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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion pathogener
Organismen, wobei das Verfahren die Unterscheidung zwischen Arten
umfasst. Das Verfahren ist insbesondere geeignet zur Bestimmung und
Diagnose einer Infektion durch pathogene Organismen, die schwer
und/oder mühsam
mit konventionellen Verfahren zu bestimmen sind. Das Verfahren beruht
auf der Analyse spezifischer variabler Regionen des RNase P RNA-Gens.
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Hintergrund der Erfindung
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RNase
P ist ein Enzym, das in allen lebenden Zellen vorhanden ist. Es
katalysiert die Abspaltung von 5'-Leader-Sequenzen
aus tRNA-Vorläufermolekülen. In
Bakterien besteht RNase P aus einem RNA-Molekül mit einer Länge von
einigen 400 nt (11,28) und einem kleinen (ca. 120 aa) Protein (33).
Bei Bakterien zeigte sich, dass die RNA-Einheit als effizienter
Katalysator in vitro fungiert (12); RNase P ist deshalb zumindest
in diesen Organismen ein Ribozym (ein RNA-Molekül, das chemische Reaktionen
katalysiert). Bakterielle RNase P Rnas wurden in zwei Hauptstrukturklassen
unterteilt. Typ A ist die üblichste
Strukturklasse und Typ B wird in den G+C-Gramm-positiv armen Bakterien
gefunden (50). Die Sekundärstruktur
von RNase P RNA wurde für viele
Bakterienlinien charakterisiert und ein Unterschied in den Helices
liefert nützliche
phylogenitische Information (51).
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Die
RNase P RNA-Gensequenzen sind zwischen Bakteriengruppen nicht sehr
gut konserviert (5), aber innerhalb einer Klasse können die
Gene ziemlich ähnlich
sein. Mehrere Hundert RNase P RNA-Sequenzen sind in der RNase P RNA-Datenbank
((http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/RnaseP/home.html) enthalten.
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Die
Reihe Chlamydiales ist eine Gruppe obligatorisch intrazellulärer Bakterien,
die unikalen Entwicklungszyklus und Pathogenität aufweisen. Sie sind für Menschen
und eine große
Vielzahl von Tieren Parasiten. Arten in der Chlamydiaceae-Familie
wurden jüngst
in zwei Gattungen, Chlamydia und Chlamydophila, die neun Arten enthalten
(43) umklassifiziert. Zusätzlich
gehören
neue Familien nun zu Chlamydiales, und sie umfassen Parachlamydiaceae
und Simkaniaceae (43). Die typenspezifische Art von Parachlamydiaceae
ist Parachlamydia acanthamoebae, ein Symbiont der Amöben Acanthamoeba
castellani, und ein gelegentliches Pathogen für Leute, die diese Amöben (34)
erwerben. Simkania negevansis ist die typenspezifische Art von Simkaniaceae
und verursacht, wie viele andere Chlamydien, eine Infektion des
Menschen (56, 57, 61).
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Es
wurde kürzlich
gezeigt, dass die RNase P RNA-Gene in der Gattung Chlamydia sich
in den Arten ausreichend unterscheiden, um als diagnostisches Mittel
verwendet zu werden (13); das Gen ist somit potentiell für eine Stammdifferenzierung
brauchbar. Die Unterschiede zwischen Sequenzen geben auch Hinweise darauf,
welche Teile des Moleküls
für die
katalytische Wirksamkeit wichtig sind, was mutationelle und strukturelle
Untersuchungen vervollständigt.
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Eine
andere wichtige Familie von Pathogenen, bei denen schnelle und empfindliche
Diagnosemethoden lebenswichtig sind, sind die Mycobakterien. Traditionelle
diagnostische Methoden stützen
sich auf die Demonstration von säurebeständigen Bazillen
in klinischen Proben nach Kultivierung. Dies ist verlässlich,
aber zeitaufwendig, da langsam wachsende Arten, wie z.B. Mycobacterium
tuberculosis, sechs bis acht Wochen brauchen können, um eine ausreichend große Population
zu bilden. In den letzten paar Jahren wurden viele Detektionsassays
auf PCR-Basis entwickelt, z.B. auf Basis des hsp60-Gens (16) oder
der variablen durchsetzenden Region zwischen den 165- und 23S-rNA-Genen
(15, 24, 30), und dieser Trend hält
an.
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Die
RNase P RNA-Gensequenz von M. tuberculosis ist bekannt (6), sowie
die von M. bovis BCG und M. leprae. Die M. bovis-Sequenz ist identisch
mit der von M. tuberculosis, während
zu M. leprae Unterschiede bestehen. Die Regionen im RNase P RNA-Gen,
die durch andere Mittel als für
die katalytische Aktivität
wichtig festgestellt wurden, wurden unter den Mycobakterien fast
vollständig
konserviert. Die enge Verwandtschaft zwischen mikrobiellen Gattungen,
wie z.B. Mycobakterien, haben eine Unterscheidung zwischen Arten
der gleichen Gattung sehr schwierig oder unmöglich gemacht.
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US-Patent
Nr. 5 574 145 beschreibt ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen
Arten unter Verwendung variabler Regionen im Genom. Es wird jedoch
nicht die Verwendung der P3- oder P19-Regionen erwähnt.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung löst
das Problem der Unterscheidung zwischen Arten innerhalb der gleichen Gattung,
wie z.B. von Mycobakterien und Chlamydien. Außerdem löst die vorliegende Erfindung
das Problem der Bestimmung von Pathogenen, die mit konventionellen
Verfahren schwierig und/oder mühsam
zu bestimmen sind.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann im Prinzip für
die Diagnose einer Infektion durch irgendeine Art eines pathogenen
Organismus verwendet werden.
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Die
Pathogene umfassen somit Archaebakterien und Eubakterien. Die letzteren
enthalten als ihre Hauptgruppen Gleitbakterien (gliding bacteria),
Spirocheten, starre Bakterien (rigid bacteria) und Mykoplasma. Starre
Bakterien umfassen Actinomyceten und einfache einzellige Bakterien.
Die letztere Gruppe besteht aus obligatorischen Intrazellular-Parasiten
und frei lebenden Bakterien. Unter den frei lebenden Varianten gibt
es (1) gramm-positive Bakterien, in welcher Gruppe sich (a) Cocci,
(b) nicht-sporenbildende Stäbchen,
(c) sporenbildende Stäbchen,
die weiter in obligatorische Aeroben und obligatorische Anaeroben
unterteilt werden können,
befinden; und (2) gramm-negative Bakterien, unter denen sich (a)
Cocci, (b) nicht-enterische Stäbchen
mit Spiralformen und geraden Stäbchen
und (c) enterische Stäbchen
mit fakultativen Anaeroben, obligatorischen Aeroben und obligatorischen
Anaeroben befinden. Für
spezifische Bakterienarten siehe ferner Medical Microbiology (Brooks
et al., Hg., 19. Ausflage (1991), Prentice-Hall International, USA).
