JP3105920B2 - 細菌性フィターゼをコードする配列、及びフィターゼ活性を有するタンパク質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はフィターゼの細菌による生産に関する。

（関連技術） リンは全ての生物の生育に必須の元素である。家畜生
産では単胃動物（たとえばブタ、家禽類および魚類）を
うまく生育させるため試料で無機リンを補給しなければ
ならない。

一方反芻動物の飼料には無機リンを添加する必要がな
い。こぶ胃に存在する微生物がフィチン酸塩（ミオ−イ
ノシトールヘキサキス−ホスフェート）をイノシトール
と無機リン酸塩に変換する酵素を生産する。

フィチン酸は植物に由来する全ての飼料中に貯蔵物質
として存在する（レヴュー参照、フィチン酸、化学と応
用、E.グラフ（Graf）（編）、ピラタスプレス版；ミネ
アポリス、MN、アメリカ（1986））。フィチン酸は全て
のナッツ、穀物、豆類、油種、胞子および花粉に１〜３
％含まれる。フィチン酸の複合塩はフィチンと呼ばれ
る。フィチン酸はカルシウム、亜鉛、マグネシウム、鉄
などのミネラルをキレートし、またたんぱく質と反応す
ることによりたんぱく質や栄養的に重要なミネラルの生
育用性を減らすので抗栄養因子と考えられている。

フィチン酸リンは単胃動物の胃腸を通過し、***物中
に排出されてしまう、結腸ではフィチン酸塩がいくらか
加水分解されるが、無機リンは小腸でしか吸収されない
のでここで発生した無機リンは栄養価をもたない。結
局、栄養的に重要なリンは飼料中に存在するにもかかわ
らず単胃動物によって有意に使用されることはない。フ
ィチン酸リンの***物中への排出にはさらに問題があ
る。家畜生産はこの10年間に著しく増大した。これに従
がい生成する***物量が増加し、世界中で環境問題を引
き起こした。部分的にこれは***物由来のリン酸が地表
水に蓄積し富栄養化を起こすことによる。

フィチン酸塩をイノシトールと無機リンに変換する微
生物由来の酵素はフィターゼとして広く知られている。
フィターゼ産生微生物には枯草菌（Bacillus snbtili
s）（V.K.ペーバー（Paver）およびV.J.ジャガナサン
（Jagannathan）（1982）J.Bacteriol,151、1102−110
8）およびシュードモナス（Psendomonas）（D.J.コスグ
ローブ（Cosgrove）（1970）Austral,J.Biol.Sci.23、1
207−1220）などのバクテリア；サッカロミセス セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（N.R.ナイニ（Na
yini）およびP.マーカキス（Markakis）（1984）Lebens
mittel Wissenschaft and Technologie 17、24−26）な
どのイースト；およびアスペルギラス テリウム（Aspe
rgillus terreus）などの菌類（K.ヤマダ（Yamada）、
Y.ミノダ（Minoda）およびS.ヤマモト（Yamamoto）（19
86）Agric.Biol.Chem.32、1275−1282）が含まれる。他
のアスペルギラス（Aspergillus）種もフィターゼを生
産することが知られている。そのうちアスペルギラス
フィカム（Aspergillus ficuum）により生産されるフィ
ターゼは最も高い比活性を有し、かつ他の微生物によっ
て生産されるフィターゼよりも高い熱安定性を有してい
ることが分った（未発表の観測）。

単胃動物飼料への微生物フィターゼ添加の考え方は以
前から報告されている（ウェア（Ware）、J.H.,ブラッ
フ（Bluff）、L.およびシー（Shieh）、T.R.（1967）米
国特許第3,297,548号；ネルソン（Nelson）、J.S.,シー
（Shieh）、T.R.,ウォドジンスキスー（Wodzinski）、
R.J.およびウェア（Ware）、J.H.（1971）J.Nutrition
101、1289−1294）。しかし今日まで微生物酵素生産の
コストが高いためこの考え方の応用は商業的に容易では
なかった（Y.W.ハン（Han）（1989）Animal Feed Sci.
＆ Technol.24、345−350）。経済的理由で無機リンが
単胃動物飼料に添加されている。

微生物フィターゼの他の工業的用途も出てきた。その
例としてはとうもろこしや小麦などの穀物からデンプン
を生産する工業プロセスへの応用がある。たとえば湿潤
製粉プロセスからのコーングルテン飼料などを含む排産
物は動物飼料として売られている。

スティーピング工程の際にフィターゼが添加される。
菌類フィターゼについてはＴ50℃およびpH＝5.5の条
件が理想的である（アルコ社のヨーロッパ特許出願0321
004参照）。そうすることによりこの工程を経た排産物
からの動物飼料にはフィチン酸塩の代りにリン酸が含ま
れることになる。

またフィターゼは大豆加工にも使用し得ると考えられ
てきた（アルコ社フィターゼ酵素、アルコ社発行の製品
情報ペンプレット、ラジャマキ、フィンランド）。大豆
ミールには高レベルの抗栄養因子フィチン酸塩が含まれ
ており、これがこのたんぱく質源をベビーフードや魚子
牛および他の非反芻動物の飼料に適さないものにしてい
る。この価値の高いタンパク質源を酵素的にグレードア
ップできればこの原料の栄養的かつ商業的価値が上が
る。

他の研究者も種々のフィターゼを研究しこの生産およ
び使用法に興味をもってきている。ウラー（Ullah）は
野生型アスペルギラスフィカス（Aspergillus ficuum）
からのフィターゼ精製操作を公表すると同時にこの精製
操作で得た産物の生化学的パラメーターのいくつかを測
定した（ウラー（Ullah）、A.（1988a）Preparative Bi
ochem.18、443−458）。ウラー（Ullah）によって得ら
れた適切なデータを以下の第１表に示す。

A.フィカム（ficuum）フィターゼたんぱく質のＮ−末
端アミノ酸配列がウラー（Ullah）により二度報告され
た；ウラー（Ullah）、A.（1987）Enzyme and Engineer
ing Conference IX、10月４−８ 1987、サンタバーバ
ラ、カリホルニア（ポスター発表）、およびウラー（Ul
lah）、A.（1988b）Preq.Biochem.18、459−471。ウラ
ー（Ullah）によって得られたアミノ酸配列は第1A図配
列Ｅに示す。

