JP3213911B2 - ミコバクテリアをプロセッシングする方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願の引用 本出願は、1994年10月11日に出願された米国出願番号
第08/322,864号の一部継続出願であり、これは、1994年
４月７日に出願された米国出願番号第08/224,592号の一
部継続出願であり、これは、1994年４月５日に出願され
た米国出願番号第08/222,731号の一部継続出願である。

発明の背景 A. ミコバクテリアおよび疾患 Mycobacterium tuberculosis（MTB）は、今日の世界
において最も一般的な感染症である、結核（TB）の原因
因子である。世界保健機構（WHO）は、17億の人々（ま
たは世界の人口の約1/3）が、現在、または以前に結核
に感染していることを報告した（Kochi,A.Tubercle 72:
1−６（1991））。MTB感染の発生率は、1991年には全世
界で800万の新たな症例の割合で増加して生じており（S
udre,P.ら、Bull.W.H.O.70:149−159（1992））、そし
てWHOは、1991年代の間に8820万の人々がTBに罹り、そ
してこの期間内に毎年約300万の人々が死亡することを
見積もった（Morbidity and Mortality Weekly Report
42（第49号）:961−964（1993））。米国における、疾
患管理センターおよび防疫センター（CDC）は、1992年
に26,673症例を報告し（Morbidity and Mortality Week
ly Report 42:696−703（1993））、そして米国におけ
る1000〜1500万の人々が、潜在性の感染を有しているこ
とが見積もられている（Morbidity and Mortality Week
ly Report 39（RR−８）:9−12（1990））。

ヒト病原としてのMAC複合体のミコバクテリア（主と
して、M.aviumおよびM.intracellulare）の重要性は、
最近、Inderlied,C.B.ら、Clin.Microbiol.Rev.6:266−
310（1993）により総説されている。MAC複合体感染は、
AIDS患者における日和見性病原としてのそれらの発生に
より増加している。疾患の進行した段階のAIDS患者の約
43％は、散在性のMAC感染を示す（Nightingaleら、Jou
r.Infect.Dis.165:1082−1085（1992））。WHOは、今
日、約300万の人々がAIDSを発症し、約1500万の人々
が、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に感染し、そして200
0年までに、感染者の数は、約4000万にのぼり得ること
を見積もった（世界保健機構（document WHO/GPA/CNP/E
VA/93.1）Global Programme on AIDS（1993））。AIDS
関連感染に加えて、M.aviumの亜種であるM.paratubercu
losis（Thorel,M.F.ら、Int.J.Syst.Bacteriol.40:254
−260（1990））は、クローン病（腸の炎症性疾患）に
関係すると考えられている（Chiodini,R.J.Clin.Micro.
Rev.2:90−117（1989））。

ミコバクテリア感染はまた、動物における問題でもあ
る。M.paratuberculosisはまた、反芻動物における腸炎
症を引き起こす（Thoen,C.O.ら、Rev.Infect.Dis.3:960
−972（1981））。これは、ヨーネ病としてより一般に
知られる。ヨーネ試験陽性なウシは、選り分けられ、そ
して駆除される。ウィスコンシン州においては、群れの
約1/3が感染しており（Collins,M.T.,Hoard's Dairyman
Feb 10:113（1991））、財政的影響は、1983年におい
て5200万ドルと見積られた（Arnoldi,J.M.ら、Proceedi
ngs,3rd Int.Symp.World Assoc.Vet.Lab.Diag.2:493−4
94（1983））。全国的な群れの間での発生率は、代表的
には、３％〜18％の間の範囲である（Merkal,R.S.ら、
J.Am.Vet.Med.Assco.190:676−680（1987））。乳業に
おけるこの疾患の財政的影響は、毎年15億ドルを超過す
る（Whitlock,R.Proceedings of the Third Internatio
nal Colloquium on Paratuberculosis,514−522頁（199
1）;Whitlock,R.ら、Proceedings of the 89th Annual
Meeting of the United States Animal Health Associa
tion,484−490頁（1985））。

上記の生物に加えて、広範な種々のミコバクテリアが
また、ヒト病原として考えられ、これには、Mycobacter
ium leprae,Mycobacterium kansasii,Mycobacterium ma
rinum,Mycobacterium fortuitum複合体、および多くの
他のものが含まれる。Wayne,L.G.ら、Clin.Micro.Rev.
5:1−25（1992）は、この属の微生物に関係する感染の
多様性を総説している。しかし、これらの感染の重要性
および影響は、MTB複合体感染およびMAC感染と同じスケ
ールではない。例えば、ライ病は、おそらくこのカテゴ
リー内で最も一般的である：全世界でMycobacterium le
praeの概算550万の症例が存在する（Nordeen,S.K.ら、I
nt.J.Lepr.63:282−287（1993））。全体として、この
グループの微生物は、非常に多くの社会的コストを強い
る。

B. ミコバクテリアの培養および検出 ミコバクテリア感染症の研究室診断のための現代のプ
ロトコルは、比較的ゆるやかである。これらの細菌の生
得のゆるやかな増殖速度のために、長期間に及ぶインキ
ュベーションが必要とされる。診断にかかる長期の時間
のために、感染の疑わしい固体は隔離され、さもないと
一般に社会に対して有為な危険を有する。

さらに、ミコバクテリア感染の診断の研究室確認は、
患者サンプル当たりいくつかの培養物を必要とする。各
サンプルは、サンプルが陰性であると報告され得るまで
に８週間（M.paratnberculosisでは16週）インキュベー
トされなければならない。各々の疑わしいサンプルの複
数の培養物の必要性は、ミコバクテリアの検出可能な数
の断続的な放出に一部起因し、そし感染性生物の損失
は、腐生性微生物を不活化するに用いられる激しい化学
的汚染除去に起因する。これらの手順は、非能率的であ
り、そして抽出しようとするミコバクテリアをしばしば
死滅させる。例えば、推奨されるＮ−アセチル−Ｌ−シ
ステイン−NaOH（NALC/NaOH）手順（Kent,P.T.ら、A Gu
ide for the Level III Laboratoryの「Public Health
Mycobacteriology」,U.S.Department of Health and Hu
man Service,Centers for Disease Control,（1985）31
−46頁）による処理は、生存するミコバクテリアの28％
〜33％を死滅させることが知られている（Krasnow,I.
ら、Am,J.Clin.Path.45:352−355（1966）;Kubica、G.
P.W.ら、Am.Rev.Resir.Dis.87:775−779（1963））。培
養技術を補完する現代のプローブアッセイ（Gonzalez,
R.ら、Diag.Microbiol.Infect.Dis.8:69−78（1987））
の出現は、診断にかかる時間を改善している；しかし、
重大な改善の余地が依然として存在する。

社会的な重要性および培養方法に頼ることの組み合わ
せは、判明する時間を減少させ、そして感度を増加させ
るミコバクテリアの試験プロトコルの重要な必要性を示
す。Gen−Probe,Inc.（San Diego,CA:Jonas,V.ら、J.Cl
in.Micro.31:2410−2416（1993））により市販されてい
る等温スキームおよびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の
両方は、単一分子検出の潜在力を有する（Higuchiら、N
ature（London）332:543−546（1988））。さらに、増
幅および検出は、約８時間内に行われ得、そして試薬
は、有意なコストを加算しない。利用可能であれば、増
幅アッセイは、検出の速度および感度を大いに増大し
得、そしてミコバクテリアの診断のコストを減少させ得
る（De Cresce,R.P.ら、Med.Laboratory Obs.25:28−33
（1993））。これらの技術がミコバクテリアイの感染を
潜在的に診断し得る迅速さは、社会に対する巨大な財政
的影響を有する。

しかし、本明細書中に記載されるように、研究者は、
ミコバクテリアの検出にこれらの技術（例えば、PCR増
幅）を適応させる取り組みにおいて、極めて多くの問題
に遭遇する。特に、（ａ）真の陽性結果の増幅アッセイ
検出を保証し、そして（ｂ）偽陰性結果を与えたい様式
における分析のためのサンプルの調製に関するプロトコ
ルを発生し得なかった。研究者が遭遇する可変性は、No
ordhoek,G.T.ら、J.Clin.Micro.32:277−284（1994）の
研究により例証される。これらの著者は、７つの研究室
が関与する盲検研究を記述している。全ての研究室は、
同一の増幅システムを用いたが、異なる処理方法論およ
び検出方法論を用いた。これらの結果の本来の概要（No
ordhoek,G.T.ら、N.Eng.J.Med.329:2036（1993））は、
低コピー数（1000コピー）で、相関が、２％〜90％（平
均は、54％である）まで変化することを簡潔に示してい
る。これらの問題の結果として、利用可能なFDA承認TB
増幅キットはまだ存在しない。

C. ミコバクテリウムサンプルをプロセッシングする方
法 システム設計、サンプルプロセッシング技術および臨
床研究に関するミコバクテリア拡散増幅参照における科
学文献の総説は、TB増幅キットのFDA承認を妨げる高度
に変わりやすい結果を示す。

２つの異なる増幅スキームが用いられている；ミコバ
クテリア感染に（膨大な大多数はMTBに）焦点を合わせ
た多数のPCRシステム設計および多数の臨床研究が存在
する。代表的には、サンプルを、第１に培養のためにプ
ロセスし、次いで増幅に供す。それ故、増幅のためのサ
ンプル調製は、ほとんどの場合、培養プロセッシングプ
ロトコルの延長として見なされ得る。

この分野が、この様式で発展しているいくつかの理由
が存在する。第１に、臨床的な試料を得ることは困難で
ある。MTBに関して診断される個体は、常に診断に基づ
く薬物治療で開始される。第２に、MTB試料のプロセッ
シングは、特殊な封じ込め施設および適切に訓練された
技術者を必要とする。第３に、「培養相関」結果、すな
わち、増幅陽性および陰性結果の培養において陽性また
は陰性であった結果との相関を得ることが、最も容易な
方法である。従って、研究者らは、代表的には培養のた
めにサンプルをプロセスし、次いで増幅のために沈殿物
を「さらに」プロセスするプロトコルを使用している。
この方法において、実際の臨床的な試料が用いられ得、
封じ込めは破綻されず、作業の流れ（work flow）は中
断されず、患者の看護は易感染性ではなく、そして現代
のプロトコルとの相関は適している。この上記で言及し
た「さらなる」プロセッシングは、広範なサンプル調製
および細胞溶解技術を含んでいる。

表１は、17の異なる国に由来するサンプルを用いた、
35の出版物を要約する。これは、臨床的な研究室におけ
る増幅技術の能力を評価する。表１の著作は、年代順に
示されている。原文の出版物を正確に示すようにあらゆ
る努力がなされている。しかし、いくつかの場合におい
てい、解釈に曖昧さが存在し、そしていくつかの論文の
弁別的な特徴が存在する。説明は、続く注釈に示され
る。

核酸増幅結果の培養結果との相関を、基礎として選択
し、表１に示される研究と比較した。この見通しを用い
ることにより、この分析は、難問を示す：表１に概説し
た方法論に従い、増幅に供されるサンプルは、ほとんど
の場合、培養を播種するために用いた「ボタン」に由来
する。培養に関して増幅の感度が与えられれば、培養陽
性／増幅陰性（例えば、偽陰性増幅）は、直観的に意味
をなさない。幾人かの著者らは、「修正された相関」
（表１の注釈Ｃを参照のこと）を示す。例えば、いくつ
かの偽陰性が得られ、そして結果が標的DNAの更なる精
製、インヒビターの希釈、同一サンプルの複数の増幅、
同一患者由来の異なるサンプルの複数の増幅、または増
幅した試料の再増幅により解決され得た場合；修正され
た結果を示した。

これは、興味深いジレンマを導く。Jackson,J.B.ら
（J.Clin.Micro.31:3123−3128（1993））は、11の研究
室が関与するHIV−PCR品質保証パネルを首尾良く実施し
た。報告された感度は、全ての研究室が、10⁶個のヒト
細胞のバックグラウンド中の２コピーのHIVゲノムを同
定する日常的な能力を有することを示唆する。本明細書
中で総説される表１の研究は、TB増幅技術の感度が同様
であることを強く示唆する。表１の研究の考察から明ら
かであることは、ミコバクテリアの検出に関するこれら
の増幅技術の感度が、培養またはスミアのオーダーより
も大きなオーダーであることが予測されるが、この予期
に対して一貫した異常性が存在することである。異常な
もののいくつかは阻害に起因し、そしてそれ故、容易に
説明されるが、不規則なものの多くは、「未説明」であ
る。明らかになることは、内部コントロールがインヒビ
ターを検出するために用いられる場合でさえ、これらの
未説明の異常性は、合理的に共通であり、そしてそうい
うものとして臨床研究室におけるミコバクテリアの検出
のための増幅技術の確証に対して有意な障害を与える。
例えば、陽性、または疑わしい陽性は、再び調査され得
るが、代表的には、陰性は再調査されない。偽陰性は、
規則正しく生じるので、研究室は、どのサンプルが真に
偽陰性であり、そして「分析」される必要があるのかを
知る方法を有しない。従って、診断が不正確に陰性に見
えるので、患者の看護は易感染性になる。それ故、本明
細書中の出版物を考察する目的で、出版物の不正確なデ
ータを用いた。これらの異常性−偽陰性−は、引き続く
考察の焦点である。

表1:培養結果と核酸増幅結果との相関を報告した文献 表１中の各々の研究について、プロセッシングプロト
コルが省略される（脚注Ａを参照のこと）。評価された
臨床試料の数は、相当する培養および増幅ポジティブサ
ンプルの数とともに記載される（脚注Ｂを参照のこ
と）。培養との「修正し戻された」相関が示される（脚
注Ｃを参照のこと）。これらの35の文献は、増幅結果と
培養結果との間の明確な比較を表していたので、選択さ
れた。Shankar,Pら、Lancet 337:5−７（1991）;de Wi
t,D.ら、Tubercle and Lung Dis.73:262−267（199
2）；およびKaneko,K.ら、Neurology 40:1617−1618（1
990）の研究は、これに基づく明確な比較がなされてい
ないので省略した。

（Ａ）Hermans,P.W.M.ら、J.Clin.Micro.28:1204−1213
（1990）,DEWit,D.ら、J.Clin.Mrcro.28:2437−2441（1
990）、Del Portillo.P.ら、J.Clin.Mrcro.29:2163−21
68（1991）、Irula,J.V.ら、J.Clin.Mrcro.31:1811−18
14（1993）、およびおそらくThierry.D.ら、J.Clin.Mrc
ro.28:2668−2673（1990）を除く、全ての研究は、第１
に、培養のために試料を処理する。一般に、利用される
全ての試料プロセッシング技術は、Kent,P.Tら、A Guid
e for Level III Laboratoryの「Public Health Mycoba
cteriology」、U.S.Department of Health and Human S
ervices,Centers for Disease Control,1985,31−46頁
に要約されている。臨床試料のプロセッシングを記載す
るために用いられる記号論は、以下の通りである：「NA
LC」は、Kubica,G.P.W.ら、Am.Rev.Resir.Dis.87:775−
779（1963）に記載されたＮ−アセチル−Ｌ−システイ
ン／水酸化ナトリウム液体（liquification）／除染プ
ロトコルをいう。「DTT」は、Hirsch,S.Rら、J.Lab.Cli
n.Med.74:346−353（1969）のプロトコルに従うミコバ
クテリアのプロセッシングのためのジチオトレイトール
（Sputolysin^TMとしても知られている）の利用をいう。
「SDS」（ドデシル硫酸ナトリウム）は、Engbaek,H.C.
ら、Scand.J.Respir.Dis.48:268−284（1967）のプロト
コルをいう。「Fic/Hyp」は、Boyumの方法（Boyum,A.J.
Clin.Lab.Invest.21（上述.97）:77−109（1968））の
後の末梢血液単核細胞（PBMC）の精製のためのFicoll/H
ypaque勾配プロトコルをいう。「NaOH」は、著者らに特
異的な水酸化ナトリウム除染プロトコルをいうか、また
は除染プロトコルの特定が明確に述べられていない文献
の著者からの直接的な引用である。「OxAc」は、シュウ
酸（corper.H.J.ら、Lab.Clin.Med.15:348−369（193
0））の使用をいう。「PEG」は、著者らに特異的なポリ
エチレングリコール沈澱の使用をいう。「TriPO₄」は、
Collinsら、Organization and Practice in Tuberculos
is Bacteriology,Buttersworth,London,1985の三リン酸
塩手順をいう。プロセスされた試料は、必ず、「ボタ
ン」（沈殿物）を産生するために遠心分離される。ボタ
ンは、水またはリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）のいず
れかに再懸濁され、そして培養およびスミアのためにア
リコートが取り出される。次いで残りの沈殿物は、増幅
のためにさらにプロセスされる。プロセッシング名称に
添付される添字「Ｐ」は、再懸濁された沈殿物が、増幅
のためにさらなるプロセッシングの前に、再び遠心分離
されるという事実をいい、そしてそれは研究に用いられ
たペレット化沈殿物である。プロセッシング名称に添付
される添字「Ｓ」は、上清が遠心分離により浄化された
という事実をいい、そしてそれは、研究に用いられた上
清であった。培養のためのプロセッシングの後、幾人か
の著者は、増幅のためのサンプルの調製に関する異なる
プロトコルを比較する：実際の研究のための試料を調製
するために用いられたプロトコルのみが含まれる。サン
プル調製方法論を比較するこれらの研究は、本文および
同様に考察されたこれらの知見の結果中に同定される。
以下の緩衝液は略語を適用する：「TE」＝Tris/EDTA、
「TX」＝Tris/Triton−X100、「TEX」＝Tris/EDTA/Trit
on−X100、ならびに「Non I」＝Tris/Tween20およびNP
−40。添字「Ｗ」は、括弧で括られた緩衝液を用いる洗
浄の工程をいう。「Gen_Buf」、「IDEXX_Buf」、および
「PCR_Buf」は、それぞれGen−Probe緩衝液またはIDEXX
緩衝液（組成は不明である）またはPCR緩衝液（20mM Tr
is−HCl pH8.3、50mM KCl、2.5mM MgCl₂、0.45％ Tween
20、0.45％ NP−40）中のサンプルの懸濁液／再懸濁液
をいう。「CHCl₃」、「HCl」、および「perCl」は、そ
れぞれ、プロセッシング工程における、クロロホルム、
塩酸、および過塩素酸の含有をいう。「PrK」および「L
z」は、プロテイナーゼＫおよび／またはリゾチームに
よるサンプルの酵素的消化をいう。極度な温度での煮沸
および処理を含む工程のいずれも、95℃での定められた
長さの時間に単一化した。「Org/ppt」は、フェノー
ル、クロロホルム、および／またはイソアミルアルコー
ルを含む、有機化合物、またはそれの組み合わせを含む
任意の抽出方法論、そしてそれに続くエタノールまたは
イソプロパノールのいずれかでの拡散の沈澱をいる。こ
のテーマにおいて多数の変形が存在するが、全ての方法
論は、Maniatis,T.ら、（「Molecular Cloning A Labor
atory Manual」,Cold Spring Harbor Laboratory,New Y
ork,1982,458−463頁）に見出されるものと類似する。
「TMA」は、Baess,I.Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.
B,82:780−784（1994）の方法論に類似するDNAまたは多
糖類を沈澱させるための４級アミンの利用をいう。「Gu
SCN/Si」は、例えば、Boom,R.ら、J.Clin.Microbiol.2
8:495−503（1990）により記載される、シリカの存在下
でグアニジウムイソチオシアネートを用いる、サンプル
からのDNAの精製をいう。「Sonic」は、（ガラスビーズ
の存在下または非存在下での）サンプルの超音波処理に
よるDNAの放出をいう。

（Ｂ）与えられた研究で使用された臨床的サンプルの総
数は、最初に培養陽性の数に従い、次いで増幅陽性の数
に従う。この欄に属する付随の脚注は、研究の関連する
特徴を記載している。

（Ｃ）増幅結果と培養結果との間の修正し戻された相関
を示す（例えば、培養陽性の総数で割った、培養陽性で
もあった増幅陽性試料の数）。幾人かの著者らは、矛盾
した結果（例えば、「偽陰性」または「偽陽性」）をさ
らに調査するか、または患者の情報を分析を取り入れ、
そして修正された結果を出版している。この欄に列挙さ
れる相関は、不正確な結果をいう。出版された結果とこ
の欄に列挙された結果との間に矛盾が存在する場合、数
は、差異を説明する適切な脚注ともに丸括弧内に入れら
れる。

（Ｄ）Shankar,Pら、Lancet 335:423（1990）は、培養
またはPCRのいずれかのためにサンプルをプロセスする
ために用いたプロトコルを明確に述べていない。しか
し、Manjunath,N.ら、Tubercle 72:21−27（1991）は、
彼らの出版物が、Shankar,P.ら、Lancet 335:423（199
0）の研究に示される予備研究の最終版であることを述
べている。それ故、考察の目的のために、プロセッシン
グ条件は、Manjunath,Nら、Tubercle 72:21−27（199
1）の条件と同一であると仮定する。

（Ｅ）Hermans.P.W.M.ら、J.Clin.Micro.28:1204−1213
（1990）の研究は、増幅のために粗試料を直接プロセス
する（例えば、試料は、培養のためにプロセスされず、
そして沈殿物分配物は、培養およびPCRの両方による分
析のためにプロセスされなかった）。

（Ｆ）Pao,C.Cら、J.Clin.Micro.28:1877−1880（199
0）は、PCRについて修正し戻された結果を与えない。し
かし、彼らは、「最初の結果が陰性である場合、最初の
増幅反応混合物の一部（通常1/5）を、別の32サイクル
で増幅した....」と述べている。それ故、本来偽陰性で
あり得る。

（Ｇ）Sjbringら、J.Clin.Micro.28:2200−2204（199
0）の研究におけるこの偽陰性PCR結果に対応する傾向
は、単一のコロニーを生産した。残りの３つの培養/PCR
陽性試料を、増幅のために直接プロセスした。

（Ｈ）DEWit,D.ら、TubercleおよびLung Dis.73:262−2
67（1992）は、胸水吸引のみを用いる。粗試料を、直接
PEGにより沈澱し、そして増幅に供した。

（Ｉ）Thierry,Dら、J.Clin.Micro.28:2268−2673（199
0）は、「DNAを0.2〜1mlの粗臨床試料または水酸化ナト
リウム除染臨床試料から抽出した....」と述べている。
それ故、考察の目的のために、試料は、増幅に直接用い
られ得ると仮定する。

（Ｊ）Pierre,C.ら、J.Clin.Micro.29:712−717（199
1）は、臨床試料のプロセッシングのための２つの方法
論を考察している。彼らは、研究に用いた方法を明確に
述べていない。しかし、彼らは、第２の非イオン溶解方
法論を用いて「いくつかの場合において、サンプルの一
部を....」プロセスしたと示唆している。彼らはまた、
さらなるインヒビターが、これらのサンプル中に見出さ
れたことを述べている。それ故、考察の目的のために、
有機抽出は、この研究で用いられた主要なプロトコルで
あったと仮定する。

（Ｋ）Pierre,C.ら、J.Clin.Micro.29:712−717（199
1）は、チューブを開放し、一部を新しいPCR混合物に移
し、そして再増幅する「再増幅」プロトコルを利用す
る。これらの結果は、最初の増幅を用いて、79.2％であ
り、再増幅では100％であった。

（Ｌ）Del Portillo,Pら、J.Clin.Micro.29:2163−2168
（1991）の研究は、増幅のために痰を直接プロセスし
た。

（Ｍ）Brisson−Nol,A.ら、Lencet 338:364−366（19
91）は、514個の試料を試験したが、446個のみをPCRお
よび培養を両方のためにプロセスした。

（Ｎ）Brisson−Nol,A.ら、Lencet 338:364−366（19
91）に使用されるシステムは、65Kdのタンパク質に対し
て設計され、そしてほとんどのミコバクテリアを増幅す
る。141個の培養陽性試料のうち、130個がMTBであり、
そして11個がMOTT（tuberculosis以外のミコバクテリ
ア）であった。141個のうち、126個がPCRで陽性であ
り、６個が偽陰性であり、９個がインヒビターを含有し
た。それ故、培養に対する相関は、89.4％（126÷141＝
0.894）であった。報告された相関は、97.4％であり、
そしてインヒビターでのサンプルの除去、および患者デ
ータ（例えば、PCR陽性／培養陰性であるサンプルの高
度な臨床嫌疑）の除去の両方を含む。

（Ｏ）Sritharan,V.ら、Mol.Cell.Probes 5:385−395
（1991）は、PCRのためのDNAの放出について８つの異な
る方法論を実際に比較する。煮沸方法は、研究のために
選択したものであった。

（Ｐ）Sritharan,V.ら、Mol.Cell.Probes 5:385−395
（1991）により述べられた相関は、100％であり、そし
て第１のPCRにおいて偽陰性であった３つのサンプルの
再増幅を表す。修正し戻された相関は、96.0％である。

（Ｑ）van der Giessen,J.W.B.ら、J.Clin.Microbiol.3
0:1216−1219（1992）は、ウシ便中のM.paratuberculos
isを検出するために設計された３つのPCRベースシステ
ム（McFadden,J.J.ら、Mol.Microbiol.1:283−291（198
7）:van der Giessen,J.W.B.ら、J.Med.Microbiol.36:2
55−263（1992）;Vary,P.H.ら、J.Clin.Microbiol.28:9
33−937（1990））を比較した。これらのうちの１つ
は、IDEXX（Vary,P.H.ら、J.Clin.Microbiol.28:933−9
37（1990））から市販入手可能なキットである。この研
究において、彼らは、２つの別々の実行において、３つ
の方法全てにより、87個のサンプルを試験した。培養を
一回のみ実行し（培養＋＝30）、一方各々のPCRを２回
実行した。それゆえ２数である。

（Ｒ）Buck,G.E.ら、J.Clin.Micro.30:1331−1334（199
2）は、PCRのためのDNAの放出について４つの異なる方
法論を実際に比較する。示された超音波処理法は、研究
のために選択した方法であった。さらに、この研究にお
ける全てのサンプルは、公知のTB−陽性であり、そして
全てがスミア陽性であった。

（Ｓ）Victorら、J.Clin.Micro.30:1514−1517（1992）
は、全ての沈殿物を分配し、そしてサンプルを直接増幅
するか、またはスクロース勾配分画によりさらに精製し
た。両方の方法論からの結果は、考察に利用可能であっ
た。

（Ｔ）Fauville−Dufauxら、Eur.J.Micro.Inf.Dis.11:7
97−803（1992）は、試料を、SDSまたは三リン酸塩
の「....いずれか....」によりプロセスしたと述べてい
る。彼らは、サンプルをどちらの方法でプロセスしたか
をさらに明記していない。

（Ｕ）Fauville−Dufauxら、Eur.J.Micro.Inf.Dis.11:7
97−803（1992）により使用されたプライマー対を抗原8
5配列に対して設計した。その結果、それらの系は、ほ
とんどのミコバクテリア種を増幅し得た。プロセスした
206個のサンプルのうち92個が培養陽性であった。これ
らの92個のサンプルのうち84個のサンプルが、初めにPC
Rにより陽性であった（91.3％）。92個のうち82個がMTB
として同定された。これらの82個のうち74個のみが初め
にPCTにより陽性であった（90.2％）。一方、損なった
８個の全ては、インヒビターを含んでいるようであり、
３個は陽性シグナルが観察される時点で希釈され得た。
それゆえ、分析により著者らは、82個のうち77個（93.9
％）が、PCRにより正確に同定されたことを述べてい
る。著者はそれらの相関を93.9％と報告している。

（Ｖ）Wilson,S.M.ら、J.Clin.Micro.31:776−782（199
3）は、PCRのためのDNAの放出について２つの異なる方
法論を比較している。両方の方法が本願研究の全てのサ
ンプルにおいて使用された。それゆえ、２つの相関であ
る。さらに、Wilson,S.M.ら、J.Clin.Micro.31:776−78
2（1993）は、「１つのチューブ」のネストされたプロ
トコルを使用している。

（Ｗ）Wilson,S.M.ら、J.Clin.Micro.31:776−782（199
3）は、GuSCN/Si手順についての相関を75％、およびク
ロロホルム手順についての相関を92％と述べている。こ
れは、「患者の結果」を示している。この欄に述べられ
ている相関は、「個々の試料」の刊行された相関を示
す。さらに、本研究の全てのサンプルは重複して行われ
ており、そして矛盾が解決された。

（Ｘ）Folgueira,L.ら、J.Clin.Micro.31:1019−1021
（1993）は、PCRのためのDNA放出についての２つの異な
る方法論を比較している。示された煮沸方法は、本願研
究のために選択された方法であった。本願研究中の全て
の試料は、TB陽性であることが公知である。

（Ｙ）培養とFolgueira,L.ら、J.Clin.Micro.31:1019−
1021（1993）により述べられれるPCRとの間の相関は100
％であり、およびインヒビターの希釈を必要とする７つ
のサンプルを含むことを示している。修正し戻された相
関は90.7％である。

（Ｚ）Kocagz,Tら、J.Clin.Micro.31:1435−1438（19
93）は、PCRのための沈殿物の調製についての２つの異
なる方法論を比較している。示される煮沸方法は、本願
研究のために選択された方法であった。

（α）Kocagz,Tら、J.Clin.Micro.31:1435−1438（19
93）によって使用された「金標準」は、「臨床的な高い
嫌疑」である。この基準に対する述べられている相関
は、87％と与えられているのに対し、培養物に対する相
関は100％である。

（β）Forbes,B.A.ら、J.Clin.Micro.31:1688−1694（1
993）は、PCRを最適化するために173個のサンプルを初
めに試験する。次いで、727個のサンプルを試験した。
両方の研究に基づく情報は考察に利用可能である。

（γ）Forbes,B.A.ら、J.Clin.Micro.31:1688−1694（1
993）は、実験した727個のサンプルについての相関は8
2.7％と述べている。この感度は、PCR陽性／培養陰性サ
ンプルを分析するにおいて患者のデータの混合を包含し
ている。この研究の表２は、80個のMTB培養陽性のうち6
7個がPCRにより選抜されたことを示している。それゆ
え、修正じ戻された感度は83.8％である。

（δ）Irula,J.V.ら、J.Clin.Micro.31:1811−1814（19
93）の研究は、血液サンプルのみを使用する。さらに、
この研究の目的は、MTBの対抗としてM.aviumを同定する
ことである。

（ε）Clarridge,J.E.ら、J.Clin.Micro.31:2049−2056
（1993）は、培養相関についてのいくつかの数を述べて
いる。MTB培養陽性試料の実際の数は、218と述べられて
おり、そしてこのグループ内のPCR陽性の数は、181と述
べられている（この参考文献の表２を参照のこと）。そ
れゆえ、考察のために記録される修正し戻された相関
は、83.0％である。

（ζ）Miyazaki,Y.ら、J.Clin.Micro.31:2228−2232（1
993）は、ネストされたPCR系（例えば、第一の反応由来
のサンプルを、実際に新鮮なPCR混合液に移して再増幅
する）を用い、そして56個のうち54個を培養陽性である
と同定した（96.4％の相関）。しかし、培養陰性／スミ
ア陽性/PCR陽性である10個のサンプルが存在した。この
著者は、これらの10個を挙げ、相関を97.0％（64÷66＝
0.970）と述べている。

（η）Jonas,V.ら、J.Clin.Micro.31:2410−2416（199
3）の研究は、Gen−Probeにより市販化されている専売
増幅スキームのみを利用した。

（θ）Jonas,V.ら、J.Clin.Micro.31:2410−2416（199
3）の研究において、119個の培養陽性試料のうち、95個
のみが増幅により選抜された（79.8％）。培養陰性／増
幅陽性である21個の試料が存在した。著者らはこれらの
21個のうち17個のみが真に陽性であると結論づけた。こ
れらの17個の含有は、増幅が136個の真性陽性のうち112
個を同定したことを示唆する。これは、82.4と報告され
ているものに対する感度を増加する。

（ι）Abe,C.ら、J.Clin.Micro.31:3270−3274（1993）
の研究において、結果がGen−Probe法（Gen）に由来す
るように全ての試料が分けられたので、Kolk,A.H.Jら、
J.Clin.Micro.30:2567−2575（1992）により記載される
PCRシステムに由来する結果と比較し得た。

（κ）Abe,C.V.ら、J.Clin.Micro.31:3270−3274（199
3）は、いくつかの矛盾した結果を解決し、そして、Gen
−Probe法による相関が91.9％であり、PCRによる相関が
84.2％であると述べている。矛盾した結果を考慮しなけ
れば、それぞれ90.6％および81.3％を与える。Gen−Pro
be増幅の感度は、PCRにより得られる感度よりも良いよ
うである。

（λ）Millerら、J.Clin.Micro.32:393−397（1994）に
より用いられる原理増幅スキームは、Gen−Probeにより
市販化されているものである。しかし、彼らはこれらの
結果をEisenachら、J.Clin.Micro.26:2240−2245（198
8）のPCPシステムにより得られる結果と比較している。
750個のサンプル全てがGen−Probeの方法論により増幅
されたのに対し、陽性と考えられるそれらの試料（156
個）のみがPCRにより増幅された。

（μ）Millerら、J.Clin.Micro.32:393−397（1994）の
研究における156個の標本は、「培養試験されたおよび
／または臨床的に診断された結核」であった。これらの
156個のうち142個のみが実際に培養陽性であった。Gen
−Probeスキームを用いて、156個のうち131個（83.9
％）が陽性であった。続いて、「同様に処置された沈殿
物由来の異なるアリコートを用いた試料の反復試験は、
検出を156個のうち142個（91.0％）に増加した」。実際
のデータは、この数が培養に対する相関を示す場合、検
出をほとんど不可能にする方法で表される。156個の陽
性のPCRによる増幅は、初めに122個（78.2％）の試料を
同定した。143個（92.3％）が、反復されたPCR試験で同
定された（PCRの感度は、Gen−Probe法の感度よりも僅
かに良いだけのようである）。両方の方法論による最初
の試験で損なわれた多くのスミア陽性試料が存在した。
全てのスミア陽性は、反復試験で同定された。

（ν）Pfyfferら、J.Clin.Micro.32:918−923（1994）
は、２つの異なる方法（NALCおよびSDS）により沈殿物
を作製し、そしてGen−Probe方法論を使用して全ての沈
殿物を増幅した。試料は各カテゴリーについて独特であ
った（例えば、同じ試料は、一方の方法または他の方法
（両方ではない）によりプロセスされた）。

（ξ）Pfyfferら、J.Clin.Micro.32:918−923（1994）
の研究において、42個のNALC試料が培養陽性であり、そ
して39個（92.9％）が増幅により同定された。36個のSD
S試料が培養陽性であり、そして35個（97.2％）が増幅
により同定された。しかし、著者らは増幅陽性／培養陰
性の結果を解析し、そしてNALC沈殿物の増幅は、49個の
「真性陽性」のうちの46個（93.9％）を正確に同定し、
およびSDS沈殿物の増幅は、39個の「真性陽性」のうち3
8個（97.4％）を正確に同定したと結論づけた。

（π）Bodmerら、J.Clin.Micro.32:1483−1487（1994）
は、Gen−Probe増幅スキームを使用した。

（†）は、著者らが偽陰性に寄与する因子として阻害ま
たはインヒビターを考察するそれらの研究を示す。

（‡）は、著者らか偽陰性に寄与する因子として低コピ
ー数を考察するそれらの研究を示す。

（§）は、著者らか統計学的ドロップアウトの現象、ま
たは統計学的ドロップアウトに矛盾のない現象（これは
「未説明」結果を含む）を観察するか、または凝集によ
り悪化される逸脱した結果を考察するそれらの研究を示
す。

（¶）は、培養陽性／スミア陽性／増幅陰性の試料の例
が観察されたそれらの研究を示す。

D. 表１の研究 表１の刊行物中で報告されている試験のデータは、系
の設計またはサンプルのプロセッシング技術に関係なく
結果に広範な変動があることを示唆している。これらの
研究は文字どおり全ての可能な試料の供給源を包含して
いる；供給源として痰、気管支洗浄液、胸膜液、胃吸引
液、脳脊髄液（CSF）、尿、組織生検試料、骨髄、腫瘍
および滲出液、血液、血清、腹膜液ならびに糞便が挙げ
られる。２つの異なる増幅スキームを用いた:30の研究
はPCRのみを用い、３つの研究は、Cen−Probeにより市
販化されている等温、レトロウイルス型の専売増幅スキ
ームを用い（Jonas,V.ら,J.Clin.Micro.31:2410−2416
（1993）;Pfyfferら,J.Clin.Micro.31:918−923（199
4）;Bodmerら,J.Clin.Micro.32:1483−1787（199
4））、そして２つの研究は２つの増幅技術を比較した
（Abe,C.ら,J.Clin.Micro.31:3270−3274（1993）;Mill
erら,J.Clin.Micro.32:393−397（1994））。33の研究
はMTBの検出に焦点を置いており、１つの研究はM.avium
の診断に焦点を置いており（Irula,J.V.ら,J.Clin.Micr
o.31:1811−1814（1993））、そして１つの研究はM.par
atuberculosisの検出を行っている（van der Giessen,
J.W.Bら,J.Clin.Microbiol.31:1216−1219（1992））。
標的、プロセッシング技術または増幅技術に関係なく、
偽陰性の結果がほとんどの試料のカテゴリーにおいて見
出された。

表１に報告されいる研究は、サンプルサイズが７試料
〜1,166試料の範囲である。培養との相関は３％〜100％
の範囲であった。35の研究のうち９の研究（26％）は10
0％の相関を主張した。しかし、その大部分（９のうち
７（78％））は100未満（ｎ＜100）のサンプルサイズを
含む。２つの研究のみ（Manjunath,N.ら、Tebercle 72:
21−27（1991）;Pao,C.C.ら、J.Clin.Micro.28:1877−1
880（1990））が100を超える試料を用いた（しかし、Pa
o,C.C.ら、J.Clin.Micro.28:1877−1880（1990）は陰性
サンプルを確認しようと努力し再増幅をし得た：表１の
脚注Ｆを参照のこと）。あるいは、35の研究のうち26
（74％）は100％未満の相関を示す。このグループにお
いて、26のうち20（77％）が100を超える（ｎ＞100）サ
ンプルサイズを用いている。増幅−培養相関とサンプル
サイズとの間に逆の相関があるようである：一般に、研
究に含まれるサンプルが多くなると、相関は低くなる。

表１において、35の研究のうちの32（91％）は、この
増幅により培養陰性試料におけるミコバクテリアDNAの
存在を検出し得たことを示す（３つの残りの研究のうち
の２つは公知の陽性試料のみを使用した）。これら32の
うち２つは培養陽性の数が２倍以上であり（Irula,J.V.
ら、J.Clin.Micro.31:1811−1814（1993）;Pao,C.C.
ら、J.Clin.Micro.28:1877−1880（1990））、そして３
はこの数の２倍に非常に近い（Kolk,A.H.J.ら、J.Clin.
Micro.30:2567−2575（1992）;Manjunath,N.ら、Teberc
le 72:21−27（1991）;Miyazaki,Y.ら、J.Clin.Micro.3
1:2228−2232（1993））。31名の著者は、理想的なイン
ビトロ条件下で彼らの系が10コピー以下の存在を検出す
る能力を有するという事実を、直接的に記述しているか
または参照している。残りの４つの感度は15コピー〜40
コピーの範囲である（Altamirano,M.ら、J.Clin.Micro.
30:2173−2176（1992）;Hermans,P.W.M.ら、J.Clin.Mic
ro.28:1204−1213（1990）;Pao,C.C.ら、J.Clin.Micro.
28:1877−1880（1990）;Soini,H.ら、J.Clin.Micro.30:
2025−2028（1992））。培養陰性サンプル（増幅により
陽性である）は、培養陽性−増幅陰性サンプルより容易
に解釈される：培養とは対照的に、PCRは生存生物を必
要としない。例えば、プロセッシングは生物を死亡させ
ることが知られており、薬剤治療は生存能を弱め得、あ
るいは低下した生存能と組合わせた低コピー数は、全て
前者のクラスのサンプルに関与している。系のパラメー
ターに関係なく、増幅は、培養またはスミアのいずれか
に関して優れた感度を有するべきである。

35の研究において、８つの異なる方法を用いて未処理
の試料をプロセスした。17の研究は、培養および増幅の
両方についてサンプルをＮ−アセチル−Ｌ−システイン
/NaOH（NALC）との処理によりプロセスし、６つの研究
はドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用い、３つの研究
は水酸化ナトリウム（NaOH）を用い、２つの研究はジチ
オトレイトール（DTT）を用い；そしてシュウ酸（OxA
c）、ポリエチレングリコール（PEG）、およびficoll−
hypaque（Fic/Hyp）勾配法をそれぞれ１回用いた。１つ
の研究は、NALCによるプロセッシングとSDSによるプロ
セッシングとを実際に比較した（Pfyfferら、J.Clin.Mi
cro.32:918−923（1994））。これらの研究は培養の沈
殿物を用いることを避け、そして増幅のためにサンプル
を直接プロセスした。100％の相関を得た９つの研究の
うち３つはNALCを用い、３つは増幅のために試料を直接
プロセスし、１つの研究はSDSを用い、１つはOxAcを用
い、そして１つはPEGを用いた。これらの研究のうち７
つが100未満（ｎ＜100）のサンプルサイズを利用したこ
とを考慮すると、未処理試料がプロセスされた方法と完
全な相関との間に結論を下し得ない。Pfyfferら、J.Cli
n.Micro.32:918−923（1994）はNALCプロセッシングとS
DSプロセッシングとを比較し、そしていずれの方法も優
れていないと結論づけた。

増幅のためのプロセスした沈殿物（またはサンプルを
直接）の調製は７つの基本的なカテゴリーに分類され
る：（ｉ）16の例は、Maniatis,T.ら、（「Molecular C
loning A Laboratory Manual」,Cold Spring Harbor La
boratory,New York（1982）,458−463頁）により記載さ
れたように有機抽出およびアルコール沈殿方法論（org/
ppt）の変形を用いる；（ii）２つの例は、Higuchi,R.A
mplifications 2:1−３（1989）により記載されるよう
に酵素細胞溶解および煮沸プロトコル（Lz/Prk⇒95゜/1
5′）を用い、そして６つの例は、単に試料を煮沸す
る；（iii）10の例は音波処理（音波）を用いる；（i
v）３つは、Boomら、J.Clin.Microbiol.28:495−503（1
990）により記載されるようにカオトロピック試薬およ
びカラスビース（GuSCN/Si）を用い、そして２つはDNA
をシリカに結合する類似のプロトコルを用いる；（ｖ）
１つの例はスクロース勾配分画を用いた（Victor,T.
ら、J.Clin.Micro.30:1514−1517（1992））；（vi）１
つの例はde Lamballerie、X.ら、Res.Microbiol.143:78
5−790（1992）により記載されるようにChelex−100を
用いた；そして（vii）１つの例（Van der Giessen,J.
W.B.ら、J.Clin.Microbiol.30:1216−1219（1992））は
製造業者により提示されるカラムクロマトグラフィー手
順を用いた（Vary,P.H.ら、J.Clin.Microbiol.28:933−
937（1990））。合計は35より多い。なぜなら、van der
Giessen,J.W.B.ら、J.Clin.Microbiol.30:1216−1219
（1992）、Victor,T.Lら、Chin.Micro.30:1514−1517
（1992）、Wilson,S.M.ら、J.Clin.Micro.31:776−782
（1993）およびAbe,C.ら、J.Clin.Micro.31:3270−3274
（1993）、Millerら、J.Clin.Micro.32:393−397（199
4）およびPfyfferら、J.Clin.Micro.32:918−923（199
4）の研究は全て、試料を１より多いプロトコルにより
プロセスし、そして各方法について分析を示しているか
らである。100％の相関を主張する９つの研究のうち８
つは有機抽出／アルコール沈殿方法論によりDNAを単離
する。しかし、有機抽出方法論も用いる８つの研究は、
55.9％〜98.4％の範囲の相関を有した。100％の相関を
主張する１つの研究は煮沸によりプロセスした（Kocag
z,T.ら、J.Clin.Micro.31:1435−1438（1993））。ま
た、この同一のプロトコルを用いる６つの研究は、78.9
％〜95.9％の相関を報告した。７つの研究は増幅のため
の培養沈殿物を調製する方法を実際に比較している。そ
れらの結論は以下のように異なる:Pierre,C.ら、J.Cli
n.Micro.29:712−717（1991）は有機抽出／アルコール
沈殿を選択した;Wilson,S.M.ら、J.Clin.Micro.31:776
−782（1993）は単にクロロホルムで処理した;Folgueri
a,L.ら、J.Clin.Micro.31:1019−1021（1993）は酵素溶
解／煮沸方法を選んだ;Kocagz,T.ら、J.Clin.Micro.3
1:1435−1438（1993）およびSritharan,V.ら、Mol.Cel
l.Probes 5:385−395（1991）は単純な煮沸方法を選択
した；そしてForbes,B.A.ら、J.Clin.Micro.31:1688−1
694（1993）およびBuck,G.E.ら、J.Clin.Micro.30:1331
−1334（1992）は音波処理が最適な方法であると判定し
た（Kocagz,T.ら、J.Clin.Micro.31:1435−1438（199
3）の研究のみが100％の相関を達成した）。偽陰性の発
生は、増幅のためのサンプルを調製するために用いられ
るプロトコルと無関係であるばかりでなく、この問題を
取りまく論争が存在するようである。

２つの研究は増幅方法を実際に比較している:Abe,C.
ら、J.Clin.Micro.31:3270−3274（1993）は、Gen−Pro
be法がPCRよりわずかに良好であったことを示し（表１
の脚注κを参照のこと）、一方Millerら、J.Clin.Micr
o.32:393−397（1994）はその反対を決定している（表
１の脚注μを参照のこと）。明らかに、どちらの増幅技
術もTB感染の臨床診断に大きな利点を与えない。

E. PCRインヒビター 100％未満の相関を報告している論文のうち、17の研
究は増幅「インヒビター」を偽陰性に関与する因子と言
っている（表１の肩付き文字†を有する著者を参照のこ
と）。血液（Panaccio,M.ら、Nucl.Acids Res.19:1151
（1991）、糞便（Allard,A.ら、J.Clin.Microbiol.28:2
659−2667（1990）；痰（Hermans,P.W.M.ら、J.Clin.Mi
cro.28:1204−1213（1990））;Shawar,R.M.ら、J.Clin.
Micro.31:61−65（1993））および尿（Khan,G.ら、J.Cl
in.Pathol.44:360−365（1991））はすべてPCRインヒビ
ターを含有する。さらに、痰、気管支洗浄液および気管
吸引液に関しては、試料の粘度（粘液含量）と疾患状態
との間に直接的に相関が存在する：進行した段階の結核
患者は最も粘性の痰を有し、そしてこれらの試料は増幅
インヒビターを保持する最も高い蓋然性を有する。Herm
ans,P.W.M.ら、J.Clin.Micro.28:1204−1213（1990）お
よびShawar,R.M.ら、J.Clin.Micro.31:61−65（1993）
はそれぞれ、痰の存在下で５倍〜20倍、および５倍の感
度の低下を示す。

表１でプロセッシングについて示した42の方法論のう
ち、12の研究のみが緩衝液交換のいくつかの形態を取り
入れなかった。例えば、有機抽出／沈殿、ペレットの洗
浄、またはカオトロピック試薬（GuSCN/Si）を用いるプ
ロトコルはすべてある時点で緩衝液交換を必要とする。
しかし、沈殿物の音波処理は緩衝液交換を必要としな
い。これらの12の研究はいずれも100％の相関を達成せ
ず、そしてこれらのグループのうちの９つはインヒビタ
ーを偽陽性に関与する因子と言っている。インヒビター
は試料およびプロセッシングに用いる溶液の両方に由来
するようであり、そして両方の供給源は増幅技術の臨床
的実施に対する重大な障害を有する。

F. 低コピー数、統計学的ドロップアウトおよび「未説
明」の結果 「サンプルの偏り」ともいわれる統計学的ドロップア
ウトは、低コピー数に起因する；アリコートを採取しな
ければならない極めて低コピー数を有するサンプルにお
いて、いくつかのアリコートは標的を含有していない可
能性が存在する。例えば、１ミリリットル中に標的の10
コピーがあり、そして10の100μｌアリコートが採取さ
れる場合、いくつかの画分には標的が存在しない。これ
らのアリコートは偽陰性と判断されるが、「真に増幅陰
性」である。表１の８つの研究は、このタイプのサンプ
ルの偏りにより説明され得る現象を記載している（表１
中の肩付き文字§を有する著者の名前を参照のこと）。
下記のように、この現象は凝集により大いに悪化する。

100％未満の相関を報告する論文のうち、15は、「低
コピー数」を偽陰性の結果に関与する因子と直接言って
いる（表１中の肩付き文字‡を有する著者を参照のこ
と）。しかし、これらの15の研究のうちの６つおよび他
の３つは、陰性増幅試料が培養陽性とスミア陽性の両方
であった例を表す（表１中の肩付き文字¶を有する著者
の名前を参照のこと）。酸高速染色（acid fast staini
ng）の検出の限界は、痰１ミリリットルあたり7,800〜
9,500の生物と報告されている（Hobby,G.L.ら、Antimic
rob.Ag.Chemother.4:94−104（1973）;Yeager,H.ら、Am
er.Rev.Resp.Dis.95:998−1004（1967））。Clarridge,
J.E.ら、J.Clin.Micro.31:2049−2056（1993）は偽陰性
の広範囲にわたる分析を示している（本参照の表７を参
照のこと）。詳細に分析した37の偽陰性試料のうち、26
がドロップアウトを示し、一方11は「真に」PCR陰性で
あった。これらの37のうち９つはスミア陽性であった：
これら９のうち４つはインヒビターを含み、３つはイン
ヒビターについて試験されず、そして２つはインヒビタ
ーを含まないと見出された。これらの最後の２つのう
ち、１つは真にPCR陰性であった。Shawar,R.M.ら、J.Cl
in.Micro.31:61−65（1993）はまた、インヒビターを含
まないことが分かった培養陽性−スミア陽性−PCR陰性
試料を報告した。サンプルがインヒビターを含まず、そ
してスミア／培養陽性である場合、「低コピー数」は現
実的な可能性であり得ない。Shawar,R.M.ら、J.Clin.Mi
cro.31:61−65（1993）はこのクラスの偽陰性を「未説
明」と言っている。

G. 遠心分離の間のミコバクテリアの分配 ミコバクテリアの浮揚性質は1924年に明らかにされた
（Andrus,P.M.ら、Am.Rev.Tuberc.9:99（1924））。そ
れ以来、いくつかの研究がミコバクテリアの沈殿物化の
困難さを強調し（Hanks,J.H.ら、J.Lab.Clin.Med.23:73
6−746（1938）;Hata,Jr.,D.ら、Dis.Chest 18:352−36
2（1950）;Klein,G.C.ら、Am.J.Clin.Pathol.22:581−5
85（1952）;Ratman,S.ら、J.Clin.Microbiol.23:582−5
85（1986）;Rickman,T.W.ら、J.Clin.Microbiol.11:618
−620（1980）およびRobinson,L.ら、J.Lab.Clin.Med.2
7:84−91（1941））、そしていくつかの例において、上
清を培養することが標準的な実施として支持されてい
る。

幾つかの研究は、上清画分はスミア陽性物質を含有し
ていると報告したが（Hanks,J.H.ら、J.Lab.Clin.Med.2
3:736−746（1938）;Rickman,T.W.ら、J.Clin,Microbio
l.11:618−620（1980）、別の研究は、それぞれ2,000rp
mおよび3,000rpmで遠心分離した全ての試料の88.8％お
よび82.4％において、上清が培養陽性であったことを示
した（Klein,G.C.ら、Am.J.Clin.Pathol.22:581−585
（1952））。事実、この同じ研究は、それぞれ2,000rpm
および3,000rpmで遠心分離した全ての試料の2.2％およ
び2.7％において、沈殿物は培養陰性であったが、上清
は培養陽性であったことを示した。上清画分を分析する
ことはなお現代の同時代の実験室マニュアルにおいて論
じられている（Kent,P.T.ら、「Public Health Mycobac
teriology」A Guide for the Level III Laboratory、
米国厚生省、Centers for Disease Control,（1985）31
−46頁;Sommers,H.M.ら、「Mycobacterium,」:Manual o
f Clinical Microbiology,E.H.Lennetteら編、第４版、
Am.Soc.Microbiol.,Washington,D.C.（1985）,216−248
頁）。

サンプルサイズと相関との間の逆の関係は、浮力現象
により潜在的に説明され得る。より大きなサンプルサイ
ズはバッチプロセッシングを必要とする。バッチプロセ
ッシングの際、最初の試料の後処理と最後の試料の後処
理との間にかかる時間が増加する。この時間が増加する
程、浮力に影響を及ぼす時間がより多くなる。この浮力
の原因はこれらの生物の高い脂質含量であることが示唆
されている（Silverstolpe,L.Nord.Med.40/48:2220−22
22（1948））。

H. ミコバクテリアの回収における細胞壁および表面張
力の影響 ミコバクテリアの細胞壁の性質はそれらの生命力の貼
り強さの原因である。顕微鏡写真は30nm〜40nm厚の非常
に複雑な構造を表す（Rastogi,N.ら、Antimicrob.Agent
s Chemother.20:666−667（1981））。細胞壁の乾燥重
量の60％が脂質である（Joklik,W.K.ら、Zinsser Micro
biology第20版,Appleton ＆ Lange,Norwalk,CT（199
2）,499頁）。

ミコバクテリアの細胞壁は３つの異なる層を有する：
（ｉ）ペプチドグリカン、（ii）アラビノガラクタン、
および（iii）糖脂質（細胞壁の構造の包括的な概説の
ために、McNeil,M.R.ら、Res.Microbiol.142:451−463
（1991）を参照のこと）。ミコール酸（極めて疎水性で
あり、そして主に炭化水素鎖（Σ＝C₇₆−C₈₀）からな
る）は、アラビノガラクタン層および糖脂質層の両方の
構築において、大量に用いられる。ミコール酸の構造お
よび種の分布はTakayama,K.ら、「脂質の構造および合
成」:The Mycobacteria:a Source Book,Part A,G.P.Kub
icaら編、Marcel Dekker,Inc.,New York,NY（1984）,31
5−344頁に概説されている。ミコバクテリアは本質的に
ワックスに入れられる。

M.tuberculosisは増殖の際に「コード」を形成し（コ
ードは多数の生物の凝塊または集合体である）、そして
MTBの菌力とコード形成との間には直接的な関係がある
（Joklik,W.K.ら、Zinsser Microbiology第20版、Apple
ton ＆ Lange,Norwalk,CT（1992）,503頁）。MAC複合体
の生物は、その細胞壁中にさらなる糖脂質（Ｃ−ミコシ
ド）成分を有する（血液型亜型間の差異はBrennan,P.J.
Rev.Infect.Dis.11（補遺２）:s420−s430（1989）に要
約されている）。培養において、MTB複合体生物は密な
凝塊を形成することが分かっているが、M.aviumはより
拡散した単細胞様式で増殖する（Dubos,R.J.ら、J.Exp.
Med.83:409−423（1946））。

Dubos,R.J.Proc.Soc.Exp.Bio.Med.58:361−362（194
5）は、培養したMTBのホールマーク（hallmark）外皮成
長は、ソルビタンモノステアレート（Tween 60:CAS 番
号9005−67−８）ポリオキシアルキレン誘導体の添加に
より改変され得ることを観察した。この観察は後に拡張
されて、他の類似の誘導体によりMTBが「迅速な」、
「拡散した」かつ「沈降した」増殖特性を示し得ること
を示した（Dubos,R.J.ら、J.Exp.Med.83:409−423（194
6））。Tween 80（CAS 番号9005−65−６）はこれに関
して最も活性であることが見出された。これらの著者
は、沈降増殖は細胞表面の「湿潤（wetting）」による
と結論付けた。用語「湿潤」は表面張力の文脈にのみ使
用される。これらの研究の示唆は、外皮の成長がワック
スの被膜と水性媒体との間の表面張力により生じるこ
と、およびTween 80の添加により、この物理的相互作用
を緩和することであった。

表面張力が生物を表面に閉じ込める場合、これはコー
ド形成と組み合わせて正常でない結果を説明し得る：非
常に重篤な患者はコード形成の傾向を有する生物により
感染されている。さらに、大きなコードは、スミア陽性
の結果および非常に速やかに陽性に転じる培養を生み出
す。大きなコードはまた、サンプルの偏りを悪化させ
る。なぜなら、大きなコードは１コピーとして分布して
いるが、何千のコピーの潜在能力を有するからである。
従って、Klein,G.C.ら、Am.J.Clin.Pathol.22:581−585
（1952）により示唆されているように、微生物は容易に
上清画分と共に流出し、それによりサンプルの偏りの現
象を助長する。さらに、コード形成は細菌の分配を引き
起こし、その結果スミア／培養陽性および増幅陰性の結
果が発生する。

表面張力および凝集が異常な結果の原因であり、そし
て表面張力および凝集が非イオン性界面活性剤の添加に
より克服され得る場合、これらの試薬が培養との相関を
改善することは理論的であると思われる：表１の５つの
研究は、非イオン性界面活性剤を用いて増幅の前に沈殿
物を洗浄している（Clarridge,J.E.ら、J.Clin.Micro.3
1:2049−2056（1993）;Irula,J.V.ら、J.Clin,Micro.3
1:1811−1814（1993）;Kolk,A.H.J.ら、J.Clin.Micro.3
0:2567−2575（1992）;Shawar,R.M.ら、J.Clin.Micro.3
1:61−65（1993）；およびSritharan,V.ら、Mol.Cell.P
robes 5:385−395（1991））。このサブセットにおける
培養との相関は78.9％〜95.5％の範囲である。1941年当
時、表面張力を緩和する試薬が遠心分離による回収の増
強に無力であることが認識されていた（Robinson,L.
ら、J.Lab.Clin.Med.27:84−91（1941））。それ故、こ
の技術は、洗浄緩衝中にこれらの界面活性剤を含有させ
ることのさらなる利点は明らかに存在しないと教示して
いる。