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Die
Pathogene umfassen auch Pilze, einschließlich pathogener Hefen und
Schimmel. Beispiele sind Apergillus, Candida, Absidia, Mucor, Rhizopus,
Cryptococcus, Hisoplasma, Blastomyces, Coccidiodes, Paracoccidiodes,
Sporotrichosis, Chromoblastomycosis, Macetoma, Microsporum, Trichophyton
und Epidermophyton.
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Andere
Pathogene, die diagnostiziert werden können, können unter den Protozoen und
Algen aufgefunden werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann natürlich
auch zur Bestimmung nicht-pathogener Bakterien verwendet werden.
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Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Bakterien besonders
interessant: Bakterien von Phylum II – Grünbakterien; Phylum III – Deinobakterien
(Thermus/Deinococcus); Phylum IV – Spirocheten; Phylum VI – gramm-negative
Anaeroben und Gleitbakterien (Bakteroiden/Flavobakterium); Phylum VIII – Chlamydia;
Phylum IX – gramm-positive
mit den drei Linien; Linie A ("Gramm-Negative"), Familie B (G+C-reiche
Bakterien), Familie C (G+C-arme Bakterien); Phylum X – Cyanobakterien;
Phylum XI – Proteobakterien
mit den fünf
Familien alpha, beta, gamma, delta und "E".
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Die
Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben Unterschiede im RNase
P RNA-Gen bestimmt, die ausreichen, um eine Artenbestimmung zu ermöglichen.
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In
einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Detektion
pathogener Organismen, einschließlich einer Unterscheidung
von Arten, umfassend die Verwendung der P3- und/oder P19-hypervariablen Region(en)
des RNase P RNA-Gens als diagnostisches Analysenziel.
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Der
Zweck des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann z.B. die Diagnose einer durch pathogene Bakterien verursachten
Infektion oder die epidemische Untersuchung der Verbreitung von
arzneimittelbeständigen Bakterien
sein.
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Vorzugsweise
wird die Region (werden die Regionen) amplifiziert, wie z.B. durch
PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
und sequenziert oder auf andere Weise zur Artenspezifizierung einem
Fingerprinting unterzogen, wie z.B. durch Heteroduplexanalyse, Größenbestimmung,
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), Schmelzpunktbestimmung
usw.
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In
einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Detektion
von Bakterien, einschließlich einer
Unterscheidung von Arten, umfassend die Amplifizierung von Nucleinsäuren hypervariabler
Region(en) des RNase P RNA-Gens aus den Pathogenen; Ausbilden eines
Heteroduplex mit einer verwandten Nucleinsäure; und die Analyse davon.
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Ein
Beispiel für
ein erfindungsgemäßes Verfahren,
das eine Heteroduplexanalyse einbezieht, umfasst eine Amplifizierungsreaktion,
eine Hybridisierungsstufe und eine nicht-denaturierende Gelelektrophoreseanalyse.
Das gesamte Verfahren kann in weniger als 24 Stunden durchgeführt werden.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung wird nun näher
in Bezug auf zwei nicht-beschränkende
Beispiele beschrieben.
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BEISPIEL 1: MYCOBAKTERIEN
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MATERIALIEN UND METHODEN
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Bakterienstämme. In
dieser Untersuchung verwendete Mycobakterien sind in der nachstehenden
Tabelle 1 aufgelistet. Klinische Stämme wurden bereits durch 16S
RNA-Gensequenzierung in den entsprechenden Instituten ihres Ursprungs
typisiert. Die RNase P RNA-Sequenzen von M. tuberculosis, M. bovis
BCG und M. leprae wurden aus der GenBank-Sequenzdatenbank abgefragt.
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PCR-Amplifizierung der RNase P RNA-Gene
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Auf
der Basis der publizierten Sequenzen von M. tuberculosis und M.
leprae (GenBank Accession Nr. Z70692 bzw. L78818) wurde ein Primerpaar
entworfen, das nahe der Enden des Gens hybridisierte. Der Forward-Primer
tbf (5' CGGATGAGTTGGCTGGGCGG
3', SEQ ID NO: 1)
und der Reverse-Primer tbr (5' CTTGGCCTGTAAGCCGGATT
3', SEQ ID NO: 2)
zeigen beide einen Mismatch zu der M. leprae-Sequenz. Unter Verwendung dieses Primerpaars
konnte das RNase P-Gen aller getesteten Mycobakterien amplifiziert
werden. Die meisten Umsetzungen wurden an unbehandelten Mycobakterien
an Kulturen durchgeführt,
ohne vorherige Isolierung und Reinigung von chromosomaler DNA. PCR
wurde in 50 μl- Reaktionen in einem
Rapidcycler Capillary PCR-Apparat (Idaho Teehnology, Idaho Falls,
USA) mit den folgenden Parametern durchgeführt: 94°C, 10'';
50°C 10''; 72°C
125''.
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Sequenzieren.
PCR-Produkte wurden über
1 %-Agarosegelen zur Entfernung der Primer gereinigt. Ca. 1/20 der
gereinigten DNA wurde für
eine automatische Sequenzierung mit den gleichen Primern, die in
der Amplifizierungsreaktion verwendet wurden, verwendet. Das Sequenzieren
wurde an einem Applied Biosystems Modell 310 Capillary Sequencer
durchgeführt.
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Heteroduplexanalyse.
Für die
Heteroduplexanalyse der RNase P P3-Schleifenregion wurde DNA mit den
Oligonucleotiden tbf und 280r (5' CTTGCTTGCCCTCCCTTTGCC
3', SEQ ID NO: 3)
amplifiziert (50 μl-Reaktionen),
was ein Produkt von ca. 250 bp ergab. Die Produkte wurden gelgereinigt
und ca. 1/10 der Produkte in jeder Analyse verwendet. DNA wurde
mit gleichen Mengen DNA von M. tuberculosis gemischt, auf 95°C 1 Minute
lang erhitzt und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Produkte
wurden auf 10% nicht-naturierenden Polyacrylamid-Gelen bei 15 mA
während
14 Stunden getrennt. Banden wurden durch Silberanfärben sichtbar
gemacht.
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Silberanfärben von
DNA-Gelen. Die Gele wurden in 10% Ethanol 5 Minuten lang fixiert
und in 1 % Salpetersäure
5 Minuten inkubiert. Das Anfärben
wurde mit einer 1 mg/ml-Lösung
von Silbernitrat während
30 Minuten durchgeführt.
Die Banden wurden in einer Natriumcarbonat/Formaldehyd-Lösung (15
g wasserfreies Natriumcarbonat und 300 μl 37%-Formaldehyd in 500 ml
Wasser) entwickelt, bis sie deutlich sichtbar waren. Die Reaktion
wurde mit 10% Essigsäure
gestoppt.
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ERGEBNISSE
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Die
Ergebnisse von Beispiel 1 werden nachstehend in Verbindung mit den
anliegenden Zeichnungen, 1–5, angegeben:
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1 Sequenzzuordnung
der RNase P RNA-Gene aus Mycobakterien. Die Bindestriche zeigen
Sequenzidentitäten
an; Sternchen markieren Basen, die in einer Sequenz fehlen. Die
Sequenz von M. tuberculosis wird als SEQ ID NO: 11 angegeben.
