィスコンシン州、米国〕が挙
げられる。
【0041】これらの市販のベクターに挿入されたヒト
又はマウスob遺伝子のヌクレオチド配列は、標準的ヌ
クレオチド配列決定法による当該分野で公知の方法によ
り確認することができる。
又はマウスob遺伝子のヌクレオチド配列は、標準的ヌ
クレオチド配列決定法による当該分野で公知の方法によ
り確認することができる。
【0042】ヒト又はマウス以外の種のob蛋白をコー
ドする他の核酸を、本発明で使用することができる。し
たがって、ヒト及びマウスob遺伝子に関して特異的D
NAがクローニングされ配列決定されたが、ob蛋白の
核酸供給源として任意の動物の脂肪細胞が潜在的には使
用可能である。
ドする他の核酸を、本発明で使用することができる。し
たがって、ヒト及びマウスob遺伝子に関して特異的D
NAがクローニングされ配列決定されたが、ob蛋白の
核酸供給源として任意の動物の脂肪細胞が潜在的には使
用可能である。
【0043】2)ヒト及びマウスob蛋白のための発現
ベクターの構築: 上記方法によりクローニングしたヒ
ト又はマウスob遺伝子を、各々ヒト及びマウスob蛋
白のための発現ベクターを構築するために使用する。
ベクターの構築: 上記方法によりクローニングしたヒ
ト又はマウスob遺伝子を、各々ヒト及びマウスob蛋
白のための発現ベクターを構築するために使用する。
【0044】トランスフェクションした又は形質転換し
た大腸菌宿主細胞による生物学的に活性なヒト及びマウ
スob蛋白の発現のために、及び細胞周辺腔へのob蛋
白の分泌のために、新規な発現ベクターを利用すること
ができる。この発現ベクターは、プロモーターと、融合
蛋白をコードするDNA配列とを含む。この融合蛋白は
2つの部分よりなる:第一部分は、大腸菌の外膜プロテ
インAのシグナルペプチド(sOmpA)であり、融合
蛋白の第二部分は、ヒト又はマウスob蛋白(これら自
体の天然シグナル配列を差し引いた)である。この融合
蛋白をコードするDNA配列も2つの部分よりなる:s
OmpAペプチドをコードする第一部分と、マウス又は
ヒトob蛋白(これらの天然のシグナル配列を差し引い
た)をコードする第二部分である。sOmpAペプチド
をコードするDNA配列の第一部分は、De Sutter, K.
ら, Gene 141, 163-170 (1994)に記載されたシグナル配
列であり、配列番号7のヌクレオチド配列を有する。こ
の2つの部分よりなるDNA配列の第二部分は、マウス
又はヒトob蛋白をコードし、各々配列番号1又は配列
番号4から、各天然シグナル配列をコードするヌクレオ
チド配列の部分を差し引いたヌクレオチド配列を有す
る。
た大腸菌宿主細胞による生物学的に活性なヒト及びマウ
スob蛋白の発現のために、及び細胞周辺腔へのob蛋
白の分泌のために、新規な発現ベクターを利用すること
ができる。この発現ベクターは、プロモーターと、融合
蛋白をコードするDNA配列とを含む。この融合蛋白は
2つの部分よりなる:第一部分は、大腸菌の外膜プロテ
インAのシグナルペプチド(sOmpA)であり、融合
蛋白の第二部分は、ヒト又はマウスob蛋白(これら自
体の天然シグナル配列を差し引いた)である。この融合
蛋白をコードするDNA配列も2つの部分よりなる:s
OmpAペプチドをコードする第一部分と、マウス又は
ヒトob蛋白(これらの天然のシグナル配列を差し引い
た)をコードする第二部分である。sOmpAペプチド
をコードするDNA配列の第一部分は、De Sutter, K.
ら, Gene 141, 163-170 (1994)に記載されたシグナル配
列であり、配列番号7のヌクレオチド配列を有する。こ
の2つの部分よりなるDNA配列の第二部分は、マウス
又はヒトob蛋白をコードし、各々配列番号1又は配列
番号4から、各天然シグナル配列をコードするヌクレオ
チド配列の部分を差し引いたヌクレオチド配列を有す
る。
【0045】配列番号7のsOmpAシグナル配列によ
りコードされるシグナルペプチドは、De Sutter, K. ら
の上記文献に報告されるように、配列番号8のアミノ酸
配列を有する。
りコードされるシグナルペプチドは、De Sutter, K. ら
の上記文献に報告されるように、配列番号8のアミノ酸
配列を有する。
【0046】本発明の新規な発現ベクターは、大腸菌宿
主細胞での組換え蛋白の発現に適切な従来の発現ベクタ
ー中に、プロモーターと、融合蛋白をコードするDNA
配列とを挿入することにより達成される。
主細胞での組換え蛋白の発現に適切な従来の発現ベクタ
ー中に、プロモーターと、融合蛋白をコードするDNA
配列とを挿入することにより達成される。
【0047】本発明によりこの新規な発現ベクターを構
築する際、大腸菌宿主細胞中でのsOmpAペプチドと
ob蛋白とを含む融合蛋白の転写を制御することが可能
である限り、任意のプロモーターを使用することができ
る。sOmpAがシグナルペプチドとして使用される場
合、lac−プロモーター−オペレーター(POlac)と
リポ蛋白プロモーター(Plpp)の両方を使用することが
好ましい。大腸菌におけるこのような発現のために有用
な他のプロモーターとしては、Studier ら, J.Mol. Bio
l. 189, 113-130 (1986) により記載されたT7RNA
ポリメラーゼプロモーター、Lauer, J. Mol. Appl. Gen
et. 1, 139-147 (1981) に記載され、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション(American Type Cultur
e Collection)(ATCC)からATCC37121と
して利用可能なlaczプロモーター、Maniatisの「分
子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor 1982
に記載され、ATCC37138として利用可能なt
acプロモーター、アルカリホスファターゼ(pho
A)プロモーター、及びGoeddel ら, Nucleic Acids Re
search 8, 4057-4075(1980)に記載されたtrpプロモ
ーターが挙げられる。他のプロモーターも発見され、大
腸菌で利用されている。これらのヌクレオチド配列に関
する詳細は公表されており〔Siebenlistら, Cell 20, 2
69-281 (1980) 〕、当業者は本発明の発現ベクター中に
機能的にこれらを連結することが可能である。
築する際、大腸菌宿主細胞中でのsOmpAペプチドと
ob蛋白とを含む融合蛋白の転写を制御することが可能
である限り、任意のプロモーターを使用することができ
る。sOmpAがシグナルペプチドとして使用される場
合、lac−プロモーター−オペレーター(POlac)と
リポ蛋白プロモーター(Plpp)の両方を使用することが
好ましい。大腸菌におけるこのような発現のために有用
な他のプロモーターとしては、Studier ら, J.Mol. Bio
l. 189, 113-130 (1986) により記載されたT7RNA
ポリメラーゼプロモーター、Lauer, J. Mol. Appl. Gen
et. 1, 139-147 (1981) に記載され、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション(American Type Cultur
e Collection)(ATCC)からATCC37121と
して利用可能なlaczプロモーター、Maniatisの「分
子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor 1982
に記載され、ATCC37138として利用可能なt
acプロモーター、アルカリホスファターゼ(pho
A)プロモーター、及びGoeddel ら, Nucleic Acids Re
search 8, 4057-4075(1980)に記載されたtrpプロモ
ーターが挙げられる。他のプロモーターも発見され、大
腸菌で利用されている。これらのヌクレオチド配列に関
する詳細は公表されており〔Siebenlistら, Cell 20, 2
69-281 (1980) 〕、当業者は本発明の発現ベクター中に
機能的にこれらを連結することが可能である。
【0048】具体的には、発現ベクターは: a)プロモーター配列、及びb)配列番号3のマウスo
b蛋白又は配列番号6のヒトob蛋白と、大腸菌の外膜
プロテインAのシグナルペプチドとを含む融合蛋白をコ
ードするDNA配列、を含む。
b蛋白又は配列番号6のヒトob蛋白と、大腸菌の外膜
プロテインAのシグナルペプチドとを含む融合蛋白をコ
ードするDNA配列、を含む。
【0049】次に、この新規な発現ベクターを構築する
方法を記載する。この方法は、実施例で更に詳述し、図
2及び図3に示す。最初に、ヒト又はマウスob遺伝子
のコード配列(その天然シグナル配列を差し引いたも
の)を、プラスミドpT10sOmpArPDIのよう
な、sOmpAシグナル配列を有するプラスミド中に組
み込む。このpT10sOmpArPDIプラスミド、
及びその構築と調製は、De Sutter, K. らの上記文献に
記載されている。このプラスミド中に組み込まれると、
ヒト又はマウスob遺伝子は、このsOmpA遺伝子と
融合して、このプラスミド中に「ハイブリッド遺伝子配
列」を生成する。このsOmpA遺伝子は、ob遺伝子
コード配列の5′領域の上流に存在しなければならな
い。そして、上に列挙したプロモーター、好適にはリポ
蛋白プロモーター(Plpp)及びlac−プロモーター−
オペレーター(POlac)を、ハイブリッド遺伝子配列を
有するこのプラスミド中に組み込んで、本発明の発現ベ
クターを生成する。これらの発現ベクターの2つの実施
態様を、pLPPsOmpA−mob及びpLPPsO
mpA−hob1として同定し、各々図2及び図3に示
す。
方法を記載する。この方法は、実施例で更に詳述し、図
2及び図3に示す。最初に、ヒト又はマウスob遺伝子
のコード配列(その天然シグナル配列を差し引いたも
の)を、プラスミドpT10sOmpArPDIのよう
な、sOmpAシグナル配列を有するプラスミド中に組
み込む。このpT10sOmpArPDIプラスミド、
及びその構築と調製は、De Sutter, K. らの上記文献に
記載されている。このプラスミド中に組み込まれると、
ヒト又はマウスob遺伝子は、このsOmpA遺伝子と
融合して、このプラスミド中に「ハイブリッド遺伝子配
列」を生成する。このsOmpA遺伝子は、ob遺伝子
コード配列の5′領域の上流に存在しなければならな
い。そして、上に列挙したプロモーター、好適にはリポ
蛋白プロモーター(Plpp)及びlac−プロモーター−
オペレーター(POlac)を、ハイブリッド遺伝子配列を
有するこのプラスミド中に組み込んで、本発明の発現ベ
クターを生成する。これらの発現ベクターの2つの実施
態様を、pLPPsOmpA−mob及びpLPPsO
mpA−hob1として同定し、各々図2及び図3に示
す。
【0050】このようなプラスミドを構築するための当
該分野で公知の任意の方法又は手順を使用することがで
きる。更に、sOmpA配列とob遺伝子配列を融合さ
せ、適切なプラスミド中にその遺伝子配列を組み込み、
そしてプロモーターを組み込んで、本発明の発現ベクタ
ーに到達する順序は、決定的に重要ではない。例えば、
sOmpA遺伝子配列を最初にマウス又はヒトob遺伝
子配列に直接融合させてハイブリッド遺伝子配列を生成
し、次にこのハイブリッド配列を、前もって適切なプロ
モーターを組み込んだプラスミド中に挿入することがで
きる。しかし、sOmpA遺伝子配列がマウス又はヒト
ob遺伝子配列の5′末端の上流に位置することは、必
要である。
該分野で公知の任意の方法又は手順を使用することがで
きる。更に、sOmpA配列とob遺伝子配列を融合さ
せ、適切なプラスミド中にその遺伝子配列を組み込み、
そしてプロモーターを組み込んで、本発明の発現ベクタ
ーに到達する順序は、決定的に重要ではない。例えば、
sOmpA遺伝子配列を最初にマウス又はヒトob遺伝
子配列に直接融合させてハイブリッド遺伝子配列を生成
し、次にこのハイブリッド配列を、前もって適切なプロ
モーターを組み込んだプラスミド中に挿入することがで
きる。しかし、sOmpA遺伝子配列がマウス又はヒト
ob遺伝子配列の5′末端の上流に位置することは、必
要である。
【0051】このような新規な発現ベクターを使用する
ことにより、特にsOmpAをコードするシグナル配列
を使用することにより、マウス又はヒトob蛋白が細胞
周辺腔に移動し、そこでシグナルペプチドが適切に切断
されて、完全な(インタクトな)ヒト又はマウスob蛋
白が、可溶性で生物学的に活性な形で生成しうることが
発見された。一旦この細胞周辺腔に入ると、ob蛋白
は、宿主細胞を冷浸透圧ショックに曝すことにより、他
の哺乳動物蛋白を含まない無細胞環境中に効率的に分泌
されて、ここでob蛋白は、生物学的に活性な形で均質
になるまで精製することができる。
ことにより、特にsOmpAをコードするシグナル配列
を使用することにより、マウス又はヒトob蛋白が細胞
周辺腔に移動し、そこでシグナルペプチドが適切に切断
されて、完全な(インタクトな)ヒト又はマウスob蛋
白が、可溶性で生物学的に活性な形で生成しうることが
発見された。一旦この細胞周辺腔に入ると、ob蛋白
は、宿主細胞を冷浸透圧ショックに曝すことにより、他
の哺乳動物蛋白を含まない無細胞環境中に効率的に分泌
されて、ここでob蛋白は、生物学的に活性な形で均質
になるまで精製することができる。
【0052】3)形質転換した大腸菌細胞でのヒト又は
マウスob蛋白の発現: 次に、上記手順により構築した発現ベクターを宿主大腸
菌細胞中に挿入して、大腸菌細胞を形質転換した。英国
特許公報第2,055,382−Aに記載される大腸菌
K−12の294株(ATCC番号31446)のよう
な、任意の株の大腸菌を使用することができる。本発明
に有用な他の菌株としては、大腸菌MC1061〔Casa
daban 及びCohen, J. Mol. Biol. 138, 179-207 (198
0)〕、大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC番号31
537)、及び大腸菌W3110(ATCC番号273
25)、又はその多くが寄託され、公認の微生物寄託機
関から利用可能な他の株を含む。
マウスob蛋白の発現: 次に、上記手順により構築した発現ベクターを宿主大腸
菌細胞中に挿入して、大腸菌細胞を形質転換した。英国
特許公報第2,055,382−Aに記載される大腸菌
K−12の294株(ATCC番号31446)のよう
な、任意の株の大腸菌を使用することができる。本発明
に有用な他の菌株としては、大腸菌MC1061〔Casa
daban 及びCohen, J. Mol. Biol. 138, 179-207 (198
0)〕、大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC番号31
537)、及び大腸菌W3110(ATCC番号273
25)、又はその多くが寄託され、公認の微生物寄託機
関から利用可能な他の株を含む。
【0053】形質転換した大腸菌細胞を適切な細胞密度
まで増殖させて、標準的方法により培養する。形質転換
した大腸菌宿主をこのように増殖させ、培養する際に、
本発明の発現ベクターは、マウス又はヒトob蛋白を効
率的かつ有効に発現させ、これら同蛋白を宿主大腸菌細
胞の細胞周辺腔中に可溶性で生物学的に活性な形で移動
させる。sOmpAシグナルペプチド(即ち、融合蛋白
の第一部分)は、融合蛋白の細胞周辺腔への移動中に切
断されて、他の哺乳動物蛋白又はポリペプチドを含まな
い生物学的に活性なob蛋白が生成される。具体的に
は、他の哺乳動物蛋白を含まない生物学的に活性な組換
えヒト又はマウスob蛋白を製造する方法は、以下の工
程: a)プロモーター配列、及び融合蛋白(この融合蛋白
は、配列番号3又は配列番号6の蛋白と、大腸菌の外膜
プロテインAのシグナルペプチドとを含む)をコードす
るDNA配列を有する発現ベクターを構築し; b)この発現ベクターを大腸菌宿主中に挿入して大腸菌
宿主細胞を形質転換し; c)大腸菌宿主細胞で融合蛋白を発現させ;そしてd)
この大腸菌宿主細胞を冷浸透圧ショック緩衝液で処理し
て、他の哺乳動物蛋白を含まず、かつシグナルペプチド
を含まない、マウス又はヒトob蛋白を遊離させる、工
程を含む。
まで増殖させて、標準的方法により培養する。形質転換
した大腸菌宿主をこのように増殖させ、培養する際に、
本発明の発現ベクターは、マウス又はヒトob蛋白を効
率的かつ有効に発現させ、これら同蛋白を宿主大腸菌細
胞の細胞周辺腔中に可溶性で生物学的に活性な形で移動
させる。sOmpAシグナルペプチド(即ち、融合蛋白
の第一部分)は、融合蛋白の細胞周辺腔への移動中に切
断されて、他の哺乳動物蛋白又はポリペプチドを含まな
い生物学的に活性なob蛋白が生成される。具体的に
は、他の哺乳動物蛋白を含まない生物学的に活性な組換
えヒト又はマウスob蛋白を製造する方法は、以下の工
程: a)プロモーター配列、及び融合蛋白(この融合蛋白
は、配列番号3又は配列番号6の蛋白と、大腸菌の外膜
プロテインAのシグナルペプチドとを含む)をコードす
るDNA配列を有する発現ベクターを構築し; b)この発現ベクターを大腸菌宿主中に挿入して大腸菌
宿主細胞を形質転換し; c)大腸菌宿主細胞で融合蛋白を発現させ;そしてd)
この大腸菌宿主細胞を冷浸透圧ショック緩衝液で処理し
て、他の哺乳動物蛋白を含まず、かつシグナルペプチド
を含まない、マウス又はヒトob蛋白を遊離させる、工
程を含む。
【0054】次に、形質転換した大腸菌細胞の細胞周辺
腔に可溶性で生物学的に活性な状態で組換えにより製造
されたヒト又はマウスob蛋白を、均質になるまで精製
する。
腔に可溶性で生物学的に活性な状態で組換えにより製造
されたヒト又はマウスob蛋白を、均質になるまで精製
する。
【0055】本明細書に記載される手順により細胞の細
胞周辺腔に移動した組換えヒト及びマウスob蛋白は、
当該分野で公知の、Koshland, D.及びBotstein, D., Ce
ll 20, 749-760 (1980) に記載された方法により、宿主
細胞を冷浸透圧ショックに曝すことにより、細胞の外に
効率的に分泌させることができる。冷浸透圧ショックの
使用により、大腸菌からob蛋白が他の哺乳動物蛋白又
はポリペプチドを含まない生物学的に活性な状態で遊離
する。
胞周辺腔に移動した組換えヒト及びマウスob蛋白は、
当該分野で公知の、Koshland, D.及びBotstein, D., Ce
ll 20, 749-760 (1980) に記載された方法により、宿主
細胞を冷浸透圧ショックに曝すことにより、細胞の外に
効率的に分泌させることができる。冷浸透圧ショックの
使用により、大腸菌からob蛋白が他の哺乳動物蛋白又
はポリペプチドを含まない生物学的に活性な状態で遊離
する。
【0056】上記手順により、形質転換した大腸菌細胞
の冷浸透圧ショックにより浸透圧液中に置かれたヒト又
