CN1264430A - 用作敏感性试验和抗微生物治疗的佐剂的甜菜碱 - Google Patents

Abstract

本发明涉及方法和组合物,其用于使用甜菜碱样去污剂对含分枝菌酸结构的细菌进行敏感性试验,以及使用相同去污剂诱导这类细菌的敏感性。

Description

用作敏感性试验和抗微生物治疗的佐剂的甜菜碱

发明领域

本发明涉及用于确定含有分枝菌酸结构的细菌的敏感性特征的组合物和方法。本发明的组合物和方法尤其可作为佐剂用于敏感性试验和抗微生物治疗，最特别地是涉及β-内酰胺家族抗生素的试验和治疗。发明背景

治疗感染细菌的患者的当代方法包括筛选用于治疗的抗生素。最常规的治疗是根据医生的经验。过于简单地，医生只是选择一种据认为对与患者症状有关的最常见传染物有效的广谱抗生素。然而在某些情况下，合适治疗剂的选择基于敏感性试验。敏感性试验通过确定何种治疗剂具有成功治疗一种特定病原体的最高可能性、以及何种抗微生物剂最可能是无效的来指导开业医生。敏感性试验是一种重要的工具，尤其当患者被确定为具有分枝杆菌感染时，最特别地当患者患结核病(TB：由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)复合体细菌(MTB)引起)时，更是如此。当前的联邦政府建议包括对TB的所有新病例进行敏感性试验(Tenover，F.C.等人，临床微生物学杂志(Jour.Clin.Micro.)31：767-770(1993))。敏感性试验是一种无价的工具，实际上所有的医生时时依赖它来为患者选择合适的抗生素疗法。

治疗细菌感染的方法为特定化合物的活性谱所限制。例如，不是所有的细菌都对特定的抗微生物化合物敏感。不同种类的细菌可耐受不同种类抗生素的作用。一般而言，特定抗生素的活性谱就其作用的微生物的种类而言属于分立的组(例如，真菌对细菌，或者革兰氏阳性菌对革兰氏阴性菌)。

抗生素通过干扰多种细胞功能发挥其作用。例如，已知不同种类的抗生素干扰细胞壁合成、RNA/DNA合成、DNA复制或蛋白质合成的多个方面。由于多种原因细菌对不同的抗生素有抗性。Quintiliani，R.等人，在Murray，P.R.等人编的《临床微生物学手册》(Manual of ClinicalMicrobiology)，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1308-1326页中综述了几种这样的抗性机制并指出，抗生素必须首先进入细胞，只有这样才能在作用位点发挥其作用。抗性的基础可能是由于生物的通透性，或者作用位点的分子构型也许是不相容的或不复存在的。另外，细菌可修饰、破坏或消除药剂。

抗性可以是先天的或是获得的。获得抗性可通过遗传物质(例如转座因子)的获得或通过DNA复制的固有的不忠实性(例如点突变)。分枝杆菌似乎具有一种另外的抗性机制。Heifets，L.B.等人，在《分枝杆菌感染化学治疗中的药物敏感性》(Drug Susceptibility in theChemotherapy of Mycobaterial Infections)，Heifets，L.B.编，CRC出版社，Boston，MA(1991)，第13-57页将传染性MTB细胞的亚群分类为活跃生长的或处于休眠的不同阶段。休眠使这些亚群在患者治疗期间幸存。

敏感性的复杂模式使治疗分枝杆菌感染进一步复杂化。例如，尽管通常可用异烟肼(INH)和/或吡嗪酰胺(PZA)有效地治疗MTB感染，但MAC分离株一般耐受这些药物，而偶发分枝杆菌(M.fortuitum)和龟分枝杆菌(M.chelonae)分离株通常耐受所有的一线抗结核药。

结核病是当今世界上最流行的传染病，传染了世界人口的大约三分之一，约17亿人(Kochi，A.，结核(Tubercle)72：1-6(1991))。另外，相比其它任何单发的传染病，结核病在世界范围内使更多人丧生(每年大约3百万)(发病率与死亡率周报(Morbidity and Mortality WeeklyReport)42：961-964(1993))。大多数TB病例在发展中国家，然而，MTB的多药抗药性(MDR)菌株(MDR-TB)在全球已成为一个重要问题(世界卫生组织(文件WHO/TB/96.198)危险的组群，WHO 1996年结核病流行报告(WHO Report on the Tuberculosis Epidemic 1996)(1996))。除非采取措施阻止MDR-TB的增加，否则结核病成为发展中国家和工业化国家中最常见死因的历史重现将不可避免。

其它分枝杆菌如鸟分枝杆菌(M.avium)复合体(MAC)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)和偶发分枝杆菌复合体也是常见的病原体(参见：Wayne，L.G.，临床微生物学综述(Clin.Micro.Rev.)5：1-25(1992)或Falkinham，J.O.，临床微生物学综述9：177-215(199)关于不同分枝杆菌病原体的综述)。MAC在所有晚期AIDS患者的几乎半数中引起传播性疾病(Nightingale，S.D.等人，传染病杂志(Jour.Infect.Dis.)165：1082-1085(1992))。世界卫生组织估计，到2000年为止感染人免疫缺陷病毒(HIV)的人数将超过4千万(世界卫生组织(文件WHO/GPA/CNP/EVA/93.1)全球AIDS计划(1993))。副结核分枝杆菌(鸟分枝杆菌的一个亚种)在反刍动物中引起副结核病。据估计，副结核病使美国农产品加工业(例如，牛奶和牛肉)每年损失超过15亿美元，这是由于较低的生产力和繁殖力所致(Whitlock，R，第三届国际副结核病讨论会会刊，第514-522页(1991)；Whitlock，R.等人，第89届美国动物健康协会年会会刊，第484-490页(1985))。分枝杆菌病耗费了大量的社会费用。

迄今为止最常用并最佳表征的抗生素化合物种类是β-内酰胺。由于这些抗生素的深入性和广泛性，用这些药剂治疗分枝杆菌感染的能力将具有显著的优点。已有限成功地尝试了β-内酰胺在用来治疗分枝杆菌感染的治疗方案中的应用(Chambers，H.F.等人，抗微生物剂化学治疗(Antimicrob.Agents Chemo.)39：2620-2624(1995))。通过定位抗性机制扩大分枝杆菌的敏感性尤其对β-内酰胺的敏感性的能力在有效治疗分枝杆菌感染中具有重要的潜力。

在此所述的本发明概述了其中分枝杆菌敏感性可被表征的新方法和组合物。这些方法和组合物改变这些细菌的敏感性，以增强抗生素尤其是β-内酰胺抗生素的效力。这些方法和组合物将使其作为有效治疗的一部分用于确定和/或治疗这类感染。发明概述

在来源于已用Thornton WO 95/27076和美国专利5,658,749的方法处理的生物学标本的液体培养瓶中，为了试图控制不希望的污染细菌的生长，发明者在标准抗微生物制剂(即PANTA)中添加第三代头孢菌素，头孢噻甲羧肟(CAS^No.72558-82-8)。发明者惊奇并意外地发现，当按照Thornton WO 95/27076和美国专利5,658,749用C₁₈-羧丙基甜菜碱(CB-18)作为处理剂并与该抗微生物制剂组合使用时，液体培养敏感性显著并惊人地降低。为了设法保持Thornton WO 95/27076和美国专利5,658,749所提供的诊断敏感性的优点，发明者进行研究来表征并消除这种液体培养敏感性的降低。这些研究产生了一类方法和组合物，其中可使用Thornton W0 95/27076和美国专利5,658,749的甜菜碱样化合物改变分枝杆菌对抗生素尤其对β-内酰胺家族抗生素的敏感性。这些方法可用于表征及改变细菌、尤其是分枝杆菌、最特别地是结核分枝杆菌复合体细菌对抗微生物化合物的敏感性，并用作抗微生物治疗的佐剂。

本发明进一步包括一种用于敏感性试验的组合物，该组合物含有与一种或多种甜菜碱样去污剂混合的一种或多种抗生素。

本发明进一步包括一种用于确定微生物敏感性的试剂盒，该试剂盒含有紧邻或相邻的一种或多种甜菜碱样去污剂与一种或多种抗生素。附图简述

图1A和图1B概述了用来表征结核分枝杆菌分离株ATCC 27294和571/573-BAL在CB-18/12B/PANTA/caz培养***中的重要生长/处理参数的实验设计。

图2A-2H显示当使用图1A和图1B所示实验设计检测结核分枝杆菌分离株ATCC 27294时的生长曲线。菱形：PANTA；正方形：P/caz。图2A：ATCC 27294，L-J，在缓冲液中处理，转种于缓冲液中；图2B：ATCC 27294，L-J，在缓冲液中处理，转种于CB-18(17μg/ml CB-18终浓度)中；图2C：ATCC 27294，L-J，在CB-18(383μg/ml)中处理，转种于缓冲液中；图2D：ATCC 27294，L-J，在CB-18(383μg/ml)中处理，转种于CB-18(17μg/mlCB-18终浓度)中；图2E：ATCC 27294，7Hll-选择性，在缓冲液中处理，转种于缓冲液中；图2F：ATCC 27294，7H11-选择性，在缓冲液中处理，转种于CB-18(17μg/ml CB-18终浓度)中；图2G：ATCC 27294，7H11-选择性，在CB-18(383μg/ml)中处理，转种于缓冲液中；图2H：ATCC 27294，7H11-选择性，在CB-18(383μg/ml)中处理，转种于CB-18(17μg/ml CB-18终浓度)中。

图3A-3H显示当使用图1A和图1B所示实验设计检测结核分枝杆菌分离株571/573-BAL时的生长曲线。菱形：PANTA；正方形：P/caz。图3A：571/573-BAL，L-J，在缓冲液中处理，转种于缓冲液中；图3B：571/573-BAL，L-J，在缓冲液中处理，转种于CB-18(17μg/ml CB-18终浓度)中；图3C：571/573-BAL，L-J，在CB-18(383μg/m1)中处理，转种于缓冲液中；图3D：571/573-BAL，L-J，在CB-18(383μg/ml)中处理，转种于CB-18(17μg/ml CB-18终浓度)中；图3E：571/573-BAL，7H11-选择性，在缓冲液中处理，转种于缓冲液中；图3F：571/573-BAL，7H11-选择性，在缓冲液中处理，转种于CB-18(17μg/ml CB-18终浓度)中；图3G：571/573-BAL，7H11-选择性，在CB-18(383μg/m1)中处理，转种于缓冲液中；图3H：571/573-BAL，7H11-选择性，在CB-18(383μg/ml)中处理，转种于CB-18(17μg/ml CB-18终浓度)中。

图4概述了用来以低浓度接种体在卵磷脂中转种的实验设计。该设计用来检验卵磷脂中和CB-18效应的能力。该实验设计也检验不同接种体时的CB-18效应。

图5A-5F显示当使用图4所示实验设计检测结核分枝杆菌分离株571/573-BAL时的生长曲线。图5A和图5B检测5,000倍稀释的细菌原液(约165±54cfu)。图5C和图5D检测25,000倍稀释的细菌原液(约33±11cfu)，图5E和图5F检测100,000倍稀释的细菌原液(约8±3cfu)。菱形：R.F.中的缓冲液；正方形：P/caz中的缓冲液；三角形：R.F.中的卵磷脂；“x”：P/caz中的卵磷脂。图5A：转种于缓冲液或缓冲液/卵磷脂中；图5B：转种于CB-18(17μg/ml)或CB-18/卵磷脂(17μg/ml@)中；图5C：转种于缓冲液或缓冲液/卵磷脂中；图5D：转种于CB-18(17μg/ml)或CB-18/卵磷脂(17μg/ml@)中；图5E：转种于缓冲液或缓冲液/卵磷脂中；图5F：转种于CB-18(17μg/ml)或CB-18/卵磷脂(17μg/ml@)中。

图6概述了CB-18和TMA-18滴定实验的实验设计，其用来比较CB-18的作用与季铵盐溴化三甲基十八烷铵(TMA-18)的作用。

图7A-7C显示当使用图6所示实验设计检测结核分枝杆菌分离株ATCC27294时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：PANTA；三角形：P/caz。图7A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图7B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。图7C：7H11-选择，转种于TMA-18(3.4μg/ml终浓度)中。

图8A-8C显示当使用图6所示实验设计检测结核分枝杆菌分离株571/573-BAL时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：PANTA；三角形：P/caz。图8A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图8B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。图8C：7H11-选择，转种于TMA-18(3.4μg/ml终浓度)中。

图9概述了用于CB-18滴定的实验设计，其应用表7所列不同分枝杆菌种检验不同CB-18浓度时的CB-18效应。

图10A和图10B显示当使用图9所示CB-18滴定实验检测结核分枝杆菌分离株ATCC 27294时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：P-cax；三角形：3μg/ml CB-18；“x”：7μg/m1 CB-18；“*”：13μg/ml CB-18；圆形：27μg/ml CB-18；垂直影线：54μg/ml CB-18；水平虚线：109μg/ml CB-18。图10A，无P-cax时的滴定。图10B，在P-cax存在下进行的每种滴定。

图11A和图11B显示当使用图9所示CB-18滴定实验检测结核分枝杆菌分离株571/573-BAL时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：P-cax；三角形：3μg/ml CB-18；“x”：7μg/ml CB-18；“*”：13μg/ml CB-18；圆形：27μg/ml CB-18；垂直影线：54μg/ml CB-18；水平虚线：109μg/ml CB-18。图11A，无P-cax时的滴定。图11B，在P-cax存在下进行的每种滴定。

图12A和图12B显示当使用图9所示CB-18滴定实验检测鸟分枝杆菌分离株ATCC 25291时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：P-caz；三角形：7μg/ml CB-18；“x”：13μg/ml CB-18；“*”：27μg/ml CB-18。图12A，无P-caz时的滴定。图12B，在P-caz存在下进行的每种滴定。

图13A和图13B显示当使用图9所示CB-18滴定实验检测鸟分枝杆菌复合体分离株802-BAL时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：P-caz；三角形：7μg/ml CB-18；“x”：13μg/ml CB-18；“*”：27μg/ml CB-18。图13A，无P-caz时的滴定。图13B，在P-caz存在下进行的每种滴定。

图14A和图14B显示当使用图9所示CB-18滴定实验检测偶发分枝杆菌分离株ATCC 6841时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：P-cft；三角形：7μg/ml CB-18；“x”：13μg/ml CB-18；“*”：27μg/ml CB-18；圆形：54μg/ml CB-18；垂直影线：109μg/ml CB-18。图14A，无P-cft时的滴定。图14B，在P-cft存在下进行的每种滴定。

图15A和图15B显示当使用图9所示CB-18滴定实验检测偶发分枝杆菌复合体分离株495-JHH时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：P-cft；三角形：7μg/ml CB-18；“x”：13μg/ml CB-18；“*”：27μg/ml CB-18；圆形：54μg/ml CB-18；垂直影线：109μg/ml CB-18。图15A，无P-cft时的滴定。图15B，在P-cft存在下进行的每种滴定。

图16概述了MTB分离株对抗生素筛选实验设计，其用来检验应用不同抗生素对表8所列结核分枝杆菌分离株的CB-18作用。

图17A和图17B显示当使用图16所示抗生素筛选实验检测结核分枝杆菌分离株ATCC 27294时的生长曲线。正方形：PANTA；三角形：P-caz；“x”：P/cfp；“*”：P/cax；圆形：P/cft。图17A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图17B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。

图18A和图18B显示当使用图16所示抗生素筛选实验检测结核分枝杆菌分离株571-BAL时的生长曲线。正方形：PANTA；三角形：P-caz；“x”：P/cfp；“*”：P/cax；圆形：P/cft。图18A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图18B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。

图19A和图19B显示当使用图16所示抗生素筛选实验检测结核分枝杆菌分离株573-BAL时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：PANTA；三角形：P-caz；“x”：P/cfp；“*”：P/cax；圆形：P/cft。图19A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图19B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。

图20A和图20B显示当使用图16所示抗生素筛选实验检测结核分枝杆菌分离株535-BAL时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：PANTA；三角形：P-caz；“x”：P/cfp；“*”：P/cax；圆形：P/cft。图20A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图20B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。

图21A和图21B显示当使用图16所示抗生素筛选实验检测结核分枝杆菌分离株896-BAL时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：PANTA；三角形：P-caz；“x”：P/cfp；“*”：P/cax；圆形：P/cft。图21A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图21B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。

图22A和图22B显示当使用图16所示抗生素筛选实验检测结核分枝杆菌分离株040-TBR时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：PANTA；三角形：P-caz；“x”：P/cfp；“*”：P/cax；圆形：P/cft。图22A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图22B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。

图23A和图23B显示当使用图16所示抗生素筛选实验检测结核分枝杆菌分离株061-TBR时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：PANTA；三角形：P-caz；“x”：P/cfp；“*”：P/cax；圆形：P/cft。图23A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图23B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。

图24A和图24B显示当使用图16所示抗生素筛选实验检测结核分枝杆菌分离株512-JHH时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：PANTA；三角形：P-caz；“x”：P/cfp；“*”：P/cax；圆形：P/cft。图24A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图24B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。

图25A和图25B显示当使用图16所示抗生素筛选实验检测结核分枝杆菌分离株538-JHH时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：PANTA；三角形：P-caz；“x”：P/cfp；“*”：P/cax；圆形：P/cft。图25A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图25B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。

图26A和图26B显示当使用图16所示抗生素筛选实验检测结核分枝杆菌分离株52-96-BOL时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：PANTA；三角形：P-caz；“x”：P/cfp；“*”：P/cax；圆形：P/cft。图26A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图26B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。

图27A和图27B显示当使用图16所示抗生素筛选实验检测结核分枝杆菌分离株57-96-BOL时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：PANTA；三角形：P-caz；“x”：P/cfp；“*”：P/cax；圆形：P/cft。图27A：7H11-选择，转种于缓冲液中。图27B：7H11-选择，转种于CB-18(17μg/ml终浓度)中。

图28A和图28B显示当使用图16所示抗生素筛选实验的改进方案检测结核分枝杆菌分离株572/573-BAL时的生长曲线。在这些实验中，检测了另外的非-β-内酰胺抗生素。菱形：R.F.；正方形：P-caz；三角形：红霉素；“x”：头孢曲松。图28A：抗生素筛选，转种于R.F.中。图28B：抗生素筛选，转种于CB-18中。

图29A和图29B显示当使用图16所示抗生素筛选实验的改进方案检测结核分枝杆菌分离株061-TBR时的生长曲线。在这些实验中，检测了另外的非-β-内酰胺抗生素。菱形：R.F.；正方形：P-caz；三角形：多粘菌素B；“x”：竹桃霉素；“*”林可霉素；圆形：萘啶酮酸；垂直影线：青霉素G；水平虚线：头孢曲松。图29A：抗生素筛选，转种于R.F.中，图29B：抗生素筛选，转种于CB-18中。

图30A和图30B显示当使用图16所示抗生素筛选实验的改进方案检测结核分枝杆菌分离株57-96-BOL时的生长曲线。在这些实验中，检测了另外的非-β-内酰胺抗生素。菱形：R.F.；正方形：P-caz；三角形：萘啶酮酸；“x”：青霉素G；“*”：头孢噻甲羧肟；圆形：头孢曲松。图30A：抗生素筛选，转种于R.F.中，图30B：抗生素筛选，转种于CB-18中。

图31概述了去污剂筛选实验设计，其用来就类似于CB-18的引起诱发敏感性的能力，筛选表10所列出的几种甜菜碱样去污剂和其它去污剂。

图32A显示在图31所述实验中使用的所有对照的群集生长曲线，图32B显示所选的几种去污剂的群集生长曲线，以突出结果的多样性。图32A：去污剂对照：菱形，缓冲液/R.F.；正方形，缓冲液/PANTA；三角形，缓冲液/P-cax；图32B：所选的去污剂：菱形，吐温80；正方形，硬脂酸；三角形，detaine PB；“x”，SB-18；“＝”crosultaine E30；开环形，velvetex OLB；闭环形，C₁₈-羧乙基甜菜碱。

图33概述了CB-18对EDTA实验设计，其用来比较在此处的培养***中CB-18的作用与EDTA的作用。

图34A和图34B显示在图33的实验中检测结核分枝杆菌分离株ATCC27294时的生长曲线。图34A：转种于所示的R.F.、P/cax或17μg/ml CB-18中：菱形，R.F.中的缓冲液；正方形：P/cax中的缓冲液；三角形：R.F.中的CB-18；“x”P/cax中的CB-18。图34B：转种于所示的含85μg/ml MgCl₂的17μg/ml CB-18中或17μg/ml EDTA中：菱形，R.F.中的CB-18和MgCl₂；正方形：P/cax中的CB-18和MgCl₂；三角形：R-F.中的EDTA；“x”P/cax中的EDTA。

图35A和图35B显示在图33的实验中检测结核分枝杆菌分离株571-573-BAL时的生长曲线。图35A：转种于所示的R.F.、P/cax或17μg/mlCB-18中：菱形，R.F.中的缓冲液；正方形：P/cax中的缓冲液；三角形：R.F.中的CB-18；“x”P/cax中的CB-18。图35B：转种于所示的17μg/mlCB-18与85μg/ml MgCl₂或17μg/ml EDTA中：菱形，R.F.中的CB-18和MgCl₂；正方形：P/cax中的CB-18和MgCl₂；三角形：R.F.中的EDTA；“x”P/cax中的EDTA。

图36概述了分枝杆菌敏感性试验的实验设计，其用来将分枝杆菌敏感性试验的现行实践与本发明的甜菜碱敏感性试验相关联。

图37显示在图36的实验中检测结核分枝杆菌分离株ATCC 27294时的生长曲线。图37A显示用0.5 MacFarland标准作为接种体(检测为6.28±0.57×10⁵cfu)时的甜菜碱敏感性结果。图37B、37C、37D和37E分别显示用10×(62,800±5,700 cfu)、100×(6,280±570 cfu)、1,000×(628±57 cfu)和10,000×(63±6 cfu)稀释的MacFarland标准作为接种体时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：P-cax；三角形：15μg/ml CB-18；“x”：30μg/ml CB-18；“*”60μg/ml CB-18；圆形：含P/cax的15μg/mlCB-18；垂直影线：含P/cax的30μg/ml CB-18；水平虚线：含P/cax的60μg/ml CB-18。

图38显示在图36的实验中检测结核分枝杆菌分离株571/573-BAL时的生长曲线。图38A显示用0.5 MacFarland标准作为接种体(检测为1.11±0.18×10⁶cfu)时的甜菜碱敏感性结果。图38B、38C、38D和38E分别显示用10×(111,000±17,900 cfu)、100×(11,100+1,790 cfu)、1,000×(1,110±179 cfu)和10,000×(111±18 cfu)稀释的MacFarland标准作为接种体时的生长曲线。菱形：R.F.；正方形：P-cax；三角形：15μg/mlCB-18；“x”：30μg/ml CB-18；“*”60μg/ml CB-18；圆形：含P/cax的15μg/ml CB-18；垂直影线：含P/cax的30μg/ml CB-18；水平虚线：含P/cax的60μg/ml CB-18。

图39(A、B、C)。图39A显示如Yuan Y.等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)93：12828-12833(1996)所述用来修饰分枝菌酸的酶机制。图39B显示硫代二十四酸作为这些相同酶的酶抑制剂起作用的机制：形成的稳定过渡态类似物为锍羧基甜菜碱。图39C概述了这种锍羧基甜菜碱合成的一种可能的合成机制。优选实施方案详述

在以下的叙述中，广泛应用了在药学领域和体外敏感性试验中使用的许多术语。为了提供对本说明书和权利要求书包括这些术语所给定的范围的清晰和一致的理解，提供了下列定义。

“CB-18效应”意思是在甜菜碱样去污剂存在下某些细菌尤其是分枝杆菌对抗生素的敏感性的提高。显示该效应的方法是，在有效水平的一种或多种抗生素存在下、在有无一种或多种甜菜碱样去污剂尤其是CB-18的情况下，体外培养一种微生物，例如一种传染物或临床分离株或其能够生长的活提取物。甜菜碱样去污剂的存在提高了某些细菌特别是分枝杆菌对抗生素的敏感性。细菌生长可以用定性或定量的方式来描述。定性结果的一个实例是简单地指出生长或不生长。定量结果的一个实例是如本领域所知将培养天数与生长指数相比。生长指数的实例包括简单的分级符号(例如，“-、±、1+、2+、3+和4+”)和数字指示(例如0-999)，如BACTEC 12B培养***(Becton Dickinson，Cockeysville，MD，美国)所产生的。CB-18效应可以以生长的完全终止而显示，或者对自身的总的生长无影响来表示，也可以表示为如本领域所知在生长的指数期的抑制、延迟或生长曲线斜率的降低(即生长速率的下降)。CB-18效应的重要方面在于，在微生物如传染物或临床分离株的一种或多种生长特征中具有观察到的变化，这种变化在本发明的甜菜碱敏感性试验的过程中显示。实施例10例证了这一点，其中提供了与多种甜菜碱样去污剂组合的不同抗生素。观察到的变化与分离株对存在的抗生素的敏感性提高相一致。

“甜菜碱敏感性试验”意思是，为了建立微生物(例如传染物或临床分离株)或不同微生物的混合物的抗生素敏感性的一种模型，与一种或多种抗生素组合的一种或多种甜菜碱样去污剂在体外试验中的应用。在甜菜碱敏感性试验中，使含有微生物例如均一群的微生物或微生物的型/变体/分离株等混合物的标本与含有一种抗生素和一种甜菜碱样去污剂的组合物相接触，并根据标本中微生物的生存力测定标本中微生物对该抗生素的敏感性。甜菜碱敏感性试验是本发明方法的第一种实施方案。如本领域所知，该甜菜碱敏感性试验能在一种微量滴定格式、在培养瓶中或在含有固体培养基的平板中完成。标准液体培养基格式的实例包括BACTEC(Becton-Dickinson，Cockeysville，MD)、ESP Myco System II^TM(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)或MT/BacT^TM(Organon Teknika，Durham，NC)。标准固体培养基的实例包括本领域所知的Mueller-Hinton琼脂或其它相当的培养基。这些培养格式中必须添加如此处所述的适当组合、适当浓度的合适的抗生素和甜菜碱样去污剂。与任何敏感性试验一样，该试验的目的在于确定具有成功消除患者感染的最高可能性的抗生素。

如本领域所知，微生物如临床分离株或传染物是“敏感的”意思是，该微生物(例如分枝杆菌)被一种抗生素有害地影响，这样使这种临床分离株或传染物失能、非传染或不能存活(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1281-1307页(在此引入作为参考))。在此所用的“敏感的”与“敏感性”同义。当确定一种微生物如临床分离株或传染物对一种特定抗生素敏感时，称该抗生素对这种分离株或传染物有“活性”或对其是“活性的”。

如本领域所知，“敏感性试验”意思是一种体外试验，籍此确定一种微生物如临床分离株或传染物对一系列抗微生物化合物的敏感性(Jorgensen，J.H.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1277-1280页；Woods，G.L等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1327-1404页；国家实验室标准委员会，《对于需氧生长细菌的稀释抗微生物敏感性试验的方法》，第四版，许可的标准M7-A4 Villanova，PA(1997)；国家实验室标准委员会，《抗微生物平板敏感性试验的执行标准》，第六版，许可的标准M2-A6 Villanova，PA(1997)；国家实验室标准委员会，《体外敏感性试验标准与质量控制参数的发展》，许可的标准M23-A Villanova，PA(1994)；国家实验室标准委员会，《对于结核分枝杆菌的抗分枝杆菌敏感性试验》，试行标准M24-Tvillanova，PA(1995)(在此全部引入作为参考))。所有敏感性试验的目的都在于更精确地预测成功的治疗性介入。

如本领域所知，“抗生素”意思是对传染物的生存力、完整性、传染性或感应性具有不利作用的本领域已知的任何化合物(参见：Murray，P.R.等人编，《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)，第1281-1307页和第1385-1404页；Kucers，A.等人，《抗生素的应用》(The Use of Antibiotics)第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)；以及Lorian，V.编，《实验室医学抗生素》(Antibiotics inLaboratory Medicine)第二版，Williams & Wilkins，Baltimore，MD，在此全部引入作为参考)。不同种类抗生素的实例包括：β-内酰胺抗生素、β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷和氨基环醇、喹诺酮、四环素、大环内酯和林可酰胺(lincosamide)，以及糖肽、脂肽和多肽、磺胺和甲氧苄啶、氯霉素、异烟肼、硝基咪唑、利福平、硝基呋喃、乌洛托品和莫匹罗星，其全部都可与本发明的方法结合使用。在此使用时术语抗生素与“抗微生物剂”、“治疗剂”或“药物”同义。所有抗生素都是药物或治疗剂，但不是所有的药物或治疗剂都是抗生素。