ウラー（Ullah）の報告にはいくつかの興味ある事項
が含まれている。第１にウラー（Ullah）（1988aおよび
1988b）によって報告されている“精製”調製物はSDS−
PAGEで２つのたんぱく質バンドを与える。我々はA.フィ
カム（ficuum）から精製したフィターゼには不純物が含
まれており、またウラー（Ullah）がフィターゼと同定
したSDS−PAGEに見られるバンドの１つはこの不純物に
由来するものであることを発見した。

この差はウラー（Ullah）によって公表されたアミノ
酸シーケンシングデータからも明らかである（1987、19
88b;第1A図配列Ａおよび配列Ｂを配列Ｃと比較せよ）。
実際にウラー（Ullah）によって報告されたフィターゼ
の内部ペプチドのアミノ酸配列の１つは（第1B図、配列
Ｅ）はウラー（Ullah）の操作で得られる調製物中に存
在し、SDS−PAGEの２つのバンドのうちの１つと見られ
る100kDaの混入たんぱく質に属すると結論した（ウラー
（Ullah）、1988aおよび1988b）。ウラー（Ullah）はこ
のような混入たんぱく質の存在を認めず、その代りにそ
れを別のタイプのフィターゼであると同定した。このよ
うな混入はフィターゼ活性をコードする実際のヌクレオ
チド配列の選択および単離を困難なものにする。さらに
このムラニー（Mullaney）等（繊維状菌類会議、４月、
1987、パシフィックグローブ、カルホルニア（ポスター
発表））もA.フィカム（ficuum）のフィターゼの特性を
報告している。しかし、この報告にも、“精製”たんぱ
く質調製物中のSDS−PAGEにおける２つのたんぱく質バ
ンド（１つは85kDa、もう１つは100kDa）について述べ
ている。彼等もこれらのたんぱく質バンドをフィターゼ
として同定した。微生物宿主をトランスホームする方法
も提案されたが報告はされなかった。フィターゼをコー
ドするDNA配列のクローニングおよび単離についての記
述もなかった。

フィターゼ生産に関する経済的方法はとりわけ動物飼
料工業において大きな貢献をするであろう。より経済的
なフィターゼの生産法の１つは高レベルのプペチドまた
はたんぱく質を発現させることで知られている種々の微
生物において酵素発現レベルを高める組換えDNA技術の
使用である。しかし今日までフィターゼ活性をコードす
るDNA配列の単離およびクローニングは報告されていな
い。

（本発明の概要） 混入はテストするたんぱく質の比活性も低下させるこ
とになる。ウラー（Ullah）が発表した配列に関してさ
らに述べると、彼は部位12のアミノ酸残基はグリシンで
あるとした。しかし、たんぱく質およびDNAシーケンジ
ングを用いて割々が調べたところによると一貫してこの
残基はグリシンではなくシスティンであることが分った
（第６図および第８図参照）、 最後にウラー（Ullah）はフィターゼが85kDaのたんぱ
く質であり、脱グリコシル化の後は61.7kDaの分子量を
持つことを公表した（ウラー（Ullah）、1988b）。初期
に報告された76kDaよりも（ウラー（Ullah）、Ａおよび
ギブソン（Gibson）、D.（1988）Prep.Biochem.17
（１）、63−91）かなり低いこの数字は加水分解により
放出される炭水化物の相対量とSDS−PAGEによる本来の
たんぱく質の見かけの分子量に基づくものであった。し
かし我々はグリコシル化フィターゼは85kDaの単一の見
かけ上の分子量を有しているが、一方脱グリコシル化た
んぱく質は脱グリコシル化の程度に応じて48〜56.5kDa
の範囲の見かけの分子量を有していることを発見した。

本発明は精製および単離したフィターゼをコードする
DNA配列を提供する。このフィターゼコードDNA配列の単
離およびクローニングは本発明のために特に開発した特
異的オリゴヌクレオチドプローブを使用して行なわれ
る。フィターゼをコードするDNA配列は菌類、特にアス
ペルギラス属の繊維状菌類から得ることが望ましい。

本発明のもう１つの目的は適当な発現宿主中フィター
ゼ活性を有するペプチドまたはたんぱく質を高度に発現
させ得る適当な調節領域に機能的に結合した、少なくと
も１つの、好ましくは相同的なフィターゼコードDNA配
列を少なくとも１コピー有する発現構築物を含むベクタ
ーを提供することである。

本発明により提供される発現構築物を微生物宿主細胞
にトランスホームするかゲノムに組込み得るベクター、
好ましくはプラスミドに挿入される。

さらに本発明の目的は先のパラグラフで述べたベクタ
ーでトランスホームしたトランスホーマント、好ましく
は微生物宿主を提供することである。本発明で提供され
るトランスホーメーション用宿主にはアスペルギラス属
（Asporgillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、ム
コール属（Mucor）およびペニシリウム属（Penicilliu
m）などの繊維状菌類、クルイベロミセス属（Kluyverom
yces）およびサッカロミセス属（Saccharomyces）など
のイーストまたはバチルス属（Bacillus）などのバクテ
リアがある。発現宿主としては特にアスペルギラス属
（Asporgillus）の繊維状菌類が好ましい。トランスホ
ームした宿主は経済的で工業的スケールの高レベル組換
えフィターゼを生産し得る。

もう１つの特徴として本発明はグリコシル化または非
グリコシル化型のフィターゼ活性を有する組換えペプチ
ドおよびたんぱく質、該非グリコシル化ペプチドおよび
たんぱく質の生産方法、不純物を含まないフィターゼ活
性を有するペプチドおよびたんぱく質、およびこれらの
組換え、または精製たんぱく質と反応するモノクローナ
ル抗体に関する。

本発明で得た精製野生型A.フィカム（ficuum）フィタ
ーゼと、ウラー（Ullah）の方法で得た精製野生型A.フ
ィカム（ficuum）フィターゼの生化学的パラメーターの
比較を以下の第１表に示す。特に比活性のデータが注目
されるが、そこには我々が得た精製たんぱく質はウラー
（Ullah）のたんぱく質の２倍の比活性を有することが
示されている。