はマウスob蛋白は、生物学的に活性であり、陰イオン
交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用カラム
クロマトグラフィー及びゲル濾過の組合せを使用して、
均質になるまで精製することができる。陰イオン交換及
び疎水性相互作用クロマトグラフィーは、任意の順に実
施することができるが、どちらも必ずゲル濾過の前に使
用しなければならない。
の冷浸透圧ショックにより浸透圧液中に置かれたヒト又
はマウスob蛋白は、生物学的に活性であり、陰イオン
交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用カラム
クロマトグラフィー及びゲル濾過の組合せを使用して、
均質になるまで精製することができる。陰イオン交換及
び疎水性相互作用クロマトグラフィーは、任意の順に実
施することができるが、どちらも必ずゲル濾過の前に使
用しなければならない。
【0057】陰イオン交換工程は、従来法により実施す
ることができる。陰イオン交換クロマトグラフィーに好
ましいカラムは、Qセファロース・ファスト・フロー
(Q Sepharose Fast Flow)カラムである。適切な陰イオ
ン交換クロマトグラフィー媒体としては、ジエチルアミ
ノエチル(DEAE)又はジエチル−(2−ヒドロキシ
プロピル)アミノエチル(QAE)基を含む種々の不溶
性マトリックスが挙げられる。これらのマトリックス
は、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セル
ロース、又は蛋白精製に通常使用される他のタイプのも
のであってよい。陰イオン交換クロマトグラフィーのた
めに特に有用な物質は、DEAE−セファセル〔DEAE-S
ephacel 、ファルマシア(Pharmacia)、ウプサラ、スウ
ェーデン〕である。DEAE基を含む媒体を使用する場
合、マウス又はヒトob蛋白を含有する抽出物は、弱塩
基性pH、例えばpH8.1で適用する。結合したマウス
又はヒトob蛋白は、トリス−HClのような適切な緩
衝液中の塩勾配の適用により、より高度に精製された形
で溶出することができる。一般に、この勾配の特性は、
少量の組換え蛋白を含む予備溶出実験により決定するこ
とができる。
ることができる。陰イオン交換クロマトグラフィーに好
ましいカラムは、Qセファロース・ファスト・フロー
(Q Sepharose Fast Flow)カラムである。適切な陰イオ
ン交換クロマトグラフィー媒体としては、ジエチルアミ
ノエチル(DEAE)又はジエチル−(2−ヒドロキシ
プロピル)アミノエチル(QAE)基を含む種々の不溶
性マトリックスが挙げられる。これらのマトリックス
は、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セル
ロース、又は蛋白精製に通常使用される他のタイプのも
のであってよい。陰イオン交換クロマトグラフィーのた
めに特に有用な物質は、DEAE−セファセル〔DEAE-S
ephacel 、ファルマシア(Pharmacia)、ウプサラ、スウ
ェーデン〕である。DEAE基を含む媒体を使用する場
合、マウス又はヒトob蛋白を含有する抽出物は、弱塩
基性pH、例えばpH8.1で適用する。結合したマウス
又はヒトob蛋白は、トリス−HClのような適切な緩
衝液中の塩勾配の適用により、より高度に精製された形
で溶出することができる。一般に、この勾配の特性は、
少量の組換え蛋白を含む予備溶出実験により決定するこ
とができる。
【0058】陰イオン交換クロマトグラフィーの使用に
より得られたヒト又はマウスob蛋白を含有する物質
を、陰イオン交換クロマトグラフィーを精製の第一工程
として使用する場合、次に疎水性相互作用クロマトグラ
フィーにかける。疎水性相互作用クロマトグラフィー
は、疎水性基を有する荷電していないカラム床物質との
疎水性相互作用の異なる強度に基づいて物質を分離する
分離技術である。典型的には、この疎水性相互作用カラ
ムは、最初に、疎水性結合に適した条件、例えば高イオ
ン強度の条件下で平衡化する。試料を溶出するために下
降する塩勾配を使用することができる。
より得られたヒト又はマウスob蛋白を含有する物質
を、陰イオン交換クロマトグラフィーを精製の第一工程
として使用する場合、次に疎水性相互作用クロマトグラ
フィーにかける。疎水性相互作用クロマトグラフィー
は、疎水性基を有する荷電していないカラム床物質との
疎水性相互作用の異なる強度に基づいて物質を分離する
分離技術である。典型的には、この疎水性相互作用カラ
ムは、最初に、疎水性結合に適した条件、例えば高イオ
ン強度の条件下で平衡化する。試料を溶出するために下
降する塩勾配を使用することができる。
【0059】任意の疎水性相互作用カラムを使用するこ
とができる。好適な疎水性カラムは、フェニルセファロ
ースであるが、ブチルセファロースも利用することがで
きる。本発明にしたがうと、陰イオンカラムから溶出さ
れた組換えマウス又はヒトob蛋白を含有する物質を、
フェニルセファロースのような比較的強疎水性のゲルを
含有するカラムにかける。疎水性ゲルとの疎水性相互作
用を促進するために、例えば、0.4M 以上の硫酸アン
モニウム(0.4M が好適である)を含有する溶媒を使
用する。即ち、カラム及び試料を、50mMトリス緩衝液
中0.4M 硫酸アンモニウムに調整し、試料をカラムに
適用する。このカラムを、0.4M 硫酸アンモニウム緩
衝液で洗浄する。次にob蛋白を、例えば、下降する塩
勾配、エチレン若しくはプロピレングリコール、又は尿
素のような疎水性相互作用を減衰させる溶媒で溶出す
る。好適な実施態様は、トリス緩衝液と、20%エチレ
ングリコールを含有するトリス緩衝液とでカラムを連続
的に洗浄することを含む。続いて、ob蛋白を、トリス
緩衝液中の低下する硫酸アンモニウム濃度と増加するエ
チレングリコール濃度の勾配でカラムから溶出する。任
意の順序の、陰イオン交換クロマトグラフィーと疎水性
相互作用カラムクロマトグラフィーとの集合的かつ逐次
の使用により、通常操作で概算90%の純度のヒト又は
マウスob蛋白が得られる。
とができる。好適な疎水性カラムは、フェニルセファロ
ースであるが、ブチルセファロースも利用することがで
きる。本発明にしたがうと、陰イオンカラムから溶出さ
れた組換えマウス又はヒトob蛋白を含有する物質を、
フェニルセファロースのような比較的強疎水性のゲルを
含有するカラムにかける。疎水性ゲルとの疎水性相互作
用を促進するために、例えば、0.4M 以上の硫酸アン
モニウム(0.4M が好適である)を含有する溶媒を使
用する。即ち、カラム及び試料を、50mMトリス緩衝液
中0.4M 硫酸アンモニウムに調整し、試料をカラムに
適用する。このカラムを、0.4M 硫酸アンモニウム緩
衝液で洗浄する。次にob蛋白を、例えば、下降する塩
勾配、エチレン若しくはプロピレングリコール、又は尿
素のような疎水性相互作用を減衰させる溶媒で溶出す
る。好適な実施態様は、トリス緩衝液と、20%エチレ
ングリコールを含有するトリス緩衝液とでカラムを連続
的に洗浄することを含む。続いて、ob蛋白を、トリス
緩衝液中の低下する硫酸アンモニウム濃度と増加するエ
チレングリコール濃度の勾配でカラムから溶出する。任
意の順序の、陰イオン交換クロマトグラフィーと疎水性
相互作用カラムクロマトグラフィーとの集合的かつ逐次
の使用により、通常操作で概算90%の純度のヒト又は
マウスob蛋白が得られる。
【0060】上に略述した陰イオン交換クロマトグラフ
ィー及び疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー工程
に続いて、ゲル濾過クロマトグラフィーを行うが、これ
は従来のあらゆるゲル濾過手順により行うことができ
る。疎水性相互作用カラム、又は陰イオン交換カラム
(どちらのカラムを最後に使用しても)から溶出された
ob蛋白を、カットオフ分子量10,000の膜〔アミ
コン−YM10(AMICON-YM10)膜〕を使用することによ
り、濃縮透析して小容量にすることができる。次に、こ
の濃縮した物質を、G100−セファデックス〔ファル
マシア(Pharmacia)、ウプサラ、スウェーデン〕のよう
なゲル濾過媒体を含有するカラムにかけることができ
る。次にob蛋白を、SDS−PAGEを使用する標準
的技術により、分子量に基づいて他の夾雑物から分離す
ることができる。
ィー及び疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー工程
に続いて、ゲル濾過クロマトグラフィーを行うが、これ
は従来のあらゆるゲル濾過手順により行うことができ
る。疎水性相互作用カラム、又は陰イオン交換カラム
(どちらのカラムを最後に使用しても)から溶出された
ob蛋白を、カットオフ分子量10,000の膜〔アミ
コン−YM10(AMICON-YM10)膜〕を使用することによ
り、濃縮透析して小容量にすることができる。次に、こ
の濃縮した物質を、G100−セファデックス〔ファル
マシア(Pharmacia)、ウプサラ、スウェーデン〕のよう
なゲル濾過媒体を含有するカラムにかけることができ
る。次にob蛋白を、SDS−PAGEを使用する標準
的技術により、分子量に基づいて他の夾雑物から分離す
ることができる。
【0061】陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性
相互作用カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過の集合
的かつ逐次の使用により、通常操作で95%の純度のヒ
ト又はマウスob蛋白が得られる。
相互作用カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過の集合
的かつ逐次の使用により、通常操作で95%の純度のヒ
ト又はマウスob蛋白が得られる。
【0062】この精製マウス又はヒトob蛋白のN−末
端アミノ酸配列決定は、例えば、Laemli, U.K., Nature
227, 680-685 (1970)の方法による電気的トランスファ
ー(electrotransfer)、又はMatsudaira, P., J. Biol.
Chem. 262, 10035-10038 (1987)により記載された手順
などの、当該分野で公知の方法により実施することがで
きる。内部配列決定も、当該分野で公知の方法により行
うことができる。例えば、エンドプロテイナーゼのリシ
ンC(Lysine C)によるMバンド(ニトロセルロース
上)の消化によりペプチド断片を生成させ、HPLC系
により分離することができる。
端アミノ酸配列決定は、例えば、Laemli, U.K., Nature
227, 680-685 (1970)の方法による電気的トランスファ
ー(electrotransfer)、又はMatsudaira, P., J. Biol.
Chem. 262, 10035-10038 (1987)により記載された手順
などの、当該分野で公知の方法により実施することがで
きる。内部配列決定も、当該分野で公知の方法により行
うことができる。例えば、エンドプロテイナーゼのリシ
ンC(Lysine C)によるMバンド(ニトロセルロース
上)の消化によりペプチド断片を生成させ、HPLC系
により分離することができる。
【0063】本発明の精製したヒト及びマウスob蛋白
の生物学的活性は、このob蛋白をヒト患者又はマウス
に頻繁に注射により投与すると、注射をしない、即ち対
照群の被験体に比較して、食物摂取が低下し、体重増加
速度が低下するというものである。
の生物学的活性は、このob蛋白をヒト患者又はマウス
に頻繁に注射により投与すると、注射をしない、即ち対
照群の被験体に比較して、食物摂取が低下し、体重増加
速度が低下するというものである。
【0064】本発明により得られる精製されたヒト及び
マウスob蛋白又はその断片の生物学的活性は、日常的
方法、例えば、実施例13及び16に詳述されるよう
な、Haley, T.J. らの上記文献の手順による、ob/o
bマウスにおける繰り返し又は単一の脳室内(ICV)
注射により、試験することができる。このICV試験に
基づき、食物摂取を低下させるED50と、体重増加を低
下させるED50とを測定することができる。更に、精製
されたヒト及びマウスob蛋白又はその断片の生物学的
活性は、実施例15に詳述されるように、ob/obマ
ウスにおける繰り返しIP注射により測定することがで
きる。IP試験に基づき、食物摂取を低下させるED20
と、体重増加を低下させるED20とを測定することがで
きる。
マウスob蛋白又はその断片の生物学的活性は、日常的
方法、例えば、実施例13及び16に詳述されるよう
な、Haley, T.J. らの上記文献の手順による、ob/o
bマウスにおける繰り返し又は単一の脳室内(ICV)
注射により、試験することができる。このICV試験に
基づき、食物摂取を低下させるED50と、体重増加を低
下させるED50とを測定することができる。更に、精製
されたヒト及びマウスob蛋白又はその断片の生物学的
活性は、実施例15に詳述されるように、ob/obマ
ウスにおける繰り返しIP注射により測定することがで
きる。IP試験に基づき、食物摂取を低下させるED20
と、体重増加を低下させるED20とを測定することがで
きる。
【0065】本発明により得られる精製されたヒト及び
マウスob蛋白又はその断片の生物学的活性はまた、ヒ
トで、当該分野で公知の方法により、例えば、Muurahai
nen,N.E. ら, Am. J. Physiol. 260, 672-680 (1991)
の方法により、また実施例14及び17に詳述するよう
に、生理食塩水のIV投与対照と比較した、肥満ヒト被
験者へのob蛋白のIV投与後の試験食摂取の低下を測
定することにより、測定することができる。あるいは、
本発明の精製されたマウス及びヒトob蛋白の体重増加
速度を低下させる能力(例えば、体重減少を誘導する)
は、実施例18に詳述するように、Drent, M.L. ら, In
t. J. Obesity 19, 221-226 (1995)の方法により、肥満
ヒト被験者への繰り返しIV投与により測定することが
できる。
マウスob蛋白又はその断片の生物学的活性はまた、ヒ
トで、当該分野で公知の方法により、例えば、Muurahai
nen,N.E. ら, Am. J. Physiol. 260, 672-680 (1991)
の方法により、また実施例14及び17に詳述するよう
に、生理食塩水のIV投与対照と比較した、肥満ヒト被
験者へのob蛋白のIV投与後の試験食摂取の低下を測
定することにより、測定することができる。あるいは、
本発明の精製されたマウス及びヒトob蛋白の体重増加
速度を低下させる能力(例えば、体重減少を誘導する)
は、実施例18に詳述するように、Drent, M.L. ら, In
t. J. Obesity 19, 221-226 (1995)の方法により、肥満
ヒト被験者への繰り返しIV投与により測定することが
できる。
【0066】本発明により精製する場合、本発明のマウ
ス及びヒトob蛋白は、下記の生物学的活性を有する: 1)16〜18時間絶食させた、体重が少なくとも30
グラムの成熟肥満ob/obマウスに、Haley 及びMcCo
rmick の上記文献の方法を使用して20μg 以下の用量
で脳室内(ICV)注射によりこれらを投与する場合、
その蛋白又はポリペプチドが: (a)5時間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注
射した対照マウスに比較して50%低下させ(食物摂取
を低下させるED50);かつ (b)ICV注射から24時間の間の体重増加を、賦形
剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも50%低
下させる(体重増加を低下させるED50); そして 2)絶食させていない、体重が少なくとも30グラムの
成熟ob/obマウスに、20μg 以下の全1日用量
で、1週間、1日に2回、明相の開始時点と暗相の3時
間の時点とにこれらを腹腔内(IP)投与する場合、そ
の蛋白又はポリペプチドが: (a)5及び24時間食物摂取を、賦形剤を注射した対
照マウスに比較して少なくとも20%低下させ(食物摂
取を低下させるED20);かつ (b)最初のIP注射から24時間の間の体重増加を、
賦形剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも20
%低下させる(体重増加を低下させるED20)。
ス及びヒトob蛋白は、下記の生物学的活性を有する: 1)16〜18時間絶食させた、体重が少なくとも30
グラムの成熟肥満ob/obマウスに、Haley 及びMcCo
rmick の上記文献の方法を使用して20μg 以下の用量
で脳室内(ICV)注射によりこれらを投与する場合、
その蛋白又はポリペプチドが: (a)5時間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注
射した対照マウスに比較して50%低下させ(食物摂取
を低下させるED50);かつ (b)ICV注射から24時間の間の体重増加を、賦形
剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも50%低
下させる(体重増加を低下させるED50); そして 2)絶食させていない、体重が少なくとも30グラムの
成熟ob/obマウスに、20μg 以下の全1日用量
で、1週間、1日に2回、明相の開始時点と暗相の3時
間の時点とにこれらを腹腔内(IP)投与する場合、そ
の蛋白又はポリペプチドが: (a)5及び24時間食物摂取を、賦形剤を注射した対
照マウスに比較して少なくとも20%低下させ(食物摂
取を低下させるED20);かつ (b)最初のIP注射から24時間の間の体重増加を、
賦形剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも20
%低下させる(体重増加を低下させるED20)。
【0067】更に、この体重と食物摂取の低下は、20
μg 未満の用量でさえ起こり、特にこれらの蛋白が均質
になるまで精製されている場合には、1μg 以下のIC
V投与用量レベルでさえ起こる。
μg 未満の用量でさえ起こり、特にこれらの蛋白が均質
になるまで精製されている場合には、1μg 以下のIC
V投与用量レベルでさえ起こる。
【0068】ヒト及び/又はマウスob蛋白の生物学的
活性を測定するための、上記の、実施例で詳述する生物
学的検定は、これらの蛋白の断片(これらの断片が、o
b蛋白の分解、化学合成、ob蛋白の部分DNA配列の
組換え蛋白の発現、又は当業者に公知の任意の他の方法
のいずれにより製造されるものであるかに関わらない)
の生物学的活性を測定するために使用することができ
る。
活性を測定するための、上記の、実施例で詳述する生物
学的検定は、これらの蛋白の断片(これらの断片が、o
b蛋白の分解、化学合成、ob蛋白の部分DNA配列の
組換え蛋白の発現、又は当業者に公知の任意の他の方法