“佐剂”意思是一种化学化合物，其本身可具有或者也许不具有抗微生物活性，但当与一种或多种抗生素组合时(即同时)，该化合物协同作用增强了这些抗生素的作用。佐剂可用来提高敏感性试验或抗微生物治疗。治疗佐剂的一个实例是β-内酰胺酶抑制剂(见下文)。在此所述的方法和组合物不是讲β-内酰胺酶抑制剂本身作为佐剂的应用，而是甜菜碱样去污剂作为佐剂的应用；然而，甜菜碱样去污剂可单独使用或与其它佐剂包括β-内酰胺酶抑制剂组合使用。

术语“甜菜碱样”与WO 95/27076和美国专利5,658,749中所用的“SB-18样”同义，在此两篇都引入作为参考。根据WO 95/27076和美国专利5,658,749的甜菜碱样去污剂具有分散分枝杆菌索(和块)和/或补偿分枝杆菌浮力的能力。成索的分枝杆菌如结核分枝杆菌复合体(MTB)生物的分散有利于检测，这是由于其提高了所测等分试样代表整个标本的可能性。能分散索的甜菜碱样去污剂具有超过16个碳原子的烷基链长度，含18-20个碳原子的烷基链是最优选的。甜菜碱样去污剂也具有利于分枝杆菌如不成块生长的鸟分枝杆菌复合体(MAC)收集的能力，这是由于其在某种程度上补偿了这些生物的天然浮力。这种补偿优选地通过一种包括去污剂向细菌细胞内移动的机制而发生。补偿浮力的甜菜碱样去污剂优选地具有超过12个碳原子的烷基链长度，最优选地是16-20个碳原子。因此，在此所用的“甜菜碱样”包括WO 95/27076的表2和表3和美国专利5,658,749中所述的结构，在此两篇都引入作为参考，其中包括，例如，如WO 95/27076和美国专利5,658,749所述具有SB-18样活性的CB样、SB样、HSB样、PB样、StB样、PhB样、SoB样、RevB样、AO样、cAB样和ImB样化合物。“甜菜碱样”去污剂包括表1所示结构的两性离子化合物。这些结构在本发明的方法中应该是最有用的。

          表1：最有用的甜菜碱样去污剂显示了最有用的甜菜碱的通用结构。R₁为疏水性烷基链，α为连接R₁与阳离子β的“键”。R₂和R₃当需要时修饰阳离子。R₄为连接该阳离子与阴离子γ的“桥”。

R1	C8-C22
		α	-CH2-，-O-
β	-N-、-P-，-S-
		R2	-H，-CH3，-C2H5，-C3H2
R3	-H，-CH3，-C2H5，-C3H7
		R4	-CH2-，-C2H4-，C3H6-，-C4H8-，-C5H10-，-C6H12-，-CH2-C6H4-，-CmH2m-；其中m≥1
γ	-SO3 ，-OSO3 ，-COO，-OPO3 ，-PO3 ，-PO2 -

“CB样”意为含羧酸盐(-COO^)部分作为阴离子的甜菜碱样去污剂(例如羧基甜菜碱样)。“SB样”意为含磺酸盐(-SO₃ ^)部分作为阴离子的甜菜碱样去污剂(例如磺基甜菜碱样)。“HSB样”意为含磺酸盐部分作为阴离子并且桥中含羟基(-OH)的甜菜碱样去污剂(例如羟磺基甜菜碱样)。“PB样”意为含磷酸盐(-OPO₃ ^)、膦酸盐(-PO₃ ^)或亚膦酸盐(-PO₂ ^)部分作为阴离子的甜菜碱样去污剂(例如磷酸甜菜碱样)。“StB样”意为含硫酸盐(-OSO₃ ^)部分作为阴离子的甜菜碱样去污剂(例如硫酸甜菜碱样)。“AO样”意为含氧化物基团(-O^)作为阴离子的甜菜碱样去污剂(例如氧化胺样)。“PhB样”意为含鏻(-P^-)部分作为阳离子的甜菜碱样去污剂(例如鏻甜菜碱样)。“SoB样”意为含锍(-S^-)部分作为阳离子的甜菜碱样去污剂(例如锍甜菜碱样)。“正烷基甜菜碱”意为含铵(-N^-)部分作为阳离子的甜菜碱样去污剂(例如正烷基甜菜碱样)。“ImB样”意为含咪唑啉部分作为阳离子的甜菜碱样去污剂(例如咪唑啉甜菜碱样)。“RevB样”意为其中烷基链与阴离子共价连接、与阳离子相对的甜菜碱样去污剂(例如反向甜菜碱样)。“cAB样”意为其中烷基链与桥共价连接、与阳离子或阴离子相对的甜菜碱样去污剂(例如c-烷基甜菜碱样)。

“CB-18”意为N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八铵，内盐。CB-18也被称为N，N-二甲基-N-(正十八烷基)-N-(3-羧丙基)铵内盐，或C₁₈-羧丙基甜菜碱。CB-18被分配为CAS^No.78195-27-4。

“SB-18”意为N-十八烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙基-磺酸盐(CAS^No.13177-41-8)。

“SB-16”意为N-十六烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙基-磺酸盐(CAS^No.2281-11-0)。

“SB-14”意为N-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙基-磺酸盐(CAS^No.14933-09-6)，“SB-12”意为N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙基-磺酸盐(CAS^No.14933-08-5)。

“临床分离株”意思是一种纯化的可引起传染的细菌菌株，这种临床分离株来源于感染了这种传染物的患者。一种或多种临床分离株可来源于相同的患者，或者相同的分离株可来源于不同患者，如医院暴发期间所见的(Pittet，D.等人，内科医学档案(Archives of InternalMedicine)155：1177-1184，(1995))。这些临床分离株一般通过标本处理与培养方法的组合来纯化。这样这些临床分离株是活的，因此可用于在体外试验(如敏感性试验)中就其对抗生素的敏感性进一步分析和检测。纯化这些临床分离株的方法包括本领域已知的方法和步骤，尤其是Kent，P.T.等人，“公共卫生分枝杆菌学：III级实验室指南”，美国卫生与人类服务部，疾病控制中心，Atlanta，GA(1985)第31-70页，和Nolte，F.S.等人，在：Murray，P.R.等人编的《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第400-437页，对于分枝杆菌的分离所述的方法，或是Clarridge，J.E.等人，在：Murray，P.R.等人编的《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第357-378页，和Beaman，B.L.等人，在：Murray，P.R.等人编的《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第379-399页，分别对于棒杆菌属(Corynebacterium)和诺卡氏菌属(Nocardia)的分离所概述的方法(在此全部引入作为参考)。

“传染物”意思是一种传染性微生物，尤其是本领域所知的一种传染性细菌。根据本发明的方法所特别关注的传染物包括那些含有分枝菌酸结构的传染物，例如，可引起疾病的分枝杆菌，最特别地是结核分枝杆菌复合体细菌(Isenberg，H.D.等人，于：Murray，P.R.等人编，《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.1995，第5-18页(在此引入作为参考))。患有由这种传染物引起的疾病的人类或动物患者被称为具有由这种传染物引起的“感染”，或是“感染有”这种传染物。引起疾病的传染物被称为是“致病的”。一般不致病且为患者正常菌群一部分的细菌被称为是腐生的。在某些情况下，例如当患者被免疫损害或免疫抑制时(例如，感染了HIV，或含AIDS复合体，或经受器官移植后)，这类腐生微生物也能引起传染。一名患者能感染有一种或多种传染物。

如本领域所知，“分枝菌酸结构”意思是在α位置被替换为适度长度的脂族链的β-羟酸(Goren，M.B.，细菌学综述(Bact.Rev.)36：33-64(1966)，在此引入作为参考)。含有棒杆菌分枝菌酸的生物的一个实例是白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)；含有诺卡菌分枝菌酸的生物的一个实例是星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)；含有分枝菌酸的生物的一个实例是结核分枝杆菌(参见Funke，G.等人，临床微生物学综述(Clin.Micro.Rev.)10：125-159(1997)对棒状杆菌的进一步讨论(在此引入作为参考))。这些分枝菌酸样分子在此统称为“分枝菌酸结构”。在例如Lederer，E.，脂类的化学及物理学(Chem.Phys.Lipids)1：294-315(1967)；Lederer，E.，纯粹及应用化学(Pure Appl.Chem.)25：135-165(1971)中也可发现代表性分枝菌酸结构的其它列表，包括某些不饱和的、环丙烷样、甲氧基化的和酮酸，两篇在此都引入作为参考。“分枝菌酸结构”是酸稳定性分子。

“抗微生物治疗”意思是通过任何合适的方法用有效水平的含抗生素的组合物在体内治疗人类或动物患者；例如，通过口服、注射、敷用或吸入这种抗生素。包含抗生素的本发明组合物的输送也包括但不限于：药物通过静脉内方式的引入、作为软膏的活性成分或通过吞服。抗微生物治疗的目的在于破坏传染物的生存力、完整性或感应性，使得被传染的患者或动物摆脱、消除或克服感染。抗微生物治疗是指，单独使用或组合使用-即同时或连续使用-一类或多类药物或一类特定抗生素中的一种或多种药物。在此使用时抗微生物治疗与  “抗生素治疗”或“治疗”同义。

“有效量”意思是足以达到所希望的目标的量。例如，当在抗微生物治疗过程中使用时，有效量是导致微生物感染好转的量。这种好转可能是对微生物的直接作用，或是一种间接作用，其使得与有效量的接触损害该微生物，这样提高该微生物对第二种药剂的敏感性。

如果将一种材料从纯化前与之相关的材料中基本上纯化到实行希望的方法或分析所需的程度，那么这种材料被称为“基本上不含污染物”。因此，这些污染物或者完全缺乏或者以低浓度存在，此低浓度使得污染物的存在(1)当将含有这种材料的制剂的对需要该制剂的患者施用时，不妨碍所希望的治疗效果，且(2)不会由于这种制剂的施用而伤害患者。

“施用”或对患者“施用”是指，通过医学领域中已知的、适于达到希望的目的的任何适当方法，将希望的物质引入希望的部位，如需要该物质的人或动物的部位，这些方法包括但不限于肠内、肠胃外(例如静脉内)和离子渗透施用。也可以以局部置于感染部位的绷带的形式施用，绷带是设计用来提供本发明的抗生素和甜菜碱样去污剂的有效释放的。

“同时施用”或对患者“同时施用”两种或多种药剂，如一种抗生素和一种甜菜碱样去污剂，是指以一种制剂的形式一起施用或以各个制剂的形式分开施用这些药剂。

“药学可接受的盐”意为包括由药学可接受的酸或碱形成的盐，例如但不限于：酸，如硫酸、盐酸、硝酸、磷酸等，或者碱，如碱或碱土金属的氢氧化物、氢氧化铵、烷基氢氧化铵等。

术语“药学可接受的载体”意为包括药学可接受的溶剂、载体、稀释剂等，它们被用作本发明的制剂的添加剂，以便为这些化合物的施用提供载体或佐剂。

术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意为包括将有效量的一种或多种希望的药剂对需要这些药剂的患者或对象施用，其目的包括一种疾病的预防、好转、防止或治愈，或者据认为对这些药剂敏感的微生物的根除。

使一种含微生物的标本“接触”本发明的组合物，是指将该微生物与该组合物混合，或者以另外的方式提供该微生物与该组合物之间的接触。

本发明者偶然发现，当至少一种甜菜碱样去污剂如C₁₈-羧丙基甜菜碱(CB-18)与抗微生物化合物组合时，可根据诱发的敏感性区分分枝杆菌的临床分离株。发明者认为，该现象可用于就其对这些抗微生物化合物的敏感性而表征这些临床分离株，也通常表征微生物和传染物。另外，发明者也认为该现象可用于在体内治疗中以协同的方式提高这些分枝杆菌对这些抗微生物化合物的敏感性。

因此，在最广泛的实施方案中，本发明涉及一种表征微生物对抗微生物化合物的敏感性的方法。在一种优选实施方案中，所试微生物是一种传染物或分离株。在一种更优选的实施方案中，表征并测定微生物对β-内酰胺抗生素的敏感性。在一种更优选的实施方案中，所试微生物从取自患者的标本中获得，该患者被怀疑感染有不希望的含分枝菌酸结构的细菌，或处于感染的危险中，或确定已被感染。本发明的敏感性试验在此被称为甜菜碱敏感性试验。该敏感性试验的结果就在此所述的CB-18效应方面表征研究中的标本中存在的微生物，如临床分离株或传染物。即，本发明的敏感性试验鉴定标本中存在的微生物是否对所试的抗生素敏感。优选地，通过本发明的敏感性试验，鉴定标本中存在的微生物所敏感的一种或多种抗生素或其与其它有效药剂如甜菜碱样去污剂的组合。然而，同样重要的是，通过本发明的敏感性试验，鉴定标本中存在的微生物所不敏感的一种或多种抗生素或其与其它药剂如甜菜碱样去污剂的组合。其结果使卫生专业人员能更有效地选择一种合适的抗微生物疗法来治疗患者，或者对于该微生物用其它方式消毒希望的采取标本的部位。

在第二种优选实施方案中，本发明涉及一种应用甜菜碱样去污剂作为佐剂在抗生素治疗中治疗患者的方法，这些患者被怀疑感染有不希望的细菌或具有感染的危险或确定已被感染。在一种优选实施方案中，这些不希望的细菌含有分枝菌酸结构。这种抗生素疗法可用于以本发明的一种或多种抗生素与一种或多种甜菜碱样去污剂的组合来治疗这种感染。抗生素与甜菜碱样去污剂的组合比单独的抗生素疗法更有效地治疗患者，这是由于相比在无甜菜碱样去污剂时应用抗生素，该组合能更快或更有效地破坏细菌的完整性，这样致使传染物失能、非传染或无法存活。

在第三种优选实施方案中，本发明涉及一种消毒或用其它方式防止不希望的微生物生长的方法，方法是对感染部位或怀疑含有该微生物的环境提供一种或多种抗生素与一种或多种甜菜碱的组合。

本发明的敏感性试验尤其可用于表征、估计和确定一种微生物特别是一种临床分离株和/或传染物对抗微生物剂的敏感性。这些微生物所致疾病可用有效量的一种或多种抗生素与甜菜碱样去污剂的组合来治疗，本发明的敏感性试验证明该组合为治疗该微生物所致感染的治疗过程中的有效成分。

在本发明的敏感性方法中，一组浓度的特定甜菜碱样去污剂的应用提供了关于该去污剂效能的有用信息，应用多于一种甜菜碱样去污剂的试验是优选的。能检测如希望的一样多的甜菜碱样去污剂或其组合。优选地至少检测五种，尽管任何数目例如10、15、20、25或30或更多种去污剂在不同的稀释度中也易于检测。敏感性试验提供关于该浓度甜菜碱样去污剂与所选抗生素组合的作用的其它信息。特定甜菜碱样去污剂的工作浓度或有效浓度取决于所用的去污剂。通常，有效浓度范围为从最有效结构的0.1μg/ml到最无效结构的1mg/ml，对于大多数甜菜碱样去污剂，1μg/ml-100μg/ml是最有效的浓度。在本发明的敏感性试验方法中，这些甜菜碱样去污剂可单独使用或与其它甜菜碱样去污剂组合使用。

尽管在本发明的方法中至少一种抗生素是提供敏感性信息所必需的，但预计在甜菜碱敏感性试验中将使用多于一种的抗生素。能检测如希望的一样多的抗生素或抗生素的组合。优选地至少检测五种，尽管任何数目例如10、15、20、25或30或更多种抗生素在不同的稀释度中也易于检测。特定抗生素的浓度取决于所用的抗生素。通常，有效浓度范围为从最有效抗微生物剂的0.1μg/ml到最无效化合物的100μg/ml，对于大多数抗生素，0.5μg/ml-64μg/ml是最有效的浓度。在本发明的方法中，这些抗生素可单独使用或与其它抗生素组合使用。

如同其它敏感性试验一样(Woods，G.L.等人，于：Murray，P.R.等人编，《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1327-1404页)，合理地预期，接种体的变化将影响甜菜碱敏感性试验所产生的结果。接种体通过标准方法制备，包括挑取菌落或类似于本领域所知的MacFarland标准。图5A-5F和实施例8所示的实验结果显示，几个细胞到几千个细胞的接种体的CB-18效应是可比的。通常，在此方面1个细胞到10⁵个细胞是有效的，100-10,000个细胞是最有效的，大约1,000个细胞是优选的。低于10个细胞时，抽样问题(例如抽样误差)可使试验的结果模糊不清，高于10⁵个细胞时，由于覆盖***而影响结果。1,000-10,000个细胞的接种体能使对照以适时的方式生长。然而，可使用用于观察CB-18效应的任何接种体，并且在此方面，本发明的甜菜碱敏感性试验类似于其它的体外敏感性试验。

在此所述的甜菜碱敏感性试验所提供的信息是分离株、甜菜碱样去污剂和抗生素动态相互作用的结果。甜菜碱敏感性试验组合这三种成分，并且使技术人员能确定并调节抗生素和甜菜碱样去污剂与接种体的适当浓度，用此方法引起CB-18效应，由此提供关于研究中的临床分离株的特性和/或敏感性的最有用信息。

实施例7显示，在本发明的敏感性和治疗方法中某些甜菜碱样去污剂可能比其它的更有用。例如，包含对键的修饰的结构在此处的敏感性试验中显示降低的活性，并因而在治疗试验中显示活性降低。另外，含有桥的修饰的甜菜碱样去污剂在此处的敏感性试验中也显示减弱的活性，并因而在治疗试验中显示活性降低。表1显示那些在本发明的方法中最有用的结构。

最有用的甜菜碱样去污剂是不含修饰的甜菜碱样去污剂，例如，其中R₁为简单的烷基，键(α)为简单的亚甲基，R₂和R₃为氢或甲基(取决于所用的阳离子)，R₄无组分。

甜菜碱样去污剂对含有分枝菌酸的细菌的毒性取决于阴离子(γ)、桥长度(R₄)和烷基链长度(R₁)。通常，在此方面必须考虑到甜菜碱的表面活性性质与作为佐剂的作用之间的平衡。例如，表面活性性质取决于阴离子的酸碱性质和烷基链长度。大多数离子型去污剂是磷酸甜菜碱(PO₄ ^)，而大多数非离子型去污剂是硫酸甜菜碱(SO₄ ^)。预计磷酸甜菜碱特别有毒，而硫酸甜菜碱有溶解性问题。因此，磺基甜菜碱和羧基甜菜碱是优选的，羧基甜菜碱是最优选的。根据通透性讨论(实施例9)，预计羧基甜菜碱具有最优选的阴离子，而CB-18具有铵阳离子，合理地预计锍甜菜碱具有最优选的阳离子。因此，优选的结构包括正烷基磺基甜菜碱，特别优选的结构是正烷基羧基甜菜碱，最优选的结构是烷基锍羧基甜菜碱。

甜菜碱的表面活性性质随渐增的链长度而改变。较长的烷基链具有较低的临界胶束浓度(CMC)，或者相反地，较短的烷基链需要较高的浓度来达到CMC。烷基链的长度能根据用途而改变。例如，由于较短的烷基链需要较高的浓度来达到CMC，那么当用于第二种实施方案时(即，抗微生物治疗中)，较短的链是优选的，特别是当通过静脉内途径输送时在本发明的治疗方法中使用。此外，可使用经吸入的治疗性输送，因为可用于这种输送的组合物较少被浓度与CMC间的关系所限制；同样，能使用较长的烷基链。在第一种实施方案中(即，在体外敏感性试验中)，可改变链长度的相关性，以鉴定能使可观察到的CB-18效应达到最大的去污剂。烷基链长度为8-22个碳原子的甜菜碱样去污剂是优选的，12-18个碳原子的烷基链长度是特别优选的，16-18个碳原子的烷基链长度是最优选的。

为保证盐溶的能力，最小的桥长度应当是丙烯。对微生物的毒性也随桥长度而变(Tsubone，K.等人，药物科学杂志(Jour.Pharm.Sci)80：441-444(1991))。例如，乙烯和丁烯都显示比丙烯更高的毒性。可能乙烯桥具有溶解性问题，这取决于所用的离子。因此，进一步的考虑需要使适当的烷基链长度与离子及桥结构匹配，以避免这些问题。例如，较长的烷基链需要较强极性的离子组合(SO₄ ^＜SO₃ ^＜CO₂ ^＜PO₄ ^)和利于盐溶的桥结构。-C_mH_2m-(其中m≥1)类型的桥结构是优选的，具有6≥m≥3的相同结构的桥是最优选的。根据Tsubone，K.等人，药物科学杂志80：441-444(1991)，用于修饰阳离子的组分也影响毒性(例如，毒性与R₂和R₃的长度负相关(见表1))。

桥的长度和阳离子组分可根据用途而变化。例如，由于较短的烷基链可用于第二种实施方案中(即抗微生物治疗中)，所以m≥2的桥结构是可接受的，因为溶解性与较短链相关性不高。另外，经吸入的输送要求甜菜碱样去污剂是可溶的，并且m≥3的桥结构是必需的。如上所述，通过改变阴离子可进一步改变甜菜碱的极性。此外，可改变桥长度与用于修饰阳离子的组分的相关性，以使在第一种实施方案中(即体外试验中)观察到的CB-18效应达到最大。

已检测了几种羧基甜菜碱，并显示了在本发明的方法中的CB-18效应。它们包括：C₁₆-羧甲基甜菜碱(CAS^No.693-33-4)、C₁₈-羧乙基甜菜碱(CAS^No.30612-73-8)、C_18∶1-羧甲基甜菜碱(CAS^No.871-37-4)和C₁₈-羧丙基甜菜碱(CAS^No.78195-27-4)。

利用亚甲基桥(“羧甲基甜菜碱”：R₄＝-CH₂-)或亚甲基键(α＝-CH₂-)并且只根据烷基链长度而变化的最有用的羧基甜菜碱的实例是：C₁₀(CAS^No.2644-45-3)、C₁₁(CAS^No.2956-38-9)、C₁₂(CAS^No.683-10-3)、C₁₃(CAS^No.23609-76-9)、C₁₄(CAS^No.2601-33-4)、C₁₅(CAS^No.23609-77-0)、C₁₆(CAS^No.693-33-4)和C₁₈(CAS^No.820-66-6)。存在一个C₁₂-羧甲基甜菜碱(CAS^No.6232-16-2)的实例，即N，N二乙基(R₃＝R₄＝-CH₂CH₃)；和一个其中烷基含有双键的实例：C_18∶1(CAS^No.871-37-4)。利用乙基桥(“羧乙基甜菜碱”：R₄＝-CH₂CH₂-)、亚甲基键(α＝-CH₂-)并且只根据烷基链长度而变化的最有用的羧基甜菜碱的实例包括：C₁₂(CAS^No.16527-85-8)、C₁₃(CAS^No.132621-79-5)、C₁₄(CAS^No.69725-38-3)、C₁₆(CAS^No.42416-43-3)和C₁₈(CAS^No.30612-73-8)。在适当条件下，R₂和R₃为氢原子的羧乙基甜菜碱的一个实例是CAS^No.1462-54-0(C₁₂-β丙氨酸)。利用丙基桥(“羧丙基甜菜碱”：R₄＝-CH₂CH₂CH₂-)、亚甲基键(α＝-CH₂-)并且只根据烷基链长度而变化的最有用的羧基甜菜碱的实例包括：C₁₁(CAS^No.150147-53-8)、C₁₂(CAS^No.15163-30-1)、C₁₄(CAS^No.146959-90-2)、C₁₅(CAS^No.146959-91-3)、C₁₆(CAS^No.71695-32-4)和C₁₈(CAS^No.78195-27-4)。利用丁基桥(“羧丁基甜菜碱”：R₄＝-CH₂CH₂CH₂CH₂-)、亚甲基键(α＝-CH₂-)的有用羧基甜菜碱的一个实例是：C₁₂(CAS^No.120139-51-7)。利用戊基桥(“羧戊基甜菜碱”：R₄＝-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-)、亚甲基键(α＝-CH₂-)的最有用的羧基甜菜碱的两个实例是：C₁₂(CAS^No.76392-97-7)和C₁₆(CAS^No.73565-98-7)。利用己基桥(“羧己基甜菜碱”：R₄＝-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-)、亚甲基键(α＝-CH₂-)的有用羧基甜菜碱的一个实例是：C₁₂(CAS^No.132621-80-8)。存在用苄基作为桥官能团(R₄＝-CH₂-C₆H₄-)的几种羧基甜菜碱的实例。有两种C₁₂实例，一种其中羧基官能团位于4位或对位(CAS^No.71695-31-3)，一种其中羧基官能团位于2位或邻位(CAS^No.71695-34-6)。有两种C₁₆实例，一种其中羧基官能团位于4位或对位(CAS^No.71695-33-5)，一种其中羧基官能团位于2位或邻位(CAS^No.71695-35-7)。因此，“羧基甜菜碱样”(“CB样”)不仅包括那些如WO 95/27076和美国专利5,658,749所述用羧基作为阴离子(γ＝-COO^)的结构，最特别地指表1所示的那些甜菜碱样结构，而且将包括如上文所述的R₁、α、R₂、R₃、β和R₄的所有可能的组合。

除羧基甜菜碱之外，可与本发明的方法结合使用的其它易于获得的甜菜碱包括磺基甜菜碱，例如高度纯化的(即研究级)“SB”系列去污剂，特别是SB-18(N-十八烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙基-磺酸盐(CAS^No.13177-41-8))、SB-16(N-十六烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙基-磺酸盐(CAS^No.2281-11-0))、SB-14(N-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙基-磺酸盐(CAS^No.14933-09-6))和SB-12(N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙基-磺酸盐(CAS^No.14933-08-5))。

大多数可商业获得的甜菜碱被用来生产去污剂、洗发剂、美容剂和其它盥洗用品。这些甜菜碱主要来源于天然油如椰子油、牛油、小麦胚芽、巴西棕榈油、蓖麻油、低芥酸菜子油、豆油和菜籽油。合理地预期，所有这些甜菜碱样去污剂都可与本发明的方法结合使用。

本发明尤其可用于表征和检测临床分离株，或治疗由传染性微生物尤其是亲脂性或包裹于蜡状荚膜中的微生物引起的疾病，该微生物的特征在于其外细胞壁(外膜)中含有分枝菌酸结构，例如，尤其是棒杆菌分枝菌酸、诺卡菌分枝菌酸和分枝菌酸。

本发明的方法涉及一种检测微生物如分枝杆菌对抗生素的敏感性的方法。在一种非常优选的实施方案中，该微生物是临床分离株。本发明的方法也涉及一种治疗方法，其中与抗生素组合使用甜菜碱样去污剂通过抗生素疗法治疗患者(人或动物)。在本发明方法的试验或治疗中最终使用的甜菜碱将取决于标本中存在的微生物，优选地细菌。

这些试验方法或治疗方案可用于任何希望的微生物，尤其是任何希望的细菌。在一种非常优选的实施方案中，该微生物是分枝杆菌属的群或复合体或其成员。例如，所试细菌可包括任何希望的分枝杆菌属的群或复合体或分枝杆菌属的种，最优选的是分枝杆菌复合体，如结核分枝杆菌(MTB)复合体、鸟分枝杆菌(MAC)复合体、MAIS复合体和偶发分枝杆菌复合体。所试细菌也可包括速生和缓生分枝杆菌，包括指出的和未指出的光色原、非光色原、暗产色菌株。根据本发明可表征或处理任何分枝杆菌，包括：田野分枝杆菌(M.agri)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、M.acetamidolyticum、非洲分枝杆菌(M.africanum)、爱知分枝杆菌(M.aichiense)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、金色分枝杆菌(M.aurum)、南非分枝杆菌(M.austroafricanum)、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌(M.boyis)、牛分枝杆菌(BCG)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、千田分枝杆菌(M.chitae)、楚布分枝杆菌(M.chubuense)、库氏分枝杆菌(M.cookii)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)、杜氏分枝杆菌(M.duvalii)、诡诈分枝杆菌(M.fallax)、产鼻疽分枝杆菌(M.farcinogenes)、微黄分枝杆菌(M.flavescens)、偶发分枝杆菌、加地斯分枝杆菌(M.gadium)、胃分枝杆菌(M.gastri)、浅黄分枝杆菌(M.gilyum)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌、科莫斯分枝杆菌(M.komossense)、麻风分枝杆菌、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)、海分枝杆菌(M.marinum)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、莫里奥卡分枝杆菌(M.moriokaense)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、奥布分枝杆菌(M.obuense)、副偶然分枝杆菌(M.parafortuitum)、副结核分枝杆菌、外来分枝杆菌(M.peregrinum)、草分枝杆菌(M.phlei)、猪分枝杆菌(M.porcinum)、多孔分枝杆菌(M.poriferae)、灰尘分枝杆菌(M.pulveris)、罗德岛分枝杆菌(M.rhodesiae)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、塞内加尔分枝杆菌(M.senegalense)、石氏分枝杆菌(M.shimoidei)、猿分枝杆菌(M.simiae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、泥炭藓分枝杆菌(M.sphagni)、斯氏分枝杆菌(M.szulgai)、土分枝杆菌(M.terrae)、抗热分枝杆菌(M.thermoresistible)、东海分枝杆菌(M.tokaiense)、次要分枝杆菌(M.triviale)、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、蟾分枝杆菌(M.xenopi)，及其血清变型。