I. MAC複合体生物に固有の問題 表１中の35の研究のうち27は増幅および／または検出
のためにMTB特異的配列を用いている。６つの研究は属
特異的プライマーを用いているが、その設計はTB複合体
微生物の増幅を優先的に促進する。Irula,J.V.ら、J.Cl
in.Micro.31:1811−1814（1993）の研究のみがM.avium
に焦点を置いており、そしてvan der Giessen,J.W.B.
ら、J.Clin.Microbiol.30:1216−1219（1992）の研究の
みがM.paratuberculosisに焦点を置いていた。Irulaは
異なる単離技術を用い、比較を困難にしていた。しか
し、PBMCが単離される際、これらは事実上Tris/EDTA/Tr
iton X−100中の洗浄工程に供されていた:PBMCが洗浄の
間に溶解された場合、細菌は上清と共に捨てられ得る。
とにかく、PBMC単離は生物を捕獲する極めて効果的な手
段であることが予想される。van der Giessenの研究
は、ウシ糞便中のM.paratuberculosisを検出するために
設計された３つのPCRをベースにした系（McFadden,J.J.
ら、Mol.Microbiol.1:283−291（1987）;van der Giess
en,J.W.B.ら、J.Med.Microbiol.36:255−263（1992）;V
ary,P.H.ら、J.Clin.Microbiol.28:933−937（1990））
（これらのうち１つはIDEXXから市販入手可能なキット
である（Vary,P.H.ら、J.Clin.Microbiol.28:933−937
（1990））を比較した。それらの結果は、表１に示され
るどれよりもはるかに悪く、そして不自然に低く思われ
る。これらの結果は、さらなる脂質親和性成分を有する
MAC複合体生物が、増幅のためのプロセッシングに対す
るさらなる未定義の複雑さを提供することを示す。

J. ミコバクテリアの先天的特質は増幅技術の阻害的搾
取作用を有する 明らかに、偽陰性の結果の２つの主要な原因が存在す
る。第１に、インヒビターは種々の試料タイプにおいて
豊富であり、準備溶液はまた、増幅反応の効率を修正す
る役割を果たす。第２のカテゴリーは、ミコバクテリア
の先天的特質に起因する。これらの特徴は原因は明らか
なようだが、感度におけるこれらの特質の影響はあまり
に一般的であるため、Noordhoekら、J.Clin.Micro.32:2
77−284（1994）は「...7つの研究間のPCRの感度におけ
る極端な差異を説明し得る可能性のある要因を推量しな
い...」と結論付けている。

これらの微生物の浮揚性質であるコード形成が、非効
率的な方法で生物の分配を引き起こし、そして生物を上
清と共に流出させる。この状態の極端な例は「未説明」
の結果を引き起こす：培養陽性かつスミア陽性である
が、多回数増幅の局面では真に陰性であるらしく、かつ
インヒビターを含有していないサンプル。明らかに、こ
れらの特徴の原因および性質は完全に説明されている。
しかし、本明細書中に記載される方法が解決すること
は、その基礎がこれらの生物の先天的性質中に存在する
これらの現象である。

発明の要旨 引き続く分析および培養のためにミコバクテリアを調
製するための現行の方法に関係する問題、およびミコバ
クテリアの検出のための生物学的および無機サンプルを
調製するための、迅速かつ安価であるが正確な方法の必
要性を認識して、本発明者は、このようなミコバクテリ
アの調製のためのサンプル抽出方法を研究した。

これらの研究は、培養による検出、特に増幅のような
方法による検出、そして最も詳細には核酸増幅による検
出を包含する検出のためのミコバクテリアのプロセッシ
ングのための方法に達した。これらの方法は、第１に、
偽陰性および統計的ドロップアウトの原因となる凝集お
よび浮力のような当該分野で認識されている問題を効果
的に克服する。本発明者は、本明細書中で「SB−18様界
面活性剤」と呼ぶ特定の両性イオン性界面活性剤が驚く
ほどそして思いがけずミコバクテリアを分散させ、そし
て全てのSB−18様界面活性剤が明らかにこれらの生物の
浮揚性質を解決することを見出した。MTB複合体のミコ
バクテリアについては、凝集が極端である場合、分散は
回収の効率を改善するのに主要な推進力であるようであ
る。単細胞として増殖する他のミコバクテリア、例えば
MAC複合体生物については、回収を改善する推進力は、
界面活性剤の蓄積による浮力の阻止であるようである。
MTB複合体でもMAC複合体でもないミコバクテリアについ
ては、サンプル調製のプロトコル中のこのような界面活
性剤の含有は、偽陰性増幅を導く当該分野における同様
の問題を回避する。

本発明者はまた、ミコバクテリアが脱気された場合、
以前に浮力を補う能力を示さなかったさらなる界面活性
剤が、回収の改善に適切であるようになることを見出し
た。おそらく脱気は、表面張力が生物を媒体の表面に制
限するただ１つの残存因子である時点まで浮力を除去す
る。適切な条件が与えられた場合、極めて大部分の界面
活性剤が表面張力を克服する能力を有する。これらの界
面活性剤はMTB複合体生物における凝集物を除去せず、
それ故サンプルの偏り現象を排除しないが、遠心分離に
よる採取の効率を改善する。本発明者らは、MAC複合体
生物および主に単細胞として増殖する他のミコバクテリ
アについて、限定した脱気と組み合わせた場合、増強さ
れた能力で回収を改善する界面活性剤を特定のクラスが
あることを示す。

本発明の方法は、一般的に、任意の微生物、特にその
細胞壁にミコール酸またはミコール酸様脂質を含有する
微生物（例えば、Corynebacteria（コリノミコール酸
（corynomycolic acid）を含有する脂質を有する）およ
びNocardia（ノカルドミコール酸を含有する脂質を有す
る）を包含する）に適用可能である。本発明の方法はま
た、一般的に、任意の微生物の検出のための生物学的サ
ンプルのプロセッシングに適用可能である。

図面の簡単な説明 図１は、NALC/NaOHサンプル抽出溶液によるPCRの阻害
を示すドットブロットアッセイである。

図２は、臨床サンプルにおけるミコバクテリアのプロ
セッシングを模倣するように設計されたインビトロのプ
ロトコルである「プロセッシングアッセイ」を記載する
スケッチを示す。

図2Aは、水が抽出溶液である場合に図２で概説される
ようなインビトロでのプロセッシングの間のMycobacter
ium tuberculosisの回収効率を強調するドットブロット
の結果を示す。

図３は、抽出溶液への0.1％ Triton X−100の添加の
効果を示す。

図４は、Mycobacterium tuberculosisを分散させる界
面活性剤の能力を評価するために設計されたプロトコル
である「凝集アッセイ」を記載する図である。

図4Aは、ミコバクテリアを分散する試みのドットブロ
ットの結果を示す。３つの代表的な条件からのデータを
示す：水、0.1％ Tween 80および2mM SB−18である。

図５は、2mM SB−18が抽出溶液中に含まれる場合のMy
cobacterium aviumおよびMycobacterium tuberculosis
の両方についてのインビトロでのプロセッシングの効果
を示す。

図６は、SB−18の異なるイオン性の同族体を抽出溶液
に使用する場合のMycobacterium tuberculosisのインビ
トロでのプロセッシングのドットブロットの結果を示
す。

図７は、異なるSB型界面活性剤を抽出溶液に用いる場
合のMycobacterium tuberculosisのインビドロのプロセ
ッシングのドットブロットの結果を示す。

図7Aは、異なるSB型界面活性剤を抽出溶液に用いる場
合のMycobacterium aviumのインビトロでのプロセッシ
ングのドットブロットの結果を示す。

図８は、ココカルボキシベタイン（例えば、SB−18様
界面活性剤）を抽出溶液中に使用する場合のMycobacter
ium tuberculosisのインビトロでのプロセッシングのド
ットブロットの結果を示す。

図９は、種々の電荷の組み合わせおよび構造的関係を
有するベタインを抽出溶液に用いる場合のMycobacteriu
m tuberculosisのインビトロでのプロセッシングのドッ
トブロットの結果を示す。

図9Aは、種々の「架橋」構造を有するベタインを抽出
液に用いる場合のMycobacterium tuberculosisのインビ
トロでのプロセッシングのドットブロットの結果を示
す。

図9Bは、種々のアルキルとアルキルとの「結合」構造
を有するベタインを抽出溶液に用いる場合のMycobacter
ium tuberculosisのインビトロでのプロセッシングのド
ットブロットの結果を示す。

図9Cは、天然油のみに由来する疎水性ドメインを有す
るベタインを抽出溶液に用いる場合のMycobacterium tu
berculosisのインビトロでのプロセッシングのドットブ
ロットの結果を示す。

図9Dは、天然油のみに由来する疎水性ドメインを有す
るベタインを抽出溶液に用いる場合のMycobacterium tu
berculosisのインビトロでのプロセッシングのドットブ
ロットの結果を示す。

図10は、アッセイ条件に対する予測可能な改変によ
り、能力の弱いあるいは非機能性であるベタインがMyco
bacterium tuberculosisのインビトロでのプロセッシン
グにおいて機能することを示す。

図11は、インビトロでのプロセッシングにおける減圧
の効果を研究するための実験プロトコルの図である。

図11Aは、Mycobacterium tuberculosisおよびMycobac
terium aviumの両方についてのインビトロでのプロセッ
シングにおける減圧の効果を示す。

図12は、Triton X−100がインビトロでのプロセッシ
ングの間の回収の効力を向上させ得るには、Mycobacter
ium tuberculosisの長期脱気が必要であることを示す。

図13は、Brij 96（SB−18とTween 80との両方のほぼ
オクタデシルの非イオン性構造ホモログ）がSB−18様活
性を表すことを示す。

図14は、Mycobacterium aviumの制限された減圧脱気
が、遠心分離によって回収を改善することにおいてある
程度の効力を有するほぼオクタデシルの界面活性剤のク
ラスを明らかにしていることを示す。

図15は、これらの実験のために用いられる減圧脱気装
置のデザインを記載している。

図16は、図11で概説したSB−18プロセッシング手順
と、NALC/NaOHプロセッシング手順とを比較するために
デザインされた実験プロトコルの概略図である。

図16Aは、図16のプロトコルが行われる場合の、Mycob
acterium tuberculosisの増殖曲線を表す。

図16Bは、図16のサンプルがPCRにかけられる場合の増
幅結果を表す。

好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、液体培地に浮き（「浮力」がある）、そし
て／または増殖中にコードまたは凝集塊を形成する点で
特徴づけられる微生物の検出または培養のための試料の
調製法を提供する。

「試料」は、ミコバクテリア（特に、Mycobacteriu
m）の存在についてアッセイされるか、または培養され
る任意の物質（生物学的サンプルおよび無機的サンプル
を含むが、これらに限定されない）を意味する。

「生物学的サンプル」は、動物（ヒトを含む）性また
は植物性供給源から採取した試料を意味する。特に目的
とされる動物性供給源由来の生物学的サンプルは、反芻
動物（例えば、ウシまたはヒツジ動物）、および魚類お
よび鳥類動物由来のものを含む。用語、生物学的サンプ
ルはまた、加工または未加工の食物（例えば卵、チー
ズ、ミルク、および他の酪農製品を含む）、植物性また
は細胞培養供給源（例えば、単球または繊維芽細胞培養
物）由来の試料を含むことを意図される。

「無機的サンプル」は、非生物学的供給源（例えば、
土壌、水、おがくずおよび空気のような環境供給源）由
来のサンプルを意味する。

「堆積物」は、ミコバクテリアを濃縮する様式で処理
され、そして／または浄化された試料を意味する。これ
により後の検出プロセッシングのためのサンプルを得る
ことが可能になる。

「洗浄」は、所望のサンプルが溶液、一般的にほぼオ
クタデシルのまたはSB−18様の界面活性剤を含有する溶
液と接して配置されることを意味する。

「ミコール酸構造」は、当該分野（Goren,M.B.Bact.R
ev.36:33−64（1966）、本明細書に参考として援用され
る）で理解されるように、中程度の長さの脂肪族鎖でα
位にて置換されたβ−ヒドロキシ酸を意味する。

「SB−18様界面活性剤」は、後の検出のために定性的
方法において、ミコール酸構造を含有するミコバクテリ
アの物理的回収を容易にする能力を有するベタインを意
味する。用語「SB−18様」は、「ベタイン様」と同義で
ある。本発明のSB−18様界面活性剤は、ミコバクテリア
のコード（および凝集塊）を分散させ、そして／または
ミコバクテリアの浮力を補償する能力を有する。分散
は、検出のために採取されるアリコートが微生物を含む
可能性を増大させることにより検出を容易にする。コー
ドを分散するSB−18様界面活性剤は、炭素原子が16を超
えるアルキル鎖長を有し、そして炭素18個〜20個を有す
るアルキル鎖が最も好ましい。本発明のSB−18様界面活
性剤はまた、自然浮力をある程度補償することにより、
好ましくは細菌細胞中への界面活性剤の移動を容易にす
ることにより、凝集塊で増殖しないミコバクテリア（例
えば、MAC生物）の回収を容易にする能力を有する。浮
力を補償するSB−18様界面活性剤は、好ましくは炭素原
子が12を超えるアルキル鎖長を有し、そして炭素原子16
個〜20個が最も好ましい。

「SB−18様活性」は、コード分断を促進する（そして
従って、溶液中に均一に微生物を分散させる）能力、ま
たは浮力を補償し、そして従って遠心分離によりこのよ
うな微生物の定量的回収を実質的に促進する能力のいず
れか、あるいはその両方の能力を意味する。例えば、増
殖中に凝集する微生物（例えばMTB生物）の場合には、S
B−18様界面活性剤での処理は、浮力を補償すること、
およびまた、プロセッシング溶液全体により均一に生物
を分散させることの両方によって検出を容易にする。こ
の２元的機能が、この界面活性剤の「SB−18様活性」で
ある。これらの性質を有するSB−18様界面活性剤の例
は、例示により、または例示されたベタインの構造に対
する類似により、これらの性質を有する、本明細書中に
記載される任意のベタインを含み、表２および３に示さ
れ、そして／または本明細書中に記載される構造を有す
る、CB様、SB様、HSB様、PB様、StB様、PhB様、So様、R
ev−Ｂ様、AO様、cAB様およびImB様界面活性剤を含む。

「脱気」は、ミコール酸構造（例えば、ミコール酸、
ノカルドミコール酸またはコリノミコール酸）を含有す
る微生物の自然浮力を相殺するのに必要な時間および温
度で、試料または堆積物を減圧下に配置することを意味
する。以下の説明に固執する意図はないが、脱気は、細
胞壁に捕捉されたCO₂を除去し、これによりこれら生物
の自然浮力のいくらかを除去すると考えられている。SB
−18様界面活性剤を用いる場合、サンプルを、60分間40
℃から42℃で600mmHgの下に配置することが好ましく、
そしてこのことにより微生物の回収が容易になる：しか
し、同一減圧下および同一温度で長期間脱気を行えば、
任意の界面活性剤も検出を容易にする。

従って、本発明の方法によれば、浮力が以下の３つの
異なる方法において相殺され得る：細胞の内部に界面活
性剤が蓄積することによる、脱気することによる、ある
いはその両方によるのいずれかである。脱気工程の存在
下または非存在下において検出を容易にした特定の界面
活性剤（ベタインではなかった）が存在する。例えば、
Brij96（ポリオキシエチレン10オレイルエーテル（Ｃ
_18:1E₁₀）（CAS 番号9004−98−２）のような非イオン
性線形界面活性剤が、ベタインの頭基（headgroup）と
同様な頭基を有する。これらの「棒状」界面活性剤は、
細胞に入り込むのに立体的障害を有さず（Tween 80と比
較して）、そして細胞内側に急速に拒絶され得、これに
より浮力が補償される。従って、本明細書中で使用され
るような「棒状」は、本発明の方法において、脱気工程
の非存在下、SB−18様活性を示す非イオン性界面活性剤
をいう。他の非イオン性棒状界面活性剤は、この様式で
浮力を補償すると期待される。他の界面活性剤（例え
ば、オクタデシル陽イオン性界面活性剤オクタデシルト
リメチルアンモニウムブロマイド（TMA−18:CAS 番号1
120−02−１）またはベンジルジメチルオクタデシルア
ンモニウムクロライド（BenzDMA−18））は、これらの
短鎖ホモログより大きな程度まで検出を容易にするよう
であるが、これは脱気した場合のみにおいてである。以
下の説明に固執する意図はないが、特定の界面活性剤が
その「ほぼオクタデシル」構造により、より容易に細胞
内に蓄積すると考えられている。

本明細書中用いられる「棒状」は、ベタインの「軸
比」と同様な軸比を有する界面活性剤分子をいう。ここ
で、軸比は以下のように定義される：「短軸に対する長
軸比...」（McGraw−Hill Dictionary of Scientific a
nd Technical Terms,第５版、Parker,S.P.編、McGraw−
Hill,Washington,D.C.（1994）168頁）。長軸を、長ア
ルキル鎖（例えば、疎水性ドメイン：表２において定義
されるようなR₁）として、そして短軸を頭基の直径とし
てとる。長軸および短軸は、定義により、互いに直交し
ている。

「ほぼオクタデシル」は、SB−18様オクタデシル部分
と同様なオクタデシル様部分（好ましくは炭素原子12個
〜20個、そして最も好ましくは、炭素原子18個〜20個）
を有する界面活性剤分子であって、SB−18様活性は観測
されるが、効果的である両性イオン官能性の存在を必要
としないように本発明の方法において使用され得る、界
面活性剤分子を意味する。これは、SB−18様活性を示す
ために、脱気を必要としない棒状界面活性剤、または脱
気を必要としない陽イオン性界面活性剤を含むが、これ
らに限定されない。ほぼオクタデシルの界面活性剤は、
MAC複合体生物に適用される場合、本発明の方法におい
て有用である；ほぼオクタデシルの界面活性剤は、SB−
18様界面活性剤を含む。全てのほぼオクタデシルの界面
活性剤が、SB−18様界面活性剤であるわけではないが、
全てのSB−18様界面活性剤は、ほぼオクタデシルの界面
活性剤である。

「CAS 番号」は、Chemical Abstracts Service登録
番号（2540 Olentangy River Road,PO Box 3012,Columb
us,Ohio）を意味する。本出願おいて言及される全てのC
AS 番号および構造のリストを、表13に示す。

検出のために試料をプロセッシングすること 本明細書中および最も好ましい実施態様において例示
されるように、微生物は、ミコバクテリウムである。本
明細書中にさらに例示されるように、後の、外部細胞壁
にミコール酸構造を含む、凝集している微生物の検出の
ために、試料をプロセッシングするための本発明の方法
を、ミコバクテリアのMTB複合体のプロセッシングおよ
び検出により例示する。本明細書中にさらに例示される
ように、後の、外部細胞壁にミコール酸構造を含み、そ
して浮く微生物群の検出のために、試料をプロセッシン
グするための本発明の方法を、ミコバクテリアのMAC複
合体の検出により例示する。ミコバクテリアのメンバー
を、本明細書中に特に例示するが、本明細書中の教示お
よび本発明の方法は、それが、浮き、そして／または凝
集し、そして／または細胞壁にミコール酸構造を含むと
いう点で同様に特徴づけられる、任意の生物のサンプル
調製に有用であると理解されるべきである。

本発明の第一の実施態様によれば、サンプル（また
は、調製される場合、堆積物サンプル）を、緩衝化SB−
18様界面活性剤、あるいは脱気工程の非存在下において
SB−18様活性を有するほぼオクタデシルの界面活性剤
（例えば、棒状界面活性剤）を含有する培地に、このサ
ンプルまたは堆積物を暴露することによりプロセッシン
グする。凝集塊として増殖しない微生物（例えば、MAC
生物）の場合には、この工程は、自然浮力をある程度補
償することにより回収を容易にする。増殖中に凝集する
微生物（例えば、MTB生物）の場合には、この工程は、
浮力を補償することにより、そして微生物をより均一に
プロセッシング溶液全体に分散させることにより、回収
を容易にする。本発明の方法の第一の実施態様におい
て、脱気工程はなく、そしてSB−18様界面活性剤が凝集
している微生物（特に、ミコバクテリア）、および特に
MTB複合体を離解するために用いられる。

本発明の第二の実施態様によれば、サンプル（また
は、調製される場合、堆積物サンプル）を、このサンプ
ルまたは堆積物を脱気工程（例えば、減圧）に暴露する
ことによりプロセッシングする。本発明の第二の実施態
様において、ミコバクテリア（例えば、MAC複合体のミ
コバクテリア）を簡単に脱気し、次いでアッセイする。
第二の実施態様における洗浄溶液の組成は、以下にさら
に示すように、水または水性緩衝液であり得るが、決し
てこれらに限定されない。

本発明の第三の実施態様によれば、サンプル（また
は、調製される場合、堆積物サンプル）に脱気工程およ
び界面活性剤含有洗浄工程の両方を施す。第三の実施態
様では、任意の界面活性剤（しかし、特には、ほぼオク
タデシルである界面活性剤、そして最も好ましくは、SB
−18様界面活性剤）が、減圧工程と共に用いられ得る；
さらに任意の界面活性剤（しかし、特には、ほぼオクタ
デシルであり、そして最も好ましくは、SB−18様界面活
性剤）が、所望の使用に依存して、脱気工程に先んじ
て、続いて、または同時に行い得る洗浄工程において使
用され得る。第三の実施態様は、ミコバクテリアの種が
非知であるサンプルが、MTB複合体およびMAC複合体の少
なくとも１つを含有すると考えられるサンプルに、特に
有用である。

試料または堆積物、さらに必要であれば、所望の界面
活性剤に接触して配置される液体培地（例えば、洗浄緩
衝液）は、特定の生物学的物質（例えば、痰）を可溶化
するのを補助するか、さもなくはサンプルの所望でない
性質の廃棄の補助をする、成分（例えば、ジチオトレイ
トール（DTT）および酵素（例えば、グリコシダーゼお
よびDNase）を含有し得る。DTTおよび酵素（例えば、グ
リコシダーゼおよびDNase）は、生物学的液体の粘度を
減じるための有用な物質である。

１つを超える洗浄工程が、所望であれば行われ得、そ
してこのような複数の洗浄工程を連続的に（相次いで）
行い得るか、または他の操作工程で分離して行い得る。
このような洗浄工程は更なる試薬を含み得る。更なるプ
ロセッシング工程が更なる試薬（例えば、さらに試料を
除染する試薬）の含有を必要とする範囲で、このような
工程は使用され得る。このような複数の洗浄工程は、異
なる界面活性剤を含み得るか、または同一の界面活性剤
を全てが含み得る。同一の洗浄工程において、異なる非
SB−18様界面活性剤を組み合わせることにより、一般
に、個々の界面活性剤の効力が減少する。しかし、これ
らの界面活性剤とSB−18様界面活性剤との特定の組み合
わせ、またはほぼオクタデシルの界面活性剤との特定の
組み合わせが、本発明の方法における効力を維持する範
囲で、このような組み合わせは用いられ得る。

本発明の任意の実施態様において、ミコバクテリアの
存在についてアッセイされるサンプルは、まず、第一の
プロセッシング工程として所望される任意の標準的な生
物学的手順（例えば、Kent（A Guide for the Level II
I Laboratory,U.S.Department of Health and Human Se
rvice,Centers for Disease Contorol（1985）、31−46
頁のKent,P.T.ら、「Public Health Mycobacteriolog
y」）により推奨される一つの手順および特に、実施例
２、４および６に示されるようなNALC/NaOH単離手順に
より抽出され得る。堆積物の一部分を、まず培養および
スミアのために取り出す。次いで、残りの堆積物を、増
幅（核酸またはシグナル）または免疫検出、あるいはサ
ンプル中の所望のミコバクテリウムの存在を識別し得る
任意の方法による後の検出のために、任意の実施態様に
よりさらにプロセッシングする。しかし、以下および実
施例において考察されるように、今日当該分野に用いら
れている標準的な技術による、このようなプロセッシン
グは、サンプル中に存在するミコバクテリアの回収およ
び／または検出を妥協する場合が多い。特にこのような
ミコバクテリアが、極めて少数しか存在しない場合にお
いてはそうである。従って、本発明の方法は、単独で用
いられる場合、サンプル中に存在する少数のミコバクテ
リアに対してさえ本質的に定量的であるが、一方、本発
明の界面活性剤または脱気工程を提供しない現在のプロ
トコルとともに用いられる場合には、ミコバクテリアの
回収は既に妥協され得る。例えば、適切な試薬で、水酸
化ナトリウムまたはシュウ酸、あるいはKent,P.T.ら
（上記）により記載された任意の除染剤を中和し、次い
で遠心分離前に、プロセッシングのためのSB−18様界面
活性剤またはほぼオクタデシルの界面活性剤を添加する
ことにより；あるいは遠心分離前の本発明の方法によ
る、さらなるプロセッシングのために、中和緩衝液とし
て作用するように、適切に緩衝化したSB−18様界面活性
剤またはほぼオクタデシル界面活性剤を添加するか；遠
心分離前に、中和された試料を簡単に脱気することによ
り非効率的な回収を避ける様式で、Kent,P.T.ら（上
記）の現代のプロトコルを改変することも可能である。
このように改変されたプロトコルにより、依然現代の方
法論を利用しながら、SB−18様活性および／または脱気
が、遠心分離による回収効率を改善し得る。

従って、実施例13において例示されるような高度に好
ましい実施態様において、ミコバクテリアの存在につい
てアッセイされるサンプルは、最初に任意の標準的な予
備的プロトコルによりプロセッシングされることなく、
直接増幅することによる検出および／または培養のため
のミコバクテリアの迅速な単離のために本発明の方法に
おいて利用される。むしろ、サンプルは、直接使用され
るか、または浄化されるか、さもなくば、必要であれ
ば、当該分野で公知の通常の分離技術（例えば、遠心分
離、ろ過、ゲル排除クロマトグラフィーまたはイオン交
換クロマトグラフィー）を用いて固体および／またはイ
ンヒビターを除かれるかのいずれかである。このサンプ
ルは、本明細書に記載されるように、SB−18様界面活性
剤での洗浄、浮力を予め取り除く減圧、またはその両方
のいずれかを直接施される。プロセッシングされた細胞
が、効率的に回収され、そして堆積物が所望の微生物の
検出のために用いられた。

上記の第一の実施態様において、所望の量の堆積物ま
たはサンプルが、溶液全体に均一にミコバクテリアを離
解し、そして浮力を補償するのに十分な時間および温度
および撹拌レベルにて、SB−18様界面活性剤を含有する
洗浄緩衝液で十分な大きさの容器中でプロセッシングす
る。このような撹拌は、次工程の直前に、例えば、ボル
テックスするか、あるいは一般的には、界面活性剤が、
微生物を効率的に離解し、そしてそれらを液体中に分散
させることを可能にするに十分にしっかりとペレットを
再懸濁（または、試料を懸濁）するために、サンプルを
保持する容器を動かし続けることにより達成し得る。多
少上昇した温度（例えば、37℃）は、後の検出法を妥協
することなく離解を容易にする。この温度は、SB−18様
界面活性剤が沈殿するのを防ぐために必要であり得る。
微生物の均一分散（および特にミコバクテリアの均一分
散）後、これらは、当該分野で公知の技術（例えば、遠
心分離）を用いて凝集塊で回収され、そして検出され得
るか、さもなくば以下に記載するようにアッセイされそ
して分析され得る。

第二の実施態様において、サンプル、または残りの堆
積物は、簡単に、水中または他の所望の培地（界面活性
剤を含む培地である必要はない）中において再懸濁さ
れ、そして溶液中のミコバクテリア（特に、MAC複合体
生物）の自然浮力傾向を予め取り除くのに十分な時間、
所望の圧力および温度にて脱気される。次いで、微生物
は、以下に記載のように回収され、そして検出され得
る。

上記に記載した第三の実施態様において、脱気の前、
その間、またはその後に、ほぼ任意の界面活性剤（しか
し、特に、ほぼオクタデシルの界面活性剤、そして最も
特にSB−18様界面活性剤）が分散を達成し、そしてさら
に浮力を補償するために培地中で使用され得ることを除
いて、最初の２つの実施態様は本質的に組み合わせられ
る。脱気工程は、界面活性剤洗浄工程に先んじるか、そ
れに続き得る。または、界面活性剤工程は、脱気工程と
同時であり得る。当業者は、現状技術が与えられれば、
試料の洗浄および脱気を同時に行うことが、顕著な安全
性リスクを引き起こし得ることに気づくべきである。

第三の実施態様は、実施例10にさらに記載される。実
施例10に示されるように、減圧処理が、界面活性剤洗浄
と共に用いられる場合、ほぼオクタデシル界面活性剤
（好ましくは、SB−18様界面活性剤、そして最も好まし
くは、SB−18）が使用され得る。実施例10においてさら
に示されるように、サンプルを十二分に脱気して、ほと
んどの自然浮力を排除する条件下で、任意の界面活性剤
を使用し得る。この実施態様において、このサンプル
は、浄化または精製を必要とし得るか、あるいは必要と
し得ない；これらの工程は、所望の減圧−界面活性剤処
理工程の前、その間、またはその後のいずれかにおいて
実施され得る。上記のように、次いで、微生物は回収さ
れ、そして検出され得る。

従って、ミコバクテリアの定量的回収のために、Ken
t,P.T.ら、「Public Health Mycobacteriology」（A Gu
ide for the Level III Laboratory,U.S.Department of
Health and Human Service,Centers for Disease Cont
rol（1985）31−46頁）に記載されたＮ−アセチル−Ｌ
−システイン/NaOH（NALC）手順のような標準的なサン
プルプロセッシング法は、好ましくは放棄されるか、ま
たは上記のように改変される。そしてこの試料、または
除染された試料は、（ｉ）SB−18様界面活性剤（好まし
くはSB−18）での洗浄、（ii）簡単な脱気、または（ii
i）アッセイが所望されるミコバクテリアに依存して、
界面活性剤洗浄と減圧処理の両方の組み合わせを直接施
される。

しかし、所望であれば、本発明の方法の実施のため
に、例えば、痰、脳骨髄液、および尿を包含する生物学
的流体由来のサンプルは、第一工程においてプロセッシ
ングされて堆積物を提供し得る。例えば、サンプルは、
以下の実施例12において強調し、かつ上記したように、
Kent,P.T.ら、「Public Health Mycobacteriology」（A
Guide for the Level III Laboratory,U.S.Department
of Health and Hhuman Service,Centers for Disease
Control（1985）31−46頁；参考として本明細書中に援
用される）に記載された任意の方法（Ｎ−アセチル−Ｌ
−システイン/NaOH（NALC）手法を包含する）によりま
ずプロセッシングされ得る。

堆積物は、激しい混合（例えば、ボルテックス）を可
能にするに十分な大きさの容器にて液体（例えば、水ま
たは所望のSBP18様界面活性剤を含む他の緩衝液）と混
合することによる第二の洗浄工程を施され得、そして必
要であれば、当該分野で公知の方法（例えば、ゲルクロ
マトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィまたはろ過
方法）を第二の洗浄工程の前、その間、またはその後に
用いてさらに精製され得る。このようなプロセッシング
から得られた細菌ペレット（堆積物）は、検出（培養に
よる検出を含む）のためのミコバクテリアの供給源とし
て用いられ得る。

好ましい実施態様において、サンプルを、激しい混合
（例えば、ボルテックス）を可能にするに十分な大きさ
の容器にて、所望の界面活性剤（例えば、以下の実施例
13に例示されるようなSB−18）を提供する溶液で直接プ
ロセッシングし、そして必要であれば、当該分野で公知
の方法（例えば、ゲルクロマトグラフィ、イオン交換ク
ロマトグラフィまたはろ過方法）を直接プロセッシング
の前、その間、またはその後に用いてさらに精製され
る。このような最初のプロセッシングから得られた細菌
ペレット（堆積物）は、検出（培養による検出を含む）
のためのミコバクテリアの供給源として用いられ得る。

当該分野で公知の更なる第一または第二の浄化工程あ
るいは精製工程は、これらが適切な界面活性剤（例えば
SB−18様界面活性剤またはほぼオクタデシル界面活性
剤）を培地中に組み込む場合、必要があれば、プロセス
中の適切な工程に包含され得る。上記にさらに示される
ように、界面活性剤への暴露および脱気の両方が用いら
れる場合、すなわち本明細書中に記載されるような適切
な界面活性剤への暴露が、脱気工程前、脱気工程と同時
に、または脱気工程後のいずれかにおいて行われる場
合、SB−18様界面活性剤のみを使用する必要性はなく、
そして任意の界面活性剤（特に本明細書中に定義され、
そして例示されるようなほぼオクタデシルである界面活
性剤）が用いられ得る。

もちろん、試料が、まず実施例12に示されるような標
準的な方法（例えば、NALC/NaOH法）によってプロセッ
シングされ、次いで浮力を予め除去するために（ｉ）SB
−18様界面活性剤、好ましくはSB−18を用いる洗浄、
（ii）簡単な脱気、または（iii）界面活性剤洗浄およ
び減圧処理の両方の組み合わせのいずれかを施される場
合、残りの生物の回収は増大するが、任意の標準的方法
によりプロセッシング由来の損失が既にサンプルを妥協
している限りは必ずしも定量的である必要はない。

本明細書中に記載される任意の組み合わせ（標準的な
NALC/NaOH法と本発明の方法との組み合わせを含む）に
おいて、プロセッシングされた細胞は、より効率的に回
収され、そして堆積物は、ここで、この中の所望の微生
物の検出のために用いられ得る。

本発明の実施により、凝集化または浮力から生じる偽
陰性を実質的に排斥する様式で試料からミコバクテリア
の定量的な抽出が得られる。本発明の方法は、初めて、
検出技術の結果（例えば、核酸増幅の結果）を信頼する
ことを可能にし、そして他の方法（例えば、煮沸）によ
るこのようなミコバクテリアの培養または溶解を可能に
する様式でこのようなミコバクテリアを提供する。

本発明の方法は、任意の宿主から採取される試料にお
けるミコバクテリアの検出に有用である。ミコバクテリ
ア感染し易いことが公知なヒト以外の動物の例として
は、ウシ、ブタ、家禽類、ヒツジ、ヤギ、シカ、サル、
ゾウ、ウマ、イヌ、ネコ、ミンクおよび種々の動物園な
らびに水族館の動物が挙げられる。本発明の方法におい
て使用される組織サンプルは、通常肉芽腫病変（一般に
は結節状で、そして線維被膜に囲まれるカゼオカルシウ
ム（caseocalcareous）中心を有する）から採取され
る。肉眼的病変がなければ、リンパ節を分析するのが好
ましい。感染が、腸管である場合、腸管の把厚部分が一
般的にサンプル化される。

試料は、例えば、痰、脳脊髄液、尿、気管支洗浄液、
胸膜液、胃吸引液、血液、血清、腹膜液、膿瘍および浸
出液を含む生物学的液体、あるいは他の生物学的液体の
形態であり得、そして公立または私立の菌株保存機関
（culture collection）など、または特に臨床的な供給
源あるいは獣医学的な供給源から得られ得る。液体培養
物、凍結懸濁液または固体培地上で増殖させてコロニー
が利用され得る。いくらかの試料（例えば、大便および
全血または培養血）は半固体物質であり得、そして／ま
たは浄化を必要とし得る。本発明の方法はまた、外来供
給源（例えば、魚、またはは虫類の鱗）および組織サン
プル由来の試料に有用である。

試料のサンプルを培養のために採取する必要はない。
実際、核酸またはシグナル増幅による所望の微生物の直
接検出を、堆積物から直接採取されたサンプルで行い得
ることが、本発明の利点である。ミコバクテリアが本発
明のプロセッシング方法後に依然生存可能（例えば、溶
解しない）であり、従って、所望であれば培養が行われ
得ることが本明細書中に示される。例えば、全試料は、
まず本発明の方法によりプロセスされて、増幅技術によ
る検出のための微生物の最大効率の回収、および可能な
最も短時間での診断に関する応答を提供し得る。次い
で、陽性の試料が、さらに培養のためにプロセスされ得
る。このようなフォーマットは、劇的に診断時間を減少
させ、そして培養に適した形態で、試料中に存在する微
生物（特にミコバクテリア）を提供する。MTB株中の薬
剤耐性の出現率の増大により、全てのMTB陽性試料が、
薬剤感受性に関して培養される必要がある。生存可能形
態での、ミコバクテリアの回収効率が最適であるので、
本発明の方法は、診断および感受性測定を容易にする。

本発明の方法は、初めて、微生物（例えば、MTB複合
体のミコバクテリア）の「凝集」による偽陰性を本質的
に排除する。凝集は、サンプルプロセッシング中の凝集
している生物の非効率な分割を実質的に悪化させる。実
際、本発明の方法は、当該分野で公知の検出技術（例え
ば、培養および核酸（DNAまたはRNA）増幅）を用いて、
規定のサンプル由来の全てのアリコートが、生物を含有
する可能性を増加されることにより、所望の溶液中の凝
集している生物の均一分布を容易にし、そして従って検
出を促進する。

さらに、本発明の方法は、水性液体中のこれらの生物
の自然浮力を克服し、これにより当該分野で公知の回収
技術（例えば、遠心分離）を用いて、これらの生物の回
収を容易にする。自然浮力は、遠心分離によるこれらの
生物の効率的回収能を実質的に減じる。

本発明の方法は、試料からのこれらの微生物の回収効
率を実質的に改善するので、より技術的に進歩した方法
が診断の代わりをし得る限り、長期間培養の結果の必要
性は、排除される；核酸ベースの増幅技術は、このよう
なより進歩した方法の１つの例である。しかし、本発明
の方法は、微生物を溶解するのではなく、その代わりに
培養技術が検出方法として除外されないように生存可能
な生物を生じる。

本発明の方法は、試料が微生物（例えば、ミコバクテ
リウム）の存在の試験のために調製される様式に関す
る。従って、最終的に検出されるミコバクテリアは、本
発明の方法と共に用いられる検出手順に依存する。この
ような検出手順は、任意の所望の微生物、および特に任
意の所望にミコバクテリウム群または複合体、あるいは
ミコバクテリウム種、ならびに最も好ましくは、ミコバ
クテリウム複合体（例えば、M.tuberculosis（MTB）複
合体、M.avium（MAC）複合体、MAIS複合体、およびM.fo
rtuitum複合体）ならびに以下に包含する急速増殖およ
び低速増殖ミコバクテリアを検出するように設計され得
る： 特定の光発色菌および未特定の光発色菌，非発色菌，
暗発色菌，ならびに特にM.africanum,M.asiaticum,M.av
ium,M.bovis,M.bovis（BCG）,M.butryricum,M.chelona
e,M.duvalii,M.flavescens,M.fortuitum,M.gastri,M.go
rdonae,M.haemophilum,M.intracellularae,M.kansasii,
M.leprae,M.lepraemurium,M.linda,M.lufu,M.marinum,
M.malmoense,M.microti,M.mucoscum,M.nonchromogenicu
m,M.paratuberculosis,M.oeregrinum,M.phlei,M.rhodoc
hrous,M.scrofulaceum,M.shimoidei,M.simiae,M.smegma
tis,M.szulgai,M.terrae,M.thermoresistable,M.trivia
le,M.tuberculosis,M.ulcerans,M.vaccae,M.xenopi,お
よびこれらの血液型亜型。

M.kansaii,M.marinum,M.simiaeおよびM.asiaticum
は、光発色菌の例である。M.scorofulaceum,M.szulgai,
M.xenopi,M.gordonaeおよびM.flavescensは、暗発色菌
の例である.M.avium,M.intracellulare,M.gastri,M.mal
moense,M.terraeおよびM.trivialeは全て、非発色菌の
例である。

M.africanum,M.avium,M.bovis,M.haemophilum,M.intr
acellulare,M.kansasii,M.malmoense,M.marinum,M.micr
oii,M.paratuberculosis,M.scrofulaceum,M.simiae,M.s
zulgai,M.tuberculosis,およびM.xenopiは全て、低速増
殖（７日以上を要する）のミコバクテリウム種の例であ
る。M.chelonei,M.flavescens,M.fortuitum,M.gordona
e,M.leprae,M.phlei,M.smegmatis,M.terrae,M.ulcerans
は全て急速増殖（７日未満を要する）ミコバクテリウム
種の例である。

M.tuberculosis,M.africanum,M.bovis,M.bovis（BC
G），およびM.microtiはMTB複合体のメンバーである.M.
aviumおよびM.intracellulareは、MAC複合体のメンバー
である;M.aviumの少なくとも３種の異なる血清群，およ
びM.intracellulareの25種を超える血液型亜型がある。

本発明は、親油性であるか、または細胞外壁における
ミコール酸様分子（例えば、コリノミコール酸、ノカル
ドミコール酸およびとりわけミコール酸）である脂質を
有することにより特徴づけられるワックス様カプセルで
覆われている微生物に特に有用である。これらは全て、
当該分野（Goren,M.B.Bact.Rev,36:33−64（1966）、本
明細書中参考として援用される）で理解されるような
「ミコール酸構造」、すなわち中程度の長さの脂肪族鎖
でα位にて置換されたβ−ヒドロキシ酸として特徴づけ
られる。コリノミコール酸を有する生物の例は、Coryne
bacterium diptheriaであり；ノカルドミコール酸を有
する生物の例は、Nocardia asteroidesであり；そして
ミコール酸を有する生物の例は、Mycobacterium tuberc
ulosisである。このようなミコール酸様分子は、本明細
書において集合的に「ミコール成分」と呼ぶ。不飽和、
シクロプロパノイド、メトキシ化、およびケトン酸であ
るものを含む代表的なミコール酸構造の更なる表はま
た、例えば、Lederer,E.Chem.Phys.Lipids 1:294−315
（1967）;Lederer,E.Pure Appl.Chem.25:135−165（197
1）（両方とも、参考として本明細書中に援用される）
においてみられ得る。「ミコール酸構造」は、酸安定分
子である。

種々のミコバクテリア種が、検出においてかなり重要
である疾患および病状の例としては、特に結核症の原因
因子（M.tuberculosis複合体）およびライ病（M.leprae
（ヒトライ病）およびM.lepreamurium（齧歯類ライ病）
が挙げられる。Mycobacterium avium複合体は、重要な
鳥類疾患である。M.aviumはまた、ミコバクテリア重複
感染を患うAIDS患者から単離された。M.bovisは、獣医
内科において重要である。M.fortuitumは、動物および
ヒトにおける病巣から単離された土壌細菌である。M.in
tracellulareは、日和見性であり、そしてAIDSウイルス
に感染した患者において特にみられる。M.paratubercul
osisは、ヒトにおけるクローン病（限局性回腸炎）の診
断において興味深い。Mycobacterium kansasiiは、希で
あるが、一般的に肺病と関連のある、荒廃因子（devast
ating agent）である。Mycobacterium marinumは、冷血
動物および魚に感染する；それはまた、ヒトの四肢の浅
肉芽腫から単離された。Mycobacterium paratuberculos
isは、ウシにおけるヨーネ病の原因因子である；これ
は、非常に増殖が緩慢であり、そして培養物を、陰性で
あることが確認され得るまでに16週間維持しなければな
らない。M.ulceransはまた、ヒト内科医学において興味
深い。上記の多くおよびその他が、Wayne,L.G.ら、Cli
n.Micro.Rev.5:1−25（1992）によって考察され、本明
細書中に参考として援用される。

検出工程は、任意の公知方法（核酸増幅、シグナル増
幅、ハイブリダイゼーション、培養および免疫アッセイ
を包含するが、これらに限定されない）を利用して、所
望の微生物（特に所望のミコバクテリア）を検出し得
る。好ましい実施態様において、検出方法は核酸増幅お
よび／または培養である。最も好ましい実施態様におい
ては、増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅が用い
られる。実際、SB−18様界面活性剤が、PCRに対して抑
制性でないこと、および生物が依然生存可能であり、そ
して培養され得ることが本発明の方法の利点である。標
準的な技術とは対照的に、NALC/NaOH溶液はPCRに対して
極めて抑制性である。さらに、生物がNALC/NaOHでの処
理後、依然生存可能であるが、28％〜33％のミコバクテ
リアは、死滅することは公知であることが十分に確立さ
れている（Krasnow,I.ら、Am.J.Clin.Path.45:352−355
（1966）;Kubica,G.P.W.ら、Am.Rev.Resir.Dis.87:775
−779（1963））。対照的に、SB−18様界面活性剤が、
本発明の方法において所望の濃度で用いられる場合、殺
菌性活性およびある程度の静菌性活性を有し得るが、ミ
コバクテリアは、溶解せず、そして依然生存可能であ
る。

ミコバクテリウムの存在の同定のための手段は、標識
（例えば、核酸検出および／またはミコバクテリウム抗
原の免疫検出とともに一般に用いる標識を利用し得る。
この標識は、以下を包含するがこれらに限定されない：
放射標識マーカー（例えば、³²P、³³P、³⁵S、¹⁴Cおよび
³H）、蛍光マーカー（例えば、フルオレセイン、オーラ
ミン、ローダミン、テキサスレッドなど）、化学発光マ
ーカー（例えば、アクリジニウムエステル標識プロー
ブ、LUMI−PHOS530^TM、Schaap Reagent（４−メトキシ
−４−（３−ホスフェートフェニル）−スピロール−
［1,2−ジオキセタン−3,2′−アダマンタン）、CSPD
（U.S.5,112,960）など）、比色検出（例えば、3,3′,
5,5′−テトラメチルベンジジン（TMB）など）、電気化
学発光（例えば、トリス（2,2′−ビピリジル）ルテニ
ウム（II）キレート（TBR））、およびタンパクまたは
酵素マーカー（例えば、抗体、アルカリホスファター
ゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼなど）。これ
らの標識は、上記の試薬範疇の任意のものと組み合わせ
て用いられ得る。

本発明の方法は、このような方法において使用する薬
剤をキットの形態で提供することにより、最も便利に実
施され得る。このようなキットは、好ましくは適切な緩
衝液、塩、SB−18様界面活性剤（または、これらの等価
物（例えば、脱気工程との組み合わせに有用な界面活性
剤）および所望であれば、適切な純度の水を含む。少な
くとも１つのタイプの同定薬剤もまた含まれ得、この同
定薬剤のタイプは、用いられる検出アッセイのタイプに
依存する（例えば、増幅、免疫検出などが、最終的に用
いられるか否か）；そして「陽性」スタンダードは、微
生物の検出において有用な核酸（DNAまたはRNA）、また
は所望の特定抗体（タンパク質あるいはその他）または
他の特徴的な物質（例えば、微生物の脂質プロファイル
により、特に、気−液クロマトグラフィによる同定のた
めの成分）のいずれかを提供する。特定のキットは、と
りわけ、特定のミコバクテリアを同定する手段（例え
ば、特定の核酸プローブ、抗体、またはスミアあるいは
培養物質を含み得る。同定薬剤が検出される方法は、キ
ットに特異的であり得る。この結果、このキットは、例
えば、酵素的、蛍光、放射性または化学発光検出、また
は任意の他の適切な当該分野で公知の検出を提供する。
このようなキットにおいて、このような検出手段は、た
とえ別の容器またはパッケージに閉じこめられたとして
も、一般的に界面活性剤試薬に非常に近位にある。

核酸増幅が、検出方法として利用される場合、このよ
うな増幅の多くのタイプは公知であり、そして全てが本
発明の方法において有用である。例えば、核酸増幅系の
タイプは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連
鎖反応（LCR）、Ｑβレプリカーゼ増幅、鎖置換増幅（s
trand displacement amplification;SDA）および単一プ
ライマー増幅（SPA）または転写ベース増幅系（例え
ば、NASBA（核酸配列ベース増幅）、SSSR（自己維持配
列複製（self sustained sequence replication））ま
たはLAT（連結活性化転写（ligation activated transc
ription））増幅）を含む。シグナル増幅系（例えば、
分枝DNA（bDNA）のシグナル増幅系）もまた、有用であ
る。

ミコバクテリアの属に特異的なプローブおよびミコバ
クテリアの配列に特異的なプローブの開発が記載されて
いる（Fries,J.W.U.ら、Molec.Cell.Probes 4:87−105
（1990））。特定の遺伝子配列は、１種を超えるミコバ
クテリア種において現れ、そしてミコバクテリア種の任
意のファミリーの存在を検出するのに好都合に用いられ
得る。例えば、Crawfordら、U.S.5,183,737は、M.tuber
culosis（MTB）複合体のメンバーに対して特異的であ
る、反復DNA配列を記載している。検出を、直接ハイブ
リダイゼーション分析（例えば、サザン分析）による
か、または増幅アッセイにおけるプライマーとして保存
配列のフラグメントを用いることにより行い得る。本明
細書中に記載される新規増幅アッセイにおいて、MTB複
合体、Mycobacterium avium複合体、Mycobacterium int
racellulare、Mycobacterium paratuberculosis、Mycob
acterium kansasii、Mycobacterium marium、Mycobacte
rium szulgai、およびMycobacterium gastriはまた、Ro
gall,Tら、Int.J.Sys.Bacteriol.40:323−330（1990）
により公開されたような16S rRNA遺伝子配列に基づく配
列を用いた、本明細書中に記載されるような１セットの
プローブを用いて増幅され得る。プライマーは、これら
が、以下のミコバクテリアの群／種の最適増幅を提供す
る能力を有するように設計された:M.tuberculosis（TB
複合体：［MTB］）、M.avium−M.intracellulareおよび
M.paratuberculosis（MAC複合体）、M.kansasiiおよび
M.marinum。正方向プライマーは、これらのミコバクテ
リアの16S rRNA遺伝子配列の第二可変（V2）領域のヌク
レオチド119〜114（Rogall,T.ら、Int.J.Sys.Bacterio
l.40:323−330（1990）の命名に従って）に対して設計
された。正方向プライマー（TBv2−119）の配列は、
５′−AAACTGGGTCTAATACCGGATAGGA−３′［配列番号
１］である。逆方向プライマーは、第３の可変（V3）領
域のヌクレオチド431〜453に対して設計された。逆方向
プライマー（TBv3−453）の配列は、５′−CCACCTACCGT
CAATCCGAGA−３′［配列番号２］である。増幅産物は、
約335塩基対（増幅される種に依存する）であった。属
特異的プローブが、増幅産物の中心部分に対して設計さ
れ、そして全てのミコバクテリアに共通である。その配
列は、５′−GCGGGCiCATCCCACACCGC−３′［配列番号
３］である。MTB種特異的プローブは、増幅産物の個別
部分に対して設計され、そしてTB複合体の生物に特異的
である。その配列は、５′−GACCACGGGATGCATGTCTTGTG
−３′［配列番号４］である。

他方、種特異的プローブは公知である。例えば、McFa
ddenら、U.S.5,225,324は、ミコバクテリアの同定に対
するプローブおよび密接に関係する種間の差異に対する
プローブとして用いられ得る。DNA挿入配列のファミリ
ーを記載している。U.S.5,216,143は、M.gordonaeに対
して特異的なプローブを記載する。M.paratuberculosis
に対するプローブもまた公知である:IS900挿入配列は、
この種に対して特異的である（McFaddenら、Mol.Microb
iol.1:283−291（1987））。

SB−18様活性 最も好ましい実施態様では、培地において、そして特
に二次洗浄工程において好ましい界面活性剤は、SB−18
様界面活性剤（そして最も特に、SB−18（CAS 番号131
77−41−８））である。このSB−18様界面活性剤は、コ
ード形成を分断し、そしてミコバクテリウムの分散さえ
可能にするために十分な量にて、コード形成を分断し得
る。SB−18は、精製された形態でその経済的な入手可能
性のため好ましい。C₁₈−カルボキシプロピルベタイン
（CAS 番号78195−27−４）が非常に好ましい。なぜな
ら、これが、本発明の方法における使用のために、溶解
度、鎖長および架橋構造の理想的な組み合わせを提供す
るからである。

SB−18（CAS 番号13177−41−８）は、化学組成C₂₃H
₄₉NO₃Sおよび化学式CH₃（CH₂）₁₇N（CH₃）_２（CH₂）₃SO
₃を有する。SB−18の化学名は、ジメチルオクタデシル
（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド内部
塩（Aldrich No.36,712−５）およびＮ−オクタデシル
−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスル
ホネート（Sigma No.08004）、および３−（N,N−ジメ
チルステアリルアンモニオ）プロパンスルホネートおよ
び３−（ステアリル−ジメチルアンモニオ）プロパンス
ルホネート（Fluka No.41570）を含む。最も好ましく
は、SigmaのSB−18が、本発明の方法において使用され
る。

SB系における他の一つの界面活性剤のみが、コード形
成を分断するのに有用であった:SB−16（CAS 2281−11
−0;N−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ
−１−プロパン−スルホネート；パルミチルスルホベタ
イン;Sigma H 6883）、しかしこれは、同濃度でSB−18
と同様の効果はなかった。本明細書中に示されるデータ
は、ほとんどのオクタデシルベタイン（すなわち、以下
で定義されるようなR₁が、16個を超える炭素原子である
ベタイン）は、M.tuberculosisの凝集塊を分断する能力
を有することを示す。

特定の界面活性剤は、申し分のない程度までコード形
成を分断しそしてMTB複合体生物を分散させる能力を有
さない。試験され、そしてMTB複合体を離解するこの能
力を有さないことを見出された界面活性剤および他の化
合物は、以下を包含した:SB−18（CAS 番号15163−36
−７）、SB−12（CAS 番号14933−08−５）、SB−14
（CAS 番号14933−09−６）、デカン酸（CAS 番号334
−48−５）、ドデカン酸（CAS 番号143−07−７）、ド
デシル硫酸ナトリウム（SDS:CAS 番号151−21−３）、
ベンズアルコニウムクロライド（BenzAlk:CAS 8001−5
4−５）、混合アルキルトリメチルアンモニウムブロマ
イド（mTMA）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマ
イド（TMA−12:CAS 番号1119−94−４）、ミリスチル
トリメチルアンモニウムブロマイド（TMA−14:CAS 番
号1119−97−７）、オクタデシルトリメチルアンモニウ
ムブロマイド（TMA−18:CAS 番号1120−02−１）、デ
オキシコール酸（CAS 302−95−４）、ベンジルジメチ
ルドデシルアンモニウムブロマイド（BenzDMA−12:CAS
番号7281−04−１）、ベンジルジメチルテトラデシル
アンモニウムクロライド（BenzDMA−14:CAS 番号139−
08−２）、ベンジルジメチルオクタデシルアンモニウム
クロライド（BenzDMA−18）、Tween20（CAS 番号9005
−64−５）、Tween60（CAS 番号9005−67−８）、Twee
n80（CAS 番号9005−65−６）、TritonX−100（CAS
番号9002−93−１）、NP−40（CAS 番号127087−87−
０）、Brij35（CAS 番号9002−92−０）、Brij99（CAS
番号9004−98−２）、Span20（CAS 番号1338−39−
２）、Span60（CAS 番号1338−41−６）、Span80（CAS
番号1338−43−８）、SynperonicF/68、ポリエチレン
グリコール1450（CAS 番号25322−68−３）、Ficoll40
0,000（CAS 番号26873−85−８）、ポリビニルピロリ
ドン360,000（CAS 番号9003−39−８）、ホルムアミド
（CAS 番号75−12−７）、およびジメチルホルムアミ
ド（CAS 番号68−12−２）。

いくつかの界面活性剤は、コード形成を分断し得ない
が、回収を容易にするようである。例えば、全てのSB系
界面活性剤（特に、SB−12、SB−14、SB−16、およびSB
−18および最も特にSB−18）は、凝集しなかった生物
（例えば、M.avium）で同等の効率で用いられ得ること
が、本明細書中に示される。従って、SB−18（CAS 番
号13177−41−８）に加えて、浮力を相殺し、従って、
重力法による回収を容易にするSB系における他の界面活
性剤は、以下を含む:SB−16（CAS 2281−11−0;N−ヘ
キサデシル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プ
ロパン−スルホネート；パルミチルスルホベタイン;Sig
ma H 6883）;SB−14（CAS 14933−09−6;N−テトラデ
シル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン
−スルホネート；ミリスチルスルホベタイン;Sigma T 7
763）；およびSB−12（CAS 番号14933−08−5;N−ドデ
シル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン
−スルホネート；ラウリルスルホベタイン;Sigma D 451
6）。

両イオン性SB系界面活性剤は、プロピル官能により分
離された４級化窒素およびスルホネート基の両方を有
し、そして各々は、４級化窒素と結合する長鎖アルキル
部分（SB−12、SB−14、SB−16、およびSB−18に対し
て、それぞれドデシル、テトラデシル、ヘキサデシルま
たはオクタデシル）を有する。SB−18は、コード形成を
分断することにおいて最も効率的であったが、界面活性
剤の全SB系は、遠心分離によるM.tuberculosisの回収を
容易にすることにおいてある程度の効力を示すことが本
明細書中に示されている。さらに、SB系界面活性剤はコ
ード形成しない生物、例えばM.aviumの回収を容易にす
ることにおいて同等の効率を示した。以下に記載される
ように、そしてこの説明に固執することを意図すること
なく、これらの両性イオン界面活性剤は、細菌細胞中へ
の界面活性剤の移動を容易にする性質を有すると考えら
れている。この蓄積の正味の効果は、遠心分離による回
収を可能にするのに十分な程度まで、生物の自然浮力を
補償することである。

本発明によると、そして界面活性剤を利用する実施態
様において、最終的な結果は、コードの分散を促進する
SB−18様界面活性剤が用いられようと、または遠心分離
による細菌の回収を容易にするSB−18様界面活性剤が用
いられようと同一である：本発明によると、ミコバクテ
リアは、それらをサンプル全体に均一に分散させるか、
そして／または遠心分離により回収および濃縮を容易に
するかのいずれかにより、後の検出を容易にする環境に
配置される。

この機能の２元性は、本明細書中「SB−18様活性」と
呼ぶ。従って、本明細書中用いられるSB−18様活性は、
凝集塊で増殖する生物をプロセッシングする（そして、
従って、溶液に微生物を均等に分散する）場合に、コー
ド分断を促進するSB−18様活性界面活性剤の能力、また
は浮力を相殺することによる、遠心分離によるこのよう
な微生物の実質的に定量的な回収を容易にする、SB−18
様界面活性剤もしくはほぼオクタデシルの界面活性剤の
能力、あるいはその両方をなすSB−18様界面活性剤の能
力のいずれかをいう。