のいずれにより製造されるものであるかに関わらない)
の生物学的活性を測定するために使用することができ
る。
【0069】本発明の別の実施態様によれば、本発明の
マウス及びヒトob蛋白は、ポリエチレン又はポリプロ
ピレングリコールホモポリマーと結合させることができ
る。これらのポリマーは、非置換であるか、又はその一
方の端の1つのヒドロキシ基のエーテル化により低級ア
ルキル基により置換されていてもよい。これらのコンジ
ュゲートは、安定な形のob蛋白を提供し、これらの蛋
白の半減期を改善する。更に、ポリエチレングリコール
又はポリプロピレングリコールホモポリマーから形成さ
れるこれらのコンジュゲートの使用は、体内におけるo
b蛋白の活性の半減期を増大させるための手段を提供す
る。更に、これらのコンジュゲートは、体内における治
療用ob蛋白の安定性及び循環時間を増加させ、また一
方ではob蛋白の免疫原性を低下させるというような、
更なる利点を提供することが見い出された。これらのP
EG化ob蛋白はまた、ヒト体内に容易に吸収されて、
血液系における取り込みの増加を提供することができ
る。
マウス及びヒトob蛋白は、ポリエチレン又はポリプロ
ピレングリコールホモポリマーと結合させることができ
る。これらのポリマーは、非置換であるか、又はその一
方の端の1つのヒドロキシ基のエーテル化により低級ア
ルキル基により置換されていてもよい。これらのコンジ
ュゲートは、安定な形のob蛋白を提供し、これらの蛋
白の半減期を改善する。更に、ポリエチレングリコール
又はポリプロピレングリコールホモポリマーから形成さ
れるこれらのコンジュゲートの使用は、体内におけるo
b蛋白の活性の半減期を増大させるための手段を提供す
る。更に、これらのコンジュゲートは、体内における治
療用ob蛋白の安定性及び循環時間を増加させ、また一
方ではob蛋白の免疫原性を低下させるというような、
更なる利点を提供することが見い出された。これらのP
EG化ob蛋白はまた、ヒト体内に容易に吸収されて、
血液系における取り込みの増加を提供することができ
る。
【0070】ob蛋白に結合される好適なポリエチレン
又はポリプロピレングリコールホモポリマーは、約15
〜60kDa の分子量を有し、ポリエチレン又はポリプロ
ピレングリコール分子によりモノ−又はポリ−PEG化
された蛋白を製造する。好適な場合には、ob蛋白は、
ポリエチレン又はポリプロピレングリコール単位により
モノ−又はジ−PEG化されたコンジュゲートを形成す
るが、このコンジュゲート中のこれらの単位は、15〜
60kDa 、最も好適には35〜45kDa の総分子量を有
する。一般に、ポリエチレン及びポリプロピレングリコ
ール出発物質は、異なる分子量を有する異なるホモポリ
マーの混合物として市販されているため、このコンジュ
ゲートは、ポリエチレン及びポリプロピレングリコール
コンジュゲートの混合物(組成物)として製造される。
上述の分子量は、このように製造されるobコンジュゲ
ートの混合物の平均分子量である。これらの混合物は、
望ましい場合には、HPLCを含むカラムクロマトグラ
フィーのような従来法により、個々のコンジュゲートに
分離することができる。しかし、治療のためには、一般
にこのコンジュゲートは混合物として使用される。
又はポリプロピレングリコールホモポリマーは、約15
〜60kDa の分子量を有し、ポリエチレン又はポリプロ
ピレングリコール分子によりモノ−又はポリ−PEG化
された蛋白を製造する。好適な場合には、ob蛋白は、
ポリエチレン又はポリプロピレングリコール単位により
モノ−又はジ−PEG化されたコンジュゲートを形成す
るが、このコンジュゲート中のこれらの単位は、15〜
60kDa 、最も好適には35〜45kDa の総分子量を有
する。一般に、ポリエチレン及びポリプロピレングリコ
ール出発物質は、異なる分子量を有する異なるホモポリ
マーの混合物として市販されているため、このコンジュ
ゲートは、ポリエチレン及びポリプロピレングリコール
コンジュゲートの混合物(組成物)として製造される。
上述の分子量は、このように製造されるobコンジュゲ
ートの混合物の平均分子量である。これらの混合物は、
望ましい場合には、HPLCを含むカラムクロマトグラ
フィーのような従来法により、個々のコンジュゲートに
分離することができる。しかし、治療のためには、一般
にこのコンジュゲートは混合物として使用される。
【0071】ポリエチレングリコール又はポリプロピレ
ングリコールポリマー〔PEG〕は、任意の従来法によ
り、蛋白の遊離のN−末端アミノ酸を介してob蛋白に
結合してコンジュゲートを形成することができる。ob
蛋白とのコンジュゲートを形成するためのポリエチレン
又はポリプロピレングリコールの結合方法は、利用可能
な数多くの公知方法の任意の方法であってよい。ポリエ
チレン又はポリプロピレングリコールは、蛋白のN−末
端アミノ酸を介して、更にはまたob蛋白上の種々のリ
シン残基を介して共有結合させてもよい。
ングリコールポリマー〔PEG〕は、任意の従来法によ
り、蛋白の遊離のN−末端アミノ酸を介してob蛋白に
結合してコンジュゲートを形成することができる。ob
蛋白とのコンジュゲートを形成するためのポリエチレン
又はポリプロピレングリコールの結合方法は、利用可能
な数多くの公知方法の任意の方法であってよい。ポリエ
チレン又はポリプロピレングリコールは、蛋白のN−末
端アミノ酸を介して、更にはまたob蛋白上の種々のリ
シン残基を介して共有結合させてもよい。
【0072】更に、ポリエチレン又はポリプロピレング
リコールホモポリマーは、二官能性又は多官能性連結基
によりob蛋白に結合させてもよい。モノ−ポリエチレ
ン又はポリプロピレングリコールホモポリマーコンジュ
ゲートを製造する際、二官能性リンカーが使用され、ホ
モポリマーは、このリンカーの1つの官能基に結合し、
一方、ob蛋白のN−末端アミノ酸及びリシン基は、こ
のリンカーの他の官能基に結合することができる。ob
蛋白とのトリ−又はポリ−〔ポリエチレン又はポリプロ
ピレングリコール〕ポリマーコンジュゲートは、三官能
性又は多官能性リンカーを使用して形成される。このホ
モポリマーは、2つ以上のこれらの官能基に結合するこ
とができ、リンカーの残りの1つの官能基にob蛋白が
結合することができる。これらのリンカーには、アミン
及びカルボキシ官能基を有する多官能性リンカーがあ
る。アミン基は、ポリエチレン又はポリプロピレングリ
コールの官能基化されたヒドロキシ基と結合して、アミ
ド結合を形成することができる。カルボキシ基は、ob
蛋白上のアミン基と結合してアミド結合を形成し、グリ
コール上の官能基化されたヒドロキシ基と結合してエス
テルを形成することができる。ob蛋白とPEGとのコ
ンジュゲートを形成するために使用することができる多
くのタイプの連結基には、米国特許第4,902,50
2号、5,034,514号、4,609,546号、
5,122,614号及び4,847,325号に開示
されているものなどがある。
リコールホモポリマーは、二官能性又は多官能性連結基
によりob蛋白に結合させてもよい。モノ−ポリエチレ
ン又はポリプロピレングリコールホモポリマーコンジュ
ゲートを製造する際、二官能性リンカーが使用され、ホ
モポリマーは、このリンカーの1つの官能基に結合し、
一方、ob蛋白のN−末端アミノ酸及びリシン基は、こ
のリンカーの他の官能基に結合することができる。ob
蛋白とのトリ−又はポリ−〔ポリエチレン又はポリプロ
ピレングリコール〕ポリマーコンジュゲートは、三官能
性又は多官能性リンカーを使用して形成される。このホ
モポリマーは、2つ以上のこれらの官能基に結合するこ
とができ、リンカーの残りの1つの官能基にob蛋白が
結合することができる。これらのリンカーには、アミン
及びカルボキシ官能基を有する多官能性リンカーがあ
る。アミン基は、ポリエチレン又はポリプロピレングリ
コールの官能基化されたヒドロキシ基と結合して、アミ
ド結合を形成することができる。カルボキシ基は、ob
蛋白上のアミン基と結合してアミド結合を形成し、グリ
コール上の官能基化されたヒドロキシ基と結合してエス
テルを形成することができる。ob蛋白とPEGとのコ
ンジュゲートを形成するために使用することができる多
くのタイプの連結基には、米国特許第4,902,50
2号、5,034,514号、4,609,546号、
5,122,614号及び4,847,325号に開示
されているものなどがある。
【0073】本発明の特に好適な実施態様によるコンジ
ュゲートは、式(I−A)及び(I−B):
ュゲートは、式(I−A)及び(I−B):
【0074】
【化3】
【0075】(式中、Pは、本明細書記載のマウス又は
ヒトob蛋白であり;n及びn′は、全PEG単位の平
均分子量が15kDa 〜60kDa で、かつ、このコンジュ
ゲートの総分子量が30kDa 〜80kDa になるように、
合計が300〜1,500の整数であり;R及びR′
は、低級アルキルである)で示される。
ヒトob蛋白であり;n及びn′は、全PEG単位の平
均分子量が15kDa 〜60kDa で、かつ、このコンジュ
ゲートの総分子量が30kDa 〜80kDa になるように、
合計が300〜1,500の整数であり;R及びR′
は、低級アルキルである)で示される。
【0076】式(I−A)及び(I−B)の化合物は、
式(II−A)及び(II−B):
式(II−A)及び(II−B):
【0077】
【化4】
【0078】で示される公知のポリマー物質から、これ
らを本発明のマウス又はヒトob蛋白と縮合させること
により、調製することができる。活性エステルとアミン
とを反応させてアミドを形成する任意の従来法を使用す
ることができる。上で説明した反応において、例示した
スクシンイミジルエステルは、アミド形成を起こす脱離
基である。式(I−B)の化合物を製造するために式
(II−B)の化合物を使用する場合、本発明のマウス又
はヒトob蛋白との反応は、式(I−A)の化合物への
式(II−A)の化合物の変換に関連して記載されるのと
同じように実施される。蛋白とのコンジュゲートを製造
するための、式(II−A)の化合物のようなこれらのス
クシンイミジルエステルは、Monfardiniら, Bioconjuga
te Chem., 6,62-69 (1995) に開示されている。
らを本発明のマウス又はヒトob蛋白と縮合させること
により、調製することができる。活性エステルとアミン
とを反応させてアミドを形成する任意の従来法を使用す
ることができる。上で説明した反応において、例示した
スクシンイミジルエステルは、アミド形成を起こす脱離
基である。式(I−B)の化合物を製造するために式
(II−B)の化合物を使用する場合、本発明のマウス又
はヒトob蛋白との反応は、式(I−A)の化合物への
式(II−A)の化合物の変換に関連して記載されるのと
同じように実施される。蛋白とのコンジュゲートを製造
するための、式(II−A)の化合物のようなこれらのス
クシンイミジルエステルは、Monfardiniら, Bioconjuga
te Chem., 6,62-69 (1995) に開示されている。
【0079】式(I−A)の化合物の場合、PEG単位
の総平均分子量が15〜60kDa 、好適には35〜45
kDa であるコンジュゲートとなるように、nとn′の合
計は、300〜1,500である。式(I−A)の好適
な実施態様において、nとn′の合計は約800〜1,
200であり、nとn′の平均合計は850〜1,00
0である。一般に、式(I−A)及び(II−A)の化合
物中のn′に対するnの好適な比は、0.5〜1.5で
あり、0.8〜1.2が好適である。式(I−B)の化
合物の場合、総分子量15〜60kDa 、好適には35〜
45kDa の、300〜1,500のPEG単位を有する
化合物を製造するために、nは、好適には300〜1,
500の間である。好適な実施態様において、nは約8
50〜1,000である。
の総平均分子量が15〜60kDa 、好適には35〜45
kDa であるコンジュゲートとなるように、nとn′の合
計は、300〜1,500である。式(I−A)の好適
な実施態様において、nとn′の合計は約800〜1,
200であり、nとn′の平均合計は850〜1,00
0である。一般に、式(I−A)及び(II−A)の化合
物中のn′に対するnの好適な比は、0.5〜1.5で
あり、0.8〜1.2が好適である。式(I−B)の化
合物の場合、総分子量15〜60kDa 、好適には35〜
45kDa の、300〜1,500のPEG単位を有する
化合物を製造するために、nは、好適には300〜1,
500の間である。好適な実施態様において、nは約8
50〜1,000である。
【0080】本発明により製造されるヒト又はマウスo
b蛋白は、当該分野で公知の方法により、薬剤学的に許
容しうる融和性の賦形剤又は賦形剤と共に、注射に適し
た薬剤組成物として調製してもよい。任意の従来の賦形
剤物質を使用することができる。賦形剤物質は、経腸、
経皮又は非経口投与に適した、有機又は無機のものであ
ってよい。適切な賦形剤としては、水、ゼラチン、アラ
ビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネ
シウム、タルク、植物油、ポリアルキレン−グリコー
ル、石油ゼリー(ワセリン)などが挙げられる。更に、
この薬剤調製物は、他の薬剤学的に活性な薬剤を含有し
てもよい。香料、保存料、安定剤、乳化剤、緩衝剤など
のような更なる添加物を、調剤の許容される慣例にした
がって添加することができる。本発明の均質なob蛋白
を処方するのに好適な賦形剤には、ヒト血清アルブミ
ン、ヒト血漿蛋白などがある。
b蛋白は、当該分野で公知の方法により、薬剤学的に許
容しうる融和性の賦形剤又は賦形剤と共に、注射に適し
た薬剤組成物として調製してもよい。任意の従来の賦形
剤物質を使用することができる。賦形剤物質は、経腸、
経皮又は非経口投与に適した、有機又は無機のものであ
ってよい。適切な賦形剤としては、水、ゼラチン、アラ
ビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネ
シウム、タルク、植物油、ポリアルキレン−グリコー
ル、石油ゼリー(ワセリン)などが挙げられる。更に、
この薬剤調製物は、他の薬剤学的に活性な薬剤を含有し
てもよい。香料、保存料、安定剤、乳化剤、緩衝剤など
のような更なる添加物を、調剤の許容される慣例にした
がって添加することができる。本発明の均質なob蛋白
を処方するのに好適な賦形剤には、ヒト血清アルブミ
ン、ヒト血漿蛋白などがある。
【0081】均質な組換えob蛋白(それがヒト由来又
はマウス由来、あるいはその組み合わせであろうと)の
投与は、肥満のヒト及び動物において食物摂取の低下と
体重減少をもたらす。したがって、ob蛋白の投与は、
体重の調節において重要であるこの蛋白を補給する。ヒ
ト又はマウスob蛋白を含有する薬剤組成物は、単独で
又はII型糖尿病のような有害な症状若しくは疾患の一部
として体重が異常に変動するヒト又は動物患者に、種々
の手段により投与するのに有効な濃度で、処方すること
ができる。注射による種々の投与法を使用することがで
き、これらには、皮下、静脈内及び腹腔内注射が含まれ
る。ob蛋白の平均量は、変化させることができ、特
に、資格を有する医師又は獣医師の推奨と処方に基づく
べきである。
はマウス由来、あるいはその組み合わせであろうと)の
投与は、肥満のヒト及び動物において食物摂取の低下と
体重減少をもたらす。したがって、ob蛋白の投与は、
体重の調節において重要であるこの蛋白を補給する。ヒ
ト又はマウスob蛋白を含有する薬剤組成物は、単独で
又はII型糖尿病のような有害な症状若しくは疾患の一部
として体重が異常に変動するヒト又は動物患者に、種々
の手段により投与するのに有効な濃度で、処方すること
ができる。注射による種々の投与法を使用することがで
き、これらには、皮下、静脈内及び腹腔内注射が含まれ
る。ob蛋白の平均量は、変化させることができ、特
に、資格を有する医師又は獣医師の推奨と処方に基づく
べきである。
【0082】本発明により調製されたヒト又はマウスo
b蛋白はまた、ob蛋白受容体(レセプター)を同定す
るためのスクリーニング法において使用することもでき
る。
b蛋白はまた、ob蛋白受容体(レセプター)を同定す
るためのスクリーニング法において使用することもでき
る。
【0083】
【実施例】以下に与える実施例は、本発明をなんら限定
しようとするものではない。
しようとするものではない。
【0084】実施例1 ヒトobのcDNAの取得 ヒト脂肪細胞組織由来RNAから作成された、市販のラ
ムダファージcDNAライブラリー(「クローンテク
(Clontech)」)のスクリーニングにより、ヒトobの
cDNAを得た。このライブラリーから、ラムダファー
ジライブラリーのハイブリダイゼーションにより、ヒト
obのcDNA配列に対応する各々約2.5キロベース
の断片を含有する2つのラムダファージを得た。この技
術により、2つのクローン(即ち、hob1−cDNA
及びhob2−cDNA)を同定した。このヒトob遺
伝子を、ストラタジーン(Stratagene)から市販されて
いるプラスミドベクターDNAのpBluescriptSk- に
サブクローニングした。これらのヒトob遺伝子配列を
有する得られたベクターを、pBluescriptSk- hob
1及びpBluescriptSk- hob2と呼んだ。
ムダファージcDNAライブラリー(「クローンテク
(Clontech)」)のスクリーニングにより、ヒトobの
cDNAを得た。このライブラリーから、ラムダファー
ジライブラリーのハイブリダイゼーションにより、ヒト
obのcDNA配列に対応する各々約2.5キロベース
の断片を含有する2つのラムダファージを得た。この技
術により、2つのクローン(即ち、hob1−cDNA
及びhob2−cDNA)を同定した。このヒトob遺
伝子を、ストラタジーン(Stratagene)から市販されて
いるプラスミドベクターDNAのpBluescriptSk- に
サブクローニングした。これらのヒトob遺伝子配列を
有する得られたベクターを、pBluescriptSk- hob
1及びpBluescriptSk- hob2と呼んだ。
【0085】このpBluescriptSk- hob1及びpBl
uescriptSk- hob2中のヒトob遺伝子配列を、ヌ
クレオチド配列決定により確認した。ヌクレオチド配列
決定から推測される蛋白のアミノ酸配列は、配列番号4
によりコードされるヒトob蛋白に対応し、Zhang, Y.
らの上記文献に発表されたとおりであった。pBluescri
ptSk- hob1は、hob1のcDNAの終結コドン
後にT−C突然変異を有していた。この突然変異によ
り、下記のように、これがなければhob1のヌクレオ
チド配列中に存在することが予測されたStuI制限部
位が喪失した:
uescriptSk- hob2中のヒトob遺伝子配列を、ヌ
クレオチド配列決定により確認した。ヌクレオチド配列
決定から推測される蛋白のアミノ酸配列は、配列番号4
によりコードされるヒトob蛋白に対応し、Zhang, Y.