さらに本発明はフィターゼ活性を有するたんぱく質を
コードするヌクレオチド配列を同たんぱく質のアミノ酸
配列とともに提供する。この配列は他の種、特に微生物
種からフィターゼ遺伝子を同定し、単離およびクローニ
ングを行うハイブリダイゼーションスクリーニング実験
に用いるオリゴヌクレオチドプローブの設計に使用し得
る。

また本発明で提供される配列は“第２世代”フィター
ゼの構築の原料にも使用される。“第２世代”フィター
ゼとは突然変異誘発技術（たとえば部位特異的突然変異
誘発など）で変化を受け、本発明の方法で生産した野生
型または組換えフィターゼとは性質が異なるフィターゼ
である。たとえば至適温度やpH、比活性または基質親和
性などをある工程で使用するのに適するよう変化させる
ことができる。

本発明において、フィターゼという語には種々のミオ
イノシトールホスフェートからの無機リンの除去に関す
る反応を触媒する酵素群が含まれる。

フィターゼ活性は多くの検定法で測定し得るが本発明
にはその選択は重要な意味をもたない。説明を目的とし
てフィターゼ活性は37℃、pH5.50において１μmol/min
の速度で1.5mMフィチン酸ナトリウムから無機リンを放
出する酵素量を測定して決定する。

本明細書全体を通して使用されている“フィターゼ”
という語はフィターゼ活性を有するペプチドおよびたん
ぱく質全てを含めて使われている。この点は配列Ａおよ
びＢ（本研究を通して得られた配列）と配列Ｃ（ウラー
（Ullah）、1988bで報告されている）を比較した第1A図
に示されている。この図は成熟A.フィカム（ficuum）フ
ィターゼたんぱく質の最初の４個のアミノ酸を欠くたん
ぱく質が本発明で得られたこと（配列Ａのたんぱく質は
最初の７個のアミノ酸を欠く）を示している。しかし、
これらのたんぱく質はフィターゼ活性を維持している。
フィターゼたんぱく質の完全なアミノ酸配列は、相当す
るヌクレオチド配列から誘導され第８図に示してある。

本発明で生産したフィターゼはフィチン酸塩をイノシ
トールと無機リン酸に変換するのに必要な種々の工程に
応用し得る。たとえば本発明のフィターゼの生産は微生
物フィターゼの生産コストを減じ、無機リン酸と競合す
るまでのインビボ価格／性能比を可能にする動物飼料の
経済的応用を実現させる。さらに別の利点として、***
物中のリン含量をかなり減少させることがあげられる。

無機リン酸と競争し得る価格で使用可能なフィターゼ
の適用は調合飼料工業の自由度を増し高品質の飼料を生
産すると考えられる。たとえば飼料にフィターゼを添加
した場合は無機リン酸塩の添加を省くことができ、かつ
フィチン酸塩を含む種々の原料の含有量も増やすことが
できる。

先に述べた動物飼料および大豆加工で使用するのに加
えて、本発明で得られるフィルターゼは以下に示す多様
な工業的用途に使用し得る； −ブタおよび家禽の液体飼料。飼料を与える前に数時間
その飼料を浸漬しておくことは一般に行なわれている。
この時点で酵素がフィチン酸塩をイノシトールと無機リ
ン酸に変換できるであろう。

−フィチン酸塩からイノシトールまたはイノシートル−
リン酸塩を生産する工業的プロセス； −デンプン工業や醸造工業などの発酵工業などのように
フィチン酸塩を含む基質を用いる他の工業的プロセス。

フィチン酸による金属イオンのキレート化はこれらの
ミネラルを生産微生物が使用できなくしてしまう。フィ
チン酸の酵素的加水分解はこれらの問題を解消する。

本発明の目的および利点は以下の詳細な説明でより明
確となろう。

図面の簡単な説明 第1A図；精製フィターゼについて決定されたＮ−末端
アミノ酸。ＡおよびＢと印されたアミノ酸配列は本発明
で提供されたものであり、各々等電点5.2および5.4をも
つフィターゼ亜型に由来する。配列Ｃはウラー（Ulla
h）（1987、1988b、上述）によって示されたものであ
る。配列ＡおよびＢの部位12にあるアミノ酸残基は本発
明によりグリシン残基ではないことが決定された〔＊は
明確な同定ができなかったことを示し、＊＊は残基が検
出されなかったことを示す〕 第1B図;CNBr切断によるフィターゼ内部フラグメント
のＮ−末端アミノ酸配列。ＡおよびＢと印されたアミノ
酸配列（各々見かけの分子量は約2.5kDaおよび36kDaで
ある）は本発明で提供されたものである。配列ＣからＥ
はウラー（Ullah）（1988b、上述）により報告されたも
のである）。

第1C図；本発明により粗フィターゼ試料中に存在する
ことが分った100kDaのたんぱく質のＮ−末端アミノ酸配
列。

第2A図；第1A図、ペプチドＡからＣのデータに基づい
て設計したオリゴヌクレオチドプローブ。

第2B図；第1B図、ペプチドＡおよびＢのデータに基づ
いて設計したオリゴヌクレオチドプローブ。

第３図；酸ホスファターゼをコードする遺伝子の単離
に用いたオリゴヌクレオチドプローブ。

第４図;A.フィカム（ficuum）のフィターゼ部位を含
むバクテリオファージラムダAF201の制限地図。矢印は
フィターゼ遺伝子の位置と転写の方向を示している。ク
ローン＃はpAN8−１（pAF28−１について）およびpUC19
（他の全てのサブクローンについて）においてファージ
AF201から指示されている制限酵素を用いて誘導された
サブクローンを示している。

第５図;pAF1−１の物理地理。pUC19に挿入されている
10kb BamH IフラグメントはA.フィカム（ficuum）由来
の酸ホスファターゼをコードする遺伝子全体を含んでい
る。