ベタイン様界面活性剤 （ａ）第４級アミンのみ（例えば、オクタデシルの陽
イオン性界面活性剤トリメチルオクタデシルアンモニウ
ムブロマイド（TMA−18:CAS 番号1120−02−１））お
よびベンジルジメチルオクタデシルアンモニウムクロラ
イド（BenzDMA−18））；（ｂ）スルフェート部分のみ
（オクタデシルの陰イオン性界面活性剤ナトリウムオク
タデシルスルフェート（SOS）:CAS 番号1120−04−
３）；および（ｃ）両性イオン性官能性のみ（３−
［（３−コルアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］
−１−プロパン−スルフェート（CHAPS）:CAS 番号756
21−03−３）を有するSB−18と同様な化合物は、全て脱
気なしで回収を増強するのに重要であることを本明細書
中に示す。このことは、アルキル部分と両性イオン官能
性との間の関係がSB−18様活性を促進することを示唆す
る。

SB系界面活性剤はまた、スルホベタインとしても知ら
れるが、ベタインとして知られる両性イオン性界面活性
剤の広いクラスのサブセットである。このベタインは、
とりわけ、負電荷の中心から分離した正電荷の中心を含
有する両性イオン分子である。表２は、最も一般的なク
ラスのベタイン（ｎ−アルキルベタイン）の一般構造を
与え、そして表３は、この主題についてのいくつかの一
般的な変形を記載する。任意の理論に固執することを意
図することなく、両イオン性官能性は、この全クラスの
分子にSB−18様活性を見かけ上与える双極子モーメント
を生ずると考えられている、それにも関わらず、本発明
の方法におけるベタインの利用に関して、ベタイン構造
の変形が、予測可能な結果を生ずることが、本明細書中
に示されている。

ｎ−アルキルベタインの一般的な記載は、表２に記載
されている。本明細書中に記載全体を通して用いられて
いる「R₁」は、界面活性剤の疎水性部分を示す。これ
は、典型的には、アルキル部分であり、そして８個ほど
の炭素原子を有する短い脂肪族鎖から22個の炭素原子を
超える長鎖まであり得る。好ましくは、アルキル部分
は、12個〜20個の炭素原子を、より好ましくは、16個〜
18個の炭素原子を含有する。アルキル鎖は、アルキレン
性不飽和を有し得、分枝状であり得、そして／または、
例えばヒドロキシル、エステル、エーテル、カルボニル
官能基、ならびに他の基で置換され得る。

「α」は、「ｎ」が０または１に等しいか否かに依存
して、存在し得るか、あるいは存在し得ない。ｎ＝０の
場合、αは存在しない;n＝１の場合、αは存在する。α
が存在する場合、それはR₁を正電荷の中心に結合させ
る。この結合はメチレン基であり得る。このような結合
のより一般的なものの１つは、アミドプロピル基（−
（CO）−NH−CH₂CH₂CH₂−）である。他の結合（例え
ば、エーテル結合（−Ｏ−）、カルボニル結合（−CO
−）またはヒドロキシメチル（−CH（OH）−）結合も同
様に公知である。しかしながら、他の基も確かに可能で
ある（例えば、アミン）。

「R₂」および「R₃」は、独立して、水素およびアルキ
ル（好ましくは炭素原子１個〜４個の低級アルキル、例
えば、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはこれら
の異性体、そして最も好ましくは、メチル）からなる群
から選択される；しかし、これらのアルキル基のバルク
を増加させることは、これらを長鎖化するか、あるいは
分枝鎖化することによるので、可能であるが実施例９お
よび10に考察されているように機能を低下させる。

「β」は、正電荷中心を示す。大多数の場合、βは、
４級化窒素（−N⁺−）であるが、ホスホニウム（−P
⁺−）、スルホニウム（−S⁺−）および他の部分が可能
である。大抵の場合、βは４級化窒素であり、そしてそ
の結果R₂およびR₃が必要であることに注意すべきであ
る。しかし、他の陽イオンについては、R₂およびR₃は、
存在する必要はあり得ない。

「R₄」は、荷電種を分離する架橋である。この架橋
は、アルキレン基（例えば、ｍ≧１）で有り得、例え
ば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペン
チレンおよびヘキシレン架橋が公知である。R₄の組成お
よび構造は、アルキレン基のものに限定されない：水酸
基を導入する例、またはR₄が分枝であるか、またはベン
ジル基である例もまた一般的である。R⁴に対する他の改
変（例えば、アミンを導入）もまた、可能であり、そし
て同様の機能が期待される。

負電荷中心「γ」は、広範な種々の基に由来し、これ
らの基には、スルホネート（−SO₃ ^-）、スルフェート
（−OSO₃ ^-）、カルボキシレート（−COO^-）およびホス
フェート（−OPO₃ ^-）部分が含まれる、これらの基を導
入する組み合わせは、文献において広く研究されてき
た。他の可能性として、ホスホネート（−PO₃ ^-）および
ホスフィネート（−PO₂ ^-）基が挙げられるが、これらに
限定されない。有機基（例えば、−CH₂CH₃）がγと結合
している例もある。界面活性剤のクラスとしてのベタイ
ンは、珍しい性質を有するが、期待され得るように、種
々の部位を置き換えることにより化学的性質および物理
的性質に興味ある、そして予想可能な変化をもたらす。
そしてこれらを使用することは、本発明の方法において
企図されている。

表2:n−アルキルベタインの構造 ｎ−アルキルベタインの一般構造を示す。R₁は疎水性
アルキル鎖であり、そしてαはR₁を陽イオンβに接続す
る「結合」である。R₂およびR₃は、必要であれば陽イオ
ンを改変する。R₄は、陽イオンを陰イオンγに接続する
「架橋」である。

スルホプロピルベタインは種々の供給源（例えば、Ca
lBiochem,La Jolla,CA;Sigma,St.Louis,MO;Fluka,Ronko
nkoma,NY;およびAldrich,Milwaukee,WI）から入手可能
である。いくつかは、本発明の方法において首尾良く試
験され、そしてSB−18様活性を示す。これらは、以下を
含む:C₁₂−スルホプロピルベタイン（SB−12:CAS 番号
14933−08−５）、C₁₄−スルホプロピルベタイン（SB−
14:CAS 番号14933−09−６）、C₁₆−スルホプロピルベ
タイン（SB−16:CAS 番号2281−11−０）およびC₁₈−
スルホプロピルベタイン（SB−18:CAS 番号13177−41
−８）。首尾良く用いられるいくつかの他のスルホベタ
インは、注文合成されるか、または本明細書中記載され
るサンプルとして得られたかのいずれかである。これら
は以下を含む:C₁₈−スルホブチルベタイン（CAS 番号2
2313−73−１）、C₁₆−ヒドロキシプロピルスルホベタ
イン（CAS 番号7425−12−９）、および３−ブトキシ
−２−ヒドロキシヒドロキシプロピルスルホベタイン
（CAS 番号108797−84−８）。アルキル鎖が天然オイ
ルから誘導されたいくつかのスルホベタインもまた、試
験された。これらは以下を含む：ココアミドプロピルヒ
ドロキシプロピルスルホベタイン（CAS 番号68139−30
−０）、獣脂アミドプロピルヒドロキシプロピルスルホ
ベタインおよびエルカアミドプロピルヒドロキシプロピ
ルスルホベタイン。

それらの高い溶解性のために、カルボキシベタイン
（γ＝COO^-）が最も広く研究されている。いくつかのカ
ルボキシベタインが試験され、そして本発明の方法にお
いてSB−18様活性を示す。これらは以下を含む:C₁₆−カ
ルボキシメチルベタイン（CAS 番号693−33−４）、C
₁₈−カルボキシエチルベタイン（CAS 番号30612−73−
８）、Ｃ_18:1−カルボキシメチルベタイン（CAS 番号8
71−37−４）、およびC₁₈−アミドプロピルカルボキシ
メチルベタイン（CAS 番号6179−44−８）。アルキル
鎖が天然オイルから誘導されたいくつかのカルボキシベ
タインもまた試験された。これらは、以下を含む：ココ
アミドプロピルカルボキシメチルベタイン（CAS 番号6
1789−379およびCAS 番号61789−40−０）、ココアカ
ルボキシメチルベタイン（CAS 番号68424−94−２）、
リシンアミドプロピルカルボキシメチルベタイン（CAS
番号71850−81−２）、および獣脂ビスヒドロキシエ
チルグリシネート（CAS 番号70750−46−８）。試験さ
れたいくつかのカルボキシベタインの中にはCAS 番号
が与えられていないものもある。これらは以下を含む：
ベヘニルカルボキシメチルベタイン（C₂₂鎖と考えられ
ている）、コムギ胚オイル−アミドプロピルカルボキシ
メチルベタイン（Schercotaine WOAB:Scher Chemicals,
Inc.,Clifton,NJ）、ババス−アミドプロピルカルボキ
シメチルベタイン（Croda,Inc.,Parsippany,NJ）、ダイ
ズアミドプロピルカルボキシメチルベタンイン（Chembe
taine S:Chemron Corp.,Paso Robles,CA）、およびカノ
ールアミドプロピルベタイン（Hetaine CLA:Heterene,I
nc.,Patterson,NJ）。

ベタインの多様な性質を考えると、特定の条件下での
み作用するものがいくつかあった：ベヘニルカルボキシ
メチルベタインは、C₂₂鎖であり、そして塩濃度が最小
にされた場合のみ機能し、そしてC₁₆−ヒドロキシプロ
ピルスルホベタインは、ヨウ化カリウムの存在を要す
る。

２つのさらなるベタインを注文合成し、２つの他のク
ラスのベタインの代表とした。これらもまた首尾良く用
いられ、そして以下を含む:C₁₆−アミドプロピルスルフ
ァトベタイン（CAS 番号58930−11−３）、およびC₁₈
−ホスホエチルベタイン（CAS 番号126712−89−
８）、これらはそれぞれスルフェートおよびホスフェー
ト陰イオンの使用を代表する。

これにより、25個のベタイン（これらの分子の広い構
造的選択を表す）は、ミコバクテリアの回収（例えば、
遠心分離による）を増強することにおける効力について
試験された。16個の炭素原子より少ない鎖長を有するも
のは、凝集を分断することなく浮力を相殺することによ
り主に機能すると考えられた。一方、18個の炭素原子ま
たはそれ以上の鎖長を有するものは、大抵の場合、コー
ド形成を分断することおよび浮力を打ち消すことにより
作用すると考えられた。全てのものは、本発明の方法に
おいて有用であることが示されている。両性イオンと疎
水性アルキル鎖との組み合わせが、ベタインをユニーク
にする性質を与える。従って、「ベタイン様」構造を有
する任意の分子は、SB−18様活性を示すことが期待され
得る。

上記の多くの構造的組み合わせのための合成経路が存
在することが知られている。SB−18様界面活性剤種（本
発明の方法において有用である種）は、この方法におけ
るこのクラスの挙動が予測可能であるので、例示された
種に限定されることを意味しない。

更なるガイダンスは以下のリストにより提供される。
これは、市販であるか、または合成経路が公知であるベ
タインの例を引用しており、そして本発明の方法におい
て有用である。

ベタインの大抵の例は、陽イオン（β）として４級化
窒素を利用している。この大きなファミリーの界面活性
剤のメンバーは、陽イオンが４級化N,N−ジメチルアン
モニオであると仮定し、次いでまず、用いる陰イオン
（γ）に基づくサブセットにグループ化することにより
非常に容易に列挙される。次いで各サブセットは、まず
架橋構造（R₄）で、次いで結合（α）、次いでアルキル
鎖長（R₁）でさらに細分化され得る。次いで、これらの
個別のカテゴリーに当てはまらない更なる組み合わせ
は、容易に列挙される。さらに、全てのものが、本発明
の方法において機能することが合理的に期待される。

メチレン架橋（R₄＝−CH₂−）、メチレン結合（α＝
−CH₂−）を利用し、そしてアルキル鎖長に基づいての
み変化するカルボキシベタイン（「カルボキシメチルベ
タイン」）の例は、C₁₀（CAS 番号2644−45−３）、C
₁₁（CAS 番号2956−38−９）、C₁₂（CAS 番号683−10
−３）、C₁₃（CAS 番号23609−76−９）、C₁₄（CAS
番号2601−33−４）、C₁₅（CAS 番号23609−77−
０）、C₁₆（CAS 番号693−33−４）およびC₁₈（CAS
番号820−66−６）である。N,N−ジメチル（R₃＝R₄＝−
CH₂CH₃）であるC₁₂−カルボキシメチルベタイン（CAS
番号6232−16−２）の例がある；そしてアルキルが二重
結合を有する例:C_18:1（CAS 871−37−４）がある。こ
のサブセット（αがアミドプロピル基である）には、い
くつかのカルボキシメチルベタインの例がある。これら
は以下を含む:C₁₂アミド（CAS 番号4292−10−８）、C
₁₄アミド（CAS 番号59272−84−３）、C₁₆アミド（CAS
番号32954−43−１）およびC₁₈アミド（CAS 番号617
9−44−８）。C₁₈アミド（CAS 番号6179−44−８）
は、構造が不定である。なぜなら、このアルキルが「イ
ソ」形態であり、このことは、アルキルがある不定な様
式で分岐していることを示唆しているからである。アル
キル鎖がココナッツオイルから誘導され、そして差異が
調製方法にある、いくつかのアミドプロピルカルボキシ
メチルベタインがある。このカテゴリーの２つの例とし
ては、CAS 番号61789−39−７および61789−40−０が
挙げられる。ココカルボキシメチルベタインの例は、CA
S 68424−94−２である。他の天然オイルカルボキシメ
チル誘導体としては、以下が挙げられる：リシンアミド
プロピルカルボキシメチルベタイン（CAS 番号71850−
81−２）および獣脂ビスヒドロキシエチルグリシネート
（CAS 番号70750−46−８）が挙げられる。試験したい
くつかのカルボキシメチルベタインの中にはCAS 番号
が与えられていないものもある。これらは以下を含む：
コムギ胚オイル−アミドプロピルカルボキシメチルベタ
イン（Schercotaine WOAB:Scher Chemicals,Inc.,Clift
on,NJ）、ババス−アミドプロピルカルボキシメチルベ
タイン（Croda,Inc.,Parsippany,NJ）、ダイズアミドプ
ロピルカルボキシメチルベタイン（Chembetaine S:Chem
ron Corp.,Paso Robles,CA）およびカンロアミドプロピ
ルベタイン（Hetaine CLA:Heterence,Inc.,Patterson,N
J）。アミド結合中の窒素が、４級化窒素である（例え
ば、結合（α）が、カルボニルである）、いくつかの例
がある。これらは以下を含む:C₁₁（CAS 番号66451−67
−０）、C₁₅（CAS 番号66516−99−２）、およびC
₁₇（CAS 番号66451−68−１）。エチル架橋（R₄＝−CH
₂CH₂−）、メチレン結合（α＝−CH₂−）を利用し、そ
してアルキル鎖長に基づいてのみ変化するカルボキシベ
タイン（「カルボキシエチルベタイン」）の例は、以下
を含む:C₁₂（CAS 番号16527−85−８）、C₁₃（CAS 番
号132621−79−５）、C₁₄（CAS 番号69725−38−
３）、C₁₆（CAS 番号42416−43−３）、およびC₁₈（CA
S 番号30612−73−８）。適切な条件下、R₂およびR₃が
水素原子である、カルボキシエチルベタインの例は、CA
S 番号1462−54−０（C₁₂−βアラニン）である。プロ
ピル架橋（R₄＝−CH₂CH₂CH₂−）、メチレン結合（α＝
−CH₂−）を利用し、そしてアルキル鎖長に基づいての
み変化するカルボキシベタイン（「カルボキシプロピル
ベタイン」）の例は、以下を含む:C₁₁（CAS 番号15014
7−53−８）、C₁₂（CAS 番号15163−30−１）、C₁₄（C
AS 番号146959−90−２）、C₁₅（CAS 番号146959−91
−３）、C₁₆（CAS 番号71695−32−４）およびC₁₈（CA
S 番号78195−27−４）。ブチル架橋（R₄＝−CH₂CH₂CH
₂CH₂−）およびメチレン結合（α＝−CH₂−）を利用す
るカルボキシベタイン（「カルボキシブチルベタイ
ン」）の例は、C₁₂（CAS 番号120139−51−７）であ
る。ペンチル架橋（R₄＝−CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂−）および
メチレン結合（α＝−CH₂−）を利用するカルボキシベ
タイン（「カルボキシペンチルベタイン」）の２例は、
C₁₂（CAS 番号76392−97−７）およびC₁₆（CAS 番号7
3565−98−７）である。ヘキシル架橋（R₄＝−CH₂CH₂CH
₂CH₂CH₂CH₂−）およびメチレン結合（α＝−CH₂−）を
利用するカルボキシベタイン（「カルボキシヘキシルベ
タイン」）の例は、C₁₂（CAS 番号132621−80−８）で
ある。ベンジル基を架橋官能（R₄＝−CH₂−C₆H₄−）と
して用いるいくつかのカルボキシベタインの例がある。
２つのC₁₂の例があるが、１つはカルボキシ官能が４位
すなわちパラ位にあり（CAS 番号71695−31−３）、そ
して１つはカルボキシ官能が、２位すなわちオルト位
（CAS 番号71695−34−６）である。２つのC₁₆の例が
あり、１つはカルボキシ官能が４位すなわちパラ位にあ
り（CAS 番号71695−33−５）、そして１つはカルボキ
シ官能が、２位すなわちオルト位（CAS 番号71695−35
−７）にある。従って、「カルボキシベタイン様」
（「CB様」）は、表２に示すように、陰イオンとしてカ
ルボキシ基を利用する（γ＝−COO^-）SB−18様ベタイン
構造を含み、そして本明細書中前記で定義したような、
R₁、α、R₂、R₃、βおよびR₄の全ての可能な組み合わせ
を含む。

ベタインの主要な第二のサブセットは、スルホベタイ
ン（γ＝SO₃ ^-）である。メチル架橋（R₄＝−CH₂−）、
メチレン結合（α＝−CH₂−）を利用し、そしてアルキ
ル鎖長に基づいてのみ変化するスルホベタイン（「スル
ホメチルベタイン」）の例は、以下を含む:C₁₂（CAS
番号52667−78−４）、C₁₆（CAS 番号69775−75−３）
およびC₁₈（CAS 番号36051−36−２）。エチル架橋（R
₄＝−CH₂CH₂−）、メチレン結合（α＝−CH₂−）を利用
し、そしてアルキル鎖長に基づいてのみ変化するスルホ
ベタイン（「スルホエチルベタイン」）の例は、以下を
含む:C₁₂（CAS 番号24020−67−５）、C₁₄（CAS 番号
58930−04−４）およびC₁₆（CAS 番号58930−05−
５）。C₁₆−アミド（CAS 番号58930−06−６）は、ア
ミドプロピル官能を利用してアルキル鎖を４級化窒素に
結合させたスルホエチルベタインの例である。プロピル
架橋（R₄＝−CH₂CH₂CH₂−）、メチレン結合（α＝−CH₂
−）を利用し、そしてアルキル鎖長に基づいてのみ変化
するスルホベタイン（「スルホプロピルベタイン」）の
例は、以下を含む:C₈（CAS 番号15178−76−４）、C₁₀
（CAS 番号15163−36−７）、C₁₂（CAS 番号14933−0
8−５）、C₁₄（CAS 番号14933−09−６）、C₁₅（CAS
番号67030−70−０）、C₁₆（CAS 番号2281−11−
０）、およびC₁₈（CAS 番号13177−41−８）。N,Nジプ
ロピル（R₃＝R₄＝−CH₂CH₂CH₃）であるC₁₂（CAS 番号1
5163−34−５）の例がある；そしてαがアミドプロピル
基であるC_n−スルホプロピルベタインの例は少なくとも
２つある。これらは、C₁₂アミド（CAS 番号52562−28
−４）およびC₁₆アミド（CAS 52562−29−５）を含
む。架橋が不定な構造のイソプロピル（−C₃H₆−）であ
るスルホプロピルベタインの例がいくつかある。これら
は、C₁₂（CAS 番号59942−40−４）、C₁₄（CAS 番号5
9942−41−５）、およびC₁₆（CAS 59942−42−６）を
含む。イソプロピル架橋およびアミドプロピル結合を利
用するC₁₆アミド（CAS 番号63663−13−８）の例もあ
る。ブチル架橋（R₄＝−CH₂CH₂CH₂CH₂−）、メチレン結
合（α＝−CH₂−）を利用し、そしてアルキル鎖長に基
づいてのみ変化するスルホベタイン（「スルホブチルベ
タイン」）の例は、以下を含む:C₁₂（CAS 番号64463−
49−６）、C₁₆（CAS 番号58930−07−７）、およびC₁₈
（CAS 番号22313−73−１）。1,3−ジメチル−３−ス
ルホブチルであるC₁₂（CAS 番号35489−44−２）の例
がある；そしてαがアミドプロピル基であるスルホブチ
ルベタインの例がある:C₁₆アミド（CAS 番号58930−08
−８）。「スルホヘキシルベタイン」（R₄＝−CH₂CH₂CH
₂CH₂CH₂CH₂−）の例がある:C₁₆（CAS 番号132621−81
−９）。ベンジル基が架橋官能として使用される（R₄＝
−CH₂−C₆H₄−）いくつかの例がある。これらは以下を
含む:C₁₂（CAS 番号65180−40−７）、C₁₄（CAS 番号
65180−41−８）、C₁₆（CAS 番号65180−42−９）およ
びC₁₈（CAS 番号65180−43−０）、ここでスルホネー
トは４位すなわちオルト位にある。これら最後の４つ
が、そのアルキル鎖を、アミドプロピル基により４級化
窒素に結合させる、いくつかの例がある:C₁₂（CAS 番
号65180−44−１）、C₁₄（CAS 番号65180−45−２）、
C₁₆（CAS 番号65180−46−３）およびC₁₈（CAS 番号6
5180−47−４）。従って「スルホベタイン様」（「SB
様」）は、表２に示すように、陰イオンとしてスルホネ
ートを利用する（γ＝−SO₃−）SB様ベタイン構造を包
含し、そして本明細書の前記に定義されるようにR₁、
α、R₂、R₃、βおよびR₄の全ての可能な組み合わせを包
含する。

スルホベタインの大きなサブセット（典型的には、劇
的に異なる性質により別々に処理され、そして全てSB−
18様活性を示すことが合理的に期待される）は、ヒドロ
キシプロピルスルホベタイン（HSB）である。これらの
界面活性剤は、低い溶解性のために集中的に研究されて
いなかった。これらのスルホベタインの多くは、２−ヒ
ドロキシプロピル架橋（R₄＝−CH₂CH（OH）CH₂−）を利
用する。これらは、直鎖アルキルを有するもの:C₁₀（CA
S 番号34135−76−７）、C₁₂（CAS 番号13197−76−
７）、C₁₄（CAS 番号13177−42−９）、C₁₅（CAS 番
号71502−45−９）、C₁₆（CAS 番号7425−12−９）、
およびC₁₈（CAS 番号19223−56−４）、およびアミド
プロピル結合を使用するもの:C₁₂アミド（CAS 番号192
23−55−３）、C₁₄アミド（CAS 番号63663−10−
５）、C₁₆アミド（CAS 番号63663−11−６）、およびC
₁₈アミド（CAS 番号63663−12−７）を含む。アルキル
が単純直鎖でないC₁₄の例がいくつかある：（CAS 番号
56505−82−９）および（CAS 番号71497−51−３）。
従って、「ヒドロキシスルホベタイン様」（「HSB
様」）は、表２に示すように、陰イオンとしてスルホネ
ートを有し（γ＝−SO₃−）、ヒドロキシプロピル架橋
（R₄＝−C_mH_2m-1（OH）−）を利用するSB−18様ベタイ
ン構造を包含し、そして本明細書の前記で定義したよう
なR₁、α、R₂、R₃およびβの全ての可能な組み合わせを
包含する。

界面活性剤のこのファミリーの第３のサブセット（こ
れらも、十分に特徴づけられている）は、ホスホベタイ
ンである。エチル架橋（R₄＝−CH₂CH₂−）、メチレン結
合（α＝−CH₂−）を利用し、そしてアルキル鎖長に基
づいてのみ変化するホスホベタイン（「ホスホエチルベ
タイン」：γ＝−OPO₃ ^-）の例は、以下を含む:C₁₀（CAS
番号134842−83−４）、C₁₁（CAS 番号134842−84−
５）、C₁₂（CAS 番号126712−86−５）、C₁₄（CAS 番
号126712−87−６）、C₁₆（CAS 番号126712−88−
７）、C₁₇（CAS 番号145578−49−０）および、C₁₈（C
AS 番号126712−89−８）。アルキルが二重結合を有す
る２つのホスホエチルベタインの例がある:C_18:1（CAS
番号134590−60−６およびCAS 番号148716−30−
７）。R₃とR₄部分が顕著に変化するC₁₆−ホスホエチル
ベタインにはいくつかの例がある。これらは、以下を含
む:N,N−ジエチル（CAS 番号126712−90−１）;N,N−
ジプロピル（CAS 番号126712−91−２）;N,N−ジブチ
ル（CAS 番号126712−93−３）;N−エチル−Ｎ−プロ
ピル（CAS 番号126712−93−４）;N−エチル−Ｎ−エ
チル（CAS 番号134842−85−６）；およびＮ−エチル
−Ｎ−ブチル（CAS 番号126712−94−５）。プロピル
架橋（R₄＝−CH₂CH₂CH₂−）を利用するホスホベタイン
（「ホスホプロピルベタイン」）の例は、以下である:C
₁₆ホスホプロピルベタイン（CAS 番号89367−17−
９）。ブチル架橋（R₄＝−CH₂CH₂CH₂CH₂−）を利用する
ホスホベタンイン（「ホスホブチルベタイン」）の例
は、C₁₆ホスホブチルベタイン（CAS 番号134842−86−
７）であり、そしてヘキシル架橋（R₄＝−CH₂CH₂CH₂CH₂
CH₂CH₂−）を利用するホスホベタンイン（「ホスホヘキ
シルベタイン」）の例は、C₁₆ホスホヘキシルベタイン
（CAS 番号134842−87−８）である。ｎ−ヒドロキシ
アルキルホスホエチルベタイン（例えば、これらは、ヒ
ドロキシル結合を利用する）のいくつかの例がある。こ
れらは、以下を含む:C₁₂（CAS 番号124591−53−
３）、C₁₄（CAS 番号124591−54−４）およびC₁₆（CAS
番号124591−57−７）。アミドプロピル結合を使用す
るヒドロキシプロピルホスホベタインは以下を含む:C₁₂
アミド（CAS 番号73602−79−６）およびC₁₈アミド（C
AS 番号144077−12−３）。結合としてエーテル官能と
共にヒドロキシプロピル基を利用するホスホエチルベタ
インのいくつかの例がある:C₁₀（CAS 番号128506−41
−２）、C₁₂（CAS 番号128506−42−３）、およびC₁₄
（CAS 番号128506−46−７）。Gallot,Bら、J.Colloid
Interface Sci.121:514−521（1988）は、エチル基が
陰イオン（例えば、−OPO₃ ^-−（C₂H₅））を改変するよ
うに用いられた一連のホスホベタインを記載する。これ
らの構造、およびγがホスホネートまたはホスフィネー
トである例もまた、本発明の方法においてSB−18様活性
を有することが合理的に期待される。従って、「ホスホ
ベタイン様」（「PB様」）は、ホスフェート、ホスホネ
ートまたはホスフィネートを陰イオンとして利用する
（γ＝−OPO_x ^-、ここでｘ＝1,2または３）表２のSB−18
様ベタイン構造を含み、そして本明細書中の前記に定義
されるようなR₁、α、R₂、R₃、βおよびR₄の全ての可能
な組み合わせを含む。

ベタインの第４のサブセットは、陰イオンとしてスル
フェート（−OSO₃ ^-）を利用するものを含む。HSB様の例
と同様に、これらの分子は、さらに溶解性が低く、そし
てこのために熱心な研究はされていない。しかし、これ
らはまた、SB−18様活性を示すことは合理的に期待され
る。エチル架橋（R₄＝−CH₂CH₂−）、メチレン結合（α
＝−CH₂−）を使用し、そしてアルキル鎖長に基づいて
のみ変化する例（「スルホエチルベタイン」）は、以下
を含む:C₁₀（CAS 番号92764−24−４）、C₁₄（CAS 番
号58930−09−９）および、C₁₆（CAS 番号58930−10−
２）。プロピル架橋（R₄＝−CH₂CH₂CH₂−）、メチレン
結合（α＝−CH₂−）を使用し、そしてアルキル鎖長に
基づいてのみ変化する例（「スルファトプロピルベタイ
ン」）は、以下を含む:C₁₀（CAS 番号92764−22−
２）、C₁₂（CAS 15163−35−６）、C₁₄（CAS 番号589
30−12−４）およびC₁₆（CAS 番号34236−95−８）。
ブチル架橋（R₄＝−CH₂CH₂CH₂CH₂−）、メチレン結合
（α＝−CH₂−）を使用し、そしてアルキル鎖長に基づ
いてのみ変化する例（「スルファトブチルベタイン」）
は、以下を含む:C₁₂（CAS 番号58930−14−６）および
C₁₆（CAS 番号58930−15−７）。アミドプロピル結合
を使用するスルフェートのいくつかの例がある:C₁₆−ア
ミドプロピルスルファトエチルベタイン（CAS 番号589
30−11−３）、C₁₆−アミドプロピルスルファトプロピ
ルベタイン（CAS 番号58930−13−５）、C₁₃−アミド
プロピルスルファトブチルベタイン（CAS 番号144077
−11−２）、およびC₁₆−アミドプロピルスルファトブ
チルベタイン（CAS 番号58930−16−８）。従って、
「スルファトベタイン様」（「StB様」）は、陰イオン
としてスルフェートを利用する（γ＝−OSO₃ ^-）、表２
のSB−18様ベタイン構造を含み得、そして本明細書中の
前記に定義されるようなR₁、α、R₂、R₃、βおよびR₄の
全ての可能な組み合わせを含む。

ホスホニウム様ベタイン（β＝−P⁺−）が、Gaertne
r,V.R.ら（U.S.2,828,332）により記載された。本明細
書のデータおよび仮説に基づいて、「ホスホニウムベタ
イン様」（「PhB様」）は、表２に示すようなホスホニ
ウム陽イオンを有する、全ての可能なSB−18様ベタイン
の組み合わせを含み、そして本明細書中の前記に定義さ
れるようなR₁、α、γ、R₂、R₃およびR₄の全ての可能な
組み合わせを含む。

ホスホニウムベタインと同様に、「スルホニウムベタ
イン様」（「SoB様」）は、SB−18様の意味に含まれる
が、表２に示すように、β＝−S⁺−であり、本明細書中
の前記に定義されるようなR₁、α、γ、R₂、R₃、および
R₄の全ての可能な組み合わせを含むものである。

表３に列挙するいくつかの他の注目に値するベタイン
様構造がある。これらは「逆性ベタイン」（RevB）、ア
ミンオキシド様（AOx）界面活性剤、ｃ−アルキルベタ
イン（cAB）、およびイミダゾリニウム−ベタイン誘導
体（ImB）を含む。これらは、表２における用語を用い
て容易に記載され、そしてアルキル（R₁）の視点から種
々の構造を考えることが、おそらく最も都合が良い：ア
ルキルは、陽イオン（β）、陰イオン（γ）または架橋
（R₄）のいずれかと結合し得、全てがベタイン様構造と
みなされる。例えば、ｎ−アルキルベタインの場合で
は、疎水性ドメイン（R₁）は、陽イオンと共有結合し、
一方、逆性ベタインの場合では、アルキルは陰イオン
（−γ−）と結合し、そしてｃ−アルキルベタインの場
合では、アルキルは架橋（R₄）と結合する。

逆性ベタインは、反対電荷（この場合、陽イオン−
［β］^＋−）が、架橋（−R₄−）により陰イオンと連絡
している点で、ｎ−アルキルベタインと同様である。典
型的には、陽イオン（−［β］−）^＋は、４級化窒素で
あり、その結果R₂およびR₃基は、かわりにこの位置で結
合する。

ｃ−アルキルベタインは、アルキルが陽イオン（−
［β］^＋−）または陰イオン（−γ⁻−）のいずれかと
対立するものとして、架橋（R₄）と共有結合する点で構
造的に異なる。

アミンオキシドの場合では、ｎ−アルキルベタイン構
造は維持される；しかし、βは、定義上、４級化窒素で
あり、そしてγは、定義上オキシドである。最小化され
る架橋を考えるのが便宜的である:R₄は、単にＮ−Ｏ共
有結合である。アミンオキシドと同様な他のオキシド様
構造（例えば、ホスホニウムオキシド）がある。これら
もまた、本発明の方法において機能することが合理的に
期待される。

両イオン性イミダゾリニウムタイプの界面活性剤もま
た２つの異なる性質を有するベタインとして注目され
る。この場合では、正電荷中心はラジカルではなく、そ
のかわりに共鳴構造が陽イオンを生ずる改変イミダゾリ
ンである。古典的な架橋構造は維持され、そしてアルキ
ルは、環上の任意の地点で結合し得る。

表3:別のベタイン様構造 さらなるベタイン構造を表す。表２に使用した命名法
を維持し、以下の構造を記載する。

表３の構造が限られた段階まで研究されているが、そ
れらはｎ−アルキルベタイン（表２）ほどの注意を受け
ていない。それ故、ベタインに見られる構造的多様性の
ごく一部のみを示す。それにもかかわらず、上記のいく
つかのクラスの代表例は、本発明の方法に使用される。
使用された代表的な逆性ベタイン、アルキル２−ヒドロ
キシ−３−トリメチルアンモニオプロピルホスフェート
（C₁₆−AHTMAP:CAS 番号99485−86−６）は、Kurosak
i,Tら,Chem.Soc.Japan 11:1297−1301（1990）により記
載されており、そしてKAO Chemical（Japan）からの贈
答物として得られた。使用されたアミンオキサイド、Am
monyx MO（ミリスチルジメチルアミンオキサイド:CAS
番号3332−27−２）は、サンプルとしてStepan Compan
y,Northfield,ILから得られた。使用されたｃ−アルキ
ルベタイン、Darvan NS（ｃ−デシルベタイン（CAS 番
号96−55−９）およびｃ−セチルベタイン（CAS 番号9
5−56−０）の混合物）は、サンプルとしてR.T.Vanderb
ilt,Norwalk,CTから得られた。

逆性ベタインのいくつかの群が研究されている。元々
Kurosaki,Tら,Chem.Soc.Japan 11:1297−1301（1990）
により記載されているいくつかのアルキル２−ヒドロキ
シ−３−トリメチルアンモニオプロピルホスフェート
（C_n−AHTMAP）の例があり、これらは全て、本発明の方
法において機能すると合理的に予期される。これらは、
以下を包含する:C₁₂（CAS 番号99485−91−３）、C₁₄
（CAS 番号132630−63−８）、C₁₆（CAS 番号99485−
86−６）、C₁₈（CAS 番号99485−87−７）。Zimmer,R.
E.ら（米国特許第3,560,393号）は、いくつかの非常に
興味深い逆性ベタインの合成を記載しており、これらは
全て本発明の方法において機能すると合理的に期待され
る。これらは、以下の例を包含する；アンモニウム陽イ
オン（β＝−N⁺（CH₃）_３）とホスフィネート陰イオン
（γ＝−PO^- ₂−）との組み合わせ:C₁₂（CAS 番号29557
−49−１）；アンモニウム陽イオン（β＝−N⁺（CH₃）
_３）とホスホネート陰イオン（γ＝−PO^- ₃−）との組み
合わせ:C₁₂（CAS 番号32020−41−０）；スルホニウム
陽イオン（β＝−S⁺−）とホスフィネート陰イオン（γ
＝−PO^- ₂−）との組み合わせ:C₁₂（CAS 番号32020−40
−９）；スルホニウム陽イオン（β＝−S⁺−）とホスホ
ネート陰イオン（γ＝−PO^- ₃−）との組み合わせ:C
₁₀（CAS 番号32020−42−１）；およびスルホニウム陽
イオン（β＝−S⁺−）とホスフェート陰イオン（γ＝−
OPO^- ₃−）との組み合わせ:C₁₀（CAS 番号32020−43−
２）。それ故、表３に示す「逆性ベタイン様」（「RevB
様」）は、表２に示し、そして上記に定義したR₁、α、
β、R₂、R₃、γ、およびR₄の全ての可能な組み合わせを
包含する。

本発明の方法において機能すると合理的に予期される
N,N−ジメチルアミンオキサイドの例は以下を包含する:
C₁₂（CAS 番号1643−20−５）、C₁₄（CAS 番号3332−
27−２）、C₁₆（CAS 番号7128−91−８）、C₁₈（CAS
番号2571−88−２）、およびC₂₂（CAS 番号26483−35
−２）。アミドプロピル結合を使用するアミンオキサイ
ドの例は、Ｃ_18:1アミド（CAS 番号14351−50−９）を
包含する。R₁が天然油に由来する例は、ココアミドプロ
ピル（cocamidopropyl）（CAS 番号68155−09−９）お
よびババス−アシドプロピル（CAS 番号124046−26−
０）を包含する。それ故、表３に示すように「アミンオ
キサイド様」（「AO様」）は、γ＝O^-、およびR₄が共有
β−Ｏ結合である構造として定義され、そして表２に示
し、そして上記に定義したR₁、α、β、R₂およびR₃の全
ての可能な組み合わせを包含する。

本発明の方法において機能すると合理的に予期される
ｃ−アルキルベタイン（γ＝COO^-、β＝−N⁺（C
H₃）_３、R₄＝−CH−）の例は以下を包含する:C₁₀（CAS
番号96−55−９）、C₁₂（CAS 番号686−83−９）、C
₁₄（CAS 番号16545−85−０）、C₁₆（CAS 番号95−56
−０）、およびC₁₈（CAS 番号686−84−０）。それ
故、表３に示すように、「ｃ−アルキルベタイン様」
（「cAB様」）は、R₁がR₄に結合している構造として定
義され、そして表２に示し、そして上記に定義したα、
β、γ、R₁、R₂、R₃、およびR₄の全ての可能な組み合わ
せを包含する。

イミダゾリニウムベタインの例は、R₄がヤシ油に由来
するイミダゾリニウムベタイン（CAS 番号68334−21−
４）である。従って、全ての「イミダゾリニウムベタイ
ン様」（「ImB様」）構造は、本発明の方法において機
能すると合理的に予期され、それ故、βが定義によりイ
ミアゾリニウム機能性である構造として定義され、そし
て表２に示し、そして上記に定義したα、γ、R₁、R₂、
R₃、およびR₄の全ての可能な組み合わせを包含する。

それ故、本明細書中で使用される「ベタイン様」は、
表２および表３に記載される構造をいい、例えば、CB
様、SB様、HSB様、PB様、StB様、PhB様、SoB様、RevB
様、AO様、cAB様、およびImB様を包含し、SB−18様活性
を有する。Gallot,Bら,J.Colloid Interface Sci.121:5
14−521（1988）の例のように、SB−18様活性を変えな
いγへの改変は、同様にこの定義の範囲内に含まれるこ
とに留意されたい。さらに、挙動が本明細書に記載のベ
タインの挙動と一致し、そしてSB−18様活性を有するよ
うな双極子モーメントを生み出す同一の分子における多
数の電荷の取り込み（例えば、２以上の電荷、ここで、
少なくとも２つの電荷は反対の記号である）はまた、ベ
タイン様と考えられる。

ベタイン様界面活性剤の使用 ベタイン様特性は、アルキル鎖の長さ、電荷の組み合
わせ、および架橋構造に依存する。より長いアルキル鎖
（例えば、C₁₆〜C₂₀）が好ましく、コード形成を破壊す
る能力およびより活性に隔離されるそれらの見かけの能
力に帰する。しかし、これらの長鎖アルキルの制限され
た溶解性は、本発明の方法においてこれらのベタインの
効果的な利用を妨げる。ホスホベタイン、カルボキシベ
タイン、またはスルホベタインのいずれかが、これらの
陰イオンにより提供された増大した溶解性により好まし
い。しかし、カルボキシベタインおよびスルホベタイン
はより容易に合成される。カルボキシベタインは、イオ
ン性界面活性剤に関係したより一般的な特性を有し、一
方、スルホベタインは非イオン性界面活性剤に関係した
より一般的な挙動特性を示す。直鎖の架橋が好ましく、
そしてプロピル基が最も好ましい架橋構造である。なぜ
なら、それにより（ａ）界面活性剤の「塩溶（salting
−in）」を可能にし、そして（ｂ）最小の静菌性構造で
あるからである。メチレン架橋は、最も好ましくない。
なぜなら塩析挙動を示すからである。メチレン結合は好
ましい；しかし、アミドプロピル結合はSB−18様活性全
体と干渉しないようであるが、非イオン性挙動を増強す
るようである。それ故、本発明の方法に使用するSB−18
様界面活性剤の選択は、検出に用いられる所望の使用ま
たはシステム、あるいは所望の静菌活性の程度に依存し
て変化し得る。例えば、目標が、凝集しない生物（例え
ばM.paratuberculosis）の検出である場合、分散および
イオン性の性能に関する特性は必須でない。これらの情
況下では、より短鎖であり、かつより非イオン性の特性
を有するベタインが使用され得る。あるいは、目的が、
凝集する生物（例えばM.tuberculosis）の検出である場
合、イオン性挙動およびより長鎖は必須である。アルキ
ル鎖の長さおよび架橋の長さが静菌性活性の重要な決定
因子であるので、ベタイン様構造は、増幅により容易に
検出されるように変えられ得る。例えば、上で考察した
ように、本明細書中の実施例は検出のための好ましい方
法としてPCRを使用するが、本発明の方法は、他の増幅
方法論により検出を容易にし得る。PCRに最適に挙動す
るベタインが有用であると予期されるが、他の方法論
（例えば、リガーゼ連鎖反応（LCR）、鎖置換増幅（SD
A）、または転写増幅（NASBA,3SRまたはLAT））に必ず
しも最適でない。ベタイン様構造および機能の局面の理
解に関して、今後の手引きは、所定の適用のための最適
なベタインを得るSB−18様界面活性剤の改変に関する当
業者への教示に包含される。上記制約を考慮すると、C
₁₈カルボキシプロピルベタイン（CAS 番号78195−27−
４）は、PCRに関連した広範囲な適用に、可溶性、鎖
長、および架橋構造の理想的な組み合わせを提供すると
予期される。従って、この化合物を利用する本発明の方
法は、非常に高く好ましい実施態様である。CAS 番号7
8195−27−４は、例えば、日本国出願番号第79100920号
［54−100920］；および日本国特許第81251394号に記載
されたような、一般の技術を使用することにより合成さ
れ得る。

２μＭ未満のSB−18の濃度は、拡散において無力なよ
うであり;2μＭと2mMとの間の濃度が、おそらく臨界ミ
セル濃度（CMC）のために、最も有用であり；そして2mM
よりはるかに大きなSB−18濃縮物は、不溶性のために溶
液中に維持することが難しい。当業者により理解される
ように、これらの考慮は、SB−18様界面活性剤が使用さ
れるのに応じて変化する。例えば、より短鎖がCMCを上
回るより高い濃度を必要とするが、しかしクラフト点は
あまり関係がない。それにもかかわらず、所望の界面活
性剤のCMCを10〜1,000倍上回る濃度が使用されるべきで
あり、アッセイの温度とSB−18様界面活性剤クラフト点
の関係は慎重に相関されなければならない。SB−18を使
用する場合、電解質含有培地（10mM〜100mM塩）を使用
し、そして溶液を温め（例えば、37℃未満ではなく37℃
〜42℃の間の温度に）、そしてミセル形態の界面活性剤
を維持するために37℃より上で全ての工程（例えば、遠
心分離）を行う必要がある。以下に考察するように、本
発明の方法に使用されるSB−18様界面活性剤を変えるこ
とにより、SB−18様界面活性剤を温かく維持する必要を
除去し得る。例えば、細胞を溶解しない濃度（一般に2m
M未満）でC₁₈−カルボキシプロピルベタイン（CAS 番
号78195−27−４）を使用することにより、SB−18によ
り課せられる厳密な温度の制限を除去する。

一般に、50℃より高い温度は溶解を容易にするようで
ある、それ故、本発明の方法は、細菌細胞がインタクト
である場合にのみ、遠心分離による回収の効率を改良す
ることに関して利点を与えるので、50℃より高い温度の
上昇は避けられるべきである。

界面活性剤を含有する洗浄液のpHは、５より高く、し
かし９より低く維持されるべきである。pH5未満では、S
B−18様界面活性剤は、異常な（anomolous）挙動を示し
始め得、そしてpH9より上ではSB−18様界面活性剤は陰
イオン性界面活性剤として挙動し得、そして塩析する。
しかし、SB−18様界面活性剤がSB−18様活性を示す全て
のpHが受け入れられる。このような界面活性剤を含有す
る洗浄の時間は、界面活性剤の蓄積を可能にするように
少なくとも60分であるべきである。最大18時間のインキ
ュベーションは、60分間のインキュベーションの結果に
対して極わずかの改良のみを提供した。

界面活性剤としてのベタイン 一般に３つのクラスの界面活性剤が考えられている：
陰イオン性および陽イオン性の両方を包含するイオン性
界面活性剤；非イオン性界面活性剤、および両性界面活
性剤（Kirk−Othmer Encyclopedia of Chemical Techno
logy,第３版，第22集,John Wiley ＆ Sons,New York（1
983）,332−387頁）。ベタインが属する界面活性剤の特
定のクラスは、均一に受け入れられない。形式的に電荷
した種の共存により、幾人かは「両性」としてベタイン
を分類する。しかし、Laughlin,R.G.Langmuir 7:842−8
47（1991）は、これらの分子が非イオン性界面活性剤の
サブクラスであると主張する。明確なことは、ベタイン
が非イオン性界面活性剤およびイオン性界面活性剤両方
と異なるカテゴリーに位置される所定の独特の性質を有
することである。ベタインは、他の局面ではイオン性界
面活性剤のように挙動し、そしていくつかの局面では非
イオン性界面活性剤のように挙動する。実際、構造に依
存して、同じ分子を、ある条件下での特定の局面におい
てイオン性界面活性剤のように挙動し、そして他の条件
下では非イオン性界面活性剤のように挙動するようにし
得る。

界面活性剤は、一般にそれらの物理的特性および温度
（Ｘ軸）に対する濃度（Ｙ軸）のプロットにおける相挙
動（phase behavior）に基づいて記載される。最も簡略
な用語では、純粋な界面活性剤には３つの相（モノマー
相、固相、およびミセル相）が存在すると考えられる。
それぞれの界面活性剤は、所定の相を表させる系の媒介
変数に基づいて記載され得る。系の媒介変数の変化は、
次いでさらに挙動を特徴付けるために使用される相の間
の転移を引き起こす。以下の一般的な情報は、以下から
要約される:Shinoda,K.,Nakagawa,T.,Tamamushi,B.,お
よびIsemura,T.編,Colloidal Surfactants,Academic Pr
ess,New York（1963）;Schick,M.J.編,Surfactant Scie
nce Series,第１集:Nonionic Surfactants,Marcel Dekk
er,New York（1967）;Jungermann,E編,Surfactant Scie
nce Series,第４集:Cationic Surfactants,Marcel Dekk
er,New York（1970）;Bluestein,B.R.およびHilton,C.
L.編,Surfactant Science Series,第12集;Amphoteric S
urfactants,Marcel Dekker,New York（1982）;Gloxhube
r,C.およびKunstler,K.編,Anionic Surfactants,Marcel
Dekker,New York（1992）。

例えば、全ての界面活性剤は、水性溶液においてある
程度の可溶性を有する。低濃度においては、モノマーの
みが存在する。濃度が上昇し相転移が生じ、温度が充分
に高い場合、ミセルが形成され始める。これらの条件下
およびほとんどの場合では、さらに濃度が上昇してもミ
セル濃度を富化するだけである。相転移が生じる濃度
は、「臨界ミセル濃度」（CMC）として知られる。

系が臨界温度よりも上であり限り、CMCは実質的には
全ての温度で同じ濃度で存在する。それゆえ、この考察
の目的のために、CMCは上述のＸ軸に平行であるように
可視化され得る。系がこの臨界温度よりも低い場合、平
衡は、濃度に関わらず、モノマー相と固相との間であ
る。温度が上昇し、系がCMCより高い場合、固相とミセ
ル相との間の相転移が最終的に生じる。クラフト点（ク
ラフト,F.ら,Ber.28:2566−2573（1985））として知ら
れるこの温度は、一般に水和した結晶の融解温度として
引用され、そして本質的に濃度に関係せず同じである。
それゆえ、この考察の目的のために、クラフト点はＹ軸
に平行であるように可視化され得る。

CMCおよびクラフト温度が交差する点は、クラフト点
として知られる。この記載に固有であるのは、サイズ特
性（ミセル分子量および凝集数）および形成されたミセ
ルの形である。この基本的なフレームワーク（温度、濃
度、および種々の電解質および電解質濃度を含む溶媒
系）を使用して、前世紀の化学者らは、異なる化学的構
造体、独特の相およびミセル挙動を定義した。以下の考
察は、臨床的に適切な条件（例えば、水性溶液）に焦点
をおき、そして、SB−18および一般的なSB−18様界面活
性剤の機能に重要であると考えらる特徴を概説し、そし
て所定の適用（例えば、PCR以外の増幅方法による検
出）のためにベタイン様界面活性剤を最適化することを
望んでいる当業者への指針に含まれる。

界面活性剤のCMCがアルキル鎖の長さの増加に伴い減
少する一方で、非イオン性界面活性剤のCMCは、同等の
鎖長のイオン性相同物のCMCよりも一般に10²倍低い。こ
れは、非イオン性相同物のモノマーがより低い可溶性で
あることを示唆する。しかし、この差異は、利用される
非イオン性部分の種類および数に強く依存する。例え
ば、Hsiao,L.ら,J.Phys.Chem.60:657−660（1956）は、
ポリオキシエチレンフェニルエーテルのCMCがポリオキ
シエチレン部分の増加に伴って増加することを示す。To
kiwa,F.ら,Bull.Chemm.Soc.Japan 35:1737−1739（195
4）およびSchick,M.J.ら,J.Phys.Chem.66:1326−1333
（1962）は、ミセル重量および凝集数が、同様にポリオ
キシエチレン単位数の増加に伴って増加する。一方、イ
オン性界面活性剤は、異なるイオン種を有するCMCにお
いて小さな差異のみを示す。Shinoda（Shinoda,K.,Coll
oidal Surfactants,Academic Press,New York（1963）5
4−55頁）は、これらの小さな差異を説明するためにい
くつかの異なるイオン性相同物についてのデータを収集
した。

対照的に、ベタインのCMCは、電荷の分離距離および
特異的なイオン基の性質に依存する。例えば、Latters,
A.ら,Surfactants Soln.11:127−1139（1991）は、水中
の一連のカルボキシベタインのCMCが、架橋の長さがメ
チルからエチル、プロピルになるにつれ増加することを
示す。Weers,J.G.ら,Langmuir 7:854−867（1991）は、
傾向が逆であることを示し、このデータを否定する。We
ers,J.G.ら,Langmuir 7:854−867（1991）は、（ｉ）一
連のスルホベタインのCMCは、最初プロピルからブチル
に行くにつれ増加し、次いでブチルからヘキシルに行く
につれ減少すること、そして（ii）カルボキシベタイン
のCMCが、対応するスルホベタインのCMCよりも低いこと
を示す。興味深いことに、Nandakumar T.N.ら,J.Oil Te
ch.Assoc.India 11:31−34（1979）は、とWeers,J.G.
ら,Langmuir 7:854−867（1991）と以下の最後の点で矛
盾する：カルボキシベタインのCMCが対応するスルホベ
タインのCMCよりも高い。陰イオン部分へのCMCの依存性
の実験は、C₁₆カルボキシベタインのCMC地（8.3×10
^-5M:Latters,A.ら,Surfactants Soln.11:127−1139（19
91））、C₁₆ホスホエチルベタインのCMC値（４×10^-5M:
Tsubone,K.ら,J.Am.Oil Chem.Soc.67:149−153（199
0））、およびC₁₆スルホエチルベタインのCMC値（不溶
性:Weers,J.G.ら,Langmuir 7:854−867（1991）;Parrie
s,Nら,J.Am.Oil Chem.Soc.53:97−100（1976）は、C₁₆
スルホエチルベタインのクラフト点が同様に90℃より高
いと報告している）を比較することにより見られ得る。
イオン性界面活性剤と比較した場合、明らかに、表面の
活性とイオン機能性とのより複雑な相関関係が、ベタイ
ンについて生じる。実際、矛盾した結果は、おそらく系
の条件に対するこれらの分子の極度の感受性に起因し得
る。

鎖長に関するCMCの変化は、以下の式により記載され
る（Kevens,H.B.ら,J.Am.Oil Chem.Soc.30:74−80（195
3））。ここで、Ａは相同な系列に関する定数であり、
そしてＢは同じに関する鎖長（ｍ）へのCMCの依存性を
示すために使用される第２の定数である： Log₁₀C＝Ａ−Bm Shinoda（Shinoda,K.:Colloidal Surfactants,Academic
Press,New York（1963）42−44頁）は、種々の界面活
性剤のＢ値を編集している。一般に、イオン性界面活性
剤のＢ値は、log2（例えば、0.3）の範囲であり、そし
て非イオン性界面活性剤についてはlog3（例えば、0.
5）の範囲である。Beckett,A.H.ら,J.Pharm.Pharmacol.
15:422−431（1963）;Molyneux,P.ら,Trans.Faraday So
c.61:1043−1052（1965）；およびLatters,A.ら,Surfac
tants Soln.11:127−1139（1991）は、log3関数の近似
として相同な一連のカルボキシベタインに関するＢ値を
報告する。Weers,J.G.ら,Langmuir 7:854−867（1991）
は、0.48として一連のスルホプロピルベタインのＢ値を
報告している。

明らかに、ベタインは非イオン性界面活性剤として挙
動し、これはCMCが対応するイオン性相同物よりもアル
キル鎖長に強い依存性を示すことを意味する。例えば、
ベタインのCMCは２つの炭素付加に伴い対数の関数とし
て減少する（これは、Nandakumar T.N.ら,J.Oil Tech.A
ssoc.India 11:31−34（1979）のデータに明らかに示さ
れ、そしてイオン性界面活性剤とベタインとの比較はHe
rrmann,K.W.J.Colloid Inter.Sci.22:352−359（1966）
によりグラフで示される。）しかし、上で考察したよう
に、この傾向は架橋の長さ、およびイオン機能性により
ある程度影響される。例えば、Tsubone,Kら,J.Am.Oil C
hem.Soc.67:394−399（1990）の一連のアルキルヒドロ
キシホスホエチルベタイン、およびTsubone,Kら,J.Am.O
il Chem.Soc.67:149−153（1990）の一連のアルキルホ
スホエチルベタインは、同程度の依存性を示さない。こ
れらの著者により報告されたＢ値は、それぞれ0.1025お
よび0.025であり、これは、それらのイオン性相同物よ
りもアルキル鎖長に低い依存性であることを示唆する。
ホスホベタインのこの偏差は、Tsubone,Kら,J.Am.Oil C
hem.Soc.67:149−153（1990）により記載されている。
これらの結果は、酸−塩基特性とつくり出された双極性
モーメントとの間に関係が存在することを示唆する。さ
らに、挙動、構造、および組成の間の複雑な関係が示さ
れる。

温度変化への対応は、おそらくイオン性界面活性剤と
非イオン性界面活性剤とを区別する最も異なる特徴であ
る。例えば、温度の上昇は、イオン性界面活性剤のCMC
を増加させ、一方非イオン性界面活性剤のCMCを減少さ
せる。Kuriyama,K.Kolloid−Z 180:55−64（1961）の研
究は、この二分法を明らかにするためにドデシル硫酸ナ
トリウムとメトキシポリオキシエチレンデシルエーテル
とを比較する。ベタインにより与えられるパターンは、
pH依存性である。Tsuboneらは、ヒドロキシアルキルホ
スホベタイン（Tsubone,Kら,J.Am.Oil Chem.Soc.67:394
−399（1990））、およびホスホエチルベタイン（Tsubo
ne,Kら,J.Am.Oil Chem.Soc.67:394−399（1990））が、
pH11.0ではイオン性界面活性剤として挙動し、pH6.0で
は非イオン性界面活性剤として挙動することを示した。
CMCは、pH2.0では温度により影響されない。従って、低
pHでは、いくつかのベタインは変則的に挙動し、高pHで
は、全てのベタインが陰イオン性界面活性剤として挙動
し、そして興味深いことに、両性イオンの存在する中間
のpHでは、ベタインは非イオン性のパターンを与える:C
MCは温度上昇に伴い減少するようである。

上記に基づいて、温度に応じるミセル重量および凝集
数の変化は予測可能である。イオン性界面活性剤のミセ
ル重量および凝集数は、温度上昇に伴ってわずかに減少
する（Nakagawa,T.ら,Colloidal Surfactants,Academic
Press,New York（1963）123−126頁）。一方、非イオ
ン性界面活性剤のミセル重量および凝集数は、温度上昇
に伴い最終的には指数関数的に増加する（Balmbra,R.R.
ら,Trans.Faraday Soc.58:1661−1667（1962）およびKu
riyama,K.Kolloid−Z 180:55−64（1961）を参照のこ
と）。この挙動は、非イオン性界面活性剤の特性であ
り、そして曇り点またはより高い共溶点として知られる
ものが得られる。

曇り点は、濁りの始まりとして観察され、そして非イ
オン性界面活性剤の親水性部分の脱水により生じ、従っ
て、可溶性の現象を生じると考えられる。クラフト点と
比較して曇り点は、あまり限定されていない温度である
ことに留意されたい。本質において、ミセルはまだ存在
している；しかし、ミセル重量および凝集数が温度上昇
に伴って徐々に増加し、そして温度がさらに上昇する
と、最終的に相分離が生じる。Nilsson,P.ら,J.Phys.Ch
em.88:6357−6362（1984）は、スルホベタインにおいて
同様の現象を記載している。これらの同じ著者らは、ス
ルホベタインがより少ない程度でこの挙動を示し、一方
カルボキシベタインは単純にこのような挙動を欠如して
いたことを示す。実際、Bhatia,Aら,Colloids and Surf
aces 69:277−292（1993）は、C₁₈カルボキシメチルベ
タインのミセル重量および凝集数が、イオン性界面活性
剤の代表的な反応である、温度の上昇に伴って減少する
ことを示す。これらの結果は、ベタインのイオン性／非
イオン性の挙動が、適切に電荷（例えば、双極子モーメ
ント）を変化させることにより選択され得ることを示唆
する。