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2 Sekundärstruktur
von M. tuberculosis-RNase P RNA, SEQ ID NO: 12. Die unter den Mycobakteriellen
Arten abweichenden Regionen sind gekennzeichnet. Kleine variable
Regionen werden nicht dargestellt.
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3 Sequenzzuordnung
des RNase P RNA-Gens von M. gastri (identische Sequenz aus zwei
verschiedenen Stämmen)
und sechs Stämmen
von M. kansasii. Für
die M. gastri-Sequenz unikale Basen sind fett gekennzeichnet. Die
Sequenz von M. kansasii 12748 ist als SEQ ID NO: 13 angegeben.
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4A Heteroduplexanalyse
der ersten 280 bp aus RNase P RNA-Genregionen verschiedener Mycobakterien.
DNA aus verschieden Mycobakteriellen Arten wurde mit M. tuberculosis-DNA
hybridisiert, und die resultierenden Duplexe auf einem 10% Polyacrylamid-Gel
getrennt. Spur 1, Kontroll-DNA von M. tuberculosis; Spur 2 M. avium;
Spur 3 M. intracellulare; Spur 4 M. malmoense; Spur 5 M. celatum;
Spur 6 M. kansasii; Spur 7 M. vaccae; Spur 8 M. xenopii.
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4B Heteroduplexanalyse
von DNA, amplifiziert aus klinischen Proben von Bakterien, die als
entweder M. intracellulare oder M. avium angenommen wurden. Spur
1, Kontroll-DNA aus M. tuberculosis; Spuren 2, 3, 6 DNA aus vermutetem
M. avium; Spuren 4, 5, 7 DNA aus vermutetem M. intracellulare; Spur
8 Kontroll-DNA aus M. avium; Spur 9: Kontroll-DNA aus M. intracellulare.
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5 vorgeschlagene
Struktur für
die P18-Schleife von RNase P aus Mycobakterien, basierend auf Sequenzvariationen
innerhalb der Gattung. Die Sequenzen sind von A) M. tuberculosis;
SEQ ID NO: 18B; B) M. smegmatis; SEQ ID NO: 19; C) M. marinum; SEQ
ID NO: 20.
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Bei
den PCR-Amplifizierungen des RNase P RNA-Gens aus Mycobakterien
unter Verwendung der O1igonucleotide tbf und tbr ergab jede Reaktion
ein einziges Fragment im Bereich von 387 (M. celatum) bis 428 (M.
tuberculosis) bp, abhängig
von den Mycobakteriellen Arten.
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Unter
Verwendung dieser Oligonucleotide war es möglich, die RNase P RNA-Gene
aus allen getesteten Mycobakterien zu amplifizieren unter Verwendung
unbehandelter Zellen aus Plattenkulturen. Es war keine vorhergehende
Reinigung chromosomaler DNA notwendig.
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Eine
Zuordnung der Sequenzen (1) zeigt sehr gut konservierte
Nucleotidsequenzen entlang des meisten Teils des Gens, mit der Ausnahme
von drei großen
Regionen, wo die Ähnlichkeiten
zusammenbrechen und keine adäquate
Zuordnung möglich
ist. Die Gesamtähnlichkeit
der Gene betrug zwischen 80 und 85%. Dies ist jedoch keine sehr
informative Zahl, da die Ähnlichkeit
innerhalb der gut konservierten Regionen nahe 100% ist, während die
unterschiedlichen Regionen zu unterschiedlich sind, um überhaupt
zugeordnet zu werden.
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Wenn
die unterschiedlichen Regionen in einer zweidimensionalen Darstellung
des RNase P RNA-Moleküls lokalisiert
werden (2), ist es auffallend, dass
die meisten der Unterschiede in Regionen fallen, die zu den Enden
von Stamm-Schleifen-Strukturen gehören. Die Hauptsächlichen
unterschiedlichen Regionen sind die P3-, P16- und P19-Schleifen.
Zusätzlich
gibt es eine Deletion in der P12-Schleife in M. smegamatis und M.
fortuitum, die mehrere ungepaarte Nucleotide dieser Schleife umfassen.
Die Hauptunterschiede von Arten liegen innerhalb der P3- und P19-Schleifen.
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Alle
analysierten Arten wiesen spezifische RNase P RNA-Gensequenzen auf.
Mehrere eng verwandte Arten konnten auf der Basis der RNase P RNA-Sequenzen
unterschieden werden. Die Mitglieder des MAI-Komplexes M. avium
und M. intracellulare unterschieden sich in mehreren Positionen,
einschließlich
einer Deletion in der P19-Schleife in M. avium (2).
Die sehr nahe verwandten (Unterarten) M. paratuberculosis und M.
avium waren auf der Basis von RNase P RNA-Gensequenzen nicht unterscheidbar.
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Soweit
unsere Analyse innerhalb einer Art durchgeführt wurde, sind die Sequenzen
identisch. Wir sequenzierten klinische Proben aller Mitglieder des
M. tuberculosis-Komplexes (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis-BCG,
M. africanum, M. microti und M. tuberculosis ssp asiaticum), ohne
irgendwelche Abweichungen von der publizierten M. tuberculosis-Sequenz
(6) festzustellen. Mitglieder dieser Gruppe konnten deshalb auf
der Basis von Unterschieden im RNase P RNA-Gen nicht unterschieden
werden.
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Für einige
Arten wurde die Möglichkeit
von Sequenzunterschieden zwischen verschiedenen Serovars von Mycobakterien
untersucht. Im Falle von M. avium und M. intracellulare wurde das
RNase P RNA-Gen aus fünf
klinischen Isolaten (Tier) von M. avium und fünf M. intracellulare (Mensch)
amplifiziert und sequenziert. Es konnten keine Unterschiede zwischen
Serovaren festgestellt werden.
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Die
einzige Art, bei der hetrogene RNase P RNA-Gensequenzen zwischen
verschiedenen Serovaren beobachtet wurden, war M. kansasii (3).
Die Unterschiede waren hauptsächlich
C-zu-T-Transitionen. Zwei Stämme
von M. gastri wurden ebenfalls sequenziert, aber in dieser Art waren
die Gensequenzen zwischen Isolaten identisch. In vier Positionen
unterschieden sich alle RNase P RNA-Gensequenzen von M. kansasii-Stämmen von
solchen von M. gastri. Drei dieser Unterschiede waren C-zu-T-Transitionen,
während
der vierte eine C-zu-A-Transversion war.
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Die
in den P3- und P19-Schleifen aufgefundene Unterscheidung von Arten
wurde als groß genug
angesehen für
einen Versuch einer einfachen diagnostischen Anwendung durch Heteroduplexanalyse.