らの上記文献に発表されたとおりであった。pBluescri
ptSk- hob1は、hob1のcDNAの終結コドン
後にT−C突然変異を有していた。この突然変異によ
り、下記のように、これがなければhob1のヌクレオ
チド配列中に存在することが予測されたStuI制限部
位が喪失した:
【0086】hob1 ...GGG.TGC.TGA GGCCT TGA... Gly Cys 終結pBluescriptSk - −hob1 ...GGG.TGC.TGA GGCCC TGA... Gly Cys 終結pBluescriptSk - −hob2 ...GGG.TGC.TGA GGCCT TGA Gly Cys 終結
【0087】pBluescriptSk- hob1のこの突然変
異は、ヒトobのcDNA配列の終結コドンの後に位置
するため、Zhang, Y. らの上記文献により発表されたと
おりの、ヒトob蛋白のアミノ酸配列に変化を起こさな
かった。
異は、ヒトobのcDNA配列の終結コドンの後に位置
するため、Zhang, Y. らの上記文献により発表されたと
おりの、ヒトob蛋白のアミノ酸配列に変化を起こさな
かった。
【0088】pBluescriptSk- hob2に存在するc
DNAのヌクレオチド配列に関する限り、制限酵素解析
により、このプラスミドが、ヒトobのcDNA配列の
終結コドンの後に位置するStuI制限部位を有するこ
とが明らかになった。
DNAのヌクレオチド配列に関する限り、制限酵素解析
により、このプラスミドが、ヒトobのcDNA配列の
終結コドンの後に位置するStuI制限部位を有するこ
とが明らかになった。
【0089】pBluescriptSk- hob1が終結コドン
に続くStuI制限部位に突然変異を有するという事実
に加えて、pBluescriptSk- hob1はまた、hob
1のcDNA中のORFの後にEcoRI制限部位を有
しており、これはhob2のcDNAには存在しない
(図1参照)。
に続くStuI制限部位に突然変異を有するという事実
に加えて、pBluescriptSk- hob1はまた、hob
1のcDNA中のORFの後にEcoRI制限部位を有
しており、これはhob2のcDNAには存在しない
(図1参照)。
【0090】実施例2 マウスob蛋白(mob)のプラスミド構築 配列番号1のマウスobのcDNAを、Zhang, Y. らの
上記文献の方法により得、これをインビトロジェン(In
vitrogen)(カリフォルニア州サンディエゴ、米国)か
ら市販されているpCDNA3ベクターに挿入した。次
に、得られたマウスob遺伝子を使用して、マウスob
蛋白(mob)の発現のための発現ベクターpLPPs
OmpA−mobを構築した。この発現ベクターとその
構築は、図2に詳述する。
上記文献の方法により得、これをインビトロジェン(In
vitrogen)(カリフォルニア州サンディエゴ、米国)か
ら市販されているpCDNA3ベクターに挿入した。次
に、得られたマウスob遺伝子を使用して、マウスob
蛋白(mob)の発現のための発現ベクターpLPPs
OmpA−mobを構築した。この発現ベクターとその
構築は、図2に詳述する。
【0091】構築の第一工程は、マウスob遺伝子の成
熟コード領域(即ち、その天然のシグナル配列を含まな
い)へのsOmpA遺伝子からのシグナルコード配列の
融合を達成することであった。pCDNA3ベクターに
挿入された成熟マウスob蛋白をコードする501bpの
DNA断片を、ベントDNAポリメラーゼ(Vent DNApo
lymerase)〔ニューイングランド・バイオラボ(New Eng
land Biolabs)〕、バリン(これは成熟mob中の最初
のアミノ酸である)をコードするコドンの最初のヌクレ
オチドから開始するフォワードプライマー(プライマー
1)(Zhang, Y. らの上記文献)、及びmobの終結コ
ドンを含有するmobの領域に対応するリバースプライ
マー(プライマー2)を使用して、このベクターから、
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。プラ
イマー2は、HindIII 制限部位に対応する配列も含
有していた。
熟コード領域(即ち、その天然のシグナル配列を含まな
い)へのsOmpA遺伝子からのシグナルコード配列の
融合を達成することであった。pCDNA3ベクターに
挿入された成熟マウスob蛋白をコードする501bpの
DNA断片を、ベントDNAポリメラーゼ(Vent DNApo
lymerase)〔ニューイングランド・バイオラボ(New Eng
land Biolabs)〕、バリン(これは成熟mob中の最初
のアミノ酸である)をコードするコドンの最初のヌクレ
オチドから開始するフォワードプライマー(プライマー
1)(Zhang, Y. らの上記文献)、及びmobの終結コ
ドンを含有するmobの領域に対応するリバースプライ
マー(プライマー2)を使用して、このベクターから、
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。プラ
イマー2は、HindIII 制限部位に対応する配列も含
有していた。
【0092】 プライマー1: 5' GTG CCT ATC CAG AAA GTC 3' Val Pro Ile Glu Lys Val プライマー2: 5' TCCCAAGCTT TCAGCATTCAGGGCTAAC 3' HindIII 終結
【0093】増幅した501bpのDNA断片を、アガロ
ースゲル電気泳動により精製して、T4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ(「ベーリンガー(Boehringer)」)を使用
してリン酸化し、次に制限酵素HindIII で消化して
プライマー2の位置に5′突出末端を作成した。得られ
た断片には、成熟mobをコードするcDNAの最初の
ヌクレオチドに対応する平滑末端と、切断されたHin
dIII 部位に対応する5′突出末端があった。
ースゲル電気泳動により精製して、T4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ(「ベーリンガー(Boehringer)」)を使用
してリン酸化し、次に制限酵素HindIII で消化して
プライマー2の位置に5′突出末端を作成した。得られ
た断片には、成熟mobをコードするcDNAの最初の
ヌクレオチドに対応する平滑末端と、切断されたHin
dIII 部位に対応する5′突出末端があった。
【0094】次に、De Sutter, K. らの上記文献の方法
により得られたsOmpAプラスミドpT10sOmp
ArPDIをmobに融合させて、pT10sOmpA
mobプラスミドを作成した。これを実施するために、
当該分野で公知の方法〔Sambrook, J.らの「分子クロー
ニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual)」、第2版、Cold Spring Harbor Lab
oratory Press 刊、コールド・スプリング・ハーバー、
ニューヨーク、1989年〕により、前もって制限酵素Na
eIとHindIII で消化したpT10sOmpArP
DIベクターDNAへ、T4リガーゼ〔ニューイングラ
ンド・バイオラボ(New England-Biolabs)〕を使用する
連結により、mob断片をクローニングした。このpT
10sOmpArPDIは、プラスミドp714〔Park
er及びWiley, Gene 83, 117-134(1989)〕から誘導し
た。このプラスミドは、sOmpA配列に融合した、成
熟ラット蛋白ジスルフィドイソメラーゼ(rPDI)を
コードするcDNAを含有していた。
により得られたsOmpAプラスミドpT10sOmp
ArPDIをmobに融合させて、pT10sOmpA
mobプラスミドを作成した。これを実施するために、
当該分野で公知の方法〔Sambrook, J.らの「分子クロー
ニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual)」、第2版、Cold Spring Harbor Lab
oratory Press 刊、コールド・スプリング・ハーバー、
ニューヨーク、1989年〕により、前もって制限酵素Na
eIとHindIII で消化したpT10sOmpArP
DIベクターDNAへ、T4リガーゼ〔ニューイングラ
ンド・バイオラボ(New England-Biolabs)〕を使用する
連結により、mob断片をクローニングした。このpT
10sOmpArPDIは、プラスミドp714〔Park
er及びWiley, Gene 83, 117-134(1989)〕から誘導し
た。このプラスミドは、sOmpA配列に融合した、成
熟ラット蛋白ジスルフィドイソメラーゼ(rPDI)を
コードするcDNAを含有していた。
【0095】成熟rPDIのcDNA中の最初のコドン
(グリシン)へのsOmpA中の最後のコドン(アラニ
ン)のこの融合により、NaeI制限部位を作成し、こ
れをNaeIで切断後、sOmpA配列中の最後のコド
ンと、rPDI配列をコードするcDNA中の最初のコ
ドンとを、平滑末端として放出させた。
(グリシン)へのsOmpA中の最後のコドン(アラニ
ン)のこの融合により、NaeI制限部位を作成し、こ
れをNaeIで切断後、sOmpA配列中の最後のコド
ンと、rPDI配列をコードするcDNA中の最初のコ
ドンとを、平滑末端として放出させた。
【0096】
【0097】rPDIをコードするcDNAの末端に、
HindIII 部位が存在していた。したがって、このプ
ラスミドを更にHindIII で消化して、rPDIのc
DNAの主要部分を放出させ、PCR断片の1つの末端
と融和性の5′突出末端を作成した。rPDIをコード
するcDNAを成熟マウスobをコードするcDNAで
置き換えた、得られたプラスミドを、pT10sOmp
Amobと呼び、図2に示した。
HindIII 部位が存在していた。したがって、このプ
ラスミドを更にHindIII で消化して、rPDIのc
DNAの主要部分を放出させ、PCR断片の1つの末端
と融和性の5′突出末端を作成した。rPDIをコード
するcDNAを成熟マウスobをコードするcDNAで
置き換えた、得られたプラスミドを、pT10sOmp
Amobと呼び、図2に示した。
【0098】標準的な電気穿孔法により、連結したDN
Aを大腸菌株MC1061に導入し、得られたコロニー
を、制限酵素解析により、マウスobDNA断片の存在
に関してスクリーニングした。クローンpT10sOm
pAmobは、sOmpAをコードする配列に融合した
成熟マウスob蛋白をコードする配列を有していた。
Aを大腸菌株MC1061に導入し、得られたコロニー
を、制限酵素解析により、マウスobDNA断片の存在
に関してスクリーニングした。クローンpT10sOm
pAmobは、sOmpAをコードする配列に融合した
成熟マウスob蛋白をコードする配列を有していた。
【0099】次に、大腸菌でのこのpT10sOmpA
mob中のmobの発現を、リポ蛋白プロモーター(P
lpp)とlacプロモーター−オペレーター(POlac)の
両方の制御下に置いた。これを行うために、De Sutter,
K. らの上記文献に記載された標準的手順により、ハイ
ブリッド遺伝子sOmpA−mob配列を、プラスミド
pT10sOmpAmobからプラスミドベクターpL
PPsOmpArPDIに移した。このpLPPsOm
pArPDIプラスミドは、本明細書で既に述べたよう
に、プラスミドp714から誘導された〔Parker及びWi
ley, Gene 83,117-134 (1989)〕。この工程のため、プ
ラスミドpT10sOmpAmobのDNAを、制限酵
素XbaIとHindIII で切断した。次に、sOmp
A−mobをコードするDNAを含有する断片を、プラ
スミドpLPPsOmpArPDI(前もって、制限酵
素XbaIとHindIII で切断してsOmpA−rP
DIをコードするDNAを除去したもの)中に連結し
た。生じたプラスミドをpLPPsOmpAmobと呼
んだ。
mob中のmobの発現を、リポ蛋白プロモーター(P
lpp)とlacプロモーター−オペレーター(POlac)の
両方の制御下に置いた。これを行うために、De Sutter,
K. らの上記文献に記載された標準的手順により、ハイ
ブリッド遺伝子sOmpA−mob配列を、プラスミド
pT10sOmpAmobからプラスミドベクターpL
PPsOmpArPDIに移した。このpLPPsOm
pArPDIプラスミドは、本明細書で既に述べたよう
に、プラスミドp714から誘導された〔Parker及びWi
ley, Gene 83,117-134 (1989)〕。この工程のため、プ
ラスミドpT10sOmpAmobのDNAを、制限酵
素XbaIとHindIII で切断した。次に、sOmp
A−mobをコードするDNAを含有する断片を、プラ
スミドpLPPsOmpArPDI(前もって、制限酵
素XbaIとHindIII で切断してsOmpA−rP
DIをコードするDNAを除去したもの)中に連結し
た。生じたプラスミドをpLPPsOmpAmobと呼
んだ。
【0100】実施例3 大腸菌(MC1061)でのマウスob蛋白の発現 大腸菌中でのマウスob蛋白の発現を以下のとおり行っ
た。実施例2により構築したpLPPsOmpAmob
プラスミドを、電気穿孔法により大腸菌株MC1061
に挿入した。プラスミドpLPPsOmpAmobを有
する大腸菌細胞(MC1061)を、抗生物質カルベニ
シリン〔100μg/ml、「ビーチャム(Beecham)」〕を
添加したルリア・バータニア(Luria-Bertania)〔「デ
ィフコ・ラボラトリーズ(Difco Laboratories)」〕培
地中で、28℃で一晩増殖させた。次に、この培養物を
接種物(100倍希釈)として使用して、同じ培地中で
28℃で30mlの一晩培養物を用意した。次に、この培
養物を上記培地で3リットルに100倍希釈(例えば、
1リットルの三角フラスコ中、0.5l×6本)して、
ニューブランズウィック・エアーシェイカー(New Brun
swick air shaker)中で300rpm 、28℃で約4時
間、A600 が0.3〜0.5の密度に達するまで振盪し
た。この時、De Sutter, K. らの上記文献に記載された
ように、最終濃度2mMのイソプロピル−β−D−チオガ
ラクトピラノシド〔IPTG、「ベーリンガー(Boehri
nger)」〕を添加することにより、lacプロモーター
を誘導した。細胞を、細胞密度がA600 =1.3〜1.
5に達するまで、更に28℃で約5時間インキュベート
した。次に、JA10ローター〔ベックマン(Beckman)
の遠心分離機モデルJ2−21又はJ2−21M〕中で
6,750rpm 、6分間(8,000×g)、4℃で遠
心分離して、細胞を集めた。上澄液を除去して、細胞ペ
レットを氷冷浸透圧ショック緩衝液(20%ショ糖と1
0mMEDTAを含有する100mMトリス−HCl、pH
7.4)250mlに迅速に再懸濁して、Koshland及びBo
tsteinの上記文献に記載されたように10〜20分間氷
上でインキュベートした。
た。実施例2により構築したpLPPsOmpAmob
プラスミドを、電気穿孔法により大腸菌株MC1061
に挿入した。プラスミドpLPPsOmpAmobを有
する大腸菌細胞(MC1061)を、抗生物質カルベニ
シリン〔100μg/ml、「ビーチャム(Beecham)」〕を
添加したルリア・バータニア(Luria-Bertania)〔「デ
ィフコ・ラボラトリーズ(Difco Laboratories)」〕培
地中で、28℃で一晩増殖させた。次に、この培養物を
接種物(100倍希釈)として使用して、同じ培地中で
28℃で30mlの一晩培養物を用意した。次に、この培
養物を上記培地で3リットルに100倍希釈(例えば、
1リットルの三角フラスコ中、0.5l×6本)して、
ニューブランズウィック・エアーシェイカー(New Brun
swick air shaker)中で300rpm 、28℃で約4時
間、A600 が0.3〜0.5の密度に達するまで振盪し
た。この時、De Sutter, K. らの上記文献に記載された
ように、最終濃度2mMのイソプロピル−β−D−チオガ
ラクトピラノシド〔IPTG、「ベーリンガー(Boehri
nger)」〕を添加することにより、lacプロモーター
を誘導した。細胞を、細胞密度がA600 =1.3〜1.
5に達するまで、更に28℃で約5時間インキュベート
した。次に、JA10ローター〔ベックマン(Beckman)
の遠心分離機モデルJ2−21又はJ2−21M〕中で
6,750rpm 、6分間(8,000×g)、4℃で遠
心分離して、細胞を集めた。上澄液を除去して、細胞ペ
レットを氷冷浸透圧ショック緩衝液(20%ショ糖と1
0mMEDTAを含有する100mMトリス−HCl、pH
7.4)250mlに迅速に再懸濁して、Koshland及びBo
tsteinの上記文献に記載されたように10〜20分間氷
上でインキュベートした。
【0101】そして、この懸濁液をプラスチックの遠心
分離用チューブに移して、8,200rpm (8,000
×g)で5分間、4℃でJA20ローター中で遠心分離
して、細胞を集めた。上澄液を除去し、激しく振盪しな
がら氷水120mlに細胞ペレットを迅速に再懸濁して、
氷上で更に10分間インキュベートした。次に、この懸
濁液をJA20ローター中で11,500rpm (16,
000×g)で6分間、4℃で遠心分離して、細胞周辺
腔画分(浸透圧ショック液)に対応する上澄液を集めた
(約120ml)。アジ化ナトリウム及びトリス−HCl
(pH7.5)を、各々最終濃度0.05%及び50mMに
なるように添加した。マウスob蛋白を含有する浸透圧
ショック液は、更に使用するまで−20℃で保存した。
分離用チューブに移して、8,200rpm (8,000
×g)で5分間、4℃でJA20ローター中で遠心分離
して、細胞を集めた。上澄液を除去し、激しく振盪しな
がら氷水120mlに細胞ペレットを迅速に再懸濁して、
氷上で更に10分間インキュベートした。次に、この懸
濁液をJA20ローター中で11,500rpm (16,
000×g)で6分間、4℃で遠心分離して、細胞周辺
腔画分(浸透圧ショック液)に対応する上澄液を集めた
(約120ml)。アジ化ナトリウム及びトリス−HCl
(pH7.5)を、各々最終濃度0.05%及び50mMに
なるように添加した。マウスob蛋白を含有する浸透圧
ショック液は、更に使用するまで−20℃で保存した。
【0102】実施例4 大腸菌(MC1061)でのマウスob蛋白の発現 ルリア・バータニア(Luria-Bertania)培地に添加する
ための抗生物質として、(カルベニシリンの代わりに)
トリアシリン(triacilline)(100μg/ml)を使用し
たほかは、実施例3に記載した手順により、マウスob
蛋白の発現を行った。
ための抗生物質として、(カルベニシリンの代わりに)
トリアシリン(triacilline)(100μg/ml)を使用し
たほかは、実施例3に記載した手順により、マウスob
蛋白の発現を行った。
【0103】実施例5 大腸菌浸透圧液からのマウスob蛋白の精製 実施例4による凍結浸透圧ショック液120ml中のマウ
スob蛋白を、以下のとおり精製した。マウスob蛋白
を含有する浸透圧ショック液120mlを解凍し、4℃で
20分間、16,000rpm でJA20ローター中で遠
心分離して、不溶性の細胞破砕物を除去した。次に、前
もって50mMトリス−HCl(pH7.5)緩衝液で平衡
化した、カラム床容量30mlのQ−セファロース・ファ
スト・フロー(Q-Sepharose Fast Flow)〔「ファルマシ
ア(Pharmacia)」〕を含有するカラムに、上澄液を直接
適用した。50mMトリス−HCl(pH7.5)緩衝液で
洗浄後、0.1M NaClを含有する50mMトリス−H
Cl(pH7.5)緩衝液でmob蛋白を溶出した。
スob蛋白を、以下のとおり精製した。マウスob蛋白
を含有する浸透圧ショック液120mlを解凍し、4℃で
20分間、16,000rpm でJA20ローター中で遠
心分離して、不溶性の細胞破砕物を除去した。次に、前
もって50mMトリス−HCl(pH7.5)緩衝液で平衡
化した、カラム床容量30mlのQ−セファロース・ファ
スト・フロー(Q-Sepharose Fast Flow)〔「ファルマシ
ア(Pharmacia)」〕を含有するカラムに、上澄液を直接
適用した。50mMトリス−HCl(pH7.5)緩衝液で
洗浄後、0.1M NaClを含有する50mMトリス−H
Cl(pH7.5)緩衝液でmob蛋白を溶出した。
【0104】次に、Q−セファロース・ファスト・フロ
ー(Q-Sepharose Fast Flow)を含有するカラムから溶出
した物質に、最終濃度1.0M になるように、固体の
(NH4)2 SO4 を添加して、1.0M (NH4)2 SO
4 を含有する50mMトリス−HCl(pH7.5)緩衝液
で前もって平衡化した、カラム床容量7.5mlのブチル
−セファロース・ファスト・フロー(Butyl-Sepharose
Fast Flow)〔「ファルマシア(Pharmacia)」〕を含有す
るカラムに、この混合物を適用した。1.0M (NH4)
2 SO4 を含有する50mMトリス−HCl(pH7.5)
緩衝液で洗浄後、50mMトリス−HCl(pH7.5)緩
衝液中1.0M (NH4)2 SO4 から水中20%エチレ
ングリコールへの勾配を適用することにより、mob蛋
白を溶出した。mob蛋白は、勾配の最後の方でブチル