结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌(BCG)和田鼠分枝杆菌为结核分枝杆菌复合体(MTB)的成员。土分枝杆菌、次要分枝杆菌和无色分枝杆菌是土分枝杆菌复合体的成员。鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌是鸟分枝杆菌复合体(MAC)的成员；鸟分枝杆菌至少有三种独特血清群，胞内分枝杆菌有超过25种的血清变型。MAIS群(鸟分枝杆菌-胞内分枝杆菌-瘰疬分枝杆菌)包括具有鸟分枝杆菌复合体和瘰疬分枝杆菌两者的生物化学性质、但不与鸟分枝杆菌复合体分枝杆菌同源核酸探针(例如，AccuProbe(Gen-Probe，San Diego，CA))杂交的分枝杆菌。

堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿分枝杆菌和亚洲分枝杆菌是光色原的实例。瘰疬分枝杆菌、斯氏分枝杆菌、蟾分枝杆菌、戈登分枝杆菌和微黄分枝杆菌是暗产色菌株的实例。鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、胃分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、土分枝杆菌和次要分枝杆菌都是非光色原的实例。

非洲分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌(BCG)、库氏分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鼠麻风分枝杆菌、海分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、无色分枝杆菌、副结核分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、石氏分枝杆菌、猿分枝杆菌、斯氏分枝杆菌、土分枝杆菌、次要分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌和蟾分枝杆菌都是缓生(需要超过7天)分枝杆菌种的实例。田野分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、M.acetamidolyticum、爱知分枝杆菌、金色分枝杆菌、南非分枝杆菌、龟分枝杆菌、千田分枝杆菌、楚布分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、杜氏分枝杆菌、诡诈分枝杆菌、产鼻疽分枝杆菌、微黄分枝杆菌、偶发分枝杆菌、加地斯分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、科莫斯分枝杆菌、莫里奥卡分枝杆菌、新金色分枝杆菌、外来分枝杆菌、奥布分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、草分枝杆菌、猪分枝杆菌、多孔分枝杆菌、灰尘分枝杆菌、罗德岛分枝杆菌、塞内加尔分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、泥炭藓分枝杆菌、抗热分枝杆菌、东海分枝杆菌和母牛分枝杆菌都是速生(需要少于7天)分枝杆菌种的实例。

存在多种分枝杆菌种并可根据本发明治疗的疾病和病症的实例特别包括：结核病(结核分枝杆菌复合体)、麻风病(麻风分枝杆菌(人麻风病)和鼠麻风分枝杆菌(啮齿动物麻风病))、由鸟分枝杆菌复合体细菌引起的鸟类疾病、AIDS患者和鸟分枝杆菌所致其它患者的机会感染和超感染(Nightingale，S.D.等人，传染病杂志165：1082-1085(1992))、以及由如下特殊分枝杆菌引起的任何感染，例如：牛分枝杆菌(在兽医学中特别重要)、偶发分枝杆菌(从动物和人的病灶分离的一种土壤细菌)、胞内分枝杆菌(尤其在感染AIDS病毒患者中所见的机会感染)、副结核分枝杆菌(在人类克罗恩氏病(节段性回肠炎)的诊断中特别重要)、堪萨斯分枝杆菌(是一种罕见但毁灭性的传染物，通常与肺部疾病有关)、海分枝杆菌(感染冷血动物和鱼；也从人肢端表层肉芽肿中分离到)、副结核分枝杆菌(牛副结核病的病原体；其生长非常缓慢，在确定其为阴性之前必须持续培养16周)和溃疡分枝杆菌(Buruli溃疡的病因)。Wayne，L.G.等人，临床微生物学综述5：1-25(1992)和Falkinham，O.等人，临床微生物学综述9：177-215(1996)中讨论了上述和其它多种疾病，两篇在此都引入作为参考。

甜菜碱样去污剂能作为佐剂单独使用(如果该去污剂具有抗微生物活性)或与抗生素组合使用。例如，在第一种优选实施方案中，甜菜碱样去污剂是敏感性试验表的一部分(如实施例10所述)，其中单独使用并与抗生素或其它甜菜碱样去污剂组合使用该去污剂，来表征临床分离株的敏感性。在第二种优选实施方案中，在抗微生物治疗过程中单独使用或与抗生素组合使用本发明的甜菜碱样去污剂。尽管可代替抗生素单独使用甜菜碱样去污剂，但更优选的是与抗生素组合使用。在任一实施方案中，甜菜碱样去污剂的使用可以是单独的或与其它佐剂组合的，既可以同时地也可以连续地。例如，甜菜碱样去污剂能与其它甜菜碱样去污剂或与其它佐剂如β-内酰胺酶抑制剂组合使用。

在第二种实施方案中，本发明的方法准备用有效量的本发明的组合物治疗需要这种治疗的人类或动物患者，该组合物包含单独的甜菜碱样去污剂或与甜菜碱样去污剂组合的抗生素。在此使用的抗微生物疗法也包括这种组合。甜菜碱样去污剂的输送可以通过能供给患者有效水平的任何途径，例如，口服或肌肉注射，或者尤其是通过静脉滴注，最特别地是吸入或敷用这些组合物。

相比甜菜碱样去污剂能以分开的方式和溶液提供抗生素，或者它们能一起提供。甜菜碱样去污剂或许不能很好地耐受口服或肌肉注射，而静脉滴注可能是一种可行的输送途径；然而，必须注意血液中甜菜碱的浓度。尽管加入甜菜碱至临界胶束浓度(CMC)以上是可行的，但如果由于血液成分的溶解而使全血水平升高到CMC以上则可导致并发症。合理地预期在感染部位的注射是可行的输送手段，然而，这只在很少情况中是可能的。优选地，通过最直接的途径输送或者如有可能直接向感染部位输送组合物或者至少甜菜碱样去污剂。在这点上，对于分枝杆菌感染，尤其是为呼吸道感染的结核病，吸入应该是最优选的输送方法。用于输送本发明的甜菜碱样去污剂的吸入装置的一个实例在设计上类似于当前用于舒喘宁-哮喘的一种β阻断剂-输送的装置(例如，Allen & Hanburys所售的舒喘灵^，Allen & Hanburys为Glaxo的一个公司，ResearchTriangle Park，NC)。优选地通过以软膏的形式直接向患处敷用甜菜碱样去污剂(含或不含抗生素)来治疗分枝杆菌感染如溃疡分枝杆菌所致感染(Buruli溃疡)。

治疗这些微生物感染的临床领域的普通技术人员能容易地确定对患者施用特定甜菜碱样去污剂的量和方案。通常，抗生素和甜菜碱样化合物的剂量依如下的考虑而变：所用抗生素和甜菜碱样化合物的类型；年龄；健康状况；所治疗的病症；如果有的话，同时治疗的种类、治疗的频率和希望的效果的性质；组织损伤的程度；性别；症状持续时间；以及如果有的话，禁忌征，和各个医生所调节的其它变量。能以一次或多次应用施用剂量以获得希望的结果。通常，有效浓度包括从对于最有效结构(例如羧乙基甜菜碱)的0.1μg/kg到最无效结构(例如表10所列的那些“无影响”的羧基甜菜碱)的1mg/kg，对于大多数甜菜碱样去污剂而言，1μg/kg-100μg/kg是最有效的浓度。当以软膏的形式使用本发明的甜菜碱样去污剂时，有效浓度为对于最有效结构的0.1μg/ml到最无效结构的1mg/ml，对于大多数甜菜碱样去污剂而言，1μg/ml-100μg/ml是最有效的浓度。在本发明的治疗方法中，可单独使用或与其它甜菜碱样去污剂组合使用这些去污剂。优选地，甜菜碱施用时间与施用抗生素的时间相同。

特定抗生素的浓度取决于所用的抗生素。可以用本发明的方法，以本领域已知的治疗剂量或以经本发明的敏感性试验鉴定为治疗上有效的浓度，提供抗生素。本发明的方法中可用的不同种类抗生素的实例包括：β-内酰胺抗生素、与β-内酰胺抗生素组合的β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷和氨基环醇、喹诺酮、四环素、大环内酯和林可酰胺，以及抗生素糖肽、脂肽和多肽、磺胺和甲氧苄啶、氯霉素、异烟肼、硝基咪唑、利福平、硝基呋喃、乌洛托品和莫匹罗星。

已知对分枝杆菌具有显著活性的抗生素包括但不限于：丁胺卡那霉素、阿奇霉素、与任一β-内酰胺酶抑制剂组合的任一β-内酰胺、卷曲霉素、头孢氰唑、头孢西丁、环丙沙星、克拉霉素、氯苯吩嗪、环丝氨酸、氨苯砜、红霉素、乙胺丁醇(EMB)、乙硫异烟胺、亚胺培南、异烟肼(INH)、卡那霉素、二甲胺四环素、氧氟沙星、对氨基水扬酸、丙硫异烟胺、吡嗪酰胺(PZA)、利福平(RMP)、利福布汀、司氟沙星、磺胺甲基异恶唑与甲氧苄啶、链霉素(SM)、四环素、thiacetazole和紫霉素(Inderlied，C.B.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1385-1404页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用)》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第1352-1437页)。全部都可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“β-内酰胺”意思为含有β-内酰胺环作为其结构组分的任何青霉素、头孢菌素、单菌霉素和碳青霉烯抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.1995第1281-1286页；Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第3-584页)。所有β-内酰胺都可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“青霉素”意思为含有6-氨基青霉烷酸化学核的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1281-1282页)。青霉素的实例包括但不限于：甲氧西林、萘夫西林、邻氯苯甲异恶唑青霉素、双氯西林、苯唑西林、氨苄青霉素、巴氨西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛西林和哌拉西林，尤其是阿洛西林。合理地预期，具有与上述任何青霉素化合物同源的化学结构的青霉素也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“头孢菌素”意思为含有7-氨基头孢菌酸化学核的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1282-1285页)。可用于本发明方法的头孢菌素的实例包括但不限于：头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢克洛、头孢孟多、头孢尼西、头孢苄胺四唑、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢氰唑、头孢替坦、头孢克肟、头孢氨噻、头孢泊肟和头孢唑肟，特别是头孢西丁、头孢哌酮和头孢噻甲羧肟，最特别地是头孢曲松。合理地预期，具有与上述任何头孢菌素化合物同源的化学结构的头孢菌素也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“单菌霉素”意思为含有β-内酰胺环作为化学核且含有不同侧链的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1285页)。可用于本发明方法的单菌霉素的实例包括但不限于氨曲南。合理地预期，具有与上述单菌霉素化合物同源的化学结构的单菌霉素也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“碳青霉烯”意为含有β-内酰胺环作为化学核且在6位含羧乙基侧链(反式构型)且在核中缺乏硫或氧原子的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1285-1286页)。可用于本发明方法的碳青霉烯的实例包括但不限于：亚胺培南、美罗培南、帕民培南和biapenem。合理地预期，具有与上述任何碳青霉烯化合物同源的化学结构的碳青霉烯也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“β-内酰胺酶抑制剂”意为含有修饰的β-内酰胺结构作为化学核的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1286-1287页)。已知这些在分离时具有有限抗菌活性的化合物与β-内酰胺协同作用。β-内酰胺酶抑制剂干扰降解β-内酰胺的酶(例如β-内酰胺酶)。例如，β-内酰胺酶降解β-内酰胺。这种情况下，微生物有效地避开β-内酰胺的作用，从而赋予传染物抗性。因此，β-内酰胺酶抑制剂可作为β-内酰胺治疗的佐剂与β-内酰胺抗生素组合使用。当也使用β-内酰胺时，可用于本发明方法的β-内酰胺酶抑制剂的实例包括但不限于：棒酸、舒巴坦和他佐巴坦。合理地预期，具有与上述任何β-内酰胺酶抑制剂化合物同源的化学结构的β-内酰胺酶抑制剂也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“氨基糖苷”或“氨基环醇”意为含有通过糖苷键与氨基环醇核连接的氨基糖的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1287-1288页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第585-750页)。可用于本发明方法的氨基糖苷和氨基环醇的实例包括但不限于：链霉素、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、紫苏霉素、奈替米星、新霉素、新霉素B和巴龙霉素。合理地预期，具有与上述任何氨基糖苷和氨基环醇化合物同源的化学结构的氨基糖苷和氨基环醇也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“喹诺酮”或“氟喹诺酮”意为含有具有不同侧链的1，5-二氮杂萘核的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1288-1290页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第1203-1275页)。可用于本发明方法的喹诺酮的实例包括但不限于：奥索利酸、西诺沙星、氟甲喹、米洛沙星、罗索沙星、吡哌酸、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、替马氟沙星、氟罗沙星、培氟沙星、氨氟沙星、司氟沙星、左氧氟沙星、克林沙星，特别是萘啶酮酸。合理地预期，具有与上述任何喹诺酮或氟喹诺酮化合物同源的化学结构的喹诺酮或氟喹诺酮也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“四环素”意为含有氢并四苯结构作为核的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1290-1291页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第979-1044页)。可用于本发明方法的四环素的实例包括但不限于：四环素、氯四环素、土霉素、二甲基氯四环素、脱甲四环素、甲烯土霉素、赖氨甲四环素、羟甲金霉素、强力霉素和二甲胺四环素。合理地预期，具有与上述任何四环素化合物同源的化学结构的四环素也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“大环内酯”意为含有一个具有两个附加糖、红霉脱氧糖胺和红霉支糖大环内酯环与及多种替代的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1291-1292页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第851-892页)。可用于本发明方法的大环内酯的实例包括但不限于：红霉素、竹桃霉素、螺旋霉素、交沙霉素、蔷薇霉素、克拉霉素、阿奇霉素(也称为azalide)、地红霉素、罗红霉素、氟红霉素和罗他霉素。合理地预期，具有与上述任何大环内酯化合物同源的化学结构的大环内酯也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“林可酰胺”意为含有一种与氨基糖连接的氨基酸的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1292-1293页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第819-850页)。可用于本发明方法的林可酰胺的实例包括但不限于林可霉素和克林霉素。合理地预期，具有与上述任何林可酰胺化合物同源的化学结构的林可酰胺也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“糖肽”或“脂肽”意为含有肽与糖类或脂类成分之一或两者的组合的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1293页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphi a，PA(1987)第1045-1072页)。可用于本发明方法的糖肽和脂肽的实例包括但不限于：万古霉素、游壁菌素、潜霉素(也称作YL146032)和雷冒拉宁(也称作MDL 62198)。合理地预期，具有与上述任何糖肽和脂肽化合物同源的化学结构的糖肽和脂肽也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“多肽抗生素”意为含有环多肽结构或肽连接的氨基酸的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1295-1296页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第899-913页)。可用于本发明方法的多肽抗生素的实例包括但不限于：多粘菌素A、B、C、D和E，以及杆菌肽和短杆菌肽。合理地预期，具有与上述任何多肽抗生素化合物同源的化学结构的多肽抗生素也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“磺胺”意为含有类似于对氨基苯甲酸的核心结构的抗生素，如本领域所知，“甲氧苄啶”意为是嘧啶类似物的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1293-1295页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第1075-1117页)。可用于本发明方法的磺胺的实例包括但不限于：对氨基苯磺酰胺、乙酰磺胺、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲异嘧啶、柳氮磺胺吡啶、高磺胺、磺胺甲异恶唑、磺胺甲氧嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二乙三嗪、周效磺胺、磺胺甲吡嗪、磺胺胍、琥珀酰磺胺噻唑和酞磺胺噻唑。在本发明的方法中甲氧苄啶可单独使用或与任何磺胺组合使用。合理地预期，具有与上述任何磺胺化合物同源的化学结构的磺胺和甲氧苄啶类似物也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“硝基咪唑”意为含有一个硝基咪唑核的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1297页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第1290-1343页)。可用于本发明方法的硝基咪唑的实例包括但不限于：甲硝基羟乙唑、磺甲硝咪唑、硝唑吗啉、氯甲硝咪唑、卡咪唑和另丁硝唑。合理地预期，具有与上述任何硝基咪唑化合物同源的化学结构的硝基咪唑也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“氯霉素”意为含有一个硝基苯环作为结构核心的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1296-1297页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第757-807页)。可用于本发明方法的氯霉素的实例包括但不限于氯霉素和甲砜氯霉素。合理地预期，具有与上述任何氯霉素化合物同源的化学结构的氯霉素也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“利福平”意为含有一个柄型或大环结构核心的抗生素(安沙霉素抗生素)(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1298页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第914-970页)。可用于本发明方法的利福平的实例包括但不限于：利福平、利福霉素SV、利福霉素B(利福酰胺)和利福布汀。合理地预期，具有与上述任何利福平化合物同源的化学结构的利福平也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“硝基呋喃”意为具有一个含硝基的杂环的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1298-1299页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第1276-1289页)。可用于本发明方法的硝基呋喃的实例包括但不限于：硝呋恶酮、硝基糖腙、呋喃唑酮和硝基呋喃托英。合理地预期，具有与上述任何硝基呋喃化合物同源的化学结构的硝基呋喃也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“乌洛托品”意为含有叔胺的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1299页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第1344-1348页)。可用于本发明方法的叔胺的实例包括但不限于：乌洛托品、扁桃酸酯、马尿酸乌洛托品。合理地预期，具有与上述任何乌洛托品化合物同源的化学结构的叔胺也可用于本发明的方法中。

如本领域所知，“莫匹罗星”(也称为假单胞菌酸)意为含有独特的9-羟基-壬酸部分的抗生素(Yao，J.D.C.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1299-1300页；和Kucers，A.等人，《抗生素的应用》第四版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia，PA(1987)第754-756页)。合理地预期，具有与上述莫匹罗星化合物同源的化学结构的化合物也可用于本发明的方法中。

对感染有结核分枝杆菌复合体细菌(MTB)的患者的治疗一般包括一种药物或多种药物的组合。用于治疗TB的优选的首选药物(“一线”药物)包括异烟肼(INH)、利福平(RMP)、吡嗪酰胺(PZA)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)；次级(或“二线”)药物包括环丙沙星、氧氟沙星、乙硫异烟胺和环丝氨酸。研究中的其它药物包括丁胺卡那霉素、利福布汀、利福喷汀和司氟沙星(Inderlied，C.B.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1385-1404页)。对含分枝菌酸结构的细菌有活性的任何药物都可用于本发明的方法中。

对感染有鸟分枝杆菌复合体(MAC)细菌的患者的抗微生物治疗一般也包括一种药物或有限数量的药物的组合。治疗MAC感染的一线药物包括阿奇霉素、克拉霉素和EMB。二线药物包括丁胺卡那霉素、氯苯吩嗪、环丙沙星和利福布汀。备用药物包括环丝氨酸和SM(Inderlied，C.B.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1385-1404页)。全部都可用于本发明的方法中。

其它重要的分枝杆菌病原体，例如堪萨斯分枝杆菌，其治疗一般使用如上所述用于治疗TB或MAC感染的一种药物或多种药物的组合。速生菌(例如偶发分枝杆菌和龟分枝杆菌)感染的治疗可以用丁胺卡那霉素或克拉霉素，以及某些β-内酰胺，尤其是头孢菌素(Inderlied，C.B.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1385-1404页)。全部都可用于本发明的方法中。

本发明的方法尤其是治疗方法中所使用的甜菜碱样去污剂和/或抗生素，其施用可以以任何合适的药理学或药学可接受的形式，需要时可包括药学可接受的盐或载体。能以实现预防、缓解、防止或治愈人与动物的微生物感染状况的任何形式施用它们。可用于本发明治疗方法的抗生素的剂量是生产商推荐的剂量。例如在《医生书桌参考》(Physician’sDesk Reference)(PDR)，Medical Economics Company，Montvale，NewJersey，美国中可查到这些剂量。关于兽医应用的剂量可见例如，《Merck兽医手册》(Merck Veterinary Manual)，Merck&Co.，Inc.，Rahway，NewJersey，美国。

当以单个制剂的形式将抗生素和甜菜碱样去污剂施用给需要它们的患者时，优选地对患者提供每种药剂，以使药剂同时以有效水平存在于该患者中。也就是，无论怎样对患者单独地提供这些药剂，优选地使该患者感染部位的微生物与有效水平的抗生素和甜菜碱样去污剂两者同时接触。因此，例如，能通过抗生素与甜菜碱样去污剂的同时施用来治疗患者，例如，通过抗生素的口服施用与甜菜碱样去污剂的吸入或静脉内施用。通过同时施用治疗患者也可如下发生：在相同制剂中，例如，在提供抗生素和甜菜碱样去污剂两者的软膏或绷带中，同时提供甜菜碱样去污剂和抗生素。

此外，对患者的治疗方法也可以是，用抗生素或甜菜碱样去污剂在二者中不仅含一种的情况下“预处理”患者，然后用抗生素和甜菜碱样去污剂两者或用预处理中不含的“另一种”-抗生素或甜菜碱样去污剂-来“治疗”患者，只要预处理对微生物的作用在治疗时尚未消失即可。因此，例如，能用甜菜碱样去污剂预处理患者，以在施用含或不合甜菜碱样去污剂的抗生素之前损害微生物的通透性和/或生存力。此外，也能在施用含或不含抗生素的甜菜碱样去污剂之前用抗生素预处理患者。

在混合物中，抗生素和甜菜碱样去污剂可各自在溶液中或各自为固体形式(尤其是悬液)。另外，一种或多种抗生素和/或一种或多种甜菜碱样去污剂可在溶液中，而相同制剂中的其它任何抗生素或去污剂可为固体形式。

肠胃外施用的本发明组合物的有用制剂包括无菌水溶剂或非水溶剂、悬液和乳剂。有用的非水溶剂的实例包括：丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射的有机酯。水载体的实例包括：水、水-乙醇溶液、乳剂或悬液，包括盐水和缓冲医用肠胃外载体，包括氯化钠溶液、林格葡萄糖溶液、葡萄糖+氯化钠溶液、含乳糖的林格溶液或非挥发油。静脉内载体的实例包括液体和养分补充剂、电解质补充剂，如基于林格葡萄糖的补充剂等。

根据已知的技术，需要时使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂，可配制注射用制剂，如油质溶液、悬液或乳剂。当活性化合物为水溶性形式如水溶性盐形式时，无菌注射制剂可使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，例如无菌无热原水或1，3-丁二醇。在其它可接受的载体和可使用的溶剂中，为5％葡萄糖注射液、林格注射液和等渗氯化钠注射液(如USP/NF所述)。当活性化合物为非水溶性形式时，可使用无菌的合适的油质悬液，其含有适当的亲脂性溶剂或载体，如脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。此外，也可使用注射水悬液，其含有提高粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖，并且任选地也含有稳定剂。

口服使用的药物制剂可以如下获得：使活性化合物与固体赋形剂结合，任选地将得到的混合物制成颗粒，并在希望或必要时加入适当的辅助剂，之后加工该混合物或颗粒，以产生糖衣核心的片剂。

合适的赋形剂包括，尤其是填充剂如糖，例如乳糖或蔗糖、甘露醇或山梨糖醇、纤维素制剂和/或磷酸钙，例如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及粘合剂，如淀粉、浆糊，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉或马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，和/或希望时的***剂，如上述淀粉，以及羧甲基淀粉、交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或褐藻酸或其盐如褐藻酸钠。辅助剂首先是流动调节剂和润滑剂，例如，硅石、滑石粉、硬脂酸或其盐如硬脂酸镁或硬脂酸钙，希望时其具有合适的包被层，能耐受胃液，就此而言尤其是浓缩的糖溶液，其任选地含有***胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、紫胶漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了产生耐受胃液的包被层，使用合适的纤维素制剂如乙酰基邻苯二甲酸酯纤维素或羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯的溶液。例如，为了辨别或者为了表征活性化合物剂量的不同组合，可向片剂或糖衣包被中加入染料或色素。

能口服使用的其它药物制剂是由明胶制成的推入契合胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推入契合胶囊可含有颗粒形式的活性化合物，例如，与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁以及任选地稳定剂相混合。在软胶囊中，活性化合物优选地溶解或悬浮于合适的液体如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中，添加稳定剂也是可能的。

用于直肠施用本发明的化合物的栓剂可如下制备，混合药物与合适的栓剂基质如无刺激性的赋形剂，例如，可可脂、天然或合成的甘油三酯、链烷烃、聚乙二醇或高级链烷醇，尤其是常温下为固体而体温下为液体因此能在直肠内熔化并释放药物的基质。另外，使用由活性化合物与基质的组合所构成的明胶直肠胶囊也是可能的；可能的基质材料是，例如，液体甘油三酯、聚乙二醇或链烷烃。

口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、锭剂、糖锭、粉剂和颗粒。在这些固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖或淀粉混合。当正常施用时，这些剂型也可包含药学辅助物质，例如硬脂酸盐润滑剂。也可用调节活性成分释放的肠溶性或其它包被制备固体口服制剂。

口服施用的液体剂型包括药学可接受的乳剂、溶液、悬液、糖浆和酏剂，其含有本领域中通常使用的惰性无毒稀释剂，如水和乙醇。这些组合物也可包含佐剂，如湿润剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。

也可借助于泵或以缓释形式施用本发明的组合物。也可通过适当***的导管，或通过使这些分子成为用来靶向特定器官的嵌合分子(或复合物)的一部分，向特定器官高浓度地输送本发明的化合物。

当需要长时间的重复注射以使患者的舒适达到最大时，以缓释形式的施用对患者是更方便的。

如果材料的生物活性不被消化过程所破坏并且化合物的特性使其通过肠组织时能被吸收，那么能以用于口服施用的剂型如片剂、胶囊、粉剂、软膏、药包或液体溶液使用在本发明的组合物和方法中使用的甜菜碱样去污剂或抗生素。

能以已知的方法生产本发明的药物组合物，例如，借助于常规的混合、颗粒化、糖衣形成、溶解、冷冻干燥或类似的方法。

也可通过以试剂盒的形式提供该方法中使用的试剂来方便地施行本发明的方法，尤其是敏感性试验。这种试剂盒优选地含有合适的缓冲液、盐、甜菜碱样去污剂或其组合、抗生素或其组合，以及如希望时适当纯度的水。在一种优选实施方案中，提供不同甜菜碱样去污剂的集合和不同抗生素的集合。集合中的甜菜碱样去污剂和/或抗生素可以不只适合一种特定微生物或是特别适合一种特定微生物。优选地至少提供5种不同的甜菜碱样去污剂，尽管在优选实施方案中，也提供多于5种的选择，例如10、15、20、25或30种，或其间的任何数量。优选地至少提供5种不同的抗生素，尽管在优选实施方案中，也提供多于5种的选择，例如10、15、20、25或30种，或其间的任何数量。如果希望，特殊的试剂盒尤其可含有特定的微生物，特别是分枝杆菌，以优选地用作标准。在这样的试剂盒中，如果非细菌成分未混合在一起，那么即使被限制于分开的容器或包装中，这些成分也通常互相非常接近，并且与该试剂盒提供的任何微生物标本非常接近。CB-18预试验

本发明源自围绕Thornton WO 95/27076和美国专利5,658,749所述发明的应用(实施例1所述的方法)的观察。在实施例2中，使用该处理方法的研究结果显示，将CB-18与用头孢噻甲羧肟(caz)强化的抗微生物添加剂PANTA组合显著影响液体培养敏感度(表6)。表6显示，液体和固体培养基的NALC/NaOH培养敏感度分别为98.4％和75.4％，而对于用CB-18处理的同组标本，液体和固体培养基的敏感度分别为64.0％和83.1％。换句话说，尽管CB-18使总培养物敏感度提高46％(表3)，但CB-18液体培养物敏感度降低。更重要的是如下发现：对于NALC/NaOH沉淀，涂片阳性与涂片阴性标本的液体培养敏感度的差异仅为4％(即，100％对95.8％)，而对于CB-18的相同比较显示65％的差异(即，75.0％对45.4％)。由于对于两种不同方法，涂片阳性与阴性标本的固体培养基敏感度间的差异是可比的(对于NALC/NaOH和CB-18分别为34％对39％)，所以最初认为用caz对PANTA的强化是液体培养敏感度降低的唯一原因。然而，实施例3(图3A-3H)揭示，不仅CB-18具有影响所试分离株(571/573-BAL：见表8)生长特征的能力，而且单独的和与caz组合的PANTA也都具有影响该分离株生长特征的能力。当与抗生素组合加入CB-18时，该效应，即所谓的CB-18效应，是协同的和分级的效应。

PANTA含有多粘菌素B、两性霉素B、萘啶酮酸、甲氧苄啶和阿洛西林。两性霉素B用来控制真菌污染，而其余抗生素全都具有抗细菌活性。多粘菌素B是一种与磷脂相互作用而改变通透性的多肽。萘啶酮酸是干扰DNA合成(在DNA促旋酶水平)的一种喹诺酮。甲氧苄啶是一种嘧啶类似物，一般与磺胺一起使用，也已知其干扰DNA合成(在二氢叶酸还原酶水平)。阿洛西林是一种青霉素，代表β-内酰胺抗生素，在细胞壁合成水平上发挥其作用。据报导萘啶酮酸、甲氧苄啶和阿洛西林都具有对分枝杆菌不同种的一定活性。CB-18与不含caz的PANTA组合能影响生长的事实(实施例3、图3F和图3H)显示，该现象不只取决于头孢噻甲羧肟的存在，而相反广泛适用于不同种类的抗生素(见上文)。图28-30突出了不同种类抗生素的应用的广泛性。合理地预期，该现象将延伸到不同种类的抗生素。