Die hypervariable P3-Region wurde für diese Analyse ausgewählt und
unter Verwendung der tbf- und 280r-Oligonucleotide amplifiziert. Jede PCR-Reaktion
ergab einzelne Banden von ca. 250 bp. Die Region von M. tuberculosis
wurde als Standard verwendet und wurde in gleichen Mengen mit den
Produkten aus verschiedenen Arten gemischt. Nach Trennen der Fragmente
auf nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelen wurden die Banden mit Silber angefärbt. Es
waren deutliche Unterschiede in den Heteroduplexmustern zwischen
allen getesteten Arten vorhanden (4A).
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Diese
Analyse wurde ferner auf klinische Proben (aus dem Swedish Institute
of Infectious Disease Control) angewendet, die vorher typisiert
wurden oder nicht. Das resultierende Gel (4B) der
Proben in den Spuren 2, 3 und 6 kann M. avium zugeschrieben werden
(vergleiche mit Spur 8), während
die Proben 4, 5 und 7 M. intracellulare zu sein scheinen (vergleiche
mit Spur 9). In jedem Fall bestätigte
das Sequenzieren des RNase P RNA-Gens die aus der Heteroduplexanalyse
erhaltenen Ergebnisse.
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DISKUSSION
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Verglichen
mit dem Fall von Clamydia sind die RNase P-Gene aus Mycobakterien
besser unter den Arten konserviert, mit Gesamtähnlichkeiten von 80 bis 85%.
Dieser Gesamtwert ist jedoch irreführend, da die meisten Unterschiede
in spezifischen Regionen zusammenfallen, wo die Variierbarkeit von
einem Grad ist, der eine unzweifelhafte Zuordnung unmöglich macht.
Alle Mycobakteriellen RNase P RNAs zeigen eine P15- bis P17-Region
des Clamydia und Cyanobakterien-Typs (13, 31), was bei der nahen
Verwandtschaft der Organismen kaum überraschend ist.
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Alle
untersuchten Arten wiesen ihre eigenen auffälligen Sequenz-Charakteristika
auf. Innerhalb einer Art wurden keine Unterschiede gesehen, ausgenommen
für M.
kansasii, einer Art, die aus anderen Gründen als heterogen beschrieben
wurde (1, 14, 32). Obwohl mehrere der Variantenpositionen zwischen
M. kansasii und M. gastri geteilt wurden, sind genügend M.
kansasii-spezifische Basen im Gen, um eine Unterscheidung von nahe
verwandtem M. gastri durch Mikrosequenzierung oder Heteroduplexanalyse
zu ermöglichen.
M. kansasii ist eine wesentliche Ursache von Lungenkrankheit aus
nicht-tuberkulösen
Mycobakterien.
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Die
Kombination sehr gut konservierter Regionen und hypervariabler Stellen
in der RNase P RNA-Gensequenz
ermöglicht
ein schnelles Typisieren unbekannter Mycobakterieller Proben. Oligonucleotide hybridisieren
mit perfekter oder nahezu perfekter Übereinstimmung mit konservierten
Regionen, was eine verlässliche
Amplifizierung der dazwischen liegenden variablen Teile ermöglicht.
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Der
M. avium-Komplex (MAI), der M. avium und M. intracellulare umfasst,
ist eine hauptsächliche
opportunistische Infektion bei AIDS-Patienten (21, 22). Eine Unterscheidung
zwischen den Mitgliedern dieses Komplexes erfordert molekulare Methoden,
und unsere Heteroduplexanalyse von PCR-Produkten aus dem RNase P
RNA-Gen ist eine rasche und ziemlich wenig teure Alternative zu
derzeitigen Methoden (7, 8, 10, 18, 19, 23, 27, 29).
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Sequenzvarianten
im RNase P RNA-Gen zwischen Arten können ebenfalls Hinweise auf
die molekulare Struktur der RNA sein. Im Fall der Mycobakterien
(2) waren fast alle Varianten in den Sequenzen
in ungepaarten Regionen oder in Strukturen, die für eine katalytische
Aktivität
in vitro unwesentlich erscheinen.
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In
zwei Arten, M. smegmatis und M. fortuitum, sind die Basen 160 bis
164, die dem Ende der P12-Schleife
entsprechen (2), in der RNase P RNA-Gensequenz
nicht vorhanden. Der P12-Schleife fehlt das Gen von einigen anderen
Organismen, wie z.B. Mycoplasma fermentans (4, 25), und scheint
deshalb nicht für
die Ribozym-Aktivität
erforderlich zu sein.
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Die
Zuordnung stützt
auch aus anderen Experimenten gezogene Schlussfolgerungen über die
RNase P-Struktur.
Angenommene wichtige Regionen, wie z.B. das Strukturprinzip bp 75
bis 85 und paarende nt 409 bis 417 (2), werden
in allen analysierten Mycobakteriellen Arten konserviert. Mit aller
Wahrscheinlichkeit sind diese zwei Regionen gepaart, da passende
Sequenzen und Organismen gut konserviert sind. Die variabelsten
Regionen unter Mycobakteriellen Arten waren die P3- bzw. P19-Schleifen.
Die P19-Struktur ist für
eine RNase P-Aktivität
in vitro nicht erforderlich (25), und es gibt eine beträchtliche
Variabilität
in der P3-Schleife unter den Organismen, aber ihre Rolle in vivo
ist unklar.
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Die
angenommene Struktur von M. tuberculosis-RNase P RNA könnte mit
Hilfe von Sequenzvariationen zwischen Arten noch verbessert werden.
Eine Struktur, von der angenommen wird, dass sie wichtig ist, ist die
P18-Stamm-Schleife (die Region nt 330 bis 351), die in Escherichia
coli- und Clamydia-RNase P RNAs einen gut konservierten Stamm aufweist.
Die angenommene Mycobakterielle Struktur weist eine wesentlich geringer überzeugende
Stamm-Struktur auf. (Siehe 2, die auf
der alten Strukturvorhersage basiert.) In M. smegmatis und M. marinum
sind jedoch Variationen von der Konsensus-Sequenz vorhanden (1).
Eine geringfügig
verschiedene Stamm-Schleifen-Struktur würde für diese Wechsel passen, während eine
sekundäre Konsensus-Struktur
intakt gehalten wird, und erlaubt gleichzeitig ein überzeugenderes
Basenpaar-Muster (5). Dies stärkt auch das Argument für die Bedeutung
dieser Stamm-Schleife
für die
RNase P-Funktion.
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BEISPIEL 2: CHLAMYDIA
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MATERIALIEN UND METHODEN
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Bakterienstämme. DNA
analysierter Organismen wurde durch eine Standard-Proteinase K-Behandlung
von in einer Zellkultur gewachsenen Organismen freigesetzt und Phenol-extrahiert
oder wurde als gereinigte DNA-Präparate
bereitgestellt (Tabelle 2).
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Tabelle
2. Stämme,
Ursprungswirt, Referenzen, Quellen und Accession-Nummern
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PCR-Amplifizierung
und DNA-Sequenzbestimmung. Das rnpB-Gen in Arten von Chlamydiaceae
wurde mit dem Primerpaar BH1-BH2, das auf der Basis der C. trachomatis-Sequenz
(13) gestaltet war, mittels PCR amplifiziert (Tabelle 3).