−セファロース・ファスト・フローカラムから溶出し、
一方、ほとんどの夾雑物ははるかに早く溶出した。この
段階でのmob蛋白の純度は、銀染色ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(PAGE)による概算では、90%で
あった。
ー(Q-Sepharose Fast Flow)を含有するカラムから溶出
した物質に、最終濃度1.0M になるように、固体の
(NH4)2 SO4 を添加して、1.0M (NH4)2 SO
4 を含有する50mMトリス−HCl(pH7.5)緩衝液
で前もって平衡化した、カラム床容量7.5mlのブチル
−セファロース・ファスト・フロー(Butyl-Sepharose
Fast Flow)〔「ファルマシア(Pharmacia)」〕を含有す
るカラムに、この混合物を適用した。1.0M (NH4)
2 SO4 を含有する50mMトリス−HCl(pH7.5)
緩衝液で洗浄後、50mMトリス−HCl(pH7.5)緩
衝液中1.0M (NH4)2 SO4 から水中20%エチレ
ングリコールへの勾配を適用することにより、mob蛋
白を溶出した。mob蛋白は、勾配の最後の方でブチル
−セファロース・ファスト・フローカラムから溶出し、
一方、ほとんどの夾雑物ははるかに早く溶出した。この
段階でのmob蛋白の純度は、銀染色ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(PAGE)による概算では、90%で
あった。
【0105】次に、ブチル−セファロース・ファスト・
フローを含有するカラムから溶出した物質中のmob蛋
白を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製し
た。これを行うために、8MC濃縮ユニット〔「アミコ
ン(Amicon)」〕を使用するYM10〔「アミコン(Am
icon)」〕膜で、マウスob蛋白を4℃で容量1mlまで
濃縮して、前もってリン酸緩衝生理食塩水で平衡化した
G100−セファデックス〔「ファルマシア(Pharmaci
a)」〕39mlを含有するカラム(1.0cm×50cm)に
適用した。次に、mob蛋白を含有する画分をプールし
て、蛋白をYM10膜で濃縮した。この段階では、PA
GEと銀染色による概算では、mob蛋白は純度95%
以上であった。SDS−PAGEにより、分子量15,
000の位置に単一蛋白バンドが見られた。
フローを含有するカラムから溶出した物質中のmob蛋
白を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製し
た。これを行うために、8MC濃縮ユニット〔「アミコ
ン(Amicon)」〕を使用するYM10〔「アミコン(Am
icon)」〕膜で、マウスob蛋白を4℃で容量1mlまで
濃縮して、前もってリン酸緩衝生理食塩水で平衡化した
G100−セファデックス〔「ファルマシア(Pharmaci
a)」〕39mlを含有するカラム(1.0cm×50cm)に
適用した。次に、mob蛋白を含有する画分をプールし
て、蛋白をYM10膜で濃縮した。この段階では、PA
GEと銀染色による概算では、mob蛋白は純度95%
以上であった。SDS−PAGEにより、分子量15,
000の位置に単一蛋白バンドが見られた。
【0106】実施例6 マウスob蛋白の配列解析 上記実施例2、3、4及び5の手順により得られた精製
されたマウスob蛋白のN−末端アミノ酸の配列決定
を、Laemli, U.K.の上記文献の手順により行った。Bau
w, G.ら, J. Biol. Chem. 7, 194-196 (1988)に記載さ
れたように、ポリ(4−ビニルN−メチルピリジニウム
ヨウ化物)でコートしたガラス繊維シートに、電気泳動
した蛋白を電気的にトランスファーした後、分子量1
5,000の蛋白のバンドを膜から切り出し、120A
オンライン・フェニルチオヒダントインアミノ酸解析機
〔「アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosyste
ms)」〕を取付けた470A気相配列決定装置で、エド
マン分解により、N−末端のアミノ酸配列を決定した。
上記手順により得られたこのマウスob蛋白のN−末端
アミノ酸配列は、配列番号3の成熟マウスob蛋白に対
応するVal−Pro−Ile−Glnであった。
されたマウスob蛋白のN−末端アミノ酸の配列決定
を、Laemli, U.K.の上記文献の手順により行った。Bau
w, G.ら, J. Biol. Chem. 7, 194-196 (1988)に記載さ
れたように、ポリ(4−ビニルN−メチルピリジニウム
ヨウ化物)でコートしたガラス繊維シートに、電気泳動
した蛋白を電気的にトランスファーした後、分子量1
5,000の蛋白のバンドを膜から切り出し、120A
オンライン・フェニルチオヒダントインアミノ酸解析機
〔「アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosyste
ms)」〕を取付けた470A気相配列決定装置で、エド
マン分解により、N−末端のアミノ酸配列を決定した。
上記手順により得られたこのマウスob蛋白のN−末端
アミノ酸配列は、配列番号3の成熟マウスob蛋白に対
応するVal−Pro−Ile−Glnであった。
【0107】実施例7 ヒトob蛋白(hob)のための発現ベクターの構築 実施例1の手順により得られたヒトob遺伝子を使用し
て、ヒトob蛋白の発現のための発現ベクターpLPP
sOmpAhob1を構築した。この構築は実施例2に
詳述したpLPPsOmpAmobの構築に類似してお
り、図3に詳細を示した。全成熟ヒトobコード配列を
含有するDNA断片を完成するために、3つの断片の連
結が必要であった。
て、ヒトob蛋白の発現のための発現ベクターpLPP
sOmpAhob1を構築した。この構築は実施例2に
詳述したpLPPsOmpAmobの構築に類似してお
り、図3に詳細を示した。全成熟ヒトobコード配列を
含有するDNA断片を完成するために、3つの断片の連
結が必要であった。
【0108】構築の第一段階において、成熟ヒトob蛋
白の最初のアミノ酸(バリン)をコードするコドンの最
初のヌクレオチドから開始するhobヌクレオチド配列
を、OmpAからのシグナルをコードする配列(sOm
pA)に融合して、sOmpA配列をhobヌクレオチ
ドコード配列の5′末端の上流に入れた。プラスミドp
BluescriptSk- hob1、ベントDNAポリメラー
ゼ、及び2つのプライマーを含有するPCR混合物中で
増幅することにより、このDNA断片を得た。フォワー
ドプライマー(プライマー1)は、成熟ヒトob蛋白の
最初のアミノ酸をコードするコドンの最初のヌクレオチ
ドで開始し、リバースプライマー(プライマー2)は、
終結コドンを含有するヒトcDNAの配列を含有した。
増幅反応により、成熟ヒトob蛋白をコードする配列を
含有する501bpのDNA断片を得た。次に、このDN
A断片の5′末端を、T4ポリヌクレオチドキナーゼで
リン酸化し、制限酵素HindIII で消化して、成熟h
obをコードするcDNAの最初のヌクレオチドに対応
する平滑末端(プライマー1に対応する位置)と、Hi
ndIII 切断部位に対応する5′突出末端とを有する3
53bpのDNA断片を得た。この353bpのDNA断片
を、アガロースゲル電気泳動により精製して、前もって
制限酵素NaeIとHindIII で消化したpT10s
OmpArPDIプラスミドにクローニングした。得ら
れたプラスミドpT10sOmpAhob1(部分)に
は、sOmpAをコードする配列に融合した、成熟ヒト
ob蛋白の一部分(アミノ末端部分)をコードするDN
A断片が含まれていた。
白の最初のアミノ酸(バリン)をコードするコドンの最
初のヌクレオチドから開始するhobヌクレオチド配列
を、OmpAからのシグナルをコードする配列(sOm
pA)に融合して、sOmpA配列をhobヌクレオチ
ドコード配列の5′末端の上流に入れた。プラスミドp
BluescriptSk- hob1、ベントDNAポリメラー
ゼ、及び2つのプライマーを含有するPCR混合物中で
増幅することにより、このDNA断片を得た。フォワー
ドプライマー(プライマー1)は、成熟ヒトob蛋白の
最初のアミノ酸をコードするコドンの最初のヌクレオチ
ドで開始し、リバースプライマー(プライマー2)は、
終結コドンを含有するヒトcDNAの配列を含有した。
増幅反応により、成熟ヒトob蛋白をコードする配列を
含有する501bpのDNA断片を得た。次に、このDN
A断片の5′末端を、T4ポリヌクレオチドキナーゼで
リン酸化し、制限酵素HindIII で消化して、成熟h
obをコードするcDNAの最初のヌクレオチドに対応
する平滑末端(プライマー1に対応する位置)と、Hi
ndIII 切断部位に対応する5′突出末端とを有する3
53bpのDNA断片を得た。この353bpのDNA断片
を、アガロースゲル電気泳動により精製して、前もって
制限酵素NaeIとHindIII で消化したpT10s
OmpArPDIプラスミドにクローニングした。得ら
れたプラスミドpT10sOmpAhob1(部分)に
は、sOmpAをコードする配列に融合した、成熟ヒト
ob蛋白の一部分(アミノ末端部分)をコードするDN
A断片が含まれていた。
【0109】
【0110】第二工程において、ヒトob蛋白のカルボ
キシ末端部分をコードするDNA配列(即ち、断片2)
を、成熟hobのアミノ末端部分をコードするDNA断
片に連結し、sOmpAに融合させた全成熟hob配列
をコードする得られた断片を、リポ蛋白プロモーター及
びlac−プロモーター−オペレーターの制御下で大腸
菌中で成熟ヒトob蛋白を発現させるために、プラスミ
ドpLPPsOmpArPDIに移した。これを行うた
めに、プラスミドpT10sOmpAhob1(部分)
をXbaIとHindIII で消化し、hobの400bp
のDNA断片1をアガロースゲル電気泳動により単離し
た(断片1)。次に、プラスミドpBluescriptSk- h
ob1をHindIII とEcoRIで切断し、アガロー
スゲル電気泳動により450bpの断片を単離した(断片
2)。最後に、プラスミドpLPPsOmpArPDI
をXbaIとEcoRIで切断し、アガロースゲル電気
泳動によりベクター断片を単離した(断片3)。次に、
DNA断片1、2及び3を相互に連結して、連結混合物
を大腸菌株MC1061に導入した。最終プラスミド構
築体pLPPsOmpAhob1を含有するコロニー
を、成熟ヒトob蛋白の発現及び分泌のために使用し
た。
キシ末端部分をコードするDNA配列(即ち、断片2)
を、成熟hobのアミノ末端部分をコードするDNA断
片に連結し、sOmpAに融合させた全成熟hob配列
をコードする得られた断片を、リポ蛋白プロモーター及
びlac−プロモーター−オペレーターの制御下で大腸
菌中で成熟ヒトob蛋白を発現させるために、プラスミ
ドpLPPsOmpArPDIに移した。これを行うた
めに、プラスミドpT10sOmpAhob1(部分)
をXbaIとHindIII で消化し、hobの400bp
のDNA断片1をアガロースゲル電気泳動により単離し
た(断片1)。次に、プラスミドpBluescriptSk- h
ob1をHindIII とEcoRIで切断し、アガロー
スゲル電気泳動により450bpの断片を単離した(断片
2)。最後に、プラスミドpLPPsOmpArPDI
をXbaIとEcoRIで切断し、アガロースゲル電気
泳動によりベクター断片を単離した(断片3)。次に、
DNA断片1、2及び3を相互に連結して、連結混合物
を大腸菌株MC1061に導入した。最終プラスミド構
築体pLPPsOmpAhob1を含有するコロニー
を、成熟ヒトob蛋白の発現及び分泌のために使用し
た。
【0111】実施例8 大腸菌(MC1061)でのヒトob蛋白の発現 実施例7により構築したpLPPsOmpAhob1を
使用して、宿主大腸菌細胞の細胞周辺腔において可溶性
の生物学的に活性な形でヒトob蛋白を発現させるため
に、大腸菌株MC1061を形質転換した。電気穿孔法
により、これらの宿主大腸菌細胞中へのプラスミドの挿
入を行った。プラスミドpLPPsOmpAhob1を
有する大腸菌細胞(MC0161)を、抗生物質カルベ
ニシリン〔100μg/ml、「ビーチャム(Beecham)」〕
を添加したルリア・バータニア〔「ディフコ・ラボラト
リーズ(Difco Laboratories)」〕培地中で、28℃で
適正な密度まで増殖させて、次に、De Sutter, K. らの
上記文献に記載されたように、最終濃度2mMのイソプロ
ピル−β−D−チオガラクトピラノシド〔IPTG、
「ベーリンガー(Boehringer)」〕を添加することによ
り、lacプロモーターを誘導した。細胞密度がA600
=1.3に達するまで、更に細胞を増殖させた。次に、
遠心分離(8,000×g、4℃)により細胞を集め
て、氷冷浸透圧ショック緩衝液(20%ショ糖と10mM
EDTAとを含有する100mMトリス−HCl、pH7.
4)に細胞ペレットを迅速に再懸濁して、Koshland及び
Botsteinの上記文献に記載されたように、10分間氷上
でインキュベートした。
使用して、宿主大腸菌細胞の細胞周辺腔において可溶性
の生物学的に活性な形でヒトob蛋白を発現させるため
に、大腸菌株MC1061を形質転換した。電気穿孔法
により、これらの宿主大腸菌細胞中へのプラスミドの挿
入を行った。プラスミドpLPPsOmpAhob1を
有する大腸菌細胞(MC0161)を、抗生物質カルベ
ニシリン〔100μg/ml、「ビーチャム(Beecham)」〕
を添加したルリア・バータニア〔「ディフコ・ラボラト
リーズ(Difco Laboratories)」〕培地中で、28℃で
適正な密度まで増殖させて、次に、De Sutter, K. らの
上記文献に記載されたように、最終濃度2mMのイソプロ
ピル−β−D−チオガラクトピラノシド〔IPTG、
「ベーリンガー(Boehringer)」〕を添加することによ
り、lacプロモーターを誘導した。細胞密度がA600
=1.3に達するまで、更に細胞を増殖させた。次に、
遠心分離(8,000×g、4℃)により細胞を集め
て、氷冷浸透圧ショック緩衝液(20%ショ糖と10mM
EDTAとを含有する100mMトリス−HCl、pH7.
4)に細胞ペレットを迅速に再懸濁して、Koshland及び
Botsteinの上記文献に記載されたように、10分間氷上
でインキュベートした。
【0112】次に、上記のとおり細胞を再度遠心分離に
より集めて、細胞ペレットを氷冷水に再懸濁し、氷上で
10分間インキュベートした。次に、この懸濁液を1
6,000×gで5分間遠心分離して、上澄液(浸透圧
ショック液)を集めた。アジ化ナトリウム及びトリス−
HCl(pH7.5)を、各々最終濃度0.05%及び5
0mMになるように添加した。このヒトob蛋白を含有す
る浸透圧ショック液は、更に使用するまで−20℃で保
存した。
より集めて、細胞ペレットを氷冷水に再懸濁し、氷上で
10分間インキュベートした。次に、この懸濁液を1
6,000×gで5分間遠心分離して、上澄液(浸透圧
ショック液)を集めた。アジ化ナトリウム及びトリス−
HCl(pH7.5)を、各々最終濃度0.05%及び5
0mMになるように添加した。このヒトob蛋白を含有す
る浸透圧ショック液は、更に使用するまで−20℃で保
存した。
【0113】実施例9 大腸菌(MC1061)でのヒトob蛋白の発現 ルリア・バータニア培地に添加するための抗生物質とし
て、カルベニシリンの代わりにトリアシリン(triacill
ine)(100μg/ml)を使用したほかは、実施例8に記
載された手順により、ヒトob蛋白の発現を行った。
て、カルベニシリンの代わりにトリアシリン(triacill
ine)(100μg/ml)を使用したほかは、実施例8に記
載された手順により、ヒトob蛋白の発現を行った。
【0114】実施例10 大腸菌浸透圧液からのヒトob蛋白の精製 実施例9の浸透圧ショック液中のヒトob蛋白を精製す
るために、NaClを最終濃度0.1M になるようにこ
の液に添加し、次に、前もって50mMトリス−HCl
(pH7.5)緩衝液で平衡化したカラム床容量30mlの
Q−セファロース・ファスト・フロー(Q-Sepharose Fa
st Flow)〔「ファルマシア(Pharmacia)」〕を含有する
カラムに、この液を直接適用した。
るために、NaClを最終濃度0.1M になるようにこ
の液に添加し、次に、前もって50mMトリス−HCl
(pH7.5)緩衝液で平衡化したカラム床容量30mlの
Q−セファロース・ファスト・フロー(Q-Sepharose Fa
st Flow)〔「ファルマシア(Pharmacia)」〕を含有する
カラムに、この液を直接適用した。
【0115】次に、Q−セファロース・ファスト・フロ
ー(Q-Sepharose Fast Flow)を含有するカラムから溶出
したフロースルー物質に、最終濃度1.0M になるよう
に、固体の(NH4)2 SO4 を添加して、1.0M (N
H4)2 SO4 を含有する50mMトリス−HCl(pH7.
5)緩衝液で前もって平衡化した、カラム床容量7.5
mlのブチル−セファロース・ファスト・フロー(Butyl-
Sepharose Fast Flow)〔「ファルマシア(Pharmaci
a)」〕を含有するカラムに、この混合物を適用した。
1.0M (NH4)2 SO4 を含有するトリス−HCl
(pH7.5)緩衝液で洗浄後、50mMトリス−HCl
(pH7.5)緩衝液中1.0M (NH4)2 SO4 から水
中20%エチレングリコールへの勾配を適用することに
より、hob蛋白を溶出した。hob蛋白は、勾配の最
後の方でブチル−セファロース・ファスト・フローカラ
ムから溶出し、一方、ほとんどの夾雑物ははるかに早く
溶出した。この段階でのhob蛋白の純度は、銀染色ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)による概算
では、90%であった。
ー(Q-Sepharose Fast Flow)を含有するカラムから溶出
したフロースルー物質に、最終濃度1.0M になるよう
に、固体の(NH4)2 SO4 を添加して、1.0M (N
H4)2 SO4 を含有する50mMトリス−HCl(pH7.
5)緩衝液で前もって平衡化した、カラム床容量7.5
mlのブチル−セファロース・ファスト・フロー(Butyl-
Sepharose Fast Flow)〔「ファルマシア(Pharmaci
a)」〕を含有するカラムに、この混合物を適用した。
1.0M (NH4)2 SO4 を含有するトリス−HCl
(pH7.5)緩衝液で洗浄後、50mMトリス−HCl
(pH7.5)緩衝液中1.0M (NH4)2 SO4 から水
中20%エチレングリコールへの勾配を適用することに
より、hob蛋白を溶出した。hob蛋白は、勾配の最
後の方でブチル−セファロース・ファスト・フローカラ
ムから溶出し、一方、ほとんどの夾雑物ははるかに早く
溶出した。この段階でのhob蛋白の純度は、銀染色ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)による概算
では、90%であった。
【0116】次に、ブチル−セファロース・ファスト・
フローを含有するカラムから溶出した物質中のhob蛋
白を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製し
た。これを行うために、8MC濃縮ユニット〔「アミコ
ン(Amicon)」〕を使用するYM10〔「アミコン(Am
icon)」〕膜で、ヒトob蛋白を4℃で容量1mlまで濃
縮して、前もってリン酸緩衝生理食塩水で平衡化したG
100−セファデックス〔「ファルマシア(Pharmaci
a)」〕39mlを含有するカラム(1.0cm×50cm)に
適用した。次に、hob蛋白を含有する画分をプールし
て、蛋白をYM10膜で濃縮した。この段階では、PA
GEと銀染色による概算では、hob蛋白は純度95%
以上であった。溶出物のSDS−PAGE解析により、
分子量15,000の位置に単一蛋白バンドが見られ
た。
フローを含有するカラムから溶出した物質中のhob蛋
白を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製し
た。これを行うために、8MC濃縮ユニット〔「アミコ
ン(Amicon)」〕を使用するYM10〔「アミコン(Am
icon)」〕膜で、ヒトob蛋白を4℃で容量1mlまで濃
縮して、前もってリン酸緩衝生理食塩水で平衡化したG
100−セファデックス〔「ファルマシア(Pharmaci
a)」〕39mlを含有するカラム(1.0cm×50cm)に
適用した。次に、hob蛋白を含有する画分をプールし
て、蛋白をYM10膜で濃縮した。この段階では、PA
GEと銀染色による概算では、hob蛋白は純度95%
以上であった。溶出物のSDS−PAGE解析により、
分子量15,000の位置に単一蛋白バンドが見られ
た。
【0117】実施例11 大腸菌浸透圧液からのヒトob蛋白の精製 実施例9の浸透圧ショック液中のヒト蛋白を精製するた
めに、下記の相違点を除いて実施例10の手順を使用し
た:フロースルー物質に固体の(NH4)2 SO4 を添加
する前に、実施例9の浸透圧ショック液に関して下記工
程を行った。
めに、下記の相違点を除いて実施例10の手順を使用し
た:フロースルー物質に固体の(NH4)2 SO4 を添加
する前に、実施例9の浸透圧ショック液に関して下記工
程を行った。
【0118】前もって50mMトリス−HCl(pH7.