電解質の存在に応じるCMCの変化はまた、これらの界
面活性剤を区別する。例えば、電解質濃度の増加は、非
イオン性界面活性剤のCMCにおいて小さな減少しか生じ
ない（Shinoda,K.ら,Bull.Chem.Soc.Japan 34:237−241
（1961））。一方、イオン性界面活性剤は、電解質濃度
における同様の変化が存在した場合、CMCにおいて著し
い減少を示す（Schwuger,V.M.J.Kolloid−Z.233:979−9
85（1969））。最終結果は、イオン性界面活性剤は、
「塩析」である。言い換えれば、対イオンの可溶性が増
強される一方で、アルキル基の可溶性が減少する。従っ
て、温度は、アルキル鎖の混合に必要とされる熱に適応
するように上昇されなければならない。この現象はま
た、クラフト点上昇と呼ばれる（例えば、Tartar,H.V.
ら,J.Phys.Chem.43:1173−1179（1940）;Tartar,H.V.
ら,J.Am.Chem.Soc.61:539−544（1939）;Nakayama,H.
ら,Bull.Chem.Soc.Japan 40:1797−1799（1967）；およ
びTsujii,K.ら,J.Phys.Chem.84:2287−2291（1980）を
参照のこと）。

最も一般に使用される非イオン性界面活性剤は、０℃
より低いクラフト点を有し、従ってこの挙動を示さな
い。しかし、親水性部分が減少するに従って、いくつか
の非イオン性界面活性剤はより低い共溶限界を示す。Sc
hott,H.ら,J.Pharm.Sci.65:979−981（1976）は、Brij
56（セチルポリオキシエチレンオキサイド（C₁₆E₁₀）:C
AS 番号9004−95−９）およびBrij 76（ステアリルポ
リオキシエチレンオキサイド（C₁₈E₁₀）:CAS 番号9005
−00−９）が塩析され得ることを示す。しかし、Schot
t,H.ら,J.Pharm.Sci.65:979−981（1976）により観察さ
れた塩析は、Tartar,H.V.ら,J.Phys.Chem.43:1173−117
9（1940）により見られた塩析よりもはるかに劇的では
ないということが指摘されるべきである。界面活性剤を
塩析する能力は以下の傾向にある：陰イオンについては
SCN^-＞I^-＞NO₃ ^-＞Cl^-であり、陽イオンについてはNa⁺＞
K⁺＞Li⁺である（Scott,H.ら,J.Pharm.Sci.65:979−981
（1976））。

曇り点を低下させる能力については逆の傾向にある
（Schott,H.ら,J.Pharm.Sci.64:658−661（1975））。
実際、Scott,H.ら,J.Pharm.Sci.65:979−981（1976）
は、いくつかの硝酸ナトリウム塩および硝酸カリウム塩
が、曇り点とクラフト点の重複を生じ得（例えば、Brij
56:セチルポリオキシエチレンオキサイド（C
₁₆E₁₀））、その結果、「非晶質ゲル」の形成を生じる
ことを示す。電解質の存在下におけるベタインの挙動
は、おそらくこのクラスの界面活性剤と他のクラスの界
面活性剤との間の最も根深い差異である。Tsujii,K.ら,
J.Phys.Chem.82:1610−1614（1978）は、C₁₆スルホプロ
ピルベタインおよびC₁₈スルホプロピルベタインが、添
加された電解質により「塩析」され得ることを示す。こ
れはいわば、クラフト点が電解質の添加により劇的に低
下されるということである（例えば、水和した結晶の融
点が低下される）。Tsujii,K.ら,Yukagaku 30:495−499
（1981）は後に、この現象が架橋間距離に直接関係する
ことを示した：架橋の長さが４〜５Åよりも長い場合、
ベタインは「塩溶タイプ（salting−in type）」のもの
であり、一方架橋間距離が４Åよりも短い場合、「塩析
タイプ」のものである。Schott,H.ら,J.Pharm.Sci.64:6
58−664（1975）は、いくつかの非イオン性界面活性剤
が、曇り点の上昇に関連して塩溶し得ることを示す。例
えば、HClの２モル溶液中のBrij 96（オレイルポリオキ
シエチレン（Ｃ_18:1E₁₀）:CAS 番号9004−98−２）の
曇り点は、11.4℃に上昇する。しかし、温度におけるこ
れらの差異は、ベタインについて観察された差異と比較
して小さい。例えば、Tsujii,K.ら,J.Phys.Chem.82:161
10−1614（1978）は、純水中のSB−18のクラフト点が、
2mM界面活性剤で73.4℃であり、そして1M NaCl（Δ＝3
9.8℃）において33.6℃であることを示す。Tsujii,K.
ら,Yukagaku 30:495−499（1981）は、塩溶現象が、両
性イオン頭部基によるイオンの配位に依存し、そして豊
富にこれを生じさせる最小の距離が存在するという仮説
を立てている。

ベタインが塩析する程度（塩析タイプのものについ
て）は、非イオン性界面活性剤の塩析挙動よりも劇的で
あるが、相同なイオン性界面活性剤において観察される
よりも劇的でない（例えば、Tsujii,K.ら,J.Phys.Chem.
82:1610−1614（1978）のデータとTsujii,K.ら,Yukagak
u 30:495−499（1981）のデータとを比較のこと）。異
なる塩の存在下におけるベタインの塩溶挙動は、古典的
な「ホフマイスター系列」に従う（Tsujii,K.ら,J.Phy
s.Chem.82:1610−1614（1978））。これはいわば、特定
のイオンが他のイオンよりもクラフト点を低下させるの
により効果的である。例えば、Tsujii,K.ら,J.Phys.Che
m.82:1610−1614（1978）は、以下の傾向でSB−18を塩
溶する能力を示す：陰イオンについてはSCN^-＞I^-＞NO₃ ^-
＞Cl^-であり、そして陽イオンについてはK⁺≒NH₄ ⁺＞Na⁺
である。しかし、この傾向は、塩析挙動については正反
対である。例えば、C₁₈カルボキシメチルベタインの塩
析の効果は、SCN^-＞I^-＞NO₃ ^-＞Cl^-の傾向である（Tsuji
i,K.ら,Yukagaku 30:495−499（1981））。これは、非
イオン性挙動に関するScott,H.ら,J.Pharm.Sci.65:979
−981（1976）の考察と一致する。

電解質濃度の変化に応じてミセル重量および凝集数の
変化は、塩溶および塩析挙動に基づいて予想可能であ
る。イオン性界面活性剤のミセル重量および凝集数は、
電解質濃度の増加に伴って増大する（Shinoda,K.,Collo
idal Surfactants,Academic Press,New York（1963）20
−21頁は、この問題における多くの研究を概説する）。
Becher（Becher.P.,Surfactant Science Series,第４
集:Nonionic Detergents,Marcel Dekker,New York（196
7）500−504頁）は、非イオン性界面活性剤のミセル重
量および凝集数における電解質の影響を概説する。そし
ていくつかの顕著の例外を除いて、これらの媒介変数
は、大部分について電解質濃度の変化により影響されな
いという結論を下している。しかし、電解質は非イオン
性界面活性剤の曇り点を下げることが知られている（Na
kagawa,T.ら,Colloidal Surfactants,Academic Press,N
ew York（1963）129−135頁）。両方のタイプの界面活
性剤における電解質の影響は類似するが、反対であると
いうことに留意することは興味深い：電解質は、イオン
性界面活性剤のクラフト点を上昇させ（例えば、結晶の
融点を上昇させる）、そして非イオン性界面活性剤の曇
り点を下げる（例えば、相分離が生じる温度を下げ
る）。Bhatia,A.ら,Colloids and Surfaces 69:277−29
2（1993）は、C₁₈カルボキシメチルベタインのミセル重
量および凝集数が、Na⁺濃度の増加に伴って増加する
が、この反応はイオン性界面活性剤に見られるほど劇的
ではないことを示す。

Shinoda,K.Colloidal Surfactants,Academic Press,N
ew York（1963）76−78頁は、イオン性界面活性剤およ
び非イオン性界面活性剤の両方が、一般にpH非依存性で
あることを示す多くの研究を概説している。これはいわ
ば、同じイオン強度である場合、これらの界面活性剤の
相挙動は異なるpH条件下で同じである（例えば、pHに関
連する何らかの変化は、上で考察したようなイオン強度
における変化に一般に寄与し得る）。

しかし、ベタインの挙動は、非常にpH依存性である。
Nandakumar T.N.ら,J.Oil Tech.Assoc.India 11:31−34
（1979）は、カルボキシメチルベタインおよびスルホプ
ロピルベタインの表面活性に関連するいくつかの媒介変
数が、pH非依存性であることを示す。Tsuboneらは、ヒ
ドロキシアルキルホスホベタイン（Tsubone,K.ら,J.Am.
Oil Chem.Soc.67:394−399（1990））およびホスホベタ
イン（Tsubone,K.ら,J.Am.Oil Chem.Soc.67:394−399
（1990））がまた、異なるpH値で反対の特性を示すこと
を示した。しかし、塩溶する界面活性剤についてでさ
え、高pH（例えば、ベタインがイオン性界面活性剤とし
て挙動する）および高塩の組み合わせが、ベタインの塩
析を生成するということを理解することは、必須であ
る。Tsubone,K.ら,J.Am.Oil Chem.Soc.67:149−153（19
90）は、C_nホスホエチルベタインのより低いpKaが4.7〜
4.9の範囲にあり、そしてより高いpKaは8.8〜9.8の範囲
にあることを示す。Weers,J.G.ら,Langmuir 7:854−867
（1991）は、種々の架橋長を有するC₁₂カルボキシベタ
インのより低いpKaことを示す。架橋長さが増加するに
つれ、より低いpK_aは上昇する。従って、ベタインにつ
いて研究する場合、系のpHは重要な因子である。まとめ
ると、pH依存性は、ベタインに利用される電荷と架橋の
長さおよび構造の両方との組み合わせに依存する。極度
な塩基性条件下での本発明の方法におけるベタインの利
用は、支持され得ない（例えば、ベタインはpH14では沈
澱する）が、一方、極度な酸性条件下での本発明の方法
におけるベタインの利用は、同一の制限を有しないよう
である。

架橋構造およびその改変に関してさらにもう１つの項
目が存在し、これらの分子の利用に関連する。Parris,
N.ら,J.Am.Oil Chem.Soc.53:60−63（1976）は、スルホ
プロピルベタインのクラフト点と対応するヒドロキシプ
ロピルスルホベタインのクラフト点とを比較し、そして
この改変に伴いクラフト点が劇的に増加することを示
す。「イソ」形態を生成する架橋の分枝は、さらに劇的
な効果を有する（Parris,N.ら,J.Am.Oil Chem.Soc.53:6
0−63（1976））。従って、架橋構造および系の電解質
の選択は、本発明の方法におけるこれらの分子の利用に
さらに影響を与え得る。

ベタインの独特の特性は、反対の電荷の構造的な配置
によりつくり出される双極子モーメントであるようであ
る（Laughlin,R.G.Langmuir 7:842−847（1991））。こ
の配置は、いくつかの興味をそそる水相の性状をもたら
す様式において、水／イオン構造を配位する能力を提供
すると考えられる。このように、この配置は種々の形態
をとり得る。表３は、明らかにベタイン様である種々の
構造を記載し、そして、表３の考察は、このカテゴリー
の分子の多くの例を挙げている。これらは、「逆性ベタ
イン」、アミンオキサイド様界面活性剤、ｃ−アルキル
ベタイン、およびイミダゾリニウムベタイン誘導体を包
含する。これらの分子に固有のベタイン様構造によりつ
くり出される強い双極子モーメントにより、逆性ベタイ
ン、アミンオキサイド、ｃ−アルキルベタイン、および
イミダゾリニウムベタイン誘導体が、本発明の方法にお
いて同様の有用性を有することを予想し得る。これらの
分子の特性は、本明細書に記載のベタインの特性から考
えて以下で考察される。

Zimmer,R.E.（米国特許第3,560,393号）は、ホスフェ
ート基、ホスホネート基、ホスフィネート基、ならびに
アンモニウム基およびスルホニウム基を取り込んだ広範
な種々の逆性ベタインの合成を記載している。Kurosak
i,T.ら,Chem.Soc.Japan 11:1297−1301（1990）は、ア
ルキル２−ヒドロキシ−３−トリメチルアンモニオプロ
ピルホスフェート（C_n−AHTMAP）タイプの逆性ベタイン
を特徴付けている。C_n−AHTMAP化合物は、対応するベタ
インのCMC値と同様のCMC値、および0.368のＢ値を有す
ると理解され、これは、アルキル鎖長へのCMCの依存性
が、非イオン性界面活性剤よりもイオン性界面活性剤の
依存性に近いことを示唆する。しかし、Tsuboneら（Tsu
bone,K.ら,J.Am.Oil Chem.Soc.67:394−399（1990）お
よびTsubone,K.ら,J.Am.Oil Chem.Soc.67:394−399（19
90））の一連のホスホベタインのＢ値が、対応するイオ
ン性界面活性剤よりもさらにイオン性の特性を示したこ
とを思い出すべきである。不幸にも、逆性ベタインのpH
依存性に関するデータは存在しない。

アミンオキサイド（AO）は、ベタインの電荷構造に非
常に類似している；しかし、架橋は共有Ｎ−Ｏ結合に最
小化された。Tsujii,K.ら,Yukagaku 30:495−499（198
1）は、架橋間距離および塩溶／塩析挙動の関係の分析
において、C₁₈−AOを彼らの研究に含む。これらの著者
らは、C₁₈−AOの挙動がC₁₈−カルボキシメチルベタイン
の挙動と平行関係にあることを示す；しかし、クラフト
点はより上昇する。C₁₈−AOの塩析挙動（Tsujii,K.ら,Y
ukagaku 30:495−499（1981））とN,N,N−トリメチルオ
クタデシルアンモニウムクロライド（Tsujii,K.ら,J.Ph
ys.Chem.82:1610−1614（1978））の塩析挙動との比較
は、前者が対応する陽イオン性界面活性剤よりも、短い
架橋を有するベタインのように挙動することを示す。ベ
タイン様構造の全ての重要な双極子モーメント特性は、
最小とはいえアミンオキサイドにおいて機能的であると
推測し得る。Fumikatsu,T.ら,J.Phys.Chem.70:3437−34
41（1996）によるアミンオキサイドにおけるさらなる研
究は、このクラスの界面活性剤の相挙動がpH依存性であ
ることを示す。そしてHermann,K.W.J.Colloid Inter.Sc
i.22:352−359（1966）は、CMC値、Ｂ値、およびミセル
特性が、対応するイオン性界面活性剤よりもベタイン
に、緊密に関係することを示す。Hermamm,K.W.J.Colloi
d Inter.Sci.22:352−359（1966）のデータはさらに、
アミンオキサイドが対応するベタインよりも非イオン性
であることを示唆している。McCutcheon's,第１集:Emul
sifiers ＆ Detergents,North American Edition,MC Pu
blishing,Glen Rock,NJ,290頁は、別のカテゴリーの界
面活性剤としてアミンオキサイドを挙げている。

ｃ−アルキルベタインの特性に関する情報の大部分
は、Toriおよび共同研究者による一連の論文に見られる
（Tori,K.ら,Kolloid−Z.Z.Polymere 187:44−51（196
3）;Tori,K.ら,Kolloid−Z.Z.Polymere 188:47−52（19
63）;Tori,K.ら,Kolloid−Z.Z.Polymere 189:50−55（1
963）;Tori,K.ら,Kolloid−Z.Z.Polymere 191:42−48
（1963）；およびTori,K.ら,Kolloid−Z.Z.Polymere 19
1:48−52（1963））。ここで再び、これらの分子の相挙
動が表２で考察したｎ−アルキルベタインに類似してい
ることが理解される。例えば、予期されるように、塩析
挙動は、塩析がイオン性相同物で見られるほど劇的でな
い短い架橋ベタインの塩析挙動に良く似ている（Tori,
K.ら,Kolloid−Z.Z.Polymere 189:50−55（1963））。
さらに、ｃ−アルキルベタインのCMCは、温度の上昇に
伴って減少する（非イオン性界面活性剤の特徴となる挙
動）。さらに、Molyneux,P.ら,Trans.Faraday Soc.61:1
043−1052（1965）は、Tori,K.ら,Kolloid−Z.Z.Polyme
re 191:48−52（1963）のｃ−アルキルベタインのデー
タと比較するために、Beckett,A.H.ら,J.Pharm.Pharmac
al.15:422−431（1963）による同様のｎ−アルキルベタ
インのデータとともにそれらのCMCを、ｎ−アルキルベ
タインについてのアルキル鎖長のデータに対してプロッ
トした。そしてｎ−アルキルベタインおよびｃ−アルキ
ルベタインのＢ値は、予想されたように同一であること
を示している。ｃ−アルキルベタインの普及率は、ｎ−
アルキルベタインと同じ比率に達しないが、販売されて
いる:c−アルキルベタインのクラスで見られる多様性
は、ｎ−アルキルベタインのクラスの画分のみである。

臨床的アッセイ（例えば、水性の電解質を含有する溶
液）において機能的形態（例えば、ミセル形態で）の界
面活性剤を表す能力は、本発明の方法においてベタイン
の機能に重要な局面のようである。従って、電荷（例え
ば、COO^-対SO₃ ^-）および架橋構造（例えば、−CH₂−対
−（CH₂）_３−、または−CH₂CH（OH）CH₂−）の選択
が、生産的なベタイン挙動において重要な役割を果たす
ようである。しかし、塩溶（塩析）の現象は、界面活性
剤のクラフト点が系の温度よりも高い（低い）場合にの
み関連している。例えば、系の温度が40℃であり、そし
てSB−18のクラフト点が88℃である場合（Parris,N.ら,
J.Am.Oil Tech.Soc.53:97−100（1976））、10mM NaCl
の添加によりクラフト点は37.5℃になり（Tsujii,K.ら,
J.Phys.Chem.82:1610−1614（1978））、その場合SB−1
8は効果的に塩溶する。一方、系の温度が40℃であり、
そして例えば、ドデシル硫酸ナトリウムのクラフト点が
31.5℃である場合（Tartar,H.V.ら,J.Am.Chem.Soc.61:5
39−544（1939））、8mM NaClの添加により臨界温度は3
4℃になり（Tartar,H.V.ら,J.Phys.Chem.43:1173−1179
（1940））、ドデシル硫酸ナトリウムは技術的に塩析す
るが、ここに記載される例に関して効果はない。あるい
は、テトラデシル硫酸ナトリウムに類似の温度（analog
ous temperature）はそれぞれ、39.5℃（Tartar,H.V.
ら,J.Am.Chem.Soc.61:539−544（1939））および43℃
（Tarar,H.V.ら,J.Phys.Chem.43:1173−1179（1940））
である。明らかに、テトラデシル硫酸ナトリウムはこの
例に記載される条件下で機能性でない。Tartar,H.V.ら,
J.Am.Chem.Soc.61:539−544（1939）はまた、水中にお
けるオクタデシル硫酸ナトリウムの臨界温度を57℃とし
て報告する。この点から、本発明の方法において界面活
性剤としてSB−18を使用する場合、系の温度を37℃より
高く維持することの決定的な重要性は強調されるべきで
ある。それゆえ、処理が行われる温度が本方法に使用さ
れるSB−18様界面活性剤のクラフト点と相関するよう
に、入念な考慮がなされるべきである。

明らかな結論は、より長いアルキル鎖であるベタイン
の独特の特性が、より魅力的な溶解特性を有する臨床的
アッセイにおいて利用され得ることである。

可溶化剤としてのベタイン 可溶化とは、水性媒体において、不溶性またはわずか
に可溶性である分子を溶液にする作用である（Nakagaw
a,T.、Nonionic Detergents、（1967）558−603頁）。
理論的には、可溶化は、３つのモードのうちの１つの経
由して作用する。第１に、ソリュビリゼートはミセルの
内部部分中で隔離され得る（例えば、非極性である化合
物）。第２に、ある程度、極性と非極性との両方である
両親媒性分子は、他の界面活性剤分子と同様の様式でミ
セルと会合し得る（例えば、非極性部分はミセルのコア
中で隔離される一方、極性部分はミセルの表面で会合す
る）。第３のメカニズムは、有機媒体および水の両方に
不溶性である化合物で引き起こされる。ジメチルフタレ
ートは、典型的な例である（McBain,J.W.ら、J.Am.Che
m.Soc.70:3838−3840（1948））。このモデルにおいて
は、分子がミセルの表面で吸着されると提案されてい
る。従って、直感的には、可溶化の挙動は、界面活性剤
およびソリュビリゼートの両方の性質に依存する。

McBain,J.W.ら、J.Phys.Chem.55:655−662（1951）
は、ラウリル酸カリウム、ドデシルアミン塩酸塩、およ
びTriton X−100により、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサ
ン、シクロヘキセン、およびベンゼンの可溶化を比較
し、そしてイオン性界面活性剤がシクロヘキサンを４す
る一方で、Triton X−100はベンゼンを最も強く可溶化
すると結論した。予想されるように、イオン性界面活性
剤および非イオン性界面活性剤は、機能的レベルで分析
した場合、異なる挙動を示す。

Weer,J.G.ら、Langmuir 7:854−867（1991）は、陰イ
オン性（SDS:CAS 番号151−21−３）、陽イオン性（C
₁₂−トリメチルアンモニウムブロミド:CAS 番号1119−
94−４）、および非イオン性界面活性剤（C₁₂−エチレ
ンオキシド（C₁₂E₆）:CAS 番号3055−96−７）とC₁₂−
カルボキシメチルベタイン（CAS 番号683−10−３）お
よびC₁₂−スルホプロピルベタイン（CAS 番号14933−0
8−５）ベタインとを比較する、唯一の調節された可溶
化研究を提供している。「Oil Blue A」を、ソリュビリ
ゼートとして用いた。これらの筆者らは、可溶化能が以
下の順に増加したことを示している： 陰イオン性＜陽イオン性＜カルボキシベタイン＜スル
ホベタイン＜非イオン性。上記のMcBain,J.W.ら、.Phy
s.Chem.55:655−662（1951）の研究の議論に基づき、そ
してOil Blue Aが縮合した多環式炭化水素（アントラセ
ン誘導体:1,4−ビス（（１−メチルエチル）アミノ）−
9,10−アントラセンジオン（CAS 番号14233−37−
５））であることより、この序列（hierarchy）は予想
される。興味深いことに、スルホベタインは、カルボキ
シベタインより多くのOil Blue Aを可溶化した。これ
は、スルホベタインに関連するカルボキシベタインの挙
動を記述する上記の議論と一致する：カルボキシベタイ
ンは、スルホベタインと比較する場合、イオン性挙動の
傾向を示すようである；あるいはスルホベタインは、カ
ルボキシベタインと比較する場合、非イオン性界面活性
剤の傾向がある。

アルキル鎖長は可溶化能に直接関係する。例えば、C
₁₈−界面活性剤は、C₁₂−界面活性剤（他のクラスおけ
るC₁₂−界面活性剤でさえ）に関連して優れた可溶化特
性を有する:Weers,J.G.ら、Langmuir 7:854−867（199
1）はまた、「最大添加濃度」がアルキル鎖長の増加と
ともに指数関数的に増大することを示す。例えば、C₁₂
−エチレンオキシド（C₁₂E₆）は、C₁₂−スルホプロピル
ベタインよりわずかに多くのOil Blue Aを可溶化する一
方で、C₁₄−スルホプロピルベタインは、C₁₂−エチレン
オキシド（C₁₂E₆）よりも４〜５倍多いOil Blue Aを可
溶化する（Weers,J.G.ら、Langmuir 7:854−867（199
1））。

界面活性の概念は可溶化現象の研究内で固有である。
最適な界面活性は、表面活性化特性の複雑な混合を必要
とする（Harris,J.C.、Surfactant Science Series、第
１巻:Nonionic Detergents,（1964）683−732頁がこれ
らの性質を総説している）。界面活性の１つの重大な面
は、何かが一旦可溶化されれば、分散された形態で維持
されなければならないという考えである。

ベタインは優れた分散特性を有する（Weil,J.K.ら、
J.Am.Oil Chem.Soc.53:757−761（1976））。Fernley,
G.W.ら、J.Am.Oil Chem.Soc.55:98−103（1978）は、界
面活性剤としてのベタインの使用を総説し、そしてそれ
らを首尾よくアルキル−スルホネート界面活性剤と比較
している。しかし、本発明の方法におけるソリュビリゼ
ートは、ミコバクテリアの細胞壁内で会合する脂質およ
びリポタンパク質である。

ミコバクテリアの細胞壁構造（包括的な総説としてMc
Neil,M.R.ら、Res.Microbiol.142:451−463（1991）を
参照）は、主として脂質、リポタンパク質、およびミコ
ール酸から構成され、著しく厚くかつ疎水性を示す。ミ
コール酸に注目すれば、各ミコール酸はおよそC_14-20の
いくつかの鎖（Σ＝C₇₆−C₈₀）を有し、そして細胞壁ユ
ニットはジミコレートとして単離される（Noll,H.ら、B
iochim.Biophys.Acta 20:299−309（1956））。ミコー
ル酸の構造が与えられれば、第２のモードの可溶化が作
用し得ると予想される（例えば、非極性部分はミセルの
コア中で隔離される一方、極性部分はミセルの表面で会
合する）。上記の議論に基づけば、イオン性界面活性剤
は、非イオン性界面活性剤よりも優れたミコール酸の可
溶化剤であると予想される。従って、周辺部に会合した
細胞壁成分は、M.tuberculosisを分散させるために取り
除かれ、そして溶液内に保持されなければならない。Yo
ung,D.B.ら、Res.Microbiol.142:55−65（1991）は、Tr
iton X−100（CAS 番号9002−93−１）がM.tuberculos
isからリポタンパク質を除去し得ることを示した。しか
し、図３は、この界面活性剤が細菌を分散し得ないこと
を示唆している。従って、長鎖ベタインは、Triton X−
100よりも優れたミコール酸の可溶化剤であると予想さ
れる。ミコール酸の巨大な大きさおよび複雑な構造が与
えられれば、溶液中でそれらを保持することは、同様に
疑わしいと予想される。すなわち、SB−12は、SB−18と
比較した場合、比較的貧可溶化剤であることに加えて、
分散状態でミコール酸を保持することが可能であり得な
い。例えば、Bhatia,A.ら、Colloids and Surfaces 69:
277−292（1993）は、C₁₂、C₁₆、およびC₁₈−カルボキ
シメチルベタインのミセル構造を詳細に比較している。
C₁₂−ベタインミセルの流体力学的半径は19±２Åであ
るが、C₁₆−ベタインおよびC₁₈−ベタインの両者のミセ
ル構造は棒状であり、そして界面活性剤および電解質濃
度に依存して変化する:C₁₆−ベタインミセルの持続長さ
は、1.0M NaCl中、25℃で600±100Åであるが、C₁₈−ベ
タインミセルの持続長さは、0.01M NaCl中、40.3℃で14
00±200Åである。C₁₂−ベタインの延びた鎖長が23Åで
あること（Bhatia,A.ら、Colloids and Surfaces 69:27
7−292（1993））を考慮し、そしてミコール酸の親水性
をさらに考慮すれば、より短い鎖の界面活性剤が溶液中
で可溶化したミコール酸を保持し得ないという可能性に
より、M.tuberculosisを分散させるために、より短いSB
−系列の界面活性剤の無能性が説明される。

要約：界面活性剤としてのベタイン ベタインは、異なるクラスに位置するが、クラスがイ
オン性および非イオン性カテゴリーの間のどこかに位置
すると思われる特異的な特徴を有する。挙動は非常に複
雑であり、そして架橋構造および両性イオンのタイプに
依存する。いくつかの場合には、ベタインは、イオン性
界面活性剤のような挙動を示し、そして他の場合には、
ベタインは非イオン性界面活性剤のような挙動を示す。
従って、陰イオンおよび架橋長さの選択は、有用性にお
いて十分な効果を有する。

例えば、全体の溶解特性は、頭部基の親水性と直接関
連する。頭部基の親水性は、陰イオンに順次依存する。
種々の陰イオンの親水性は、SO₄ ^-≪SO₃ ^-＜CO₃ ^-の系列
（Laughlin,R.G.、Advances in Liquid Crystals、Brow
n,G.H.編、Academic Press、New York（1978）41−148
頁）に従うので、カルボキシベタインは、スルホトベタ
インよりも可溶性であり、それらは順次スルファトベタ
インよりも可溶性であると予想される。Nandakumar T.
N.ら、J.Oil Tech.Assoc.India 11:31−34（1979）およ
びWeers,J.G.ら、Langmuir 7:854−867（1991）のデー
タは、異なるアルキル鎖長を有するカルボキシベタイン
のクラフト温度と、同様の鎖長のスルホベタインとを比
較し、そしてこれがその場合であることを明確に示して
いる。スルホベタインがスルファトベタインと同様に比
較されるParris,N.ら、J.Am.Oil Tech.Soc.53:97−100
（1976）のデータの検証により、この結論が確認され
る。架橋長さのデータを含めることにより、１つのメチ
レン架橋を有するこれらのベタインは塩析され、イオン
性挙動に類似しているが、より長い架橋を有するベタイ
ンは塩溶されることが示唆される。例えば、カルボキシ
プロピルベタインは、同様のアルキル鎖長のカルボキシ
メチルベタインよりも可溶性であると予想される。再
度、Tsujii,K.ら、Yukakagu 30:495−499（1981）は、
前者が塩溶されるが、後者は塩析されることを示してい
る。架橋への基の導入はベタインの溶解性を妨害するよ
うであり、それ故魅力的な特徴を危うくさせる：ヒドロ
キシプロピル、および「イソ」ベタインは、あまり所望
の特性を有さない（Parris,N.ら、J.Am.Oil Chem.Soc.5
3:60−63（1976））。より短い架橋は、より広い操作可
能なpH範囲を有する（Weers,J.G.ら、Langmuir 7:854−
867（1991））。カルボキシベタインおよびスルホベタ
インは、非イオン性界面活性剤のＢ−値と同様のＢ−値
を有するが、ホスホベタインのＢ−値はイオン性界面活
性剤と同様である。スルファトベタインはより高い共溶
温度を示すが、カルボキシベタインのミセルの分子量お
よび凝集数は、温度の上昇に伴って実際には減少する；
イオン性挙動に類似する。しかし、ある点に関して、ア
ルキル構造、全ての界面活性剤は同一の挙動を示すと予
想される。例えば、アルキル鎖における構造的変更の導
入により、それらが１つまたはいくつかの２重結合、ヒ
ドロキシル、エステル、アミド、またはエーテルのよう
な極性基、あるいはシクロプロパン環の導入のような他
の改変であれ、すべてが特性において合理的な変化を生
じると予想される。ベタイン様構造の公知の物理的特性
を組み合わせて、構造が広範にする場合、本発明の方法
における使用に対して理想的な特性を有するベタインを
設計することが可能となる。例えば、カルボキシベタイ
ンは、より大きい割合のpH依存性をうけるが、より可溶
性のベタインを生成し、従ってより長いアルキル鎖の使
用を可能にする。さらに、イオン性挙動を示す傾向があ
るカルボキシベタインは、ベタインのうちミコール酸の
より優れた可溶化剤であると予想される。架橋は４〜５
Åより長くなくてはならず、従って、プロピル基が最小
である。Hodge,D.J.ら、Langmuir 7:878−884（1991）
は、20℃のクラフト点を有するC₂₀−カルボキシヘキシ
ルベタインを報告している。C₁₈−カルボキシプロピル
ベタイン（CAS 番号78195−27−４）が最適な特性を有
すると予想される。

要約すれば、長鎖のアルキルはM.tutberculosisを分
散させるために必要であり、そしてこれらの分子は、生
理学的に適切な条件（例えば、約100−150mMの電解質濃
度）の環境で機能しなければならない。その点で、ベタ
インは本発明の方法におけるイオン性界面活性剤を上回
る明らかな利点がある：ベタインは塩溶され、そしてイ
オン性界面活性剤は塩析される。非イオン性界面活性剤
を上回るベタインの利点について説明することはさらに
推測的ではあるが、一般的にベタインは、非イオン性界
面活性剤よりも、コード形成に関与するミコール酸およ
び他の脂質のより優れた可溶化剤であるということが示
唆される。

これらの議論は実際、なぜSB−18が凝集アッセイにお
いて機能する唯一の界面活性剤であるのかの説明を示唆
する一方で、SB−18の２方法的（bimodal）作用、すな
わち、なぜSB−18はまた、M.aviumの回収を容易にする
か（ここで、凝集は問題でない）を完全に説明しない。
これについては、以下で議論する。

ミコバクテリアの浮力（buoyancy） ミコバクテリアによる脂質の合成は、種特異的である
多くの特徴とともに、非常に複雑であり、かつ種々の事
象がある（再検討のため、Bloch,K.Adv.Enzymol.45:1−
84（1977）、Minnikin,D.E.、The Biology of the Myco
bacteria、C.Ratledgeら編、第１巻、Academic Press、
New York、1982、95−184頁;Ratledge,C.、The Biology
of the Mycobacteria、C.Ratledgeら編、第１巻、Acad
emic Press、New York、1982、53−92頁、およびTakaya
ma,K.ら、The Mycobacteria a source book,part A.、
G.P.Kubicaら編、Marcel Dekker、Inc.、New York、198
4、315−344頁参照のこと）。しかし、一般に、細胞壁
の約60％は脂質であり、そして細胞壁における脂質の約
50％はミコール酸の形態で存在する（Joklik,W.K.ら、Z
insser Microbiology、20版、Appelton ＆ Lange、Norw
alk、CT、1992、81頁および499頁）。

ミコール酸は、このクラスの微生物において特異的な
特徴を提供する（Ratledge、The Biology of the Mycob
acteria、C.Ratledgeら編、第１巻、Academic Press、N
ew York、1982、53−92頁、および特にミコール酸合成
の詳細な記載について65−84頁を参照）。

ミコール酸合成の結果は、ミコール酸を合成する結果
としてインビボで多量のCO₂を発生することである。例
えば、80個の炭素原子を含むマロニルCoA経路によるミ
コール酸残基の合成は、約80個のCO₂分子を生成する。

いくつかの関連する（pertinent）点がある。第１
に、ミコバクテリアの細胞壁は、そのインビトロ対応物
より厚い（Rastogi,N.ら、Antimicrob.Agents Chemothe
r.20:666−677（1981））。第２に、（オレイン酸、Twe
en 80またはBSAの非存在下で増殖させた）ミコバクテリ
ア細胞の乾燥重量のほぼ18％の脂質であり（Stinson,M.
W.ら、Am.Rev.Resp.Dis.104:717−727（1971））、およ
びインビボで細胞壁の約60％は複合脂質であり、そして
この50％はミコール酸である（Joklik,W.K.ら、Zinsser
Microbilogy、20版、Appelton ＆ Lange、Norwalk、C
T、1992、81頁、499頁および503頁）；従って、ミコバ
クテリアは、細胞壁合成の間に多量のCO₂を生成する。
本質的に、オレイン酸、Tween 80およびBSAを含有する
富化培地中での増殖の効果の効果は脂質合成における減
少であり、そしてそれ故に、CO₂生成における実質的な
減少である。最後に、遠心場（centrifugal field）に
おいて未処置細胞が浮遊性である事実は、トラップされ
たガスを含むいかなる浮力理論（buoyancy theory）も
可能性として伝統的な「ガス小胞（gas vacuole）」を
排除することを示唆する（Walsby,A.E.Bact.Rev.36:1−
32（1972））。このことにより、本発明者らは、浮力を
減少または排除するために、生物の脱気のみをし得ると
いう意見に至った。例えば、下記のように、減圧下、ミ
コバクテリア（コード因子（cord factor）融解点（M
P）＝43℃〜45℃（Noll,H.ら、Biochim.Biophys.Acta 2
0:299−309（1956））を少し暖めることにより、浮力に
影響するに十分なトラップされたCO₂を多くを除去する
ことを可能にした。

MAC複合体生物の調製 MAC複合体の微生物のような特定の微生物について、
さらなるプロセス工程（上昇された温度（例えば40℃）
で、約600mmHg減圧下での十分な時間のインキュベーシ
ョン）が必要である。効果がほとんど即時であるような
分散の目的のための界面活性剤含有洗浄溶液に対してMA
C生物サンプルを曝すための最少時間はないが、一般的
に60分が好ましく、浮力を相殺し得る界面活性剤の蓄積
を可能にする。サンプルを60分を超えて洗浄溶液に曝す
ことはぎりぎりの利点に過ぎないと考えられる。このよ
うな減圧脱気工程のための時間は、少なくとも20分であ
るべきで、そして60分が好ましい。数時間までのインキ
ュベーションは、SB−18様界面活性剤を使用する場合、
60分のインキュベーションより僅かな改善のみを提供す
る。しかし、数時間のインキュベーションは、ほとんど
の界面活性剤で使用され得る。MAC生物の界面活性剤含
有洗浄溶液への曝露は、脱気工程と同時であり得るが、
この実施態様を用いて実用上の安全事象であり得る。脱
気工程の温度は、30℃と50℃との間であるべきで、好ま
しくは40℃〜42℃である。30℃を下回る温度は、MAC生
物上のワックス−コート（waxy−coat）の軟化を恐らく
促進せず;50℃を超える温度は、生物の溶解を明らかに
促進する。従って、実行可能性は本明細書に記載する方
法の主要な利点であるので、そしてさらにこの方法は細
菌細胞が無傷（intact）である場合のみ、遠心分離によ
る回収の効率を改善することに関して利点を与えるた
め、プロセッシング温度は、本明細書に記載する微生物
のほとんどについて50℃を超えるべきでなく、しかし、
そのような温度で検出する特定の種が溶解しない場合、
50℃を超える温度が使用され得る。しかし、これは所望
の結果を提供するために利用され得る。例えば、定義さ
れたプロセッシング条件下で特定の微生物を溶解するこ
とが公知であるが、同一の定義されたプロセッシング条
件下で第２の種の微生物を溶解しないことは公知でない
温度が選択され得る。このような例において、本発明の
方法は、非溶解微生物について選択的に強化され得る。

以下の説明に固執するわけではないが、MTB複合生物
とMAC複合生物との間で観測される相違は、それらのそ
れぞれの増殖特性によると考えられる。MAC複合生物
（これらは単細胞として主に増殖する）において、SB−
18様界面活性剤は、３つの効果を有する：（１）界面活
性剤のほとんど見られる一般的な表面張力破壊効果、
（２）MTB複合生物で見られる分散効果（あまり肝要で
はないが）、および（３）膜を通って輸送されそして細
胞内に蓄積する能力。Weir,M.P.ら、Am.Rev.Res.Dis.10
6:450−457（1972）は、ミコバクテリアは脂質、例えば
オレイン酸を能動的に蓄積することに非常に効率的であ
ることを示した。Schaefer,W.B.ら、J.Bacteriol.90:14
38−1447（1965）は、脂質蓄積は２時間以内で観測可能
であり、そして24時間以内に劇的な類脂質濃度（lipoid
al bodies）になることを示した。脂質蓄積の結果は、
従来持たれていた考え（Silverstolpe,L.、Nord.Med.40
/48:2220−2222（1948）;Davis,B.D.ら、Microbiolog
y、Harper ＆ Row、New York（1973）、847頁）に対比
して、天然の浮力を部分的に中和するに十分な有意な方
法で細胞の部分比容積を変化させ得る。

以下の説明に固執するわけではないが、減圧脱気工程
は、CO₂（これは微生物の天然の代謝の結果として形成
される）のような、トラップされたガス、しかしある程
度はその外側のワックス状（waxy）細胞壁内に捕捉され
たガスを効率的に除去すると考えられる。最後の理論
は、回収における限界だが識別可能な改善が、添加した
界面活性剤の非存在下で観測され、そして生物の大規模
に脱気する場合、任意の界面活性剤を利用し得るという
観測に基づく。脱気に用いる界面活性剤を組み合わすこ
とによる浮力の克服が、本明細書に記載されるように、
遠心分離のような重力法による集積をさらに促進するこ
とが見られた。

生物を徹底的に脱気する場合、SB−18様、棒状または
ほぼオクタデシル以外である界面活性剤を使用し得ると
いう事実は、MAC複合生物の天然の浮力がほとんどトラ
ップされたガスに由来するように示唆する。この説明に
固執するわけではないが、MAC複合生物の天然の浮力
は、表面張力が浮遊を可能にする唯一の残される要素で
あることを完全に排除すると考えられる。界面活性剤の
ほとんどは表面張力緩和剤であるため、多くの付加的な
界面活性剤は遠心分離による回収を余儀なく改善させ得
る。しかし、減圧下での延長されたインキュベーション
は、生物の生存性を危険にさらし得る。

減圧圧力は、便宜上600mmHgであるが、この範囲内で
経済的な真空ポンプの一般的な商業的入手可能に負う。
しかし、当業者は、任意の圧力または、オクタデシル様
成分を含有する界面活性剤に対する微生物の感受性を示
す所望の結果を達成するのに十分である方法を使用し得
る。SB−18のような界面活性剤での洗浄工程の後、そし
て、必要であれば、脱気工程の後、サンプル中の微生物
を当該分野で公知の方法（例えば、遠心分離のような方
法）により集め、そして必要であれば、増幅による核酸
検出のようなさらなる分析のため溶解する。検出のすべ
ての方法が微生物の溶解を必要とするわけではない。例
えば、培養による検出またはイムノアッセイを用いる膜
抗原の検出は溶解を必要としない。なぜなら、本発明の
方法は溶解しないので、外膜にミコール酸構造を有する
微生物そして特にミコバクテリアは、本発明のいずれか
の界面活性剤での処置後、増幅または培養のようないず
れかの技術により検出され得る。

界面活性剤の蓄積 以下の説明に固執するわけではないが、界面活性剤の
蓄積は、SB−18様活性の１つの局面を説明する。脱気仮
説の基礎を繰り返すために、Tween 80（CAS 番号9005
−65−６）／オレイン酸（CAS 番号112−80−１）の存
在下におけるミコバクテリアの培養が液内増殖（submer
ged growth）を引き起こし（Dubos,R.J.、Exp.Biol.Me
d.58:361−362（1945））、そしてTween 80/オレフイン
酸の存在下におけるミコバクテリアの増殖が脂質体の形
成を引き起こす場合（Schaefer.W.B.ら、J.Bacteriol.9
0:1438−1447（1965））、従来の学説（Silverstolpe,
L.、Nord.Med.40/48:220−2222（1948）;Davis,B.D.
ら、Microbiology、Harper ＆ Row、New York（197
3）、847頁）と対比して、脂質体の形成が、液内増殖と
関連し、そして恐らくはその原因にさえなると結論され
得る。また、この結論は、これらの生物の自然浮力の源
についての説明が、今日まで、認識されなかったという
ことにちがいない。ベタイン（Tween 80/オレイン酸に
対するアナログ）は、それらが細胞内部に隔離されるよ
うに細胞に現れ、そしてそうしながら細胞の部分比容積
を変化させ、これらの生物の自然浮力を部分的に相殺
し、これにより遠心分離による回収を増強する。ベタイ
ンが、界面活性剤（Gomi,T、JP 8895298 A2;JP 639529
8）、抗腐食剤（Nemcova,J.ら、CS 202494 B）、および
歯磨き調製物（Oshino,K.ら、JP 92134025 A2;JP 04134
025）における市販の抗菌処方物中の成分として長く使
用されてきたという事実は、実際にベタインがまさに微
生物細胞内に進入することを示唆する。Mycobacterium
cheloneiの細胞壁が、E.coliの細胞壁より1,000倍から1
0,000倍透過性が低いという事実（Jarlier,V.ら、J.Bac
teriol.172:1418−1423（1990））は、ベタインの特性
のいくつかの局面がこれらの化合物を優先的に隔離させ
ることを示唆する。

分子が微生物細胞内に進入するために、分子は最初に
細胞壁（外膜）を、次いで細胞膜（内膜）を通過しなけ
ればならない。微生物細胞の透過性は、Nikaido,H.ら、
Microbiol.Rev.49:1−32（1985）により総説され、そし
てミコバクテリア細胞の透過性は、Connell,N.D.らによ
り、Tuberculosis:Pathogenesis,Protection,and Contr
ol、B.R.Bloom,編、American Society for Microbiolog
y、Washington,D.C.（1994）333−352頁に総説される。
一般的に、分子が外膜を通過し得る３つの方法がある。
第１は、ポーリン（porin）を通常含む「親水性経路」
を通じてである；第２は、疎水性領域全体への核酸を含
む通常「疎水性経路」を介してである；そして第３は、
「自己促進経路」は、または分子自身の進入を可能にす
る、薬剤による細胞壁の崩壊をいう（Hancock,R.E.W.An
n.Rev.Microbiol.38:237−264（1984）から要約され
る）。細胞壁を一旦通過すると、キャリア媒介（carrie
r−mediated）輸送が、内膜を通過するための最も一般
的な手段である。キャリア媒介輸送の２つの一般的なク
ラスは、「促進拡散」および「能動輸送」である。両者
は特定のタンパク質複合体の使用を包含し、ある程度の
基質特異性、および、その結果、Michaelis−Menten特
性を有する。あるものはエネルギー依存性であり、一
方、その他は電気化学的勾配に依存する。要約すれば、
ミコバクテリアの細胞壁は、細胞外媒体との分子の交換
についていくつかの機構を提供しなければならない障壁
の極端な例を示す。

本発明の方法の内容において、議論される時間枠に留
意することは避けられないことである。例えば、特定の
化合物の殺菌または静菌活性を調査するたいていの研究
は、長期間（例えば、数日）、当該分子の存在下で細菌
を増殖させる。この期間にわたる増殖を記録し、そして
効力を報告した。本発明の方法において、議論される時
間枠は数時間に限定される。従って、疎水性経路または
自己促進経路のような機構が包含されるのは合理的と思
われない。

従って、外膜を横切るベタインの通過は、主として親
水性経路（例えば、ポーリン）を使用するべきである。
ポーリンは、「膜を通過して小分子の拡散を可能にする
非特異的で、開かれ、水で満たされたチャネルを産生す
るタンパク質である。」（Connell,N.D.ら、Tuberculos
is:Pathogenesis,Protection,and Control、B.R.Bloom,
編、American Society for Microbiology、Washington,
D.C.（1994）336頁から引用）。Trias,J.V.ら、Science
258:1479−1481（1992）は、M.chelonaeのポーリン
が、約2.2nmの直径および2,000ダルトンと3,000ダルト
ンとの間の排除限界を有する孔を産生する59KDタンパク
質であることを報告する。SB−18（CAS 番号13177−41
−８）の分子量は419.7ダルトンである。さらに、Tsubo
ne,K.、J.Am.Oil Chem.Soc.67:149−153（1990）および
Tsubone,K.、J.Am.Oil Chem.Soc.67:394−399（1990）
は、いくつかのＮ−アルキルホスホエチルベタイン、お
よびいくつかの２−ヒドロキシアルキル−ホスホエチル
ベタインそれぞれの物理的パラメーターを研究し、そし
てC₁₆−ベタイン対して１分子当たりの占有面積がそれ
ぞれ、0.475nm²、および0.761nm²であると報告する。従
って、ベタイン頭部基の断面直径はそれぞれ、約7.8
Å、および9.8Åである。Bhatia,A.ら、Colloids Surf.
69:277−292（1993）は、C₁₈−カルボキシベタイン（CA
S 番号820−66−６）の頭部基容積を180Å^３とした
が、これはこの頭部基について7.7Åの直径を与える。
比較のため、SDS（CAS 番号151−21−３）の頭部基直
径は7.5Åのオーダーにある（Shinoda,K.J.Phys.Chem.5
9:432−435（1955））。非イオン性界面活性剤、例えば
Tween 80（オレイルポリオキシエチレン（ｎ＝20）ソル
ビタン:CAS 番号9005−65−６）は、極端により大きな
頭部基直径を有することが期待され、従って、容易にポ
ーリンを通過することが立体的に妨げられ得る。この支
持において、Wayne,L.G.ら、Am.Rev.Resp.Dis.90:588−
597（1964）は、特定のミコバクテリアのみがTweenを加
水分解する能力を有し、そしてTweenを加水分解し得な
いミコバクテリアにおいては、増殖はこの界面活性剤の
添加により刺激されないことを示す。この示唆は、頭部
基は同化前に取り除かれなければならないということで
ある。

回収を改善するために、特定の非イオン性界面活性剤
を使用することが、本明細書中に示される。例えば、Tw
een 80の頭部基はポーリンを通過するには嵩高いが、他
の界面活性剤（例えば、本発明の方法において有用であ
る脂肪酸の線状ポリオキシエチレンエーテル（例えば、
「Brij」化合物））は、細胞内への通過を可能にし、そ
して本発明の方法において機能し得るようになると考え
られている。Hsiao,L.ら、J.Phys.Chem.60:657−660（1
956）は、ポリオキシエチレンフェニルエーテルの１分
子当たりの面積が、ベタイン（例えば、C₉−ベタイン
（平均して9.5POEユニットを有する）、および55Å^２の
面積）の面積と同じオーダーである。Brij 96（オレイ
ル−ポリオキシエチレンエーテル（Ｃ_18:1E₁₀）:CAS
番号9004−98−２）は、M.tuberculosisの凝固を分散さ
せることにおいて相対的に有効でないが、浮力の相殺に
関してSB−18様活性を有することが本明細書中に示され
る。以下の説明に固執するわけではないが、Brij 96の
ような非イオン性界面活性剤は、その相同の化学的形状
の結果として本発明の方法において機能する。すなわ
ち、Brij 96は、同一の「棒状」特性を有し、そして細
胞内への進入を立体的に妨げないという点においてSB−
18様界面活性剤と同様である。従って、本明細書中で使
用するように、「棒状」は、本発明の方法において脱気
の存在下において、SB−18様活性を現す非イオン性界面
活性剤を示す。棒状界面活性剤は、同様の「軸比」を有
する。軸比は、the McGraw−Hill Dictionary of Scien
tific and Technical Terms、５版、Parker,S.P.編、Mc
Graw−Hill、Washington,D.C.（1994）、168頁により定
義されるように、「短軸に対する長軸の比....」であ
る。例えば、Bhatia,A.ら、Colloids and Surfaces 69:
277−292（1993）は、C₁₂−カルボキシメチルベタイン
の長鎖長（例えば、長軸）を23Åとし、そしてそのカル
ボキシメチルベタインの頭部基容積を180Å^３とする。
頭部基を球と仮定すれば、頭部基の直径（例えば、短
軸）は約7.7Åとなり得る。定義により、長軸は、短軸
と直交する。従って、C₁₂−カルボキシメチルベタイン
（CAS 番号683−10−３）の軸比は、約３（23÷7.7＝
2.99）である。Tsubone,K.、J.Am.Oil Chem.Soc.67:394
−399（1990）は、２−ヒドロキシアルキルホスホエチ
ルベタインについて占有頭部基面積を0.761nm²と報告す
る。これらのベタインの短軸は9.8Åであり、C₁₂−ベタ
イン（CAS 番号124591−53−３）の軸比は2.3の値であ
る。従って、ベタインの軸比は、1.5（長軸（R₁）に８
炭素原子を含有する界面活性剤について）から約６（疎
水性ドメインが22炭素原子に接近するベタインについ
て）の範囲にあることが期待される。棒状界面活性剤
は、アルキル鎖長が８個〜22個の炭素原子、好ましくは
12個〜20個の炭素原子、そして最も好ましくは16個〜18
個の炭素原子を有するすべての電気的に中性の界面活性
剤を包含する。これらは、脱気の非存在においてSB−18
様活性を示す。

ほぼオクタデシルの界面活性剤 いくつかの界面活性剤はMTB集塊を分散させる能力を
有さないが、生物を一旦脱気すると、遠心分離によるMA
Cの回収をさらに改善し得ることを見出した。例えば、
上記の減圧処理後、多くの付加的な界面活性剤、特に構
造においてほぼオクタデシルである界面活性剤を使用し
得る。すなわち、SB−16およびSB−18の両者は、脱気
後、回収を容易にすることにおいてさらに効果的にな
る。例えば、トリメチルオクタデシル−アンモニウムブ
ロミド（TMA−18:CAS 番号1120−02−１）およびベン
ジルジメチルオクタデシルアンモニウムクロリド（Benz
DMA−18）は、脱気を実施した後、本発明の方法を用い
る集積を改善することにおいて、ある程度の効力を有す
ると現在認められている。Tween 80（CAS 番号9005−6
5−６）およびSpan 80（CAS 番号1338−43−８）のよ
うな非イオン性のオクタデシル界面活性剤はまた、脱気
後、同一現象を示すことが認められた。捕捉されたガス
が一旦除去されると、ほぼオクタデシルの分子は、上記
のような細胞の部分比容積を変化させることにより採取
を容易にする。

従って、本明細書中で使用される「ほぼオクタデシ
ル」は、SB−18様オクタデシル部分と類似のオクタデシ
ル様部分を有する界面活性剤分子を示し、かつ効果的で
あるために両性イオン機能の存在を必要としない。ほぼ
オクタデシル界面活性剤は、MAC複合体生物に適用され
かつSB−18様界面活性剤を含有する場合、本発明の方法
において有用である。すべてのほぼオクタデシルの界面
活性剤はSB−18様界面活性剤ではないが、すべてのSB−
18様界面活性剤はほぼオクタデシルの界面活性剤であ
る。SB−18様界面活性剤は、MTB複合体に適用される場
合（すなわち、この場合脱気を必要としない）、本発明
の方法において有用な界面活性剤である。

陰イオン性の界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS:CAS 番号151−21−３）またはオクタデシ
ル硫酸ナトリウム（SOS）:CAS 番号1120−04−３）、
または陽イオン性のアルキル−トリメチルアンモニウム
塩（例えば、TMA−12（CAS 番号1119−94−４）および
TMA−18（CAS 番号1120−02−１）がSB−18の様式と同
様の様式で作用できないことは、以下のように説明され
得る。長鎖のイオン性界面活性剤のクラフト点は、SOS
およびTMA−18の微結晶様形態化を引き起こし、従っ
て、迅速な取り込みが不可能である。これは、Weir,M.
P.ら、Amer.Rev.Res.Dis.106:450−457（1972）の方法
を調査することにより支持され得る:BSAを用いて、オレ
イン酸（CAS 番号112−80−１）を乳化して使用した。
乳化により、取り込みについて受容可能な様式（例え
ば、溶液において）でのオレイン酸の存在を可能とす
る。溶液中に存在する陰イオン性界面活性剤の除外に対
する説明は、ミコバクテリアのポーリンが陽イオン選択
的であるという事実に基づく。すなわち、チャンネル
は、ポーリンの出入り口においていくつかの空間的に配
置された陰イオン性のアミノ酸を有し、陰イオン性化合
物を除外する（Trias,J.V.ら、Science 258:1479−1481
（1992）；およびTrias,J.V.ら、J.Biol.Chem.268:6234
−6240（1993））。Jarlier,V.ら、J.Bacteriol.172:14
18−1423（1990）は、セファロスポリンが親水性経路を
使用し、細胞内に進入すること、そしてさらに、「実効
電荷を有さない」セファロスポリンより、陰イオン性セ
ファロスポリンは細胞内にはるかにに遅く拡散すること
を示した。外膜を通過する陽イオン性界面活性剤の移動
を妨げる障害は、Trias,J.V.ら、J.Biol.Chem.268:6234
−6240（1993）のポーリンが電位依存的であるという事
実に起因すると思われる。陽イオン性界面活性剤の蓄積
はチャンネルを閉ざすだけである。

外膜を一旦通過すれば、ベタインは能動輸送により内
膜を通過する。Schaefer,W.B.ら、J.Bacteriol.90:1438
−1447（1965）はM.kansasiiを研究し、そしてWeir,M.
P.ら、Amer.Rev.Res.Dis.106:450−457（1972）はM.sme
gmatisを研究し、そしてオレイン酸塩の取り込みは迅速
でありそしてエネルギー依存的であることを示してい
る。さらに、Wier,M.P.ら、Amer.Rev.Res.Dis.106:450
−457（1972）は、関与するメカニズムはある程度立体
特異的であることをさらに示している。McCarthy,C.Inf
ect.Immun.4:199−204（1971）は、M.aviumを研究し、
そして78nmolのパルミチン酸（CAS 番号57−10−３）
は30分で1mgの細胞により隔離され得ることを報告して
いる。しかし、種特異的な特質がある。Schaefer.W.B.
ら、J.Bacteriol.90:1438−1447（1965）は、MTB複合体
生物は、「...Tweenまたはオレイン酸を有する培地にお
いて同一の著しい形態学的または濁度変化を示さなかっ
た」と述べている。Cella,J.A.ら、J.Am.Chem.Soc.74:2
061−2062（1952）は、C₁₆−C₁₈の四級アンモニウム塩
は最高の殺菌活性を提供したと結論し、そしてTsubone,
K.ら、J.Pharm.Sci.80:441−444（1991）は、C₁₆−ホス
ホエチルベタイン（CAS 番号126712−88−７）は上記
活性に対して理想的な長さであることを明確に示す（C
₁₈ホモログ（homologue）はアッセイ条件下では不明瞭
であると報告した）。両著者は、より短い鎖の化合物は
抗菌作用が比較的効果的でないことを示す。Tsubone,K.
ら、J.Pharm.Sci.80:441−444（1991）はまた、活性に
おける極端な種依存性を示している。結論は、脂質輸送
はより長い鎖の脂質に対してはるかに高い比活性を示す
ということであり、そしてこの活性は種を越えて広い変
化を示す。それとは関係なく、ベタインが細胞内に進入
するのを阻害する大きな障害はない。本発明の方法にお
いてベタインが有する利点は、ベタインは構造上理想的
な様式で細胞に提供されることである。