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Die
Reaktionsmischung enthielt 0,2 μM
jedes Primer, 200 μM
dNTP, 1,5 μM
MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl,
15% Glycerin und 2 E Taq-Polymerase. Die Amplifizierungsbedingungen
bestanden aus 7 Zyklen mit 45 s bei 94°C, 45 s bei 42°C, 1 Minute
bei 72°C,
gefolgt von 35 Zyklen, worin die Annealing-Temperatur auf 58°C erhöht wurde.
Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich alle im Text erwähnten PCR-Produkte
auf die Verwendung des Primerpaars BH1-BH2, das 82% des Gens voller
Länge amplifizierte.
Um die 5'-flankierende
Region aus Artenstämmen
der neun Chlamydiaceae-Arten auszubilden, verwendeten wir das Primerpaar
JB1-JB2, das aus der vollständigen
RNase P RNA-Gensequenz
von C. trachomatis (freundlicherweise von Dr. J. Brown zur Verfügung gestellt)
erhalten wurde. Die Amplifizierungsbedingungen waren die gleichen
wie für
das BH1-BH2-Primerpaar beschrieben, mit der Ausnahme, dass Glycerin
weggelassen wurde und Annealing-Temperaturen 53 bzw. 58°C betrugen.
Zur Amplifizierung von S. negevansis und P. acanthamoebae wurde
der BH1-Primer durch BM1 ersetzt, der hoch konservierte Nucleotide,
wie vorstehend beschrieben (13), umfasste, aber kein Sequenzieren
des 5'-Endes von
rnpB ermöglichte.
Die resultierenden PCR-Produkte wurden unter Verwendung einer Terminator-markierten
Zyklussequenzierungschemie sequenziert und die Sequenzreaktionen
wurden auf einem 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer) analysiert.
Die Sequenzen wurden EMBL überreicht
und alle in der Tabelle 2 aufgelisteten Accession-Nummern sind aus
der vorliegenden Untersuchung.
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Sequenzzuordnung
und phylogenetische Analyse. Die Sequenzzuordnung erforderte ein
sekundäres Struktur-Modellieren
jedes RNase P RNA-Moleküls,
das unter Verwendung von Vergleichssequenzanalysen manuell durchgeführt wurde.
Die vorhergesagten Strukturen wurden danach im Zuordnungsverfahren
als Hilfe zur Identifizierung von Schleifen- und Stamm-Regionen
verwendet. Die Zuordnung wurde zur Untersuchung der molekularen
Phylogenese verwendet. Die berechnete Distanzmatrix wurde für Mehrfach-Basenänderungen
an einzelnen Stellen durch das Ein-Parametermodell von Jukes & Cantor (1969)
(55) korrigiert. Diese Matrix wurde nachfolgend verwendet, um einen
phylogenetischen Baum zu berechnen, unter Verwendung des Neighbor-Joining-Programms
(77), bereitgestellt unter dem Namen NEIGHBOR im Phylogenetic Inference
Package, PHYLIP Version 3.51c (44). Unter Verwendung des DNAPARS-Programm
wurden maximal spärliche Bäume abgeleitet.
Das SEQBOOT-Programm wurde verwendet, um die Bäume auf der Basis von Neighbor-Joining
und eine maximale Spärlichkeit
durch 1000-maliges Wiederabfragen der Datensätze einzugeben. Die Konstruktion
des maximalen Wahrscheinlichkeitsbaumes wurde mit dem DNAML-Programm
unter Verwendung des F84-Modells der molekula ren Evolution unter
Anwendung empirischer Basenfrequenzen, globaler Umordnung und der
Durcheinander-Option (Jumble-Option) durchgeführt.
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Herstellung
von RNase P RNA und Substraten. Um die rnpB-katalytische Aktivität zu testen,
wurde C. trrachomatis rnpB voller Länge PCR-amplifiziert, hinter
einem T7-Promotor geklont und auf die tRNA-Vorläuferspaltung untersucht. Wir
konstruierten einen PCR-Primer, der zum 5'-Ende (5' TTTGAATTCGAAATTAATACGACTCACTATAGCGAACTAATCGGAAGAGTA; SEQ ID
NO: 9) passt. Unterstrichene Reste passen zu C. trachomatis rnpB,
während
der verbleibende Teil des Primers dem T7-Promotor entspricht. Wir
konstruierten einen Primer, der das 3'-Ende (5' TTTAAGCTTGGATGGTACCTTGGAAAAGCTCGGAAGAGCGAGTAA; SEQ ID NO: 9) komplementiert.
Unterstrichene Reste sind komplementär zu C. trachomatis rnpB und
die nicht markierten Reste wurden eingebaut, um das resultierende
Plasmid mit Fokl spalten zu können.
Das PCR-amplifizierte C. trachomatis rnpB wurde mit EcoRI und HindIII
geschnitten und in pUC 19 eingeführt,
das mit den gleichen Enzymen geschnitten wurde. Das rekombinante
Plasmid wurde im Escherichia coli-Stamm DH5a nach Standardprotokollen
transformiert.
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Die
E. coli-RNase P RNA, die C. trachomatis-RNase P RNA und Vorläufer tRNA TyrSu3 wurden unter Verwendung der T7-DNA-abhängigen RNA-Polymerase,
wie andernorts beschrieben (59 und die darin enthaltenen Referenzen)
gebildet.
-
RNase
P RNA-Assay. Die RNase P RNA-Aktivität wurde bei 37°C in unserem
Standardreaktionspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5% (Gew./Vol.)
PEG 6000, 100 mM NH4Cl (oder 1 M NH4Cl, wie angegeben) und 100 mM MgCL2) wie vorstehend beschrieben (59 und die
darin enthaltenen Referenzen) überwacht,
und die Endkonzentration an C. trachomatis-RNase P RNA betrug ≈ 2,4 pMol·ml–1 und
von Vorläufer
tRNA TyrSu3 ≈ 0,052 pMol·ml–1.
-
Nucleotidsequenz-Accession-Nummern.
Repräsentative
Nucleotidsequenzen von geprüften
Arten wurden an EMBL überreicht.
Die Accession-Nummern sind in Tabelle 2 aufgelistet.
-
ERGEBNISSE
-
Die
Ergebnisse aus Beispiel 2 werden nachstehend im Zusammenhang mit
den anliegenden Zeichnungen, 6 bis 8,
diskutiert:
-
6:
DNA-Sequenzvergleich von rnpB der 9 Chlamydiaceae-Arten, P. acanthamoebae
und S. negevensis. Die Punkte zeigen die Identität mit der C. trachomatis A/Har-13T-Sequenz (SEQ ID NO: 14) an und Bindestriche
zeigen Lücken
in der Zuordnung an. Die hypervariablen Regionen P3, P12, P17 und
P19 sind angezeigt. Die Nummerierung entspricht Brown (39).