5)緩衝液で平衡化した、カラム床容量30mlのQ−セ
ファロース・ファスト・フロー(Q-Sepharose Fast Flo
w)〔「ファルマシア(Pharmacia)」〕を含有するカラム
に、実施例9の浸透圧ショック液中のヒトob蛋白を直
接適用した。50mMトリス−HCl(pH7.5)緩衝液
で洗浄後、0.1M NaClを含有する50mMトリス−
HCl(pH7.5)緩衝液でhob蛋白を溶出した。
5)緩衝液で平衡化した、カラム床容量30mlのQ−セ
ファロース・ファスト・フロー(Q-Sepharose Fast Flo
w)〔「ファルマシア(Pharmacia)」〕を含有するカラム
に、実施例9の浸透圧ショック液中のヒトob蛋白を直
接適用した。50mMトリス−HCl(pH7.5)緩衝液
で洗浄後、0.1M NaClを含有する50mMトリス−
HCl(pH7.5)緩衝液でhob蛋白を溶出した。
【0119】実施例12 ヒトob蛋白の配列解析 上記実施例7〜11の手順により得られた精製されたヒ
トob蛋白のN−末端アミノ酸の配列決定を、Laemli,
U.K.の上記文献の手順により行った。Bauw, G.らの上記
文献により記載されたように、ポリ(4−ビニル−N−
メチルピリジニウムヨウ化物)でコートしたガラス繊維
シートに、電気泳動した蛋白を電気的にトランスファー
した後、分子量15,000の蛋白のバンドを膜から切
り出し、120Aオンライン・フェニルチオヒダントイ
ンアミノ酸解析機〔「アプライド・バイオシステムズ
(Applied Biosystems)」〕を取付けた470A気相配
列決定装置で、エドマン分解により、N−末端のアミノ
酸配列を決定した。上記手順により得られたこのhob
蛋白のN−末端アミノ酸配列は、配列番号6の成熟ヒト
ob蛋白に対応するVal−Pro−Ile−Glnで
あった。
トob蛋白のN−末端アミノ酸の配列決定を、Laemli,
U.K.の上記文献の手順により行った。Bauw, G.らの上記
文献により記載されたように、ポリ(4−ビニル−N−
メチルピリジニウムヨウ化物)でコートしたガラス繊維
シートに、電気泳動した蛋白を電気的にトランスファー
した後、分子量15,000の蛋白のバンドを膜から切
り出し、120Aオンライン・フェニルチオヒダントイ
ンアミノ酸解析機〔「アプライド・バイオシステムズ
(Applied Biosystems)」〕を取付けた470A気相配
列決定装置で、エドマン分解により、N−末端のアミノ
酸配列を決定した。上記手順により得られたこのhob
蛋白のN−末端アミノ酸配列は、配列番号6の成熟ヒト
ob蛋白に対応するVal−Pro−Ile−Glnで
あった。
【0120】実施例13 マウスob蛋白の生物学的活性:ob/obマウスにお
ける脳室内(ICV)注射 下記のとおりに、ICV法を使用して、実施例5により
精製した成熟マウスob蛋白の生物学的活性を測定し
た。Haley 及びMcCormick の上記文献の方法に基づき、
以下の座標(中線の2mm外側;ブレグマに対して0.6
mm;2mm下)を用いて、麻酔をかけたメスの肥満ob/
obマウス(6〜13週齢)の脳の側脳室中に、注入用
カニューレを埋め込んだ。カニューレの末端は、精密ね
じ(jeweler screw)と歯科用セメントを使用して頭蓋骨
に固定した。マウスは、個別に、自由に食物摂取(IC
V注射の前の晩を除いて)と水の摂取ができるプラスチ
ックケージに収容した。1日食物摂取量及び体重増加に
より評価して、手術から回復した後、下記の試験液の1
つを1μl 脳室内(ICV)注射して、幾つかの場合に
マウスを検討した: 1)人工CSF; 2)細菌性対照液; 3)ob蛋白(0.6〜1μg/マウス);又は4)輸液
なし。 各マウスへの上記試験液の1つのICV注射に続いて、
カニューレをきれいにするために人工CSF1μl を注
射した。この実験の目的のために、細菌性対照液は、大
腸菌に挿入されたプラスミドにマウスob遺伝子が含ま
れていなかったことを除いて、実施例2〜4に略述した
手順と同様に処理し調製した試料であった。
ける脳室内(ICV)注射 下記のとおりに、ICV法を使用して、実施例5により
精製した成熟マウスob蛋白の生物学的活性を測定し
た。Haley 及びMcCormick の上記文献の方法に基づき、
以下の座標(中線の2mm外側;ブレグマに対して0.6
mm;2mm下)を用いて、麻酔をかけたメスの肥満ob/
obマウス(6〜13週齢)の脳の側脳室中に、注入用
カニューレを埋め込んだ。カニューレの末端は、精密ね
じ(jeweler screw)と歯科用セメントを使用して頭蓋骨
に固定した。マウスは、個別に、自由に食物摂取(IC
V注射の前の晩を除いて)と水の摂取ができるプラスチ
ックケージに収容した。1日食物摂取量及び体重増加に
より評価して、手術から回復した後、下記の試験液の1
つを1μl 脳室内(ICV)注射して、幾つかの場合に
マウスを検討した: 1)人工CSF; 2)細菌性対照液; 3)ob蛋白(0.6〜1μg/マウス);又は4)輸液
なし。 各マウスへの上記試験液の1つのICV注射に続いて、
カニューレをきれいにするために人工CSF1μl を注
射した。この実験の目的のために、細菌性対照液は、大
腸菌に挿入されたプラスミドにマウスob遺伝子が含ま
れていなかったことを除いて、実施例2〜4に略述した
手順と同様に処理し調製した試料であった。
【0121】ICV注射の前に18時間(一晩)、マウ
スを絶食させた。マウスを軽く拘束して、前もって較正
したポリエチレン(PE)チューブ(PE20)を装着
した10μl ハミルトン(Hamilton)シリンジを使用し
て、側脳室に取付けたカニューレに試験液1μl を注射
した。次いで、直ちにマウスを、前もって重量を計量し
たペレット化したマウス用の餌を含有する食物皿と水瓶
のついた試験ケージに入れた。マウスを肉眼で観察し、
食物摂取をそれから7時間測定した。食物摂取測定は、
ICV注射の0.5、1、2、3、4、6及び7時間後
に行った。ICV注射の前と24時間後に、各マウスの
体重を測定した。カニューレ固定がうまくいっているこ
とは、Morley, J.E.ら, American J. Physiol. 253, 51
6-522 (1987)の、2時間絶食マウスでのニューロペプチ
ドY 10μg のICV注射後2時間の食物摂取の増加
により示された。
スを絶食させた。マウスを軽く拘束して、前もって較正
したポリエチレン(PE)チューブ(PE20)を装着
した10μl ハミルトン(Hamilton)シリンジを使用し
て、側脳室に取付けたカニューレに試験液1μl を注射
した。次いで、直ちにマウスを、前もって重量を計量し
たペレット化したマウス用の餌を含有する食物皿と水瓶
のついた試験ケージに入れた。マウスを肉眼で観察し、
食物摂取をそれから7時間測定した。食物摂取測定は、
ICV注射の0.5、1、2、3、4、6及び7時間後
に行った。ICV注射の前と24時間後に、各マウスの
体重を測定した。カニューレ固定がうまくいっているこ
とは、Morley, J.E.ら, American J. Physiol. 253, 51
6-522 (1987)の、2時間絶食マウスでのニューロペプチ
ドY 10μg のICV注射後2時間の食物摂取の増加
により示された。
【0122】上記ICV試験の結果は以下のとおりであ
った:A.食物摂取の低下 ICV注射後最初の30分間、ほとんど全てのマウス
は、短い間隔をおいて食べ、約0.5グラム消費した。
注射をしなかったか、人工CSFを注射したマウスは、
次の6.5時間中食べ続け、累積7時間摂取量は3.2
グラムに達した(第1表)。対照的に、ob蛋白のIC
Vを行ったマウスは、最初の30分以降食べるのを停止
し、再び食べることはなかった。即ち、次の6.5時間
にわたって、これらの累積食物摂取量は、約0.5グラ
ムに抑制され続けた(第1表)。賦形剤対照液のICV
を行ったマウスも、30分後に食べるのを停止し、6〜
7時間後になってようやく再び食べ始めた。
った:A.食物摂取の低下 ICV注射後最初の30分間、ほとんど全てのマウス
は、短い間隔をおいて食べ、約0.5グラム消費した。
注射をしなかったか、人工CSFを注射したマウスは、
次の6.5時間中食べ続け、累積7時間摂取量は3.2
グラムに達した(第1表)。対照的に、ob蛋白のIC
Vを行ったマウスは、最初の30分以降食べるのを停止
し、再び食べることはなかった。即ち、次の6.5時間
にわたって、これらの累積食物摂取量は、約0.5グラ
ムに抑制され続けた(第1表)。賦形剤対照液のICV
を行ったマウスも、30分後に食べるのを停止し、6〜
7時間後になってようやく再び食べ始めた。
【0123】B.体重増加の低下 賦形剤対照液を注射されたマウスの体重の24時間変化
は、人工CSFを注射されたか又は注射をされていない
マウスに比べて、わずかに低下した(第1表)。しか
し、ob蛋白を注射されたマウスの体重の変化パーセン
トは、ゼロに近く、賦形剤対照液を注射されたマウスに
比較して有意に低下した(第1表)。
は、人工CSFを注射されたか又は注射をされていない
マウスに比べて、わずかに低下した(第1表)。しか
し、ob蛋白を注射されたマウスの体重の変化パーセン
トは、ゼロに近く、賦形剤対照液を注射されたマウスに
比較して有意に低下した(第1表)。
【0124】C.結論 組換えマウスob蛋白の直接投与(1μl 中の1.1μ
g/マウスを脳に)の観察された効果は、メスのob/o
bマウスの食物摂取及び体重増加の持続性で有意な低下
であった。これにより、ob蛋白が、脳で直接に作用す
ることができ、腹腔内に注射された場合のob蛋白の効
果に一致することが明らかになった。この実施例では、
本発明によりメスの肥満ob/obマウスにおける細菌
で発現させた組換えマウスob蛋白の生物学的活性も確
認された。
g/マウスを脳に)の観察された効果は、メスのob/o
bマウスの食物摂取及び体重増加の持続性で有意な低下
であった。これにより、ob蛋白が、脳で直接に作用す
ることができ、腹腔内に注射された場合のob蛋白の効
果に一致することが明らかになった。この実施例では、
本発明によりメスの肥満ob/obマウスにおける細菌
で発現させた組換えマウスob蛋白の生物学的活性も確
認された。
【0125】
【表1】
【0126】*は、ob蛋白群と人工脳脊髄液(CS
F)群との間の有意(p<0.05)な差を示す。 **は、対照を100としたパーセントを示す。
F)群との間の有意(p<0.05)な差を示す。 **は、対照を100としたパーセントを示す。
【0127】実施例14マウスob蛋白の生物学的活
性:ob/obマウスにおける静脈内(IV)注射 実施例2、3、4及び5により得られた精製されたマウ
スob蛋白の生物学的活性を、以下のとおりに肥満ob
/obマウスへの静脈(IV)注射により試験した。
性:ob/obマウスにおける静脈内(IV)注射 実施例2、3、4及び5により得られた精製されたマウ
スob蛋白の生物学的活性を、以下のとおりに肥満ob
/obマウスへの静脈(IV)注射により試験した。
【0128】Mokhtarian A. ら, Physiol. Behav. 54,
895-898 (1993)の方法により、オス及びメスの肥満ob
/obマウス(6〜13週齢)にペントバルビタール麻
酔(80mg/kg 体重)下で長期頚部カニューレを埋め込
んた。12時間/12時間の明暗サイクルで一定の環境
条件下のプラスチックケージにマウスを個々に収容し
た。毎日固定して体重を測定し、カニューレの開存は、
1日おきに無菌ヘパリン/生理食塩水(0.9%生理食
塩水中50U/ml)≦0.1mlの注入により確認して維持
した。手術から完全に回復後、マウスを16〜18時間
(一晩)絶食させた。翌朝、マウスの体重を測定し、実
験の前の環境順応のために45分間試験ケージに入れ
た。水は継続して自由に与えた。マウスob蛋白(0.
1ml中3μg)又は等容量の賦形剤対照液又は生理食塩水
(0.9%)を静脈内注射した。覚醒しているマウスを
軽く拘束し、0.5mlのインスリンシリンジを使用し
て、試験液0.1ml、続いてヘパリン/生理食塩水0.
05mlを注射した。試験は少なくとも3日間おいて行っ
た。次いで直ちに、マウスを、前もって重量を測定した
マウス用の餌のペレットを含有するペトリ皿のついた試
験ケージに入れた。マウスを肉眼で観察し、それから7
時間、IV注射の0.5、1、2、3、4、6及び7時
間後に食物摂取を測定した。IV注射前と24時間後に
体重を測定した。2つの別々の群のカニューレを挿入し
たマウス(ob/ob11匹及び痩身12匹)を5回の
個別の試験で使用した。ほとんどのマウスに、相殺する
順でマウスob蛋白と1つ又は両方の対照液注射を行っ
た。この実験には、マウスob蛋白の2つの別の調製物
を使用した。ここに報告したデータは、これら個々の反
復の結果の組合せである。
895-898 (1993)の方法により、オス及びメスの肥満ob
/obマウス(6〜13週齢)にペントバルビタール麻
酔(80mg/kg 体重)下で長期頚部カニューレを埋め込
んた。12時間/12時間の明暗サイクルで一定の環境
条件下のプラスチックケージにマウスを個々に収容し
た。毎日固定して体重を測定し、カニューレの開存は、
1日おきに無菌ヘパリン/生理食塩水(0.9%生理食
塩水中50U/ml)≦0.1mlの注入により確認して維持
した。手術から完全に回復後、マウスを16〜18時間
(一晩)絶食させた。翌朝、マウスの体重を測定し、実
験の前の環境順応のために45分間試験ケージに入れ
た。水は継続して自由に与えた。マウスob蛋白(0.
1ml中3μg)又は等容量の賦形剤対照液又は生理食塩水
(0.9%)を静脈内注射した。覚醒しているマウスを
軽く拘束し、0.5mlのインスリンシリンジを使用し
て、試験液0.1ml、続いてヘパリン/生理食塩水0.
05mlを注射した。試験は少なくとも3日間おいて行っ
た。次いで直ちに、マウスを、前もって重量を測定した
マウス用の餌のペレットを含有するペトリ皿のついた試
験ケージに入れた。マウスを肉眼で観察し、それから7
時間、IV注射の0.5、1、2、3、4、6及び7時
間後に食物摂取を測定した。IV注射前と24時間後に
体重を測定した。2つの別々の群のカニューレを挿入し
たマウス(ob/ob11匹及び痩身12匹)を5回の
個別の試験で使用した。ほとんどのマウスに、相殺する
順でマウスob蛋白と1つ又は両方の対照液注射を行っ
た。この実験には、マウスob蛋白の2つの別の調製物
を使用した。ここに報告したデータは、これら個々の反
復の結果の組合せである。
【0129】A.結果 上記実験の結果は以下のとおりであった: IV注射後最初の30分間、ほとんどの肥満及び痩身マ
ウスは短い間隔をおいて食べ、約0.3〜0.5グラム
消費した。生理食塩水及び賦形剤対照液を注射した肥満
マウスの食物摂取は、実験を通して上昇した。賦形剤対
照液を注射した肥満ob/obマウスの累積食物摂取量
は、同様に絶食させた生理食塩水を注射した肥満マウス
の食物摂取量と差がなかった。対照的に、組換えob蛋
白を注射した肥満ob/obマウスの食物摂取量は有意
に低下し、対照の57%に抑制された(第2表)。7時
間の観察期間を通して、賦形剤対照液及びob蛋白の群
には、他の行動に及ぼす効果は観察されなかった。予想
通り、マウスob蛋白の単回IVボーラスの限定された
作用時間のために、注射24時間後の体重増加は、処理
群間に差はなかった。
ウスは短い間隔をおいて食べ、約0.3〜0.5グラム
消費した。生理食塩水及び賦形剤対照液を注射した肥満
マウスの食物摂取は、実験を通して上昇した。賦形剤対
照液を注射した肥満ob/obマウスの累積食物摂取量
は、同様に絶食させた生理食塩水を注射した肥満マウス
の食物摂取量と差がなかった。対照的に、組換えob蛋
白を注射した肥満ob/obマウスの食物摂取量は有意
に低下し、対照の57%に抑制された(第2表)。7時
間の観察期間を通して、賦形剤対照液及びob蛋白の群
には、他の行動に及ぼす効果は観察されなかった。予想
通り、マウスob蛋白の単回IVボーラスの限定された
作用時間のために、注射24時間後の体重増加は、処理
群間に差はなかった。
【0130】B.結論 これらの結果により、組換えマウスob蛋白が、肥満o
b/obマウスへのIV投与(3μg/マウス)後の累積
7時間食物摂取量を有意に低下させることが明らかにな
った。肥満ob/obマウスにおける食物摂取を低下さ
せる組換えマウスob蛋白の能力は、肥満ob/obマ
ウスにおけるob蛋白の繰り返しIP注射により得られ
る食物摂取の結果に一致した。この実施例では、メスの
肥満ob/obマウスにおける細菌で発現させた組換え
マウスob蛋白の生物学的活性も確認された。
b/obマウスへのIV投与(3μg/マウス)後の累積
7時間食物摂取量を有意に低下させることが明らかにな
った。肥満ob/obマウスにおける食物摂取を低下さ
せる組換えマウスob蛋白の能力は、肥満ob/obマ
ウスにおけるob蛋白の繰り返しIP注射により得られ
る食物摂取の結果に一致した。この実施例では、メスの
肥満ob/obマウスにおける細菌で発現させた組換え
マウスob蛋白の生物学的活性も確認された。
【0131】
【表2】
【0132】データは、平均値±semである。nはマ
ウスの個体数を示し、semは「標準誤差」を意味し、
*はob蛋白群と人工CSF群との間の有意(p<0.
05)な差を示す。 **は、対照を100としたパーセントを示す。
ウスの個体数を示し、semは「標準誤差」を意味し、
*はob蛋白群と人工CSF群との間の有意(p<0.
05)な差を示す。 **は、対照を100としたパーセントを示す。
【0133】実施例15マウスob蛋白の生物学的活性:ob/obマウスにお
ける繰り返しIP注射 実施例2〜5により得られた精製されたマウスob蛋白
の生物学的活性を、以下のとおりに肥満ob/obマウ
スへの繰り返し腹腔内(IP)注射により試験した。
ける繰り返しIP注射 実施例2〜5により得られた精製されたマウスob蛋白
の生物学的活性を、以下のとおりに肥満ob/obマウ
スへの繰り返し腹腔内(IP)注射により試験した。
【0134】3群の6匹のメスの肥満ob/obマウス
を検討した。12時間/12時間の明暗サイクルで一定
の環境条件下のプラスチックケージにマウスを収容した
(1ケージ当り3匹)。24時間食物摂取と体重を毎日
測定した。環境条件及び日常の取り扱いと注射に対する
適応期間の後、マウスを3つの処理群に仕分けした。各
マウスに、各処理日に下記の試験液0.1mlの2回(明
暗サイクルの暗相の始まる少し前と暗相に入って3時
間)の腹腔内(IP)注射を行った: 1)生理食塩水(0.9%); 2)細菌性対照液;又は3)マウスob蛋白(3μg/
0.1ml)。 細菌性対照液は、大腸菌に挿入されたプラスミドにマウ
スob遺伝子が含まれていなかったことを除いて、マウ
スob蛋白を得て精製するための実施例2〜4に略述し
た手順により同様に処理し調製した試料であった。5日
間マウスを1日2回処理し、次に2日間何も処理しなか
った。各ケージの食物摂取量を、各処理日に最初のIP
注射の2、3、5及び24時間後に測定した。
を検討した。12時間/12時間の明暗サイクルで一定
の環境条件下のプラスチックケージにマウスを収容した
(1ケージ当り3匹)。24時間食物摂取と体重を毎日
測定した。環境条件及び日常の取り扱いと注射に対する
適応期間の後、マウスを3つの処理群に仕分けした。各
マウスに、各処理日に下記の試験液0.1mlの2回(明
暗サイクルの暗相の始まる少し前と暗相に入って3時
間)の腹腔内(IP)注射を行った: 1)生理食塩水(0.9%); 2)細菌性対照液;又は3)マウスob蛋白(3μg/
0.1ml)。 細菌性対照液は、大腸菌に挿入されたプラスミドにマウ
スob遺伝子が含まれていなかったことを除いて、マウ
スob蛋白を得て精製するための実施例2〜4に略述し
た手順により同様に処理し調製した試料であった。5日
間マウスを1日2回処理し、次に2日間何も処理しなか
った。各ケージの食物摂取量を、各処理日に最初のIP
注射の2、3、5及び24時間後に測定した。
【0135】A.結果 食物摂取の低下 1週間の実験を通して、処理日と非処理日の生理食塩水
及び細菌性対照液を注射したマウスの間で、食物摂取に
差はなかった(第3表)。しかし、実験を通して、処理
日にob蛋白6μg を注射した6匹のマウスでは食物摂
取が低下した。細菌性対照液及び生理食塩水対照群に比
較して、ob蛋白を投与した群では、処理日の最初の注
射から2、3、5及び24時間後に食物摂取の低下が観
察された。
及び細菌性対照液を注射したマウスの間で、食物摂取に
差はなかった(第3表)。しかし、実験を通して、処理
日にob蛋白6μg を注射した6匹のマウスでは食物摂
取が低下した。細菌性対照液及び生理食塩水対照群に比
較して、ob蛋白を投与した群では、処理日の最初の注
射から2、3、5及び24時間後に食物摂取の低下が観
察された。
【0136】体重増加の低下 ob蛋白群の5処理日にわたる累積体重増加は、−3.
3±0.7グラムであり、これに対して生理食塩水群で
は−0.9±0.2グラム、細菌性対照液群では−0.
7±0.4グラムであった(第3表)。
3±0.7グラムであり、これに対して生理食塩水群で
は−0.9±0.2グラム、細菌性対照液群では−0.