最初将头孢噻甲羧肟掺入CB-18/12B/PANTA检测***中以控制污染(实施例1)，而不是牺牲分枝杆菌的生存力。在检测不同头孢菌素对分枝杆菌生存力的影响的实验之后进行这种检测。所试PANTA-头孢菌素组合，除了头孢噻甲羧肟之外，还包括不同组合的头孢哌酮(cfp)、头孢氨噻(cft)和头孢曲松(cax)(例如，cfp/cft、cfp/cax和cfp/cft/cax)。

实施这些实验要使用大约7-15μg/ml的CB-18和结核分枝杆菌(ATCC27294)、鸟分枝杆菌(ATCC 25291)、堪萨斯分枝杆菌(ATCC 12478)、偶发分枝杆菌(ATCC 6841)、蟾分枝杆菌(ATCC 19250)和戈登分枝杆菌(ATCC 14470)的不同ATCC型菌株。CB-18/12B/PANTA/caz组合是在初步研究中对这些分离株显示最小影响的唯一制剂。例如，PANTA与cfp/cft、cfp/cax和cfp/cft/cax的组合在大多数所试分离株中都引起明显延迟。PANTA/caz引起所试鸟分枝杆菌分离株的延迟，和所试戈登分枝杆菌分离株的明显延迟。

在CB-18预试验中，CB-18/12B/PANTA/caz***漏掉了14个涂片阳性标本(表6)。对这些涂片阳性分离株的分析显示，5个是MTB，其它9个是不同的MOTT种，包括4个MAC、2个偶发分枝杆菌、1个戈登分枝杆菌、斯氏分枝杆菌和1个堪萨斯分枝杆菌。由这些数据得出的重要结论是，CB-18/12B/PANTA/caz***影响了大范围的分枝杆菌，MTB和MOTT两者皆是。

在无头孢噻甲羧肟时CB-18效应是可观察到的(实施例3)，也就是说，其它抗生素(例如，头孢菌素、PANTA的其它成分和其它的抗生素)能引起不同分枝杆菌生长的延迟，***对CB-18浓度的表观敏感度导致实施例5和实施例6的实验。实施例5的实验就CB-18浓度的改变检测了结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌复合体和偶发分枝杆菌复合体分离株，而实施例6集中于结核分枝杆菌分离株的敏感性模式。表7总结了实施例5的实验结果，图10-15显示应用不同分枝杆菌种的结果。表8总结了实施例6的实验结果，图17-27显示所试结核分枝杆菌分离株的结果。图28-30显示，该现象扩展到所试β-内酰胺之外。尽管在实施例5和实施例6的实验中种和分离株之间存在显著差异，但都被CB-18与抗生素的组合在某种程度上协同影响。结核分枝杆菌分离株似乎是所试分枝杆菌种中最敏感的，而速生菌受较小程度的影响，但当与抗生素组合使用时其显示最大的协同作用。鸟分枝杆菌复合体分离株显示中度的反应。基本上，根据在CB-18和不同抗生素存在下的生长特征，能鉴别所有的分离株。因此，CB-18效应取决于所用的分离株和抗生素，适当浓度CB-18的存在对鉴别分离株是必要的。

这随后产生了如下概念：对于鉴别分离株，不同甜菜碱可提供较高程度的敏感性。实施例7在试验中使用了与重建液(R.F.)、PANTA或PANTA/cax组合的多种去污剂。表10总结了这些实验的结果，图32B显示几种不同去污剂的结果(在只有P-cax存在下)。因此，CB-18效应取决于分离株、去污剂和抗生素的动态相互作用，其中具有CB-18效应的应用。抗微生物疗法、抗药性和通透性

就作用位点而言，抗生素不尽相同。例如，Yao，J.D.C.等人，在Murray，P.R.等人编的《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1281-1307页中论述了不同种类的抗微生物剂，并报告对于影响或妨碍细胞壁和细胞膜合成或完整性、蛋白质合成、核酸合成(例如，RNA和DNA前体两者)和DNA复制的不同方面，以及只利于诱变的药物，作用位点的范围不同。

细菌由于多种原因对不同抗生素不敏感(即有抗性)。Quintiliani，R.等人在Murray，P.R.等人编的《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1308-1326页(在此引入作为参考)中论述了几种这样的机制。总之，抗生素必须首先进入细胞，然后在作用位点发挥其作用。抗药性的基础可能是由于：(a)生物的通透性，(b)在特定临床分离株中作用位点的分子构型可能是不相容的或完全不存在的，或者(c)细菌可以修饰、破坏或从细胞内间隙中泵出抗生素。在第一种情况中，如果细菌对于药物是不通透的，那么抗生素不能到达作用位点发挥其影响。在第二种情况中，如果药物能进入细菌，但作用位点(例如靶位点的3-D结构)使抗生素不能与之结合，或者如果作用位点不存在(例如，所述结构或酶不是表达的组分的一部分)，那么细菌将不受药物影响。在最后一种情况中，如果抗生素能进入并且靶存在，那么细菌能通过降解抗生素、修饰抗生素以降低其毒性或从细胞内环境中移除/泵出抗生素而有效地避开药物的作用。

分枝杆菌感染的治疗是非常有限的(见上文)，相比大多数微生物更是如此(Inderlied，C.B.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1385-1404页)。这种不敏感性部分是由于该类细菌的不通透性：分枝杆菌比大肠杆菌(Escherichia coli)通透性低1,000-10,000倍(Jarlier，V.等人，细菌学杂志(Jour.Bact.)172：1418-1423(1990)和Nikaido，H.等人，微生物学研究(Res.Microbiol.)142：437-443(1991))。Connell，N.D.等人在《结核病.发病机理、保护及控制》(Tuberculosis.Pathogenesis，Protection，and Control)Bloom，B.R.编，ASM出版社，Washington，D.C.(1994)第333-352页中论述了分枝杆菌的通透性特征，并声明“龟分枝杆菌细胞壁的低通透性完全解释了该微生物对头孢菌素抗性的水平”。

低通透性部分地导致分枝杆菌所显示的敏感性的复杂模式。例如，MTB感染通常可用INH和/或PZA有效地治疗，而MAC分离株一般耐受这些药物。另外，偶发分枝杆菌和龟分枝杆菌分离株对所有的一线抗结核药一般都有抗性(Inderlied，C.B.等人，于：Murray，P.R.等人编《临床微生物学手册》，ASM出版社，Washington，D.C.(1995)第1385-1404页)。Cynamon，M.H.等人在《分枝杆菌感染化学治疗中的药物敏感性》Heifts，L.B.编，CRC出版社，Boston，MA(1991)第147-159中论述了关于治疗这些速生菌所致感染的研究，并报导了敏感性的多种模式。例如，在所述抗生素的每种类别中(β-内酰胺、磺胺、大环内酯、氨基糖苷等)，描述了敏感性的范围，从几个百分点到100％，30％-60％是标准(取决于药物及其浓度)。Heifts，L.B.在《分枝杆菌感染化学治疗中的药物敏感性》Heifts。L.B.编，CRC出版社，Boston，MA(1991)第13-57页中论述了对MTB和MAC的类似研究，并讨论了敏感性的多样性，但建议敏感性的模式尽管仍然多样，但不是变化的。

虽然通透性解释了分枝杆菌的一部分重要的敏感性模式，但这些微生物似乎具有另外两种在抗药性中起重要作用的机制。第一，MTB感染似乎由细胞的亚群组成。这些亚群可被分类为：(a)活跃生长的，(b)半休眠的-由于巨噬细胞的低pH，(c)半休眠的-具有散发的代谢爆发，和(d)休眠的(Heifts，L.B.于：《分枝杆菌感染化学治疗中的药物敏感性》，Heifts，L.B.编，CRC出版社，Boston，MA(1991)第13-57页)。休眠使这些亚群在治疗期间幸存。另一种机制可能是遗传不稳定性。点突变的产生导致潜在治疗靶位点的分子变异性。全部地，敏感性模式的变异性是这些机制的组合，主要机制或许取决于种甚至分离株本身。

一般而言，在分枝杆菌中似乎最有效的抗性机制是通透性、增殖的调节(例如休眠)和靶位点的结构变异性。克服或绕过抗性的方法必须修饰通透性、理解并定位增殖或修饰抗生素的化学结构以更适当地“适合”靶位点。

根据这一观点，必须调和此处实施例中所示的5条信息。第一，CB-18效应的作用机制不同于季铵盐的机制。后一组去污剂发挥普通的表面活性作用来破坏细胞膜并变性细胞蛋白质(Hugo，W.B.于：《S.C.I.专题19号：微生物学中的表面活性剂》(S.C.I.Monograph no.19：Surface-Active agents in Microbiology)London Soc.Chem.Industry，伦敦(1965)第69-82页)。图7A-7C和图8A-8C比较了TMA-18与CB-18的作用，证实CB-18效应不同于季类去污剂的作用。然而在高浓度时，甜菜碱似乎模拟季类去污剂并导致通常有害的作用。

第二，没有抗生素后效应(PAE)。例如，与383μg/ml CB-18接触90分钟对生长特征没有明显影响(图3C和图3G)。如果CB-18效应是特异的，也就是说不引起通常有害的作用，但在活跃的代谢中需要最低浓度，那么PAE可能是最小的。异烟肼是一种没有PAE的抗结核药(Heifts，L.B.于：《分枝杆菌感染化学治疗中的药物敏感性》，Heifts，L.B.编，CRC出版社，Boston，MA(1991)第13-57页)。

第三点围绕着如下事实：在某些分离株中仅在重建液(R.F.)存在下(即，无抗生素时(图10-15))可见CB-18效应。该效应是依赖分离株(图17-27)的事实强烈提示，CB-18效应具有特异的作用位点，这与全世界的结果不符。换句话说，CB-18效应是分枝杆菌中最特别地是结核分枝杆菌复合体中敏感性模式微观不均一性的反映。

第四，CB-18效应不同于EDTA的作用(图34-35)。EDTA通过提取并螯合稳定细胞壁结构的二价金属阳离子而改变通透性。Rastogi，N.等人，抗微生物剂化学治疗34：759-764(1990)报导，在1mM EDTA(372.5μg/ml)中的生长被影响到在作者进行的“X/Y商”分析中无法使用这些数据的程度。EDTA和CB-18都以17μg/ml的浓度(大约等摩尔量)在实施例7的实验中使用，而在本发明的试验中显示不同的表现。另外，Tsubone，K.，药物科学杂志80：1051-1054(1991)显示，在不同磷酸甜菜碱的螯合活性与抗微生物活性之间一般没有或有极低的相关性。另外，表10评述了所试的不同甜菜碱。相对于含有相同桥但没有酰胺丙基键的羧基甜菜碱，含有酰胺丙基键的羧基甜菜碱是无效的(比较Hetaine CLA或Schercotaine WOAB与DeTaine PB和Velvetex OLB)。预计酰胺丙基键不能干扰电荷中心之间的螯合，但如果作用位点性质上是生理学的(例如酶)，则应能干扰CB-18效应。

第五，实施例7(图32B)在试验中检测了吐温80：吐温80在17μg/ml(13μM)时对571/573-BAL分离株无影响。这是相当令人感兴趣的结果，因为几名作者曾经报导向培养基中掺入吐温80也导致敏感性的诱导(Hui，J.等人，抗微生物剂化学治疗11：773-779(1977)；Yamori，S.等人，微生物学与免疫学(Microbiol.Immunol.)35：921-926(1991))。此处的数据提示，吐温80发挥作用的机制不同于CB-18。例如，在高浓度的吐温80时(例如1％(10mg/ml))，生长实际上是最佳的，高至10％的量也无抑制(Stinson，M.W.等人，美国呼吸道疾病综述(Am.Rev.Resp.Dis.)104：717-727(1971))。相反，大约3-7μg/ml的CB-18不引起生长的变化，而在54μg/ml(222μM)时两种分离株(ATCC 27294和571/573-BAL)的生长都被完全抑制(图10A和图11A)。在较窄的浓度范围内(约13μg/ml-约27μg/ml之间，取决于分离株)CB-18效应是可观察到的。

最后，卵磷脂能克服CB-18效应。这与Barry，C.E.等人(美国专利5,610,198)的教导相反。Barry，C.E.等人(美国专利5,610,198)将卵磷脂列为其发明的佐剂。在此所述的本发明中，该磷脂可发挥作用来中和CB-18(类似于其与季盐的静电作用)或作为一种竞争性抑制剂(在作用位点干扰CB-18效应)。由于CB-18具有中性净电荷，后一种假说似乎更有可能(即，将有最小的稳定的静电作用)。如果脂类如卵磷脂作为竞争性抑制剂，那么这可解释PAE的缺乏。

如果如Thornton WO 95/27076所建议的将CB-18隔离于类脂体内，那么甜菜碱样去污剂将无法作为表面活性剂起作用。如果分枝杆菌在CB-18效应的作用位点是异源的，则在不同甜菜碱样去污剂存在下不同的临床分离株应该有不同的表现(实施例7)。另外，如果改变通透性以利于治疗剂进入靶位点，并且对于抗生素的靶位点而言有异源的临床分离株群，那么预期也有该水平上的变异(如实施例5、6所见)。预计甜菜碱样去污剂与不同抗生素的组合在行为方面显示显著的变异性。这种对两个不同作用位点的信息的分析正是甜菜碱敏感性试验将要提供的。

本发明可定位一种或多种这样的抗性机制(即，通透性、休眠或分子相容性)。下列说明不是为了支持下列假说，只是作为一种手段来阐明本发明的应用：生长的延迟可能是负责休眠的机制被刺激的表现。例如，由于大多数抗生素具有天然的半衰期，如果CB-18效应引起分枝杆菌代谢的终止直到抗生素的毒性水平下降，那么CB-18效应可用来就增殖特征而言区分临床分离株的性质。此信息在所用的药物以及治疗时间方面对临床医生是有价值的。

其它机制与分枝杆菌的通透性有关。下列说明不是为了支持下列假说，只是作为一种手段来阐明本发明的应用：甜菜碱样去污剂可通过修饰分枝菌酸组合物的构象而改变分枝杆菌的通透性。最终结果是诱发的对抗生素的敏感性。由本发明获得的信息在用于最有效治疗的药物方面对临床医生是有价值的。

CB-18效应可能是分枝菌酸修饰模式改变的结果这一概念部分地基于Yuan，Y.等人，国家科学院院报93：12828-12833(1996)的工作，并在实施例9中详细检验。总之，对分枝菌酸的修饰直接与细胞壁的流动性有关。某些修饰降低细胞壁的流动性，而细胞壁流动性的下降可与通透性的降低相关。分枝杆菌的低通透性被认为在抗微生物抗性中起重要作用(Yuan，Y.等人，国家科学院院报92：6630-6634(1995)；Brennan，P.J.等人，生物化学年述(Annu.Rev.Biochem.)64：29-63(1995))。记得Connell，N.D.等人在《结核病.发病机理、保护及控制》，Bloom，B.R.编，ASM出版社，Washington，D.C.(1994)第333-352页中，将龟分枝杆菌对头孢菌素的抗性唯一地归因于通透性。

对分枝菌酸的修饰通过一系列有关的依赖S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的酶反应而发生(图39A)。Barry，C.E.等人(U.S.5,610,198)教导，能用硫代脂肪酸衍生物(“硫代二十四酸”)抑制对分枝菌酸的这种依赖SAM的修饰(图39B)，来治疗致病性分枝杆菌所致的感染。硫代二十四酸的过渡态结构类似于甜菜碱样去污剂(Yuan，Y.等人，国家科学院院报93：12828-12833(1996))，尤其是基于锍的羧基甜菜碱(表1和图39B)。锍羧基甜菜碱不需要酶催化来激活，而只抑制这些依赖SAM的酶。

与本发明的甜菜样去污剂相比，硫代二十四酸是极端不溶的。换句话说，硫代二十四酸的Krafft温度在生理标准(例如37℃)之上。其输送将有显著障碍。锍羧基甜菜碱是更加可溶的(甚至当R₁＝18-20时，但尤其当R₄≥3时(表1；Laughlin，R.，Langmuir 7：842-847(1991)))。甜菜碱样结构直接解决溶解性问题并在某种程度上解决输送问题。例如，如果静脉内输送，硫代二十四酸最可能为固相。因为甜菜碱更可溶，由于甜菜碱的较低Krafft温度使低剂量的静脉内输送更可行。

Barry，C.E.等人(美国专利5,610,198)也公开硫代二十四酸对缓生致病分枝杆菌特异。Barry，C.E.等人(美国专利5,610,198)进一步公开只有也干扰分枝菌酸合成的抗生素才能与这些硫代脂肪酸衍生物协同作用。本发明显示，甜菜碱样去污剂适用于大范围的含分枝菌酸结构的细菌(即，棒杆菌、诺卡氏菌及分枝杆菌(实施例9))，本发明也能应用大范围的抗生素(实施例5和实施例6)。

锍羧基甜菜碱的合成可根据图39C所示的合成，但使用本领域已知的方法实现相同目的的任何方法都是可接受的(March，《高级有机化学.反应、机理与结构》(Advanced Organic Chemistry.Reactions，Mechanismsand Structures)第四版，John Wiley & Sons，纽约，NY(1992)；和Fieser等人，《有机合成试剂》(Reagents for Organic Synthesis)第1-16卷，John Wiley & Sons，纽约，NY(1992)，两篇在此都引入作为参考)。

总之，不是为了进行下列说明，CB-18效应似乎是甜菜碱样去污剂与特定作用位点间相互作用的结果。如果该相互作用是修饰含分枝菌酸结构的细菌的通透性，则最终结果为增加了抗生素在靶位点的有效浓度。例如，对于来源于CB-18预试验的分离株(表7和表8)，如果这些分枝杆菌在靶位点(即肽聚糖合成)和β-内酰胺酶位点都显示异质性，则在甜菜碱敏感性试验中可预期到甚至更高程度的辨别率。一种情况中使用一种对特定β-内酰胺敏感的特定分离株，但由于通透性的不足该分离株可逃脱抗生素的作用。如果甜菜碱样去污剂能提高该分离株的通透性，则β-内酰胺酶也许具有或者也许不具有在发挥作用之前破坏抗生素的能力。如果来源于所述分离株的β-内酰胺酶在破坏特定β-内酰胺结构的能力上不足，则改变通透性足以发挥破坏性的作用，观察为CB-18效应。合理地预期，对于该实施例中讨论的三种不同分子(β-内酰胺、甜菜碱样去污剂和β-内酰胺酶)的作用位点而言，含有分枝菌酸结构的不同细菌具有显著的结构差异。因此，由于能与大量可获得的甜菜碱样去污剂组合使用的大量可获得的抗生素(尤其是β-内酰胺)，高度的辨别率是可能的。

根据本发明的一种敏感性试验使β-内酰胺作为抗结核治疗中佐剂的应用成为可能，该试验是非常有用的，因为迄今为止最常用且最佳表征的抗生素化合物种类是β-内酰胺。由于这些抗生素的深入性和广泛性，用这些药剂治疗分枝杆菌感染的能力将具有明显的优点。已有限成功地尝试了β-内酰胺在用来治疗分枝杆菌感染的治疗方案中的应用。例如Chambers，H.F.等人，抗微生物剂化学治疗39：2620-2624(1995)检验了5种MTB临床分离株并检验了几种不同种类的β-内酰胺。大多数分离株对青霉素和大多数头孢菌素有抗性；然而，亚胺培南(一种碳青霉烯)显示一定活性。将几乎所有的β-内酰胺与一种β-内酰胺酶抑制剂组合是达到显著敏感性所必要的。

如上所述，β-内酰胺酶抑制剂干扰生物降解抗生素的抗性机制。有一个实例，其中抗生素治疗定位了一种抗性机制，并由此增强任何基于β-内酰胺的化学治疗。通过定位抗性机制扩大分枝杆菌对抗生素尤其对β-内酰胺抗生素的敏感性的能力，这在有效治疗分枝杆菌感染中具有重要的潜力。在此所述的本发明使用定位一种机制的分子，该机制以在以前未描述过的方式影响细菌的抗性。对分离株512-JHH(图24)和538-JHH(图25)的分析，以及CB-18对经受体内抗结核菌素治疗的分离株有显著影响(表9)的事实，强调了甜菜碱样去污剂的治疗应用。

现在已完全叙述了本发明，本领域的技术人员应当理解，在不影响本发明或其任何实施方案的精神或范围的情况下，可在较宽和相当范围的条件、参数等等之内实行本发明。在此引用的所有参考文献在此全部引入作为参考。实施例实施例1CB-18处理与分枝杆菌培养

最初由于在涉及为了分枝杆菌检测而处理临床标本的新方法的研究中所进行的观察，而构想了在此所述的本发明。这些方法基于如WO 95/27076中所述的Thornton的方法，并作为主要处理方法用于从临床标本、最特别地从呼吸道标本中分离含有分枝菌酸结构的细菌，尤其是分枝杆菌。下面叙述了Thornton WO 95/27076的方法，并在本实施例的最后叙述了该方法所用试剂的制备。

(1)将1-10ml痰或支气管冲洗液置于50ml锥形管中

注意：尽管呼吸道标本是预计与此处所述方法结合使用的主要标本类型，但其它标本类型如水、土壤、组织、粪便等也能适于与以下方法结合使用。其中某些标本首先应被澄清，方法为在水或缓冲液中重悬浮，并使混合物通过装备有20-60微米烧结材料(frit)的Spin-X II柱(Corning Costar，Boston，MA)。这种柱也可含有一种基质如Sephadex^(Sephadex G-50^：Pharmacia，Piscataway，NJ)或一种相当的树脂以增强纯化。然后任何标本都能如下所述处理。

(2)向标本中加入等体积的0.5％NALC液化溶液(见下：0.5％

   NALC/25mM柠檬酸钠)并振荡。

(3)在室温下温育10分钟(振荡约5分钟，然后即进行下一步骤)。

(4)打开试管，向标本中加入过滤的无菌水至终体积约为35ml(注

   意：使用过滤的无菌水(例如，GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD，

   目录#：15230-022))。

(5)加入4ml含甜菜碱样去污剂的浓缩溶液，例如10×CB-18缓冲

   液(见下)：10×CB-18＝10mM CB-18、0.5M Tris-HCl pH8.0、50mM

   NALC和1mM NaCl。

(6)充分振荡以完全混匀标本。

(7)在摇动下(140转/分)37℃温育90分钟。

(8)振荡，然后于30℃以4,000×g离心标本20分钟。

(9)充分滗析试管，向标本中加入500μl无菌水或缓冲液。

(10)充分重悬浮沉淀块，制备沉淀用于检测，例如通过抗酸细菌

    染色法(即显微镜检术)、培养、核酸扩增或免疫诊断。

初步研究用来估计突破添加了PANTA的BACTEC 12B液体培养基的污染物的性质，它使用来自Quest Diagnostics-Baltimore的废弃的呼吸道标本(n＝277)。(注意：BACTEC 12B液体培养***是本领域中用于培养分枝杆菌的标准方法之一，PANTA是一种抗微生物添加剂，含有多粘菌素B、阿洛西林、萘啶酮酸、甲氧苄啶和两性霉素B：该培养***在此被称为“12B/PANTA”(Becton Dickinson，Cockeysville，MD.))。收集标本并根据上述方法用CB-18处理。将大约400-500μl每种沉淀物转种于12B/PANTA上。通过形态学和/或革兰氏染色鉴定所有污染物，从而鉴别为氧化酶/过氧化氢酶、阳性或阴性。然后使污染物形成物种(speciate)，并用MicroScan^表(Dade，West Sacramento，CA)测定抗生素敏感性。结果显示于表2中。

表2 BACTEC 12B/PANTA污染物的鉴定(n＝277)
			组	#	％
革兰氏阴性	48	84.2％
			革兰氏阳性	5	8.8％
酵母	3	5.3％
			真菌	1	1.8％
总数：	57
			来自40名患者：污染＝14.4％

表2显示从40个标本中分离到57种污染物。以每个标本为基础的污染率为14.4％(40÷277)。这提示，根据WO 95/27076(例如CB-18)处理的呼吸道标本遇到的主要问题是革兰氏阴性生物的存在(＞84％)。48种革兰氏阴性分离株中约31种(64％)为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。最常见的分离株是斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)(n＝13)、假单胞菌属(Pseudomonas)种(n＝11)和奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)(n＝7)。因此，对污染率的显著影响需要革兰氏阴性生物发生率的降低。敏感性数据显示，48种革兰氏阴性菌中的40种对8μg/ml的头孢噻甲羧肟敏感。由于这些数据和其它实验的结果，决定应当用头孢噻甲羧肟(8μg/ml终浓度)强化抗生素添加剂PANTA，以试图控制此革兰氏阴性污染(添加头孢噻甲羧肟(caz)的12B/PANTA***在此被称为“12B/PANTA/caz”)。根据使用几种ATCC分枝杆菌型菌株的平行实验，认为头孢噻甲羧肟可降低革兰氏阴性污染的发生率，而不显著影响分枝杆菌的生存力。10×CB-18缓冲液的制备(1)20×缓冲盐：1M Tris-HCl pH8.0、2mM NaCl

Tris碱(121.14克/摩尔)	54.27克
		Tris HCl(157.64克/摩尔)	87.02克
NaCl	0.117克
		加水至：	1升

(i)在1升量筒中加入约250ml水。

(ii)加入Tris碱(Sigma，St.Louis，MO，目录#：T 1503)、Tris-HCl(Sigma，St.Louis，MO，目录#：T 3253)和NaCl(Sigma，St.Louis，MO，目录#：S 7653)，混合(注意：使用过滤的无菌水(例如，GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD，目录#：15230-022))。

(iii)加入其余的水至1升，并保证充分混匀。

(iv)通过取出一小份检查pH。pH应为±0.2pH单位。

(v)过滤除菌(0.22μ滤膜)，分成50ml等份，室温下贮存。(2)100×CB-18贮存液：100mM CB-18

*CB-18(383克/摩尔)	1.915克
		异丙醇：水(1∶1)至：	50ml

*CB-18：N，N-二甲基-N-(正十八烷基)-N-(3-羧丙基)铵内盐

(CAS^No.78195-27-4)

(i)将25ml分析级异丙醇(Baxter，McGaw Park，IL，目录#：3043-1 NY)与25ml水在量筒中混合，以制备50ml 1∶1的异丙醇∶水(注意：使用过滤的无菌水(例如，GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD，目录#：15230-022))。

(ii)将25ml异丙醇∶水(1∶1)溶液转移至50ml锥形管中。

(iii)称取1.915克CB-18，将其置于含25ml剩余异丙醇∶水(1∶1)的量筒中。涡旋振荡混匀。

(iv)加入更多的异丙醇∶水(1∶1)溶液，至大约40ml，并轻轻涡旋振荡。静置溶液约20分钟，大约每隔5分钟轻轻涡旋振荡一次。

(v)CB-18溶解后(总共约30分钟)，用异丙醇∶水(1∶1)溶液使终体积达到50ml，颠倒混匀。

(vi)将溶液分入两个50ml无菌塑料锥形管中，室温下贮存。(3)10×CB-18缓冲液

(i)确定待处理的标本数，将该数字***下表中(该数字加1，以确保足够的缓冲液)，计算所需每种成分的最终量，并如下所述制备适量的10×CB-18。

成分	乘法因数				最终量
						20×缓冲盐	2ml	×	标本数+1	＝
100×CB-18	400μl	×	＝
					NALC(163.2克/摩尔)	0.033克	×	＝
加水至	4ml	×	＝

(ii)合并20×缓冲盐、NALC(Fluka，Ronkonkoma，NY，目录#01039)和100×CB-18，用过滤的无菌水使之达到所需体积(注意：使用过滤的无菌水(例如，GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD，目录#：15230-022))，立即使用。

注意：在该方法的任何时候，若缓冲液中存在沉淀，切勿使用。该溶液在贮存与使用中应当保温(例如，高于20℃)。不要冷藏该溶液。0.5％NALC液化溶液的制备(1)10×柠檬酸钠贮存液：0.25M二水合柠檬酸钠

二水合柠檬酸三钠(294.1克/摩尔)	7.35克
		加水至：	100ml

(i)在100量筒中加入约25ml水(注意：使用过滤的无菌水(例

如，GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD，目录#：15230-022))。

(ii)加入二水合柠檬酸三钠(Sigma，St.Louis，MO，目录#：C

3434)，涡旋振荡混合。加入其余的水至100ml，颠倒混匀。

(iii)过滤除菌(0.22μ滤膜)，等分于50ml锥形管中。室温下贮

存。(2)0.5％NALC液化溶液(每日新鲜制备)