この経路がSB−18様活性に関与する場合、付加的なpH
および温度依存性のファクターが存在し得る。例えば、
McCarthy,C.Infect.Immun.4:199−204（1971）は、M.av
iumの脂質輸送がpH依存性および温度依存性の両方であ
ることを示す：輸送は、38℃およびpH6.5で最適であ
る。プロセッシングの際にpHを変化させ、そして温度を
低くすることにより、SB−18の化学的構造および相構造
のそれぞれに関して、負の（negative）結果を有する一
方で、これらのパラメーターはまた、SB−18様界面活性
剤を蓄積する能力を制限し得る。例えば、Tsujii,K.
ら、J.Phys.Chem.82:1610−1614（1978）は、10mM NaCl
中のSBP−18は、ミセル構造を維持するためには37.5℃
以上を保たなければならないことを示す。Tsubone,K.
ら、J.Am.Oil Chem.Soc.67:149−153（1990）は、C_n−
ホスホエチルベタインの低いpKaは4.7から4.9の範囲に
あり、そして高いpK_aは8.8から9.8の範囲にある。Weer
s,J.G.ら、Langmuir 7:854−867（1991）は、広範囲のC
₁₂−カルボキシベタインの低いpK_a値を決定し、架橋構
造の依存性を示している。これらのpH範囲内でアッセイ
条件を保護することにより、ベタインが界面活性剤とし
て機能することを可能にする（例えば、ミセル形態を維
持し、それによりコード形成に関与するミコール酸およ
び脂質の安定化を可能にする）。穏和な酸性緩衝液（例
えば、pH5.7）を利用する実験は、識別可能な程度にM.t
uberculosisの集積を阻害しなかった。しかし、この結
果は、種特異的であり得る。従って、広範囲の生物の検
出のために、本発明の方法におけるベタインの使用から
最大の利益を得るために、pHを5.0以上で、しかし8.0を
大きく超えないように維持しなければならない。しかし
SB−18様界面活性剤がSB−18様活性を呈し得る任意のpH
が適用可能である。

本明細書で記載するアッセイにおいて、短鎖の界面活
性剤が減少した活性を示す理由は、アルキル鎖長と抗菌
活性との間に関係が存在するという事実に実際上、起因
し得る。Tsubone,K.J.Pharm.Sci.80:441−444（1991）
の最も興味深い発見は、試験した９つの生物（カビおよ
び細菌の両方）の中で、Propionibacterium acnesおよ
びStreptococcus mutansは、基としてのホスホベタイン
により飛び抜けて影響を受けるということである。９つ
の生物の中で、P.acnesはミコバクテリアに最も近縁で
ある。実際、正方向プライマー配列（TBv2−119［配列
番号:1］）は、16S rRNA遺伝子配列のこの領域において
P.acnesと完全に相同的である。結論は、ベタインは効
果的に隔離されるか、またはその構造は極めて強い効力
を有するかのいずれか、または両方である。

本発明を一般的に記載したが、同じことは、以下の実
施例を引用することでさらに容易に理解され得る。実施
例は例示として提供され、そして本発明を限定すること
を意図されてない。

実施例 実施例１ 材料および方法 I. SB−18洗浄緩衝液の調製 SB−18洗浄溶液（500mlあたり） A.25mlの20X SB−18塩（下記を参照）を、約475mlのH₂O
（または洗浄緩衝液100mlにつき5ml）に加え、そしてオ
ートクレーブする（20分／液サイクル）。

B.オートクレーブからボトルを取り除き、直ちに5mlの1
00X SB−18（または洗浄緩衝液100mlにつき1mlの100X S
B−18）を加える。攪拌（swirling）によって混合し、4
0℃で保持する。

C.ボトルを、使用時まで40℃で保管する（ボトルは、使
用までに数日間保管することが可能である）。

D.場合により：使用直前に、1.25M DTTを室温に戻し、
そしてSB−18洗浄溶液500mlにつき2mlの1.25M DTTを加
える（最終濃度:5mM、すなわち洗浄緩衝液100mlにつき4
00μｌの1.25M DTT）。攪拌によってよく混合する。DTT
が添加時に冷たくないことが重要である。注意：沈殿が
存在する場合は用いないこと。

E.下記の実施例で説明するように使用する。

F.使用後、残存含有物を廃棄する。

この手順中の任意の時点において、洗浄緩衝液に沈殿
が存在する場合は、用いてはならない。さらに、溶液
は、使用前および使用中、常に暖かく保たなければなら
ない。これらの条件下においけるSB−18のクラフト温度
は、約37℃である（Tsuji,K.ら、Jour.Phys.Chem.82:16
10−1614（1978））。それ故、結晶化を防ぎかつ安定し
たミセル形成を行うため、溶液はこの温度より高く保た
れなければならない。

II. SB−18洗浄緩衝液成分 本レシピにより、10リットルの洗浄緩衝液が得られ
る。これは、約400の試料を各25mlでプロセスするため
に十分の量である。本明細書の以下の実施例において
は、下記に定義する緩衝液を用いる。しかし、実施例９
および12に説明するように、この緩衝液を、使用される
特定のSB−18様界面活性剤（実施例9:図10）および特定
の所望のプロセッシング手順（実施例12:表11）に適合
するように、改変してもよい。

滅菌濾過し、２つの100mlの画分にアリコートにす
る。室温で保存する。この溶液は、週単位または月単位
で作製し、保存し得る。

＊注：フェニルアラニンのようなアミノ酸が、必要に応
じて使用される。しかし、アミノ酸は、pH7.0でのみオ
ートクレーブすべきである。従って、アミノ酸を使用す
る場合は、20XストックのpHをpH7.0に下げるべきであ
る。

（Ｂ）100X SB−18ストック溶液 （都合の良いように、最初にSB−18をイソプロパノー
ル：水＝1:1中に溶解することにより加えてもよい） A.イソプロパノール：水（1:1。下記参照）溶液50ml
を、目盛り付きシリンダーに移す。

B.3.358グラムのSB−18（Ｎ−オクタデシル−N,N−ジメ
チル−３−アンモニオ−１−プロパン スルホネート;S
igmaカタログNo.O8004）を秤量し、シリンダーに入れ、
そして穏やかにボルテックスにより攪拌する。溶液を約
20分間保持し、約５分間おきに穏やかにボルテックスに
より攪拌する。

C.イソプロパノール：水の溶液を約75mlになるように更
に添加し、穏やかにボルテックスにより攪拌する。SB−
18が溶解したら（合計約30分）、最終容積を100mlに
し、反転（inversion）によって混合する。

D.溶液を、滅菌されたプラスチックのナルジェン（Nalg
ene）ボトルに移す。

E.この溶液は、何ヶ月間か室温で保存することが可能で
ある。

（Ｃ）1.25M DTT 40mlになるよう、7.71グラムのジチオトレイトール
（154.2g/モル）を水で溶解する。即座に2mlの画分にア
リコートにする。−20℃で保存する。

VI. 水 SB−18洗浄溶液を含有する大容量については、Milli
−Ｑ精製水を用いた。

より少ない容量については、Gibco/BRL水を用いた： １リットル 15230−022 100ml 15230−014 「より少ない容量は、以下の調製に必要なものを含
む： a. 50X SB−18洗浄塩： 1M NaHPO₄および5M NaClを含む b. 100K SBP18ストック溶液： イソプロパノール水（1:1）を含む c. 1.25M DTT d. 2X溶解緩衝液： 10X Taq緩衝液、1M Tris−HCl pH8.9、4M KClおよび
プロテイナーゼＫ（50mg/ml）を含む VII. 臨床試料の培養工程 全ての臨床試料は、日常の培養のために本発明者らの
研究所に送られた。全ての臨床試料を、Ｎ−アセチル−
Ｌ−システイン/NaOH手順によって処理した（Kent,P.T.
ら、「Public Health Mycobacteriology」,A Guide for
the Level III Laboratory,U.S.Department of Health
and Human Service,Centers for Disease Control,198
5,31−46頁）。細菌のペレットを1mlの滅菌水中に再懸
濁し、BACTEC 12B培地（Becton Dickinson,Towson,MD）
に植菌し、Lowenstein−Jensen寒天（Becton Dickinso
n,Towson,MD）でのインキュベーションおよびスミア分
析（Kent,P.T.ら、「Public Health Mycobacteriolog
y」,A Guide for the Level III Laborartory,U.S.Depa
rtment of Health and Human Service,Centers for Dis
ease Control,1985,57−70頁）のために、その一部分を
取り出した。次いで、残りの沈殿物を、−20℃にて凍結
するかまたは下記のPCR手順のためにさらにプロセスし
た。全ての陽性なBACTEC培養は、Gen−Probe培養アッセ
イ（GenProbe,San Diego,CA）、または標準的な生物化
学的分析（Kent,P.T.ら、「Public Health Mycobacteri
ology」,A Guide for the Level III Laboratory,U.S.D
epartment of Health and Human Service,Centers,for
Disease Control,1985n,71−157頁）のいずれかによっ
て同定した。

VIII. 沈殿物の直接増幅 表4:200μｌの沈殿物を、200μｌの２×溶解緩衝液
（40mM Tris−HCl［pH8.3］、100mM KCl、0.45％のTwee
n 20、0.45％のNP−40および200μg/mlのプロテイナー
ゼＫ）を含むスクリューキャップ付マイクロ遠心チュー
ブに直接移した。この標本を、60℃で60分間インキュベ
ートし、次いで、15分間煮沸した。次いで、PCRによる
増幅のために50μｌのアリコートを取り出した。

IX. 沈殿物の洗浄 沈殿物を、下記の異なる溶液で洗浄した。表5:以下の
ような３つの洗浄条件が存在した：（ｉ）水による洗
浄：沈殿物に25mlの滅菌水を添加し、ボルテックスによ
り撹拌し、次いですぐ、3,500×ｇにて、４℃で20分
間、遠心分離した。（ii）ジチオトレイトール（DTT）
による洗浄：沈殿物に、5mM DTTを含有する25mlの10mM
KHPO₄（リン酸カリウム緩衝液、KHPO₄およびK₂HPO₄の混
合液）,pH8.0を添加し、ボルテックスにより撹拌し、室
温で20分間インキュベートして、次いで7,410×ｇに
て、４℃で20分間、遠心分離した。（iii）Tween 20/NP
−40による洗浄：沈殿物に、25mlの10mM KHPO₄（pH8.
0）および5mM DTT（0.05％のTween 20および0.05％のNP
−40含有）を添加し、ボルテックスにより撹拌し、室温
で20分間、振動させながらインキュベートし、次いで7,
410×ｇにて、４℃で20分間、遠心分離した。いずれの
場合も、チューブをデカントし、200μｌの滅菌水を添
加して、ペレットを再懸濁した。次いで、200μｌを、2
00μｌの２×溶解緩衝液を含有するスクリューキャップ
付マイクロ遠心チューブに移した。この標本を、60℃で
60分間インキュベートし、次いで、15分間煮沸した。増
幅のために50μｌのアリコートを取り出す前に、全ての
チューブを12,000×ｇで１分間スピンした。

表6:沈殿物に、25mlの10mM NaHPO₄（pH7.0）、45mM N
aCl、5mM DTTおよび200μＭおよび2mMのＮ−オクタデシ
ル−N,N−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンス
ルホン酸のいずれか（SB−18［Sigma Cat.No.O8004］）
を添加し、ボルテックスにより撹拌し、37℃で60分間、
振とう（140rpm）させながらインキュベートした後、7,
410×ｇ、37℃で20分間、遠心分離を行った。チューブ
をデカントし、200μｌの滅菌水を添加して、ペレット
を再懸濁した。次いで、200μｌを、200μｌの２×溶解
緩衝液を含有するスクリューキャップ付マイクロ遠心チ
ューブに移した。この標本を、60℃で60分間インキュベ
ートし、次いで、30分間煮沸した。増幅のために50μｌ
のアリコートを取り出す前に、全てのチューブを12,000
×ｇで１分間スピンした。

表9:沈殿物に、25mlの10mM NaHPO₄（pH7.0）、15mM N
aCl、5mM DTTおよび2mM SB−18を添加し、ボルテックス
により撹拌し、そして37℃で60分間、振とう（140rpm）
させながらインキュベートした。次いで、キャップを緩
め、チューブを、予め40℃に加熱した真空オーブン中に
置いた。次いで60分間、600mm Hgの真空状態とした。全
てのチューブを真空オーブンから取り出し、キャップを
締め、次いで7,410×ｇ、37℃で20分間、遠心分離を行
った。チューブをデカントし、200μｌを滅菌水を添加
して、ペレットを再懸濁した。次いで、200μｌを、200
μｌの２×溶解緩衝液を含有するスクリューキャップ付
マイクロ遠心チューブに移した。この標本を、60℃で60
分間インキュベートし、次いで、15分間煮沸した。増幅
のために50μｌのアリコートを取り出す前に、全てのチ
ューブを12,000×ｇで１分間スピンした。最終確認のた
めに、全てのサンプルを増幅し、複製した。

X. PCRシステム 開発したPCRシステムは、特有で、Rogall,T.ら、Int.
J.Sys.Bacteriol.40:323−330（1990）によって出版さ
れたような、16S rRNA遺伝子配列に基づくものである。
以下の群／種のミコバクテリアを最適な増幅を提供する
能力を有するようにプライマーを設計した:M.tuberculo
sis（TB複合体：［MTB］）、M.avium−M.intracellular
eおよびM.paratuberculosis（MAC複合体）、M.kansasii
およびM.marinum。正方向プライマーは、これらのミコ
バクテリアの16S rRNA遺伝子配列の第２可変（V2）領域
のヌクレオチド119−144（Rogall,T.ら、Int.J.Sys.Bac
teriol.40:323−330（1990）の命名による）に対して設
計した。正方向プライマー（TBv2−119）の配列は、
５′−AAA CTG GGT CTA ATA CCG GAT AGG A−３′［配
列番号１］である。逆方向プライマーは、第３可変（V
3）領域のヌクレオチド431−453に対して設計した。逆
方向プライマー（TBv3−453）の配列は、５′−CCA CCT
ACC GTC AAT CCG AGA−３′［配列番号２］である。増
幅産物は、約335塩基対であった（増幅する種によって
異なる）。属特異的プローブは、増幅産物の中央部分に
対して設計し、全てのミコバクテリアに共通である。そ
の配列は、５′−GCG GGC iCA TCC CAC ACC GC−３′
［配列番号３］である。MTB種特異的プローブは、増幅
産物の独特な部分に対して設計し、TB複合体生物に特異
的である。その配列は、５′−GAC CAC GGG ATG CAT GT
C TTG TG−３′［配列番号４］である。

増幅プロトコルは、9600サーマルサイクラー（Perkin
Elmer,Norwalk,CT）を利用し、全ての反応においてウ
ラシルDNAグリコシラーゼ（UDG［Life Technologies,In
c.Gaithersburg,MD］滅菌スキームを用いる（Longo,M.
C.ら、Gene 93:125−128（1990））。反応物100μｌ
は、最終濃度200μM dATP/dCTP/dGTPおよび400μM dUTP
（dU−dNTP:Boehringer,Indianapolis,IN）、3.0mMのMg
Cl₂、25pmoleの各プライマー、ならびに、2.5単位のTaq
DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer,Norwalk,CT）を含ん
だ。緩衝液の最終濃度は、50mM Tris−HCl pH8.9、10mM
KClおよび0.225％の各Tween20/NP−40であった。効率
を最適化するために、AmpliWax（Perkin Elmer,Norwal
k,CT）もまた用いた。反応物は、次のように作製した:2
5μｌ（2.5単位のTaq、0.25単位のUDG、dU−dNTPおよび
１×緩衝液中25pmoleのTBv2−119含有）を、AmpliWaxビ
ーズと共に、0.2mlのマイクロ遠心チューブに入れ、80
℃で５分間加熱した後、次いで冷却した。次いで、25μ
ｌ（MgCl₂、0.75単位のUDGおよび１×緩衝液中25pmoles
のTBv3−453含有）を、AmpliWax上に重曹した。標本
を、１×PCR緩衝液中50μｌの容量中に加えた。サイク
ルプロフィールは次の通りであった:45℃で５分間、94
℃で７分間、次いで、94℃で20秒間、61℃で１秒間、72
℃で10秒間を40サイクル；次いで、72℃でのソークファ
イル。熱サイクルの後、反応物を、−20℃で凍結した。

CloneAmp System（Life Technologies,Inc.Gaithersb
urg,MD）を用いて、陽性の増幅コントロールをクローニ
ングした。TBv2−119およびTBv3−453プライマーを、製
造者に従って改変した。スラント上で増殖したMycobact
erium tuberculosis ATCC ＃27294（ATCC,Rockville,M
D）のコロニーを、200μｌのPCR溶解緩衝液中に入れ、
そして30分間煮沸した。10μｌのアリコートを取り出し
て、400μＭのdUTPの代わりに200μＭのdTTPを用い、そ
して酵素UDGを反応物から省いた以外は上記の様に増幅
した。生成物を、製造者の手順（Life Technologies,In
c.Gaithersburg,MD）に従って、DH5α細胞にクローニン
グした。プラスミド（pOL332）を、Applied Biotechnol
ogies,Inc.（Ellicot City,MD）によって精製し、Cycle
Sequencing Kit（Life Technologies,Inc.Gaithersbur
g,MD）を用いて配列決定し、その同一性を確認した。精
製したプラスミドを、A₂₆₀の読取りによって定量化し、
次いで、陽性の増幅コントロールとして使用するために
希釈した。全ての増幅作業は、このプラスミドを20およ
び100コピー含有する複製反応物を含んでいた。添加し
て、複製陰性のコントロールもまた、各作業で増幅し
た。また、このプラスミドは、各ブロットにおいて、ハ
イブリダイゼーションコントロールとして用いた。

XI. 検出 増幅したサンプルを、−20℃から取り出し、そして10
0μｌの２×変性溶液（1M NaOH/2M NaCl）を添加して、
プロットのために調製した。次に、反応チューブをサー
マルサイクラー機に戻し、そして60℃で15分間加熱し
た。全てのプローブを、製造者に従って、γ−［³²P］A
TPおよびポリヌクレオチドキナーゼ（Life Technologie
s,Inc.Gaithersburg,MD）を用いて、５′−末端標識し
た。製造者（Clontech,Palo,Alto,CA）に従って、Chrom
aspinカラムを用いて、プローブを精製した。サンプル
を、Nytran Plus（Schleicher ＆ Schuell,Keene,NH）
上にドットブロットし、製造者の推奨に従ってプローブ
した。簡潔に述べると、被ルターを80℃で１時間ベーク
した後、10×デンハルト溶液、６×SSPE、１％のSDSお
よび10μg/mlの変性ニシン***DNA中、42℃で３時間、
プリハイブリダイゼーションを行った。次いで、フィル
ターを、５′−³²P標識したプローブを有する６×SSPE
および３％のSDS中に入れ、61℃（属プローブ［配列番
号３］）または65℃（TB特異的プローブ［配列番号
４］）のいずれかで、一晩インキュベートした。フィル
ターを、６×SSPE中、室温で各回10分間、３回洗浄し、
次いで、属プローブ［配列番号３］については１×SSPE
中61℃で３分間、またはTB特異的プローブ［配列番号
４］については１×SSPE中65℃で３分間のいずれかで、
１回洗浄した。次いで、フィルターをオートラジオグラ
フィーに供した。次いで、フィルターを、0.1％のSDS中
で15分間煮沸することによってストリップし、必要に応
じて再プローブした。

XII. PCRの最適化 系を最適化する手段として、陽性コントロールを用い
た。システムを最適化するために、MgCl₂濃度、ヌクレ
オチド濃度、種々の増幅プロフィール、およびアニーリ
ング温度を調べた。アガロースゲル電気泳動と臭化エチ
ジウム染色、ならびにドットブロッティングおよびハイ
ブリダイゼーションにより、PCR産物を分析した。上記
の増幅条件により、常に20のコピーを検出可能なレベル
にまで増幅し得た。発明者らは、Carmody,M.W.ら、Biot
echniques 15:692−699（1993）に記載されたものと同
一の現象に気付いた。特に、ゲル上で視覚化されるdU−
PCR産物の量は、ハイブリダイゼーションにより算定さ
れる量よりも多いようであった（ブロットされたdT−プ
ラスミドの公知の量と比較した場合）。発明者らは、Lo
ewy,Z.Gら、J.Clin.Micro.32:135−138（1994）に記載
されているような「UDGホットスタート」を用いること
を試みたが、同一のシグナルの増強は観察されていな
い。

XIII. ドットロットの構成 上記のように、PCR反応物を変性し二次元配列のナイ
ロンメンブレンに共有結合的に固定化した。二次元配列
の精製は、標準96ウェルフォーマット（例えば、８ウェ
ル×12ウェル）に配置されたドットブロットマニホール
ド装置（「The Convertible」、Life Technologies,In
c.,Gaithersburg,MD）を用いて行う。

図2Aおよび16Bの最下列、または、図３、4A、５、６、
７、7A、８、９、9A、9B、9C、9D,10、11A、12および13
の最も下の２列列、または図14の縦列１は、ハイブリダ
イゼーションおよび増幅コントロールの結果を表す。ハ
イブリダイゼーションコントロールは、「10⁸、10⁹、お
よび10¹⁰」と認識されたウェルであり、図2Aおよび16A
の同一の横列、そして図３、4A、５、６、７、7A、８、
９、9A、9B、9C、9D、10、11A、12、13よび14の同一の
列に、二連でスポットされる。pOL332プラスミドの示さ
れたコピー数を、ハイブリダイゼーションコントロール
として用いた、このコピー数をブロット単位で比較して
露光を評価し得る。

同様に、増幅コントロールは、pOL332プラスミドの
「０、20および100」開始コピーを含む複製反応物から
なり、所定の増幅手順の効率を評価するために実験中で
用いられ得る。増幅コントロールもまた、図2Aおよび16
Aの同一の横列、そして図３、4A、５、６、７、7A、
８、９、9A、9B、9C、9D、10、11A、12、13および14の
同一の縦列に、二連でスポットされる。

実験の大半は、実験の開始時には同一であると考えら
れる、複数物の複製を利用する。これらの複製サンプル
を、「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」等と標識し、標識
を囲む括弧により示されるように、少なくとも二連で増
幅する。すべての実験ウェルは、括弧により示されるよ
うに、少なくとも二連で示される。いくつかの実験は単
に「テスト条件」を比較するものであるが、実験の多く
は、いくつかの内部コントロール、すなわち、「アッセ
イ陰性コントロール」「アッセイ陽性コントロール」お
よび「アッセイインプットコントロール」を利用する。
アッセイインプットコントロール（「ダイレクトインプ
ット」または「ダイレクトアリコート」としても知られ
る）は、所定の実験においてアリコートにされるコピー
の最大数（例えば、最大強度ドット）を表す。この型の
アッセイコントロールまたはテスト条件との比較は、プ
ロセッシングの効率を表す。アッセイ陰性コントロール
（水）は、実際には、低効率回収を表し、そしてアッセ
イ陽性コントロール（2mM SB−18）は、実際には、高効
率回収を表す。アッセイ陰性、アッセイ陽性、およびア
ッセイインプットコントロールと、種々のテスト条件と
の比較により、改変が回収効率を向上させるか否かに関
する結論が導き出される。

XIV. 矛盾する結果の分析 実験作業の際に、培養陽性であるがPCR陰性であるこ
とが見い出された全試料のインヒビターをチェックし
た。これらの例において、増幅阻止のチェックのため
に、100コピーの陽性コントロールは、スパイク（spik
e）されて矛盾する試料になった。バリデーションの際
に、同一の試料の二連の増幅が異なる結果になる（例え
ば、一方は陽性で他方は陰性）という例がいくつかあっ
た。これらの試料を再び二連で増幅したところ、結果
を、Jacksonら、J.Clin.Microbiol.31:3123−3128（199
3）に記載されている様式に類似の様式で分析した：第
２連の反応のうち少なくとも１つが陽性であれば、試料
は陽性と考えられた。

XV. PCRの特異性 上記のプライマーおよびプローブを用いる系の特異性
を調べるために、３つのカテゴリーの生物体の増幅能力
をチェックした。３つのカテゴリーは、以下のようにプ
ライマーの相補性に基づくものであった：（ｉ）最適に
増幅すると見なされるもの、（ii）増幅し得るプライマ
ー配列におけるわずかなミスマッチにより効率が低下す
るもの、および（iii）プライマーにおけるミッシング
（missing）配列により増幅しないと見なされるもの。
第１のカテゴリーを調べるために、以下のAmerican Typ
e Culture Collection（ATCC,Rockville,MD）株を用い
た:M.tuberculosis（ATCC ＃27294）、M.avium（ATCC
＃25291）、M.intracellulare（ATCC ＃13950）、M.kan
saii（ATCC ＃12478）、M.paratuberculosis（ATCC ＃1
9698）、M.marinum（ATCC ＃927）、M.szulgai（ATCC
＃35799）、およびM.gastri（ATCC ＃15754）。第２の
カテゴリーを調べるために、以下のATCC株を用いた:M.x
enopi（ATCC ＃19250）、M.gordonae（ATCC ＃1447
0）、M.malmoenseATCC ＃29571）、M.terra（ATCC ＃15
755）、およびM.nonchromogenicum（ATCC ＃19530）。
第３のカテゴリーを調べるめに、以下のATCC株を用い
た:M.fortuitum（ATCC ＃6841）は、増幅すると見なさ
れない、安定増殖するミコバクテリアを代表する；関連
はないが類似の生物体には、Propionibacterium acnes
（ATCC ＃6919）、Corynebacterium xerosis（ATCC ＃3
73），およびRhodococcus equi（ATCC ＃6939）が含ま
れる；痰および気管支試料（Murray,P.R.ら,Manual of
Clinical Microbiology,第５版、A.Balowsら編.,Am.So
c.Microbiol.,Washington,DC.,1991、488〜490頁）に数
多く見い出される他の生物体は、Prevotella melaninog
enica（ATCC ＃25845）およびPeptostreptococcus magn
us（ATCC ＃15794）により代表される。すべてのミコバ
クテリアを、使用前にスラント上で蔵書させた。他のす
べての生物体は、ATCCが提案するように増殖させた。

PCR産物を、アガロースゲル電気泳動および臭化エチ
ジウム染色の両方、そしてドットブロッティングおよび
ハイブリダイゼーションにより、分析した。第１のカテ
ゴリー中のすべての生物体は、同等の効率で増幅され
た。第２のカテゴリー中の生物体は、ライマーに対する
相補性に基づいて、２つの小集団に分かれた。M.gordon
ae（正方向プライマーにおいて１つのミスマッチ、そし
て逆方向プライマーにおいて２つのミスマッチ）は、高
いコピー数でのみ増幅された。M.malmoense（正方向プ
ライマーにおいて１つのミスマッチのみ）は、これより
低い効率で増幅した。第２の小集団において、M.terr
a、M.nonchromogenicumおよびM.xenopiは、それぞれ多
くのプライマーミスマッチを有し、そして増幅しない。
第３のカテゴリー中の生物体はいずれも、高いコピー数
でさえも増幅しなかった。

実施例２ PCR緩衝液の直接煮沸は十分でなかった まず、増幅に対して敏感な形態のミコバクテリアをよ
りよく回収するために、Victor,T.ら、J.Clin.Microbio
l.30:1514−1517（1992）に記載のように、沈降物を直
接煮沸することを試みた。76個の凍結NALC/NaOH沈降物
をPCR緩衝液中に直接入れて煮沸した（表４）。上記の
ように、沈降物の直接増幅のために、200μｌの２×溶
解緩衝液（40mM Tris−HCl［pH8.3］、100mM KCl、0.45
％ Tween 20、0.45％ NP−40および200μg/mlプロテイ
ナーゼＫ）を含むスクリューキャップ付マイクロ遠心チ
ューブに、200μｌの沈降物を直接移した。試料を60℃
で60分間インキュベートし、次いで15分間煮沸した。次
いで、PCRによる増幅のために、50μｌのアリコートを
取り出した。

表4:NALC/NaOH沈降物を直接増幅する場合の、PCRと培養
の相関 NALC/NaOH沈降物のPCRによる直接増幅の結果を示す。
増幅のためのプロセッシングに先だって沈降物を取り出
し、上記のようにBACTEC 12B培地ボトル中で増殖させ
た。Gen−Probe培養アッセイ（Gen−Probe,San Diego,C
A）を用いて、すべてのMTB培養またはMAC培養を同定し
た。他のすべてのものは、生化学的分析（A Guide for
the Level III Laboratory,U.K.Department of Health
and Human Service,Centers for Disease Control,198
5、71〜157頁における、Kent,P.T.ら、「Public Health
Mycobacteriology」）により同定した。

表４に示すように、沈降物が直接用いられた場合、７
つの培養陽性サンプルのうち１つのみが、増幅（14.3
％）によって検出された。それぞれの場合において、培
養由来の生物体を増幅することは可能であった。このこ
とは、これらの単離体上でプライマー対が機能したこと
を示す。各偽陰性は、NALC/NaOH抽出の結果としてのPCR
アッセイの阻害の結果であると判断された。

実施例３ 増幅阻害効果 本発明者らの実験室では、臨床試料をプロセスするた
めに、代表的には３％のNaOHを用いる（Kent,P.T.ら、
「公衆衛生ミコバクテリア学、A Guide for the level
III Laboratory、U.S.Department of Health and Human
Sarvices、Centers for Disease Control、（1985）31
−46頁）。３％ストック中のNaOH（例えばOH^-）の濃度
は、pH14では0.75Mである。３％ストック（1.45％のク
エン酸ナトリウムを含む）中のNa⁺の総濃度は、0.8Mで
ある。塩濃度（例えばNa⁺）またはpH（例えばOH^-濃度
に）による潜在的なPCR阻害効果を調べるために、図１
に示す実験を行った。5mlのNALC/NaOH（0.5％のNALC、
1.45％のクエン酸ナトリウムおよび３％のNaOH）を、45
mlの水で10倍に希釈した。希釈した各成分の最終濃度
は、31.mMのNALC、5.6mMのクエン酸ナトリウム、および
75mMのNaOHでった。次いで、種々の量の希釈NALC/NaOH
を、200μｌの２×溶解緩衝液を含有する1.5mlのマイク
ロ遠心チューブに移した。約1000コピーのpOL332陽性コ
ントローラプラスミドを各混合液中にスパイクし、全容
量を水で400μｌの最終容量に調整した。すべてのチュ
ーブを95℃で15分間インキュベートし、次いで各チュー
ブの50μｌを２連で増幅した。結果を図１に示す（デー
タのフォーマットの説明については、実施例１のXIII節
を参照のこと）。パーセンテージは、最終増幅反応チュ
ーブにおけるNALC/NaOHの量を示す。例えは、25％は、2
5μｌのNALC/NaOH溶液（3.1mMのNACL、5.6mMのクエン酸
ナトリウム、および75mMのNaOH）を最終容量100μｌで
増幅反応物中に入れたことを意味する。０、20および10
0コピーのコピーコントロールを同時に増幅させた。1
0⁸、10、および10¹⁰コピーのハイブリダイゼーションコ
ントロールも同様にプロットした。

図１に示す結果は、PCR反応を効率よく作用させるた
めに、希釈されたNALC/NaOH溶液は、最終増幅混合液中
では10倍を超える倍率でさらに希釈されなければならな
いことを示唆している。したがって、増幅を効率よく作
用させるためには、塩の添加量またはOH^-の添加量は、
約5mM未満でなければならない。PCRはpHの変化に対して
（塩のわずかな増加に対して）より感度が高いので、阻
害はpHの変化によるものと思われる。試料のコンシステ
ンシーの可変性を考慮すると、デカントのみによりすべ
てのNALC/NaOHを除去することは実質上不可能である。
試料をプロセスするための第１の工程としてNALC/NaOH
を用いる場合、これらのデータは、沈降物をさらにプロ
セスすることが必要であることを確認する。この結論
は、Noordhoek,G.T.ら、J.Clin.Micro.32:277−284頁
（1994）のデータによってさらに実証される：この研究
において成果が最も悪い２つの実験室では、NALC/NaOH
沈殿物のさらなる精製をしなかった。

実施例４ 水およびDTTを用いた２次的洗浄工程の追加による効果 I. 水による洗浄 多数のサンプルをプロセスすることが望ましい場合、
サンプル当たりのコストを減らし、効率を高めるため
に、NALC/NaOHのような阻害剤をさらに除去するための
２次洗浄工程（２゜−洗浄）の適用可能性を実験した
（表５）。

増幅条件は、上記「材料および方法」に記載されるよ
うであった。

まず、ボタン（button）（沈殿物）をリンスするため
に単純な水による洗浄を用いた。25mlの滅菌水を沈殿物
に添加し、ボルテックスにより撹拌した後、ただちに、
3,500×ｇにて20分間４℃で遠心分離に供した。チュー
ブをデカントし、そして200μｌの滅菌水を添加し、ペ
レットを再懸濁した。次いで、200μｌの２×溶解緩衝
液を含有するスクリューキャップ付きマイクロ遠心チュ
ーブに200μｌを移した。この試料を60℃で60分間イン
キュベートし、次いで15分間煮沸した。増幅のために50
μｌのアリコートを除去する前に、すべてのチューブを
12,000×ｇで１分間スピンした。

この水による洗浄工程を取り入れることによって、相
関は33％にまで改善された（表５、21の培養陽性のうち
７つは、PCR陽性［ｎ＝407］）。上述のように、ここで
も培養液から生物を増幅することが可能であった。しか
し、上述とは反対に、いくつかの試料は反復増幅で陰性
であったので、阻害は主要な問題ではないようであっ
た。さらにM.aviumの単離もまた重要な問題であるよう
であった。一般に相関が低い場合、これらの結果は、表
１に記載の大多数の研究に一致した。表１において100
％未満の相関を報告している33種の方法論のうち、21種
は何らかの形態の緩衝液交換工程を包含している。残り
の12種は、緩衝液交換工程を包含しておらず、そして９
種は、問題として阻害剤に言及している。

II. DTTによる洗浄 Shawar.R.M.ら、J.Clin.Micro,31:61−65頁（1993）
およびHermans,P.W.M.ら、J.Clin.Micro.28、1204−121
3頁（1990）は、痰がPCRを抑制することを示している。
酸性ムコ糖類は、おそらく阻害性である（Ochert,A.S.
ら、POR Methods and Applications 3:365−368頁（199
4））。あるいは、痰の「粘着性」の性質もまた、増幅
の効率に影響し得る。Buck,G.E.ら、J.Clin.Micro.30:1
331−1334頁（1992）は、偽陰性に寄与する要因である
として粘着性に特に言及している。この症状、すなわち
疾病状態に直接比例する症状のいくつかの極端な例がま
た、予備研究において観察されている。したがって、こ
の問題を克服する試みとして、２゜−洗浄の組成を、痰
をさらに液化するように変更した。

痰をよりよく液化するためには、Hirshch,S.R.ら、J.
Lab.Clin.Med.74:346−353頁（1969）のプロトコルと同
様に、10mMのKHPO₄、pH8.0および5mMのジチオトレイト
ール（DTT）を洗浄工程に含み、そしてRatnam,S.ら、J.
Clin.Microbiol.23:582−585頁（1986）およびRickman,
T.W.ら、J.Clin.Microbiol.11:618−620頁（1980）によ
り推奨されるように、遠心分離工程の間、RCFを増加さ
せた。25mlの10mM KHPO₄（pH8.0）を5mM DTTとともに沈
殿物に添加し、ボルテックスにより撹拌し、室温で20分
間インキュベートして、次いで7,410×ｇにて４℃で20
分間、遠心分離に供した。すべての場合において、チュ
ーブをデカントし、200μｌの滅菌水を添加して、ペレ
ットを再懸濁した。次いで、200μｌの２×溶解緩衝液
を含有るスクリューキャップ付きマイクロ遠心チューブ
に200μｌを移した。この試料を60℃で60分間インキュ
ベートし、次いで15分間煮沸した。増幅のために50μｌ
のアリコートを取り出す前に、すべてのチューブを12,0
00×ｇで１分間スピンした。

表５に示すように、これらの条件を用いて175個の無
作為抽出試料を洗浄した。サンプルのコンシステンシー
が有意に改善されたようであり、そして、相関がこの場
合は60％（10個の培養陽性のうち、６つがPCR陽性）ま
でさらに改善された。１つの例外（表５の脚注ｃを参照
のこと）を除いて前述のように、培養から（またはスラ
ントから）生物を増幅させることが可能であり、そし
て、ただ１つの偽陰性が阻害に起因し得た。しかし、同
一サンプルの複製物の中に、「統計上除外すべきもの」
がここでも観察された。

沈殿物を洗浄する工程は、阻害をある程度軽減するよ
うであるが、明らかに、偽陰性は必ずしも阻害に起因し
なかった：これらの条件下で、サンプルの偏りが、偽陰
性の問題を克服するようであった。

表5:種々の洗浄条件を用いるPCRと、培養との相関 種々のアッセイ条件の結果、および沈殿物の洗浄によ
るPCRと培養とのそれらの相関を示す。すべての試料
は、NALC/NaOH手順（Kent,P.T.ら、「公衆衛生ミコバク
テリア学」、A Guide for the Level III Laboratory、
U.S.Department of Health and Human Service、Center
s for Disease Control、1985、31−46頁）によりまず
プロセスした。洗浄して、BACTEC 12B培養ボトルで増殖
させる前に、沈降物を除去した。すべての陽性MTB、MAC
あるいはM.kansasii培養液を、Gen−Probe培養アッセイ
（Gen−Probe、San Diego、CA）を用いて同定した。そ
の他すべての試料は、生化学分析（Kent,P.T.ら、「公
衆衛生ミコバクテリア学」、A Guide for the Level II
I Laboratory、U.S.Department of Health and Human S
ervice、Centers for Disease Control、1985、71−157
頁）により同定した。「条件」は、洗浄によって沈殿物
をさらにプロセスする工程を表す。「材料および方法」
で記載したように、３つの異なる２次洗浄条件を用い
た：（ｉ）水、（ii）10mMのKHPO₄（pH8.0）および5mM
のDTT、ならびに（iii）10mMのKHPO₄（pH8.0）および5m
MのDTT（0.05％のTween 20および0.05％のNP−40を含
有）。

実施例５ 遠心分離の間のミコバクテリアの分配 上記した実験の間に、洗浄工程間にミコバクテリアを
損失し得るかどうかの問題を研究した。図２は、プロセ
スを真似するために用いられたアッセイの実験設計（以
下、「プロセッシングアッセイ」と称する）を示す。ス
トラント上で増殖したMycobacterium tuberculosisをこ
れらの実験における供給源として用いた。

細胞の小塊を、最初に5mlの10mM KHPO₄（pH8.0）に移
し、そしてボルテックスにより撹拌して、バクテリアス
トックを生成した。次いで、ストックを２×10³倍に希
釈し、そして20μｌを15mlの２゜−洗浄緩衝液に移し
た。この移転をさらに５回繰り返し、合計６つのサンプ
ルを得た。同時に。直接増幅のために２×10³倍の希釈
液から６つの20μｌアリコートを直接取り出し380μｌ
の溶解緩衝液を含有する６つのアリコートに入れた。こ
れら後者のアリコート（以下、「ダイレクト」、「ダイ
レクトインプット」または「ダイレクトアリコート」コ
ントロールと称する）は、所与の実験における総標的イ
ンプットに対するコントロールとして作用する。次い
で、洗浄緩衝液を含むチューブを遠心分離（7,410×
ｇ、４℃で20分間）に供した。遠心分離に続いて、上清
（200μｌ）からなるアリコートを、200μｌの２×溶解
緩衝液に入れた。次いで、この上清を抽出し、ペレット
を200μｌの水に再懸濁させて、そして200μｌの再懸濁
させたペレットを、200μｌの２×溶解緩衝液と混合し
た。各シリーズの50μｌアリコートを４回連でPCRに供
した。

この実験におけるインプットは、約10,000コピーであ
ると評価された。したがって、ダイレクトアリコート
は、約1,000コピーの増幅を示すはずである。この上清
において生物を溶解するか、または均一に分布する場
合、増幅反応は、約20コピーを含む。ペレットの増幅
は、おそらく遠心分離による復元効率を示す。結果を図
2Aに示す（データのフォーマットの説明については、実
施例１のXIII節を参照のこと）。

図2Aにおいて、PCR産物を、「材料および方法」で上
述したように、変性し、プロットし、プローブした後
に、オートラジオグラフィーに供した。６つの異なる
「試料」を、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆとして示し、
同一であるべきである。所与の試料に対する上清の画分
およびペレットの４連の増幅を、同一線上に示す（１、
２、３および４）。所与の試料に対応するダイレクトイ
ンプットアリコートの４連の増幅を、それぞれ同一線上
に示す。０、20および100コピーのコピーコントロール
を同時に増幅させた。10⁸、10⁹および10¹⁰コピーのハイ
ブリダイゼーションコントロールも同様にブロットし
た。結果（図2A）は、あるペレットは陰性であり、ある
上清画分は陽性であり、そして両方の画分がサンプルの
偏りを示すことを表している。

上記結果に対する１つの考えられ得る説明は、ミコバ
クテリアの溶解である。これらの生物を振盪的に溶解す
ることは、無視できない。Thacore,H.ら、Rev.Infect.D
is.3:960−972頁（1981）およびSato,H.ら、Can.J.Micr
obiol.12:255−261頁（1966）は、MTBのスフェロプラス
トおよび「ゴースト」を生じるためには極端な尺度が必
要であると報告している。あるいは、Thacore,H.ら、Pr
oc.Soc.Exptl.Biol.Med.114:43−47頁（1963）は、EDTA
の存在下で増殖した細胞がフラスコの壁に付着すること
を示している。しかし、このことは培地にリゾチームを
添加することによって容易に克服される。正しい説明
は、おそらく、浮力から生じたミコバクテリアの分配に
よる。図2Aの観察結果は、Klein,G.C.ら、Am.J.Clin.Pa
thol.22:581−585頁（1952）の結果を考慮すると驚くこ
とではない：沈殿物および上清の両方は、それぞれ2,00
0rpmおよび3,000rpmで遠心分離した88.8％および82.4％
の全試料で、培養陽性であった；そして、それぞれ2,00
0rpmおよび3,000rpmで遠心分離した2.7％および2.2％の
全試料では、沈殿物は培養陰性であったが、上清は培養
陽性であった。

実施例６ ミクロバクテリアの復元に対する細胞壁の影響 Dubos,R.J.ra,J.Eep.Med.83:409−423頁（1946）は、
Tween 80（CAS 番号9005−65−６）の存在下で消失し
た（submerged）増殖は、細胞表面が「湿潤であるこ
と」によると結論づけた。異常な結果の原因が表面張力
であり、そして非イオン性界面活性剤の添加によってそ
の表面張力を克服し得る場合、これらの試薬が培養に対
する相関を改善すべきであることは、論理的であるよう
に見える。しかし、以下に示すように、ここではそのケ
ースは当てはまらない。

Young,D.B.ら、Res.Microbiol.142:55−65頁（1991）
は、末梢関連性リポタンパク質を、非イオン性界面活性
剤Triton X−100（CAS 番号9002−93−１）中のインキ
ュベーションによって除去し得ることを証明した。非イ
オン性界面活性剤Tween 20（CAS 番号9005−64−５）
およびNP−40（CAS 番号127087−87−０）は、PCRにお
ける添加剤として通常用いられており、ミコバクテリア
細胞の表面張力（あるいは粘着性）を影響させるための
試みとして２次的洗浄工程において用いた（表５）。

NALC/NaOHでプロセスされた沈殿物をTween 20/NP−40
洗浄液で洗浄した:25mlの10mM KHPO₄（pH8.0）および5m
M DTTを、0.05％のTween 20および0.05％のNP−40とと
もに沈殿物に添加し、ボルテックスにより撹拌し、振盪
しながら室温で20分間インキュベートして、次いで４
℃、7410×ｇで20分間、遠心分離に供した。すべての場
合において、チューブをデカントし、200μｌの滅菌水
を添加して、ペレットを再懸濁した。次いで、200μｌ
の２×溶解緩衝液を含有するスクリューキャップ付きマ
イクロ遠心チューブに200μｌを移した。試料を60℃で6
0分間インキュベートし、次いで15分間煮沸した。増幅
のために50μｌのアリコートを取り出す前に、すべての
チューブを12,000×ｇで１分間スピンした。

表５に示すように、増幅した359の試料のうち、26
は、MTB複合体（５試料）またはMAC複合体（21試料）の
いずれかに対して培養陽性であった。MTBは、わずか４
試料（80％）から増幅され、およびMACは、９試料（43
％）から増幅された。さらに、すべての偽陰性のうち１
つを除いて阻害のないことが示された；生物を培養から
増幅し得、そして、統計上除外すべきものが偽陰性を左
右することが観察された。

したがって、表５に示す洗浄結果を累計すると（MTB
単離物の相対数は小さかったが）培養との80％の相関
が、MTBについて実現された。このプロトコルによってM
AC複合体生物を単離する能力に関する結果は、著しく異
なった：培養との相関は37％（ｎ＝46）であった。この
二分法はまた、表１に示す当該分野においては反映され
る。

この発見をさらに支持するために、図２にその概略を
示すプロセッシング実験を、0.1％のTriton X−100（CA
S 番号9002−93−１）の存在下でM.tuberculosisを用
いて複製物した。図３は、この実験の結果を示す。この
実験では、２゜−洗浄緩衝液が、水か、または0.1％のT
riton X−100および5mMのDTTを補充した10mM Tris−HC
l、pH8.0のいずれかを含有した以外は、図２に記載のプ
ロセッシングアッセイを用いた。さらに、アリコートを
４つだけ取り出し、そしてチューブを振盪しながら室温
で20分間インキュベートした。４つのアリコートの複製
増幅物は、ａ、ｂ、ｃ、およびｄで表され、ならびにす
べてが同一であるべきである。ダイレクトアリコートの
複製増幅物は、適切に標識されたライン上に示す。０、
20および100コピーのコピーコントロールを同時に増幅
した。10⁸、10⁹および10¹⁰コピーのハイブリダイゼーシ
ョンコントロールも同様にブロットした。

図３に示す結果は、上記データ（表５）と一致する：
非イオン性界面活性剤は、復元効率を改善することは期
待されない。実際に、凝集に起因し得る大きな変化が観
察された。他のブロットに比例してこのブロット（図
３）を過度に感光させることに注意されたい。このこと
は、これらの結果を観察するために必要であった。

これらの結果に一致する結論は、サンプルから阻害剤
をさらに除去するために追加工程を行わなければならな
いが、単に細胞を「湿潤にする」だけでは、この問題を
完全に解決しないようである。このことは、増幅の前に
沈殿物を洗浄するために非イオン性界面活性剤を用いて
いる表１に示す５つの研究（Clarridge,J.E.ら、J.Cli
n.Micro.31:2049−2056頁（1993）;Irula,J.V.ら、J.Cl
in.Miorc.31:1811−1814頁（1993）;Kolk,A.H.J.ら、J.
Clin.Micro.30:2567−2575頁（1992）;Shawar,R.M.ら、
J.Clin.Micro.31:61−65頁（1993）；およびSritharan,
V.ら、Mol.Cell.Probes 5:385−395頁（1991））の相関
のいずれもが、培養液に対する100％の相関を達成して
いないという事実によりさらに実証される。Robinson,
L.ら、J.Lab.Clin.Med.27:84−91頁（1941）は、表面張
力を軽減する薬剤が遠心分離による復元力を増強するこ
とにおいて効力がないことを何年も前に報告した。Dubo
sの提案（Dubos,R.J.、Exp.Biol.Med,58:361−362頁（1
945）;Dubos,R.J.ら、J.Exp.Med.83:409−423頁（194
6））とは異なり、Tween 80、オレイン酸およびBSAが、
表面張力を補償することは対照的にインビボプロセスを
介してペリクラ増殖に影響した場合、本明細書に記載の
実験（図３）に、凝集物が依然存在すると予想される。
本願明細書（表５）、および当該分野（表１）に示す結
果に基づくと、このような非イオン性界面活性剤を洗浄
緩衝液中に含めても何の利点も得られない。

実施例７ ミコバクテリアの集合および分散 上記実験（図３）において、周囲に結合した脂質成分
は、Triton X−100によって確実に除去されたが、細胞
は集合したままであった。次段階として、分散による回
収を改善する試みを開始した。図４は、MTBの集塊を分
散させる異なる界面活性剤の能力評価をするために開発
されたアッセイの実験設計（本明細書では以下、集合ア
ッセイ（aggregation assay）とする）の詳細を示す。
このアッセイは、集合がサンプルの偏りを悪化させる
（集合が分散された場合にのみ複数のアリコートが類似
の増幅結果をもたらす）という事実に基づいている。さ
らに詳細には、同じサンプル由来の各アリコートは、生
物が溶液全体に均質に分配された場合にのみ同数の生物
を有する。この状態は、コピー数が少ないときに最も顕
著であると予想される。理論的には、集塊を分散するこ
とによって、いずれのアリコートも、より高い潜伏（ha
rboring）標的の確率を有するようになるため、比較的
低コピー数の場合でも、診断の正確性が高くなる。

これらの実験において、ミコバクテリアを分散する界
面活性剤の能力を評価するために設計されたプロトコル
（図４）を、スラント上で増殖したMycobacterium tube
rculosisを供給源として利用して実施した。少量の細胞
を、まず5mlの10mM KHPO₄（pH8.0）に移し、細菌ストッ
ク（bacterial stock）を作製するためにボルテックス
により撹拌した。このストックを次に、20mlの２゜−洗
浄緩衝液中に10μｌ移すことにより２×10³倍に希釈し
た。２゜−洗浄緩衝液の異なる局面を変化させた（これ
は界面活性剤およびその濃度、使用される緩衝液ならび
に緩衝液のイオン強度およびpH、インキュベーションの
時間、インキュベーションの温度、ならびに撹拌のプラ
スまたはマイナスを包含する）。インキュベーションに
続いて、20μｌを25mlの標準化緩衝液（10mM KHPO₄ pH
8.0、0.05％のTween 20、0.05％のNP−40および5mM DT
T）に移した。この移転は、合計４つのサンプルのため
にその後３回繰り返された。同時に、４つの20μｌのア
リコートを、２×10³倍の希釈液から、直接増幅のため
に380μｌの溶解緩衝液を含む４つの異なるマイクロ遠
心チューブに直接移した。これら後者のアリコート（本
明細書中では以下「ダイレクト液（directs）」、「ダ
イレクトインプット（direct input）」または「ダイレ
クトアリコート」コントロールとする）は、所定の実験
においてインプットの合計についてのコントロールとし
ての役割を果たす。標準化緩衝液を含むチューブを、7,
410×ｇ、４℃にて20分間、遠心分離に供した。いずれ
の場合も、チューブはデカンテーションを行い、そして
200μｌの滅菌水を加えて、ペレットを再懸濁した。即
座に200μｌのアリコートを取り出し、そして200μｌの
2X溶解緩衝液に入れた。全てのチューブを、物質および
方法の章において説明したようにPCRのために調製し
た。各型のアリコート50μｌを２連でPCRに供し、希釈
および標準化インプットの補整をした。

図4Aに示されるデータについては、各アッセイのPCR
産物を、変性、ブロット、プローブし、そして物質およ
び方法の章（上記）において説明したようにオートラジ
オグラフィーに供した。各条件についての４つの異なる
「試料」の複製増幅物を、ａ、ｂ、ｃ、およびｄで表
し、そしてこれらは同一のものとする。各条件のダイレ
クトアリコートの複製増幅物を、正確に標識されたライ
ン上に示す。０、20、および100コピーのコピーコント
ロールを同時に増幅した。10⁸、10⁹、および10¹⁰コピー
のハイブリダイゼーションコントロールもブロットし
た。

図4Aは、界面活性剤の入っていない緩衝液（例えば、
水）、10mM Tris−HCl pH8.0中の0.1％のTween 80、お
よび10mM NaHPO₄、15mM NaCl中の2mM N−オクタデシル
−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンス
ルホネート（SB−18:CAS 番号13177−41−８）を比較
する代表的な結果を示す。すべてのチューブを、標準化
緩衝液のアリコートにする前に、撹拌しながら（140rp
m）、37℃にて60分間インキュベートした。試験したこ
れらの化合物のうち、このアッセイにおいて、一貫して
有意な活性を示した唯一の界面活性剤は、スルホプロピ
ルベタイン、SB−18であった。SB−16（CAS 番号2281
−11−０）はいくらかの分散活性を示した:SB−16は一
貫性はないものの機能することが認められた。その他の
界面活性剤、および16のアルキル炭素の長さより短いス
ルホプロピルベタイン型のその他の界面活性剤（SB−10
（CAS 番号15163−36−７）、SB−12（CAS 番号14933
−08−５）、およびSB−14（CAS 番号14933−09−
６））は、MTBの集塊を分解（disaggregating）する効
力がなかった。MTBの集塊の分散によって、低コピーの
場合でも、全てのアリコートが標的を有する確率が向上
する。

分散理論を抗酸スミアによって確認する試みは不成功
に終わった。明らかに、どの界面活性剤が含有される場
合も、細胞をスライドに熱固定する能力が有意に減少す
る。

実施例８ SB−18は遠心分離によるミコバクテリアの単離を容易に
する 上記の結果を、図２に記載されるプロセッシングアッ
セイを用いて拡大した。界面活性剤の集塊を破壊する効
力とプロセッシングアッセイの回収との間に直接的な相
関があった。図５は、2mM SB−18の存在下および非存在
下での、M.aviumおよびM.tuberculosisの両方を用いた
代表的な結果を示す。図５に示される実験は、図２にお
いて記載されるスキームに従った。２゜−洗浄緩衝液
は、10mM NaHPC₄ pH7.0、15mM NaCl、2mM SB−18、2mM
フェニルアラニンおよび5mM DTTを含有し、水と比較し
た。さらに、チューブを、振とうさせながら（140rp
m）、37℃にて60分間インキュベートした。４つのアリ
コートの複製増幅物を、ａ、ｂ、ｃ、ｄで表し、そして
これらを同一のものとする。所定の種に対応する、ダイ
レクトアリコートの複製増幅物を、正確に標識されたラ
イン上に示す。０、20、および100コピーのコピーコン
トロールを、同時に増幅した。10⁸、10⁹、および10¹⁰コ
ピーのハイブリダイゼーションコントロールも同様にブ
ロットされた。

このブロットは、M.tuberculosis特有の集塊およびM.
aviumのより拡散した分布特性が明確に識別可能である
ため選択された。さらに、このブロットを認められる集
塊形成に関しては、フェニルアラニンは、MAC生物の回
収を向上させるが、SB−18の分散活性の効力を低減させ
ることが観察された。いずれにせよ、有意な回収の向上
が、両方の生物について常に観察された。

表６は、NALC−NaOH沈殿物を、2mM SB−18の追加され
た洗浄緩衝液でプロセッシングした結果を記載してい
る。

表６ 洗浄緩衝液にSB−18が含有される場合のPCRと培養との
相関 ２゜−洗浄緩衝液にSB−18が含有される場合の結果
は、物質および方法の章に記載のように表される。この
型のサンプル中の沈殿物を洗浄するために用いられる緩
衝液の成分は10mM NaHPO₄（pH7.0）、45mM NaCl、5mM D
TT、および200μＭもしくは2mM SB−18のいずれかであ
った。洗浄に先だって、沈殿物を取り出し、そしてBACT
EC 12B培養ボトルにて増殖した。陽性のMTB、MACまたは
M.kansasii培養はいずれも、Gen−Probe培養アッセイ
（Gen−Probe,San Diego,CA）を用いて同定した。その
他の生物はいずれも生化学的分析（Kent,P.T.ら、「公
衆衛生ミコバクテリア学」、A Guide for the Level II
I Laboratory、U.S.Department of Health and Human S
ervice,Centers for Disease Control,1985,pp.71−15
7）によって同定された。沈殿物を、37℃にて60分間、
振とうしながら（140rpm）洗浄した。沈殿物の洗浄に続
いて、サンプルを遠心分離し、物質および方法の章にて
記載されるようにPCRのためにさらなるプロセスに供し
た。

SB−18を含有する緩衝液で洗浄された754のサンプル
の内、23のサンプルはM.aviumについて、５つはM.tuber
culosisについて、そして１つはM.kansasiiについて培
養陽性であった。培養に対する相関は以下の通りであっ
た:M.aviumが65％、M.tuberculosisが100％、およびM.k
ansasiiが100％。培養陽性試料の実際の数は少なかった
ものの、明らかに全体的な相関の識別可能な改善が認め
られた。予備スクリーニングにおいて見落とされた８つ
のM.aviumサンプルの内、５つは低コピー数に起因し
（複数の増幅物は陽性および陰性の両方であることが認
められた）、１つはインヒビターの存在の結果と確認さ
れ、２つは「未説明」（複数の増幅物はいずれも陰性で
あったが、インヒビターは存在していなかった）であっ
たことが不一致の分析により示された。さらに、培養陽
性のM.gordonaeのサンプルとの相関が現れ始めた。高コ
ピー数が導入された場合にのみ、陽性なM.gordonae増幅
物がインビトロで観察されたという事実は、回収の全体
的な効率が有意に向上したことのからなる証拠として解
釈された。

実験的な目的のために臨床沈殿物およびオフスラント
（off slant）からM.aviumおよびM.tuberculosisの両方
を単離する能力を再び改善したが、インヒトロでの実験
から機論に値するいくつかの観察がなされた。まず、実
験によってインプットが異なるために、意味を持った結
果を得るのが極めて困難であった。低コピー数のインプ
ットにおいて、MTB集合に影響を与えなかった界面活性
剤について著しいサンプルの偏りが観察され、判定はほ
とんど不可能であった。高インプットコピー数の場合に
おいては、いずれの反応物の増幅も直線相（linear pha
se）に進行したため、意味を持った差異は観察され得な
かった。２つの極値間で慎重にバランスを取ることが必
要とされ、完成が困難であることが判明した。実験の結
果、意味を持った結果を得るためには100と1,000との間
のコピーが必要であることが算定された。100コピー未
満の場合、遠心分離された試料において著しいサンプル
の偏りができ、そして1,000コピーより多い場合、プロ
セッシング溶液の性質に関わらず、細胞を含むことが確
証される比較的均質な溶液が作製された。第２の観察
は、予想された相対的な差異に注目する。例えば、単純
水（simple water）または非イオン性界面活性剤洗浄液
を用いた場合、MTBと培養とに80％の相関があった（表
５）。これは100％の相関を達成するためには、わずか
な改善（約20％）が必要であるに過ぎないことを示唆す
る。他方で、M.aviumは、100％の相関を達成するのため
には効率を倍以上にする必要がある。上述された第１の
観察を考慮すると、この概念は意味を持ったデータを得
ることをさらに困難にする。いずれにせよ、記載された
条件下で有意な改善が得られ、そして元の予想より消失
が実質的に大きいことを示唆する。MAC生物について得
られる「未説明」の結果は、プロセッシングの際にほぼ
定量可能な消失を起こすことによってのみ説明可能であ
る。第３の観察は、M.tuberculosisおよびM.aviumを単
離する能力の差異が継続したしたことである:2つの生物
は、インビボおよびインビトロの両方で異なる反応を示
すようであり、SB−18を加えた結果、MTBはより著しい
改善を示した（図５）。さらに、MAC生物が単細胞様式
にて増殖するという事実は、SB−18機能の作用のメカニ
ズムは、分散のみではないことを示す。