-
7:
Abgeleitet sekundäre
Strukturen von RNase P RNA in C. psittaci (SEQ ID NO: 15), P. acanthamoebae
(SEQ ID NO: 17) und S. negevensis (SEQ ID NO: 16). Die Nucleotiden
in den Primer-Sequenzen
sind in Kleinbuchstaben, m bedeutet eine Adenin-Cytosin-Mischung
und r bedeutet eine A denin-Guanin-Mischung an dieser Position. N
bedeutet orientierende Nucleotide in den flankierenden Regionen
des Primers auf der Basis der minimalen Konsensus-bakteriellen RNase
P RNA (39).
-
8:
Neighbour-Joining-Baum auf der Basis von rnpB, der die Verwandtschaft
unter den Mitgliedern der Familie Chlamydiaceae zeigt. P. acanthamoebae,
Stamm Bn9 T und S.
negevensis, Stamm ZT wurden als Outgruppen
gewählt
wurden. Die Sparsamkeit und ML-Analysen ergaben eine identische
Verzweigungsordnung. Zwei Taxien verzweigten sich jedoch im ML-Baum
geringfügig
verschieden, und dieser Knoten ist mit einem Sternchen bezeichnet.
Eingegebene Werte an den Knoten wurden von 1000 Wiederabfragen des
Datensatzes unter Verwendungen von Neighbor-Joining und maximaler
Sparsamkeit erhalten. Der Skalenmaßstab zeigt 5 Substitutionen
pro 100 Nucleotide.
-
Vergleich von rnpB-Sequenzen
-
Aus
60 Chlamydial-Stämmen
wurden PCR-Produkte erhalten, die 82% des rnpB-Gens voller Länge enthielten.
Die Produkte von P. acanthamoebae-Stamm Bn9 T und Berg17 waren
313 Basen lang, und ihre Sequenzen waren identisch. Die Sequenz
des 299-bp-Produkts des ZT-Stamms von S.
negevensis war 68,9% ähnlich
zur P. acanthamoebae-Sequenz. Die Chlamydiaceae-PCR-Produkte waren
zwischen 63,8% und 69,3% ähnlich
zu den aus P. acanthamoebae und S. negevensis erhältlichen
Sequenzen. Die rnpB-Sequenzen von Chlamydia und Chlamydophila, die
die 2 Gattungen in den Chlamydiaceae sind, waren 75,9% bis 83,3% ähnlich.
Die zu Chlamydia gehörenden
18 Stämme
waren > 89,9% ähnlich;
die zu Chlamydophila gehörenden 38
Stämme
waren > 84,8% ähnlich.
Die 14 C. trachomatis-Sequenzen unterschieden sich nur durch eine
einzige Basensubstitution in LGV-Biovar im Vergleich zum Trachoma-Biovar.
Die 2 Chlamydia suis-Stämme
unterschieden sich nur durch zwei Nucleotid-Positionen. Die 6 Chlamydia
pecorum-Stämme
waren identisch oder unterschieden sich nur 1 oder 2 Basen. Sequenzen
waren identisch innerhalb der Arten für 10 Chlamydia psittaci-Stämme (ausgenommen
Stamm M56, siehe unten), 10 Chlamydia pneumoniae-TWAR-Biovar-Sequenzen,
9 Chlamydia abortus-Sequenzen, 3 Chlamydia felis-Sequenzen und 2
Chlamyida muridarum-Sequenzen.
-
Durch
PCR unter Verwendung der Primer JB1 und JB2 wurden aus einer Untergruppe
von 14 Stämmen,
die alle 9 Chlamydiaceae-Arten umfassten, Gensegmente mit nahezu
voller Länge
(98% des rnpB-Gens) gebildet. Der Vergleich dieser Sequenzen verringerte
die Ähnlichkeit
zwischen Arten (inter-species) um so viel wie 2,6%, weil sie die
variable P3-Region enthielten. Der Unterschied in rnpB war groß genug,
um klar Artengruppierungen in den Chlamydiaceae zu unterscheiden.
Zum Unterschied von ompA-Genprodukten,
die sich bis zu 50% unterscheiden, und ribosomalen RNA-Genen, die
um < 10% unterschiedlich
sind, erlaubt dieser Unterschied den Entwurf von Gattungs- und Gruppen-spezifischen
PCR-Sonden.
-
Die
Stämme
MoPnT (Maus) und SFPD (Hamster) der Art
C. muridarum ergab, dass sie sich in ihren MOMP-Gensequenzen (85)
unterschieden. Im Gegensatz dazu waren die rnpB-Gene in den zwei
C. muridarum-Stämmen
identisch, so wie dies auch in den ribosomalen 16S/23S-intergenen
Spacern und 23S-Domäne-1-Segmenten
gefunden wurde (42). Das einem Evolutionsdruck an der Oberfläche ausgesetzte
Protein war klar größer als
an den in den Translationsprozess verwickelten Genen.
-
Zweiundzwanzig
Stämme,
die bis vor kurzem als C. psittaci klassifiziert wurden, wurden
nun in C. psittaci, C. abortus, C. felis und C. caviae unterteilt.
Unsere Untersuchung trennte die Stämme in die 4 Artengruppen durch
rnpB-Gensequenz-Unterschiede von bis zu 6,7% (die Daten sind nicht
gezeigt). Diese Arten wurden aus Wirtsgruppen entfernten Ursprungs
isoliert, und sie verursachen ein breites Spektrum von Erkrankungen (Tabelle
2). Nur der C. psittaci-Stamm M56 stand in Konflikt mit seiner Klassifizierung
als C. psittaci, und PCR dieses Stammes ergab eine rnpB-Sequenz,
die zu den in dieser Untersuchung analysierten Katzensequenzen passte.
Die M56-Historie ergab einen gewissen Einblick, warum dies aufgetreten
sein konnte. M56 wurde 1961 aus einer Bisamratte in Kanada isoliert
(79), dann gelagert und vom USDA National Animal Disease Center
in Ames, Iowa, USA, an ATCC gegeben. In der Zellkultur wuchs das
ATCC-Präparat
von M56 als M56-Serotyp in einer Zelllinie und als Katzen-Serotyp
in einer anderen (Andersen, unveröffentlicht). Fukushi & Hirai (1989) (46)
berichteten über
einen aus ATCC erhaltenen Katzen-Serotyp von M56. PCR aus M56, kultiviert
bei NADC am 8/1/90 in den Dotterbeuteln embryonaler Eier, ergab
C. psittaci-vogelähnliche
ribosomale und Hauptaußenmembran-Protein-Gensequenzen
voller Länge
(42). In der derzeitigen Untersuchung verwendete M56-DNA war ein
Aliquot der 1997-Untersuchung (Tabelle 2). Im Hinblick auf diese
Historie legt unsere rnpB-Analyse nahe, dass M56-Kulturen während der
1960-iger Jahre mit Katzen-Chlamydiae verunreinigt war, und das
nicht verunreinigte Isolate nicht länger erhältlich sein dürften.