第６図；染色体フィターゼ遺伝子部位を含むプラスミ
ドpAF2−３、pAF2−６およびpAF2−７のヌクレオチド配
列の編集。フィターゼコード領域はヌクレオチド210番
から1713番の間にある。染色体遺伝子のヌクレオチド25
4番と355番の間はイントロンである。制限部位、フィタ
ーゼ開始および終止コドンおよびインドロンの位置など
の関連する特性も示してある。

第７図；シーケンスしたフィターゼ染色体部位の詳細
な物理地図；矢印はフィターゼコード領域の２つのエク
ソンの位置を示している。

第８図；フィターゼcDNAフラグメントの翻訳領域のヌ
クレオチド配列およびそれから誘導されるフィターゼた
んぱく質のアミノ酸配列；成熟フィターゼたんぱく質の
開始コドンは＋１の位置で示されている。36kDaの内部
たんぱく質フラグメントのアミノ末端はアミノ酸241番
に位置し、一方、2.5kDaたんぱく質フラグメントはアミ
ノ酸390番から開始する。

第９図；フィターゼ発現カセットpAF2−2Sの物理地
図。矢印は遺伝子の転写方向を示している。

第10図;A.フィカム（ficuum）NRRL3135トランスホー
マントにおけるフィターゼ過剰発現を示すIEF−PAGE。
同一条件下で生育させた等容量のA.フィカム（ficuum）
（レーン１）およびトランスホーマントpAF2−2S SP7
（レーン２）の培養上清をpH範囲4.5〜６のファスト−
システム（ファルマシア）IEF−PAGEゲルで分析した。
比較のため、均一にまで精製したA.フィカム（ficuum）
フィターゼ試料も別個に（レーン４）、もしくは上清と
混ぜて（レーン３）分析した。このゲルはテキストで述
べたホスファターゼ染色法（Ａ）もしくは一般的たんぱ
く質染色法（コマージブリリアントブルー、８）で染色
した。フィターゼのバンドはアステリスクで示してあ
る。

第11図;A.ニガー（niger）CBS513.88トランスホーマ
ントにおけるフィターゼの過剰発現を示すIEF−PAGE。
A.ニガー（niger）親株（レーン１）またはトランスホ
ーマントpAF2−2S＃８（レーン２）、pFYT3＃205（レー
ン３）および＃282（レーン４）の各培養上清等容量を
第10図の脚注に示したようにIEF−PAGEで分析した。ゲ
ルは一般的ホスファターゼ活性染色法（Ａ）または一般
的たんぱく質染色法（Ｂ）で染色した。フィターゼのバ
ンドはアステリスクで示してある。

第12図;pAB6−１の物理地図。pUC19中の14.5kb Hind
III DNA挿入物にはA.ニガー（niger）由来の全グルコア
ミラーゼ（AG）部位が含まれている。

第13図；ポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）
によるAGプロモーターフィターゼ遺伝子融合物生成を示
す模式図。使用するすべてのオリゴヌクレオチドの配列
はテキスト中に示した。

第14図；フィターゼ発現カセットpAF2−2SHの物理地
図。

第15図；中間構築物pXXFYT1、pXXFYT2およびフィター
ゼ発現カセットpXXFYT3（名称中のXXはリーダー配列
（Ｌ）を示している）の物理地図。p18FYT＃およびp24F
YT＃では各々18aaおよび24aaAGリーダー配列が挿入され
ているがpFYT＃の場合はフィターゼのリーダー配列が使
用されている。

第16図；プラスミドpFYT3ΔamdSの物理地図。

第17図；プラスミドpFYT3INTの物理地図。

第18図；フィターゼ/AG置換ブクターpREPFYT3の物理
地図。

第19図;Pvu II（Ａ）およびBamH I（Ｂ）で消化し、
かつプローブとして³²P標識化A.フィカム（ficuum）フ
ィターゼcDNAはハイブリダイズした微生物S.セレビシエ
（cerevisiae）（レーン２）、B.サブチラス（subtili
s）（レーン３）;K.ラクチス（lactis）（レーン４）、
P.クリソゲナム（crysogenum）（レーン５）、P.エルギ
ノーサ（aeruginosa）（レーン６）、S.リビダンス（li
vidans）（レーン７）、A.ニガー（niger）１μｇ（レ
ーン８）、A.ニガー（niger）５μｇ（レーン９）、ブ
ランク（レーン10）、C.サーモセラム（thermocellum）
（レーン11）の染色体DNAのオートラジオグラム。レー
ン１はマーカーDNA。

（発明の詳細な説明） 微生物において生産される選択されたたんぱく質をコ
ードする遺伝子のクローニングは様々な方法で行われ
る。１つの方法には目的たんぱく質の精製、そのＮ−末
端アミノ酸配列の決定、および該Ｎ−末端アミノ酸配列
に基づくDNAオリゴヌクレオチドプローブを用いた該微
生物のゲノムライブリーのスクリーニングがある。この
方法の成功例にはセファロスポリウム アクレモニウム
（Cephalosporium acremonium）からのインペニシリン
Ｎ−シンセターゼ遺伝子のクローニング（S.M.サムソン
（Samson）等（1985）Nature,318、191−194）およびア
スペルギラス オリゼ（Aspergillus oryzae）のTAKAア
ミラーゼをコードする遺伝子の単離（ボール（Boel）等
（1986）EP−Ａ−0238023）がある。この方法を用いフ
ィターゼをコードするアスペルギラス フィカム（Aspe
rgillus ficuum）の遺伝子を単離してみた。このたんぱ
く質を十分精製し、いくつかの生化学的パラメーターを
測定した。このデータをウラー（Ullah）（1988a）。こ
れらのデータを以下の第１表に示す。

フィターゼをコードする遺伝子を単離するため、上述
の方法に従って第１組のオリゴヌクレオチドプローブを
設計した（第2A図）。これらのプローブの設計はアミノ
酸配列データに基づいている。全操作のコントロールと
して、ウラー（Ullah）およびカミンス（Cummins）
（（1987）Prep.Biochem.17、397−422）によって発表
されたたんぱく質データを用い酸ホスファターゼをコー
ドする遺伝子を単離するため同一の操作を行った。酸ホ
スファターゼの場合、相当する遺伝子は困難なく単離さ
れた。しかし、フィターゼの場合、状況は少し異なって
いた。Ｎ−末端アミノ酸配列から誘導したプローブを用
いる実験を多数行ったにもかかわらずフィターゼをコー
ドする遺伝子を含むと同定されるゲノムDNAフラグメン
トまたはクローンはゲノムライブラリーから単離するこ
とができなかった。