7±0.4グラムであった(第3表)。
【0137】結論 この実施例により、細菌で発現させた組換えマウスob
蛋白(6μg/マウス/日)の1日2回のIP注射が、生
理食塩水及び細菌性対照液処理のob/obマウスに比
較して、処理したメスのob/obマウスの食物摂取の
有意で持続的な低下と、体重増加速度の有意な低下をも
たらすことが明らかになった。これらの結果により、本
発明により、細菌で発現させたマウスob蛋白が生物学
的に活性であり、遺伝的に肥満のob/obマウスに対
して期待通りの抗肥満効果を及ぼすことを証明した。第
3表において、2及び5時間の結果は平均1日食物摂取
量であり、一方、24時間の結果は処理5日間の平均累
積食物摂取量である。
蛋白(6μg/マウス/日)の1日2回のIP注射が、生
理食塩水及び細菌性対照液処理のob/obマウスに比
較して、処理したメスのob/obマウスの食物摂取の
有意で持続的な低下と、体重増加速度の有意な低下をも
たらすことが明らかになった。これらの結果により、本
発明により、細菌で発現させたマウスob蛋白が生物学
的に活性であり、遺伝的に肥満のob/obマウスに対
して期待通りの抗肥満効果を及ぼすことを証明した。第
3表において、2及び5時間の結果は平均1日食物摂取
量であり、一方、24時間の結果は処理5日間の平均累
積食物摂取量である。
【0138】
【表3】
【0139】データは、各群6匹のob/obマウスの
平均値±標準誤差である。食物摂取は、処理5日間の、
最初のIP注射の2、5及び24時間後の、3匹のマウ
スのケージの平均累積摂取量である。体重増加は、処理
5日間の体重の累積変化である。*はob蛋白群と賦形
剤群との間の有意(p<0.05)な差を示す。
平均値±標準誤差である。食物摂取は、処理5日間の、
最初のIP注射の2、5及び24時間後の、3匹のマウ
スのケージの平均累積摂取量である。体重増加は、処理
5日間の体重の累積変化である。*はob蛋白群と賦形
剤群との間の有意(p<0.05)な差を示す。
【0140】実施例16 ヒトob蛋白の生物学的活性:ob/obマウスにおけ
る脳室内(ICV)注射 ob /obマウスにおける脳室内(ICV)注射による
ヒトob蛋白の生物学的活性を測定するのに使用した方
法は、試験液が下記のとおりである他は、実施例13と
同じであった: ・0.1%マウス血清アルブミンを含有するリン酸緩衝
生理食塩水(PBS)中の、実施例11で製造された組
換えヒトob蛋白(0.05μg);及び・賦形剤対照液
として、0.1%(w/v)マウス血清アルブミンを含有す
るPBS(アルブミン対照液)。
る脳室内(ICV)注射 ob /obマウスにおける脳室内(ICV)注射による
ヒトob蛋白の生物学的活性を測定するのに使用した方
法は、試験液が下記のとおりである他は、実施例13と
同じであった: ・0.1%マウス血清アルブミンを含有するリン酸緩衝
生理食塩水(PBS)中の、実施例11で製造された組
換えヒトob蛋白(0.05μg);及び・賦形剤対照液
として、0.1%(w/v)マウス血清アルブミンを含有す
るPBS(アルブミン対照液)。
【0141】A.食物摂取の低下 ICV注射後最初の30分間、ほとんど全てのマウスは
短い間隔をおいて食べ、約0.5グラム消費した。注射
していないマウスは、その後6.5時間食べ続けて、累
積7時間摂取量は1.8グラムに達した(第4表)。ア
ルブミン対照液のICVを行ったマウスは、30分後食
べるのを停止し、3〜7時間後になってようやく再び食
べ始めた。対照的に、ヒトob蛋白ICVで処理したマ
ウスは、最初の30分間に食べた量は有意に少なく
(0.2グラム)、その後6.5時間の間非常に少量を
食べた。即ち、次の6.5時間にわたってこれらの累積
食物摂取量は、約0.4グラムで抑制され続けた(第4
表)。
短い間隔をおいて食べ、約0.5グラム消費した。注射
していないマウスは、その後6.5時間食べ続けて、累
積7時間摂取量は1.8グラムに達した(第4表)。ア
ルブミン対照液のICVを行ったマウスは、30分後食
べるのを停止し、3〜7時間後になってようやく再び食
べ始めた。対照的に、ヒトob蛋白ICVで処理したマ
ウスは、最初の30分間に食べた量は有意に少なく
(0.2グラム)、その後6.5時間の間非常に少量を
食べた。即ち、次の6.5時間にわたってこれらの累積
食物摂取量は、約0.4グラムで抑制され続けた(第4
表)。
【0142】B.体重増加の低下 賦形剤対照を注射したマウスの体重の24時間の変化
は、アルブミン対照液を注射したか何も注射していない
マウスに比べてわずかに低下した(第4表)。しかし、
ヒトob蛋白を注射したマウスの体重の変化パーセント
はゼロに近かった(第4表)。
は、アルブミン対照液を注射したか何も注射していない
マウスに比べてわずかに低下した(第4表)。しかし、
ヒトob蛋白を注射したマウスの体重の変化パーセント
はゼロに近かった(第4表)。
【0143】C.結論 組換えヒトob蛋白の脳への直接投与(1μl 中の0.
05μg/マウス)の観察された効果は、メスのob/o
bマウスの食物摂取及び体重増加の持続的で有意な低下
であった。これにより、ob蛋白が脳に直接に作用する
ことができ、腹腔内に注射された時のob蛋白の効果に
一致することが証明された。この実施例では、メスの肥
満ob/obマウスにおける細菌で発現させた組換えヒ
トob蛋白の生物学的活性も確認された。
05μg/マウス)の観察された効果は、メスのob/o
bマウスの食物摂取及び体重増加の持続的で有意な低下
であった。これにより、ob蛋白が脳に直接に作用する
ことができ、腹腔内に注射された時のob蛋白の効果に
一致することが証明された。この実施例では、メスの肥
満ob/obマウスにおける細菌で発現させた組換えヒ
トob蛋白の生物学的活性も確認された。
【0144】
【表4】
【0145】データは、平均値±標準誤差である。nは
マウスの個体数を示す。*は、ヒトob蛋白群とアルブ
ミン対照液群との間の有意(p<0.05)な差を示
す。**は、対照を100としたパーセントを示す。
マウスの個体数を示す。*は、ヒトob蛋白群とアルブ
ミン対照液群との間の有意(p<0.05)な差を示
す。**は、対照を100としたパーセントを示す。
【0146】実施例17 肥満ヒト被験者におけるob蛋白の生物学的活性:IV
投与後の試験食摂取の低下 各々実施例7〜11により得られた精製されたマウス及
びヒトob蛋白の生物学的活性を、以下のとおりにヒト
へのIV投与後の試験食摂取量を測定することにより測
定した。
投与後の試験食摂取の低下 各々実施例7〜11により得られた精製されたマウス及
びヒトob蛋白の生物学的活性を、以下のとおりにヒト
へのIV投与後の試験食摂取量を測定することにより測
定した。
【0147】痩身及び肥満のヒト志願者に、Muurahaine
n, N.E. らの上記文献の方法を使用して2つの場合で食
事実験室内で一定カロリー含量の試験食を与えた。食事
提供の少なくとも1時間前に、内在式(indwelling)I
Vカテーテルを肘前又は前腕静脈に入れて、ヘパリンロ
ックで開口を維持した。食事提供の15分前、15分
後、及び試験食の終了時に、視覚によるアナログの飢餓
評点を得た。次いで、食事提供の20分前にマウス又は
ヒトob蛋白あるいは生理食塩水をIV注入した。各被
験者に、満足するまで好きなだけ試験食を食べるように
指示した。各被験者が摂取した試験食の量を測定した。
次に、各被験者にヒトob蛋白(0.5mg/kg 体重)、
マウスob蛋白(0.5mg/kg 体重)又は生理食塩水の
いずれかを注入して、これらの条件下での摂取した試験
食の量の差を計算した。ヒト又はマウスob蛋白群にお
いて、消費した食事量が少なくとも20%低下した。
n, N.E. らの上記文献の方法を使用して2つの場合で食
事実験室内で一定カロリー含量の試験食を与えた。食事
提供の少なくとも1時間前に、内在式(indwelling)I
Vカテーテルを肘前又は前腕静脈に入れて、ヘパリンロ
ックで開口を維持した。食事提供の15分前、15分
後、及び試験食の終了時に、視覚によるアナログの飢餓
評点を得た。次いで、食事提供の20分前にマウス又は
ヒトob蛋白あるいは生理食塩水をIV注入した。各被
験者に、満足するまで好きなだけ試験食を食べるように
指示した。各被験者が摂取した試験食の量を測定した。
次に、各被験者にヒトob蛋白(0.5mg/kg 体重)、
マウスob蛋白(0.5mg/kg 体重)又は生理食塩水の
いずれかを注入して、これらの条件下での摂取した試験
食の量の差を計算した。ヒト又はマウスob蛋白群にお
いて、消費した食事量が少なくとも20%低下した。
【0148】実施例18 肥満ヒト被験者におけるob蛋白の生物学的活性:繰り
返しIV投与による体重減少の誘導 各々実施例7〜11により得られた精製されたマウス及
びヒトob蛋白の生物学的活性を、以下の方法により、
ob蛋白の繰り返しIV投与後の体重減少を測定するこ
とにより測定した。
返しIV投与による体重減少の誘導 各々実施例7〜11により得られた精製されたマウス及
びヒトob蛋白の生物学的活性を、以下の方法により、
ob蛋白の繰り返しIV投与後の体重減少を測定するこ
とにより測定した。
【0149】Drent, M.L. らの上記文献の方法を使用し
て、プラセボ対照を用いた二重盲検体重減少試験を行っ
た。肥満指数(BMI)が27を超える肥満被験者の体
重を測定し、2〜4週間のならし(run-in)期間の間、
1,500Kcalの規定食を与えた。ならし期間の最後
に、少なくとも1kg体重が減少した全ての肥満被験者
を、ならし相での体重減少に合わせて2つの処理群に無
作為に分けた。被験者に、ヒト又はマウスob蛋白
(0.5mg/kg/日)あるいはプラセボ(生理食塩水)
を、少なくとも6週間、毎日IV投与した。毎週体重を
記録した。ヒト又はマウスob蛋白を投与した被験者
は、6週間の処理後、プラセボ群に比べて有意な体重の
減少があった。
て、プラセボ対照を用いた二重盲検体重減少試験を行っ
た。肥満指数(BMI)が27を超える肥満被験者の体
重を測定し、2〜4週間のならし(run-in)期間の間、
1,500Kcalの規定食を与えた。ならし期間の最後
に、少なくとも1kg体重が減少した全ての肥満被験者
を、ならし相での体重減少に合わせて2つの処理群に無
作為に分けた。被験者に、ヒト又はマウスob蛋白
(0.5mg/kg/日)あるいはプラセボ(生理食塩水)
を、少なくとも6週間、毎日IV投与した。毎週体重を
記録した。ヒト又はマウスob蛋白を投与した被験者
は、6週間の処理後、プラセボ群に比べて有意な体重の
減少があった。
【0150】実施例19 A.大腸菌細胞からのポリエチレングリコール結合ob
蛋白の調製 実施例8に記載されたように調製した大腸菌細胞ペレッ
ト50gを、再懸濁の前に、5mMEDTAを含有する5
0mMトリス−HCl(pH8.5)1lに懸濁した。この
懸濁液を37℃で15分間インキュベートし、5mMED
TAを含有する50mMトリス−HCl(pH8.5)1l
で更に希釈した。次に、この懸濁液を、ホモジナイザー
を使用して50%の出力設定で15分間ホモジナイズし
た。8,000rpm で1時間4℃で遠心分離することに
より、この懸濁液を清澄化した。ペレットを廃棄した。
伝導率が1.8mSになるまで上澄液を水で希釈して、前
もって50mMトリス−HCl(pH8.5)で平衡化した
Q−セファロース・ファスト・フロー(強陰イオン性イ
オン交換樹脂)200mlを充填したカラムに直接適用し
た。平衡化緩衝液で洗浄後、100mMNaClを更に含
有する同じ平衡化緩衝液で、吸着したob蛋白をカラム
から溶出した。塩化ナトリウムを含有する平衡化緩衝液
によるカラムの処理後得られた溶出物を、Q−セファロ
ース溶出物と呼んだ。
蛋白の調製 実施例8に記載されたように調製した大腸菌細胞ペレッ
ト50gを、再懸濁の前に、5mMEDTAを含有する5
0mMトリス−HCl(pH8.5)1lに懸濁した。この
懸濁液を37℃で15分間インキュベートし、5mMED
TAを含有する50mMトリス−HCl(pH8.5)1l
で更に希釈した。次に、この懸濁液を、ホモジナイザー
を使用して50%の出力設定で15分間ホモジナイズし
た。8,000rpm で1時間4℃で遠心分離することに
より、この懸濁液を清澄化した。ペレットを廃棄した。
伝導率が1.8mSになるまで上澄液を水で希釈して、前
もって50mMトリス−HCl(pH8.5)で平衡化した
Q−セファロース・ファスト・フロー(強陰イオン性イ
オン交換樹脂)200mlを充填したカラムに直接適用し
た。平衡化緩衝液で洗浄後、100mMNaClを更に含
有する同じ平衡化緩衝液で、吸着したob蛋白をカラム
から溶出した。塩化ナトリウムを含有する平衡化緩衝液
によるカラムの処理後得られた溶出物を、Q−セファロ
ース溶出物と呼んだ。
【0151】最終伝導率が82mSに達するまでQ−セフ
ァロース溶出物に固体NaClを添加した。次に、この
溶出物を、1M NaClを含有する50mMトリス−HC
l(pH8.5)で前もって平衡化したブチル−セファロ
ース・ファスト・フロー200mlを充填した疎水性相互
作用カラム(HIC)に適用した。吸着していない物質
を平衡化緩衝液で洗い流して、吸着したob蛋白を50
mM酢酸アンモニウム(pH6.9)で溶出してHIC溶出
物を製造した。逆相HPLCにより測定したところ、H
IC溶出物中のob蛋白は純度95%であった。サイジ
ング(sizing)膜(YM−10)を使用して、この精製
したob蛋白を3.7mg/ml まで濃縮した。このサイジ
ング膜は、10,000ダルトン以上の分子を保持する
膜であった。サイジング膜を使用するこの濃縮工程後、
ob蛋白を100mMホウ酸緩衝液(pH8.0)中に透析
濾過して、これをob保存溶液として使用した。
ァロース溶出物に固体NaClを添加した。次に、この
溶出物を、1M NaClを含有する50mMトリス−HC
l(pH8.5)で前もって平衡化したブチル−セファロ
ース・ファスト・フロー200mlを充填した疎水性相互
作用カラム(HIC)に適用した。吸着していない物質
を平衡化緩衝液で洗い流して、吸着したob蛋白を50
mM酢酸アンモニウム(pH6.9)で溶出してHIC溶出
物を製造した。逆相HPLCにより測定したところ、H
IC溶出物中のob蛋白は純度95%であった。サイジ
ング(sizing)膜(YM−10)を使用して、この精製
したob蛋白を3.7mg/ml まで濃縮した。このサイジ
ング膜は、10,000ダルトン以上の分子を保持する
膜であった。サイジング膜を使用するこの濃縮工程後、
ob蛋白を100mMホウ酸緩衝液(pH8.0)中に透析
濾過して、これをob保存溶液として使用した。
【0152】B.ヒトob蛋白のPEG化 このPEG化反応を実施する際、シアーウォーター・ポ
リマーズ(ShearwaterPolymers)、アラバマ州ハンツビ
ル(Huntsville)から購入した式(II−A)のPEG2
−NHS試薬〔式中、RはCH3 であり、n及びn′の
合計は820〜1,040の範囲であり、平均合計は約
930であり、そして平均分子量40kDa である〕を使
用した。これは、式(II−A)のPEG2 −NHS試薬
の混合物であり、n′に対するnの比が約1.0であ
り、この混合物中のn及びn′の合計が820〜1,0
40ユニットの範囲であり、この混合物中のPEG鎖の
平均分子量は約20kDa であって、このため、この試薬
の平均分子量は約40kDa であり、この混合物中のn及
びn′の平均合計は約930である。上記パートAで調
製した3.7mg/ml 精製ヒトob保存溶液0.54ml
〔ob蛋白125nmol〕又は2mgに、上記PEG2 −N
HS試薬溶液250nmolを添加した。この溶液は、1mM
HCl中の100mg/ml PEG2 −NHS試薬溶液0.
1ml又は10mgよりなっていた。100mMホウ酸塩(pH
5.0)を添加することにより全反応混合物を0.67
mlに調製した。蛋白対試薬の最終モル比は1:2であっ
た。この混合物を、4℃で4時間撹拌して、氷酢酸1μ
l の添加により最終pHを4.5にして反応を停止し
た。生じた反応混合物(0.67ml)を水で希釈して溶
液27mlを形成し、これをカルボキシメチル化陽イオン
交換樹脂〔パーセプティブズ(Perseptives)、マサチュ
ーセッツ州フラミンガム〕1.7mlを含有するカラムに
適用した。このカラムを、3.3μM HEPES/ME
S/酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0で平衡化した。希
釈した反応混合物をこのカラムに適用して、吸着してい
ないPEG2 −NHS試薬をカラムから洗い流した。吸
着したPEG化及び非修飾ob蛋白を、80、150及
び500mMNaClの段階塩勾配〔各15カラム容量〕
で溶出した。これらの溶出物2mlを別々に順に集めて、
各画分の試料をSDS−PAGE解析にかけた。この解
析により、高度PEG化コンジュゲート、目的の分枝状
モノ−PEG−ob(PEG2 −ob)及び非修飾ob
蛋白として溶出物を分類した。これらの各画分を、上で
設定した分類にプールした。第二のプールが目的の分枝
状モノ−PEG2 −ob蛋白を含有していた。この目的
蛋白は、式(I−A)〔式中、n及びn′の合計は約8
20〜1,040であり、平均合計は約930であり、
R及びR′はCH3 であり、そして各PEG鎖の平均分
子量は約20kDa である〕の化合物の構造であった。こ
のPEG化生成物は、約56kDa の平均分子量であっ
た。YM10膜を使用して、PEG2 −obを含有する
プールを3.7mg/ml まで濃縮した。YM10は、10
kDa 以上の分子量の分子を保持するサイジング膜であ
る。このサイジング工程後、濃縮物質をPBS緩衝液
(pH7.3)中に透析濾過して、−20℃で凍結保存し
た。この保存生成物は、式(I−A)のPEG化ob蛋
白であり、n及びn′の合計は約820〜1,040で
あり、各ob鎖の平均分子量は約20kDa であった。こ
のob蛋白コンジュゲート混合物中のPEG蛋白の平均
分子量は56kDa であった。
リマーズ(ShearwaterPolymers)、アラバマ州ハンツビ
ル(Huntsville)から購入した式(II−A)のPEG2
−NHS試薬〔式中、RはCH3 であり、n及びn′の
合計は820〜1,040の範囲であり、平均合計は約
930であり、そして平均分子量40kDa である〕を使
用した。これは、式(II−A)のPEG2 −NHS試薬
の混合物であり、n′に対するnの比が約1.0であ
り、この混合物中のn及びn′の合計が820〜1,0
40ユニットの範囲であり、この混合物中のPEG鎖の
平均分子量は約20kDa であって、このため、この試薬
の平均分子量は約40kDa であり、この混合物中のn及
びn′の平均合計は約930である。上記パートAで調
製した3.7mg/ml 精製ヒトob保存溶液0.54ml
〔ob蛋白125nmol〕又は2mgに、上記PEG2 −N
HS試薬溶液250nmolを添加した。この溶液は、1mM
HCl中の100mg/ml PEG2 −NHS試薬溶液0.