-
Sekundäre
Strukturen der RNase P RNA
-
Die
Zuordnung der aus den neun Chlamydiaceae-Arten abgeleiteten Sequenzen
des rnpB-Gens zeigte vier in getrennten Stammschleifen lokalisierte
hypervariable Regionen in den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen
mit P3, P12, P17 und P19 bezeichnet (7).
-
Die
P15-Schleife (siehe 7) ist von Interesse, da sie
in den meisten bakteriellen RNase P RNA-Molekülen eine GGU-Struktur beherbergt,
die mit tRNA-Vorläufern
durch Basenpaarung mit der 3'-terminalen RCCA-Struktur
der tRNA in Wechselwirkung tritt (60). Die Abwesenheit dieser Sequenzstruktur
aus allen Mitgliedern der Chlamydiales ist auffallend, und in allen
neun Chlamydiaceae-Arten (Positionen 291 bis 294 in C. psittaci, 7),
außer
in C. pneumoniae (GAAA) und C. felis (ACAA) ist eine ATAA-Ausbuchtung
zu sehen. Eine verschiedene Struktur in der P15-Region von Chlamydiaceae-Arten ist außerdem dadurch
erklärbar,
dass keines der identifizierten tRNA-Gene die 3'-terminale CCA-Sequenz kodieren (80).
-
Interessant
ist es, dass die P15-Region in P. acanthamoebae eine Purin-reiche
Ausbuchtung, die eine GGU-Struktur aufweist, enthält. Dies
könnte
darauf hinweisen, dass diese RNase P RNAs mit der 3'-terminalen RCCA-Sequenz wie E. coli-RNase
P RNA in Wechselwirkung tritt, unter der Voraussetzung, dass die
CCA-Sequenz in den tRNA-Genen in diesen Arten kodiert wird. Im Gegensatz
dazu ist die P15-Schleifenstruktur
von aus S. negevensis abgeleiteter RNase P RNA ähnlich zu der in den meisten
Cyanobakterien beobachteten (87) und beinhaltet in der P15-Schleife
so wie von Thermus thermophilus abgeleitete RNase P RNA- eine GGAU-Struktur
(53). Es wurde angenommen, dass diese Schleife der RNase P RNA in
T. thermophilus eine Bindungsstelle mit hoher Affinität für das 3'-Ende des tRNA-Vorläufers enthält (52),
und dass dies deshalb auch für
S. negevensis gelten könnte.
-
Die
RNase P RNA in Chlamydiaceae-Arten beherbergt eine P18-Helix, während bei
P. acanthamoebae und S. negevensis dieses Element fehlen dürfte. Es
wurde früher
gezeigt, dass die P18-Helix ohne Verlust der katalytischen Aktivität deletiert
werden kann, was darauf hinweist, dass sie nicht direkt in der Katalyse
verwickelt ist (49). Die P18-Helix ist, wenn vorhanden, mit einer
phylogenetisch konservierten GNRA-tetra-Schleife assoziiert, die
in ihrem vermuteten Rezeptor in P8 andockt (das G83C93-Basenpaar
in C. psittaci; 2 (38, 62)). Die bakteriellen
RNase P RNAs, denen die P18-Helix fehlt, weisen außerdem eine
ausgedehnte P8-Helix auf, und es wurde angenommen, dass dies den
Verlust von P18 kompensiert (38). Da weder C. acanthamoebae noch
S. negevensis ausgedehntes P8 oder ein scheinbares P18 mit einer
GNRA-tetra-Schleife aufweisen, bilden die Nucleotide in der P18-Region
vielleicht ein alternatives Strukturelement, das mit P8 in Wechselwirkung
tritt.
-
Zwischen
der GNRA-tetra-Schleife in der P14-Helix und dem P8-Stamm wurde
auch eine Wechselwirkung über
einen weiten Bereich vermutet (38, 62). Dies wird durch unsere derzeitigen
Daten in allen neun Arten von Chlamydiaceae (das U82A94-Basenpaar
und G201 in C. psittaci, 7) und durch die Gegenwart eines
A in der P14-Schleife und des GC-Basenpaars in P8 in P. acanthamoebae
und S. negevensis (2) gestützt. Unter der Voraussetzung
dieser Wechselwirkung ist es überraschend,
dass in den drei Serovars L1 bis L3 von C. trachomatis das G205-Nucleotid
(entsprechend G201 in C. psittaci in 7) durch
ein A substituiert ist, aber ohne einer entsprechenden Basenpaarverschiebung
in der P8-Helix.
-
In
der minimal übereinstimmenden
bakteriellen RNase P RNA weisen bestimmte Positionen 100% konservierte
Nucleotid-Basen auf (39). Unsere Daten zeigten, dass das gut konservierte
Cytosin in Position 60 in allen überprüften Arten
der Chlamydophila-Gattung (7) durch
ein Uracil ersetzt wurde, während
für die Chlamydia-Gattung
keine Veränderung
beobachtet wurde. Dies bildet, abhängig vom Rest in Position 376
(die Bezifferung bezeiht sich auf C. psittaci), entweder ein UG-Wobble-Basenpaar
oder ein UA-Basenpaar. Die Region der von diesen Arten abgeleiteten
RNase P RNA konnte mit den in der vorliegenden Untersuchung verwendeten
Primern nicht beobachtet werden.
-
Spaltung von tRNA-Vorläufern durch C. trachomatis-RNase
P RNA
-
Bakterielle
RNase P RNA ist in Abwesenheit der RNase P-Proteineinheit (33, und
die darin enthaltenen Referenzen) katalytisch aktiv. Um zu untersuchen,
ob Chlamydia-RNase P RNA allein dazu fähig ist, ihr Substrat zu spalten,
bildeten wird C. trachomatis-RNase P RNA und analysierten das Spaltungsmuster
unter Verwendung des E. coli-tRNA TyrSu3(pSu3)-Vorläufers als
Substrat. Diese RNase P RNA war tatsächlich dazu fähig, Psu3
an der erwarteten Position nur unter Verwendung von NH4Cl
bei hoher Konzentration zu spalten, wie unter Methoden beschrieben.
Dies steht im Einklang mit einer früheren Beobachtung der Spaltung
durch C. trachomatis-RNase P RNA (51). Zusammen mit den strukturellen
Beobachtungen zeigt dies, dass RNase P RNA keine P15-interne Schleife
(oder eine P15-Haarnadelschleife) für die katalytische Aktivität benötigt. Wir weisen
jedoch darauf hin, dass das Ausmaß der Spaltung durch C. trachomatis-RNase
P RNA im Vergleich zur Spaltung durch E. coli-RNase P RNA beträchtlich
verringert war.