この問題を解決するため精製フィターゼをCNBr処理で
切断し、生じたたんぱく質フラグメントを単離した。こ
れらのフラグメントのＮ−末端アミノ酸配列を決定し
（第1B図）、新しいこれらのデータに基づきオリゴヌク
レオチドプローブを設計した（第2B図）。驚くべきこと
に新しいオリゴヌクレオチドプローブは特異的DNAフラ
グメントを同定し、したがってゲノムライブラリーから
のクローンを明確に同定するのに適していた。新しいク
ローンまたはそれらから単離されたDNAフラグメントお
よび第１組のオリゴヌクレオチドプローブまたはこれら
の第１組をプローブを用いて単離したクローン間にクロ
スハイブリダイゼーションは見られなかった。

第２組のプローブも関連フィターゼのコード配列を同
定するのに使用し得ると考えられる。

新しく単離したクローンをノーザンブロットハイブリ
ダイゼーションのプローブとして用いた。フィターゼ生
産菌糸体からmRNAを単離すれば個々のmRNAを検出するこ
とができる。非フィターゼ生産菌糸体からのRNAを試し
た場合、ハイブリダイゼーションシグナルは見られなか
った。このmRNAは約1800bの大きさを有しており、理論
的には最高分子量約60kDaのたんぱく質を生ずる。この
値は非グリコシル化たんぱく質に対して測定された分子
量およびDNA配列から誘導されるたんぱく質の分子量に
相当する。

さらに、トランスホーメーションで菌類細胞に導入さ
れたとき、フィターゼ活性の増加が示された。結果的に
このことはフィターゼをコードするヌクレオチド配列が
実際に単離されたことを意味している。精製したフィタ
ーゼ酵素およびそこから得られたCNBrフラグメントにつ
いて決定されたアミノ酸配列はクローン化した遺伝子に
ついて決定された配列から誘導されるアミノ酸配列と一
致した。このヌクレオチド配列および誘導されるアミノ
酸配列を第６図および第８図に示した。これらはフィタ
ーゼをコードするクローン化した配列を示している。

フィターゼをコードするヌクレオチド配列の単離によ
り、遺伝子増巾、たとえばプロモーター、分泌シグナル
などの調節要素の交換、もしくはこれらの組合せなどの
組換えDNA技術を応用して工業的スケールでフィターゼ
を経済的に生産できる。

従って本発明にはフィターゼ活性を有するペプチドま
たはたんぱく質を高レベルに効率よく発現し得、かつ望
ましい場合には同様に酸ホスファターゼも効率よく発現
し得るトランスホームした発現宿主も含まれる。目的と
する発現宿主はアスペルギラス（Aspergillus）、トリ
コデルマ（Trichoderma）、ムコール（Mucor）およびペ
ニシリウム（Penicillium）属から選ばれる繊維状菌類
クルイベロミセス（Kluyveromyces）およびサッカロミ
セス（Saccharomyces）から選ばれるイーストおよびバ
チルス（Bacillus）などのバクテリアである。発現宿主
には内在たんぱく質を効率的に分泌し得るものを選択す
ることが望ましい。

工業的株としてはアスペルギルス（Aspergillus）特
にニガー（niger）、フィカム（ficuum）、アワモリ（a
wamori）またはオリゼ（oryzae）が興味深い。別にトリ
コンデルマ リーセィ（Trichonderma reesei）、ムコ
ール ミーヘイ（Mucor miehei）、クルイベロミセス
ラクチス（Kluyveromyces lactis）、サッカロミセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、バチルスサ
ブチリス（Bacillus subtilis）またはバチルス リチ
ェニホルミス（Bacillus licheniformis）も使われる。

発現構築物には発現すべき望ましい酵素産物をコード
するヌクレオチド配列を含み、かつ通常、宿主中で機能
しその産物ペプチドまたはたんぱく質の分泌を起こすシ
グナルペプチドを有する。

本発明に従がい種々のシグナル配列が用いられる。発
現されるクローン化ヌクレオチド配列と同種のシグナル
配列が使用される。一方、別に宿主のターゲット部位に
ある遺伝子のシグナル配列と実質的に同種のシグナル配
列を用いると相同組換えが容易に起こる。さらに、選択
した宿主からの分泌を改善するよう設計したシグナル配
列も使用される。たとえばヴォン ヘイン（Von Heyn
e）（1983）Eur.J.Biochem.133、17−21;およびパール
マン（Perlman）およびハルバーソン（Hal Verson）（1
983）J.Mol.Biol.167、391−409参照。シグナル配列を
コードするDNA配列をプロセシングシグナルをコードす
る配列を介し（切断認識部位）目的たんぱく質をコード
する配列に直接接合する場合と、短かい架橋、通常10個
以下のコドンを介して結合する場合がある。

本発明の範囲で使用する分泌シグナル配列は発現させ
るクローン化したヌクレオチド配列と同種のシグナル配
列、18個のアミノ酸からなるグルコアミラーゼ（AG）シ
グナル配列および24個のアミノ酸からなるグルコアミラ
ーゼ（AG）シグナル配列（後者の２つは発現するヌクレ
オチド配列と同種の場合と異種の場合がある）が望まし
い。

目的の発現産物、またはヌクレオチド配列が発現宿主
と同種の場合も異種の場合もある。

“同種"DNAとは同じ属に由来するDNAと定義する。た
とえばアスペルギラス（Aspergillus）をアスペルギラ
ス（Aspergillus）のDNAでトランスホームする場合であ
る。このようにすることで以前にその属に存在しなかっ
た新しい性質を導入することなしにその菌類の属の既存
の性質を改善することができる。

“異種"DNAとは１つ以上の属に由来するDNAで、すな
わち前のパラグラフで述べた例から分るようにアスペル
ギラス（Aspergillus）以外の属に由来するDNAでアスペ
ルギラスで発現される場合のDNAと定義される。