1ml又は10mgよりなっていた。100mMホウ酸塩(pH
5.0)を添加することにより全反応混合物を0.67
mlに調製した。蛋白対試薬の最終モル比は1:2であっ
た。この混合物を、4℃で4時間撹拌して、氷酢酸1μ
l の添加により最終pHを4.5にして反応を停止し
た。生じた反応混合物(0.67ml)を水で希釈して溶
液27mlを形成し、これをカルボキシメチル化陽イオン
交換樹脂〔パーセプティブズ(Perseptives)、マサチュ
ーセッツ州フラミンガム〕1.7mlを含有するカラムに
適用した。このカラムを、3.3μM HEPES/ME
S/酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0で平衡化した。希
釈した反応混合物をこのカラムに適用して、吸着してい
ないPEG2 −NHS試薬をカラムから洗い流した。吸
着したPEG化及び非修飾ob蛋白を、80、150及
び500mMNaClの段階塩勾配〔各15カラム容量〕
で溶出した。これらの溶出物2mlを別々に順に集めて、
各画分の試料をSDS−PAGE解析にかけた。この解
析により、高度PEG化コンジュゲート、目的の分枝状
モノ−PEG−ob(PEG2 −ob)及び非修飾ob
蛋白として溶出物を分類した。これらの各画分を、上で
設定した分類にプールした。第二のプールが目的の分枝
状モノ−PEG2 −ob蛋白を含有していた。この目的
蛋白は、式(I−A)〔式中、n及びn′の合計は約8
20〜1,040であり、平均合計は約930であり、
R及びR′はCH3 であり、そして各PEG鎖の平均分
子量は約20kDa である〕の化合物の構造であった。こ
のPEG化生成物は、約56kDa の平均分子量であっ
た。YM10膜を使用して、PEG2 −obを含有する
プールを3.7mg/ml まで濃縮した。YM10は、10
kDa 以上の分子量の分子を保持するサイジング膜であ
る。このサイジング工程後、濃縮物質をPBS緩衝液
(pH7.3)中に透析濾過して、−20℃で凍結保存し
た。この保存生成物は、式(I−A)のPEG化ob蛋
白であり、n及びn′の合計は約820〜1,040で
あり、各ob鎖の平均分子量は約20kDa であった。こ
のob蛋白コンジュゲート混合物中のPEG蛋白の平均
分子量は56kDa であった。
【0153】実施例20 PEG化ヒトob蛋白の生物学的試験:ob/obマウ
スにおける単回IP注射方法 2群の6匹のメスの肥満ob/obマウスを検討した。
12時間/12時間の明暗サイクルで一定の環境条件下
のプラスチックケージにマウスを収容した(3匹/ケー
ジ)。24時間食物摂取と体重を毎日測定した。環境条
件、日常の取り扱い及び注射に対する適応期間の後、マ
ウスを2つの処理群に仕分けした。実験の第1日目に、
1回(明暗サイクルの暗相の始まる直前)の腹腔内(I
P)注射で各マウスに下記の試験液0.1mlを与えた:
生理食塩水(0.9%);実施例19のパートAで調製
したヒトob蛋白保存溶液(30μg/0.1ml);PE
G化対照溶液(ヒトob蛋白を含まない、同様に処理し
精製した試料)又は実施例19に記載されたように調製
したPEG化ob蛋白(30μg/0.1ml)。第1日目
に1回だけマウスに注射した。その後3日間及び第6日
目に再度、ケージの毎日の食物摂取量と各マウスの体重
を測定した。
スにおける単回IP注射方法 2群の6匹のメスの肥満ob/obマウスを検討した。
12時間/12時間の明暗サイクルで一定の環境条件下
のプラスチックケージにマウスを収容した(3匹/ケー
ジ)。24時間食物摂取と体重を毎日測定した。環境条
件、日常の取り扱い及び注射に対する適応期間の後、マ
ウスを2つの処理群に仕分けした。実験の第1日目に、
1回(明暗サイクルの暗相の始まる直前)の腹腔内(I
P)注射で各マウスに下記の試験液0.1mlを与えた:
生理食塩水(0.9%);実施例19のパートAで調製
したヒトob蛋白保存溶液(30μg/0.1ml);PE
G化対照溶液(ヒトob蛋白を含まない、同様に処理し
精製した試料)又は実施例19に記載されたように調製
したPEG化ob蛋白(30μg/0.1ml)。第1日目
に1回だけマウスに注射した。その後3日間及び第6日
目に再度、ケージの毎日の食物摂取量と各マウスの体重
を測定した。
【0154】結果 A)食物摂取の低下 生理食塩水及びPEG化対照液を注射したマウスには、
単回処理及びそれに続く2日間、1日食物摂取量に差は
なかった(第5表)。しかし、処理日に、30μg のヒ
トob蛋白及びPEG化ヒトob蛋白を注射した6匹の
マウスでは、生理食塩水及びPEG化対照液を注射した
マウスに比較して、1日摂取量が低下(5.2、8.2
対11.9、11.4g)した。ヒトob蛋白を注射し
たマウスの食物摂取は対照レベルに戻ったが、一方、P
EG化ヒトob蛋白を注射したマウスの食物摂取は実験
のそれ以降の日も低下したままだった。PEG化ヒトo
b蛋白群では、食物摂取の低下が単回注射後48時間観
察された。PEG化ヒトob蛋白では、生理食塩水及び
PEG化対照群に比較して、実験から3日間にわたる累
積24時間食物摂取が対照の49%と有意に低下した。
単回処理及びそれに続く2日間、1日食物摂取量に差は
なかった(第5表)。しかし、処理日に、30μg のヒ
トob蛋白及びPEG化ヒトob蛋白を注射した6匹の
マウスでは、生理食塩水及びPEG化対照液を注射した
マウスに比較して、1日摂取量が低下(5.2、8.2
対11.9、11.4g)した。ヒトob蛋白を注射し
たマウスの食物摂取は対照レベルに戻ったが、一方、P
EG化ヒトob蛋白を注射したマウスの食物摂取は実験
のそれ以降の日も低下したままだった。PEG化ヒトo
b蛋白群では、食物摂取の低下が単回注射後48時間観
察された。PEG化ヒトob蛋白では、生理食塩水及び
PEG化対照群に比較して、実験から3日間にわたる累
積24時間食物摂取が対照の49%と有意に低下した。
【0155】B)体重増加の低下 生理食塩水及びPEG化対照液を注射したマウスには、
単回処理及びそれに続く2日間、体重の変化に差はなか
った(第6表)。しかし、処理日に、30μgのヒトo
b蛋白及びPEG化ヒトob蛋白を注射した6匹のマウ
スでは、生理食塩水及びPEG化対照液を注射したマウ
スに比較して、体重が低下(−0.9、−0.7対0.
1、0.3g)した。ヒトob蛋白を注射したマウスの
体重は対照レベルに戻ったが、一方、PEG化ヒトob
蛋白を注射したマウスの体重は実験のそれ以降の日も低
下し続けた。PEG化ヒトob蛋白群では、継続した体
重の低下が単回注射後48時間観察された。実験の6日
間にわたる体重の累積変化は−1.6グラムであり、こ
れに対してob蛋白群では0.4グラム、生理食塩水で
は0.7グラム、そしてPEG化対照群では1.1±
0.2グラムであった(第6表)。
単回処理及びそれに続く2日間、体重の変化に差はなか
った(第6表)。しかし、処理日に、30μgのヒトo
b蛋白及びPEG化ヒトob蛋白を注射した6匹のマウ
スでは、生理食塩水及びPEG化対照液を注射したマウ
スに比較して、体重が低下(−0.9、−0.7対0.
1、0.3g)した。ヒトob蛋白を注射したマウスの
体重は対照レベルに戻ったが、一方、PEG化ヒトob
蛋白を注射したマウスの体重は実験のそれ以降の日も低
下し続けた。PEG化ヒトob蛋白群では、継続した体
重の低下が単回注射後48時間観察された。実験の6日
間にわたる体重の累積変化は−1.6グラムであり、こ
れに対してob蛋白群では0.4グラム、生理食塩水で
は0.7グラム、そしてPEG化対照群では1.1±
0.2グラムであった(第6表)。
【0156】結論 この実施例により、PEG化ヒトob蛋白(30μg/マ
ウス)の単回IP注射が、3日間にわたって、生理食塩
水及びPEG化対照液処理のob/obマウスに比較し
て、処理したメスのob/obマウスの食物摂取の有意
で持続的な低下と、体重増加の有意な低下をもたらすこ
とが明らかになった。これらの結果により、PEG化ヒ
トob蛋白が、持続的な強力な生物学的活性を有し、遺
伝的に肥満のob/obマウスに対して期待通りの抗肥
満効果を有することが証明された。
ウス)の単回IP注射が、3日間にわたって、生理食塩
水及びPEG化対照液処理のob/obマウスに比較し
て、処理したメスのob/obマウスの食物摂取の有意
で持続的な低下と、体重増加の有意な低下をもたらすこ
とが明らかになった。これらの結果により、PEG化ヒ
トob蛋白が、持続的な強力な生物学的活性を有し、遺
伝的に肥満のob/obマウスに対して期待通りの抗肥
満効果を有することが証明された。
【0157】
【表5】
【0158】データは、各群6匹のob/obマウスの
平均値である。食物摂取は、第1日目に単回IP注射
後、各実験日の3匹のマウスのケージについての平均1
日食物摂取量である。1日食物摂取の持続性の低下は、
PEG化ob蛋白群のみであることに注意されたい。
平均値である。食物摂取は、第1日目に単回IP注射
後、各実験日の3匹のマウスのケージについての平均1
日食物摂取量である。1日食物摂取の持続性の低下は、
PEG化ob蛋白群のみであることに注意されたい。
【0159】
【表6】
【0160】データは、各群6匹のob/obマウスの
平均値である。第1日目のみに単回IP注射をマウスに
行った。体重の変化は、各実験日の体重の変化である。
持続性の体重減少は、PEG化ob蛋白群のみであるこ
とに注意されたい。表中のNDは、測定しなかったこと
を示す。
平均値である。第1日目のみに単回IP注射をマウスに
行った。体重の変化は、各実験日の体重の変化である。
持続性の体重減少は、PEG化ob蛋白群のみであるこ
とに注意されたい。表中のNDは、測定しなかったこと
を示す。
【0161】
【配列表】(1)一般的情報 (i)出願人: (A)名称:エフ・ホフマン・ラ・ロシュ AG (B)番地:Grenzacherstrasse 124 (C)市:バーゼル (D)州:BS (E)国:スイス (F)郵便番号:CH−4070 (G)電話:061−688 42 56 (H)ファックス:061−688 13 95 (I)テレックス:962292/965542 hl
r ch (ii)発明の名称:組換え肥満(ob)蛋白 (iii)配列の数:8 (iv)コンピュータ可読形態: (A)媒体タイプ:フロッピーディスク (B)コンピュータ:アップル・マッキントッシュ (C)オペレーティング・システム:システム7.1
(マッキントッシュ) (D)ソフトウェア:Word 5.0
r ch (ii)発明の名称:組換え肥満(ob)蛋白 (iii)配列の数:8 (iv)コンピュータ可読形態: (A)媒体タイプ:フロッピーディスク (B)コンピュータ:アップル・マッキントッシュ (C)オペレーティング・システム:システム7.1
(マッキントッシュ) (D)ソフトウェア:Word 5.0
【0162】(2)配列番号1に関する情報: (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:702塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:1本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:cDNA (iii)ハイポセティカル:No (iv)アンチセンス:No (xi)配列番号1:
【0163】
【表7】
【0164】(2)配列番号2に関する情報: (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:167アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (C)鎖の数:該当せず (D)トポロジー:不明 (ii)配列の種類:ペプチド (iii)ハイポセティカル:No (iv)アンチセンス:No (xi)配列番号2:
【0165】
【表8】
【0166】(2)配列番号3に関する情報: (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:146アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (C)鎖の数:該当せず (D)トポロジー:不明 (ii)配列の種類:ペプチド (iii)ハイポセティカル:No (iv)アンチセンス:No (xi)配列番号3:
【0167】
【表9】
【0168】(2)配列番号4に関する情報: (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:690塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:cDNA (iii)ハイポセティカル:No (iv)アンチセンス:No (xi)配列番号4:
【0169】
【表10】
【0170】(2)配列番号5に関する情報: (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:167アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (C)鎖の数:該当せず (D)トポロジー:不明 (ii)配列の種類:ペプチド (iii)ハイポセティカル:No (iv)アンチセンス:No (xi)配列番号5:
【0171】
【表11】
【0172】(2)配列番号6に関する情報: (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:146アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (C)鎖の数:該当せず (D)トポロジー:不明 (ii)配列の種類:ペプチド (iii)ハイポセティカル:No (iv)アンチセンス:No (xi)配列番号6:
【0173】
【表12】
【0174】(2)配列番号7に関する情報: (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:63塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:二本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:DNA(genomic) (iii)ハイポセティカル:No (iv)アンチセンス:No (xi)配列番号7:
【0175】
【表13】
【0176】(2)配列番号8に関する情報: (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:21アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (C)鎖の数:該当せず (D)トポロジー:不明 (ii)配列の種類:ペプチド (iii)ハイポセティカル:No (iv)アンチセンス:No (xi)配列番号8:
【0177】
【表14】
【図1】ヒトob蛋白の2つのクローン(即ちhob−
cl1とhob−cl2)の概略図であり、この概略図
は、ヒトobのcDNA配列の5′及び3′末端に位置
する制限部位の位置及び型を図示している。
cl1とhob−cl2)の概略図であり、この概略図
は、ヒトobのcDNA配列の5′及び3′末端に位置
する制限部位の位置及び型を図示している。
【図2】pLPPsOmpA−mob発現ベクターの構
築の概略図である。
築の概略図である。
【図3】pLPPsOmpA−hob1発現ベクターの
構築の概略図である。
構築の概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C12N 1/21 (C12N 1/21 C12P 21/02 C12R 1:19) //(C12N 1/21 (C12P 21/02 C12R 1:19) C12R 1:19) (C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:19) A61K 37/02 (72)発明者 ルネ・デボ ベルギー国、ベー−8400 オステンド、 カーイストラート 24 ビュス 1 (72)発明者 イーブ・ギーセ ベルギー国、ベー−8200 サント−アン ドリース・ブリュッヘ、ザンドストラー ト 209 (56)参考文献 特表 平9−506264(JP,A) Nature(1994)Vol.372, p.425−432 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/47 C07K 19/00 C12P 21/00- 21/02 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG) SwissProt/PIR/GeneS eq Genbank/EMBL/DDBJ/G eneSeq
Claims (19)
- 【請求項1】 配列番号6のアミノ酸配列からなる、均
質な生物学的に活性なヒトobタンパク質。 - 【請求項2】 16〜18時間絶食させた、体重が少な
くとも30グラムの成熟肥満ob/obマウスに、Hale
y及びMcCormickの方法を使用して20μg以下の用量で
脳室内注射により投与するとき、そのタンパク質が5時
間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注射した対照
マウスに比較して少なくとも50%低下させる、他の哺
乳動物のタンパク質を含まない生物学的に活性な組換え
ヒトobタンパク質である、請求項1記載のタンパク
質。 - 【請求項3】 哺乳動物の食物摂取を低下させ、かつ哺
乳動物の体重増加速度を低下させる生物学的活性を有す
ることを特徴とする、請求項1又は2記載のタンパク
質。 - 【請求項4】 配列番号3のアミノ酸配列からなる、均
質な生物学的に活性なマウスobタンパク質。 - 【請求項5】 16〜18時間絶食させた、体重が少な
くとも30グラムの成熟肥満ob/obマウスに、Hale
y及びMcCormickの方法を使用して20μg以下の用量で
脳室内注射により投与するとき、そのタンパク質が5時
間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注射した対照
マウスに比較して少なくとも50%低下させる、他の哺
乳動物のタンパク質を含まない生物学的に活性な組換え
マウスobタンパク質である、請求項4記載のタンパク
質。 - 【請求項6】 哺乳動物の食物摂取を低下させ、かつ哺
乳動物の体重増加速度を低下させる生物学的活性を有す
ることを特徴とする、請求項4又は5記載のタンパク
質。 - 【請求項7】 a)プロモーター配列、及びb)配列番
号3のマウスobタンパク質又は配列番号6のヒトob
タンパク質と、大腸菌の外膜プロテインAのシグナルペ
プチドとを含む融合タンパク質をコードするDNA配
列、 を含む、大腸菌宿主細胞中で該融合タンパク質を発現さ
せることができる発現ベクター。 - 【請求項8】 プロモーターが、lac−プロモーター
−オペレーター及びリポタンパク質プロモーターの両方
よりなる、請求項7記載の発現ベクター。 - 【請求項9】 マウスobタンパク質が配列番号3のア
ミノ酸配列からなり、ヒトobタンパク質が配列番号6
のアミノ酸配列からなる融合タンパク質。 - 【請求項10】 次の第一及び第二部分を含むDNA配
列からなり、 (a)第一部分が、sOmpAペプチドをコードする配
列番号7のsOmpA遺伝子配列であり;そして (b)第二部分が、請求項4のマウスobタンパク質を
コードするヌクレオチド配列、又は請求項1のヒトob
タンパク質をコードするヌクレオチド配列である、 DNA。 - 【請求項11】 マウスobタンパク質が配列番号3の
アミノ酸配列を含み、ヒトobタンパク質が配列番号6
のアミノ酸配列を含む、請求項10記載のDNA。 - 【請求項12】 請求項7記載の発現ベクターで形質転
換された大腸菌宿主生物。 - 【請求項13】 他の哺乳動物のタンパク質を含まない
生物学的に活性な組換えヒト又はマウスobタンパク質
を製造する方法であって、以下の工程: a)プロモーター配列、及び配列番号3又は配列番号6
のタンパク質と大腸菌の外膜プロテインAのシグナルペ
プチドとを含む融合タンパク質をコードするDNA配列
を有する発現ベクターを構築し; b)この発現ベクターを大腸菌宿主中に挿入して大腸菌
宿主細胞を形質転換し; c)大腸菌宿主細胞中で融合タンパク質を発現させ;そ
して d)大腸菌宿主細胞を冷浸透圧ショック緩衝液で処理し
て、他の哺乳動物タンパク質を含まず、かつシグナルペ
プチドを含まない、マウス又はヒトobタンパク質を遊
離させる、 ことを特徴とする方法。 - 【請求項14】 請求項1のヒトobタンパク質又は請
求項4のマウスobタンパク質を含有する浸透圧液に、
陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作
用カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過の組合せを行
うことを特徴とする、16〜18時間絶食させた、体重
が少なくとも30グラムの成熟肥満ob/obマウス
に、Haley及びMcCormickの方法を使用して20μg以下
の用量で脳室内注射により投与するとき、そのタンパク
質が5時間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注射
した対照マウスに比較して少なくとも50%低下させ
る、均質な生物学的に活性な組換えヒト又はマウスob
タンパク質を製造する方法。 - 【請求項15】 請求項1〜6のいずれか1項記載のヒ
ト又はマウスobタンパク質にポリエチレングリコール
及び/又はポリプロピレングリコールが結合した1つ以
上のコンジュゲートを含む組成物であって、この組成物
中の該コンジュゲートのポリエチレン又はポリプロピレ
ングリコール単位の平均分子量が15kDa 〜60kDa の
間である組成物。 - 【請求項16】 式(I−A): 【化1】 (式中、Pは、請求項1〜6のいずれか1項記載のヒト
又はマウスobタンパク質であり;n及びn′は、合計
が300〜1,500の整数であり;この組成物中の該
コンジュゲート中のポリエチレングリコール単位の平均
分子量が15kDa〜60kDa であり;そしてR及びR′
は、低級アルキルである)で示される1つ以上のコンジ
ュゲートを含む組成物。 - 【請求項17】 式(I−B): 【化2】 (式中、Pは、請求項1〜6のいずれか1項記載のヒト
又はマウスobタンパク質であり;nは、300〜1,
500の整数であり;この組成物中の該コンジュゲート
中のポリエチレングリコール単位の平均分子量が15kD
a 〜60kDa であり;そしてRは、低級アルキルであ
る)で示される1つ以上のコンジュゲートを含む組成
物。 - 【請求項18】 請求項1〜6のいずれか1項記載のヒ
ト又はマウスobタンパク質、あるいは請求項15〜1
7のいずれか1項記載の組成物を含有する医薬。 - 【請求項19】 請求項1〜6のいずれか1項記載のヒ
ト又はマウスobタンパク質、あるいは請求項15〜1
7のいずれか1項記載の組成物を含有する肥満及び関連
疾患の治療、予防及び制御のための医薬。
Applications Claiming Priority (4)
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---|---|---|---|
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ID=27030682
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