アッセイを改善するための試みは、添加物の取り込み
に焦点を置いた。界面活性剤の混合は、Linfield W.M.
ら、J.Am.Oil Chem.Soc.40:114−117（1963）の知見か
らも逆効果に思われたが、緩衝液にアミノ酸を取り込む
ことによって回収のコンシステンシーが適度に改善され
た。しかし、MTBを分散する能力は減少した。アミノ酸
が簡単に活発に隔離され、それによりミコバクテリアの
自然の浮力をある程度減少させたためと思われる。いず
れにせよ、実験による全てのデータが、いくらかのイン
プットした物質が消失していることを示した。

実施例９ ミコバクテリア単離でのベタイン類の使用 SB−18（CAS 番号13177−41−８）およびSB−16（CA
S 番号2281−11−０）（より低級であるが）は、上記
試験したうち凝集アッセイで機能する唯一の界面活性剤
であった（図4Aは、SB−18を使用した結果を示す）。さ
らに、図５の結果は、SB−18が機能する機能が単に分散
機構ではないことを示唆した。従って、一連の実験は、
検出における改善を促進するSB−18の特性を解明する試
みで企てられた（図６−9D）。

図６に示される結果は、図２に示されるプロセッシン
グアッセイの変法に基づき、SB−18の数種のイオン性同
族体を使用した：オクタデシル硫酸ナトリウム（SOS:CA
S 番号1120−04−３）、トリメチルオクタデシルアン
モニウムブロマイド（TMA−18:CAS 番号1120−02−
１）、および３−［（３−コロアミドプロピル）−ジメ
チルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（CHAPS:
CAS 番号75621−03−３）。SOSおよびTMA−18は、それ
ぞれに、陰イオン性および陽イオン性のオクタデシル界
面活性剤であり、そしてCHAPSは、（N,N−ジメチルアン
モニオ）プロパンスルホネート部分を有する、両性イオ
ン性胆汁酸塩である。水コントロール以外の全洗浄緩衝
液は、10mM NaHPO₄（pH8.0）および15mM NaClを含有し
た。各シリーズについて４つの複製チューブを調製し
て、2mM SB−18、20μM SOS、2mM TMA−18、または2mM
CHAPSのいずれかを添加した。SOSの2mM溶液は、PCR反応
を阻害する白色沈殿物を生じた。従って、200μＭ溶液
を使用した。全チューブに20μｌのM.tuberculosis細菌
ストックを摂取し、遠心分離前に、振盪しながら（140r
pm）37℃で60分間インキュベートした。４つの複製物の
２連の増幅物をａ、ｂ、ｃ、およびｄとして表し、これ
らは同一である。ダイレクトアリコートの２連の増幅物
を、適切に標識した線上に示す。０、20、および100コ
ピーのコピーコントロールを同時に増幅させた。10⁸、1
0⁹、および10¹⁰コピーのハイブリダイゼーションコント
ロールを、同様にブロットした。

結果は、SB−18が、この試験されたシリーズの中で有
効に機能した唯一の界面活性剤であることを示す。反復
実験は、以下の結果を導いた：（ａ）SOSは、非常に高
価であることに加え、使用条件下で沈殿を生じ、そして
（ｂ）TMA−18およびCHAPSは両方とも、SOSまたは水コ
ントロールよりはよく作用するようであるが、SB−18で
通常見られるシグナルを示さなかった。

図７および7Aに示される結果は、図２に示されるプロ
セッシングアッセイの変法に基づき、界面活性剤SBシリ
ーズを使用する：それぞれMycobacterium tuberculosis
およびMycobacterium aviumを伴う、SB−12、SB−14、S
B−16、およびSB−18。これらの同族体は、アルキル鎖
の長さが異なるだけである。水コントロール以外の全2⁰
洗浄緩衝液は、10mM NaHPO₄（pH8.0）、15mM NaCl、お
よび5mM DTTを含有した。各シリーズについて４つの複
製チューブを調製し、適切な界面活性剤で2mMの最終濃
度になるように全てを補充した。全チューブに、20μｌ
のM.tuberculosis細菌ストック（図７）、または20μｌ
のM.avium細菌ストック（図7A）のいずれかを接種し
た。次いで、チューブを、遠心分離前に、振盪しながら
（140rpm）37℃で60分間インキュベートした。各界面活
性剤シリーズについて４つの複製物お２連の増幅物を
ａ、ｂ、ｃ、およびｄとして表し、これらは同一であ
る。ダイレクトアリコートの２連の増幅物を、適切に標
識した線上に示す。０、20、および100コピーのコピー
コントロールを同時に増幅させた。10⁸、10⁹、および10
¹⁰コピーのハイブリダイゼーションコントロールを、同
様にブロットした。

図７に示されるように、SB−18およびSB−16は両方と
も、同程度の強さおよび均一分布の結果を生じたようで
あった。あるいは、SB−14は、遠心分離によるM.tuberc
ulosisの回収を促進することにおいてかなりの見込みを
示す一方、凝集に起因する不均一な分布に特有な結果を
生じた。SB−12は、明らかに水よりは良好に作用する一
方、より高級なアルキル鎖長をを有する同族体と同程度
には作用しなかった。図7Aの結果に関しては、このシリ
ーズにおける全ての界面活性剤は、M.aviumの回収を促
進することに関して比較的同程度に機能するようであっ
た。これらの結果は、M.tuberculosisを使用したときに
SB−16が一般にSB−18ほど均一でない結果を生じたこと
を除けば、かなり典型的なものであった。

結果が図３のようになる実験を行った際、凝集がなお
主要な問題であることが認識された。実施例７で考察さ
れるように、実行される調査方針は、この現象を緩和す
ることを目的とした。本発明の方法におけるSB−18の実
用性は、元来界面活性剤の無作為スクリーニング中に発
見され、M.tuberculosisの凝集を分散させる能力に基づ
いて同定された。全SBシリーズの界面活性剤がM.tuberc
ulosisおよびM.aviumの両方の凝集を促進したことは、
M.aviumが単一細胞として増殖する（例えば、分散が要
求されない）ことと組み合わせると、SBシリーズの界面
活性剤が、本発明の方法においてそれらを機能させる共
通性（commonality）を有することを示唆する。別に言
えば、長鎖SB同族体がコードを分散させ得ることに加え
て、全てのSB−18様界面活性剤は、なんらかの未だ解明
されていない様式で、このクラスの微生物の回収を促進
し得る能力を有する。従って、これらのデータは、SB−
18作用の二様式機構を示唆する。発明者は、SB−18のこ
の二様式特質がいかに他の分子に及ぶかを以下に示す。

SBシリーズの界面活性剤（スルホプロピルベタインと
いても知られる）は、ベタイン類として知られる両性イ
オン性界面活性剤の広範なクラスのサブセットである。
両性イオン性界面活性剤のSBシリーズは、市販により入
手可能である（例えば、Aldrich,Milwaukee,WI.;CalBio
chem,La Jolla,CA:Fluka,Ronkonkoma,NY;およびSigma,S
t.Louis）。同族構造について多数の製造者が存在し、
まず４つの異なるサンプルが３つの異なる製造者から得
られた:Henkel Corporation（Hoboke,NJ）は、「Velvet
ex AB−45」および「Velvetex BK−35」を提供し、Inol
ex Chemical Company（Philadelphia,PA）は、「Lexain
e Ｃ」を提供し、そして、Goldschmidt Chemical Corp
oration（Hopewell,VA）は、「TEGO Betain L5351」を
提供した。Velvetex AV−45（CAS 番号68424−94−
２）は、ココカルボキシメチルベタイン（R₁＝ヤシ油、
α＝−CH₂−、R₂、R₃＝−CH₃、R₄4＝−CH₂−、β＝N⁺お
よびγ＝−COO^-;構造略語については表２を参照のこ
と）;Velvetex BK−35（CAS 番号61789−40−０）、Le
xaine Ｃ（CAS 番号61789−39−７）およびTEGO Bet
ain L 5351（CAS 番号「登録（proprietary）」）は、
全てココアミドプロピルカルボキシメチルベタイン（α
＝−Ｃ（Ｏ）NHC₃H₆−）である。ヤシ油は、複雑な組成
を有するが、しかし、この油のベタイン合成における使
用は、R₁を以下のアルキル鎖混合物で構成させる:45.4
％ラウリン酸（C₁₂）、18.0％ミリスチン酸（C₁₄）、1
0.5％パルミチン酸（C₁₆）、2.3％ステアリン酸
（C₁₈）、0.4％アラキジン酸（C₂₀）、7.4％オレイン酸
（Ｃ_18:1）、および5.4％その他の酸（オイル組成は、C
RC Handbook of Chemistry and Physics、第55編、CRC
Press,Cleveland,OH（1974）Ｄ−192−193頁から集
計）。

図８に示される結果は、図２に示されるプロセッシン
グアッセイの変法に基づき、上記の市販の入手可能なベ
タイン調製物を使用する:Velvetex AB−45、Velvetex B
K−35、Lexaine CおよびTEGO Betain L 5351。2mM
SB−18を陽性コントロールとして使用し、水を陰性コン
トロールとして使用した。水コントロール以外の全2⁰洗
浄緩衝液は、10mM NaHPO₄ pH8.0および15mM NaClを含有
した。４つの複製チューブを各シリーズについて調製
し、適切なココベタイン界面活性剤で、最終濃度10mMに
補充した。全チューブに、20μｌのM.tuberculosis細菌
ストックを接種した。次いで、全チューブを、遠心分離
前に、振盪しながら（140rpm）37℃で60分間インキュベ
ートした。各界面活性剤シリーズについて４つの複製物
の２連の複製物をａ、ｂ、ｃ、およびｄとして表し、こ
れらは同一である。ダイレクトアリコートの２連の増幅
物を適切に標識した線上に示す。０、20、および100コ
ピーのコピーコントロールを同時に増幅させた。10⁸、1
0⁹、および10¹⁰コピーのハイブリダイゼーションコント
ロールを、同様にブロットした。

明らかに、これらの市販調製物は、遠心分離によるこ
れらの生物を採集する能力を改善することに対して、あ
る程度の「SB−18様活性」を示す。アルキル部分の組成
および図７に示される結果を考慮すると、これらの調製
物は、SB−12、SB−14、およびSB−16間の中間の様式で
挙動することが演繹的に予期され得、そして実際挙動し
た。例えば、これらは回収を改善するが、これらの生物
を分散させることに関しては能力に制限があった。これ
らの３つの試薬（Velvetex BK−35,Lexaine CおよびT
EGO Betain L 5351）は、同一の構造を有することが
報告されたので、それらは同一に機能することが予測さ
れ、そして実際機能したことに留意すべきである。（２
つは別のCAS 番号を有することに注目のこと。）３つ
の全てが同程度の有効性で実際に機能するという事実
は、履行は製造者に依存しないことを示唆する。さら
に、これらの調製物が不純物であっても、これらはこの
アッセイにおいて機能した。

ベタイン様分子のさらなる供給源を以下に調査した。
これらの分子における背景を、広範な同族構造の試験結
果がより良く考察され得るために示す。

ベタインにおける背景 ベタインは、本質的に、正電荷の中心が負電荷の中心
から離れている両性イオン性界面活性剤分子である。ア
ルキルは、陽イオン、陰イオン、または電荷を分離する
架橋のいずれかに結合され得る。表２は、ベタインの最
も一般的なクラスの一般構造を示し、そして表２の考察
は多数の例を与える。表３は、ベタインを主題とする数
種の構造変形を示し、そして表３の考察は、これらのサ
ブクラスのいくつかの例を与える。大多数の場合、陽イ
オンは４級窒素である。陰イオンは、より高度の多様性
を示す。例えば、カルボキシベタイン、ホスホベタイ
ン、およびスルホベタインのアンモニオ型は、市販によ
り容易に入手可能である。

上記の供給源に加えて、「McCutcheon's」の1994年版
（McCutcheon's,第１巻:Emulsifiers ＆ Detergents、N
orth American Edition,MC Publishing、Glen Rock,NR,
290−291頁）に、93の市販の「ベタイン誘導体」が掲載
されている。今日では、ベタインに関し、多数の科学的
情報、技術的専門知識、および製造能力が存在する。

本明細書に示されている結果は、構造的および挙動的
特性の組合せが、本発明の方法におけるベタインの作用
を促進することを示す。このクラスの両性イオン性界面
活性剤により示される多様性および独特の特性を考慮す
ると（表２および３）、構造バリエーションの幅広いス
ペクトルを示す多様なベタインが、Mycobacterium tube
rculosisの採集を改善する、これらの同族体の能力を評
価するために試みられた。表７は、図９から9Dを作製す
るために使用されたベタインの構造、供給源、およびCA
S 番号のまとめである。

ベタイン電荷構造の調査 図６、７、7A、および８の比較、およびベタイン構造
の考察は、SB−18様活性を促進するのが、スルホネー
ト、４級ジメチルアミン、およびオクタデシル鎖の独特
の組み合わせではないことを示唆する。これに対し、陰
イオンは陽イオンから離れており、そしてこの２つは、
同じ分子に共有結合で接続されていることが事実であ
る。図９に示される実験の目的は、SB−18様分子におけ
る対抗電荷が共存することにより形成される双極子モー
メントの役割を調査することであった。図９に示される
結果は、図２に示されるプロセッシングアッセイの変法
に基づき、電荷および電荷構造に基づいて変化する数種
のベタインを使用した。２つの分子は、市販供給源由来
のものであり、３つは、注文合成品であった。SB−18コ
ントロール（CAS 番号13177−41−８）は、C₁₈−スル
ホプロピルベタインであり、Sigma,St.Louis,MOから購
入した。SB−18は、４級ジメチルアミンをスルホネート
（−SO₃ ^-）基と組み合わせる。DeTaine PB（CAS 番号6
93−33−４）は、C₁₆−カルボキシメチルベタインであ
り、DeForest,Inc.,Boca Raton,FLからサンプルとして
得た。DeTaine PBは、４級ジメチルアミンをカルボキシ
ル（−COO^-）基と組み合わせる。３つの注文合成品の２
つは、Chaska,MNのEcochem,Inc.に契約した（全ての化
学的特徴付けはEcochemによって実施された）。第１の
注文ベタインであるC₁₆−アミドプロピルスルファトエ
チルベタイン（CAS 番号58930−11−３）は、４級ジメ
チルアミンをスルフェート（−OSO₃ ^-）基と組み合わせ
る。C₁₆−アミドプロピルスルファトエチルベタイン（C
16−AmStB）は、Parris N.ら、J.Am.Oil Chem.Soc.53:9
7−100（1976）の手順に従って合成した。第二の注文ベ
タインであるC₁₈−ホスホエチルベタイン（CAS 番号12
6712−89−８）は、４級ジメチルアミンをホスフェート
（−OPO₃ ^-）基と組み合わせる。C₁₈−ホスホエチルベタ
インは、Tsubone,Kら、J.Am.Oil Chem.Soc.67:149−153
（1990）の手順に従って合成した。３つの注文ベタイン
の第三であるC₁₆−アルキル２−ヒドロキシ−３−トリ
メチルアンモニオプロピルホスフェート（C₁₆−AHTMAP:
CAS 番号99485−86−６）は、表３に記載のような「逆
性ベタイン」の区分に属する。C₁₆−AHTMAPは、４級ト
リメチルアミン（γ＝−N⁺（CH₃）_３）をホスフェート
（−OPO₃ ^-）基と組み合わせるが、この分子の独特の性
質は、アルキルが陰イオンに結合されていることであ
る。C₁₆−AHTMAPは、Kao Institute for Fundamental R
esearch,Tochigi,Japanから寄贈品として得、Kurosaki,
T.ら、Chem.Soc.Japan 11:1297−1301（1990）の手順に
従って合成した。C₁₆−AHTMAP化合物の構造は、Ecochem
of Chaska,MNによって確認した、SB−18を陽性コント
ロールとみなし、水を陰性コントロールとして使用し
た。水コントロールおよびC₁₆−AmStB（これを、1mM Tr
is−HCl,pH8.0中に分散した）以外の全洗浄緩衝液は、1
0mM NaHPO₄（pH8.0）および15mM NaClを含有した。各シ
リーズについて４つの複製チューブを調製し、最終濃度
200μＭで使用したC₁₆−AmStB以外は、適切な界面活性
剤で2mMの最終濃度になるように補充した。全チューブ
に、20μｌのM.tuberculosis細菌ストックを接種した。
次いで、全チューブを、遠心分離前に、振盪しながら
（140rpm）37℃で60分間インキュベートした。各界面活
性剤シリーズについて４つの複製物の２連の増幅物を
ａ、ｂ、ｃ、およびｄとして表し、これらは同一であ
る。ダイレクトアリコートの２連の増幅物を適切に標識
した線上に示す。０、20、および100コピーのコピーコ
ントロールを同時に増幅させた。10⁸、10⁹、および10¹⁰
コピーのハイブリダイゼーションコントロールを、同様
にブロットした。

図９に示されるように、試験された界面活性剤の全て
が、このアッセイで同程度に作用するようである。本明
細書に示されている論拠に基づき、逆性ベタインがSB−
18と同様の様式で機能することは、全てのベタイン様分
子がSB−18様活性を有することを実証する。この共通性
の根拠は、対抗電荷が非常に近接して共存し、そのこと
により大きな双極子モーメントを有する電気的に中性な
分子を形成することであると考えられる。この組み合わ
せの結果は、Laughlin,R.G.Langmuir 7:842−847（199
1）：「Zwitterionic functional groups possess the
greatest polarity found within the nonionic class
of hydrophilic groups」に最もよく総括されている。
異なるイオン基が、本明細書中に記載されているアッセ
イで互換的に使用され得ることにより、これらの界面活
性剤の識別特性としての頭部基の極性度が同定される。
例えば、ポリオキシエチレン基によって生成される極性
度は、電気的に中性で、いわばSB−18のアンモニオ−プ
ロパンスルホネート部分とほぼ同じ分子サイズのもので
あるが、比較において有意ではない。これは、Brij 76
（CAS 番号9005−00−９）およびSB−18のCMCおよびク
ラフト点をナトリウムオクタデシルスルホネートと比較
することによって例証される。Brij 76（ステアリル−
エチレンオキシド（C₁₈E₁₀））は、約３×10^-5MのCMC
（オレイル等価物に基づき、Schott,H.ら、J.Phar.Sci.
64:658−664（1975）から概算）、45.5℃のクラフト
点、および64℃の曇り点（Schott,H.ら、J.Phar,Sci.6
5:979−981（1976））を有する。SB−18は、約２×10^-6
のCMC（Nandakumar,T.N.ら、J.Oil Tech.Assoc.India 1
1:31−34（1979））、および、純水中89℃および10mM N
aCl中37.5℃のクラフト温度（Tsujii,K.ら、J.Phys.Che
m.82:1610−1614（1978））を有する。ナトリウムオク
タデシルスルホネートの臨界温度は、7.5×10^-4M濃度で
57℃である（Tartar,H.V.ら、J.Am.Chem.Soc.61:539−5
44（1939））。SB−18は最も可能性が低い（例えば、最
低CMC）であるが、塩の存在下で最も低いクラフト温度
（例えば、水和結晶物の最低融点）を有する。明らか
に、CMC、クラフト温度、および極性の関係は複雑であ
るが、しかし、電解質存在下での構造水に対する両性イ
オンのめざましい能力が、機能にとって重要であるよう
である。従って、表２および３を参照し、そして掲載の
陽イオンおよび陰イオンを調査すると、本発明の方法に
おいて機能性ベタインを生産するために組み合わせられ
得る多数のさらなるイオンが想起される。

ベタイン架橋構造の調査 図９に示される結果は、ベタイン構造の重要な性質が
対抗電荷の存在であることを示唆する。これらのデータ
はまた、ベタイン架橋構造の重要性と結びつけて、架橋
構造およびアルキル鎖の組み合わせがアッセイの状況内
でミセル形成を可能とする限り、ベタインはSB−18様活
性を示すことを示唆する。図９中に使用された構造の調
査は、DeTaine PBがメチル架橋を有し、スルファトエチ
ルベタインおよびホスホエチルベタインがエチル架橋を
有し、SB−18がプロピル架橋を有し、およびC₁₆−AHTMA
Pがヒドロキシプロピル架橋を有することを示す。図9A
に示される結果は、さらなる架橋構造および電荷組み合
わせを示す。

図9Aに示される結果は、図２に示されるプロセッシン
グアッセイの変法に基づき、電荷を分離する架橋構造に
基づいて変化する数種のベタインを使用する。２つの分
子は市販供給源由来であり、３つは注文合成品であっ
た。Ammonyx MO（CAS 番号3332−27−２）は、C₁₄−ジ
メチルアミンオキシド（架橋は、NO結合である:N⁺−
O^-）であり、Stepan Company,Northfield,ILからサンプ
ルとして得た。Ammonyx MOは、図９に考察される双極子
モーメント構造上の別のバリエーションとみなされ得る
こともまた、注目されるべきである。Darvan NSは、表
３に記載されているようなｃ−アルキルベタインであり
（アルキルは架橋に接続されている）、R.T.Vanderbil
t,Nowalk,CTからサンプルとして得た。製造者は、Darva
n NSが、ｃ−デシルベタイン（CAS 番号96−55−９）
とｃ−セチルベタイン（CAS 番号95−56−０）との混
合物であると明示している。各々の比率は明示されてい
ない。３つの注文合成品は、Chaska,MNのEcochem,Inc.
に契約した（全ての化学的な特徴づけは、Ecochemによ
って実施された）。

第一の注文ベタインはC₁₈−カルボキシエチルベタイ
ン（CAS 番号30612−73−８）であり、エチル架橋（R₄
＝−CH₂CH₂−）を有し、Weers,J.G.ら、Langmuir 7:854
−867（1991）の手順によって合成した。第二の注文ベ
タインは、C₁₈−スルホブチルベタイン（CAS 番号2231
3−73−１）であり、ブチル架橋（R₄＝−CH₂CH₂CH₂CH₂
−）を有し、Parris,N.ら、J.Am.Oil Chem.Soc.53:97−
100（1976）の手順に従って合成した。第三の注文ベタ
インは、C₁₆−ヒドロキシプロピルスルホベタイン（CAS
番号7425−12−９）であり、２−ヒドロキシプロピル
架橋（R₄＝−CH₂CH（OH）CH₂−）を有し、Parris,N.
ら、J.Am.Oil Chem.Soc.53:60−63（1976）の手順に従
って合成した。2mMのSB−18を陽性コントロールとして
使用し、そして水を陰性コントロールとして使用した。
水コントロール以外の全洗浄緩衝液は、10mM NaHPO
₄（リン酸ナトリウム緩衝液、NaHPO₄およびNa₂HPO₄の混
合物）（pH8.0）および15mM NaClを含有した。各シリー
ズについて４つの複製チューブを調製し、最終濃度10mM
にしたDarvan NS以外は、適切な界面活性剤で最終濃度
が2mMになるように補充した。全チューブに、20μｌの
M.tuberculosis細菌ストックを接種した。次いで、全チ
ューブを、遠心分離前に、振盪しながら（140rpm）37℃
で60分間インキュベートした。各界面活性剤シリーズに
ついて４つの複製物の２連の増幅物をａ、ｂ、ｃおよび
ｄとして表し、これらは同一である。ダイレクトアリコ
ートの２連の増幅物を適切に標識した線上に示す。０、
20、および100コピーのコピーコントロールを同時に増
幅させた。10⁸、10⁹、および10¹⁰コピーのハイブリダイ
ゼーションコントロールを、同様にブロットした。

再度、C₁₆−ヒドロキシプロピルスルホベタイン以外
は、全ての試験化合物が本発明の方法において機能し
た。詳細には、全ての試験化合物がSB−18様活性を示し
た。興味あることに、C₁₀およびC₁₆の組み合わせである
Darvan NSは、最低限で作用した。各々の比率は不明で
あるが、Darvan NSは極度に薄い液体であり、よりおそ
らくはココ誘導体であり、それは非常に高いC₁₀誘導体
濃度を有することを示唆する。それにもかかわらず、ｃ
−アルキルは、ある程度のSB−18様活性を示した。アミ
ドオキシドによるさらなる実験は、凝集が絶えず観察さ
れたが、この構造が優れた有効性を有することを示し
た。不運にも、臨床条件下でのAO鎖長の増加は差し支え
があり得た。例えば、C₁₈−AOのクラフト点は約43℃で
あり、塩析型であった（Tsujii,K.ら、Yukagaku 30:495
−499（1981））。さらに、図９に示されるように、ア
ミンオキシドは、双極子モーメントの構造化可変性のも
う１つの例を提供する。C₁₈−カルボキシエチルベタイ
ンおよびC₁₈−スルホブチルブタインは両方とも、一般
的にSB−18と同様の様式で挙動した：これらの２つのベ
タインを使用する数種のプロセッシング実験は、通常か
なり均一な結果を生じた。

C₁₆−ヒドロキシプロピルスルホベタインが、遠心分
離による細菌の回収を促進できないことは、NaHPO₄への
添加に際して界面活性剤が沈殿したことによって説明さ
れ得る。ベタイン架橋構造の種々のイオンとの相互作用
に関する情報に基づいて、当業者は、C₁₆−ヒドロキシ
プロピルスルホベタインが使用され得るようなシステム
パラメーターを改変し得た。例えば、４〜５オングスト
ロームの電荷分離が、塩溶が可能になる最短の電荷間距
離であり（プロピル距離は5.5オングストロームである
（Tsujii K.ら、Yukagaku 30:495−499（1981）））、
塩溶挙動の促進が以下の順；陰イオンについてはSCN^-〉
I^-〉NO₃ ^-〉Cl^-、陽イオンついてはK⁺＝NH₄ ⁺〉Na⁺（Tsuj
ii,K.ら、J.PHys.Chem.82:1610−1614（1978））に従う
とき、C₁₆−ヒドロキシプロピルスルホネートの有用性
を促進するために緩衝液組成は改変され得る。これらの
実験の結果は、図10に示され、考察されている。

これらのデータから、ベタイン有効性は大部分は架橋
構造よりも電荷構造に依存するというLaughlin,R.G.Lau
bmuir 7:842−847（1991）の結果に同意するように導か
れる。言い換えると、架橋がシステム条件下でミセル形
成を可能とする限り、本発明の方法においてこれらの界
面活性剤の使用を促進するのは同じ分子上の電荷の共存
であるようである。従って、架橋構造の重要性は、アッ
セイ条件の状況において所定の界面活性剤の生産的提示
を可能にすることにおいて、主に機能することであるよ
うである。例えば、架橋が、アッセイの温度、電解質、
および電解濃度を与えられてミセル形成を可能にすると
き、ベタインはSB−18様活性を示す。

ベタイン機能についてのアルキルおよびアルキル結合の
調査 結果が図９および図9Aのようになる実験で使用された
構造の綿密な調査により、アルキル構造の複合配列が本
発明の方法において使用されていることが明白になる。
例えば、C₁₀、C₁₄、C₁₆、およびC₁₈直鎖炭化水素は、こ
れらの例における疎水領域（R₁）の基礎であった。さら
に、スルファトベタインは、アルキルを４級窒素へ共有
結合接続させるためにアミドプロピル結合を使用する。
ベタイン機能は、アルキル構造にさほど依然しないこと
が言外にある。すなわち、電荷、架橋構造、およびアル
キル構造の組み合わせがアッセイの状況内でミセル形成
を可能にする限り、ベタインはSB−18様活性を示す。こ
のことをさらに例証するために、数種のさらなるベタイ
ンを試験した。図9Bに示される結果は、図２に示される
プロセッシングアッセイに基づき、そしてアルキル構
造、組成物、および４級窒素への結合に基づいて変化す
る数種のベタインを使用する。５つの全ての分子は、市
販源由来であった。Velvetex AB−45（CAS 番号68424
−94−２）は、アルキル鎖供給源としてヤシ油を使用し
（ヤシ油の組成は上記で示す）、Henkel Corporation,E
mery Group Cospha,Hoboken,NJからサンプルとして得
た。Velvetex AB−45のアルキル結合は、単にアルキル
鎖の伸長である。Mirataine ASC（CAS 番号108797−84
−８）は、３−ブトキシ−２−ヒドロキシ官能基（func
tionality）をアルキル部分の４級窒素への接続結合部
分として使用し、Rhone−Poulenc,Surfactants ＆ Spec
ialty Division,Cranberry,NJからサンプルとして得
た。このCAS 番号の情報は構造を以下のように明示し
ている：「１−プロパンアンモニウム、３−ブトキシ−
２−ヒドロキシ−Ｎ−（−２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−N,N−ジメチル−、内部塩」。この液体の
粘度は、ほぼドデシル構造のアルキルがブトキシに結合
されていることを示唆するが、正確な構造は不明であ
る。Schercotaine IAB（CAS 番号6179−44−８）は、
アルキル部分を４級窒素に結合するためにアミドプロピ
ル配列を使用し、Scher Chemical,Inc.,Clifton,NJから
サンプルとして得た。製造者は、アルキルが「イソステ
アリル」であることを明示しており、その分子がなんら
かの未確定の様式で分岐し得ることを示している。しか
し、CAS 番号の情報は単に、アルキル構造が「オウタ
デシル」であることを明示するのみである。Velvetex O
LB−50（CAS 番号871−37−４）は、アルキル鎖として
オレイル基（Ｃ_18:1）を使用し、（例えば、二重結合の
導入）、Henkel Corporation,Emery Group Cospha,Hobo
ken,NJからサンプルとして得た。Incronam B−40は、非
常に長いアルキル鎖（C₂₂）であり、Croda,Inc.,Parsip
pany,NJからサンプルとして得た。Incronam B−40に対
してCAS 番号は与えられなかったが、同様の製品が合
衆国外で同じ製造業者によって、同じ商標名で販売され
ていて、その活性成分は「ベタンアミド」であり、CAS
番号は84082−44−０であると掲載されている。CAS
番号の情報は、そのアルキル組成をC₈−C₂₂の混合物で
あると明示している。両方ともペーストとして販売さ
れ、それは、非常に長いアルキル鎖が優勢であることを
示す。Incronam B−40界面活性剤ストックは、イソアミ
ルアルコール：水の10:1混合物中に、ペーストの一部を
溶解することによってのみ生成し得た。2mMのSB−18を
陽性コントロールとして使用し、水コントロールを陰性
コントロールとして使用した。水コントロール以外の全
洗浄緩衝液は、10mM NaHPO₄（pH8.0）および15mM NaCl
を含有する。各シリーズについて４つの複製チューブを
調製し、200μＭの最終濃度にしたInconam B−40以外
は、適切な界面活性剤で2mMの最終濃度になるように補
充した。界面活性剤のフロキュレーションはこれらの条
件下で生じた。全チューブに、20μｌのM.tuberculosis
細菌ストックを接種した。次いで、全チューブを、遠心
分離前に、振盪しながら（140rpm）37℃で60分間インキ
ュベートした。各界面活性剤シリーズについて４つの複
製物の２連の増幅物をａ、ｂ、ｃ、およびｄとして表
し、これらは同一である。ダイレクトアリコートの２連
の増幅物を適切に標識した線上に示す。０、20、および
100コピーのコピーコントロールを同時に増幅させた。1
0⁸、10⁹、および10¹⁰コピーのハイブリゼーションコン
トロールを、同様にブロットした。

再度、Inconam B−40を除いて、これらの全てのベタ
インがSB−18様活性を示す。Velvetex AB−45は、図８
において見られるより、これらの実験においてわずかに
より均一な結果を生じた。Mirataine ASCは、鎖の長さ
は不明であるが、非常に薄い液体であり、ミコバクテリ
アを分散し得ないようであった。凝集のために、これら
の結果は、典型的にはより短い鎖のベタインによって見
られた。Schercotaine IABおよびVelvetex OLB−50は両
方ともオクタデシル界面活性剤であり、前者は飽和鎖で
あり、後者は不飽和鎖である。これらの両ベタインは、
SB−18によって通常認められる結果を生じた：これらの
ベタインによるプロセッシングは、かなり均一な結果を
生じたが、未精製のサンプルを用いると、わずかにより
変化が観察された。アルキル部分がシステム条件下でミ
セル形成を可能にする限り、本発明の方法においてこれ
らの界面活性剤の使用を促進するのは、同じ分子上にお
ける電荷の共存であることが、明白な結論である。C₁₆
−ヒドロキシプロピルスルホベタイン（図9A）に類似す
るInconam B−40はNaHPO₄への添加に際して沈殿し、従
って、同程度の有効性を示すとは予測されなかった。ベ
タインの架橋構造と種々の電解質との相互作用に関する
情報に基づいて、Incronam B−40は、C₁₆−ヒドロキシ
プロピルスルホベタインよりもより困難な問題を提示す
ることが示される（図9A）。例えば、４〜５オングスト
ロームの電荷分離が、塩溶し得る最短の電荷間距離であ
って（メチルの距離は約3.1オングストロームであった
（Tsujii K.ら、Yukagaku 30:495−499（1981）））、
塩析挙動は以下の順で悪化される；陰イオンについては
SCN^-〉I^-〉NO₃ ^-〉Cl^-、陽イオンについてはK⁺＝NH₄ ⁺〉N
a⁺である（Tsujii,K.ら、J.Phys.Chem.82:1610−1614
（1978））とき、Incronam B−40の有用性を促進しよう
として、緩衝液組成の改変に関して制限される。言い換
えると、単に電解質を最少化すると、一般にイオン性界
面活性剤に類似する状況に制限され得る。この研究方針
を追跡する試みの結果は、図10に示され、考察されてい
る。

天然油由来のベタイン 市販により入手可能なベタインの大多数は、天然油
（主にヤシ油）由来である。図８、９、9A、およびＢの
結果に基づくと、これらのベタインは同様に、本発明の
方法において機能するはずである。図9Cおよび9Dに示さ
れる結果は数種の異なるベタインを使用し、全てのアル
キルはもっぱら天然オイル由来である。これらの構造
は、アルキルの長さ、アルキル構造、アルキル混合物、
４級窒素への結合、架橋構造、および陰イオン部分に基
づいて異なる。本質的に、これらのベタインは、ベタイ
ン解析の種々な局面間の関連をさらに調査するために独
特の好機を提供する。各実験をまず示し、続いて両図の
考察を示す。

図9Cに示される結果は、図２に示されるプロセッシン
グアッセイの変法に基づき、もっぱら天然油に由来する
数種のベタインを使用する。５つの全ての分子は、市販
供給源由来であった。TEGO Betaine L5351（CAS 番号
「登録」）は、アミドプロピル結合と組み合わせて、ア
ルキル側供給源としてヤシ油を使用するカルボキシメチ
ルベタインである。TEGO Betaine L5351は、Henkel Cor
poration,Emery Group Cospha,Hoboken,NYからサンプル
として得た。Coeos nucifera由来のヤシ油は、以下の組
成を有する脂肪酸の複合混合物である:45.4％ラウリン
酸（C₁₂）、18.0％ミリスチン酸（C₁₄）、10.5％パルミ
チン酸（C₁₆）、2.3％ステアリン酸（C₁₈）、0.4％アラ
キジン酸（C₂₀）、7.4％オレイン酸（Ｃ_18:1）、および
5.4％その他の脂肪酸（オイル組成は、CRC Handbook of
Chemistry and Physicsの第55編、CRC Press,Clevelan
d,OH（1974）Ｄ−192−193頁から集計）。Crosultaine
C−50（CAS 番号68139−30−０）は、アミドプロピル
結合との組み合わせて、ヒドロキシプロピル架橋、およ
びアルキル鎖供給源としてヤシ油を使用するスルホベタ
インである。Crosultaine C−50は、Croda,Inc.,Parsip
pany,NJからサンプルとして得た。Incronam BA−30（CA
S 番号は明示されず）は、アミドプロピル結合と組み
合わせて、疎水性ドメインの基礎として「ババス−オイ
ル」を使用するカルボキシメチルベタインである。Incr
onam BA−30は、Croda,Inc.,Parsippany,NJからサンプ
ルとして得た。Attalea funifera由来のババス−オイル
は、以下の組成を有する脂肪酸の複合混合物である:44.
1％ラウリン酸（C₁₂）、15.4％ミリスチン酸（C₁₄）、
8.5％パルミチン酸（C₁₆）、２％ステアリン酸
（C₁₈）、0.2％アラキジン酸（C₂₀）、16.1％オレイン
酸（Ｃ_18:1）、1.4％リノール酸（Ｃ_18:2）、および11.
6％その他の脂肪酸（オイル組成は、CRC Handbook of C
hemistry and Physicsの第55編、CRC Press,Cleveland,
OH（1974）Ｄ−192−193頁から集計）。Rewoteric AM−
R40（CAS 番号71850−81−２）は、アミドプロピル結
合と組み合わせて、アルキル鎖供給源としておそらくヒ
マシ油を使用するカルボキシメチルベタインである。Re
woteric AM−R40は、Sherex Chemical Company,Dublin,
OHからサンプルとして得た。Ricinus communis由来のヒ
マシ油は、脂肪酸の複合混合物であるが、おもにリシノ
レイン酸（87％）、およびオレイン酸（7.4％）および
リノール酸（3.1％）からなる（オイル組成は、CRC Han
dbook of Chemistry and Physicsの第55編、CRC Press,
Cleveland,OH（1974）Ｄ−192−193頁から集計）。リシ
ノレイン酸、すなわち12−ヒドロキシ−９−オクタデセ
ン酸（cis）は、以下の構造を有する不飽和C₁₈鎖であ
る:C₆H₁₃CH（OH）CH₂CH＝CH（CH₂）₇COOH。リノール
酸、すなわち9,12−オクタデカジエン酸はまた、以下の
構造を有する不飽和C₁₈鎖である:CH₃（CH₂）₄CH＝CHCH₂
CH＝CH（CH₂）₇COOH。Schercotaine WOAB（CAS 番号
「指定なし」）はおそらく、アミドプロピル結合と組み
合わせて、アルキル鎖供給源としてコムギ胚芽油を使用
するカルボキシメチルベタインである。Schercotaine W
OABは、Scher Chemicals,Inc.,Clifton,NJからサンプル
として得られた。Triticum aestivum由来のコムギ胚芽
油は、脂肪酸の複合混合物であるが、おもにリノール酸
（52.3％）、オレイン酸（28.1％）およびリノレン酸
（3.6％）からなる。残り約16％は、ラウリン酸、ミリ
スチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、およびアラキ
ジン酸の混合物である（オイル組成は、CRC Handbook o
f Chemistry and Physicsの第55編、CRC Press,Clevela
nd,OH（1974）Ｄ−192−193頁から集計）。リノレン
酸、すなわち9,12,15−オクタデカトリエン酸（cis、ci
s、cis）は、以下の構造を有するまた別の不飽和C₁₈鎖
である:CH₃［CH₂CH＝CH］_３（CH₂）₇COOH。2mMのSB−18
を陽性コントロールとして使用し、水を陰性コントロー
ルして使用した。水コントロール以外の全洗浄緩衝液
は、10mM NaHPO₄（pH8.0）および15mM NaClを含有し
た。各シリーズについて、４つの複製チューブを調製し
た。Incronam BA−30、Rewoteric AM−R40、およびSche
rcotaine WOABを、それぞれの洗浄緩衝液に加えて最終
濃度2mMにし、TERO Betaine L5351およびCrosultaine C
−50は、最終濃度10mMにした。これらの界面活性剤はど
れも、リン酸ナトリウム緩衝液への添加に際して沈殿を
生じなかった。全チューブに、20μｌのM.tuberculosis
細菌ストックを接種した。次いで、全チューブを、遠心
分離前に、振盪しながら（140rpm）37℃で60分間インキ
ュベートした。各界面活性剤シリーズについて４つの複
製物の２連の増幅物をａ、ｂ、ｃ、およびｄとして表
し、これらは同一である。ダイレクトアリコートの２連
の増幅物を適切に標識した線上に示す。０、20、および
100コピーのコピーコントロールを同時に増幅させた。1
0⁸、10⁹、および10¹⁰コピーのハイブリダイゼーション
コントロールを、同様にブロットした。

図9Dに示される結果は、図２に示されるプロセッシン
グアッセイの変法に基づき、またもっぱら天然油に由来
する数種のベタインを使用する。これらの構造は、アル
キルの長さ、アルキル構造アルキル混合物、４級窒素へ
の結合、架橋構造、および陰イオン部分に基づいて異な
る。５つの全ての分子は、市販供給源由来であった。Ch
embetaine S（CAS 番号：明示されず）は、アミドプロ
ピル結合と組み合わせて、アルキル鎖供給源としてダイ
ズ油を使用するカルボキシメチルベタインである。Chem
betaine Sは、Chemron Cporporation,Paso Robles,CAか
らサンプルとして得た。Glycine soja由来のダイズ油
は、脂肪酸の複合混合物であるが、おもにリノール酸
（50.7％）、オレイン酸（28.9％）、およびパルミチン
酸（9.8％）からなる。さらなる成分は、リノレン酸
（6.5％）、ステアリン酸（2.4％）、およびアラキジン
酸（0.9％）を含有する（オイル組成は、CRC Handbook
of Chemistry and Physicsの第55編、CRC Press,Clevel
and,OH（1974）Ｄ−192−193頁から集計）。Hetaine CL
A（CAS 番号「なし」）は、アミドプロピル結合と組み
合わせて、アルキル鎖供給源としてカノーラ油（canola
oil）を使用する未知構造のベタインである。Hetaine
CLAは、Heterene,Inc.,Paterson,NJからサンプルとして
得た。カノーラ油の組成は確認されていない。Crosulta
ine T−30（CAS 番号は与えられていない）は、アミド
プロピル結合と組み合わせて、ヒドロキシプロピル架
橋、およびアルキル鎖供給源として獣脂を有するスルホ
ベタインである。Crosultaine T−30は、Croda,Inc.,Pa
rsippany,NJからサンプルとして得た。獣脂は、典型的
には、牛肉（Bovis taurus）または羊肉（Ovis aries）
由来である。牛肉由来の獣脂は以下の組成を有する:49.
6％オレイン酸、27.4％パルミチン酸、14.1％ステアリ
ン酸、6.3％ミリスチン酸、および2.5％リノール酸。羊
肉由来の獣脂は以下の組成を有する:36.0％オレイン
酸、24.6％パルミチン酸、30.5％ステアリン酸、4.6％
ミリスチン酸、および4.3％リノール酸（オイル組成
は、CRC Handbook of Chemistry and Physicsの第55
編、CRC Press,Cleveland,OH（1974）Ｄ−192−193頁か
ら集計）。Crosultaine T−30を製造するために使用さ
れた獣脂の供給源は不明である。Rewoteric TEG（CAS
番号70750−68−８）は、アルキル鎖供給源として獣脂
を有するビス−ヒドロキシエチルグリシネートである。
Rewoteric TEGは、Sherex Chemical Company,Dublin,OH
からサンプルとして得た。Rewoteric TEGを製造するた
めに使用された獣脂の供給源は不明である。Crosultain
e E−30（CAS 番号は与えられていない）は、アミドプ
ロピル結合と組み合わせて、ヒドロキシプロピル架橋、
およびアルキル鎖供給源として菜種油を使用するスルホ
ベタインである。Crosultaine E−30は、Croda,Inc.,Pa
rsippany,NJからサンプルとして得た。Brassica campes
tris由来の菜種油は、脂肪酸の複合混合物であるが、お
もにエルカ酸（50％）、オレイン酸（32％）、およびリ
ノール酸（15％）からなる（オイル組成は、CRC Handbo
ok of Chemistry and Physicsの第55編、CRC Press,Cle
veland,OH（1974）Ｄ−192−193から集計）。エルカ
酸、すなわちcis−13−ドコセン酸は、以下の構造を有
する不飽和C₂₀鎖である:CH₃（CH₂）₇CH＝CH（CH₂）₁₁CO
OH。

まず、Hetaine CLA、Crosultaine T−30、およびCros
ultaine E−30の全ては、NaHPO₄への添加の際に沈殿し
た（最終濃度:2mM界面活性剤）。従って、条件を変え、
代わりに50mM Tris−HCl（pH8.0）を使用した。2mMのSB
−18を陽性コントロール（典型的には、10mM NaHPO₄（p
H8.0）、15mM NaCl緩衝液中）として使用し、水を陰性
コントロールとして使用した。水コントロール以外の界
面活性洗浄緩衝液は、50mM Tris−HCl（pH8.0）を含有
した。各シリーズについて、４つの複製チューブを調製
した。Chembetaine SおよびRewoteric TEGは、各洗浄緩
衝液に添加して最終濃度を2mMにし、Hetaine CLA、Cros
ultaine T−30、およびCrosultaine E−30は、最終濃度
を200μＭにした。Tris緩衝液中でHetaine CLAおよびCr
osultaine E−30は濁ったが、一方、Crosultaine T−30
は透明のままであった。しかし、Crosultaine T−30
は、実験の１つにおける最終の遠心分離の際に沈殿した
（示されていない）。全チューブに、20μｌのM.tuberc
ulosis細菌ストックを接種した。次いで、全チューブ
を、遠心分離前に、振盪しながら（140rpm）37℃で60分
間インキュベートした。各界面活性剤シリーズについて
４つの複製物の２連の増幅物をａ、ｂ、ｃ、およびｄと
して表し、これらは同一である。ダイレクトアリコート
の２連の増幅物を適切に標識した線上に示す。０、20、
および100コピーのコピーコントロールを同時に増幅さ
せた。10⁸、10⁹、および10¹⁰コピーのハイブリダイゼー
ションコントロールを、同様にブロットした。

図9Cおよび図9Dに示されるベタインが、本発明の方法
における有効性に関して、アルキル部分の混合物、複合
アルキル構造、異なる電荷組み合わせ、および異なる結
合の影響を調査するために選択された。図9Bで結論され
るように、これらの構造が通常のシステムパラメータ下
でミセル形成を可能にする限り、アルキル構造に対する
改変は本発明の方法に関して非常に影響が少ない。言い
換えると、電荷、架橋構造、およびアルキルの組み合わ
せがミセル形成が生じ得るようなものであれば、ベタイ
ンは、遠心分離によるミコバクテリア回収を増強する、
獣脂、ヤシ油、ババスー油、ダイズ油、菜種油、および
コムギ胚芽油は、飽和および不飽和のアルキル鎖でなる
広範囲の複合混合物を提供し、そしてヒマシ油は、ヒド
ロキシル化アルキルを利用する。Rewoteric TEGを除い
て、疎水性部分は、アミドプロピル基を介して４級窒素
に結合され、そして基として、これらの構造は、カルボ
キシメチル部分またはヒドロキシプロピルスルホ部分の
いずれかと併用して使用される。ベタイン性能に関して
架橋構造に関する情報に基づいて、メチレン架橋および
ヒドロキシプロピル架橋は両方とも、本明細書に記載の
アッセイにおいて、より長いアルキル鎖を使用する能力
を低下させる。しかし、この溶解度の減少は、アミドプ
ロピル結合の使用によってある程度克服される。

TEGO Betaine L5351およびCrosultaine C−50は両方
とも、この実験において、典型的に見られるよりもより
均一な結果を生じた（図9C）。主に短鎖からなるもう１
つの油であるIncronam BA−30は、凝集のより特徴的な
増幅パターンを生じたが、一般に回収改善に関するSB−
18様活性をなお示した（図9C）。Rewoteric AM−R40お
よびSchercotaine WOABに関する本明細書に示されてい
る結果は、かなり典型的であった：凝集に起因する増幅
パターンが同様に、ここで観察された（図9C）。おもに
オクタデシルであり、典型的に予想以上により多くの凝
集を示した別の界面活性剤は、Chembetaine Sであっ
た。演繹的に、オクタデシル界面活性剤は同様の挙動を
することが予期された。例えば、SB−18、C₁₈−カルボ
キシエチルベタイン、およびC₁₈−スルホブチルベタイ
ン（図9A）、Velvetex OLB−50およびSchercotaine IAB
（図9B）、Rewoteric AM−R40およびSchercotaine WOAB
（図9C）、およびChembetain S、Crosultaine T−30、R
ewoteric TEGおよびCrosultaine E−30（図9D）は全
て、主に飽和または不飽和のオクタデシル様鎖から構成
される。全ては、回収有効性の改善において、より短い
鎖より良好に作用したが、凝集の緩和に関して変化す
る。おそらく、種々の鎖長の混合物の使用あるいは二重
結合または他の官能基（例えば、水酸基）の包含による
界面活性剤の複雑度の増大は、コード形成に関連するミ
コール酸および脂質を可溶化する能力を妥協させる（co
mpromise）。あるいは、これらの市販標品の多くは不純
品であり、そしておそらくこの因子が全体的な有効性に
影響した。

おそらく図9Cおよび9Dにおいて試験された最も興味深
い組み合わせは、Hetaine CLAにより提供された組合せ
であるCrosultaine T−30、およびCrosultaine E−30で
あった。「カノーラ油」が、Hetaine CLA製造者がトウ
モロコシ油を意味するのであれば、Zea mays由来のトウ
モロコシ油は、脂肪酸の複合混合物であるが、おもにオ
レイン酸（49.6％）、リノール酸（34.3％）、およびパ
リミチン酸（10.2％）からなる（オイル組成は、CRC Ha
ndbook of Chemistry and Physicsの第55編、CRC Pres
s,Cleveland,OH（1974）Ｄ−192−193頁から集計）。Ve
lvetex OLB−50（オレイルカルボキシメチルベタイン）
が問題なく機能したことは、非常に粘度が高いHetaine
CLAのアルキル混合物が、おそらく非イオン特性を際だ
たせる基（例えば、ヒドロキシプロピルスルホベタイ
ン）を含む、異なるものであることを示唆する。Rewote
ric TEGが問題なく機能する一方でCrosultaine T−30が
重要でない程度の溶解度の問題を示した（例えば、両方
とも獣脂を使用する）ことは、陰イオン（−COO^-対−SO
₃）の溶解度および架橋のヒドロキシル化の両方の性質
に言及する。Crosultaine E−30は、おそらく、最も極
度のベタインの１つである：それは、おもに不飽和のC
₂₀およびC₁₈部分をから構成され、そしてスルホネート
陰イオン（−SO₃ ^-）を有するヒドロキシプロピル架橋を
利用する。

しかし、図9Dの最も興味深い局面は、Hetaine CLAお
よびCrosultaine E−30の両方を用いて、何が濁った溶
液であるように見えるか（例えば、曇り点）を提示する
ことであった。C₁₆−ヒドロキシプロピルスルホベタイ
ン（図9A）とは逆に、これらの両ベタインは、本発明の
方法において機能した。これらの結果は矛盾していな
い。逆に、曇り点は非イオン性界面活性剤の親水性部分
の脱水により生じると考えられ、そして曇り点は、クラ
フト温度とは対照的に十分に定義された温度ではないの
で、ミセルは、濁りが観察される場合にもなお存在し得
る。一般に、濁りが開始する時点で、ミセル重量および
凝集数は温度上昇を伴って徐々に増加し、そして温度が
さらに上昇すると、最終的に相分離が起こる（Nagkagaw
a,Tら、「Colloidal Surfactans」,Academic Press,New
York（1963）121−135頁）。従って、Hetaine CLAおよ
びCrosultaine E−30は相分離を起こさなかったので、
これらはプロセッシングアッセイにおいて機能すること
が予期された。

Nilsson,P.ら、J.Phys.Chem.88:6357−6362（1984）
は、スルホベタインにおいて曇り点を観察し、そしてFa
ulkner,P.G.ら、Langmuir 5:924−926（1989）は、スル
ホベタインにおける架橋のヒドロキシル化の際に生じる
変化を記述した。これらの結果の興味深い局面は、ベタ
インの１つであるC₁₆−ヒドロキシプロピルスルホベタ
インがイオン性界面活性剤として挙動し、そしてリン酸
緩衝液中で塩析され；一方異なるが非常に密接に関連し
たベタインであるCrosultaine E−30（Ｃ_20:1−、Ｃ
_18:1−、およびＣ_18:2−アミドプロピルヒドロキシプロ
ピルスルホベタイン）は非イオン性界面活性剤として挙
動し、そして濁りを生じた（この考察の目的のために、
Hetaine CLAの構造は不明である）ことである。アミド
プロピル結合、ヒドロキシプロピル架橋、およびアルキ
ル鎖長の相互作用に関するベタイン構造のいくつかの非
常に興味深い局面を示唆することに加え、これらの所見
は、電解質の添加に関する推定可能な反応を示唆する。
例えば、C₁₆−ヒドロキシプロピルスルホベタインの溶
解度は、クラフト点の上昇効果のために、異なるイオン
（例えば、NaHPO₄に対してヨウ化カリウム（KI））によ
って改善するが（Tsujii.K.ら、J.Phys.Chem.82:1610−
1614（1978）;Tsujii,K.ら、Yukagaku 30:495−499（19
81））、一方、同じイオンの添加は、Hetaine CLAおよ
びCrosultaine E−30の曇り点を悪化させることが予期
された（Schott,H.ら、J.Pharm.Sci.64:658−664（197
5）;Schott,H.ら、J.Pharm.Sci.65:979−981（197
6））。事実、推定されたように、100mM KIの添加は、C
₁₆−ヒドロキシプロピルスルホベタインの透明な溶液を
提供したが、Crosultaine E−30およびHetaine HLAによ
り濁度をさらに悪化させた。従って、後者の２つの利用
には、塩濃度を最少にすることが必要とされる。一般
に、アミドプロピル機能は、非イオン特性を増強するよ
うである。例えば、アミドロピル部分は、Hsiao,L.ら、
J.Phys.Chem.60:657−660（1956）に考察されているよ
うにポリオキシエチレン基の数を増加することと同様
に、界面活性剤の親水性部分を増加させることにより、
全体の頭部基を増加させる。

しかし、ここに提供されている市販のサンプルの使用
に関する重要な問題の１つは、その個々の純度である。
例えば、SB−18（Sigma,St.Louis,MO）は、精製内部塩
として提供された。これは純度98％とされている。Incr
onam B−40、Hetaine CLA、Crosultaine T−30、および
Crosultaine E−30は全て、反応生成物の粗混合物とし
て提供される。製造者により明示されたこれらの物質の
各々の活性物質パーセントは、それぞれに、44％〜48
％;38％〜42％;30％〜34％；および30％〜34％である。
さらに、各々の塩（NaCl）含有量は、それぞれ4.2％〜
4.6％;5％;2.4％〜4.0％；および2.5％〜4.0％とされて
いる。これらの界面活性剤のいずれかの2mM溶液を生成
する試みは、見落としにより、また３−4mM NaCl溶液を
生じ、これは、ある場合において、利用可能でない溶液
を作製する。

図10は、C₁₆−ヒドロキシプロピルスルホベタイン、I
ncronam B−40、Hetaine CLA、Crosultaine T−30、お
よびCrosultaine E−30の利用を促進するように改変さ
れるように、異なるアッセイパラメーターを調査する。
アッセイ条件は、以下のように改変された:C₁₆−ヒドロ
キシプロピルスルホベタインおよびCrosultaine T−30
緩衝液は、10μM Tris−HCl（pH8.0）および50mM KIか
ら構成された。各々は、2mM界面活性剤で透明な溶液で
あった。Incronam B−40、Hetaine CLA、およびCrosult
aine E−30緩衝液は、単に200mM Tris−HlC（pH8.0）で
あった。各界面活性剤は、200μＭで透明な溶液であっ
た。各緩衝液はまた、37℃に平衡化された。SB−18コン
トロールは、10mM Tris−HCl（pH8.0）および50mM KI緩
衝液を使用した。各シリーズについて、４つの複製チュ
ーブを調製した。全チューブに、20μｌのM.tuberculos
is細菌ストックを接種した。次いで、全チューブを、遠
心分離前に、振盪しながら（140rpm）37℃で60分間イン
キュベートした。４つの複製物の２連の増幅物をａ、
ｂ、ｃ、およびｄとして表し、これらは同一である。ダ
イレクトアリコートの２連の増幅物を適切に標識した線
上に示す。０、20、および100コピーのコピーコントロ
ールを同時に増幅させた。10⁸、10⁹、および10¹⁰コピー
のハイブリダイゼーションコントロールを、同様にブロ
ットした。

Hetaine CLA、Crosultaine T−30、およびCrosultain
e E−30は、もとの条件下で機能することが示されたが
（図9D）、Incronam B−40およびC₁₆−ヒドロキシプロ
ピルスルホベタインは、機能に関して非常に妥協され
た。この実験が示したことは、ベタインの物理的性質に
基づいて、アッセイ条件に対する推定可能な改変が、他
では機能しない化合物の利用を可能にするように行われ
得る。さらに、この実験は、界面活性剤の（例えば、ミ
セル相での）機能提示の重要性を示す。

結論 C₁₂−C₁₆アルキル鎖は全ミコバクテリアの単離におけ
る改善を可能にするが、C₁₈−C₂₂アルキル鎖もまた、ミ
コバクテリアのコード形成の破壊の可能にする。ジメチ
ル４級窒素は、カルボキシ陰イオン（−COO^-）と組み合
わせて、経済的に効率的な様式でも最も高い溶解度を生
じる。最も好ましい架橋構造は、最少で３つの炭素原子
を有する直鎖アルキル（例えば、改変なし）である（例
えば、プロピル架橋）。アミドプロピル結合の影響は識
別が難しいが、単純には、その結合は、疎水性ドメイン
の伸長であることが必要とされるのみである。合成する
のは依然として比較的単純であるが、C₁₈−カルボキシ
プロピルベタイン（CAS 番号78195−27−４）は、溶解
度、架橋構造、およびイオン特性の最適な特徴を組み合
わせる（日本国特許出願番号第79100920号［54−10092
0］;JP 8125139）。