フィターゼ活性をコードするヌクレオチド配列は菌類
を起源とすることが望ましい。さらにこのフィターゼコ
ードヌクレオチド配列はアスペルギラス（Aspergillu
s）属に由来することがより好ましい。またその配列は
アスペルギラス フィカム（Aspergillusficuum）また
はアスペルギラス ニガー（Aspergillus niger）種に
由来することが最も好ましい。

問題のヌクレオチド配列の読み枠の５′側領域には転
写開始調節領域（またはプロモーター）が含まれる。宿
主中で機能する領域なら、発現すべきフィターゼコード
ヌクレオチド配列と同種のプロモーターも含めてあらゆ
る領域を使用し得る。しかし、ほとんどの場合、使用す
る領域は標的部位の領域と同種のものとなる。これには
標的部位の発現産物を問題とする発現産物で置換する効
果がある。標的部位にコードされているたんぱく質の発
現および分泌のレベルが十分なものであればこの転写開
始調節領域は一般に満足すべきものであることが分る。
しかし、場合によっては標的部位遺伝子よりもより高い
転写が望まれることもあるし、また特定の誘導剤を用い
た誘導可能な発現を行うこともある。このような場合、
標的部位遺伝子の領域とは異なる転写開始調節領が使用
される。繊維状菌類内で機能する多くの転写開始調節領
域が知られている。これらの領域にはグルコアミラーゼ
（AG）、菌類アミラーゼ、酸ホスファターゼ、GAPDH、T
rpC、AmdS、AlcA、AldA、ヒストンH2A、pry4、PyrG、イ
ソペニシリンＮシンセターゼ、PGK、酸プロテアーゼ、
アシルトランスフェラーゼなどをコードする遺伝子由来
のものが含まれる。

その標的部位は高発現たんぱく質遺伝子、すなわち発
酵工程の終りにその発現産物が少なくとも約0.1g/の
濃度にまで発現される遺伝子をコードしていることが望
ましい。このプロセスでとり扱われる目的たんぱく質は
様々である。このような遺伝子の例としてはグルコアミ
ラーゼ（AG）をコードする遺伝子が挙げられる。目的遺
伝子としてはその他に菌類α−アミラーゼ、酸ホスファ
ターゼ、プロテアーゼ、酸プロテアーゼ、リパーゼ、フ
ィターゼ、およびセロビオヒドラーゼがある。特に好ま
しい標的部位にはA.ニガー（A.niger）のグルコアミラ
ーゼ遺伝子、A.オリゼ（oryzae）の菌類アミラーゼ遺伝
子、T.リーセイ（reesei）のセロビオヒドラーゼ遺伝
子、ムコール ミエヘイ（Muror miehei）の酸プロテア
ーゼ遺伝子、クルイベロミセス ラクチス（Kluyveromy
ces lactis）のラクターゼ遺伝子またはサッカロミセス
セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）のインバー
ターゼ遺伝子がある。

転写開始調節領域には目的遺伝子、標的部位、または
その他の簡便な配列に由来する。構築物が目的の遺伝子
の下流に（転写の方向で）さらに目的配列を含む場合、
転写終止調節領域はこれが標的部位と同種であるならそ
の同種隣接領域よりも実質的に小さくなければならな
い。

通常、発現構築物の１部としてか、または発現構築物
とは別に存在し、結果的に目的遺伝子とは異なる部位に
組込まれた選択可能マーカーを用いる。本発明の組換え
分子は工業生産に適した宿主株へトランスホームするこ
とが望ましいので、トラスホーメーションをモニターす
る選択マーカーは優性選択マーカー、すなわち宿主株に
変異に導入せずに使用できる選択マーカーであることが
望ましい。これらの例にはトランスホーマントを決った
栄養培地で生育させ得るマーカー（たとえばA.ニズラン
ス（nidulans）amdS遺伝子はA.ニガー（niger）トラン
スホーマントの単一窒素源としてアセトアミドを用いた
生育を可能とする）または抗生物質に対する耐性を付与
するマーカー（たとえばble遺伝子はフレオマイシンに
対する耐性、hph遺伝子はハイグロマイシンＢに対する
耐性を付与する。）がある。

選択マーカーはそれ自身転写および翻訳開始および停
止調節領域を有し、そのマーカーの独立した発現が可能
である。先に述べたように非常に多くの転写開始調節領
域が知られており、これらのマーカー遺伝子と組合せて
用いられている。抗生物質耐性が採用された場合、選択
用抗生物質の濃度はその種類に応じて約30〜300μg/ml
の範囲で使用される。

制限処理、相補的制限部位の結合とライゲーション、
突出末端の平滑化と平滑末端のライゲーション、Bal31
再結合、プライマー修復、インビトロ突然変異誘発など
の従来技術を用いて様々な配列を連結し得る。適当な場
合はアダプターやポリリンカーを用い従来法で導入ある
いは除去を行なって発現構築物の構築を容易に行うこと
ができる。構築物合成の各段階で、フラグメントのクロ
ーン化、制限酵素、シーケンジングやハイブリダイゼー
ションによる解析が行ない得る。クローニングには多く
のベクターが使用可能でありその選択は本発明にとって
本質的なものではない。通常クローニングには大腸菌を
用いる。

隣接領域には標的部位の読み枠の少なくとも一部、特
に標的部位遺伝子の５′側および３′側調節領域を含む
か、もしくはその調節領域を越えて伸びている。その隣
接領域は少なくとも100bpであり普通は少なくとも200bp
であるが、500bp以上のこともある。この隣接領域は標
的遺伝子を破壊し、その発現を妨害するように選択され
る。このことは発現カセット（発現すべき配列と場合に
よっては、シグナル配列、転写開始調節領域配列およ
び、または転写停止調節領域配列などの付加的要素を含
む）をその５′領域に隣接する読み枠に挿入すること、
標的遺伝子の全てまたは一部を発現構築物で置換するこ
と、または標的部位の転写開始調節領域とその読み枠の
間に発現構築物を介在させることにより行ない得る。す
でに述べたように低下調節領域が標的部位の領域と同種
の場合、その３′隣接領域は実質的に構築物中に存在す
る停止調節領域より大きくなければならない。