(i)确定所需NALC液化溶液的大致体积。

(ii)在50ml锥形管或量筒中合并10×柠檬酸钠贮存液和NALC

    (Fluka，Ronkonkoma，NY，目录#01039)，用水加至终体积(注

    意：使用过滤的无菌水(例如，GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD，

    目录#：15230-022))。

(iii)立即使用，丢弃未用的部分。

大约#标本	3-10	7-25	12-37	15-50
					10×柠檬酸钠贮存液	2.5ml	5ml	7.5ml	10ml
NALC(163.2克/摩尔)	0.12克	0.25克	0.38克	0.5克
					加水至：	25ml	50ml	75ml	100ml

头孢噻甲羧肟贮存液和12B/PANTA/caz的制备(1)头孢噻甲羧肟贮存液(36mg/ml)

头孢噻甲羧肟	72mg
		1M碳酸氢钠	85.6μl
加水至：	2ml

(i)在2ml容量瓶中混合1ml水和1M碳酸氢钠(Sigma，St.Louis，MO：目录#：S 6297(在100ml水中溶解8.40克碳酸氢钠，无菌过滤，以10ml和1ml的等份冻存))(注意：使用过滤的无菌水(例如，GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD，目录#：15230-022))。(ii)加入头孢噻甲羧肟(Sigma，St.Louis，MO：目录#：C 3809)，

立即用水使体积达到2ml。

(iii)轻轻颠倒混合，直到溶液澄清。切勿在室温以上加热溶液

     (例如，不要在手中温暖该溶液)。

(iv)立即等分50μl部分于1.5ml微量离心管中，立即贮存于-70

    ℃直到使用。(2)PANTA/caz的强化和使用

(i)从冷藏箱中取出冻干的PANTA和重建液(R.F.)，从冷冻箱

   中取出1份50μl等份的头孢噻甲羧肟贮存液(36mg/ml)。

(ii)头孢噻甲羧肟融化后，使用1个5ml注射器，向头孢噻甲羧

   肟贮存液中加入1ml R.F.。通过将其吸入注射器中排出一次

   而混合。使用注射器，将全部内容物转移到PANTA瓶中。

(iii)向PANTA瓶中加入4毫升多R.F.(终体积＝5ml)。贴标签

   “PANTA/caz”。

(iv)使用前向每个12B瓶中加入100μl PANTA/caz(在加入标本

    2小时内加入抗生素)。

(v)将未用的部分贮存于-20℃。48小时后丢弃(例如，不要冻

   融超过1次)。实施例2 CB-18预试验

用CB-18处理呼吸道标本用于分枝杆菌(抗酸杆菌：AFB)检测，以试图评价Thornton WO 95/27076的方法。呼吸道标本(n＝573)从QuestDiagnostics-Baltimore(BAL)的TB实验室，以及Quest Diagnostics-Teterboro(TBR)，Washington，D.C.实验室局(BOL)、Johns HopkinsHospitals(JHH)和Baltimore的马里兰(Maryland)大学(UMB)分开并收集。来源地将每一标本分开，使得在当地用标准NALC/NaOH方法(Kent，P.T.等人，“公共卫生分枝杆菌学”，于《三级实验室指南》，美国卫生与人类服务部，疾病控制中心，(1985)第31-46页)处理每一标本的一半，并转种于液体(BACTEC 12B或BBL MGIT)和固体培养基(7H11、L-J或SeptiCheck)中，而把每一标本的另一半送到Quest-Baltimore设施，如实施例1所述以每天为基础用CB-18处理标本。如上所述将CB-18沉淀转种于12B/PANTA/caz和7H11选择性斜面上。按照推荐的方法(Kent，P.T.等人，“公共卫生分枝杆菌学”，于《三级实验室指南》，美国卫生与人类服务部，疾病控制中心，(1985)第57-69页)进行所有涂片分析。该研究的结果在此称为“CB-18预试验”。

在处理的573个标本中，根据所有方法(即，根据NaOH或CB-18，根据液体或固体培养)有106个AFB培养阳性标本。有8个戈登分枝杆菌分离株。在两种方法间它们全部都是差异的、革兰氏阴性的并且等分(即，CB-18漏掉了用NaOH分离的4个标本，反之亦然)。由于认为戈登分枝杆菌分离株是具有有限临床意义的污染物(Wayne，L.G.等人，临床微生物学综述(Clin.Microbiol.Rev.)5：1-25(1992))，故将其从下列分析中省略：因此分析了98个AFB培养阳性标本。表3总结了无戈登分枝杆菌分离株的培养结果。

有52个一致的阳性标本、467个一致的阴性标本和46个不一致的标本。NaOH鉴定出总共61个阳性标本，敏感度为62.2％。CB-18鉴定出总共89个阳性标本，敏感度为90.8％。CB-18使聚集培养敏感度提高了大约46％。

表3 CB-18预试验的聚集培养结果
		n＝573CB-18	NALC/NaOH+     -+    52    37    90.8％-    9     46762.2％      总计AFB＝98

在98个培养阳性标本中，69个为非结核的分枝杆菌(MOTT)，29个为MTB。NaOH鉴定出33个MOTT阳性标本和28个MTB阳性标本。CB-18鉴定出64个MOTT标本，但仅25个MTB标本。NaOH处理的标本中的培养敏感度对于MOTT和MTB分别为47.8％和96.6％。CB-18处理的标本中的培养敏感度对于MOTT和MTB分别为92.8％和86.2％。CB-18使MOTT疾病阳性标本中的培养敏感度提高94.1％，但使MTB疾病阳性标本中的培养敏感度降低12.1％。

表4显示涂片分析的结果。有61个培养阳性标本通过任一处理方法也是涂片阳性的。有18个标本通过两种处理方法都具有相同的涂片值，有19个标本其中两种方法均报告了涂片阳性结果，但CB-18报告的值较高。不存在涂片阳性标本中NaOH具有较高涂片值的例子。有23个例子其中CB-18报告涂片阳性结果而NaOH报告涂片阴性结果。只有一个例子中NaOH报告涂片阳性结果而CB-18报告涂片阴性结果。根据涂片NaOH鉴定出98个培养阳性标本中的38个，敏感度为38.8％，而根据涂片CB-18鉴定出60个培养阳性标本中的18个，敏感度为61.2％。因此，CB-18使涂片敏感度提高大约58％。表4也显示，涂片敏感度的增加是结核分枝杆菌(MTB)和非结核分枝杆菌(MOTT)两者都增加的结果。

表4 CB-18预试验的涂片分析
					全部	MOTT	MTB
相同的涂片值CB-18涂片值＞NaOH涂片值NaOH涂片值＞CB-18涂片值CB-18涂片且NaOH涂片NaOH涂片且CB-18涂片	18190231	890161	1010070
				总培养且涂片研究中总AFB培养	6198	3469	2729
NaOH涂片敏感度CB-18涂片敏感度	38.8％61.2％	26.1％42.8％	69.0％93.1％

应用CB-18涂片敏感度增加，但通过NALC/NaOH和CB-18涂片分析的特异性分别为99.8％和96.8％。有大量标本经CB-18报告为“涂片±”但未进行CB-18的确证培养。CDC指南(Kent，P.T.等人，“公共卫生分枝杆菌学”，于《三级实验室指南》，美国卫生与人类服务部，疾病控制中心，(1985)第57-69页)指示实验室在没有确证培养结果的情况下称这些涂片±结果为“可疑的”。

当用CB-18处理标本时存在特别大量的涂片±。独立分析每种方法，即代替另一种处理方法的结果，并且包含这些涂片±结果，得到十分不同的结果。例如，表5的数据显示，为NALC/NaOH培养阳性的61个标本中的37个也为NALC/NaOH涂片阳性。在89个培养阳性CB-18标本中，56个也是CB-18涂片阳性。NALC/NaOH涂片分析的敏感度和特异性分别为60.6％和99.6％，而CB-18分别为62.9％和91.2％。

在CB-18发现的31个涂片±结果中(5+26＝31)，约42％(n＝13)经其它方法或从其它标本确证培养，或者能与以前的疾病相关联，或者具有阳性扩增结果(即，证实分枝杆菌DNA的存在)。(注意：根据CDC指南，16个涂片1+和2+CB-18培养阴性标本在表4的分析中被认为是CB-18涂片阳性-因此最初特异性降低(99.8％对96.8％(表4))。)总之，尽管CB-18使培养敏感度全面提高(表3)，但根据表5所示的分析，NALC/NaOH和CB-18的涂片特异性分别为99.6％和91.2％。

表5所示的结果提示，CB-18处理对涂片技术本身没有影响。例如，对于对载玻片的粘附而言，CB-18不改变细菌的“粘性”。这基于如下观察：相对于NALC/NaOH，CB-18使培养阳性标本的涂片敏感度提高了58％(表4)；然而，就通过该方法经涂片挑出的培养阳性标本的数量而言，每种方法大致相同(表5：60.6％对62.9％)。换句话说，培养仍然是更敏感的诊断技术，但CB-18似乎大致相同地影响两种方法的总敏感度。

表5两种不同处理方法的独立评价
			涂片值	NALC/NaOH	CB-18
AFB   AFB 	AFB   AFB 
		阴性±1+		24    5023     07     1	33    4345     268     14

2+3+4+	8                  15                  014                 O		6                  27                  030                 0
					总数	61                 504		89                 476
涂片：	敏感度	特异性	敏感度	特异性
					60.6％	99.6％	62.9％	91.2％

总之，通过每种方法鉴定的培养阴性且涂片阳性(即，涂片+和涂片±两者)标本的数量明显不同：NALC/NaOH仅报告2个涂片阳性且培养阴性标本，而CB-18报告42个涂片阳性标本(包括CB-18涂片±但培养阴性的标本：表5)。这些涂片±结果的正确性问题(即涂片特异性的降低)有重要意义。特别地，如果上述假设是正确的(例如，CB-18大致相同地影响两种检测方法的总敏感度)，则CB-18降低涂片分析的特异性。这对化验员具有重要意义。如果该假设不正确，并且这些是有效的涂片结果，表明这些患者实际上感染了分枝杆菌，那么CB-18涂片分析的敏感度也许高于表4或表5所示。这后一种结论对医生具有重要意义。为了理解这些结果，进行表6所示的分析。

独立检查了在CB-18预试验中使用的两种不同处理方法的液体和固体培养的敏感度(表6)。对于处理方法(NaOH对CB-18)分析通过特定培养方法(液体对固体)分离的AFB培养阳性标本的数量。对于61个NaOH培养阳性标本而言：45个液体和固体两种培养均为阳性，15个仅液体培养为阳性，1个只在固体培养基上为阳性。检查了89个CB-18培养阳性标本：42个液体和固体两种培养均为阳性，15个仅液体培养为阳性，32个只在固体培养基上为阳性。用NaOH和CB-18处理时液体培养的敏感度分别为98.4％和64.0％。用NaOH和CB-18处理时固体培养基的敏感度分别为75.4％和83.1％。

对于NaOH处理的标本预期的结果为：液体培养比固体培养基上的培养约敏感31％。相反，当用CB-18处理标本(如实施例1所述)，并转种于12B/PANTA/caz和7H11选择性斜面时，固体培养基大约敏感30％。

表6液体培养与固体培养基的比较
					培养结果	AFB总数	敏感度
液体与固体 单独液体 单独固体	液体    固体
		NaOH涂片涂片	31       6         014       9         1		3724		100％   83.8％95.8％  62.5％
总数	45       15        1			61		98.4％  75.4％
CB-18涂片涂片	38       4         144        11        18					5633	75.0％  92.9％45.4％  66.7％
		总数	42       15        32	89	64.0％  83.1％

在这些结果中有显著的和意外的二分现象(dichotomy)。例如，尽管聚集培养敏感度提高约46％(表3)，但这种增加只是由于MOTT分离的增加(即，MTB培养敏感度降低)。与此明显相反的是涂片敏感度的全面提高，其中贡献几乎同等地来自于MOTT和MTB两种阳性标本(表4)。

Thornton WO 95/27076建议，提高的敏感度是由于(i)与NaOH有关处理的有害影响的降低，(ii)由于补偿生物固有的浮力而提高的离心回收效率，以及(iii)由于成索的生物的分散而增加的检测可能性。提高的培养敏感度可能是由于所有这三方面的结合，而提高的涂片敏感度可能只是由于分散或增强的回收(涂片与生存力无关)。由于MOTT生物一般不能形成如MTB细菌一样程度的索带，所以提高的涂片敏感度最可能是由于回收增强。另外，直觉上，生存力肯定是培养敏感性的一个重要方面。二分现象来源于如下事实：涂片数据显示MOTT和MTB两种生物中回收增强，但培养数据显示MOTT生物中提高的生存力而MTB生物中降低的生存力。

CB-18处理的标本中液体-固体培养敏感度的逆转(表6)提示，二分现象是CB-18与PANTA/头孢噻甲羧肟添加物中抗生素联合的结果。例如，比较两种不同处理方法的涂片阳性与涂片阴性标本的固体培养敏感度，显示明显的相似性。用NALC/NaOH处理时涂片阳性标本中固体培养基敏感度比涂片阴性标本高34％，用CB-18处理时高39％。液体培养数据的相同检验显示，用NALC/NaOH处理时涂片阳性与涂片阴性标本间敏感度有较小差异(例如，4％的差异)，而用CB-18处理的相同组之间有显著差异(例如，65％的差异)。用CB-18处理的涂片阳性标本中75％的液体培养敏感度是意外地且十分不寻常的(这14个标本包括5个MTB和9个MOTT：4个MAC，2个偶发分枝杆菌，龟分枝杆菌、斯氏分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌各1个)。对于用NALC/NaOH处理的涂片阳性标本，100％的液体培养敏感度不是偶然发现的。Stone，B.L.等人，临床微生物学杂志35：1030-1031(1997)报导，(用NALC/NaOH处理的)涂片阳性标本的液体培养敏感度也是99.3％(这是一次较大的研究：n＝439)。

从这些数据得出两个结论。第一，CB-18/12B/PANTA/caz***影响大范围的分枝杆菌。例如，尽管5种漏过的MTB分离株由于其社会重要性而非常明显，但MTB分离株仅占涂片阳性-液体培养阴性标本的36％(5÷14)，和该研究中所有AFB分离株的30％(29÷98)。类似地，MOTT分离株占涂片阳性-液体培养阴性标本的64％(9÷14)，和该研究中所有AFB分离株的70％(69÷98)。由于受影响的分离株的比例相同，这似乎是一个广泛适用的现象：CB-18与抗生素的有害组合对MTB和MOTT的影响类似。

第二，CB-18/12B/PANTA/caz***的影响可能是依赖接种体的。例如，类似于Eng，R.K.等人，抗微生物剂化学治疗26：42-47(1984)对于绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)所报导的，头孢噻甲羧肟的最小抑制浓度(MIC)随递增的接种体而增加。由于涂片是每单位体积生物数量的直接反映，所以CB-18/12B/PANTA/caz***更能影响涂片阴性标本-因此涂片阳性与涂片阴性标本的液体培养敏感度之间有65％的差异。

在此研究中，以1mM(383μg/ml)的浓度使用CB-18。转种于BACTEC 12B中的标本中的CB-18浓度大概为35μg/ml-7μg/ml，这取决于标本的原始稠度、CB-18方法液化标本的能力和滗析后剩余的“反洗液”(即，原始处理的液体)的量。在一种最差的情况中(例如，稠的浓痰)，标本不能很好地液化，残留大体积的原始处理基质。在这些情况下，基本将标本转种于处理溶液中。向BACTEC 12B瓶中加入400-500μl沉淀，终体积≈4.5ml，提供≈11倍的稀释(即，35μg/ml)。在最好的情况下(例如，稀的支气管冲洗物)，残留≈100μl原始处理的基质。然后将沉淀重悬浮于500μl水中，提供≈5倍的稀释。这些标本约为7μg/ml。尽管对于给定的标本不知道CB-18浓度为多少，但相应假定CB-18均匀地溶解于处理基质中，并且由于CB-18不被洗掉，所以对于每种标本有一定的浓度范围，有时为7μg/ml-35μg/ml。

固体基质与液体对应物十分不同。首先，向斜面中加入更小的体积(≈100μl)。这种较小的接种体部分地解释了培养敏感度的差异。其次，加至斜面的任何CB-18都通过毛细管作用减至最小：去污剂将被吸收到培养基内，远离细菌，由此使其作用减到最小。

总之，上述数据提示，抗生素和CB-18是协同有害的，该作用广泛影响所有的分枝杆菌。实施例3CB-18中的处理对CB-18中的转种

为了试图理解转移入12B/PANTA/caz培养***中的CB-18的动态相互作用，设计了图1A和图1B所概述的实验(注意：图1A和图1B是指相同的实验—由于实验设计的复杂性提供相同实验的两种不同构思)。使用两种不同分离株：结核分枝杆菌型菌株ATCC 27294(ATCC，Rockville，MD)和来源于CB-18预试验的临床分离株571/573-BAL(注意：“571/573-BAL”是指两种分离株之一，这两种分离株都来源于相同患者，但来源于同一天提交的两种不同的自然标本(即，571-BAL和573-BAL(见表8并比较图18与图19))—这两种分离株在所有方面都表现相同，并在本实施例和以后的实施例中可交换地使用)。

将每种分离株培养于Lowenstein-Jensen(L-J)斜面或7H11选择性斜面上(7H11选择性斜面用多粘菌素B、羧苄青霉素、两性霉素B和甲氧苄啶(Becton Dickinson，Cockeysville，MD)强化)。从这些斜面上刮下细胞，置于缓冲液或含1mM CB-18的缓冲液中(如实施例1所述)，然后在相同缓冲液中稀释1000倍(图1A和图1B)。在进一步稀释前将每种细菌原液在摇动下(140转/分)37℃温育90分钟。然后用缓冲液或0.5mMCB-18连续稀释每种细菌原液，产生25,000×、50,000×和100,000×的终稀释液(相对于原始原液(图1A和图1B))。然后将每一稀释系列一式双份(每份400μl)转种于BACTEC 12B瓶中，瓶中添加有PANTA或用caz强化使得caz终浓度为8μg/ml的PANTA(P/caz)。在这些实验中CB-18的浓度约为17μg/ml(如实施例2所述在大多数瓶中估计为7μg/ml-3μg/ml之间)。定期检查培养瓶并记录生长指数。将特定系列中全部6个培养瓶的生长指数平均，并对培养天数作图。图2A-2H显示ATCC 27294的结果，图3A-3H显示571/573-BAL的结果。

ATCC 27294分离株一般不被该实验范例施加的任何条件所影响：培养条件(L-J对7H11)或抗生素(PANTA对PANTA/caz)或处理溶液(缓冲液对CB-18)或转种溶液(缓冲液对CB-18)对ATCC 27294的生长特征都没有显著影响(图2A-2H)。

另外，571/573-BAL分离株被实验方案的几乎所有方面显著影响。例如，571/573-BAL的行为不仅取决于如何为实验准备分离株(L-J对7H11选择性)，而且其行为也取决于头孢噻甲羧肟的存在和转种溶液的组成(例如，缓冲液对CB-18)。实际上，最重要的参数似乎是转种溶液中CB-18的存在(比较图3A与图3B；3C与3D；3E与3F；及3G与3H)。在缓冲液中处理并转种于CB-18中的细胞，直到恰好转种前才与CB-18接触。在图3F中，在P/caz存在下转种的分离株不生长。事实上，用来在图3F和图3H中生成P/caz生长曲线的12个瓶中只有3个实际生长。

看来实际处理对生长特征具有最小的影响。例如，设计实验，使细胞能在CB-18中处理并稀释，使得培养瓶中CB-18的浓度约为0.68μg/ml(@25,000×)、0.34μg/ml(@50,000×)到0.17μg/ml(@100,000×)。这些不同稀释度之间生长特征无显著差异。比较图3A和图3C与图3E和图3G显示，能在CB-18中处理细胞，但只要培养瓶中的CB-18浓度低于例如约1μg/ml，生长就不受阻碍。换句话说，用“CB-18”没有“抗生素后效应”(Heifets，L.B.等人，于：《分枝杆菌感染化学治疗中的药物敏感性》，Heifets，L.B.编，CRC出版社，Boston，MA(1991)，第13-57页)。

总之，与CB-18预试验结合的上述数据显示，不同分离株表现不同，这些分离株的表现影响分离株的敏感性(例如，在与抗生素接触之前：在7H11选择性上培养的细胞(图3E-3H))。然而最重要地，培养基中甜菜碱(例如CB-18)的存在加剧了这些分离株对也存在于培养基中的抗生素的敏感性。实施例4卵磷脂的加入克服CB-18效应：低浓度接种体的检测及与季铵盐的比较

实施例3所述实验(图1A和图1B)显示，CB-18作为主要诊断工具的应用需要进一步的改进。例如，CB-18必须从转种溶液中去除，应使用低毒性的甜菜碱，或者CB-18效应必须被中和。这导致CB-18的作用可以被卵磷脂以类似于Patterson，R.A.，美国公共卫生杂志(Amer.Jour.Public Health)46：1429-1430(1956)和Wayne，L.G.，美国呼吸道疾病综述80：912-913(1959)所述的季铵盐(例如，Ziphiran^或氯化苯甲烃铵)的方式中和这一观念。

据认为季铵盐对细菌和真菌生物具有相当普遍的有害作用。Hugo，W.B.在《S.C.I.专题19号：微生物学中的表面活性剂》London Soc.Chem.Industry，伦敦(1965)第69-82页中综述了文献，并总结了季盐引起细胞膜破裂和胞内蛋白质一般变性(例如失活)的作用。

Patterson，R.A.等人，美国公共卫生杂志46：1429-1430(1956)和Wayne，L.G.，美国呼吸道疾病综述80：912-913(1959)显示，用卵磷脂(磷脂酰胆碱，一种磷脂)能克服分枝杆菌培养中季铵盐的有害作用。图4显示一种实验设计，其用来检验卵磷脂是否也能克服571/573-BAL的CB-18致敏作用。

该实验中，在7H11选择性培养基中培养571/573-BAL分离株，用NALC/柠檬酸连续稀释为约1000×。为了试图检验接种体如何影响该试验结果，制备三种不同的原液，一种系列在缓冲液中稀释，一种系列在CB-18中稀释。因此，在缓冲液或1.0mM CB-18中进行进一步的连续稀释至2,500×、12,500×和50,000×。通过将这三种原液与缓冲液或卵磷脂的缓冲溶液(Sigma，St.Louis，MO；目录#：P5394(在100％乙醇中以100×浓缩液制备7.5％卵磷脂(3克于40ml中)，用实施例1的Tris缓冲液稀释，立即使用))1∶1混合制备转种溶液。三种不同转种溶液的最终稀释度约为5,000×、25,000×和100,000×。CB-18和卵磷脂在适当转种溶液中的终浓度约为0.5mM。然后将每一系列一式四份(每份400μl)转种于BACTEC 12B瓶中，瓶中添加了重建液(R.F.)或含有补加了8μg/ml头孢噻甲羧肟的PANTA(P/caz)。温育期间卵磷脂和CB-18的终浓度都约为17μg/ml。定期检查培养瓶，记录生长指数。平均特定系列的生长指数，并对培养天数作图。

也通过转种于7H10平板(Becton Dickinson，Cockeysville，MD)对三种原液(即，2,500×、12,500×和50,000×)的等份进行定量培养。7H10平板分析证明，在5,000×系列中每一瓶大约有165±54个菌落形成单位(cfu)，在25,000×系列中每一瓶大约有33±11 cfu，在100,000×系列中每一瓶大约有8±3 cfu。图5A显示转种于缓冲液或含卵磷脂的缓冲液中的5,000×系列，图5B显示转种于CB-18或与卵磷脂组合的CB-18中的5,000×系列。图5C显示在缓冲液或含卵磷脂的缓冲液中转种的25,000×系列，图5D显示转种于CB-18或与卵磷脂组合的CB-18中的25,000×系列。图5E显示转种于缓冲液或含卵磷脂的缓冲液中的100,000×系列，图5F显示转种于CB-18或与卵磷脂组合的CB-18中的100,000×系列。

图5A、5C和5E的检验证实，该浓度卵磷脂的添加对BACTEC 12B试验的敏感性即使有的话也只有很小的影响。另外，卵磷脂具有在某种程度上克服不含CB-18时抗生素制剂(P/caz)的有害作用的能力。图5B、5D和5F的检验显示，卵磷脂能克服单独的或与抗生素组合的CB-18的有害作用。当接种体从165±54 cfu降至33±11 cfu至8±3 cfu时，卵磷脂克服抗生素、CB-18或两者组合的有害作用的能力似乎降低。然而在所有情况下，当作为转种溶液的成分加入卵磷脂时，所有平行瓶都变为阳性。相反，CB-18与P/caz组合的所有平行瓶都是阴性(图5B、5D和5F)。显然，卵磷脂能克服CB-18效应。重复实验证实了这些发现。

季铵盐

图5A-5F所示的结果表明，CB-18的作用机制类似于季铵类化合物(例如，一般的表面活性性质)。该结论基于卵磷脂能中和季铵去污剂和CB-18两者的概念。大概，是通过两种脂的静电相互作用实现这种中和。阳离子季类去污剂与阴离子磷脂的相互作用似乎是合理的，但甜菜碱具有中性净电荷。甜菜碱一卵磷脂的相互作用是短暂的。

图3C和图3G的结果显示，用CB-18处理但转种于缓冲液中的细胞没有“抗生素后效应”。如果CB-18的作用机制类似于季盐(即，通常有害的)，则预计有某种延迟。例如，如果CB-18效应是去污剂表面活性性质的结果，那么细胞功能的破坏将不仅具有非特异的长期后果而且也将不依赖于分离株。为了试图检验机制的相似性，平行测定CB-18与溴化三甲基十八烷基铵(TMA-18(Aldrich，Milwaukee，WI，目录#35，924-6)：类似于实施例1中对于CB-18所述在1∶1的水∶异丙醇中制为100×原液)。图6概述了该实验设计。

在该实验中，ATCC 27294和571/573-BAL都在7H11选择性培养基中培养，然后用NALC/柠檬酸连续稀释为10,000×。通过用缓冲液、0.5mMCB-18或0.1mM TMA-18(所有浓度代表转种溶液中的去污剂最终浓度)稀释制备转种溶液(即，最终稀释度(50,000×))。然后将每一系列一式两份(每份400μl)转种于BACTEC 12B瓶中，瓶中添加有重建液(R.F.)、PANTA或用头孢曲松强化的PANTA(8μg/ml终浓度：P/cax)。温育期间CB-18的终浓度约为17μg/ml。温育期间TMA-18的终浓度约为3.4μg/ml。定期检查培养瓶，记录生长指数。平均特定系列的生长指数，并对培养天数作图。图7A-7C显示一种实验，其中将ATCC 27294细胞转种于上述不同溶液中，图8A-8C显示一种平行实验，其中将571/573-BAL细胞转种于相同系列中。

使用ATCC 27294的结果显示，P/cax比单独的PANTA(图7A)或PANTA/caz组合(比较图2A与图7A)具有更有害的作用。在17μg/ml CB-18存在下，单独PANTA中较小的延迟变得明显，而P/cax制剂显示明显的延迟(图7B)。在3.4μg/ml TMA-18存在下ATCC 27294的培养在所有瓶中显示明显延迟(图7C)。

571/573-BAL分离株的行为在许多方面类似于ATCC 27294分离株，具有微妙但明显的差异。例如，在17μg/ml CB-18存在下，所有条件下的延迟变得明显，P/cax制剂显示惊人的延迟(图8B)。在3.4μg/ml TMA-18存在下571/573-BAL的培养与ATCC 27294相同：在所有瓶中都观察到明显的延迟(图8C)。

这些实验提示，CB-18发挥作用的机制不同于季铵盐(例如TMA-18)。例如，在无任何添加的去污剂时(比较图7A与图8A)，或在低浓度CB-18的存在下(比较图10A与图11A)，ATCC 27294和571/573-BAL的生长曲线实际上相同。当CB-18浓度增加时，可区别分离株(比较图7B与图8B)。进一步提高CB-18浓度时，分离株似乎再次有相似的行为：在高浓度CB-18存在下两者都不能生长(再次比较图10A与图11A)。这明显不同于这两种分离株在TMA-18存在下的行为(比较图7C与图8C)：两种分离株行为表现几乎相同。如果CB-18与TMA-18的作用位点相同，则两种分离株在所有条件下都应表现相似。如果两种去污剂的作用位点不同，则预期两种分离株在各自培养条件下表现的方式有差异。重要地是要记住，该结果是通过围绕图3C和图3G的讨论预见的：CB-18不显示抗生素后效应(实施例3)。

观察这些数据的另一种方式强调，CB-18与P/cax的组合似乎主要是协同的。例如，尽管分开的CB-18(图7B)和P/cax(图7A)对ATCC 27294具有很小的影响，但这两者的组合是协同的，而不是加成的。此外，图8A和图8B显示，分开的P/cax和CB-18似乎影响571/573-BAL，然而，CB-18-P/cax组合虽然在某种程度上是加成的但主要是协同的。相反，分离的TMA-18是抑菌剂(图7C和图8C)，当与抗生素组合使用时，结果似乎主要是加成的。应用CB-18和TMA-18对这些及其它分离株的其它实验证实了这两种去污剂所发挥作用的微妙但明显的性质。结论