-
Phylogenese der Familie Chlamydiaceae
-
Die
Sekundärstrukturen
der Helices P15, P16, P17, P18 und P19 waren für die Mitglieder von Chlamydiaceae
die am schwierigsten aufzulösenden
Regionen. Zwei dieser Regionen, nämlich P17 und P19, wurden deshalb
aus dem endgültigen
Datensatz, der für
die phylogenetischen Überlegungen
verwendet wurde, entfernt. Dies war in der hohen Nucleotid-Variabilität in der
P17-Szene begründet,
und die scheinbare Abwesenheit der Helix P19 im rnpB-Gen von P.
acanthamoebae (6 & 7). Auch
die zweifelhaft zugeordneten Positionen 94, 150, 151, 153, 286 und
298 (gemäß der Bezifferung
des rnpB-Gens von C. trachomatis in 6) wurden
vor der phylogenetischen Analyse entfernt. Aus der endgültigen Anordnung
wurden Lückenpositionen,
mit Ausnahme der Enden des 5'-Endes,
im allgemeinen nicht ausgelassen, da die Positionen 1 bis 68 für S. negevensis
und P. acanthamoebae nicht bestimmt wurden. Die korrigierte endgültige Zuordnung
umfasste deshalb 271 Positionen.
-
Zur
Berechnung der evolutionären
Stämme
zur Aufdeckung der phylogenetischen Verwandtschaft unter den Arten
der Familie Chlamydiaceae wurden verschiedene Algorithmen verwendet.
Unter Verwendung von Distanzmatrix und auf Buchstaben basierenden
Methoden wurden virtuell identische Baumtopologien erhalten. Ein
unter Verwendung von Neighbor-Joining (NJ) (Saitou & Nei, 1987) abgeleiteter
repräsentativer
phylogenetischer Baum ist in 3 dargestellt.
Die Stabilität
der Verzweigungsordnung wurde statistisch durch die Bestimmung von
Eingabe-Prozentwerten ermittelt. Diese durch NJ und maximale Sparsamkeit
erhaltenen Werte sind an den Knotenpunkten angegeben. Die durch
den maximalen Wahrscheinlichkeitsbaum (ML) gestützte Verzweigungsordnung wurde
auch jedem Verzweigungspunkt in 3 zugefügt. Zwei
Taxien verzweigten in durch ML konstruierten Dendrogramm etwas verschieden,
und der aktuelle Knotenpunkt, der diese Instabilität zeigt,
wurde mit einem Sternchen versehen. Unter alleiniger Verwendung
von rnpB-Daten aus den zu Chlamydophila und Chlamydia gehörenden Arten,
aber unter Ausdehnen des Datensatzes, um die Nucleotid-Information
des 5'-Endes zu
umfassen, wurden auch zu den in 3 dargestellten
identische Baumtopologien erhalten. Die Reihenfolge der Verzweigung
in diesem Teil des Baumes wurde deshalb nicht gelöst.
-
Der
Baum in 8 zeigt, dass die Gattungen
Chlamydophila und Chlamydia leicht von einander unterschieden werden
können
durch Vergleich der rnpB-Gensequenzen. Diese Erkenntnis stimmt mit
den kürzlich
veröffentlichten
Phylogenesen auf der Basis von 165- und 23S-ribosomalen RNA-Genen
voller Länge
und mit ihren intergenen Spacer-Regionen überein (42, 43, 73). Dies steht
jedoch in Konflikt mit dem aus dem 16S-rRNA-Gen durch Pettersson
et al. (1997) angegebenen Ergebnissen. Eine plausible Erklärung ist
es, dass die 16S-rRNA-Untersuchung auf der Basis von nur 4/5 der
Nucleotid-Information voller Länge
dieser Gene basiert, und dass einige der zum Vergleich verwendeten
Sequenzen ziemlich entfernt verwandt waren. Einige phylogenetische
Information wurde deshalb im endgültigen Datensatz verloren.
In einer nachfolgenden 16S-rRNA-Analyse unter Verwendung der fast
vollständigen
16S-rRNA-Gensequenzen
und nur eng verwandten als Outgruppen war eine begrenzte Wechselbeziehung
mit anderen Verzweigungsordnungen vorhanden. Es kann deshalb daraus
geschlossen werden, dass die 16S-rRNA-Gene
bei der Beschreibung der evolutionären Verwandtschaft der Mitglieder
der Chlamydiaceae-Familie
eine geringe Auflösung
ergeben.
-
Die
Analyse des rnpB-Gens zeigte, dass eine chlamydiale Phylogenese
nicht vollständig
auf Genen beruhen muss, für
die nur eine schwache Verzweigungsstütze vorhanden ist. Während 16S-rRNA-Analysen zahlreiche
lange Verzweigungen mit anliegenden Clustern zeigen, weist die rnpB-Analyse
gleichmäßig verteilte
Sequenzunterschiede auf, die chlamydiale Gruppen auf dem Niveau
Familie, Gattung und Art unterscheiden. Die Sequenzvielseitigkeit
des rnpB-Gens in den Arten der Ordnung Chlamydiales macht es möglich, dieses
Gen zur Unterscheidung von chlamydialen Arten zu verwenden. Darüber hinaus
ergibt diese Spezifität eine
funktionelle Isolierung jeder Gruppierung, die mit den artspezifischen ökologischen
Nischen, wie beschrieben, übereinstimmen
(70). Die Konservierung ist ebenfalls mit früher identifizierten Gruppierungen übereinstimmend.
Die in einer so grundlegenden Funktion, wie dem tRNA-Processing, aufgefundene
Spezifität
legt es nahe, dass Artengruppierungen in Chlamydiaceae sehr lange
Zeit evolutionär
isoliert waren. Die angegebenen phylogenetischen Analysen stützen die
Revision der Klassifizierung der Chlamydiaceae-Familie, wie früher beschrieben
(43).
-
Zusammenfassend
wurde die Sequenz des RNase P RNA-Gens (rnpB) für 60 Stämme bestimmt, die alle neun
Arten in der Chlamydiaceae-Familie und für die verwandten Chlamydiales-Arten,
Parachlamydia acanthamoebae und Simkania negevensis, repräsentieren.
Diese Sequenzen wurden verwendet, um auf evolutionäre Verwandtschaften
unter den Chlamydiaceae zu schließen. Die Analyse trennte Chlamydophila
und Chlamydia in zwei Familien, wobei Chlamydiophila drei getrennte
Cluster bildet: die Chlamydophila pneumoniae-Stämme, die Chlamydophila percorum-Stämme und
ein drittes Cluster, umfassend die Arten Chlamydophila psittaci,
Chlamydophila abortus, Chlamydophila caviae und Chlamydophila felis.
Die Chlamydia-Linie von Abkommen enthielt zwei Cluster, wobei die
Chlamydia suis-Stämme
von den Stämmen
von Chlamydia trachomatis und Chlamydia muridarum klar getrennt
sind. Diese Analyse zeigte, dass die rnpB-Sequenz und -Struktur
deutliche Marker für
Arten der Chlamydiaceae sind. Wir zeigten ebenfalls, dass die von
C. trachomatis abgeleitete RNase P RNA dazu fähig ist, einen tRNA-Vorläufer in
Abwesenheit eines Proteins zu spalten. Unsere Erkenntnisse werden
in Bezug auf die Struktur von Chlamydia RNase P RNA diskutiert.
-
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