本明細書で使用されているC₁₈−カルボキシプロピル
ベタイン（CAS 番号78195−27−４）については、この
化合物を調製するために、以下の手順（Clorox Technic
al Center,Pleasanton,CAのDr.Lafayette D.Folandによ
る情報）を用いた： （１）１当量（0.1モルまたは27.7g）のN,N−ジメチル
オクタデシルアミン（297g/モル:CAS 番号124−28−
７）を、1.1当量（0.11モルまたは19.9g）のブロモ酪酸
エチルエステル（195g/モル:CAS 番号2969−81−５）
にアルゴン下で添加して、混ぜものを含まない（neat）
溶液を生成する。

（２）フラスコを、50℃〜60℃の油浴中に入れ、そして
一晩その溶液を（アルゴン下で）攪拌する。大きな白色
の塊が生じる［注：これはかなり発熱性の反応である。
この反応をスケールアップするときは、中間生成物が爆
発しないように温度をモニターすることが重要であ
る。］ （３）600mlのイソプロピルアルコールを反応生成物に
直接添加し、そして直ちに、150gの活性化陰イオン交換
樹脂AG 1−X8（Bio−Rad第140−1422号）、または水酸
化物対イオンを有するAmberlite IRA−400H（Sigma IRA
−440C）のような同等の陰イオン樹脂をフラスコに加
え、そしてその懸濁液を一晩攪拌する。［注:150gの樹
脂を１リットルの５％ NaOHと混合することにより、陰
イオン交換樹脂を活性化（または再活性化）させる。使
用する前に、その樹脂をカラム中で５リットルの蒸留水
で洗浄する。樹脂量は実質的に減少され得、そしてこれ
は規定の方法を用いて測定され得る。］ （４）濾過によって陰イオン交換樹脂を除去する。

（５）Rotovap上で溶媒を除去し、そして得られた固体
を高真空ライン下に一晩置く。

（６）物質を以下のように２回再結晶する： −乾燥ベタインを400mlのエーテル中に入れ、そして
煮沸する。その物質がちょうど溶解するまで、フラスコ
内にメタノールを滴下する。フラスコを室温まで冷却す
る（ほとんど直ちに白色結晶が形成し始める）。そのフ
ラスコを０〜４℃にて一晩放置する。濾過によって結晶
化した物質を取り出し、そして一晩高真空ライン下に置
く。［注：陰イオン交換樹脂から取り出された物質はか
なり純粋であり、95％純度が許容され得るときは、再結
晶が１回のみ必要であるか、またはおそらく再結晶は必
要でない。さらに、二価プロトン性の非極性溶媒がエー
テルの代わりに用いられ得たことも注意されたい。） この手順により約20gの精製C₁₈−カルボキシプロピル
ベタインが得られる（約50％収率）。N,N−ジメチルオ
クタデシルアミンは、AKZO,Inc.（No.Armeen DM18D）、
American Tokyo Kasei,Icn.（No.D1609）、およびPfalt
z ＆ Bauer,Inc.（No.D42680）から入手可能である。ブ
ロモ酪酸メチルエステルは、Aldrich（No.16,711−８）
およびFluka（No.16540）から入手可能である。ブロモ
酪酸エチルエステルは、Kazuo（JP 8125139）特許で使
用されたヨウ化酪酸メチルエステルの代わりに使用され
得ることに注意されたい；同様に、SigmaからのAmberli
te IRA−400OH陰イオン交換は、Bio−RadからのAG 1−X
8の代わりに使用され得る。412g/モルの中間生成物は、
2.4ミリモル/gであった。Amberlite樹脂は、Sigmaのカ
タログに従って、4meq/g容量を有する。塩濃度を減少さ
せるには、一般に１回の再結晶で十分である。

C₁₈−カルボキシプロピルベタイン（CAS 番号78195
−27−４）は、極度に静菌性であり、そして本発明のア
ッセイ中でこの化合物の濃度が2mMを超えると、細菌を
望ましくない溶解に至らせ得ることに注意されたい。

従っで、アッセイ条件の重要な局面は、温度、pH、イ
オン強度、および特定電解質である。例えば、5.0を上
回るが9.0の下回るpHが、一般に、多くのベタインが両
性イオンを維持するために絶対的に必要とされる。プロ
セッシング温度は、使用される特定のSB−18様界面活性
剤のクラフト温度を上回るように維持されなければなら
ない。例えば、SB−18に対するプロセッシング温度は、
37℃を維持するか、またはそれを超えなければならない
（Tsujii,K.ら、J.Phys.Chem.82:1610−1614（1978））
が、C₁₈−カルボキシプロピルベタイン（CAS 番号7819
5−27−４）のプロセッシング温度は、25℃のみの温度
で維持されなければならない（Tsujii,K.ら、YukaKaGu
30:495−499（1981））。イオン強度は、使用されるイ
オンと相互に関連する。例えば、塩化ナトリウムによる
塩溶を最大にするためには、ヨウ化カリウムのような塩
を使用するときよりも、かなり高い濃度が必要とされ
る。

検出方法としてPCR増幅を付けることが考慮されると
きは、塩化カリウムが十分であり（理想的ではない
が）、そして増幅反応条件に関して、有用な濃度で、必
要な効果を生じる。

結果は、ベタイン構造およびアッセイ設計選択の理論
的な組み合わせが可能であり、そして当業者により所望
されるように最適化され得ることを示す。以前に記され
ていたように、C₁₈−カルボキシプロピルベタイン（CAS
番号78195−27−４）のようなベタインが、実験室的
にまたは注文合成業者によって容易に合成されるが、SB
−18は、精製形態で現在市販により容易に入手可能であ
る、最も有効なベタインである。

図６、７および7A、８、９から9D、および図10の集積
データは、以下のことを示す：（１）SB−18は、ミコバ
クテリアの分散、および遠心分離によるその採集を促進
する点で、掲載の同族イオン性界面活性剤中で独特であ
る（図６）；（２）スルホプロピルベタインシリーズの
全てが、ミコバクテリアの両クラスの回収を促進するこ
とにおいて、ある程度の有効性を有する（図７および7
A）；（３）広範な同族「ベタイン様」界面活性剤が本
発明の方法において「SB−18様活性」を示し、そしてこ
れらの特徴は推定可能な挙動パターンに従う（図８、
９、9A、9B、9C、および9D）；そして（４）システムパ
ラメーターを改変することにより、このクラスの分子の
挙動の理解に基づき、本発明の方法において他に機能す
るわけでないベタインは、それらにSB−18様活性を示さ
せるようにする様式で提供され得る（図10）。

結論として、電荷の分離により作製された双極子モー
メントの極性が、臨床アッセイにおいて、界面活性剤分
子の機能提示を促進する。さらに重要なことに、コード
化ミコバクテリア分散に関して、作製された双極子は、
長鎖アルキル部分を、水性電解質含有溶液中で使用され
得るようにする。このことの結果は、臨床実験室に一般
的な反応条件下で、優れた溶解能を有する界面活性剤を
使用できることである。しかし、以前に明示されたよう
に、これらの生物を分散する能力は、より短い鎖の分子
が凝集しない生物の採集を促進できることを十分に説明
しない。回答のもう半分は、次の実施例でより理解され
る。

実施例10 M.tubeuculosisおよびM.aviumの脱気 おそらく、このクラスの生物の細胞壁の疎水的な性質
が直接的に、外皮増殖（pellicular growth）の原因と
なる。多くの刊行物が、Dubos,R.J.Eup.Biol.Med.58:36
1−362（1945）を参照し、そしてTween 80が、「湿潤」
の結果として、「迅速」で「拡散」した「浸水した増
殖」（“rapid,"“diffuse,"and“submerged growth"）
を可能にすることが述べられている。しかし、図4Aおよ
び表６の結果は、表面張力および凝集が外皮増殖に直接
的に関わるかどうかに関わらず、実際、Tweew 80がこの
現象を緩和する機構がSB−18の機構と異なることを示唆
する。M.aviumは、より拡散様式で増殖し、最小凝集を
示すので、MTBが、図５に記載されている実験によって
より劇的に影響されることが予期される。また、Tween
80は、インビボにおいて、浸水増殖を誘起するように作
用しているに違いないことが言外にある。それにも関わ
らず、論理的には、表面張力の非存在下で、浸水増殖お
よび浮力の要素が、なんらか密接に関連しているに違い
ないと思われる。

Silverstolpe,L.Nord.Med.40/48:2220−2222（1948）
は、結核菌と比重範囲が、1.07から0.79であることを測
定した（これは、平均1.00をわずかに下回る）。Silver
stolpe,L.Nord.Med.40/48:2220−2222（1948）は、“Ba
kteriernas Jmforelsevis laga specifika vikt ka
n frklaras av deras fetthalt...."と結論してい
る。翻訳は、“The comparatively low specific weigh
t of the bacteria can be explained by their fat co
ntent....（細菌の比較的低い比重は、...それらの脂肪
含量により説明され得る）”である。それが、低比重の
原因となるのは細胞壁中の脂質の実際量であるという意
見が、当該分野で受け入れられている。1973年の一般的
な微生物のテキストでは、その著者は、“...The strik
ing abundance of lipids in the cell well（60％ of
the dry weight）accounts for the hydrophobic chara
cter of the organisms,which tend to adhere to each
other during growth in aqueous media and to float
at the surface（生物の疎水性特徴は細胞壁中の目立
って豊富な脂質（乾燥重量の60％）が原因であり、水性
媒体中での増殖の間互いに接着し、表面で浮流する傾向
にある）..."（Davis,B.D.ら、Microbiology,Harper an
d Row,New York,1973,847頁）と述べている。しかし、
本発明によれば、脂質含量は、最終的にミコバクテリア
の低比重の原因とならない。

おそらく、当該分野の推論に従うと、細胞中の脂質の
部分比容積は、浮流を可能にするように、残りの成分の
部分比容積を補う。このことは、表面張力の非存在下
で、M.aviumの細胞壁中のさらなる脂質成分が、遠心分
離中のその回収困難性の増大の原因となることを示唆す
る（表１）。これはもっともらしいが、Stinson,M.W.
ら、Am.Rev.Resp.Dis.104:717−727（1971）は、グリセ
ロール含有では、媒体脂質は細胞の乾燥重量の17.7％を
占め、一方、Tween 80の存在下では、脂質含量は34.1％
に増加することを示した。Tween 80は、浸水増殖を可能
にするので、この仮説は、浮力に対する合理的な説明で
はあり得ない：脂質含量はほぼ二倍増加し、逆説的に細
胞は浸水する。

Schaefer,W.B.ら、J.Bacteriol.90:1438−1446（196
5）は、オレイン酸BSAまたはTween 80−BSAを含有する
培地の存在下で、ミコバクテリア中のポイド（類脂質）
体の生産を示す劇的な顕微鏡写真を示すことにより、こ
の不一致を早くに示した。Weir,M.P.ら、Amer.Rev.Res.
Dis.106:450−457（1972）、およびMcCarthy,C.Infect.
Immun.4:199−204（1971）もまた、培養条件下でのオレ
イン酸の迅速な取り込みを特徴づけた。浮力と全脂質含
量と間の関連が存在するという仮説を支持するために必
要な証拠がないと思われる。事実、これらの発見の比較
から、おそらく脂質の蓄積が浸水増殖をある程度まで促
進するということに客観的に結論づけられる。

上記の説明によより、Tween 80（CAS 番号9005−65
−６）の存在下での浸水増殖は、細胞構造内のなんらか
の他の変化から生じるに違いないことが推測される。Ya
mori,S.ら、Microbiol.Immunol.35:921−926（1991）の
報告は、Tween 80含有培地へのOADC（オレイン酸、BS
A、デキストロース、カタラーゼ、およびNaCl）の添加
の際に、有意な細胞壁変化が生じることを確認してい
る。これらの著者は、細胞壁変化の結果として薬物感受
性が変化する（例えば、細胞壁がより透過性になる）と
結論している。さらに、Rastogi,N.ら、Antimicrob.Age
nts Chemother,20:666−667（1981）は10年前に、培養
継代で細胞壁は有意に薄くなり、さらに、オレイン酸、
BSA、およびTween 80を含有する富化培地において、生
化学的特徴が同様に変化することを示した。まとめれ、
これらの所見は、表面張力が、外皮増殖に関連し得る
が、表面張力および脂質組成のいずれもが、「浮力」ま
たは「低比重」を十分に説明し得ないことを示唆する。
それにかわって、細胞壁構造の変化が浸水増殖の原因と
なるに違いない。従って、他の可能性が存在したに違い
ない：例えば、（ｉ）これらの脂質が細胞壁に挿入され
ることによるプロセス、（ii）取り込みに際して形成さ
れる構造、または（iii）両方の組み合わせ。

一般的な、脂質が表面に限定された増殖の原因となり
得るには、２つの点がある。第一は、Dubos,R.J.Exp.Bi
ol.Med.58:361−362（1945）によって示唆されるよう
に、表面張力である。第二の説は、Silverstolpe.l.Nor
d.Med.40/48:2220−2222（1948）の研究に由来し、これ
らの生物の「脂質の部分比容量」に依存する。

本明細書に記載されているように、本発明によれば、
偏性好気性であるミコバクテリアに対して、表面張力ま
たは脂質の部分比容量の非存在下で、浮力を維持するた
めに最も有効な方法は、細胞壁構築の副産物として生成
されるガス（例えば、CO₂）のトラッピングによると考
えられる。約80CO₂分子が、マロニルCoA経路により合成
される各ミコール酸残基に対して生成される。ミコバク
テリア、Propionibacterium shermaniiに密接に関連す
る生物のCO₂生成は、スイスチーズの目（eyes）（例え
ば、穴）を生じる（Sherman,J.M.J.Bacteriol.6:379−3
92（1921））。分子レベルでは、細胞壁は、結晶ミコー
ル酸および糖脂質の入り組んだ網目構造にトラップされ
たCO₂の巨大分子ポケットを有するように単に想起され
得る。コート因子（α，α−Ｄ−トレハロースの6,6′
−ジミコレート）の融点は43℃〜45℃でるので（Noll,
H.ら、Biochim.Biophys.Acta 20:299−309（1956））、
細胞壁のワックス稠度は、ガスの巨大分子ポケットをト
ラップするように作用し得た。真空下に緩衝液を置くこ
とにより、溶解CO₂が、濃度勾配が作られるような緩衝
液から除去されると考えられる。次いで、これは、細胞
壁中にトラップされたCO₂を緩衝液中に溶解させる。こ
のプロセスは、理論的には効果的でないと考えられ、そ
してコード形成の存在下ではよりずっと効果的でないと
考えられる。

図11は、全プロセッシングプロトコールの最終配置の
概要を示す。図11Aは、M.tuberculosisおよびM.aviumの
両方についてのSB−18の存在または非存在下での脱気の
結果を示す。

図11Aに示されているデータに関して、図２に示され
るスキームを、図11に記載のように改変した。洗浄緩衝
液は、水、あるいは10mM NaHPO₄（pH7.0）、15mM NaC
l、2mM SB−18、2mMフェニルアラニン、および5mM DTT
のいずれかを含有した。さらに、チューブを、振盪（14
0rpm）しながら37℃で60分間、最初のインキュベートを
行い、次いで、直接遠心分離するか、または、遠心分離
前に、40℃で60分間真空（600mmHg）下に供する。脱気
前にキャップをゆるめた。M.aviumおよびM.tuberculosi
sの両方を、この実験において試験した。４つのアリコ
ートの２組増幅物をａ、ｂ、ｃ、およびｄとして表し、
これらは同一である。所定の種に対応するダイレクトア
リコートの２組増幅物を適切に標識した線上に示す。
０、20、および100コピーのコピーコントロールを同時
に増幅させた。10⁸、10⁹、および10¹⁰コピーのハイブリ
ダイゼーションコントロールを、同様にブロットした。

明らかに、表面張力および浮力の両方が、増幅のため
のプロセッシングの間のこれらの生物の挙動を説明する
ことにおいて、有意の役割を示す。いかなる界面活性剤
を添加しなくても、生物が真空に供されるとき、一般に
多量の回収がなされる（添加界面活性剤がない場合の減
圧脱気による水中でのMAC回収を参照のこと）。多数の
実験は、表面張力およびトラップされたガスの両方がM.
tuberculosisおよびM.aviumの両方に関与するが、M.tub
erculosisの優勢特徴は表面張力であり、M.aviumの優勢
特徴はトラップされたガスであるという結論に導いた。
すなわち、SB−18は両クラスのミコバクテリアの回収を
改善するが、MTBはより劇的に界面活性剤に影響され、
一方、MACは、脱気によってMTBより大きな程度に影響さ
れる。さらに、これらの条件下でのMTB脱気は、おそら
く、SB−18が生物を分散させるために、より有効であ
る。

トラップされたガスの仮説が正しければ、さらなる脱
気は、実際に、任意の界面活性剤がM.tuberculosisの回
収を改善することを可能にする。例えば、MTB偽陰性を
取り巻く問題は、凝集、表面張力、および浮力に関与す
るので、浮力が、脱気によってある程度補われ得るとき
は、凝集および表面張力のみが残る。適切な濃度が与え
られたほとんどの界面活性剤は表面張力を克服し得るの
で、サンプルの偏りのみが残る。図12はこれを調査す
る。

図12に示されるデータに関して、図２に示されるスキ
ームを、再度、図11に記載のように用いた。洗浄緩衝液
は、水、あるいは10mM Tris−HCl（pH8.0）または10mM
NaHPO₄（pH7.0）中0.1％ Triton X−100（CAS 番号900
2−93−１）、15mM NaCl、2mM SB−18（CAS 番号13177
−41−８）、および5mM DTTのいずれかを含有した。さ
らに、各条件について、３セットのチューブを調製し
た。接種後に、全チューブを、振盪（140rpm）しながら
37℃で60分間、最初のインキュベートを行った。１セッ
トのチューブを直接遠心分離し、一方３つの条件の各々
について残りの２セットを真空（600mmHg）に供した。
１セットのチューブを、遠心分離前に40℃で60分間のみ
真空に供し、最後のセットのチューブは、遠心分離前に
40℃で６時間真空に供した（脱気前にキャップをゆるめ
た）。M.tuberculosisのみをこの実験において試験し
た。４つのアリコートの２組増幅物をａ、ｂ、ｃ、およ
びｄとして表し、これらは同一である。ダイレクトアリ
コートの２組増幅物を適切に標識た線上に示す。０、2
0、および100コピーのコピーコントロールを同時に増幅
させた。10⁸、10⁹、および10¹⁰コピーのハイブリダイゼ
ーションコントロールを、同様にブロットした。

明らかに、長期間の脱気が、遠心分離によるこれらの
生物の回収能力を改善する。これらの条件下での任意の
界面活性剤の含有は、コード形成を破壊しないが、遠心
分離による採集が増強される程度に表面張力を軽減す
る。脱気は、コード形成を破壊するそれらの界面活性剤
の存在下でより有効であることが予期されることに注目
されるべきである。

SB−18様活性を有する他の界面活性剤 次の研究は、ベタイン（betaine）に類似する他の界
面活性剤が、細胞内に隔離されるように細胞に存在し、
そうすることによりこれらの生物の自然な浮力を部分的
に中和するように細胞の部分的な特定の容積を変え、そ
れにより遠心分離による回収率を高めるかどうかを調べ
た。

例えば、外膜を横切るベタインの通過の親水性経路を
用い（Connell,N.D.ら、Tuberculosis:Pathogenesis,Pr
otection,and Control,B.R.Bloom編、American Society
for Microbiology,ワシントンD.C.（1994）333−352
頁）、そして内膜を横切る通過が脂質輸送体を用いる
（Schaefer,W.B.ら、J.Bacteriol.90:1438−1447（196
5）;Weir,M.P.ら、Amer.Rev.Res.Dis.106:450−457（19
72）およびMcCarthy,C.Infect.Immun.4:199−204（197
1））と仮定すると、類似の特徴を有するクラスの非イ
オン性界面活性剤（例えば、頭部基（headgroup）の容
積を最小にするほぼオクタデシルの界面活性剤）をおそ
らく用い得る。Tween80の頭部基はポーリンを通過する
には大きすぎるが、脂肪酸の直鎖型ポリオキシエチレン
エーテルのような他の界面活性剤（例えば「Brij」化合
物は）、細胞内へ通過させ得、かつ本発明の方法におい
て機能させるように存在し得る。

Hsiao,L.ら、J.Phys.Chem.60:657−660（1956）は、
ポリオキシエチレンフェニルエーテルの１分子あたりの
領域がベタインの領域（例えば、平均9.5POEユニットを
有するC₉および55Å^２の領域）と同じ次数であることを
示す。図13は、プロセッシングアッセイにおいて、SB−
18をBrij 96（オレイル−ポリオキシエチレンエーテル
（Ｃ_18:1E₁₀））およびTween80（オレイルポリオキシエ
チレンソルビタン（ｎ＝20））と比較する。

図13の実験は、図２に概説したプロセッシングアッセ
イに従い、10mM NaHPO₄、pH8.0、15mM NaCl中、2mM SB
−18、１％ Brij96（CAS 番号9004−98−２）および１
％Tween80（CAS 番号9005−65−６）を用いる。水は陰
性コントロールとして用いた。４つの複製チューブを各
シリーズ用に用意した。全チューブを20μｌのM.tuberc
ulosis細菌ストックで接種し、次いで37℃で60分間、振
盪（140rpm）しながらインキュベートし、遠心分離し
た。各界面活性剤シリーズに対する４つの複製物の２連
の増幅は、ａ、ｂ、ｃ、およびｄで示し、それらは同じ
であるべきである。ダイレクトアリコートの２連の増幅
は適切に標識した線で示されている。０、20、および10
0コピーのコピーコントロールを同時に増幅した。10⁸、
10⁹、および10¹⁰コピーのハイブリダイゼーションコン
トロールも同様にブロットした。

図13に示されたものに類似する多くの実験におけるBr
ij 96の利用は、類似の結果を示した。Brij 96は、浮力
を補う点に関してSB−18様活性を発揮するが、予想され
るように、Brij 96はM.tuberculosisの分散に関して限
定された能力（capaciry）を有する。それにもかから
ず、ここ（図13）に示したTween 80の結果は図4Aの結果
と一致する（Tween 80はこれらの生物の回収率を改善し
ないだけでなく分散させない）。Brij 96が細胞に進入
し得るという仮説を支持して、Dubos,R.Jら、J.Exptl.M
ed.83:409−423（1946）は、Brij 96のホモログが培養
中における増殖を刺激するために用いられ得ることを示
した。不幸にも、Dubosは、これらの化合物が血清およ
び他のタンパク質の存在下で沈殿を生じるようであると
報告した。ポリオキシエチレンの直鎖型ポリマーを用い
るタンパク質の沈殿の有用性はいつか知られていた（一
例として、Yamamoto,K.R.ら、Virology 40:734（1970）
を参照のこと）。このことは臨床試料のプロセッシング
に対するこれらの界面活性剤の有用性を制限する。

これらの非イオン性界面活性剤を用いることのさらな
る問題点は、非常に狭い操作範囲を有するということで
ある。例えば、ここでの観察に基づくと、より長いアル
キル鎖が好ましく、より長いアルキル鎖は溶解度を減少
させている。Brij 96は２℃を下回るクラフト点および5
4℃の曇り点を数い、Brij 76（ステアリル−ポリオキシ
エチレンエーテル（C₁₈E₁₀）:CAS 番号9005−00−９）
は、約46℃のクラフト点および64℃の曇り点を有する
（Schott,H.ら、J.Pharm.Sci.64:658−664（1975）:Sch
ott,h.ら、J.Pharm.Sci.65:979−981（1976））。Bjij
72（ステアリル−ポリオキシエチレンエーテル（C
₁₈E₂）:CAS 番号9005−00−９）およびBrij 92（オレ
イル−ポリオキシエチレンエーテル（Ｃ_18:1E₂）:CAS
番号9004−98−２）は、両方ともこれらのアッセイ条件
下では不溶性である。溶解度を増加するにはPOEユニッ
トの数を増加する必要がある。POEユニットの数が増加
するにしたがって、頭部基領域も増加する（Hsiao,L.
ら、J.Phys.Chem.60:657−660（1956））。

さらに、この狭い範囲内では、非イオン性界面活性剤
は普通とは異なる作用をする。例えば、Schott,H.ら、
J.Pharm.Sci.65:979−981（1976）は、いくつかの硝酸
ナトリウム塩および硝酸カリウム塩が、Brij 56（セチ
ル−ポリオキシエチレンエーテル（C₁₆E₁₀）:CAS 番号
9004−95−９）の曇り点およびクラフト点を重複させ
得、それにより「アモルファスゲル」の形成を生じ得る
ことを示す。Brij 56は、32.5℃のクラフト点および67
℃の曇り点を有する（Schott,H.ら、J.Pharm.Sci.65:97
9−981（1976））。さらに、ベタインの有利点は、長鎖
アルキルが任意のコード形成（cording）を分散して浮
力を補う臨床条件下で確実に用いられ得るという事実に
関連するようである。

図14におけるデータは、あるクラスの界面活性剤が、
一旦生物が限界減圧脱気にさらされると、遠心分離によ
る収集を促進する傾向がより高いことを示す。図11に示
されたアッセイの改変型が次のようである場合、図14は
M.aviumを用いた代表的な結果を示す。水と2mM SB−18
（10mM NaHPO₄ pH7.0,15mM NaCl,2mM SB−18,2mMフェニ
ルアラニン、および5mM DTT）との両方を用いる洗浄
を、同様のリン酸ナトリウム緩衝液（10mM NaHPO₄ pH7.
0,15mM NaCl、および5mM DTT）中のいくつかの異なる界
面活性剤と比較いた。２つのシリーズの４級アンモニウ
ム界面活性剤を化学構造とアルキル鎖長との両方を試験
するために用いた。第一のシリーズの界面活性剤は長鎖
アルキル−トリメチルアンモニウム塩であった。これら
は、（ａ）臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（TMA
−12:CAS 番号1119−94−４）、（ｂ）混合臭化アルキ
ル−トリメチルアンモニウム（mTMA:mTMAは、主としてC
₁₂およびC₁₆₆ホモルゴのいくつかが存在するテトラデシ
ルホモログ（C₁₄）である）、および（ｃ）臭化オクタ
デシルトリメチルアンモニウム（TMA−18:CAS 番号112
0−02−１）を含んでいた。用いた第二のシリーズの界
面活性剤は、長鎖アルキル−ベンジルジメチルアンモニ
ウム塩であった。それらは、（ｄ）塩化ベンザルコニウ
ム（BenzAlk（CAS 番号8001−54−５））:BenzAlkは主
として、いくらかのC₁₄およびC₁₆が存在するC₁₂ホモロ
グである；（ｅ）塩化ベンジルジメチルテトラデシルア
ンモニウム（BenzDMA−14:CAS 番号139−08−２）；お
よび（ｆ）塩化ベンジルジメチルステアリルアンモニウ
ム（BenzDMA−18）を含んでいた。各々は、SB−18につ
いて記載された様式に類似した様式（実施例１）で作製
され、最終濃度2mMで緩衝液に添加した。チューブをま
ず、37℃で60分間振盪（140rpm）しながらインキュベー
トし、次いで60分間40℃で600mmHg真空下でインキュベ
ートした。３つのアリコートの２連の増幅は、ａ、ｂ、
およびｃで示し、それらは同じであるべきである。ダイ
レクトインプットアリコートの２連の増幅を適切に標識
した線で示す。０、20、および100コピーのコピーコン
トロールを同時に増幅した。10⁸、10⁹、および10¹⁰コピ
ーのハイブリダイゼーションコントロールを同様にプロ
ットした。

本明細書に示したデータによると、全ての界面活性剤
が付加された効果を行うことが見られるが、ほぼオクタ
デシルの界面活性剤はより能動的に分離され、一旦脱気
が浮力を補うと、遠心分離により細胞の回収率を改善す
るのにわずかにより良い。類似の実験は、非イオン性オ
クタデシル界面活性剤Tween 80およびSpan 80が、以前
は脱気されていない生物の回収ばかりかミコバクテリア
細胞の非凝集を改善し得なかったが、図14に観察される
結果に類似の結果を生じることを示した（Tween 80は少
量の加水分解された界面活性剤を含むことが知られてお
り、そしてSpan 80は単にステアリン酸のソルビタンエ
ステルである）。

したがって、ミコバクテリアを脱気することは「ほぼ
オクタデシルの」界面活性剤（「ほぼオクタデシル様
の」界面活性剤ともいう）のクラスを明らかにし、その
クラスはSB−18様界面活性剤を包含し、現在は、微生物
をより効果に収集するために、SB−18様界面活性剤のよ
うに用いられ得る。MAC複合生物は最初単細胞として成
長するので、図14の実験において用いられた界面活性剤
は容易に表面張力を破砕し、細胞を分散させる。これら
の界面活性剤は、それらのほぼオクタデシルの特徴のた
め、上記のように膜を横切ってより有効に輸送されて、
細胞中に蓄積されると考えられている。

従って、より長いアルキル鎖長は２つの理由で重要で
あるようである。第一に、長鎖は分散を促進し、そして
第二に、長鎖はより能動的に分離される。長鎖界面活性
剤（難溶性）は機能するのに特定の条件が必要となる。
例えば、イオン性界面活性剤は電気分解の最小化が必要
であり、そして非イオン性界面活性剤はより大きい頭部
基が必要である。臨床試料は電解質を含有する溶液の環
境下での操作が必要であり、細菌細胞への界面活性剤の
能動輸送には頭部基を最小化することが必要である。次
にベタインの利点を示す：それらは電解質含有溶液中で
より有効に機能し、頭部基の容積を最小化する。つまり
ベタインはミコバクテリア感染の迅速な診断を強化する
独特の機会を提供するようである。なぜなら長鎖アルキ
ルはいかなるコード形成も分散させ、浮力を補うような
臨床条件下で確実に使用され得るからである。

さらなる特徴は、Tsubone,K.ら、J.Pharm.Sci.80:441
−444（1991）の研究由来の本明細書に記載された方法
のためにベタインを設計することに関していた。これら
の著者は、抗菌活性の効果はアルキル鎖長、架橋長、な
らびにR₂およびR₃（表２に定義されたR₂およびR₃）の長
さに依存するとみられることを示す。例えば、C₁₆は多
くの場合（C₁₈ホスホエチルベタインは明らかに沈殿し
た）に理想的に鎖長のようであり、R₂およびR₃位のメチ
ル基は立体効果により最高レベルの抗菌活性を示すよう
であり、C₂架橋は最高の抗菌活性を示したが、C₃は最小
の活性を示した。C₃をこえる架橋長における増加は抗菌
活性において一定の増加を示した。最近の文献で、著者
らは、これらの現象が２価カチオンをキレートする能力
に相関することを示す（Tsubone,K.J.Pharm.Sci.80:105
1−1054（1991））。

結論として、ベタインを独特にするのは荷電種の性
質、組合せ、および空間の関係の両方であるので、ベタ
インのファミリー内変型を引き起こすのは特定のイオン
の組合せである；上記の記載に基づいて、これは所望の
特徴のためにベタインを設計し得る。例えば、より長い
アルキル鎖長はより効果的に分離され、コード形成に関
する問題を低減し得る。プロピル基のような架橋を維持
することは、静菌活性を最小化する。R₂およびR₃基は、
立体障害を避けるためメチル基で最小化される。それに
もかかわらず、プロピル架橋（例えば、SB−18はスルホ
プロピルベタインである）での静菌活性を最小化する考
えは、ただちに生存能力の問題を生じさせた。

SB−18プロセスしたミコバクテリアの生存能力 M.tuberculosisに関して、このプロトコルは生存可能
な生物を産生する。表８は、未処理のミコバクテリア
（ＡおよびＢ）；追加の処理をしないでPCR溶解緩衝液
中でインキュベートした細胞（ＣおよびＤ）；溶解緩衝
液中でインキュベートし、60℃で１時間処理し次いで95
℃で15分処理した細胞（ＥおよびＦ）；ならびにSB−18
プロトコルによりプロセスした細胞（ＧおよびＨ）の¹⁴
CO₂放出を比較する粗BACTEC培養データを示す。

表8:SB−18プロセスされたM.tuberculosis細胞が生存可
能であることを示す予備データ 図２に概説されるようなM.tuberculosisをプロセッシ
ングした予備培養結果を示す。数字は、BACTEC 460TBカ
ウンター（Becton Dickinson、Sparks、MD）により記録
されるような所定のサンプルについて放出された¹⁴CO₂
カウントを示す。各サンプルを、６週の期間中規則的に
チェックした。培養物を2/16に接種した。それぞれ２つ
の複製を有する４セットのBACTEC 12−Ｂ培養物を、図
２に記載のように、20μｌの細菌ストック；未処理のミ
コバクテリア（ＡおよびＢ）；追加の処理をしないでPC
R溶解緩衝液中でインキュベートした細胞（Ｃおよび
Ｄ）、または60℃で１時間処理し次いで95℃で15分処理
した細胞（ＥおよびＦ）；ならびにSB−18プロトコルに
よりプロセスした細胞（ＧおよびＨ）を用いて接種し
た。それぞれの複製サンプルを２連で培養し、そして１
または２のいずれかとして標識した。＞15の読みは、陽
性であると考えられる。培養物を陽性として記録する
と、「＋」でマークされ、そしてその培養物の分析が終
了する。

SB−18プロトコルは生存能力のある生物を産生する
が、さらなる脱気はいずれの界面活性剤の遠心分離によ
る収集も容易にする効果を増強し、ミコバクテリアが必
須の好気性菌であるため、さらに長期間の脱気が生存能
力を傷害すると予測される。

表９は、SB−18処理とNALC/NaOH沈殿物の脱気とを組
み合わせた結果を示す。

表９ 洗浄緩衝液中のSB−18および洗浄した沈殿物の減圧脱気
を用いる培養物とPCRとの相互関係 ２゜洗浄緩衝液中のSB−18の包含の他に、減圧脱気工
程を包含する結果を示す。全試料をまずNALC/NaOH手順
によりプロセスした（kent,P.T.ら、「Public Health M
ycobacteriology］、A Guide for the Lebel III Labor
atory,U.S.Department of Health and Human Service,C
enters for Disease Control（1985）,31−46頁）。沈
殿物を洗浄の前に取り除き、BACTEC 12B培養瓶中で増殖
した。全ての陽性MTB、MAC、またはM.kansasii培養物
を、Gen−Probe培養アッセイ（Gen−Probe,San Diego,C
A）を用いて同定した。全ての他の生物を生化学分析に
より同定した（Kent,P.T.ら、「Public Health Mycobac
teriology」、A Guide for the Lebel III Laboratory,
U.S.Department of Health and Human Service,Centers
for Disease Control（1985）,71−157頁）。このシリ
ーズのサンプルにおけるNALC/NaOH沈殿物を洗浄するの
に用いた洗浄液の組成は、10mM NaHPO₄,pH8.0,15mM NaC
l,5mM DTT、および2mM SB−18であった。沈殿物を60分
間37℃で振盪（140rpm）しながら洗浄した。沈殿物を洗
浄した後、サンプルを600mmHgに40℃、60分間供した。
次いで、サンプルを遠心分離（20分間37℃で5,000×
ｇ）に供し、さらに材料および方法に記載されたように
PCR用にプロセスした。

SB−18で37℃で洗浄し、600mmHg下40℃で脱気し、そ
して２連の増幅した504サンプルのうち、13サンプルがM
AC複合体に対して培養陽性であり、４つがMTB複合体に
対して培養陽性であり、そして４つがM.kansasiiに対し
て培養陽性であった。結果の分析は、MAC培養陽性サン
プルのうち９つは、PCRでも陽性であった（70％）;MTB
培養陽性試料のうち３つは、PCRでも陽性であった（75
％）；そして全てのM.kansasii培養陽性試料がPOR陽性
であった（100％）、ことを示す。失敗したMACサンプル
のうち３つがインヒビターを含み、１つは説明不能であ
った。失敗したMTBサンプルは、解析すると統計学的に
棄却された特徴（例えば、低コピー数）を示した。MAC
培養物/PCR陽性サンプルのうち３つは、統計学的な棄却
（例えば、２連の増幅の１つが陰性で、もう１つが陽性
であった）に一致する特徴を示した。サンプルの偏りを
示すように見られるこれらのサンプルも、この方法によ
る検出のための培養物においてさらなるインキュベーシ
ョンが必要であった。

ここでの正しい結論は、不十分な結果がSB−18/脱気
手順に固有の問題の結果ではないということである。そ
のかわり上記の全てのデータは、サンプルがまずNALC/N
aOHによりプロセスされた事実と考え合わせると、サン
プルの統合がSB−18/脱気手順によってプロセスされる
前に著しく傷害されることを示唆する。MAC試料が依然
として統計学的な棄却および説明不能な結果を示すとい
う事実はさらに、現在のプロトコルが最初にサンプルを
プロセスする手段として使用されるかぎり、不十分な結
果がやがて生じることを示唆する。

安全の記載 試料チューブのキャップは減圧脱気の前に弛めなけれ
ばならないので、万一事故の場合は多量のエアゾルが発
生する。従って、以下のガイドラインを実験者の安全を
保障するために適用した。第一に、全てのデータを、連
続した界面活性剤洗浄、減圧脱気方法を用いて得た。こ
れは単に安全上の理由のためであった：脱気工程にはキ
ャップを弛めることが必要であり、そして界面活性剤洗
浄工程にはかき混ぜが必要であるので、２つの工程を同
時に完了することはキャップをはずし、実験者が試料に
さらされることを引き起こし得る。第二に、図15に示さ
れる装置を層流フード（laminar flow hood）に設置し
た。当業者は層流フード中の気流が真空オーブンにより
妨害されないことを確実にしなければならない。第三
に、全空気を、２セットのフィルターを通して真空オー
ブンから排出し、ほこりを生じる粒子を除去した。最初
のフィルターは、0.2μシリンジ型フィルター（Gelma
n、Ann Arbor、Michigan）であり、これは真空ラインに
備えられ得る。このフィルターは真空チューブの短い部
分を通して真空オーブンに付けられる。ホースのクラン
プをそれに固定するために用い、偶然にはずれる可能性
を排除する。シリンジフィルターは毎月取り除かれ、オ
ートクレーブして廃棄される。第二のフィルターは、0.
3μHEPA−CAPフィルター（Whatman,Clifton,NJ）であ
り、これもまた真空ラインに備えられる。このフィルタ
ーは必要に応じてはずし得、浄化し得、そして保管し得
るようにシリンジフィルターにホースクランプなしで接
続される。HEPA−CAPフィルターは年４回交換される。
最後に、真空オーブンはフードと同じスケジュールで浄
化される。

実施例11 SB−18脱気プロトコルはNALC/NaOHプロセッシングに優
れる 図２の概略図を、未処理M.tuberculosis、SB−18およ
び脱気を用いてプロセスされたM.tuberculosis、ならび
にNALC/NaOHによりプロセスされたM.tuberculosisの間
での培養および増幅の両方による直接比較がされるよう
に改変した。図16に示されるアッセイは必要な改変を示
す。表10は３つの条件の各々についてBACTEC 12B培養物
（Becton Dickinson,Sparks,MD）から放出された¹⁴CO₂
カウントの生データを示す。このデータは図16Aにプロ
ットされ、そして図16Bは、プロセスされたサンプルの
アリコート（培養物を接種するのに用いたのと同じサン
プル）がPCRにより増幅された場合の増幅結果を示す。

この実験における図16のプロトコルは次に示す。M.tu
berculosis細胞を斜面からこすり落として水中に懸濁し
た。全サンプルを接種するために次に用いられたバクテ
リアストックを作るために、細胞をさらに希釈した。２
セットのチューブ（各々６複製物からなる）を各プロセ
ッシングプロトコル用に作った。SB−18プロセッシング
溶液は、15mlの10mM NaHPO₄、pH8.0、15mM NaCl、2mM S
B−18、および5mM DTTからなる。20μｌの細胞を各SB−
18チューブに加え、次いで全てをまず37℃で60分間振盪
（140rpm）しながらインキュベートし、次いで60分間40
℃で真空（600mmHg）に供した（脱気前にキャップを弛
めた）。次いで、チューブを遠心分離（20分間、37℃で
5,000×ｇ）してデカントした。NALC/NaOH（Kent,P.T.
ら、「Public Health Mycobacteriology」、A Guide fo
r the Lebel III Laboratory,U.S.Department of Healt
h and Human Service,Centers for Disease Control（1
985）,31−46頁）の5mlをこのセットの各複製物中にい
れ、20μｌの細胞ストックを加えた。NALC/NaOHチュー
ブを15分間室温でインキュベートし、45mlの滅菌水で希
釈し、次いで遠心分離（20分間４℃で3,000×ｇ）に供
し、次いでデカントした。全ペレットを300μｌの滅菌
水中に際懸濁した。６つの陽性コントロールサンプル
を、生存能力および最大増幅シグナル強度をモニターす
るために作った。インプットコントロールを、280μｌ
の滅菌水と20μｌのバクテリアストックとを単に混合す
ることにより作製した。次いで、全サンプルを培養およ
び増幅の両方による分析用に分割した。これは次のよう
に完了した:2連の25μｌアリコートを用いてBACTEC 12B
培養物を接種し、このサンプルの200μｌアリコートを2
00μｌの2X溶解緩衝液に加えた。培養瓶をBACTEC 460TB
カウンターで¹⁴CO₂放出について日常的にチェックし
た。増幅を、材料および方法に記載されたように行っ
た。各セット由来の６サンプルの２連の増幅をａ、ｂ、
ｃ、ｄ、ｅ、およびｆで示し、これらは同一であるべき
である（図16B）。０、20、および100コピーのコピーコ
ントロールを同時に増幅した。10⁸、10⁹、および10¹⁰コ
ピーのハイブリダイゼーションコントロールも同様にブ
ロットした。

行なわれるべき２つの重要なポイントおよびこのデー
タに関するいくつかのマイナーな観察がある。第一の重
要なポイント：全SB−18処理培養物が陽性に転じた、お
よび第二の重要なポイント:1つのNALC/NaOH培養物が陽
性に転じたのではなかった。NALC/NaOHがミコバクテリ
アの生存能力を傷害することが知られているが（Krasno
w,I.ら、Am.J.Clin.Path.45:352−355（1966）;Kubica,
G.P.W.ら、Am.Rev.Resir.Dis.87:775−779（1963））、
増幅結果（図16B）は、予測どおりに微生物の多量の損
失が実際に起こることを確証する。いくつかの例ではこ
れらの損失は定量的である。表９に示される臨床データ
は、NALC/NaOHプロセスされた沈殿物を利用したので、
サンプルがSB−18洗浄および脱気の前に傷害される程度
がささいないことではないことが明らかであるべきであ
る。

第一のマイナーな観察は、陽性コントロールが、閾値
（15cpm）を超えるためにほとんど２週間を必要とする
ことである。これと表８のデータ（陽性コントロールお
よびSB−18処理細胞が５日目まで陽性であった）との比
較は、この実験において用いられた非常に低いコピー数
を示す。第二に、表10におけるデータは、SB−18プロセ
スされた細胞が約１週目までにコントロール細胞から遅
れることを示唆する。これには３つの説明がある：
（ａ）実施例10に考察されたように、SB−18がいくらか
の静菌活性を有することが予測される；（ｂ）陽性コン
トロールが真実の最大のインプットを示すが、プロセス
された細胞に損失が疑いなくおこる（この効果は低コピ
ー数で悪化する）；そして最後に（ｃ）デカントしたチ
ューブはさらにプロセスされず（例えば、水を添加した
サンプルの容量は、全ての場合において300μｌを超え
た）、希釈効果を生じた。界面活性剤が静菌性である程
度はまだ決定され得ないが、もしそれが事実ならば、SB
−18は明らかに殺菌性ではない。上記の「ｃ」に関して
は、この実験を繰り返し、上清をマイクロ遠心チューブ
に移し、静菌効果および希釈効果の両方を最小化するよ
うにさらにプロセスした。この実験では、SB−18および
コントロールの結果は区別し得ず、12個のNALC/NaOH培
養物のうち２つは陽性であった。

上記のM.tuberculosis感染の診断の欠点が当該技術分
野において現在用いられるプロセッシングプロトコルに
根ざすという結論は回避できない。Small,P.M.ら、New
Engl.J.Med.330:1703−1709（1994）およびAllard,D.
ら、New Engl.J.Med.330:1710−1716（1994）は、制限
酵素断片長多型（RFLP）研究を報告することにより医学
界の考えを変え（Hamburg,M.A.ら、New Engl.J.Med.33
0:1750−1751（1994））、アメリカ合衆国におけるTB感
染の1/3より多数が最近の伝染が原因であることを示唆
した。以前に、感染の90％が潜伏性であり、不活性な病
巣から発生することを推定した。これらの実施例（およ
び特に実施例11）に示されるデータは、遅い増殖、浮
力、凝集、不完全なプロセッシングプロトコル、ならび
に信頼できかつ高感度な診断アッセイの欠如の組合せに
起因し、潜伏性感染または最近の伝染から発生する症例
の真実の割合が確立されていないことを強く暗示する。

偽陰性結果の２つの主要なソース（インヒビターおよ
び低コピー数）のうち、本発明の方法は特に後者を解決
する。この界面活性剤はある程度までコード形成を***
し、浮力を補い、そして脱気はさらに浮力を軽減する。
その結果、これらの特徴を表す生物は、現在は検出用に
より有効に収集され得る。さらに本発明の方法はサンプ
ル中に存在する少数の微生物を効果的に収集し、抽出す
る能力を強化するので、従って本発明の方法は、低コピ
ー数で行う必要がある場合に、検出アッセイの効果を強
化する。

実施例12および実施例13を、SB−18様界面活性剤の使
用が実際に生物学的試料または他の試料にどのように適
用されるのかさらなる実施例として示す。臨床実験室は
Centers for Disease Control（Kent,P.T.ら、「Public
Health Mycobacteriology」、A Guide for the Level
III Laboratory,U.S.Department of Health and Human
Service,Centers for Disease Control,（1985）31−46
頁）により発表された推奨ガイドラインに従わねばなら
ないとすれば、実施例12が与えられる。実施例13は本明
細書に示された結果を考慮して与えられ、現在の方法論
が、臨床実験室において信頼されて使用される増幅に基
づく技術のために、破棄されなければならないことを示
唆している。

表10:SB−18プロセッシングとNALC/NaOHプロセッシング
との比較 図16に概説したプロセッシング実験の培養結果を示
す。この数値は、BACTEC 460TBカウンター（Becton Dic
kinson,Sparks,MD）による記録として、所定のサンプル
について放出された¹⁴CO₂カウントを示す。各サンプル
を８週間の間定期的にチェックした（「培養日数」）。
３セットの培養物（各々６複製物をともなう）を開始し
た：「インプット」は陽性コントロール群を示す（サン
プルＡ−Ｆ）；「SB−18」は本発明の方法によりプロセ
スされ、図11で概説したようなM.tuberculosisを示す
（サンプルＧ−Ｌ）；および「NALC」はCenters for Di
sease Control（Kent,P.T.ら、「Public Health Mycoba
cteriology」、A Guide for the the Lebel III Labora
tory,U.S.Department of Health and Human Service,Ce
nters for Disease Control（1985）,31−46頁）により
推奨された手順によりプロセスされたM.tuberculosisを
示す（サンプルＭ−Ｒ）。各サンプルを２連で培養した
（１または２で標識された）。上記の15の読みは陽性と
考えた。999を超える読みはスケールをはずれており、
「＋」でマークした。所定の日についてのデータを平均
して、図16Aにプロットした。

実施例12 以前は標準的方法でプロセスされていた臨床試料からの
増幅のためのミコバクテリアの調製手順 この実施例は、臨床実験室がCenters for Disease Co
ntrol（Kent,P.T.ら、「Public Health Mycobacteriolo
gy」、A Guide for Level III Laboratory,U.S.Departm
ent of Health and Human Service,Centers for Diseas
e Control,（1985）31−46頁）により発表された推奨ガ
イドラインに従わなければならないという観点から与え
られる。

次の手順は上記の問題を解決し、臨床試料（例えば、
痰、脳脊髄液（CSF）、および尿を含む）由来のあらゆ
る標準的方法により生じた沈殿物からの増幅用のミコバ
クテリアの調製に特に有用である。次の手順はミコバク
テリア（M.tuberculosis複合体、M.avium複合体、およ
びM.kansasiiを含むが、これらに限定されない）の調製
に特に有用である。表11に示すように、洗浄緩衝液のpH
はSB−18様活性が本発明の方法において得るように注意
深くモニターされなければならない。

1. ミコバクテリアを、最初にNALC/NaOH単離手段（Iso
lation Procedure）により、またはKent（kent,P.T.
ら、「Public Health Mycobacteriology」、A Guide fo
r the Level III Laboratory,U.S.Department of Healt
h and Human Service,Centers for Disease Control,
（1985）31−46頁）によって推奨されたいずれかの手順
により臨床試料から抽出する。

2. 沈殿物を培養物および塗布検出物から取り出す。

3. 沈殿物を、必要に応じて次の工程の前にさらに浄化
または精製し得る。このような浄化を、所望の体液につ
いて、当該技術分野で公知の技法（例えば、遠心分離、
ゲル濾過クロマトグラフィー、および濾過を含む）によ
り行い得る。

（ａ） 工程４、５、または６のいずれかをその適用
に従って行う。

（ｂ） 工程８〜15はPCRに関連した使用について記
載される。これらの工程は、得られたプロセスされた沈
殿物が上記の検出方法のいずれかに関連して用いられ得
るように改変され得る。

4. SB−18界面活性剤洗浄： （ｉ） 残った沈殿物にSB−18二次洗浄緩衝液を用い
て、容量を約25mlにする。注意：二次洗浄緩衝液は元の
試料をプロセスするのに用いた同じ50mlのコニカルに注
ぐべきである（例えば、チューブを変えない）。（50ml
のコニカルチューブはしばしば本明細書中で記載される
が、当業者はもちろん所望の機能に適切な任意のサイズ
の適切な容器を使用し得る。） （ii） 次の工程の直前に、ペレットをボルテックス
にかけて再懸濁し、37℃にて60分間インキュベートする
（140rpm、または培養物を破砕し、液体中に分散させる
に十分強く。）37℃の温度は分散を促進し、界面活性剤
を沈殿させないために必要である。

（iii） 工程７に進む。

5. 減圧脱気： （ｉ） 残った沈殿物に、水または任意の他の所望の
緩衝液を用いて容量を約25mlにする。注意：水は元の試
料をプロセスするのに用いた同じ50mlのコニカルに注ぐ
べきである（例えばチューブを変えない）。

（ii） 60分間40℃にて約60mmHg真空下でインキュベ
ートする（この工程ではチューブのキャップをゆるめる
べきである）。

（iii） 工程７に進む 6. SB−18界面活性剤洗浄および減圧脱気： （ｉ） 残った沈殿物に、SB−18二次洗浄緩衝液を用
いて容量を約25mlにする。注意：二次洗浄緩衝液は元の
試料をプロセスするのに用いた同じ50mlのコニカルに注
ぐべきである（例えば、チューブを変えない）。

（ii） 次の工程の直前に、ペレットをボルテックス
にかけて再懸濁し、37℃にて60分間インキュベートする
（140rpm、または培養物を破砕し、液体中に分散させる
に十分強く）。37℃の温度は分散を促進し、界面活性剤
を沈殿させないために必要である。

（iii） 60分間40℃にて約600mmHg真空下でインキュ
ベートする（この工程ではチューブのキャップをゆるめ
るべきである）。

（iv） 工程７に進む。

7. チューブを20分間37℃で回転（spin）させる。注
意：この実施例においては、IEC Model PR7000M臨床遠
心分離機を用いた。このローターで見積もられる最大速
度／重力（5,200rpm/7410×ｇ）を用いた。

8. チューブを回転している間、200μｌの2X溶解緩衝
液を適切な数の標識した1.5mlのスクリューキャップの
マイクロ遠心チューブ（チューブを４℃にする）に分け
入れる。

9. 遠心分離後、ペレットを除去しないように気を付け
ながら、上清をデカントする。できるだけ完全にデカン
トする。

10. ペレットに200μｌの水を加える。

11. ペレットをボルテックスで撹拌して再懸濁する。

12. 200μｌの試料を200μｌの2X溶解緩衝液を含む適
切に標識した1.5mlスクリューキャップマイクロ遠心チ
ューブ（上記の工程８からの）に移す。

13. ボルテックスで撹拌し、60℃で60分間チューブを
インキュベートする。

14. ボルテックスで撹拌し、95℃で30分間チューブを
インキュベートする。

15. ボルテックスで撹拌し、すぐにPCRを行うかまたは
−20℃に保存す。チューブは、増幅用アリコートを取り
出す直前に迅速な遠心分離工程に供するべきである。

SB−18洗浄緩衝液のpHのモニターにおける注意 実施例10および11は、洗浄緩衝液のpHが最大のSB−18
様活性を達成するようにモニターされるべきであること
を示唆する。表11は、希釈したNALC/NaOHの添加におけ
る２つの異なるSB−18洗浄緩衝液のpHを試験している。
実施例12の方法が次のようであるならば、洗浄後は50mM
Tris−HClのような高い緩衝強度を有しなければなら
ない。

表11:NALC/NaOHのSB−18緩衝液への添加 以下の表は、種々の量の希釈したNALC/NaOHの添加に
おけるSB−18洗浄緩衝液のpHを示す。３つの異なる濃度
のNALC/NaOHが用いられた（２％、３％、または４
％）。これらの３つは、ミコバクテリア検出用の試料を
プロセスするために臨床実験室において用いられるもっ
とも通常の濃度のNALC/NaOHを示す（Kent,P.T.ら、「pu
blic Health Mycobacteriology」、A Guide for the Le
bel III Laboratory,U.S.Department of Health and Hu
man Service,Centers for Disease Control（1985）,31
−46頁）。これらの割合は、現状の試料に加えた溶液の
NaOHのパーセントをいう。現状のサンプルのプロセッシ
ングの間、および試料を浄化するための短いインキュベ
ーション後、次いでこの溶液は、遠心分離の前に水また
はリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）のいずれかでさらに
希釈される。この実験の目的についておよび模擬の臨床
プロセッシングのために、5mlの各NALC/NaOH溶液を50ml
のコニカルに加え、次いで直ちに45mlの水で希釈した。
次いで種々の量の（例えば、1ml、2ml、3ml、4ml、また
は5ml）の希釈したNALC/NaOH溶液を、25mlの：（Ａ）10
mM NaHPO₄,pH8.0,15mM NaCl;または（Ｂ）50mM Tris−H
Cl,pH8.0,50mM KClのいずれかに加え、pHを記録した。

実施例13 主要はプロセッシング工程としてのSB−18あるいは脱気
を用いる培養、塗布、または増幅用のミコバクテリアの
調製手順 この実施例は、本明細書に示した結果を考慮して与え
られ、現在の方法論が、増幅に基づく技術が臨床実験室
で信頼されて用いられるために破棄されなければならな
いことを示唆している。

次の手順は上記の問題を解決し、あらゆる標準的方法
によってプロセスされたサンプルではなくむしろ本発明
の方法で直接プロセスされるサンプルからの培養、塗
布、または増幅用のミコバクテリアの迅速な単離に特に
有用である。この手順は臨床試料（例えば、痰、脳脊髄
液（CSF）、および尿を含む）由来のミコバクテリアの
単離に用いられ得、特にM.tuberculosis複合体、M.aviu
m複合体、およびM.kansasiiを含むがこれらに限定され
ないミコバクテリアの調製に有用である。この手順は半
固体材料由来のミコバクテリア（牛糞便由来のM.paratu
berculosis、鳥糞便由来のM.avium、または他の土壌由
来のミコバクテリアを含むがこれらに限定されない）の
単離に用いられ得る。さらに、他のミコバクテリア（M.
avium複合体およびM.paratuberculosisを含むがこれに
限定されない）が、ミルクまたは全血のような生物学液
体から単離され得る。この手順は、水のような環境ソー
ス由来のM.gordonaeを含むがこれに限定されない、ミコ
バクテリアの単離に用いられ得る。この手順は、あらゆ
る外来ソース（例えば、魚または爬虫類の鱗、両生類の
皮膚サンプル、あるいは他の組織サンプル）、ヒトまた
はその他由来のミコバクテリア（M.tuberculosis複合体
（MTB）、M.avium複合体（MAC）、M.marinum、M.fortui
tum、およびM.chelonaeを含むがこれらに限定されな
い）の単離に用いられ得る。

注意： （ａ） 工程１〜４は、まずあらゆる標準的手順により
プロセスされているのではなく、むしろ本発明の方法に
よりプロセスされるサンプルをどのようにして使用する
かを示している。

（ｂ） 工程11〜14は、PCRに関連した利用について記
載される。これらの工程は、得られたプロセスされた試
料があらゆる上記の検出方法に関連して用いられ得るよ
うに改変され得る。

（ｃ） 適用に応じて工程１、２、３、または４のいず
れかでこの手順を開始する。

（ｄ） この手順を開始する前、または任意の工程の前
のいずれかに浄化または精製あるいは両方が必要ならあ
らゆるサンプルは、当該技術分野で公知の技術（例え
ば、遠心分離、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／ま
たはイオン交換クロマトグラフィー、および／または濾
過を含む）により完了され得る。用いた浄化方法および
／または精製方法は当業者の裁量であり、その適用に依
存する。工程４はこれを例証するために含まれている。

1. SB−18界面活性剤洗浄： （ｉ） 試料（１〜２グラムまたは１〜2ml）に約25m
lのSB−18洗浄緩衝液を加える。注意：洗浄緩衝液は元
の試料の入った50mlコニカルに注ぐべきである。

（ii） サンプルをボルテックスで撹拌して懸濁し、
37℃で60分間インキュベートする（140rpm、または培養
物を破砕し、液体中に分散させるん十分強く）。37℃の
温度は分散を促進し、そしてまた界面活性剤を沈殿させ
ないために必要である。