图2H与图7B的比较(ATCC 27294分离株)，以及图3H和图8B与图5B、5D、5F的比较(571/573-BAL分离株)，对于在CB-18存在下对抗生素的敏感性而言，产生重要的一点。例如，在图3H和图8B中，571/573-BAL分离株在CB-18与抗生素存在下生长。相反，在图5B、5D和5F中，在相似条件下没有单独的重复生长。推理地，可合乎逻辑地认为这些差异是实际CB-18浓度、抗生素浓度或特定实验中所用接种体(见实施例2和表6的讨论，参照Eng，R.K.等人，抗微生物剂化学治疗26：42-47(1984)和接种体)或其组合的变化的结果。例如，相对于分别用来产生图2H或3H和图8B的实验，在用来产生图7B或图5B、5D和5F的实验中偶然使用较高浓度的CB-18或抗生素；或者图7B、5B、5D和5F中的接种体低于其各自的对应物。由于向每一瓶中引入CB-18、抗生素和接种体的方式(即，使用1ml注射器)，可预期到所有三种变量在特定系列瓶与瓶之间的差异：是规律而不是例外。如果在此使用的培养***对任一种成分过于敏感，则如上所述的差异将变得明显。在图4和图5A-5F所述实验中，在不同接种体之间观察到生长曲线的差异。这些差异主要是预期有较低输入的延迟。相对于CB-18浓度或接种体的变化，抗生素浓度的变化为最小。对于CB-18浓度的变化而言，培养***似乎更具灵活性。实施例5CB-18滴定：NTB、MAC与速生菌的比较

CB-18预试验(实施例2)的结果提示，CB-18效应广泛适用于大范围的分枝杆菌种(表6)，实施例4提示，对于CB-18浓度而言该***是灵活的。为了试图证实这一假说，使用不同分枝杆菌种进行了图9所述的实验，其中几种分枝杆菌种来源于CB-18预试验。

在此实验中，试验了结核分枝杆菌复合体、鸟分枝杆菌复合体和偶发分枝杆菌复合体分离株。所试结核分枝杆菌复合体分离株是ATCC 27294和571/573-BAL。所试鸟分枝杆菌复合体分离株是ATCC 25291和802-BAL；所试偶发分枝杆菌复合体分离株是ATCC 6841和495-JHH。这些分离株的特征和实验结果总结于表7中。

所有分离株都在7H11选择性培养基上培养，然后用NALC/柠檬酸连续稀释为1,000×。通过用缓冲液或一系列不同的CB-18浓度稀释制备转种溶液(即，最终稀释度(5,000×))。其中包括0.1mM CB-18、0.2mM CB-18、0.4mM CB-18、0.8mM CB-18、1.6mM CB-18或3.2mM CB-18。所有浓度代表转种溶液中的最终去污剂浓度，但并不是所有分离株都在所有浓度试验。

然后将每一系列一式三份(每份400μl)转种于BACTEC 12B瓶中，瓶中添加了重建液(R.F.)、PANTA或用头孢曲松(8μg/ml终浓度：P/cax)、头孢噻甲羧肟(8μg/ml终浓度：P/caz)或头孢西丁(8μg/ml终浓度：P/cft)强化的PANTA。结核分枝杆菌分离株被转种于P-cax中，鸟分枝杆菌分离株被转种于P-caz中，偶发分枝杆菌分离株被转种于P-cft中。温育期间CB-18的终浓度对于0.1mM系列约为3μg/ml，对于0.2mM系列约为7μg/ml，对于0.4mM系列约为13μg/ml，对于0.8mM系列约为27μg/ml，对于1.6mM系列约为54μg/ml，对于3.2mM系列约为109μg/ml。定期检查培养瓶，记录生长指数。平均特定系列的生长指数，并对培养天数作图。

图10A和图10B显示一种实验，其中在上述不同溶液中转种结核分枝杆菌分离株ATCC 27294，图11A和图11B显示一种平行实验，其中相同系列中转种结核分枝杆菌分离株571/573-BAL。图12A和图12B显示一种实验，其中在上述不同溶液中转种鸟分枝杆菌分离株ATCC 25291，图13A和图13B显示一种平行实验，其中在相同系列中转种鸟分枝杆菌分离株802-BAL。图14A和图14B显示一种实验，其中在上述不同溶液中转种偶发分枝杆菌分离株ATCC 6841，图15A和图15B显示一种平行实验，其中在相同系列中转种偶发分枝杆菌分离株495-JHHL。

当CB-18的浓度接近54μg/ml时结核分枝杆菌分离株ATCC 27294的生存力下降(图10A)，而当CB-18的浓度接近27μg/ml时结核分枝杆菌分离株571/573-BAL的生存力下降(图11A)。培养基中含有抗生素时，当CB-18的浓度接近27μg/ml时ATCC 27294的生存力下降(图10B)，当CB-18的浓度接近13μg/ml时571/573-BAL的生存力下降(图11B)。显然，该***对CB-18浓度的改变非常敏感。用这种敏感性能轻易地解释实验与实验间的易变性。

当CB-18的浓度接近27μg/ml时鸟分枝杆菌分离株ATCC 25291的生存力下降(图12A)，而鸟分枝杆菌复合体(MAC)分离株802-BAL的生存力在试验浓度下不受影响(图13A)。培养基中含有抗生素时，当CB-18的浓度接近13μg/ml时ATCC 25291的生存力下降(图12B)，当CB-18的浓度接近27μg/ml时802-BAL的生存力下降(图13B)。在27μg/ml时曲线开始平台期，因为三个瓶中只有一个成为阳性(图13B)。此外，该***对CB-18浓度的改变敏感。

当CB-18的浓度接近109μg/ml时两种偶发分枝杆菌分离株(ATCC 6841和495-JHH)的生存力都下降(分别图14A和图15A)。培养基中含有抗生素时，当CB-18的浓度接近54μg/ml时ATCC 6841的生存力下降(图14B)，当CB-18的浓度接近27μg/ml时495-JHH的生存力下降(图15B)。

速生菌作为一种组群，似乎对单独CB-18的作用更有抗性，但当与抗生素组合时显示最佳协同作用。例如，495-JHH在109μg/ml CB-18时存活，但在P-cft存在下在13-27μg/ml时下降(图15A和图15B)。此外，571/573-BAL在13μg/ml CB-18时存活，但在P-cax存在下在7-13μg/ml时生存力下降(图11A和图11B)。

两种速生菌的结果是由如下观点产生的有趣的结果：Connell，N.D.等人在《结核病.发病机理、保护及控制》Bloom，B.R.编，ASM出版社，Washington，D.C.(1994)第333-352页中将速生菌对头孢菌素的抗性归因于通透性。如果如实施例9所述，CB-18以某种方式影响通透性，那么此结果是可以预料的。

表7*筛选的分枝杆菌种
									ID		NALC/NaOH			CB-18			结果与评语
	培养物			培养物
						涂片	液体	固体			涂片	12B	7H11
ATCC27294	MTB	NA	NA	NA	NA									NA	NA	在27-54μg/ml单独CB-18时，及抗生素存在下在13-27μg/ml时，生存力下降
						573-BAL	MTB	1+	/28		3+		/20				在13-27μg/ml单独CB-18时，及抗生素存在下在7-13μg/ml时，生存力下降
ATCC25291	M.av1	NA	NA	NA	NA									NA	NA	在13-27μg/ml单独CB-18时，及抗生素存在下在7-13μg/ml时，生存力下降
						802-BAL	MAC		/10	/ll	1+		/20				试验水平的单独CB-18不影响生存力，抗生素存在下13-27μg/ml时生存力下降
ATCC6841	M.fo2	NA	NA	NA	NA									NA	NA	在高于109μg/ml水平的单独CB-18时，及抗生素存在下在27-5μg/ml时，生存力下降
						495-JHH	M.fo		/		±		/14				在高于109μg/ml水平的单独CB-18时，及抗生素存在下在13-27μg/ml时，生存力下降

*涂片值根据CDC指南报告。阳性培养物表示为“”符号随后是一个数字。该数字代表阳性结果总天数。阴性培养物用“”符号突出。受污染的斜面用“cont.”符号标记，经受再消化的液体培养物用“^”符号标记。ATCC 27294株并非来自于CB-18预试验。因而，培养结果无效(“NA”)。¹M.av为鸟分枝杆菌。¹M.fo为偶发分枝杆菌。

由这些数据可得出几点。第一，似乎存在CB-18的最小有效浓度：低浓度的CB-18没有诱发的作用，但高浓度的CB-18是杀细菌剂(甚至在无添加的抗生素时)。诱导能力取决于分枝杆菌种以及分离株本身。实施例6MTB分离株和抗生素的表征

由实施例2、3和5得出的主要结论是，CB-18使正常情况下不敏感的某些分枝杆菌对抗生素变得敏感。在分离株和抗生素方面检查了该现象的广泛性。在有无CB-18的情况下对于不同β-内酰胺抗生素检验了来自CB-18预试验(实施例2)的几种分离株。在一系列附加实验中，检验了其它(即，非β-内酰胺)抗生素。

图16概述了用来试验不同MTB分离株的实验设计。在7H11选择性斜面上培养这些分离株(表8)，并用NALC/柠檬酸连续稀释为大约10,000×。通过用缓冲液或0.5mM CB-18(终浓度)进一步稀释制备转种溶液(即，最终稀释度(约50,000×))。然后将每一系列一式两份(每份400μl)转种于BACTEC 12B瓶中，瓶中添加了重建液(R.F.)、PANTA或用以下头孢菌素强化的PANTA：8μg/ml终浓度的头孢噻甲羧肟(“P/caz”)、16μg/ml终浓度的头孢哌酮(“P/cfp”)(Sigma，St.Louis，MO，目录#：C-4292：在水中以72mg/ml制备头孢哌酮，并以类似于对于头孢噻甲羧肟所述的方式(实施例1)加入)、8μg/ml终浓度的头孢曲松(“P/cax”)(Sigma，St.Louis，MO，目录#：C-5793：在水中以36mg/ml制备头孢曲松，并以类似于对于头孢噻甲羧肟所述的方式(实施例1)加入)或8μg/ml终浓度的头孢西丁(“P/cft”)(Sigma，St.Louis，MO，目录#：C-4786：在水中以36mg/ml制备头孢西丁，并以类似于对于头孢噻甲羧肟所述的方式(实施例1)加入)。此外，温育期间CB-18的终浓度约为17μg/ml。定期检查培养瓶，记录生长指数。平均特定系列的生长指数，并对培养天数作图。

筛选出11个分离株(包括ATCC 27294株)。表8总结了使用的10个临床分离株和试验结果。图17-27显示代表性分离株。对于试验中的行为而言，这些分离株中存在显著的差异。

表8*筛选的MIB分离株
								ID	NALC/NaOH			CB-18			结果与评语
	培养物			培养物
						涂片	液体		固体	涂片	12B	7H11
ATCC27294	NA	NA	NA	NA	NA								NA	如果有的话，CB-18诱导的对所试抗生素的敏感性最小，然而，CB-18加剧cax敏感性。
						571-BAL	1+	/28	/42	1+		/cont.			CB-18诱导的对所试所有抗生素的敏感性惊人(与573-BAL相同的Pt.)。
573-BAL	1+	/28		3+									/20	CB-18诱导的对所试所有抗生素的敏感性惊人(与571-BAL相同的Pt.)。
						535-BAL	4+	/3	/28	4+	/3	/11			CB-18诱导的对所试抗生素的作用最小：cax敏感性不依赖于CB-18.
896-BAL	4+	/1	/14	4+	/1								/5	如果有的话，CB-18诱导的对所试抗生素的敏感性最小，然而，CB-18轻微加剧cax敏感性，菌株为广谱抗药性：INH、RIF和PZA。
						040-TBR		/29	/42	1+	/14/				CB-18诱导的对所试大多数抗生素的敏感性较小，然而，C8-18显著加剧cax敏感性。
061-1BR		/29	/35	2+	/10								/19	如果有的话，CB-18诱导的对所试抗生素的敏感性较小，然而，CB-18加剧cax敏感性。菌株为INH抗性。
						512-JHH	2+	/4		4+	/3	/12			CB-18诱导的对所试大多数抗生素的敏感性较小(与538-JHH相同的Pt.)。
538-JHH		/31	/33	2+									/49	CB-18诱导的对所试大多数抗生素的敏感性较小(与512-JHH相同的Pt.)。
						52-96-BOL	1+	/25	/27	1+		/39			CB-18诱导的对所试大多数抗生素的敏感性较小，然而，CB-18显著加剧cax敏感性。
57-96-BOL	1+	/25	/27	3+									/25	对大多数抗生素的敏感性适中，CB-18诱导的对大多数抗生素的敏感性也适中。菌株为MDR。

*涂片值根据CDC指南报告。阳性培养物表示为“”符号随后是一个数字。该数字代表阳性结果总天数。阴性培养物用“”符号突出。受污染的斜面用“cont.”符号标记，经受再消化的液体培养物用“”符号标记。ATCC 27294株并非来自于CB-18预试验。因而，培养结果无效(“NA”)。除了在CB-18与P/cax组合时有较小延迟外，ATCC 27294在CB-18诱导的敏感性方面显示很小的差异或没有差异(图17A和图17B)。这些结果与以前检验P/caz(比较图2F与图17B)和P/cax(比较图7B与图17B)的数据一致。在图7B中而不是在图17B中观察到诱导的对PANTA敏感性的明显差异，这或许是如实施例5所述实验之间CB-18浓度改变的结果。

571-BAL(图18A和图18B)和573-BAL(图19A和图19B)都再次显示对所试所有药物的敏感性的显著诱导。只有当抗生素与CB-18组合时，才有对571/573-BAL的协同有害作用。

类似于ATCC 27294，535-BAL分离株不受此浓度CB-18的影响，然而，P-cax影响该分离株(图20A和图20B)。对INH、RIF和PZA有抗性的896-BAL分离株的行为也类似于ATCC 27294(比较图17A和17B与图21A和21B)。分离株040-TBR和52-96-BOL在某种程度上受CB-18影响，然而，在这两种分离株中CB-18的存在显著影响对cax的敏感性(分别见图22A和22B、图26A和26B)。相反，061-TBR和57-96-BOL分离株在无CB-18时被所有抗生素影响，然而，CB-18的存在加剧抗生素的有害作用(分别见图23A和23B、图27A和27B)。

512-JHH和538-JHH对(分别见图24A和24B、图25A和25B)是有趣的，这是由于以下观点：在CB-18预试验过程中，当接触CB-18时一种是自然的(512-JHH)，而另一种在抗结核菌素治疗时接触CB-18(538-JHH)。处理来自该患者中的4个标本(表9)。第一个标本于1996年2月8日提交，在必须遵循的24小时报告时间内报告为涂片阳性，在提交4天内呈现AFB培养阳性。在最初标本之后10天、从培养瓶中分离AFB之后大约1周、患者开始药物治疗后5天提交来自该患者的第二个标本(572-JHH)。在药物治疗开始后提交的三个标本都是CB-18/12B/PANTA/caz阴性的，只有两个(538-JHH和541-JHH)在7H11斜面上为阳性。尽管在任何这些CB-18/12B/PANTA/caz差异中污染不起作用，但527-JHH具有4个提交物中最低涂片值的事实可以解释有差异的7H11结果；然而，538-JHH在固体培养基上的明显延迟(即49天)，对于涂片阳性标本来说是异常的。虽然用NALC/NaOH处理的类似标本相对于最初标本也延迟，但CB-18似乎显著影响治疗中该分离株的生存力。这与实施例3的讨论和图3所示系列(比较图3B与图3F、图3D与图3H)一致，并且提出甜菜碱样去污剂作为治疗佐剂的临床应用。

表9*来自一名患者的结核分枝杆菌分离株
									ID		NALC/NaOH			CB-18			评语
	培养物			培养物
						涂片	液体	固体			涂片	12B	7H11
512-JHH	MTB	2+	/4		4+									/3	/12	2/8/96-自然的
						527-JHH	MTB		/24		±						2/17/96-治疗
538-JHH	MTB		/31	/33	2+										/49	2/27/96-治疗
						541-JHH	MTB		/31	/33	2+		/20				2/27/96-治疗

*涂片值根据CDC指南报告。阳性培养物表示为“”符号随后是一个数字。该数字代表阳性结果总天数。阴性培养物用“”符号突出。

图16的实验设计也用来检验CB-18效应对于其它非β-内酰胺抗生素的广泛性。在这些实验中，在水或缓冲液中将抗生素(Sigma，St.Louis，MO)制备为贮存液，然后用重建液稀释，并在接种前加入培养瓶中。对ATCC27294、571/573-BAL、061-TBR、52-96-BOL和57-96-BOL试验制霉菌素(100μg/ml终浓度)、多粘菌素B(300单位终浓度)、红霉素(4μg/ml终浓度)、竹桃霉素(2μg/ml终浓度)、青霉素G(8μg/ml终浓度)、萘啶酮酸(30μg/ml终浓度)、林可霉素(2μg/ml终浓度)、头孢曲松(32μg/ml终浓度)和头孢噻甲羧肟(16μg/ml终浓度)(在10％碳酸氢钠中制备头孢噻甲羧肟)。所有实验都用R.F.和P-caz作为对照，加入CB-18的所有培养瓶都使用17μg/ml的终浓度。图28显示应用红霉素和头孢曲松的571/573-BAL分离株的结果。图29显示应用多粘菌素B、竹桃霉素、林可霉素、萘啶酮酸、青霉素G和头孢曲松的061-TBR的结果。图30显示应用萘啶酮酸、青霉素G、头孢噻甲羧肟和头孢曲松的57-96-BOL的结果。

这些结果表明，CB-18效应取决于分离株和抗生素两者。有趣的是，16μg/ml终浓度的单独的头孢噻甲羧肟(即不合PANTA)是最有害的化合物之一。结论

这些结果突出了结核分枝杆菌复合体关于抗微生物敏感性的微观不均一性。尽管与这些观察有关的机制尚未确定，但CB-18似乎使根据敏感性对结核分枝杆菌分离株的高度辨别力成为可能。这一信息可用来预测治疗分枝杆菌感染尤其是MTB感染的更成功的治疗方案。另外，CB-18诱导敏感性的事实提示该化合物本身也可能是一种有用的治疗佐剂。

“CB-18效应”，即诱导敏感性的能力，取决于甜菜碱样去污剂(例如CB-18)、抗生素和分离株的动态相互作用。甜菜碱样去污剂的最有效浓度应该取决于甜菜碱样去污剂本身，并且能用本发明的筛选方法确定。实施例7筛选去污剂和其它甜菜碱样结构

为了试图延伸实施例6的发现，发展了一种试验来筛选CB-18的结构相应物。表10列出了在图31概述的试验中使用的去污剂。由于571/573-BAL分离株对敏感性诱导的敏感度，将其用作这些筛选实验中的报道株。在7H11选择性斜面上培养571/573-BAL分离株，并用NALC/柠檬酸盐连续稀释为约10,000×。通过用缓冲液、0.5mM CB-18或适当去污剂进一步稀释制备转种溶液(即，最终稀释度(约50,000×))。将所有去污剂在1∶1异丙醇∶水中制备为100×浓缩液，在特定实验系列中用作最终稀释剂。

每种去污剂的终浓度，使得得到的12B瓶含有约17μg/ml终浓度的特定去污剂。用缓冲液进行每一实验系列，并将CB-18转种对照一式两份(每份400μl)转种于BACTEC 12B瓶中，瓶中含有重建液(R.F.)、或是PANTA或添加了8μg/ml终浓度的头孢曲松的PANTA(“P/cax”)。一次试验5-7种去污剂。将含有MTB细胞的每种稀释的去污剂一式两份(每份400μl)转种于添加了PANTA或P/cax的BACTEC 12B瓶中。几乎所有去污剂都试验两次。定期检查培养瓶，并记录生长指数。平均特定系列的生长指数，并对培养天数作图。

表10总结了检测的去污剂及其结果。下列去污剂从Aldrich化学品公司(Milwaukee，WI)获得：苄基二甲基-硬脂酰氯化铵(目录#：22,901-6)、苄基二甲基-十四烷基氯化铵(目录#：29，279-6)和十八烷基三甲基溴化铵(目录#：35，924-6)。下列去污剂从Sigma化学品公司(St.Louis，MO)获得：混合的溴化烷基三甲基铵(目录#：M-7635)、软脂酸(目录#：P-0500)、硬脂酸(目录#：S-4751)、CHAPS(目录#：C-3023)、脱氧胆酸(目录#：D-6750)、SB-18(C₁₈-磺丙基甜菜碱)(目录#：0-8004)、Brij 97(油烯基(聚氧乙烯)₁₀)(目录#：P-6136)和Brij56(鲸蜡基(聚氧乙烯)₁₀)(目录#：P-5759)。吐温80(油酸的聚氧乙烯山梨聚糖酯)(目录#：1334 875)从Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)获得。订制的去污剂包括：C₁₈-羧乙基甜菜碱、C₁₈-磺丁基甜菜碱、C₁₆-羟丙基磺基甜菜碱、C₁₆-酰胺丙基硫酸甜菜碱，它们由Ecochem Research，Inc.(Chaska，MN)合成，以及作为礼物从KAO基础研究所(Tochigi，日本)获得的C₁₆-AHTMAP(一种反向甜菜碱)。化学甜菜碱(chembetaine)-S(大豆酰胺丙基羧甲基甜菜碱)作为样品从Chemron公司(Paso Robles，CA)得到。DeTaine PB(鲸蜡基羧甲基甜菜碱)作为样品从DeForest，Inc.(Boca Raton，FL)获得。Hetaine CLA(carola酰胺丙基羧基甜菜碱)作为样品从Heterene，Inc.(Paterson，NJ)获得。Rewoteric AM R-4(牛脂甘氨酸酯)作为样品从Sherex化学品公司(Dublin，OH)获得。Schercotaine IAB(硬酯酰酰胺丙基羧基甜菜碱)和Schercoatine WOAB(麦芽酰胺丙基羧基甜菜碱)作为样品从Scher Chemicals，Inc.(Clifton，NJ)获得。Velvetex OLB-50(油烯基羧甲基甜菜碱)作为样品从Henkel公司，Emory Group Cospha(Hoboken，NJ)获得。Crosultaine E-30(埃勒克纤维酰胺丙基(erucamidopropyl)羟丙基磺基甜菜碱)作为样品从Croda，Inc.(Parsippany，NJ)获得。Mackamine 02(氧化油酰胺)作为样品从McIntyre Group，LTD.(University Park，IL)获得。

图32A显示了这些实验的对照，图32B显示了代表性去污剂的结果。在图32A中，将来自所有8个实验的每一对照系列的双份瓶平均并作图，以显示与抗生素(◆-PANTA，▲-P/cax)、CB-18( -单独的CB-18)及两者组合(□-CB-18/PANTA，●-CB-18/P-cax)影响有关的结果的趋势。图32B中所见的生长曲线是基于来自两个实验的双份瓶的平均值，该实验中将细胞转种于添加了P/cax的BACTEC 12B瓶中的各自去污剂中。

如前所示，在无CB-18时PANTA或P/cax的存在不影响或最小影响571/573-BAL(比较图3A、3E、8A和18A/19A与图32A)。此外，单独的CB-18对571/573-BAL株的生长特征有影响，CB-18与抗生素的组合是协同有害的，其中P/cax提供最大的生长抑制(图32A：

-单独的CB-18，□-CB-18/PANTA，●-CB-18/P-cax)。

此外，关于去污剂的结构结果中有显著的多样性。总之，所试的所有季铵盐在该浓度非常有活性，在试验中完全抑制生长(表10)。另外，所试的阴离子脂肪酸或胆盐对生长都没有任何影响。

显示活性的羧基甜菜碱只是那些未修饰的羧基甜菜碱。例如，其中酰胺丙基被用来连接烷基链与阳离子(表1中的“α”)的羧基甜菜碱在该试验中不显示活性。此外，当与抗生素组合时无组分的羧基甜菜碱显示强烈的抑制生长的能力，尤其是C₁₈-羧乙基甜菜碱(CB-18的乙基桥相应物)。用C₁₈-羧乙基甜菜碱对ATCC 27294的进一步研究显示非常窄的活性范围(约7-13μg/ml)。图32A和图32B显示当在该试验中使用含亚甲基(Detain PB和Velvetex OLB)、乙烯(C₁₈-羧乙基甜菜碱)和丙烯(CB-18)桥的简单(即未修饰的)羧基甜菜碱时的变异性。这与Tsubone，K.等人，药物科学杂志80：441-44(1991)的数据一致，其中毒性与桥长度相关。

“其它”种类的甜菜碱样去污剂显示混杂的结果。反向甜菜碱或硫酸甜菜碱(例如，-SO₄ ^)都不抑制生长。四种磺基甜菜碱(-SO₃ ^)中只有一种(即，Crosultaine E30)、三种非离子去污剂中有两种(Brij 56和Brij 97)及所试的一种氧化胺(氧化油酰胺)能显著抑制生长(表10)。

尽管根据这些化合物在抗微生物制剂中的应用可预见氧化酰胺的明显的杀菌活性(Michaels，E.B.，美国专利564，454和美国专利641,728)，但Brij化合物和Crosultaine E-30的活性仍是惊人的。除了CrosultaineE-30，在该试验中似乎具有显著活性的其它磺基甜菜碱只有SB-18。用SB-18对571/573-BAL的进一步研究显示非常广的活性范围(约20-75μg/ml)。其它磺基甜菜碱都含有酰胺丙基键或羟丙基桥，表明类似于羧基甜菜碱，对主链结构的修饰似乎妨碍在此所述的活性。CrosultaineE-30既有酰胺丙基键又有羟丙基桥。尽管Brij化合物没有对主链的修饰，但预计这些试剂能刺激生长。历史上，曾报导非离子去污剂被杂质污染，只有纯化后才能刺激生长(Dubos，R.J.等人，实验医学杂志(Jour.Exptl.Med.)83：409-423(1946))。杂质可解释应用Brij去污剂和Crosultaine E-30的结果。

这些数据提出了观察到的作用是由一种杂质引起的这一可能性。然而，提供的CB-18纯度约为98％(个人通信，Bob Carlson，Ecochem Research，Inc.，Chaska，MN)。因此，任何杂质在约0.34μg/ml时都必须在这些试验中起作用(假定添加的CB-18的2％是一种杂质，则17μg/ml的2％约为0.34μg/ml)。在该试验中TMA-18在低浓度时是抑制性的，10倍于以上浓度(图7C和图8C)。此外，尽管许多可商业获得的甜菜碱可被合成机制产生的季盐污染(例如，前体或合成副产物)，但在CB-18合成期间形成季盐的可能性是非常不可能的(个人通信，Bob Carlson，EcochemResearch，Inc.，Chaska，MN)。此外，在根据Weers，J.等人，Langmuir7：854-867(1991)或Kazuo(JP 8125139)的改进方法进行的CB-18合成过程中所产生的预期副产物，应预计无毒性(个人通信，Bob Carlson，Ecochem Research，Inc.，Chaska，MN)。

这些实验(图32B)也显示，吐温80在17μg/ml(13μM)时对571/573-BAL分离株无影响。Hui，J.等人，抗微生物剂化学治疗11：773-779(1977)改变吐温80的浓度，显示直到约0.005％(50μg/ml(38μM))才达到对利福平的敏感性诱导。更重要的是，较高浓度的吐温80(高达0.05％(500μg/ml(380μM)))仅用来刺激生长。Stinson，M.W.等人，美国呼吸道疾病综述104：717-727(1971)报导在1％(10mg/ml(7.69mM))时达到最大刺激，而高达10％的量(100mg/ml(76.9mM))没有其它的优越性，但也无抑制性。向培养基中添加吐温80也许是本世纪在分枝杆菌学中最重要的诊断进展，因为它引起“快速”生长(Dubos，R.等人，实验医学杂志83：409-423(1946))。Yamori，S.等人，微生物学与免疫学35：921-926(1991)报导了当从0％到0.5％到2％滴定吐温80时对某些药物敏感性模式的改变。ODAC(一种培养添加剂，含有BSA、NaCl、葡萄糖、过氧化氢酶和油酸)的存在引起与吐温80组合时敏感性的显著改变。另一方面，CB-18在约3-7μg/ml时不引起生长的改变，但在13-27μg/ml时引起生长的完全抑制(图10A和图11A)。

从这些实验中得出的结论是，多种甜菜碱样去污剂可用于本发明的方法中，敏感性诱导随甜菜碱样结构而变。每种甜菜碱样去污剂必须为与本发明的方法结合使用而优化。通过将不同抗生素与不同甜菜碱样去污剂组合，特别高度的区分分离株的辨别力是可能的。