また本発明は“第２世代”フィターゼ、すなわちここ
で単離した酵素とは異なる性質を有するフィターゼを構
築するための原料を提供する。第２世代フィターゼは至
適温度や至適pH、比活性や基質親和性、または所定の工
程に応用する場合の種々の適合性が変化したものといえ
る。大腸菌はこのような突然変異誘発（すなわち部位指
定突然変異誘発）にもっとも適した宿主である。大腸菌
はフィターゼ遺伝子中に存在するイントロンを除去する
スプライシング機構を欠いているため、フィターゼのcD
NAクローンは大腸菌中で発現するよう選択された配列で
ある。このcDNA配列は従来法を用いて容易に変異させる
ことができ、その後この変異遺伝子を望ましい発現構築
物中に導入する。

この構築物は一本鎖または二本鎖のクローニングベク
ターとして宿主にトランスホームすることもできるし、
また望まれるならクローニングベクターから除くことも
できる。このクローニングベクターはプラスミドである
ことが好ましい。通常プラスミドは目的の遺伝子の約1k
bp以内で線状化される。本発明のフィターゼ生産のため
の発現構築物は選択された発現ホストのゲノム中に導入
されることが望ましい。

繊維状菌類のトランスホーメーションには多くの方法
がある。この方法にはプロトプラスト融合またはトラン
スホーメーション、エレクトロポレーション、および微
粒子衝突法がある。プロトプラストトランスホーメーシ
ョン法はうまく行き都合が良い。

までKClまたはソルビトールなどの浸透圧安定剤の存
在下、目的の菌類の菌糸体を細胞膜の酵素消化によりプ
ロトプラストに変換する。このプロトプラストによるDN
Aの取り込みはCaCl₂やポリエチレングリコール濃厚溶液
により促進される。後者の物質はプロトプラストの凝集
を起こす。この過程でトランスホームDNAが凝集体の中
に包含され、このプロトプラストに取り込まれる。つづ
いてこのプロトプラストは浸透圧安定剤および適当な場
合はトランスホームDNA上に耐性をコードしてある選択
試薬を含む固形培地上で再生させる。

トランスホーマントの選択後、目的遺伝子の存在は種
々の方法で測定できる。発現産物が宿主と異種である場
合抗体を使用することにより、目的遺伝子の発現を検出
し得る。それとは別にサウザンまたはノーザンブロット
を用いて組込み遺伝子または転写産物の存在を検出でき
る。

目的のヌクレオチド配列又は発現構築物の増巾は、ト
ランスホームベクターへの多数の構築物コピーの導入ま
たは選択マーカーとしてのandS遺伝子の使用など標準的
方法で行うことができる（たとえばウェイナンス（Wein
ans）等（1985）Current Genetics,９、361−368）。増
巾するDNA配列には上述どおり発現宿主と同種または異
種のDNAが含まれる。

それからこの細胞を簡便な栄養培地で生育させる。低
濃度のプロテアーゼインヒビター、たとえばフェニルメ
チルスルホニルフルオライド、α２−マクログロブリ
ン、ペプスタチンなどが使われる。通常この濃度は約１
μg/mlから1mg/mlの範囲である。目的たんぱく質の変性
を回避または減少させるためプロテアーゼ遺伝子を不活
性化することもできる。

このトランスホーマットをバッチあるいは連続発酵器
で生育させ、栄養培地を単離して目的たんぱく質を抽出
する。

この産物を精製する必要がある場合は、種々の方法、
たとえばクロマトグラフィー（たとえばHPLC）、溶媒−
溶媒抽出、電気泳動、これらを組合せた方法などを行
う。

また本発明は発酵培地（場合によっては精製したも
の）を濾過し、ついで２回目の無菌濾過を行なって濾液
を濃縮する処理法も提供する。このようにして得た濃縮
液は以下のように使用する。

ａ） 攪拌しながらこの濃縮液にアセトンを最終濃度60
％（v/v）となるように添加しフィターゼおよびその他
のたんぱく質を沈澱させる。この沈澱は35℃、減圧下で
乾燥させる。乾燥粉末をグラインディングした後、適用
実験に用いるようにこの酵素産物を使用する。回収率は
約90％である。

ｂ） この濃縮液を従来の噴霧乾燥法を用いて分霧乾燥
する。回収率は80〜99％である。

ｃ） この濃縮液を小麦もみがらなどのキャリヤー物質
と混ぜる。この混合物を噴霧塔または流動床中で乾燥さ
せる。

ｄ） この濃縮液にたとえばゾルビトールを添加して浸
透圧を安定化させる。安息香酸などの防腐剤を加えて微
生物の混入を防ぐ。

これら４種の加工物は調合製造業、合成飼料業、その
他の配給業者および農家に販売される。

ここに示す例は本発明を説明するものでこれを制限す
るものではない。本発明のフィターゼ遺伝子は他の微生
物由来のフィターゼコード遺伝子の単離を目的とした異
種ハイブリダイゼーション実験で使用し得ることは当業
者にとって明白であろう。

（例１）A.フィカム（ficuum）NRRL3135の発酵 アスペルギラス フィカム（Aspergillus ficuum）NR
RL 3135株はノーザンリージョンリサーチラボラトリ
ー、USDA、1815ノースユニバーシティーストリート、ペ
オリア、イリノイ州、USAから入手した。菌類胞子調製
は標準法に従って行った。

胞子のその細胞は三角フラスコ中での一連のバッチ発
酵を介して10の発酵槽に移した。バッチ培養後、この
発酵槽の中味を最終的な500リットルバッチ発酵用の接
種物として用いた。

使用した培地には91g/のコーンスターチ（BDHケミ
カルズ社）;38g/グルコール・H₂O;0.6g/ MgSO₄・7H
₂O;0.6g/ KCl;0.2g/ FeSO₄・7H₂Oおよび12g/ KN
O₃が含まれている。このpHは4N NaOHまたは4N H₂SO₄
を用いた自動滴定により4.6±0.3に維持した。