（iii） 工程５に進む。

2. 減圧脱気： （ｉ） 約１〜２グラムのサンプルまたは１〜2mlの
液体サンプルを、50mlコニカルチューブ中の6mlの滅菌
水または任意の他の所望の緩衝液に懸濁する。（水サン
プルは問題の培地の表面で得られるべきである。） （ii） 60分間40℃にて約600mmHg真空下でインキュ
ベートする（この工程ではチューブのキャップをゆるめ
るべきである）。

（iii） 工程５に進む。

3. SB−18界面活性剤洗浄および減圧脱気： （ｉ） 試料（１〜２グラムまたは１〜2ml）に約25m
lのSB−18洗浄緩衝液を加える。注意：洗浄緩衝液は元
の試料の入った50mlコニカルに注ぐべきである。

（ii） サンプルをボルテックスで撹拌して懸濁し、
37℃で60分間インキュベートする（140rpm、または培養
物を破砕し、溶液中に分散させるに十分強く）。37℃の
温度は分散を促進し、そしてまた界面活性剤を沈殿させ
ないために必要である。

（iii） 60分間、40℃にて約600mmHg真空下でインキ
ュベートする（この工程ではチューブのキャップをゆる
めるべきである）。

（iv） 工程５に進む。

4. 浄化および／または精製に続くSB−18界面活性剤洗
浄（必要に応じて減圧脱気）： （ｉ） 約１〜２グラムのサンプルまたは１〜2mlの
液体サンプルを50mlコニカルチューブ中の6mlの滅菌水
に懸濁する。

（ii） サンプルをボルテックスで撹拌し、室温に10分間放置す
る。

（iii） 1.25X SB−18二次洗浄緩衝液の入ったチュ
ーブを用意し、37℃で保存する。

（iv） 2,700rpm（2,000×ｇ）で、あるいは上清画
分由来のミコバクテリアのさらなるプロセッシングを傷
害することなく、サンプルを浄化するために必要である
いかなる力で、25℃にて10分間遠心分離することにより
サンプルを浄化する（この工程は、サンプル中に目で見
える粒子がない場合は随意である）。

（ｖ） 遠心分離機から取り出し10分間室温に放置す
る。

（vi） 各サンプルから上清画分の一部またはほとん
どを、直接Ｇ−50カラム（Pharmacia、Piscataway、N
J）を通して、適切に標識した1.25X−SB−18洗浄緩衝液
を含む50mlのコニカル中に注意深くデカントした。所望
の容量を取り出すが、ペレットに一番近い部分は残す。
できるだけペレットがほとんどないように移す。

（vii） 内容物をボルテックスで混合し、次いで37
℃で60分間振盪（140rpm）しながらインキュベートす
る。

（viii） キャップを弛め、60分間40℃にて約600mmH
g真空下でインキュベートする（この工程は随意であ
る）。

（ix） 工程５に進む。

5. チューブを20分間37℃で回転させる。注意：この実
施例においては、IEC Model PR7000M臨床遠心分離機を
用いた。このローターで見積もられる最大速度/g−重力
（5,200rpm/7410×ｇ）を用いた。

6. チューブを回転している間、200μｌの2X溶解緩衝
液を適切な数の標識した1.5mlのスクリューキャップの
マイクロ遠心チューブ（チューブを４℃にする）に分け
入れる。

7. 遠心分離後、ペレットを除去しないように気を付け
ながら、上清をデカントする。できるだけ完全にデカン
トする。

8. ペレットに200μｌの水を加える。

9. ペレットをオルテックスで撹拌して再懸濁する。

10. 所望の場合、培養物の100μｌアリコートを除く。
代表的には、コニカルの底に残った100〜200μｌの上清
がある。200μｌより多い水をペレットに加えること
は、通常必要ではない：培養、塗布および増幅のための
十分な液体がある。注意：塗布分析のために、可能な限
り多い界面活性剤を取り除かなければならない。

11. 200μｌの試料を200μｌの2X溶解緩衝液を含む適
切に標識した1.5mlスクリューキャップマイクロ遠心チ
ューブ（上記の工程６からの）に移す。

12. ボルテックスで撹拌し、60℃で60分間チューブを
インキュベートする。

13. ボルテックスで撹拌し、95℃で30分間チューブを
インキュベートする。

14. ボルテックスで撹拌し、すぐにPCRを行うかまたは
−20℃に保存する。チューブは、増幅用アリコートを取
り出す直前に迅速な遠心分離工程に供するべきである。

NALC/NaOHおよびSB−18処理した臨床サンプルの比較 表12は、NALC/NaOHおよびSB−18の両方によりプロセ
スされた13サンプルを比較する。用いた試料は臨床実験
室由来の廃棄されたサンプルであり、その一部はNALC/N
aOHによりプロセスされている。これらのサンプルの最
初の容量は、Kent,P.T.ら、「Public Health Wycobacte
riology」、A Guide for the Lebel III Laboratory,U.
S.Department of Health and Human Service,Centers f
or Disease Control（1985）,31−46頁により示唆され
た最大推奨容量を超えていた。従って、元の試料の残り
（次のNALC/NaOH沈殿物を有する培養物の接種のあと廃
棄されるべきである）を用いた。代表的には、1mlより
少ない量をSB−18プロセッシングのために残した。培養
物１、10、12および13は両方の方法で培養陽性であっ
た。しかし、培養物１由来のSB−18サンプルは抗酸性物
質を含まなかった。この培養での増殖は、Pseudomonas
株由来の結果に後で示された。培養物10、12、および13
は全て、両方の方法により抗酸性物質を含んでいた。SB
−18沈殿物を増幅し、そしてサンプル４、10、12、およ
び13はPCR陽性であった。サンプル１はインヒビターを
含み、そして４は過去にM.tuberculosis感染と診断され
た患者由来であった。この患者は薬物治療中であると推
測される。サンプル４は塗布陰性であった。表12の結果
は（非常に限定されるが）、サンプルがSB−18によりプ
ロセスされ得、そして増幅されて、ミコバクテリアDNA
の存在を評価し得ることを示唆する。さらに、SB−18は
顕著な殺菌活性および静菌活性を有する。しかし、Pseu
domonasはこれもかなり不透過性である（Jarlier,V.
ら、J.Bacteriol.172:1418−1423（1990））が、SB−18
プロセスされたサンプルを培養することに関与するよう
である。SB−18サンプルの10、12、および13（かなり少
量の物質を示す）が、培養陽性サンプルをより迅速に産
生したことは注目すべきことである。

表12:臨床試料のSB−18での直接プロセッシング 培養データ（NALC/NaOHおよびSB−18プロトコルの両
方によりプロセスされた13の臨床試料を示す）を比較す
る。詳細に述べると、NALC/NaOH手順は、Kent,P.T.ら、
「Public Health Mycobacteriology」、A Guide for th
e Lebel III Laboratory,U.S.Department of Health an
d Human Service,Centers for Disease Control（198
5）,31−46頁（最終３％）に従った手順であり、そして
SB−18手順は上に記載された手順であり、工程３で開始
され、次いで工程５〜14に向けて続く。NALC/NaOH沈殿
物は、Kent,P.T.ら、「Public Health Mycobacteriolog
y」、A Guide for the Lebel III Laboratory,U.S.Depa
rtment of Health and Human Service,Centers for Dis
ease Control（1985）,71−157頁の手順に従って、抗酸
性物質についてチェックした。用いた試料は臨床実験室
から廃棄されたサンプルであり、その一部分はNALC/NaO
Hによりプロセスされた。数値は、BACTEC 460TBカウン
ター（Becton Dickinson,Sparks,MD）により記録され
る、所定のサンプルについて放出された¹⁴CO₂カウント
を示す。各培養物を一定期間の間、定期的にチェックし
た。15を超える値を陽性とみなした。次いで、陽性培養
物を、Kent,P.T.ら、「Public Health Mycobacteriolog
y」、A Guide for the Lebel III Laboratory,U.S.Depa
rtment of Health and Human Service,Centers for Dis
ease Control（1985）,71−157頁の手順に従って、抗酸
性物質についてチェックした。一旦サンプルが抗酸性陽
性であると示されると、培養を終了し、「＋」として示
した。NDは、サンプルが７週間の古さでないことを示
す。

実施例14 全血由来のM.avium複合体の定量的な単離方法 （１） 1mlの新鮮な全血を10mlのSB−18様界面活性剤
またはほぼオクタデシルの界面活性剤を含む緩衝液に加
え、ボルテックスで撹拌して溶液を混合する。

注意：全血はACD（酸−クエン酸−デキストロース）収
集チューブ（Becton−Dickinson）中に吸い出し、24時
間以内に用いるべきである。収集チューブは収集後十分
に混合すべきである。

注意：このプロトコルは、CB−18（CAS番号78195−27−
４）で用いるために至適化されている。用いた緩衝液
は、20mM Tris−HCl、pH8.0、2mM NaCl、および1mM CB
−18であった。より高濃度のCB−18（例えば、2mM）
は、これらの生物の溶解を促進するようである。このプ
ロトコルに対する改変は、用いた各SB−18様界面活性剤
またはほぼオクタデシルの界面活性剤について至適化さ
れるべきである。

（２） 37℃で60分間振盪（140rpm）しながらインキュ
ベートする。

（３） キャップを弛め、真空オーブンに移す。42℃に
て60分間600mmHg下でインキュベートする。

（４） キャップを締め、3,500×ｇで20分間30℃にて
遠心分離する。

注意:15mlコニカルチューブを遠心分離にかける際には
気を付けるべきである。第一に、適切なローターアダプ
ターを用いるべきである。第二に、破損の可能性がある
ので、ポリスチレンチューブを用いるべきではない：ポ
リプロピレンチューブを用いるべきである。

（５） チューブをデカントし、500μｌの同じSB−18
様界面活性剤またはほぼオクタデシルの界面活性剤を含
む洗浄緩衝液を加え、ペレットを際懸濁する。［注意：
代表的には小さいゼラチン様ペレットが生じる。チュー
ブから全ての上清を除去することを試みない。］ （６） 再懸濁したペレットを、1.5mlスクリューキャ
ップマイクロ遠心チューブに使い捨ての移し換え用ピペ
ットを用いて移す。

（７） チューブをマイクロ遠心分離機に入れ、10分間
室温で最高速度で回転させる（この工程の温度は、この
プロトコルで採用した界面活性剤によって変化する）。

（８） 上清をアスピレートし、300μｌの滅菌水を試
料に加える。

（９） ペレットを再懸濁し、200μｌの2X溶解緩衝液
を増幅用に移す。増幅および検出のために実施例１に記
載したように試料をプロセスする。

（10） 残った沈殿物を、分析用のBACTEC 12B培養法
（Becton−Dickinson）に移す。

実施例15 改変されたシュウ酸浄化手順 実施例13のプロトコルを用いた場合、Pseudomonas夾
雑の可能性が最大の問題である。これが関連している場
合、Pseudomonasはシュウ酸での切断または夾雑した痰
のシュウ酸での予めの切断により排除され得る。このよ
うな浄化のためのプロトコルは次のとおりである。この
プロトコルは、Kentら、「Public Health Mycobacterio
logy」、A Guide for the Lebel III Laboratory,U.S.D
epartment of Health and Human Service,Centers for
Disease Control（1985）,31−46頁の43−44頁に記載さ
れたシュウ酸手順を改変する。

（１） 0.5〜2mlの生試料または2mlの夾雑した培養物
を50mlのコニカルチューブに入れる。

（２） 試料または夾雑した培養物に等量の５％シュウ
酸（エタンジオン酸、CAS番号6153−56−６）を加え
る。

５％シュウ酸:100mlの水中、５グラムのシュウ酸２水和
物（126.01g/mol）。

（３） 室温で15分間インキュベートする。

（４） 10分の１（1/10）量の「NaOH中和溶液」を混合
物に加え、直ちにボルテックスで撹拌する。例えば、2m
lのシュウ酸を試料に加えた場合、次いで200μｌのNaOH
中和溶液が試料に加えられる。

NaOH中和溶液:100mlの水中、31.76グラムの水酸化ナト
リウム（40g/mol）（最終濃度:7.94M）。

（５） SB−18様界面活性剤またはほぼオクタデシルの
界面活性剤を含む緩衝液を試料に最終容量約25mlになる
まで加える。

（６） 37℃で60分間振盪（140rpm）しながらインキュ
ベートする。

（７） キャップをゆるめ、真空オーブンに移す。42℃
にて60分間、600mmHg下でインキュベートする。

（８） キャップを締め、5,000×ｇで20分間37℃で遠
心分離する。

（９） チューブをデカントし、300μｌの滅菌水を試
料に加える。

（10） ペレットを再懸濁し、200μｌを増幅用に2X溶
解緩衝液に移す。増幅および検出用に試料を実施例１に
記載したようにプロセスする。

（11） 残った沈殿物を分析用のBACTEC 12B培養瓶（Be
cton−Dickinson）に移す。

実施例16 実施例12、13、14、または15のいずれかの方法で、所
望の非ミコバクテリア微生物、あるいは所望のミコバク
テリア群または複合体、あるいはミコバクテリア種、あ
るいはM.tuberculosis（MTB）複合体、M.avium（MAC）
複合体、MAIS複合体およびM.fortuitum複合体のような
ミコバクテリア複合体、ならびに速く増殖するまたは遅
く増殖するミコバクテリア（特定のおよび非特定の光発
色菌、非光発色菌、暗発色菌、ならびに特に M.africanum,M.asiaticum,M.avium,M.bovis,M.bovis
（BCG）,M.butyricum,M.chelonae,M.duvalii,M.flavesc
ens,M.fortuitum,M.gastri,M.gordonae,M.haemophilum,
M.intracellularae,M.kansasii,M.leprae,M.lepraemuri
um,M.linda,M.lufu,M.marinum,M.malmoense,M.microti,
M.mucoscum,M.nonchromogenicum,M.paratuberculosis,
M.peregrinum,M.phlei,M.rhodochrous,M.scrofulaceum,
M.shimoidei,M.simiae,M.smegmatis,M.sxulgai,M.terra
e,M.thermoresistable,M.triviale,M.tuberculosis,M.u
lcerans,M.vaccae,M.xenopi を含む）が、遺伝物質の検出またはこのような微生物の
存在を示す抗原の検出により検出されることを除く。

実施例17 実施例12〜16のいずれかに示された方法で、界面活性
剤が、SB−18以外で表２および３に定義されるSB−18様
界面活性剤であることを除く。

実施例18 実施例12〜16のいずれかに示された方法で、界面活性
剤が、SB−18以外でほぼオクタデシルの界面活性剤であ
ることを除く。

実施例19 実施例12〜16のいずれかに示された方法で、少なくと
も２つの異なるほぼオクタデシルの界面活性剤が、プロ
セッシング工程で用いられることを除く。

実施例20 本明細書中で記載されたCAS 番号のCAS 番号、化学
名および化学構造のリストが表13に提供される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ３２２，８６４ (32)優先日 平成６年10月11日(1994．10．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ３９３，５６４ (32)優先日 平成７年２月23日(1995．2．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 前置審査 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃ ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ, （1993）Ｖｏｌ．31，Ｎｏ．１，ｐ．61 −65 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/24 C12N 1/00 - 1/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (51)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の工程を包含する、試料中に存在して
   いるのが疑わしい少なくとも１種の微生物の検出のため
   の該試料の調製方法： （ａ）該試料のサンプルを界面活性剤を含有する組成物
   に曝す工程；および （ｂ）該微生物を検出する工程、ここで該微生物はその
   外膜にミコール酸構造を含む。工程； を含有する方法であって、ここで、該界面活性剤が、以
   下の一般式（Ｉ）〜（Ｖ）に対応する、CB様、SB様、HS
   B様、PB様、StB様、PhB様、SoB様、ReV−Ｂ様、AO様、c
   AB様、ImB様界面活性剤、およびポリオキシエチレン10
   オレイルエーテル（Ｃ_18:1E₁₀）（CAS^R番号9004−98−
   ２）からなる群から選択される、方法： 【化１】 ここで、R₁はC₈−C₂₂であり； αは−CH₂−、−CH（OH）−、−（CO）−NH−CH₂CH₂CH₂
   −、−Ｏ−、または−Ｃ（Ｏ）−であり； ｎは０または１であり； βは−N⁺−、−P⁺−、または−S⁺−であり； R₂は−Ｈ、−CH₃、−C₂H₅、−C₃H₇、または−C₄H₉であ
   り； R₃は−Ｈ、−CH₃、−C₂H₅−、−C₃H₇、または−C₄H₉で
   あり； R₄は−CH₂−、−C₂H₄−、−C₃H₆−、−C₄H₈−、−C₅H₁₀
   −、−C₆H₁₂−、−CH₂−C₆H₄−、−C_mH_2m−、−CH（O
   H）CH₂CH₂−、−CH₂CH（OH）CH₂−、または−C_mH
   _2m-1（OH）−（ここでｍは≧１である）であり；そして γは−SO₃ ^-、−OSO₃ ^-、−COO^-、−OPO₃ ³−PO₃ ^-、−P
   O₂ ^-、または−O^-であり； 【化２】 ここで、R₁〜R₁、α、βおよびγは、上記の式（Ｉ）に
   ついて定義されるとおりである。
2. 【請求項２】前記界面活性剤が、式（Ｉ）に記載のSB様
   界面活性剤であり、ここでγは−SO₃ ^-である、請求項１
   に記載の方法。
3. 【請求項３】前記界面活性剤が、式（Ｉ）に記載のHSB
   様界面活性剤であり、ここでγは−SO₃ ^-で、そしてR₄は
   −C_mH_2m-1（OH）−（ここでｍは≧１である）である、
   請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】前記SB様界面活性剤が、以下からなる群か
   ら選択される、請求項２に記載の方法： N,N−ジメチル−Ｎ−（スルホメチル）−１−ドデカン
   アミニウム、分子内塩（CAS^R番号52667−78−４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（スルホメチル）−１−ヘキサデ
   カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号69775−75−
   ３）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（スルホメチル）−１−オクタデ
   カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号36051−36−
   ２）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−スルホエチル）−１−ドデ
   カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号24020−67−
   ５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−スルホエチル）−１−テト
   ラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号58930−04−
   ４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−スルホエチル）−１−ヘキ
   サデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号58930−05−
   ５）、 N,N−ジメチル−３−（（１−オキソヘキサデシル）ア
   ミノ）−Ｎ−（２−スルホエチル）−１−プロパンアミ
   ニウム、分子内塩（CAS^R番号58930−06−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−オ
   クタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号15178−76−
   ４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−デ
   カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号15163−36−
   ７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−ド
   デカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号14933−08−
   ５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−テ
   トラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号14933−09
   −６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−ペ
   ンタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号67030−70
   −０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−ヘ
   キサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号2281−11−
   ０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−オ
   クタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号13177−41
   −８）、 ドデシルジプロピル（３−スルホプロピル）−アンモニ
   ウムヒドロキシド、分子内塩（CAS^R番号15163−34−
   ５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソドデシル）
   アミノ）プロピル）−３−スルホ−１−プロパンアミニ
   ウム、分子内塩（CAS^R番号52562−28−４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソヘキサデシ
   ル）アミノ）プロピル）−３−スルホ−１−プロパンア
   ミニウム、分子内塩（CAS^R番号52562−29−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（メチル−２−スルホエチル）−
   １−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号59942−4
   0−４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（メチル−２−スルホエチル）−
   １−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号5994
   2−41−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（メチル−２−スルホエチル）−
   １−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号5994
   2−42−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソヘキサデシ
   ル）アミノ）プロピル）−２−スルホ−１−プロパンア
   ミニウム、分子内塩（CAS^R番号63663−13−８）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（４−スルホブチル）−１−ドデ
   カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号64463−49−
   ６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（４−スルホブチル）−１−ヘキ
   サデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号58930−07−
   ７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（４−スルホブチル）−１−オク
   タデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号22313−73−
   １）、 Ｎ−（1,3−ジメチル−３−スルホブチル）−N,N−ジメ
   チル−１−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号35
   489−44−２）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（オキソヘキサデシル）
   アミノ）プロピル）−４−スルホ−１−ブタンアミニウ
   ム、分子内塩（CAS^R番号58930−08−８）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（６−スルホヘキシル）−１−ヘ
   キサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号132621−81
   −９）、 Ｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−４−スルホ−ベンゼン
   メタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−40−
   ７）、 N,N−ジメチル−４−スルホ−Ｎ−テトラデシル−ベン
   ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−41
   −８）、 Ｎ−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−４−スルホ−ベン
   ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−42
   −９）、 N,N−ジメチル−Ｎ−オクタデシル−４−スルホ−ベン
   ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−43
   −０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソドデシル）
   アミノ）プロピル）−４−スルホ−ベンゼンメタンアミ
   ニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−44−１）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソテトラデシ
   ル）アミノ）プロピル）−４−スルホ−ベンゼンメタン
   アミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−45−２）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソヘキサデシ
   ル）アミノ）プロピル）−４−スルホ−ベンゼンメタン
   アミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−46−３）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソオクタデシ
   ル）アミノ）プロピル）−４−スルホ−ベンゼンメタン
   アミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−47−４）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
   ジメチル−１−デカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号
   34135−76−７）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
   ジメチル−１−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
   号13197−76−７）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
   ジメチル−２−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CA
   S^R番号56505−82−９）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
   ジメチル−１−ペンタデカンアミニウム、分子内塩（CA
   S^R番号71502−45−９）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
   ジメチル−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CA
   S^R番号7425−12−９）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
   ジメチル−１−オクタデカンアミニウム、分子内塩（CA
   S^R番号19223−56−４）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
   オキソドデシル）アミノ）プロピル）−３−スルホ−１
   −プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号19223−55
   −３）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
   オキソテトラデシル）アミノ）プロピル）−３−スルホ
   −１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号63663
   −10−５）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
   オキソヘキサデシル）アミノ）プロピル）−３−スルホ
   −１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号63663
   −11−６）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
   オキソオクタデシル）アミノ）プロピル）−３−スルホ
   −１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号63663
   −12−７）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
   ジメチル−１−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CA
   S^R番号13177−42−９）、 およびＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
   N,N−ジメチル−１−テトラデカンアミニウム、分子内
   塩（CAS^R番号71497−51−３）、 ココアミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（CAS^R番
   号68139−30−０）、 アルキルエーテルヒドロキシプロピルスルホベタイン
   （CAS^R番号108797−84−８）、 獣脂アミドプロピルヒドロキシプロピルスルホベタイ
   ン、 エルカアミドプロピルヒドロキシプロピルスルホベタイ
   ン、および カノールアミドプロピルベタイン。
5. 【請求項５】前記SB様界面活性剤が、N,N−ジメチル−
   Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−ヘキサデカンアミニ
   ウム、分子内塩（CAS^R番号2281−11−０）である、請求
   項４に記載の方法。
6. 【請求項６】前記SB様界面活性剤が、N,N−ジメチル−
   Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−オクタデカンアミニ
   ウム、分子内塩（CAS^R番号13177−41−８）である、請
   求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】前記界面活性剤が、式（Ｉ）に記載のCB様
   界面活性剤であり、ここでγは−COO^-である、請求項１
   に記載の方法。
8. 【請求項８】前記CB様界面活性剤が、以下からなる群か
   ら選択される、請求項７に記載の方法： Ｎ−（カルボキシメチル）−N,N−ジメチル−１−ヘキ
   サデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号693−33−
   ４）、 ココカルボキシメチルベタイン（CAS^R番号68424−94−
   ２）、 Ｎ−（カルボキシメチル）−N,N−ジメチル−９−オク
   タデセン−１−アミニウム、分子内塩（CAS^R番号871−3
   7−４）、 Ｎ−（カルボキシメチル）−N,N−ジメチル−３−
   （（１−オキソオクタデシル）アミノ）−１−プロパン
   アミニウム、分子内塩（CAS^R番号6179−44−８）、 ３−アミノ−Ｎ（カルボキシメチル）−N,N−ジメチル
   −１−プロパンアミニウムＮ−C8−C22アシル誘導体、
   分子内塩（CAS^R番号84082−44−０）、 Ｎ−（カルボキシメチル）−３−（（12−ヒドロキシ−
   １−オキソ−９−オクタデセニル）アミノ）−N,N−ジ
   メチル−１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号
   71850−81−２）、 ココアミドプロピルカルボキシメチルベタイン（CAS^R番
   号61789−39−７およびCAS^R番号61789−40−０）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
   ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号16527−85−
   ８）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
   トリデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号132621−79
   −５）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
   テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号69725−3
   8−３）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
   ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号42416−4
   3−３）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
   オクタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号30612−7
   3−８）、 Ｎ−ドデシル−β−アラニン（CAS^R番号1462−54−
   ０）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
   −ウンデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号150147−
   53−８）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
   −ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号15163−30
   −１）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
   −テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号146959
   −90−２）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
   −ペンタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号146959
   −91−３）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
   −ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695
   −32−４）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
   −オクタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号78195
   −27−４）、 Ｎ−（４−カルボキシブチル）−N,N−ジメチル−１−
   ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号120139−51−
   ７）、 Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−N,N−ジメチル−１
   −ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号76392−97
   −７）、 Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−N,N−ジメチル−１
   −ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号73565
   −98−７）、 Ｎ−（６−カルボキシヘキシル）−N,N−ジメチル−１
   −ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号132621−80
   −８）、 ４−カルボキシ−Ｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−ベン
   ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695−31
   −３）、 ２−カルボキシ−Ｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−ベン
   ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695−34
   −６）、 ４−カルボキシ−Ｎ−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−
   ベンゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695
   −33−５）、 ２−カルボキシ−Ｎ−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−
   ベンゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695
   −35−７）、 獣脂グリシネート（CAS^R番号70750−46−８）、 ダイズアミドプロピルカルボキシメチルペタイン、およ
   び ババス−アミドプロピルカルボキシメチルベタイン。
9. 【請求項９】前記CB様界面活性剤が、Ｎ−（３−カルボ
   キシプロピル）−N,N−ジメチル−１−オクタデカンア
   ミニウム、分子内塩（CAS^R番号78195−27−４）であ
   る、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】前記界面活性剤が、式（Ｉ）に記載のPB
    様界面活性剤であり、ここでγは−PO_x ^-（ここでｘは
    １、２、または３）である、請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記PB様界面活性剤が、以下からなる群
    から選択される、請求項10に記載の方法： N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−デカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号1348
    42−83−４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ウンデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号
    134842−84−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号12
    6712−86−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−87−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−88−７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘプタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号145578−49−０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−オクタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−89−８）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−オクタデセン−１−アミニウム、分子内塩（CAS^R
    番号134590−60−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−９−オクタデセン−１−アミニウム、分子内塩
    （CAS^R番号148716−30−７）、 N,N−ジエチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−90−１）、 Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチル）−N,N−ジプロ
    ピル−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−91−２）、 N,N−ジブチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−92−３）、 Ｎ−エチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチル）−
    Ｎ−プロピル−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩
    （CAS^R番号126712−93−４）、 Ｎ−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキ
    シ）エチル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩
    （CAS^R番号134842−85−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（ホスホノオキシ）プロピ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号89367−17−９）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（４−（ホスホノオキシ）ブチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号134842−86−７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（６−（ホスホノオキシ）ヘキシ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号134842−87−８）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホ
    ノオキシ）エチル）−１−ドデカンアミニウム、分子内
    塩（CAS^R番号124591−53−３）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホ
    ノオキシ）エチル）−１−テトラデカンアミニウム、分
    子内塩（CAS^R番号124591−54−４）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホ
    ノオキシ）エチル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分
    子内塩（CAS^R番号124591−57−７）、 Ｎ−ブチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキ
    シ）エチル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩
    （CAS^R番号126712−94−５）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソドデシル）アミノ）プロピル）−３−（ホスホノ
    オキシ）−１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号73602−79−６）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソオクタデシル）アミノ）プロピル）−３−（ホス
    ホノオキシ）−１−プロパンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号144077−12−３）、 ３−（デシルオキシ）−２−ヒドロキシ−N,N−ジメチ
    ル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチル）−１−プロ
    パンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号128506−41−
    ２）、 ３−（ドデシルオキシ）−２−ヒドロキシ−N,N−ジメ
    チル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチル）−１−プ
    ロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号128506−42−
    ３）、および ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホ
    ノオキシ）エチル）−３−（テトラデシルオキシ）−１
    −プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号128506−46
    −７）。
12. 【請求項１２】前記微生物の少なくとも１種が、ミコバ
    クテリアのメンバーである、請求項１〜11のいずれか１
    項に記載の方法。
13. 【請求項１３】前記ミコバクテリアが、以下からなる群
    の１種またはそれ以上のメンバーから選択される、請求
    項12に記載の方法： 【化３】 M.tuberculosis（MTB）複合体,M.avium（MAC）複合体,M
    AIS複合体,M.fortuitum複合体,photochromogens,nonpho
    tochromogens,scotochromogens,M.africanum,M.asiatic
    um,M.avium,M.bovis,M.bovis（BCG）,M.butyricum,M.ch
    elonae,M.duvalii,M.flavescens,M.fortuitum,M.gastr
    i,M.gordonae,M.haemophilum,M.intracellularae,M.kan
    sasii,M.leprae,M.lepraemurium,M.linda,M.lufu,M.mar
    inum,M.malmoense,M.microti,M.mucoscum,M.nonchromog
    enicum,M.paratuberculosis,M.peregrium,M.phlei,M.rh
    odochrous,M.scrofulaceum,M.shimoidei,M.simiae,M.sm
    egmatis,M.szulgai,M.terrae,M.thermoresistable,M.tr
    iviale,M.tuberculosis,M.ulcerans,M.vaccae,M.xenop
    i,およびそれらの血液型亜型。
14. 【請求項１４】前記ミコバクテリアが、M.tuberculosis
    （MTB）複合体およびM.avium（MAC）複合体からなる群
    から選択される、請求項13に記載の方法。
15. 【請求項１５】前記ミコバクテリアが、M.tuberculosis
    （MTB）複合体のメンバーである、請求項14に記載の方
    法。
16. 【請求項１６】前記ミコバクテリアが、M.tuberculosi
    s、M.avium、M.paratuberculosis、M.intracellulare、
    M.kansasiiおよびM.marinumからなる群から選択され
    る、請求項13に記載の方法。
17. 【請求項１７】以下の工程を包含する、試料中に存在し
    ているのが疑わしい１種またはそれ以上の微生物の検出
    のための該試料の調製方法： （ａ）該試料のサンプルを、該サンプル中の少なくとも
    １種の該微生物の浮力を変化させるに十分な減圧に曝す
    工程、ここで該微生物はその外膜にミコール酸構造を含
    む；および （ｂ）該微生物を、該浮力の変化の結果として検出する
    工程。
18. 【請求項１８】前記方法が、少なくとも１つの洗浄工程
    をさらに包含し、ここで前記微生物サンプルが、請求項
    １〜11のいずれか１項において規定される界面活性剤と
    接触して配置される、請求項17に記載の方法。
19. 【請求項１９】先に行われる前記洗浄工程が、前記減圧
    工程後および／または前記減圧工程と同時である、請求
    項18に記載の方法。
20. 【請求項２０】前記界面活性剤が、式（Ｉ）に記載のSB
    様界面活性剤であり、ここでγは−SO₃ ^-である、請求項
    18または19に記載の方法。
21. 【請求項２１】前記界面活性剤が、式（Ｉ）に記載のHS
    B様界面活性剤であり、ここでγは−SO₃ ^-であり、そし
    てR₄は−C_mH_2m-1（OH）−（ここでｍは≧１である）で
    ある、請求項18または19に記載の方法。
22. 【請求項２２】前記SB様界面活性剤が、以下からなる群
    から選択される、請求項20に記載の方法： N,N−ジメチル−Ｎ−（スルホメチル）−１−ドデカン
    アミニウム、分子内塩（CAS^R番号52667−78−４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（スルホメチル）−１−ヘキサデ
    カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号69775−75−
    ３）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（スルホメチル）−１−オクタデ
    カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号36051−36−
    ２）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−スルホエチル）−１−ドデ
    カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号24020−67−
    ５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−スルホエチル）−１−テト
    ラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号58930−04−
    ４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−スルホエチル）−１−ヘキ
    サデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号58930−05−
    ５）、 N,N−ジメチル−３−（１−オキソヘキサデシル）アミ
    ノ）−Ｎ−（２−スルホエチル）−１−プロパンアミニ
    ウム、分子内塩（CAS^R番号58930−06−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−オ
    クタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号15178−76−
    ４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−デ
    カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号15163−36−
    ７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−ド
    デカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号14933−08−
    ５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−テ
    トラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号14933−09
    −６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−ペ
    ンタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号67030−70
    −０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−ヘ
    キサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号2281−11−
    ０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−オ
    クタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号13177−41
    −８）、 ドデシルジプロピル（３−スルホプロピル）−アンモニ
    ウムヒドロキシド、分子内塩（CAS^R番号15163−34−
    ５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソドデシル）
    アミノ）プロピル）−３−スルホ−１−プロパンアミニ
    ウム、分子内塩（CAS^R番号52562−28−４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソヘキサデシ
    ル）アミノ）プロピル）−３−スルホ−１−プロパンア
    ミニウム、分子内塩（CAS^R番号52562−29−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（メチル−２−スルホエチル）−
    １−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号59942−4
    0−４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（メチル−２−スルホエチル）−
    １−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号5994
    2−41−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（メチル−２−スルホエチル）−
    １−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号5994
    2−42−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソヘキサデシ
    ル）アミノ）プロピル）−２−スルホ−１−プロパンア
    ミニウム、分子内塩（CAS^R番号63663−13−８）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（４−スルホブチル）−１−ドデ
    カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号64463−49−
    ６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（４−スルホブチル）−１−ヘキ
    サデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号58930−07−
    ７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（４−スルホブチル）−１−オク
    タデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号22313−73−
    １）、 Ｎ−（1,3−ジメチル−３−スルホブチル）−N,N−ジメ
    チル−１−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号35
    489−44−２）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（オキソヘキサデシル）
    アミノ）プロピル）−４−スルホ−１−ブタンアミニウ
    ム、分子内塩（CAS^R番号58930−08−８）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（６−スルホヘキシル）−１−ヘ
    キサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号132621−81
    −９）、 Ｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−４−スルホ−ベンゼン
    メタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−40−
    ７）、 N,N−ジメチル−４−スルホ−Ｎ−テトラデシル−ベン
    ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−41
    −８）、 Ｎ−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−４−スルホ−ベン
    ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−42
    −９）、 N,N−ジメチル−Ｎ−オクタデシル−４−スルホ−ベン
    ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−43
    −０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソドデシル）
    アミノ）プロピル）−４−スルホ−ベンゼンメタンアミ
    ニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−44−１）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソテトラデシ
    ル）アミノ）プロピル）−４−スルホ−ベンゼンメタン
    アミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−45−２）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソヘキサデシ
    ル）アミノ）プロピル）−４−スルホ−ベンゼンメタン
    アミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−46−３）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソオクタデシ
    ル）アミノ）プロピル）−４−スルホ−ベンゼンメタン
    アミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−47−４）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−デカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号
    34135−76−７）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号13197−76−７）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−２−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号56505−82−９）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−ペンタデカンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号71502−45−９）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号7425−12−９）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−オクタデカンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号19223−56−４）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソドデシル）アミノ）プロピル）−３−スルホ−１
    −プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号19223−55
    −３）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソテトラデシル）アミノ）プロピル）−３−スルホ
    −１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号63663
    −10−５）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソヘキサデシル）アミノ）プロピル）−３−スルホ
    −１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号63663
    −11−６）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソオクタデシル）アミノ）プロピル）−３−スルホ
    −１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号63663
    −12−７）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号13177−42−９）、および Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号71497−51−３）、 ココアミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（CAS^R番
    号68139−30−０）、 アルキルエーテルヒドロキシプロピルスルホベタイン
    （CAS^R番号108797−84−８）、 獣脂アミドプロピルヒドロキシプロピルスルホベタイ
    ン、 エルカアミドプロピルヒドロキシプロピルスルホベタイ
    ン、および カノールアミドプロピルベタイン。
23. 【請求項２３】前記SB様界面活性剤が、N,N−ジメチル
    −Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−ヘキサデカンアミ
    ニウム、分子内塩（CAS^R番号2281−11−０）である、請
    求項22に記載の方法。
24. 【請求項２４】前記SB様界面活性剤が、N,N−ジメチル
    −Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−オクタデカンアミ
    ニウム、分子内塩（CAS^R番号13177−41−８）である、
    請求項22に記載の方法。
25. 【請求項２５】前記界面活性剤が、式（Ｉ）に記載のCB
    様界面活性剤であり、ここでγは−COO^-である、請求項
    18または19に記載の方法。
26. 【請求項２６】前記CB様界面活性剤が、以下からなる群
    から選択される、請求項25に記載の方法： Ｎ−（カルボキシメチル）−N,N−ジメチル−１−ヘキ
    サデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号693−33−
    ４）、 ココカルボキシメチルベタインおよび（CAS^R番号68424
    −94−２）、 Ｎ−（カルボキシメチル）−N,N−ジメチル−９−オク
    タデセン−１−アミニウム、分子内塩（CAS^R番号871−3
    7−４）、 Ｎ−（カルボキシメチル）−N,N−ジメチル−３−
    （（１−オキソオクタデシル）アミノ）−１−プロパン
    アミニウム、分子内塩（CAS^R番号6179−44−８）、 ３−アミノ−Ｎ（カルボキシメチル）−N,N−ジメチル
    −１−プロパンアミニウムＮ−C8−C22アシル誘導体、
    分子内塩（CAS^R番号84082−44−０）、 Ｎ−（カルボキシメチル）−３−（（12−ヒドロキシ−
    １−オキソ−９−オクタデセニル）アミノ）−N,N−ジ
    メチル−１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号
    71850−81−２）、 ココアミドプロピルカルボキシメチルベタイン（CAS^R番
    号61789−39−７およびCAS^R番号61789−40−０）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
    ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号16527−85−
    ８）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
    トリデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号132621−79
    −５）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
    テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号69725−3
    8−３）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
    ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号42416−4
    3−３）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
    オクタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号30612−7
    3−８）、 Ｎ−ドデシル−β−アラニン（CAS^R番号1462−54−
    ０）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
    −ウンデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号150147−
    53−８）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
    −ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号15163−30
    −１）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
    −テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号146959
    −90−２）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
    −ペンタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号146959
    −91−３）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
    −ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695
    −32−４）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
    −オクタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号78195
    −27−４）、 Ｎ−（４−カルボキシブチル）−N,N−ジメチル−１−
    ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号120139−51−
    ７）、 Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−N,N−ジメチル−１
    −ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号76392−97
    −７）、 Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−N,N−ジメチル−１
    −ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号73565
    −98−７）、 Ｎ−（６−カルボキシヘキシル）−N,N−ジメチル−１
    −ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号132621−80
    −８）、 ４−カルボキシ−Ｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−ベン
    ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695−31
    −３）、 ２−カルボキシ−Ｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−ベン
    ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695−34
    −６）、 ４−カルボキシ−Ｎ−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−
    ベンゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695
    −33−５）、 ２−カルボキシ−Ｎ−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−
    ベンゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695
    −35−７）、 獣脂グリシネート（CAS^R番号70750−46−８）、 ダイズアミドプロピルカルボキシメチルペタイン、およ
    び ババス−アミドプロピルカルボキシメチルベタイン。
27. 【請求項２７】前記CB様界面活性剤が、Ｎ−（３−カル
    ボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１−オクタデカン
    アミニウム、分子内塩（CAS^R番号78195−27−４）であ
    る、請求項26に記載の方法。
28. 【請求項２８】前記界面活性剤が、式（Ｉ）に記載のPB
    様界面活性剤であり、ここでγは−PO_x ^-（ここでｘは
    １、２、または３）である、請求項18または19に記載の
    方法。
29. 【請求項２９】前記PB様界面活性剤が、以下からなる群
    から選択される、請求項28に記載の方法： N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−デカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号1348
    42−83−４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ウンデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号
    134842−84−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号12
    6712−86−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−87−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−88−７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘプタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号145578−49−０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−オクタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−89−８）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−オクタデセン−１−アミニウム、分子内塩（CAS^R
    番号134590−60−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−９−オクタデセン−１−アミニウム、分子内塩
    （CAS^R番号148716−30−７）、 N,N−ジエチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−90−１）、 Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチル）−N,N−ジプロ
    ピル−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−91−２）、 N,N−ジブチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−92−３）、 Ｎ−エチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチル）−
    Ｎ−プロピル−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩
    （CAS^R番号126712−93−４）、 Ｎ−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキ
    シ）エチル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩
    （CAS^R番号134842−85−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（ホスホノオキシ）プロピ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号89367−17−９）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（４−（ホスホノオキシ）ブチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号134842−86−７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（６−（ホスホノオキシ）ヘキシ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号134842−87−８）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホ
    ノオキシ）エチル）−１−ドデカンアミニウム、分子内
    塩（CAS^R番号124591−53−３）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホ
    ノオキシ）エチル）−１−テトラデカンアミニウム、分
    子内塩（CAS^R番号124591−54−４）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホ
    ノオキシ）エチル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分
    子内塩（CAS^R番号124591−57−７）、 Ｎ−ブチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキ
    シ）エチル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩
    （CAS^R番号126712−94−５）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソドデシル）アミノ）プロピル）−３−（ホスホノ
    オキシ）−１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号73602−79−６）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソオクタデシル）アミノ）プロピル）−３−（ホス
    ホノオキシ）−１−プロパンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号144077−12−３）、 ３−（デシルオキシ）−２−ヒドロキシ−N,N−ジメチ
    ル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチル）−１−プロ
    パンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号128506−41−
    ２）、 ３−（ドデシルオキシ）−２−ヒドロキシ−N,N−ジメ
    チル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチル）−１−プ
    ロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号128506−42−
    ３）、および ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホ
    ノオキシ）エチル）−３−（テトラデシルオキシ）−１
    −プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号128506−46
    −７）。
30. 【請求項３０】前記PB様界面活性剤が、以下からなる群
    から選択される、請求項28に記載の方法： N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号12
    6712−86−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−87−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−88−７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘプタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号145578−49−０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−オクタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−89−８）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（ホスホノオキシ）プロピ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号89367−17−９）、および N,N−ジブチル−Ｎ−（４−（ホスホノオキシ）ブチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号134842−86−７）。
31. 【請求項３１】前記微生物が、ミコバクテリアである、
    請求項18〜30のいずれか１項に記載の方法。
32. 【請求項３２】前記ミコバクテリアが、以下からなる群
    の１種またはそれ以上のメンバーから選択される、請求
    項31に記載の方法： 【化４】 M.tuberculosis（MTB）複合体,M.avium（MAC）複合体,M
    AIS複合体,M.fortuitum複合体,photochromogens,nonpho
    tochromogens,scotochromogens,M.africanum,M.asiatic
    um,M.avium,M.bovis,M.bovis（BCG）,M.butyricum,M.ch
    elonae,M.duvalii,M.flavescens,M.fortuitum,M.gastr
    i,M.gordonae,M.haemophilum,M.intracellularae,M.kan
    sasii,M.leprae,M.lepraemurium,M.linda,M.lufu,M.mar
    inum,M.malmoense,M.microti,M.mucoscum,M.nonchromog
    enicum,M.paratuberculosis,M.peregririum,M.phlei,M.
    rhodochrous,M.scrofulaceum,M.shimoidei,M.simiae,M.
    smegmatis,M.szulgai,M.terrae,M.thermoresistable,M.
    triviale,M.tuberculosis,M.ulcerans,M.vaccae,M.xeno
    pi,およびそれらの血液型亜型。
33. 【請求項３３】前記ミコバクテリアが、M.tuberculosis
    （MTB）複合体、およびM.avium（MAC）複合体からなる
    群から選択される、請求項32に記載の方法。
34. 【請求項３４】前記ミコバクテリアが、M.tuberculosis
    （MTB）複合体のメンバーである、請求項33に記載の方
    法。
35. 【請求項３５】前記ミコバクテリアが、M.tuberculosi
    s、M.avium、M.paratuberculosis、M.intracellulare、
    M.kansasiiおよびM.marinumからなる群から選択され
    る、請求項32に記載の方法。
36. 【請求項３６】ミコバクテリアを検出するために試料を
    プロセッシングするたのキットであって、ここで該キッ
    トを該ミコバクテリアの検出手段と密接に拘束された、
    および／または近接する界面活性剤を含み、ここで該界
    面活性剤が請求項１〜11のいずれか１項において特定さ
    れるように規定される、キット。
37. 【請求項３７】前記界面活性剤が、式（Ｉ）に記載のSB
    様界面活性剤であり、ここでγは−SO₃ ^-である、請求項
    36に記載のキット。
38. 【請求項３８】前記界面活性剤が、式（Ｉ）に記載のHS
    B様界面活性剤であり、ここでγは−SO₃ ^-であり、そし
    てR₄は−C_mH_2m-1（OH）−（ここでｍは≧１）である、
    請求項36に記載のキット。
39. 【請求項３９】前記SB様界面活性剤が、以下からなる群
    から選択される、請求項38に記載のキット： N,N−ジメチル−Ｎ−（スルホメチル）−１−ドデカン
    アミニウム、分子内塩（CAS^R番号52667−78−４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（スルホメチル）−１−ヘキサデ
    カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号69775−75−
    ３）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（スルホメチル）−１−オクタデ
    カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号36051−36−
    ２）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−スルホエチル）−１−ドデ
    カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号24020−67−
    ５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−スルホエチル）−１−テト
    ラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号58930−04−
    ４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−スルホエチル）−１−ヘキ
    サデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号58930−05−
    ５）、 N,N−ジメチル−３−（（１−オキソヘキサデシル）ア
    ミノ）−Ｎ−（２−スルホエチル）−１−プロパンアミ
    ニウム、分子内塩（CAS^R番号58930−06−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−オ
    クタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号15178−76−
    ４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−デ
    カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号15163−36−
    ７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−ド
    デカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号14933−08−
    ５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−テ
    トラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号14933−09
    −６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−ペ
    ンタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号67030−70
    −０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−ヘ
    キサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号2281−11−
    ０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−オ
    クタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号13177−41
    −８）、 ドデシルジプロピル（３−スルホプロピル）−アンモニ
    ウムヒドロキシド、分子内塩（CAS^R番号15163−34−
    ５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソドデシル）
    アミノ）プロピル）−３−スルホ−１−プロパンアミニ
    ウム、分子内塩（CAS^R番号52562−28−４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソヘキサデシ
    ル）アミノ）プロピル）−３−スルホ−１−プロパンア
    ミニウム、分子内塩（CAS^R番号52562−29−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（メチル−２−スルホエチル）−
    １−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号59942−4
    0−４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（メチル−２−スルホエチル）−
    １−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号5994
    2−41−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（メチル−２−スルホエチル）−
    １−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号5994
    2−42−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソヘキサデシ
    ル）アミノ）プロピル）−２−スルホ−１−プロパンア
    ミニウム、分子内塩（CAS^R番号63663−13−８）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（４−スルホブチル）−１−ドデ
    カンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号64463−49−
    ６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（４−スルホブチル）−１−ヘキ
    サデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号58930−07−
    ７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（４−スルホブチル）−１−オク
    タデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号22313−73−
    １）、 Ｎ−（1,3−ジメチル−３−スルホブチル）−N,N−ジメ
    チル−１−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号35
    489−44−２）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（オキソヘキサデシル）
    アミノ）プロピル）−４−スルホ−１−ブタンアミニウ
    ム、分子内塩（CAS^R番号58930−08−８）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（６−スルホヘキシル）−１−ヘ
    キサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号132621−81
    −９）、 Ｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−４−スルホ−ベンゼン
    メタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−40−
    ７）、 N,N−ジメチル−４−スルホ−Ｎ−テトラデシル−ベン
    ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−41
    −８）、 Ｎ−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−４−スルホ−ベン
    ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−42
    −９）、 N,N−ジメチル−Ｎ−オクタデシル−４−スルホ−ベン
    ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−43
    −０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソドデシル）
    アミノ）プロピル）−４−スルホ−ベンゼンメタンアミ
    ニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−44−１）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソテトラデシ
    ル）アミノ）プロピル）−４−スルホ−ベンゼンメタン
    アミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−45−２）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソヘキサデシ
    ル）アミノ）プロピル）−４−スルホ−ベンゼンメタン
    アミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−46−３）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−オキソオクタデシ
    ル）アミノ）プロピル）−４−スルホ−ベンゼンメタン
    アミニウム、分子内塩（CAS^R番号65180−47−４）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−デカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号
    34135−76−７）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号13197−76−７）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号56505−82−９）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−ペンタデカンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号71502−45−９）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号7425−12−９）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−オクタデカンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号19223−56−４）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソドデシル）アミノ）プロピル）−３−スルホ−１
    −プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号19223−55
    −３）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソテトラデシル）アミノ）プロピル）−３−スルホ
    −１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号63663
    −10−５）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソヘキサデシル）アミノ）プロピル）−３−スルホ
    −１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号63663
    −11−６）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソオクタデシル）アミノ）プロピル）−３−スルホ
    −１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号63663
    −12−７）、 Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−N,N−
    ジメチル−１−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号13177−42−９）、 およびＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
    N,N−ジメチル−１−テトラデカンアミニウム、分子内
    塩（CAS^R番号71497−51−３）、 ココアミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（CAS^R番
    号68139−30−０）、 アルキルエーテルヒドロキシプロピルスルホベタイン
    （CAS^R番号108797−84−８）、 獣脂アミドプロピルヒドロキシプロピルスルホベタイ
    ン、 エルカアミドプロピルヒドロキシプロピルスルホベタイ
    ン、および ４カノールアミドプロピルベタイン。
40. 【請求項４０】前記SB様界面活性剤が、N,N−ジメチル
    −Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−ヘキサデカンアミ
    ニウム、分子内塩（CAS^R番号2281−11−０）である、請
    求項39に記載のキット。
41. 【請求項４１】前記SB様界面活性剤が、N,N−ジメチル
    −Ｎ−（３−スルホプロピル）−１−オクタデカンアミ
    ニウム、分子内塩（CAS^R番号13177−41−８）である、
    請求項39に記載のキット。
42. 【請求項４２】前記界面活性剤が、式（Ｉ）に記載のCB
    様界面活性剤であり、ここでγは−COO^-である、請求項
    36に記載のキット。
43. 【請求項４３】前記CB様界面活性剤が、以下からなる群
    から選択される、請求項42に記載のキット： Ｎ−（カルボキシメチル）−N,N−ジメチル−１−ヘキ
    サデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号693−33−
    ４）、 ココカルボキシメチルベタイン（CAS^R番号68424−94−
    ２）、 Ｎ−（カルボキシメチル）−N,N−ジメチル−９−オク
    タデセン−１−アミニウム、分子内塩（CAS^R番号871−3
    7−４）、 Ｎ−（カルボキシメチル）−N,N−ジメチル−３−
    （（１−オキソオクタデシル）アミノ）−１−プロパン
    アミニウム、分子内塩（CAS^R番号6179−44−８）、 ３−アミノ−Ｎ（カルボキシメチル）−N,N−ジメチル
    −１−プロパンアミニウムＮ−C8−C22アシル誘導体、
    分子内塩（CAS^R番号84082−44−０）、 Ｎ−（カルボキシメチル）−３−（（12−ヒドロキシ−
    １−オキソ−９−オクタデセニル）アミノ）−N,N−ジ
    メチル−１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号
    71850−81−２）、 ココアミドプロピルカルボキシメチルベタイン（CAS^R番
    号61789−39−７およびCAS^R番号61789−40−０）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
    ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号16527−85−
    ８）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
    トリデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号132621−79
    −５）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
    テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号69725−3
    8−３）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
    ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号42416−4
    3−３）、 Ｎ−（２−カルボキシエチル）−N,N−ジメチル−１−
    オクタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号30612−7
    3−８）、 Ｎ−ドデシル−β−アラニン（CAS^R番号1462−54−
    ０）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
    −ウンデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号150147−
    53−８）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
    −ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号15163−30
    −１）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
    −テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号146959
    −90−２）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
    −ペンタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号146959
    −91−３）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
    −ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695
    −32−４）、 Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１
    −オクタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号78195
    −27−４）、 Ｎ−（４−カルボキシブチル）−N,N−ジメチル−１−
    ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号120139−51−
    ７）、 Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−N,N−ジメチル−１
    −ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号76392−97
    −７）、 Ｎ−（５−カルボキシペンチル）−N,N−ジメチル−１
    −ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号73565
    −98−７）、 Ｎ−（６−カルボキシヘキシル）−N,N−ジメチル−１
    −ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号132621−80
    −８）、 ４−カルボキシ−Ｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−ベン
    ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695−31
    −３）、 ２−カルボキシ−Ｎ−ドデシル−N,N−ジメチル−ベン
    ゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695−34
    −６）、 ４−カルボキシ−Ｎ−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−
    ベンゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695
    −33−５）、 ２−カルボキシ−Ｎ−ヘキサデシル−N,N−ジメチル−
    ベンゼンメタンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号71695
    −35−７）、 獣脂グリシネート（CAS^R番号70750−46−８）、 ダイズアミドプロピルカルボキシメチルベタイン、およ
    び ババス−アミドプロピルカルボキシメチルベタイン。
44. 【請求項４４】前記CB様界面活性剤が、Ｎ−（３−カル
    ボキシプロピル）−N,N−ジメチル−１−オクタデカン
    アミニウム、分子内塩（CAS^R番号78195−27−４）であ
    る、請求項43に記載のキット。
45. 【請求項４５】前記界面活性剤が、式（Ｉ）に記載のPB
    様界面活性剤であり、ここでγは−PO_x ^-（ここでｘは
    １、２、または３）である、請求項36に記載のキット。
46. 【請求項４６】前記PB様界面活性剤が、以下からなる群
    から選択される、請求項45に記載のキット： N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−デカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号1348
    42−83−４）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ウンデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号
    134842−84−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ドデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号12
    6712−86−５）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−テトラデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−87−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−88−７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘプタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号145578−49−０）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−オクタデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−89−８）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−オクタデセン−１−アミニウム、分子内塩（CAS^R
    番号134590−60−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−９−オクタデセン−１−アミニウム、分子内塩
    （CAS^R番号148716−30−７）、 N,N−ジエチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−90−１）、 Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチル）−N,N−ジプロ
    ピル−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−91−２）、 N,N−ジブチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号126712−92−３）、 Ｎ−エチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチル）−
    Ｎ−プロピル−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩
    （CAS^R番号126712−93−４）、 Ｎ−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキ
    シ）エチル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩
    （CAS^R番号134842−85−６）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（ホスホノオキシ）プロピ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号89367−17−９）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（４−（ホスホノオキシ）ブチ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号134842−86−７）、 N,N−ジメチル−Ｎ−（６−（ホスホノオキシ）ヘキシ
    ル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号134842−87−８）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホ
    ノオキシ）エチル）−１−ドデカンアミニウム、分子内
    塩（CAS^R番号124591−53−３）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホ
    ノオキシ）エチル）−１−テトラデカンアミニウム、分
    子内塩（CAS^R番号124591−54−４）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホ
    ノオキシ）エチル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分
    子内塩（CAS^R番号124591−57−７）、 Ｎ−ブチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−（ホスホノオキ
    シ）エチル）−１−ヘキサデカンアミニウム、分子内塩
    （CAS^R番号126712−94−５）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソドデシル）アミノ）プロピル）−３−（ホスホノ
    オキシ）−１−プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番
    号73602−79−６）、 ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（３−（（１−
    オキソオクタデシル）アミノ）プロピル）−３−（ホス
    ホノオキシ）−１−プロパンアミニウム、分子内塩（CA
    S^R番号144077−12−３）、 ３−（デシルオキシ）−２−ヒドロキシ−N,N−ジメチ
    ル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチル）−１−プロ
    パンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号128506−41−
    ２）、 ３−（ドデシルオキシ）−２−ヒドロキシ−N,N−ジメ
    チル−Ｎ−（２−（ホスホノオキシ）エチル）−１−プ
    ロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号128506−42−
    ３）、および ２−ヒドロキシ−N,N−ジメチル−Ｎ−（２−（ホスホ
    ノオキシ）エチル）−３−（テトラデシルオキシ）−１
    −プロパンアミニウム、分子内塩（CAS^R番号1285606−4
    6−７）。
47. 【請求項４７】少なくとも１種の前記微生物が、ミコバ
    クテリアのメンバーである、請求項36〜46のいずれか１
    項に記載のキット。
48. 【請求項４８】前記ミコバクテリアが、以下からなる群
    の１種またはそれ以上のメンバーから選択される、請求
    項47に記載のキット： 【化５】 M.tuberculosis（MTB）複合体,M.avium（MAC）複合体,M
    AIS複合体,M.fortuitum複合体,photochromogens,nonpho
    tochromogens,scotochromogens,M.africanum,M.asiatic
    um,M.avium,M.bovis,M.bovis（BCG）,M.butyricum,M.ch
    elonae,M.duvalii,M.flavescens,M.fortuitum,M.gastr
    i,M.gordonae,M.haemophilum,M.intracellularae,M.kan
    sasii,M.leprae,M.lepraemurium,M.linda,M.lufu,M.mar
    inum,M.malmoense,M.microti,M.mucoscum,M.nonchromog
    enicum,M.paratuberculosis,M.peregrinum,M.phlei,M.r
    hodochrous,M.scrofulaceum,M.shimoidei,M.simiae,M.s
    megmatis,M.szulgai,M.terrae,M.thermoresistable,M.t
    riviale,M.tuberculosis,M.ulcerans,M.vaccae,M.xenop
    i,およびそれらの血液型亜型。
49. 【請求項４９】前記ミコバクテリアが、M.tuberculosis
    （MTB）複合体、およびM.avium（MAC）複合体からなる
    群から選択される、請求項48に記載のキット。
50. 【請求項５０】前記ミコバクテリアが、M.tuberculosis
    （MTB）複合体のメンバーである、請求項49に記載のキ
    ット。
51. 【請求項５１】前記ミコバクテリアが、M.tuberculosi
    s、M.avium、M.paratuberculosis、M.intracellulare、
    M.kansasiiおよびM.marinumからなる群から選択され
    る、請求項48に記載のキット。