表10
		去污剂	结果
阳离子去污剂
		苄基二甲基硬脂酰氯化铵	完全的生长抑制
苄基二甲基十四烷基氯化铵	完全的生长抑制
		混合的烷基三甲基溴化铵	完全的生长抑制
十八烷基三甲基溴化铵	完全的生长抑制
		阴离子去污剂
软脂酸	无影响
		硬脂酸	无影响
胆盐
		CHAPS	无影响
脱氧胆酸	无影响
		羧基甜菜碱
C18-羧乙基甜菜碱	完全的生长抑制
		化学甜菜碱-S(大豆酰胺丙基羧甲基甜菜碱)	无影响
DeTaine PB(鲸蜡基羧甲基甜菜碱)	强烈的生长抑制
		Hetaine CLA(canola酰胺丙基羧基甜菜碱)	无影响
Rewoteric AM R-4(牛脂甘氨酸酯)	无影响
		Schercotaine IAB(硬酯酰酰胺丙基羧基甜菜碱)	无影响
Schercotaine WOAB(麦芽酰胺丙基羧基甜菜碱)	无影响
		velvetex OLB-50(油烯基羧甲基甜菜碱)	非常强烈的生长抑制
其它甜菜碱
		C16-AHTMAP(反向甜菜碱)	无影响
C18-磺丁基甜菜碱	轻微的生长延迟
		C16-羟丙基磺基甜菜碱	轻微的生长延迟
C16-酰胺丙基硫酸甜菜碱	无影响
		Crosultaine E-30(埃勒克纤维酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱)	强烈的生长抑制
SB-18(C18-磺丙基甜菜碱)	适度的抑制
		Mackamine 02(氧化油酰胺)	完全的生长抑制
非离子去污剂
		吐温80(油酸的聚氧乙烯山梨聚糖酯)	无影响
Brij 97(油烯基(聚氧乙烯)10)	非常强烈的生长抑制
		Brij 56(鲸蜡基(聚氧乙烯)10)	非常强烈的生长抑制

CB-18效应与EDTA

实施例4显示CB-18的作用不同于TMA-18，图32B显示CB-18的作用不同于吐温80。试验不同甜菜碱样去污剂的结果提示，未修饰的结构可能是最有用的(表10)。为了试图进一步区别CB-18效应与其它效应物如金属螯合剂(例如，EDTA)，进行了图33所述的实验。

EDTA通过提取并螯合稳定细胞壁结构的二价金属阳离子而改变细菌的通透性。Rastogi，N.等人，抗微生物剂化学治疗34：759-764(1990)报导，在1mM EDTA(372.5μg/ml)中培养分枝杆菌的尝试对生存力有显著影响。假定甜菜碱根据其配位水的能力而以盐的形式溶解(Tsujii，K.等人，物理化学杂志(Jour.Phys.Chem.)82：1610-1614(1978))，则引出CB-18效应是该化合物螯合活性的结果这一可能性。

为了试图区分CB-18效应与金属螯合剂如EDTA的作用，发展了一种试验来剖析CB-18的作用(图33)。在7H11选择性斜面上培养ATCC 27294和571/573-BAL分离株，然后将每一种用NALC/柠檬酸盐连续稀释为约10,000×。通过用缓冲液、0.5mM CB-18、含2.5mM MgCl₂的0.5mM CB-18或0.5mM EDTA(Life Technologies，Gaithersburg，MD)进一步稀释制备转种溶液(即，最终稀释度(约50,000×))。温育期间CB-18和EDTA的终浓度约为17μg/ml，温育期间MgCl₂的浓度约为85μg/ml。将每一实验系列一式三份(每份400μl)转种于BACTEC 12B瓶中，瓶中含有重建液(R.F.)或添加了8μg/ml终浓度的头孢曲松的PANTA(“P/cax”)。定期检查培养瓶，并记录生长指数。将特定系列的生长指数平均后对培养天数作图。图34A和图34B显示ATCC 27294分离株的结果，图35A和图35B显示571/573-BAL分离株的结果。

EDTA在所用浓度对任一分离株的生长特征都没有影响(图34B和图35B)。在这些实验中使用的EDTA浓度比Rastogi，N.等人，抗微生物剂化学治疗34：759-764(1990)所用的浓度几乎低22倍(372μg/ml对17μg/ml)。

这些实验中最令人感兴趣的方面是CB-18/MgCl₂组合。支持该实验的假说是，如果CB-18能螯合MgCl₂，则该相互作用或许能(在某种程度上)中和CB-18的作用。ATCC 27294分离株不受单独的CB-18影响(图34A：即，无MgCl₂时)，而571/573-BAL分离株被单独的CB-18抑制(图35A)。加入5倍摩尔过量的MgCl₂不显示571/573-BAL生长特征的改善(图35B)。在单独的P/cax存在下ATCC 27294或571/573-BAL都不显示加剧的延迟；然而，在CB-18存在下P/cax再次显示为协同有害的，对于571/573-BAL分离株更是如此(图34A和图35A)。向CB-18/P-cax组合中加入MgCl₂似乎在某种程度上减轻了CB-18/P-cax组合的有害作用(图34B和图35B)，尤其是CB-18/P-cax对571/573-BAL的作用。如果MgCl₂不减轻不合P-cax时的CB-18效应，但MgCl₂减弱在P-cax存在下的敏感性，那么MgCl₂肯定妨碍P-cax的作用。由于头孢曲松(cax)作为二钠盐出售，所以该抗生素具有负的净电荷(即-2)并且应能与MgCl₂相互作用。

Tsubone K.，药物科学杂志80：1051-1054(1991)显示，在不同磷酸甜菜碱的螯合活性与抗微生物活性之间一般存在很小的相关性或不存在相关性。这与CB-18效应不是螯合金属离子的后果这一发现相一致。实施例8分枝杆菌敏感性试验与CB-18效应

进行敏感性试验有多种方法。当前使用的标准方法包括：(a)平板扩散试验，(b)肉汤微量稀释法，(c)琼脂梯度，和(d)快速自动化仪器法。在这些方法中改变药物的浓度并描述生长特征。已知接种体的量十分影响敏感性试验的结果。

当代的分枝杆菌学敏感性试验按照如Vestal，A.L.疾病控制中心，[***，教育与福利出版号(CDC)76-8230]第97-115页(1975)所述的1％比例法。其特征在于将对照稀释100倍(100×)并将在抗结核菌素存在下的生长与对照相比较。如果1％或更多的接种体对药物有抗性，则所研究的分离株的生长将等同于或高于对照。若分离株是敏感的，或低于1％的接种体是抗性的，则其生长将弱于对照。

结核敏感性试验中的黄金标准是BACTEC^S.I.R.E或BACTEC^PZA试验(Becton Dickinson，Cockeysville，MD)。这是一种自动化肉汤法(Snider，D.E.等人，美国呼吸道疾病综述123：402-406(1981)；Siddiqi，S.H.等人，临床微生物学杂志13：908-912(1981)；Vincke，G.等人，抗微生物化学治疗杂志(Jour.Antimicrob.Chemther.)10：351-354(1982)；Roberts，G.D.等人，临床微生物学杂志18：689-696(1983)；及Tarrand，J.J.等人，临床微生物学杂志21：941-946(1985))。产品标签说明，对照生长指数(GI)超过30(GI_t＝0)后，在下一天读取培养瓶(GI_t+1)并确定这两天之间的差异(GI_t+1-GI_t＝ΔGI_对照)。在相同的这两天读取含试验药物的培养瓶，并用相同方法确定对于药物的ΔGI_药物。若ΔGI_对照＞＞ΔGI_药物，则认为分离株是敏感的。若ΔGI_对照≥ΔGI_药物，则认为分离株是临界的。若ΔGI_对照＜ΔGI_药物，则认为分离株是抗性的。Heifets，L.，抗微生物剂化学治疗40：1759-1767(1996)说明，8天的培养期间药物存在下的GI不应超过50(当含药物的培养瓶中接种体为10⁴-10⁵ cfu/ml时)。

为了试图将此处的发现与S.I.R.E.试验中所用的比例法相关联，进行图36所述的实验。该实验设计是用来估计分枝杆菌敏感性试验的当前方法与使用甜菜碱样去污剂观察到的结果之间的相关性。例如，含MacFarland药物瓶的对照为100×-R.F.瓶；10×稀释药物瓶的对照为1,000×-R.F.瓶；100×稀释药物瓶的对照为10,000×-R.F.瓶。

在该实验中，ATCC 27294和571/573-BAL结核分枝杆菌分离株都在7H11选择性培养基上培养2周。刮下细胞，将其悬浮于NALC/柠檬酸盐中，超声处理60秒，然后静置。将溶液调节为0.5 MacFarland标准，以10倍梯度连续稀释10,000倍。

除10,000×稀释度之外，将每一稀释系列一式两份转种于7H11中进行菌落计数，然后一式两份接种于培养瓶中，瓶中含有R.F.、含8μg/ml终浓度头孢曲松的PANTA(P-cax)、含有15μg/ml(或30μg/ml或60μg/ml)的单独CB-18或与P-cax组合的CB-18(15μg/ml、30μg/ml或60μg/ml的CB-18)。将10,000×稀释液一式两份转种于7H11上，并一式两份接种于含R.F.或仅含P-cax的瓶中。

菌落计数使对于每种分离株的0.5 MacFarland标准估计成为可能。然后用这些估计值近似为每一稀释度接种于12B瓶中的cfu数。以下显示了对于每一系列转种的cfu数。图37A-37E显示ATCC 27294分离株的结果，图38A-38E显示571/573-BAL分离株的结果。

稀释度	转种于12B中的cfu
			ATCC 27294	571/573-BAL
	0.5 MacFarland	6.28±0.57×105			1.11±0.18×106
10×			62,800±5,700	111,000±17,900
	100×	6,280±570			11,100±1,790
1,000×			628±57	1,110±179
	10,000×	63±6			111±18

在高输入时(＞1×10⁵ cfu)，ATCC 27294型菌株和571/573-BAL分离株的生长曲线都显示异常的模式(图37A和图38A)。第一周中，甚至在30μg/ml CB-18时分离株的生长也未受妨碍。然而在含有P-cax的30μg/mlCB-18时，两种分离株在第一周后都显示异常的延迟。在60μg/ml CB-18时(在有或无抗生素时)，两种分离株都生长，但以一种异常方式生长：两者最初都开始生长，但然后逐渐停止。只有ATCC 27294分离株曾经恢复。

BACTEC试验使用¹⁴CO₂释放试验。由于以每天为基础读取培养瓶，所以在前两周中应从瓶中清除由于代谢而释放的¹⁴CO₂。天与天之间GI的差异是自最后一次读取后产生的新¹⁴CO₂的反映。只有前两周以每天为基础读取培养瓶，阳性GI表示生长，但非指数升高的GI表示没有新的生长。两周后，每3-5天读取培养瓶。此段时间内GI累积。无论如何，使用上述ΔG标准，在用MacFarland标准作为接种体的情况中，没有一个描述分离株是敏感的或者能区别它们。因此，以超过10⁵cfu接种培养瓶达不到预期目标，也就是说，是不予推荐的。

对10×稀释度的分析开始显示易读的结果。报导在P-cax存在下两种分离株都在60μg/ml CB-18时敏感。报导在P-cax存在下只有571/573-BAL分离株在30μg/ml CB-18时敏感。

稀释系列的延续显示，在100×稀释度时认为在P-cax存在下ATCC27294分离株在30μg/ml CB-18时敏感。使用该接种体，报导在P-cax存在下571/573-BAL分离株在15μg/ml CB-18时敏感。1,000×稀释度的检验显示，结果与100×稀释度时相同，但在最后两种条件下(即，100×和1,000×)571/573-BAL分离株的生长曲线非常类似于较早的曲线(图5A-5F和图11)。

从这些实验中得出的结论有两层。第一，能区别ATCC 27294和571/573-BAL，但不是在所有条件下都能区别。第二，试验的下限是一个生物，尽管另一方面，超过10⁵的细菌加量将使***超负荷。100-10⁴个杆菌的输入水平产生可读的结果，其使分离株的辨别成为可能，10³-10⁴个杆菌的接种体将以适时的方式提供可报告的结果。实施例9分枝杆菌的通透性与CB-18效应

关于CB-18发挥作用的机制的一种可能性与分枝杆菌的通透性有关。不是为了支持下列假说，下列说明只是作为一种手段来阐明本发明的应用：甜菜碱样去污剂可改变含有分枝菌酸结构的细菌的通透性，由此使该细菌变得对抗生素更加敏感。特别地，CB-18效应可能是分枝菌酸结构构象分布改变的结果。

这主要基于Yuan，Y.等人，国家科学院院报93：12828-12833(1996)的工作。总之，某些分枝杆菌具有改变其细胞壁流动性的能力(Liu，J.等人，生物化学杂志271：29545-29551(1996))。这是通过改变分枝菌酸的长度、改变分枝菌酸结构构象的组成或通过这两者而实现的。换句话说，细胞壁分枝菌酸的长度和结构构象都影响细胞壁的熔解温度。例如，当分枝菌酸的长度改变时，或者当反式比顺式双键的比例改变时，或者当环丙烷、羟化、甲基化和羰基的数量和/或构象改变时，分枝菌酸的熔解温度也改变(Barry，C.E.等人，生物化学杂志271：29545-29551(1996))。例如在耻垢分枝杆菌中，当生长温度升高时，分枝菌酸近端双键中反式链烯的比例也相应提高，这又与这些脂的熔解温度的升高(即，流动性的降低)相关联。在结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌中，当近端位置中反式环丙烷的比例提高时，这些分枝菌酸的熔解温度也相应提高。

据认为分枝杆菌细胞壁的流动性在通透性中起重要作用，因而有抗性(Yuan，Y.等人，国家科学院院报92：6630-6634(1995)；Brennan，P.J.等人，生物化学年述64：29-63(1995))。龟分枝杆菌对头孢菌素的抗性被认为只是由于通透性(Connell，N.D.等人，于：《结核病，发病机理、保护及控制》，Bloom，B.R.编，ASM出版社，Washington，D.C.(1994)第333-352页)。例如，Barry，C.E.等人，生物化学杂志271：29545-29551(1996)显示，当耻垢分枝杆菌细胞壁的流动性降低时(即，当反式链烯的百分数升高时)，诺氟沙星和鹅脱氧胆酸盐的摄取也都降低。Kaneda，K.等人，普通微生物学杂志(Jour.Gen.Microbiol.)134：2213-2229(1988)显示，在高度抗药性速生菌中，大多数近端双键是反式链烯。

不同分枝菌酸构象的产生主要通过一系列结构相关的依赖S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的酶来完成。分子分析显示，在结核分枝杆菌中存在四种结构相关的基因，它们编码负责许多这种修饰的甲氧基分枝菌酸合酶(MMAS)(Yuan，Y.等人，国家科学院院报93：12828-12833(1996))。这四种基因产物(MMAS-1、MMAS-2、MMAS-3和MMAS-4)都显示与大肠杆菌环丙烷脂肪酸合酶(CFAS)及麻风分枝杆菌和结核分枝杆菌环丙烷分枝菌酸合酶(CMAS-1和CMAS-2)的强烈序列同源性。暗示它们共用一种通用的机制。该机制包括SAM和一种碳鎓中间产物(图39A)。不同的产物由如下事实产生：不同合酶在各自的活性位点具有不同的电子供体/受体，产生链烯、环丙烷、甲基化和羟化与甲基化的组合(Yuan，Y.等人，国家科学院院报93：l2828-12833(1996))。

在美国专利5,610,198中，Barry，C.E.等人指出，“硫代二十四酸”(硫代脂肪酸衍生物)能用来通过这些依赖SAM的反应的抑制来抑制致病分枝杆菌中分枝菌酸的环丙烷化和氧合(图39B)。作为应用的证据试验了四种“硫代二十四酸”。总之，这些类似物的抑制机制包括其作为合酶之酶反应前半段的底物的参与(尤其是，从SAM中的甲基转移)。催化后，形成的结构是“稳定的过渡态类似物”(图39B)。本质上，该化合物不是从活性位点释放的，并作为一种典型的竞争性抑制剂。过渡态结构类似于甜菜碱样去污剂。特别地，一种基于锍的羧基甜菜碱(表1和图39B)：锍羧基甜菜碱不需要酶的催化来激活，而直接抑制依赖SAM的修饰。

在美国专利5,610,198中，Barry，C.E.等人也指出，这些硫二十四酸对腐生的分枝杆菌如耻垢分枝杆菌是无效的。与Barry等人的公开内容(美国专利5,610,198)相反，在此所述的本发明说明，这些腐生分枝杆菌对甜菜碱样去污剂的作用敏感：偶发分枝杆菌显示CB-18与所试头孢菌素之间最高程度的协同作用。例如，临床分离株495-JHH不受头孢西丁存在的影响，并能在109μg/ml CB-18存在下有某种程度地生长(图15)。然而，当头孢西丁与低至13μg/ml的CB-18组合时，在某种程度上影响生长，在27μg/ml CB-18时完全抑制。

如果甜菜碱样去污剂通过对依赖SAM的酶的作用在细胞壁流动性水平上影响分枝杆菌的通透性，则图14和图15的结果实际上就是预期的结果。该预期的基础源于偶发分枝杆菌与耻垢分枝杆菌的相似性。Dobson，G.等人，在：Goodfellow，M.等人编的《细菌分类学中的化学方法》(ChemicalMethods in Bacterial Systematics)，Academic Press，伦敦(1985)第237-265页和Brennan，P.J.等人，生物化学年述64：29-63(1995)中总结了不同分枝杆菌种的分枝菌酸分布，显示速生菌(例如，偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等)共有相似的分枝菌酸分布：主要的分枝菌酸是α’型。Liu，J.等人，生物化学杂志271：29545-29551(1996)报导，当生长温度升高时，耻垢分枝杆菌中的主要分枝菌酸酯(mycolate)变为α₁和α₂型。α₁和α₂型都长于α’型(α’＝C₆₄，α₁和α₂＝C_78-79)，α₂型具有近端反式链烯，该结构赋予细胞壁最低的流动性或最低通透性。α₂型在较高温度时占优势(α’、α₁和α₂分枝菌酸的结构都显示于George，K.等人，生物化学杂志270：27292-27298(1995))。

当回顾Yuan，Y.等人，国家科学院院报93：12828-12833(1996)对于这些依赖SAM的酶所提出的机制时(图39A)：反式链烯是依赖SAM的甲基化作用的产物，流动性与反式链烯的含量成反比，这些观察的意义变得明显。向培养基中加入CB-18可抑制反式链烯的形成，由此提高细胞壁的流动性，从而提高细胞对抗生素的通透性。一旦通透性缓解，抗生素就能更容易地进入细胞。特定抗生素的效能取决于分离株本身的性质(即，抗生素与所研究的分离株中药物作用位点的相互作用)。最终结果是观察到的CB-18效应。

如果如Liu，J.等人，生物化学杂志271：29545-29551(1996)所述，脂肪酸的依赖SAM的修饰是分枝杆菌借之调节细胞壁流动性的一种通用机制，那么预计甜菜碱样去污剂可影响大范围的分枝菌酸结构，例如，棒形分枝菌酸酯(Durand，E.等人，欧洲生物化学杂志(Eur.Jour.Biochem.)93：103-112(1979))和诺卡菌分枝菌酸酯(norcardiomycolates)。

尽管前述讨论合理地说明了在偶发分枝杆菌中观察到的头孢西丁与CB-18之间的极端协同作用(表7)，但没有解释结核分枝杆菌对甜菜碱样去污剂的极端敏感性(表8)。例如，在无抗生素时结核分枝杆菌型菌株ATCC 27294的生长在27μg/ml CB-18时受较小程度的影响，在54μg/mlCB-18时完全停止。在抗生素存在下，在13μg/ml CB-18时生长受较小程度的影响，在27μg/ml CB-18时不存在(图10)。在无抗生素时571/573-BAL结核分枝杆菌分离株的生长在13μg/ml CB-18时受较小程度的影响，在27μg/ml CB-18时完全停止。在抗生素存在下，该分离株的生长在13μg/ml CB-18时不存在(图11)。与偶发分枝杆菌试验(图14和图15)相比，结核分枝杆菌对甜菜样去污剂本身更敏感。

显然，缓生分枝杆菌，如结核分枝杆菌，不象速生分枝杆菌如耻垢分枝杆菌(Liu，J.等人，生物化学杂志271：29545-29551(1996))那样调节细胞壁的流动性。例如，Takayama，K.等人，美国呼吸道疾病综述118：113-117(1978)显示结核分枝杆菌对生长温度的极端敏感性：偏离最适温度几度时，分枝菌酸合成停止，结核分枝杆菌不能存活。结核分枝杆菌对代替抗生素的本发明的甜菜碱样去污剂或Barry，C.E.等人(U.S.5,610,198)的硫代二十四酸的敏感性，可能是结核分枝杆菌分离株对分枝菌酸合成的属间干扰的敏感性的后果。例如，抑制分枝菌酸的环丙烷化或氧合将影响通透性并因而影响敏感性；分枝菌酸合成的干扰通常具有致死后果。在缓生分枝杆菌中仅在低CB-18浓度时观察到诱发的对抗生素的敏感性。

如果在含分枝菌酸结构的细菌中甜菜碱样去污剂的作用位点是依赖SAM的合酶，则预期将抑制对脂肪酸(例如，分枝菌酸)的修饰，并在某些情况下引起分枝菌酸合成的停止。因此，甜菜碱样去污剂在速生菌的处理中仅起一种辅助治疗作用，但预期对多种缓生分枝杆菌具有辅助和致死两种后果。例如，当与依赖SAM的抑制剂一起温育的缓生分枝杆菌的通透性表现诱发的对抗生素的敏感性时，由于分枝菌酸合成的干扰而引起的对生存的不利影响也是明显的并且可能是主要的因素。另一方面，速生分枝杆菌一般不受分离的甜菜碱样去污剂存在的影响，但由于调节流动性的机制的抑制而显示与抗生素的惊人的协同作用。

Barry等人(美国专利5,610,198)也说明，只有抗分枝杆菌药物如异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、利福平、氨苯砜、利福布汀、克拉霉素、环丙沙星、氯苯吩嗪、阿奇霉素、乙硫异烟胺、丁胺卡那霉素或resorcinomycin A能与硫代二十四酸一起使用。在此所述并在实施例5和6中例证的本发明显示，在CB-18存在下细菌生理学的某些方面改变，大概通透性改变在此所述的机制，从而诱发对大范围抗生素的敏感性。因此，根据本发明，甜菜碱敏感性试验将利用CB-18效应与多种抗生素，来鉴定所试分离株的天然敏感性，由此更有效地指导医生。

本发明的甜菜碱样去污剂比Barry等人(U.S.5,610,198)的硫代二十四酸具有明显的优点。例如，硫代二十四酸是极端不可溶的。换句话说，这些试剂的Krafft温度远远高于生理标准。在适当浓度的输送几乎是不可能的。相反，本发明中使用的甜菜碱样去污剂大部分是可溶的。例如，Hodge，D.等人，Langmuir 7：878-884(1991)已合成了一种Krafft值为20℃的C₂₀-羧己基甜菜碱。

尽管在此使用CB-18来表征CB-18效应，但显然其它甜菜碱在这点上也是有用的。例如，根据结构，一种烷基锍羧基甜菜碱将是抑制分枝菌酸修饰的理想化合物。可通过对Zimmer，R.E.的一种改进方法(美国专利3,560,393)合成该烷基锍羧基甜菜碱。例如，能甲基化十八烷基硫醇并纯化R₁-S-R₂，用于用合适类型的卤化酯修饰(图39C)。用阳离子交换层析纯化将去除酯产生酸。实施例10用于筛选临床分离株的甜菜碱敏感性表

实施例5和实施例6显示，在一种甜菜碱与多种不同抗生素匹配的试验过程中，不同的临床分离株行为表现不同。实施例6显示，在不同去污剂与P/cax抗生素制剂组合的试验中，一种临床分离株行为表现不同。于是，为了敏感性试验，发展并完善一种甜菜碱敏感性表。这种表将交叉使用不同的甜菜碱与不同的抗生素。在此所述的实施例显示这种表是如何设计并用于敏感性试验的。本实施例是作为一种手段来说明如何发展这种表，而不是作为本发明的限制。

使用对于不同临床分离株引起广谱结果的不同甜菜碱，例如五种，连同对于不同临床分离株引起广谱结果的不同抗生素，例如五种，组成甜菜碱敏感性表。例如，确定5种抗生素α-1、α-2、α-3、α-4和α-5，并确定5种甜菜碱作为β-1、β-2、β-3、β-4和β-5。五种不同的甜菜碱样去污剂条件可以是不同浓度的相同去污剂或其组合。同样，五种不同抗生素可以是不同浓度的相同抗生素或其组合。表11显示这5种甜菜碱如何与这5种抗生素相匹配以鉴定最有效的甜菜碱-抗生素组合。

表11甜菜碱敏感性表
							抗生素	甜菜碱样去污剂
φ	β-1	β-2	β-3	β-4	β-5
						φ		-	β-1	β-2	β-3	β-4	β-5
α-1	α-1	α-1/β-1	α-1/β-2	α-1/β-3	α-1/β-4		α-1/β-5

α-2	α-2	α-2/β-1	α-2/β-2	α-2/β-3	α-2/β-4	α-2/β-5
							α-3	α-3	α-3/β-1	α-3/β-2	α-3/β-3	α-3/β-4	α-3/β-5
α-4	α-4	α-4/β-1	α-4/β-2	α-4/β-3	α-4/β-4	α-4/β-5
							α-5	α-5	α-5/β-1	α-5/β-2	α-5/β-3	α-5/β-4	α-5/β-5

甜菜碱敏感性表

下面叙述表11所示甜菜碱表的应用(1)在液体培养基(例如BACTEC 12B)中或固体培养基(例如7H11斜

面)上培养所述临床分离株。(2)建立甜菜碱表。例如能在微量滴定板或单个瓶中建立该表。甜菜碱

和抗生素可在合适的孔或瓶中冻干，然后用生长培养基重建，或者

以抗生素、甜菜碱和肉汤的单个溶液混合来达到相同目的。前者是

优选的。(3)用向每一孔或管中加入适量细胞(例如，100-10,000 cfu)的方

式制备细菌贮存液。如本领域所知，通过基于MacFarland标准的应

用产生悬液能将这种贮存液调节到适量的细胞，然后稀释到希望的

终点。(4)将板、管或瓶温育预定的时间，并使用所选方法检查生长。生长的

检测可基于¹⁴C释放(例如，BACTEC 12B：Becton-Dickinson，

Cockeysville，MD)、O₂消耗(ESP Myco System II^TM，DIFCO

Laboratories，Detroit，MI)、pH改变(MB/BacT^，Organon Teknika，

Durham，NC)或本领域所知的其它标准技术，如浊度法。

这种表也能用来分类临床分离株。例如，如果已经知道甜菜碱借之发挥作用来增强抗微生物治疗的机制，那么这种信息对于提高与甜菜碱-抗生素组合有关或无关的治疗方案将有参考性。因此，存在两种截然不同的终点。在第一种终点中，甜菜碱敏感性表被用作分类临床分离株的一种手段。这种分类是用来更有效地确定与甜菜碱作为治疗佐剂的应用无关的治疗方案。在第二种终点中，甜菜碱敏感性试验的目的在于确定特定甜菜碱样去污剂与特定抗生素的组合(如下一个实施例(实施例11)所述)。实施例11甜菜碱样去污剂作为治疗佐剂的应用

如实施例10所述，敏感性试验有两种终点。在一种终点中，甜菜碱表被作为一种典型的敏感性筛选法用于确定消除感染的最有效的治疗方案，最明显地是实施例10的表中的一种抗生素。在该终点中，治疗方案不包括甜菜碱样去污剂作为治疗佐剂的应用。

在另一种终点中，治疗方案基于表中所含的一种或多种抗生素：甜菜碱样去污剂组合。在该终点中，从实施例10所述表的结果中获得的认识是，例如，终点本身：该信息对技术人员指定抗生素和甜菜碱样去污剂的特定组合。在此情况下，甜菜碱必须与患者接触。该实施例的目的在于描述甜菜碱如何用作治疗佐剂。该实施例是作为一种手段来阐明如何发展这种表，并不是用作本发明的限制。

在此所述的实施例和数据显示，甜菜碱样去污剂尽管在分开使用时具有有限的抗微生物效能，但在与一种或多种抗生素组合使用时是最有效的。为了使任何抗微生物治疗有效，必须向微生物输送抗生素。在本发明的方法中抗生素本身的输送可以通过本领域所知的用于抗生素输送的标准方法。本实施例的目的在于描述如何向传染物输送甜菜碱。因此，在根据本发明的方法接受佐剂治疗的患者中，如果希望，能通过一种方法输送甜菜碱而通过另一种方法输送抗生素。

输送甜菜碱样去污剂的标准方法在本领域中已知，包括口服、肌肉注射、静脉滴注、在感染部位注射或吸入。然而，甜菜碱样去污剂是表面活性剂，通过口服或肌肉注射可能不能很好地耐受。例如，大量甜菜碱样去污剂的口服可能会导致胃肠疼痛，大量甜菜碱的注射可能会导致细胞结构的溶解，引起注射部位的刺激。当应用静脉滴注时，必须注意血液中甜菜碱的浓度。尽管加入甜菜碱至临界胶束浓度(CMC)以上是可行的，但如果由于血液成分的溶解而使全血水平升高至CMC以上则可引起并发症。在感染部位注射也可能是一种可行的输送方法；不幸地，这只在很少的情况中才是可能的，例如由传播性MAC疾病引起的结核性损害或肉芽瘤性损害。在一种优选实施方案中，通过吸入输送甜菜碱。

结核病主要是一种呼吸道感染。结核性损害一般出现于肺的上叶。假使肺的表面覆盖有一种天然表面活性剂，向感染部位输送甜菜碱样去污剂的有效途径可能类似于哮喘病患者中β-阻断剂或类固醇的输送。例如，某些类固醇和β-阻断剂一般以微结晶的形式输送，如Ventolin^(由Allen& Hanburys生产，Allen & Hanburys为Glaxo的一个公司，ResearchTriangle Park，NC)。

现已完全叙述了本发明，本领域的技术人员应当理解，在不影响本发明或其任何实施方案的精神或范围的情况下，可在较宽和相等范围的条件、参数等之内进行本发明。

Claims (143)

1.一种敏感性试验的方法，该方法包括使微生物与含有抗生素和甜菜碱样去污剂的组合物相接触，并且根据该微生物在该组合物中的生存力表征该微生物对该抗生素的敏感性。

2.权利要求1的方法，其中所述甜菜碱样去污剂选自：CB样、SB样、HSB样、PB样、StB样、PhB样、SoB样、RevB样、AO样、cAB样和ImB样去污剂。

3.权利要求2的方法，其中该甜菜碱样去污剂是CB样去污剂。

4.权利要求3的方法，其中该CB样去污剂具有结构

其中R₁为C₈-C₂₂；

α为-CH₂-、-CH(OH)-、-(CO)-NH-CH₂CH₂CH₂-、-O-或-C(0)-；

n为0或1；

β为-N^-、-P^-或-S^-；

R₂为-H、-CH₃、-C₂H₅、-C₃H₇或-C₄H₉；

R₃为-H、-CH₃、-C₂H₅、-C₃₁H₇或-C₄H₉；

R₄为-CH₂-、-C₂H₄-、-C₃H₆-、-C₄H₈-、-C₅H₁₀-、-C₆H₁₂-、-CH₂-C₆H₄-、-C_mH_2m-、-CH(OH)CH₂CH₂-、-CH₂CH(OH)CH₂-或-C_mH_2m-1(OH)-，其中m≥1；以及

γ为-COO^。

5.权利要求4的方法，其中所述CB样去污剂选自：

N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.693-33-4)、

椰油羧甲基甜菜碱和(CAS^No.68424-94-2)、

N-(羧甲基)-N，N-二甲基-9-十八烷-1-铵，内盐(CAS^No.871-37-4)、

N-(羧甲基)-N，N-二甲基-3-((1-氧十八烷基)氨基)-1-丙铵，内盐(CAS^No.6179-44-8)、

3-氨基-N(羧甲基)-N，N-二甲基-1-丙铵N-C8-C22酰基衍生物，内盐(CAS^No.84082-44-0)、

N-(羧甲基)-3-((12-羟基-1-氧-9-十八烷基)氨基)-N，N-二甲基-1-丙铵，内盐(CAS^No.71850-81-2)、

椰油酰胺丙基羧甲基甜菜碱(CAS^No.61789-39-7和CAS^No.61789-40-0)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.16527-85-8)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十三烷铵，内盐(CAS^No.132621-79-5)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS^No.69725-38-3)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.42416-43-3)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS^No.30612-73-8)、

N-十二烷基-β-丙氨酸(CAS^No.1462-54-0)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十一烷铵，内盐(CAS^No.150147-53-8)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.15163-30-1)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS^No.146959-90-2)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS^No.146959-91-3)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.71695-32-4)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS^No.78195-27-4)、

N-(4-羧丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.120139-51-7)、

N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.76392-97-7)、

N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.73565-98-7)、

N-(6-羧己基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.132621-80-8)、

4-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-31-3)、

2-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-34-6)、

4-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-33-5)、

2-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-35-7)、牛脂甘氨酸酯(CAS^No.70750-46-8)、大豆酰胺丙基羧甲基甜菜碱，以及巴西棕榈酰胺丙基羧甲基甜菜碱。

6.权利要求5的方法，其中所述羧基甜菜碱是N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CB-18)(CAS^No.78195-27-4)

7.权利要求2的方法，其中所述甜菜碱样去污剂是SB样去污剂。

8.权利要求7的方法，其中该SB样去污剂选自SB-18、SB-16、SB-14和SB-12。

9.权利要求8的方法，其中该SB样去污剂是SB-16。

10.权利要求8的方法，其中该SB样去污剂是SB-18。

11.权利要求2的方法，其中所述甜菜碱样去污剂是SoB样去污剂。

12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述组合物含有两种或多种甜菜碱样去污剂。

13.权利要求1的方法，其中所述抗生素选自：β-内酰胺抗生素、氨基糖苷、氨基环醇、喹诺酮、四环素、大环内酯、林可酰胺、糖肽、脂肽、多肽抗生素、磺胺、甲氧苄啶、氯霉素、异烟肼、硝基咪唑、利福平、硝基呋喃、乌洛托品和莫匹罗星。

14.权利要求13的方法，其中该抗生素是β-内酰胺抗生素。

15.权利要求14的方法，其中该β-内酰胺抗生素选自青霉素、头孢菌素、单菌霉素和碳青霉烯抗生素。

16.权利要求15的方法，其中该β-内酰胺抗生素是青霉素。

17.权利要求16的方法，其中该青霉素选自：阿洛西林、甲氧西林、萘夫西林、邻氯苯甲异噁唑青霉素、双氯西林、苯唑西林、氨苄青霉素、巴氨西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛西林和哌拉西林。

18.权利要求15的方法，其中该类抗生素是头孢菌素。

19.权利要求18的方法，其中该头孢菌素选自：头孢西丁、头孢哌酮、头孢噻甲羧肟、头孢曲松、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢克洛、头孢孟多、头孢尼西、头孢苄胺四唑、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢氰唑、头孢替坦、头孢克肟、头孢氨噻、头孢泊肟和头孢唑肟。

20.权利要求19的方法，其中该头孢菌素是头孢曲松。

21.权利要求15的方法，其中所述β-内酰胺抗生素是单菌霉素。

22.权利要求21的方法，其中该单菌霉素是氨曲南。

23.权利要求15的方法，其中所述β-内酰胺抗生素是碳青霉烯。

24.权利要求23的方法，其中该碳青霉烯选自亚胺培南、美罗培南、帕民培南和biapenem。

25.权利要求24的方法，其中该碳青霉烯是亚胺培南。

26.权利要求13-25任一项的方法，其中所述组合物进一步含有一种β-内酰胺酶抑制剂。

27.权利要求26的方法，其中该β-内酰胺酶抑制剂选自棒酸、舒巴坦和他佐巴坦。

28.权利要求13的方法，其中所述抗生素是氨基糖苷或氨基环醇。

29.权利要求28的方法，其中该氨基糖苷或氨基环醇选自：链霉素、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、紫苏霉素、奈替米星、新霉素、新霉素B和巴龙霉素。

30.权利要求13的方法，其中所述抗生素是喹诺酮。

31.权利要求30的方法，其中该喹诺酮选自：萘啶酮酸、奥索利酸、西诺沙星、氟甲喹、米洛沙星、罗索沙星、吡哌酸、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、替马氟沙星、氟罗沙星、培氟沙星、氨氟沙星、司氟沙星、左氧氟沙星和克林沙星。

32.权利要求13的方法，其中所述抗生素是四环素。

33.权利要求13的方法，其中所述抗生素是大环内酯。

34.权利要求33的方法，其中该大环内酯选自：红霉素、竹桃霉素、螺旋霉素、交沙霉素、蔷薇霉素、克拉霉素、阿奇霉素、地红霉素、罗红霉素、氟红霉素和罗他霉素。

35.权利要求13的方法，其中所述抗生素是林可酰胺。

36.权利要求13的方法，其中所述抗生素是糖肽。

37.权利要求13的方法，其中所述抗生素是脂肽。

38.权利要求13的方法，其中所述抗生素是多肽抗生素。

39.权利要求13的方法，其中所述抗生素是磺胺。

40.权利要求13的方法，其中所述抗生素是甲氧苄啶。

41.权利要求13的方法，其中所述组合物含有两种或多种抗生素。

42.权利要求41的方法，其中该抗生素是磺胺和甲氧苄啶。

43.权利要求42的方法，其中该磺胺是磺胺甲基异噁唑。

44.权利要求13的方法，其中所述抗生素是氯霉素。

45.权利要求13的方法，其中所述抗生素是异烟肼。

46.权利要求13的方法，其中所述抗生素是硝基咪唑。

47.权利要求13的方法，其中所述抗生素是利福平。

48.权利要求47的方法，其中该利福平选自利福平、利福霉素SV、利福霉素B(利福酰胺)和利福布汀。

49.权利要求48的方法，其中该利福平是利福平。

50.权利要求48的方法，其中该利福平是利福布汀。

51.权利要求13的方法，其中所述抗生素是硝基呋喃。

52.权利要求13的方法，其中所述抗生素是乌洛托品。

53.权利要求13的方法，其中所述抗生素是莫匹罗星。

54.权利要求1的方法，其中所述抗生素选自：丁胺卡那霉素、阿奇霉素、与任一β-内酰胺酶抑制剂组合的任一β-内酰胺、卷曲霉素、头孢氰唑、头孢西丁、环丙沙星、克拉霉素、氯苯吩嗪、环丝氨酸、氨苯砜、红霉素、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、亚胺培南、异烟肼、卡那霉素、二甲胺四环素、氧氟沙星、对氨基水扬酸、丙硫异烟胺、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、司氟沙星、磺胺甲基异噁唑与甲氧苄啶、链霉素、四环素、thiacetazole和紫霉素。

55.一种抗微生物治疗的方法，用于感染了一种微生物或有感染该微生物危险的患者，该方法包括以足以杀死该微生物的量和时间对该患者同时施用甜菜碱样去污剂和抗生素。

56.权利要求55的方法，其中所述甜菜碱样去污剂选自：CB样、SB样、HSB样、PB样、StB样、PhB样、SoB样、RevB样、AO样、cAB样和ImB样去污剂。

57.权利要求56的方法，其中该甜菜碱样去污剂是CB样去污剂。

58.权利要求57的方法，其中该CB样去污剂具有结构

其中R₁为C₈-C₂₂；

α为-CH₂-、-CH(OH)-、-(CO)-NH-CH₂CH₂CH₂-、-O-或-C(O)-；

n为0或1；

β为-N^-、-P^-或-S^-；

R₂为-H、-CH₃、-C₂H₅、-C₃H₇或-C₄H₉；

R₃为-H、-CH₃、-C₂H₅、-C₃₁H₇或-C₄H₉；

R₄为-CH₂-、-C₂H₄-、-C₃H₆-、-C₄H₈-、-C₅H₁₀-、-C₆H₁₂-、-CH₂-C₆H₄-、-C_mH_2m-、-CH(OH)CH₂CH₂-、-CH₂CH(OH)CH₂-或-C_mH_2m-1(OH)-，其中m≥1；以及

γ为-COO^。

59.权利要求58的方法，其中所述CB样去污剂选自：

N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.693-33-4)、

椰油羧甲基甜菜碱和(CAS^No.68424-94-2)、

N-(羧甲基)-N，N-二甲基-9-十八烷-1-铵，内盐(CAS^No.871-37-4)、

N-(羧甲基)-N，N-二甲基-3-((1-氧十八烷基)氨基)-1-丙铵，内盐(CAS^No.6179-44-8)、

3-氨基-N(羧甲基)-N，N-二甲基-1-丙铵N-C8-C22酰基衍生物，内盐(CAS^No.84082-44-0)、

N-(羧甲基)-3-((12-羟基-1-氧-9-十八烷基)氨基)-N，N-二甲基-1-丙铵，内盐(CAS^No.71850-81-2)、

椰油酰胺丙基羧甲基甜菜碱(CAS^No.61789-39-7和CAS^No.61789-40-0)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.16527-85-8)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十三烷铵，内盐(CAS^No.132621-79-5)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS^No.69725-38-3)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.42416-43-3)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS^No.30612-73-8)、

N-十二烷基-β-丙氨酸(CAS^No.1462-54-0)，

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十一烷铵内盐(CAS^No.150147-53-8)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.15163-30-1)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS^No.146959-90-2)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS1^No.146959-91-3)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.71695-32-4)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS^No.78195-27-4)、

N-(4-羧丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.120139-51-7)、

N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.76392-97-7)、

N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.73565-98-7)、

N-(6-羧己基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.132621-80-8)、

4-羧基-N-十二烷基-N，N-三甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-31-3)、

2-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-34-6)、

4-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-33-5)、

2-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-35-7)、牛脂甘氨酸酯(CAS^No.70750-46-8)、大豆酰胺丙基羧甲基甜菜碱，以及巴西棕榈酰胺丙基羧甲基甜菜碱。

60.权利要求59的方法，其中所述羧基甜菜碱是N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CB-18)(CAS^No.78195-27-4)

61.权利要求56的方法，其中所述甜菜碱样去污剂是SB样去污剂。

62.权利要求61的方法，其中该SB样去污剂选自SB-18、SB-16、SB-14和SB-12。

63.权利要求62的方法，其中该SB样去污剂是SB-16。

64.权利要求62的方法，其中该SB样去污剂是SB-18。

65.权利要求56的方法，其中所述甜菜碱样去污剂是SoB样去污剂。

66.权利要求56-65任一项的方法，其中所述方法包括对患者施用两种或多种甜菜碱样去污剂。

67.权利要求55的方法，其中所述抗生素选自：β-内酰胺抗生素、氨基糖苷、氨基环醇、喹诺酮、四环素、大环内酯、林可酰胺、糖肽、脂肽、多肽抗生素、磺胺、甲氧苄啶、氯霉素、异烟肼、硝基咪唑、利福平、硝基呋喃、乌洛托品和莫匹罗星。

68.权利要求67的方法，其中该抗生素是β-内酰胺抗生素。

69.权利要求68的方法，其中该β-内酰胺抗生素选自青霉素、头孢菌素、单菌霉素和碳青霉烯抗生素。

70.权利要求69的方法，其中该抗生素是青霉素。

71.权利要求70的方法，其中该青霉素选自：阿洛西林、甲氧西林、萘夫西林、邻氯苯甲异噁唑青霉素、双氯西林、苯唑西林、氨苄青霉素、巴氨西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛西林、青霉素和哌拉西林。

72.权利要求69的方法，其中该抗生素是头孢菌素。

73.权利要求72的方法，其中该头孢菌素选自：头孢西丁、头孢哌酮、头孢噻甲羧肟、头孢曲松、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢克洛、头孢孟多、头孢尼西、头孢苄胺四唑、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢氰唑、头孢替坦、头孢克肟、头孢氨噻、头孢泊肟和头孢唑肟。

74.权利要求73的方法，其中该头孢菌素是头孢曲松。

75.权利要求69的方法，其中所述抗生素是单菌霉素。

76.权利要求75的方法，其中该单菌霉素是氨曲南。

77.权利要求69的方法，其中所述抗生素是碳青霉烯。

78.权利要求77的方法，其中该碳青霉烯选自亚胺培南、美罗培南、帕民培南和biaapenem。

79.权利要求78的方法，其中该碳青霉烯是亚胺培南。

80.权利要求68-80任一项的方法，其中所述方法进一步包括对患者施用β-内酰胺酶抑制剂。

81.权利要求80的方法，其中该β-内酰胺酶抑制剂选自棒酸、舒巴坦和他佐巴坦。

82.权利要求67的方法，其中所述抗生素是氨基糖苷或氨基环醇。

83.权利要求82的方法，其中该氨基糖苷或氨基环醇选自：链霉素、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、紫苏霉素、奈替米星、新霉素、新霉素B和巴龙霉素。

84.权利要求67的方法，其中所述抗生素是喹诺酮。

85.权利要求83的方法，其中该喹诺酮选自：萘啶酮酸、奥索利酸、西诺沙星、氟甲喹、米洛沙星、罗索沙星、吡哌酸、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、替马氟沙星、氟罗沙星、培氟沙星、氨氟沙星、司氟沙星、左氧氟沙星、克林沙星。

86.权利要求67的方法，其中所述抗生素是四环素。

87.权利要求67的方法，其中所述抗生素是大环内酯。

88.权利要求87的方法，其中该大环内酯选自：红霉素、竹桃霉素、螺旋霉素、交沙霉素、蔷薇霉素、克拉霉素、阿奇霉素、地红霉素、罗红霉素、氟红霉素和罗他霉素。

89.权利要求67的方法，其中所述抗生素是林可酰胺。

90.权利要求67的方法，其中所述抗生素是糖肽。

91.权利要求67的方法，其中所述抗生素是脂肽。

92.权利要求67的方法，其中所述抗生素是多肽抗生素。

93.权利要求67的方法，其中所述抗生素是磺胺。

94.权利要求67的方法，其中所述抗生素是甲氧苄啶。

95.权利要求55的方法，其中对患者施用两种抗生素。

96.权利要求95的方法，其中该抗生素是磺胺和甲氧苄啶。

97.权利要求96的方法，其中该磺胺是磺胺甲基异噁唑。

98.权利要求67的方法，其中所述抗生素是氯霉素。

99.权利要求67的方法，其中所述抗生素是异烟肼。

100.权利要求67的方法，其中所述抗生素是硝基咪唑。

101.权利要求67的方法，其中所述抗生素是利福平。

102.权利要求101的方法，其中该利福平选自利福平、利福霉素SV、利福霉素B(利福酰胺)和利福布汀。

103.权利要求102的方法，其中该利福平是利福平。

104.权利要求102的方法，其中该利福平是利福布汀。

105.权利要求67的方法，其中所述抗生素是硝基呋喃。

106.权利要求67的方法，其中所述抗生素是乌洛托品。

107.权利要求67的方法，其中所述抗生素是莫匹罗星。

108.权利要求55的方法，其中所述抗生素选自丁胺卡那霉素、阿奇霉素、与任一β-内酰胺酶抑制剂组合的任一β-内酰胺、卷曲霉素、头孢氰唑、头孢西丁、环丙沙星、克拉霉素、氯苯吩嗪、环丝氨酸、氨苯砜、红霉素、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、亚胺培南、异烟肼、卡那霉素、二甲胺四环素、氧氟沙星、对氨基水扬酸、丙硫异烟胺、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、司氟沙星、磺胺甲基异噁唑与甲氧苄啶、链霉素、四环素、thiacetazole和紫霉素。

109.权利要求1或55任一项的方法，其中所述微生物在其外膜中具有分枝菌酸结构。

110.权利要求109的方法，其中该微生物是分枝杆菌属。

111.权利要求110的方法，其中该分枝杆菌选自：田野分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、M.acetamidolyticum、非洲分枝杆菌、爱知分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、金色分枝杆菌、南非分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌(BCG)、龟分枝杆菌、千田分枝杆菌、楚布分枝杆菌、库氏分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、杜氏分枝杆菌、诡诈分枝杆菌、产鼻疽分枝杆菌、微黄分枝杆菌、偶发分枝杆菌、加地斯分枝杆菌、胃分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、戈登分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、科莫斯分枝杆菌、麻风分枝杆菌、鼠麻风分枝杆菌、海分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、莫里奥卡分枝杆菌、新金色分枝杆菌、无色分枝杆菌、奥布分枝杆菌、副偶然分枝杆菌、副结核分枝杆菌、外来分枝杆菌、草分枝杆菌、猪分枝杆菌、多孔分枝杆菌、灰尘分枝杆菌、罗德岛分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、塞内加尔分枝杆菌、石氏分枝杆菌、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、泥炭藓分枝杆菌、斯氏分枝杆菌、土分枝杆菌、抗热分枝杆菌、东海分枝杆菌、次要分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、母牛分枝杆菌、蟾分枝杆菌。

112.权利要求111的方法，其中该分枝杆菌是结核分枝杆菌复合体(MTB)的一员。

113.权利要求112的方法，其中该微生物是结核分枝杆菌。

114.权利要求111的方法，其中该微生物是鸟分枝杆菌(MAC)复合体的一员。

115.权利要求111的方法，其中该微生物是MAIS组的一员。

116.权利要求111的方法，其中该微生物是溃疡分枝杆菌。

117.权利要求111的方法，其中该微生物是堪萨斯分枝杆菌。

118.权利要求111的方法，其中该微生物是龟分枝杆菌。

119.权利要求111的方法，其中该微生物是偶发分枝杆菌。

120.一种用于敏感性试验的组合物，该组合物含有与一种或多种甜菜碱样去污剂混合的一种或多种抗生素。

121.权利要求121的组合物，其中至少一种甜菜碱样去污剂选自：CB样、SB样、HSB样、PB样、StB样、PhB样、SoB样、RevB样、AO样、cAB样和ImB样去污剂。

122.权利要求122的组合物，其中该甜菜碱样去污剂是CB样去污剂。

123.权利要求123的组合物，其中该CB样去污剂具有结构

其中R₁为C₈-C₂₂；

α为-CH₂-、-CH(OH)-、-(CO)-NH-CH₂CH₂CH₂-、-O-或-C(O)-；

n为O或1；

β为-N^-、-P^-或-S^-；

R₂为-H、-CH₃、-C₂H₅、-C₃H₇或-C₄H₉；

R₃为-H、-CH₃、-C₂H₅、-C₃₁H₇或-C₄H₉；

R₄为-CH₂-、-C₂H₄-、-C₃H₆-、-C₄H₈-、-C₅H₁₀-、-C₆H₁₂-、-CH₂-C₆H₄-、-C_mH_2m-、-CH(OH)CH₂CH₂-、-CH₂CH(OH)CH₂-或-C_mH_2m-1(OH)-，其中m≥1；以及

γ为-COO^。

124.权利要求124的组合物，其中所述CB样去污剂选自：

N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.693-33-4)、

椰油羧甲基甜菜碱和(CAS^No.68424-94-2)、

N-(羧甲基)-N，N-二甲基-9-十八烷-1-铵，内盐(CAS^No.871-37-4)、

N-(羧甲基)-N，N-二甲基-3-((1-氧十八烷基)氨基)-1-丙铵，内盐(CAS^No.6179-44-8)、

3-氨基-N(羧甲基)-N，N-二甲基-1-丙铵N-C8-C22酰基衍生物，内盐(CAS^No.84082-44-0)、

N-(羧甲基)-3-((12-羟基-1-氧-9-十八烷基)氨基)-N，N-二甲基-1-丙铵，内盐(CAS^No.71850-81-2)、

椰油酰胺丙基羧甲基甜菜碱(CAS^No.61789-39-7和CAS^No.61789-40-0)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.16527-85-8)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十三烷铵，内盐(CAS^No.132621-79-5)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS^No.69725-38-3)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.42416-43-3)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS^No.30612-73-8)、

N-十二烷基-β-丙氨酸(CAS^No.1462-54-0)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十一烷铵，内盐(CAS^No.150147-53-8)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.15163-30-1)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS^No.146959-90-2)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS^No.146959-91-3)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.71695-32-4)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS^No.78195-27-4)、

N-(4-羧丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.120139-51-7)、

N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.76392-97-7)、

N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.73565-98-7)、

N-(6-羧己基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.132621-80-8)、

4-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-31-3)、

2-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-34-6)、

4-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-33-5)、

2-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-35-7)、牛脂甘氨酸酯(CAS^No.70750-46-8)、大豆酰胺丙基羧甲基甜菜碱，以及巴西棕榈酰胺丙基羧甲基甜菜碱。

125.权利要求125的组合物，其中所述羧基甜菜碱是N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CB-18)(CAS^No.78195-27-4)

126.权利要求121的组合物，其中所述甜菜碱样去污剂是SB样去污剂。

127.权利要求126的组合物，其中该SB样去污剂选自SB-18、SB-16、SB-14和SB-12。

128.权利要求127的组合物，其中该SB样去污剂是SB-16。

129.权利要求127的组合物，其中该SB样去污剂是SB-18。

130.权利要求120-129任一项的组合物，其中所述组合物含有两种或多种甜菜碱样去污剂。

131.权利要求120的组合物，其中所述抗生素选自：β-内酰胺抗生素、氨基糖苷、氨基环醇、喹诺酮、四环素、大环内酯、林可酰胺、糖肽、脂肽、多肽抗生素、磺胺、甲氧苄啶、氯霉素、异烟肼、硝基咪唑、利福平、硝基呋喃、乌洛托品和莫匹罗星。

132.一种用于测定微生物敏感性的试剂盒，该试剂盒含有紧邻或相邻的一种或多种甜菜碱样去污剂与一种或多种抗生素。

133.权利要求132的试剂盒，其中至少一种甜菜碱样去污剂选自：CB样、SB样、HSB样、PB样、StB样、PhB样、SoB样、RevB样、AO样、cAB样和ImB样去污剂。

134.权利要求133的试剂盒，其中该甜菜碱样去污剂是CB样去污剂。

135.权利要求134的试剂盒，其中该CB样去污剂具有结构

其中R₁为C₈-C₂₂；

α为-CH₂-、-CH(OH)-、-(CO)-NH-CH₂CH₂CH₂-、-O-或-C(O)-；

n为0或1；

β为-N^-、-P^-或-S^-；

R₂为-H、-CH₃、-C₂H₅、-C₃H₇或-C₄H₉；

R₃为-H、-CH₃、-C₂H₅、-C₃₁H₇或-C₄H₉；

R₄为-CH₂-、-C₂H₄-、-C₃H₆-、-C₄H₈-、-C₅H₁₀-、-C₆H₁₂-、-CH₂-C₆H₄-、-C_mH_2m-、-CH(OH)CH₂CH₂-、-CH₂CH(OH)CH₂-或-C_mH_2m-1(OH)-，其中m≥1；以及

γ为-COO^。

136.权利要求135的试剂盒，其中所述CB样去污剂选自：

N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.693-33-4)、

椰油羧甲基甜菜碱和(CAS^No.68424-94-2)、

N-(羧甲基)-N，N-二甲基-9-十八烷-1-铵，内盐(CAS^No.871-37-4)、

N-(羧甲基)-N，N-二甲基-3-((1-氧十八烷基)氨基)-1-丙铵，内盐(CAS^No.6179-44-8)、

3-氨基-N(羧甲基)-N，N-二甲基-1-丙铵N-C8-C22酰基衍生物，内盐(CAS^No.84082-44-0)、

N-(羧甲基)-3-((12-羟基-1-氧-9-十八烷基)氨基)-N，N-二甲基-1-丙铵，内盐(CAS^No.71850-81-2)、

椰油酰胺丙基羧甲基甜菜碱(CAS^No.61789-39-7和CAS^No.61789-40-0)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.16527-85-8)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十三烷铵，内盐(CAS^No.132621-79-5)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS^No.69725-38-3)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.42416-43-3)、

N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS^No.30612-73-8)、

N-十二烷基-β-丙氨酸(CAS^No.1462-54-0)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十一烷铵，内盐(CAS^No.150147-53-8)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.15163-30-1)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS^No.146959-90-2)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS^No.146959-91-3)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.71695-32-4)、

N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS^No.78195-27-4)、

N-(4-羧丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.120139-51-7)、

N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.76392-97-7)、

N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS^No.73565-98-7)、

N-(6-羧己基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS^No.132621-80-8)、

4-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-31-3)、

2-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-34-6)、

4-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-33-5)、

2-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-苯甲烷铵，内盐(CAS^No.71695-35-7)、牛脂甘氨酸酯(CAS^No.70750-46-8)、大豆酰胺丙基羧甲基甜菜碱，以及巴西棕榈酰胺丙基羧甲基甜菜碱。

137.权利要求136的试剂盒，其中所述羧基甜菜碱是N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CB-18)(CAS^No.78195-27-4)

138.权利要求133的试剂盒，其中所述甜菜碱样去污剂是SB样去污剂。

139.权利要求138的试剂盒，其中该SB样去污剂选自SB-18、SB-16、SB-14和SB-12。

140.权利要求139的试剂盒，其中该SB样去污剂是SB-16。

141.权利要求139的试剂盒，其中该SB样去污剂是SB-18。

142.权利要求132-141任一项的试剂盒，其中所述试剂盒含有不同甜菜碱样去污剂的集合。

143.权利要求132的试剂盒，其中所述抗生素选自：β-内酰胺抗生素、氨基糖苷、氨基环醇、喹诺酮、四环素、大环内酯、林可酰胺、糖肽、脂肽、多肽抗生素、磺胺、甲氧苄啶、氯霉素、异烟肼、硝基咪唑、利福平、硝基呋喃、乌洛托品和莫匹罗星。

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