細胞は25％空気飽和の溶存酸素濃度に自動制御しなが
ら28℃で増殖させた。発酵10日後でフィターゼ生産は５
〜10U/mlの最高レベルに達した。

（例２） A.フィカム（ficuum）フィターゼの精製と特性 A.フィターゼ活性検定 培地濾液（必要ならば希釈）または上清100μまた
は参照として水100μに以下の組成のインキュベーシ
ョン混合物を加える。

−0.25M酢酸ナトリウムバッファ pH5.5、または −グリシン−HClバッファ、pH2.5 −1mMフィチン酸ナトリウム塩、 −水900μとなるまで。

この混合物を37℃で30分間インキュベートする。反応
は10％TCA（トリクロロ酢酸）1mlを加えて停止する。反
応停止後・2mlの試薬（50mlのモリブデン酸アンモニウ
ム溶液（2.5g（NH₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂Oおよび8ml H₂SO₄を
水で250mlまで希釈したもの）中3.66g FeSO₄・7H₂O溶
液）を添加する。

750nmの青色強度を分光測定する。この測定値は０〜1
mmol/の範囲のリン酸校正曲線により放出されたリン
酸量を指定する。

（ホスファターゼ） ホスファターゼ活性を有する成分は一般のホスファタ
ーゼを用いた等電点フォーカシングにより検出する。こ
のゲルをα−ナフチルホスフェートとファーストガーネ
ットGBC塩（シグマ、各々0.1％および0.2％（w/v）の0.
6M酢酸ナトリウムバッファ（pH5.5）溶液とインキュベ
ートする。黒色沈澱が出現するこの反応はメタノール：
酢酸（30:10％、v/v）で停止するが、さもなければ蒸留
水ですすぐことにより必要とされるフィターゼ活性たん
ぱく質を回収する。

B.A.フィカム（ficuum）フィターゼの精製 フィターゼはA.フィカム（ficuum）NRRL3135の培養培
地から均一になるまで精製した。まずこの培地を濾過で
無菌状態にした。この培養濾液はつづいて30kDカットオ
フフィルターを用いたフィルトロン限外濾過ユニットで
さらに濃縮する。この試料のpHおよびイオン強度は試料
を10mM酢酸バッファ（pH4.5）で洗うことにより調整し
た。この限外濾過操作による最終濃縮率は約20倍であっ
た。

この試料をウォーターズ分取用650アドバーンスプロ
ティン精製システムでカチオン交換カラムにチャージす
る（HR16/10 20mlカラム中SPセファロースファースト
フロー、いずれもファルマシアから入手可能）。結合し
たたんぱく質は酢酸バッファ中０〜1Mの塩化ナトリウム
勾配で溶出する。フィターゼは約250mM NaClで溶出す
る。フィターゼ活性含有フラクションを採取し、濃縮後
限外濾過で脱塩する。この溶液をアニオン交換カラムに
チャージし（ファルマシア、HR16/10 20mlカラム中Ｑ
−セファロースファーストフロー）、再び先に述べたよ
うに酢酸バッファ中０〜1Mの塩化ナトリウム勾配で溶出
する。フィターゼは約200mM NaClで溶出する。

この精製ステップは約40〜50U/mgたんぱく質の比活性
を示す部分精製フィターゼ調製物を与え、これは25倍の
精製に相当する。

部分精製フィターゼの純度分析は分子量約100kDaの主
要不純物の存在を示している（第1B図、配列Ｅ）。等電
点フォーカシングは３〜４個のフィターゼ亜型を含むい
くつかのフィターゼ活性含有酵素の存在を示している
（5.0〜5.4の間の等電点）（第1A図、配列Ａおよび
Ｂ）。

均一なフィターゼ調製物を得るため、アンホリンPAG
プレート（pH範囲４〜6.5）上LKBマルチフォーシステム
での等電点フォーカシングにより部分精製フィターゼ成
分の分離でさらに２倍の精製を行った。フィターゼ活性
を有するたんぱく質（フィターゼを含む）は先に述べた
一般的ホスファターゼ染色法で検出した。つづいて目的
バンドをゲルから切り出し、そのゲル片を10mM酢酸ナト
リウムバッファ（pH5.5）中16時間インキュベーション
することにより活性たんぱく質を溶出させる。このたん
ぱく質フラクションを例２で述べたフィターゼ比活性検
定で分析し、フィターゼフラクションと他の酸ホスファ
ターゼとを区別する。フィターゼの最終精製度は約60倍
であった（最終精製物の比活性は約100U/mgたんぱく質
である）。この最終精製ステップでも異なるフィターゼ
亜型を単離し得る（第1A図、配列ＡおよびＢ）。

A.フィカム（ficuum）フィターゼに対するモノクロー
ナル抗体を調製した。これは有効な精製手段を提供す
る。この抗体を臭化シアン活性化セファロース4Bに結合
させる（4mg/mlゲル）。このマトリクスを免疫アフィニ
ティーカラムに用いる。このマトリクスは1ml当り約1mg
のフィターゼを結合することが示された。フィターゼは
このアフィニティーカラムから活性のロスなしにpH2.5
バッファ（100mMグリシン−HCl、500mM NaCl）で溶出す
る。この操作を用いて単一ステップで粗培養濾液から80
％の回収および60倍の精製度で均一のフィターゼを単離
し得る。

C.フィターゼの脱グリコシル化 A.フィカム（ficuum）フィターゼ（70μｇたんぱく
質）を総容積30μで0.2Mリン酸ナトリウムバッファpH
8.6および1.10−フェナントロリン中2.5UのＮ−グリカ
ナーゼ（ゼンザイム）とインキュベートした。37℃、16
時間後、脱グリコシル化度を電気泳動でチェックした
（ファーストシステム、ファルマシア社）。フィターゼ
の見かけの分子量は85kDaから約56.5kDaに減少している
ことが分った。糖たんぱく質として本来のフィターゼを
同定し得る過ヨウ素酸シッフ（PAS）糖染色ではこのた
んぱく質に結合した炭水化物は検出されなかった。さら
に炭水化物の完全な除去は感度の高いレクチン−ブロッ
ティング法で実証した。本来のおよび脱グリコシル化し
たフィターゼ（いずれも1.5μｇ）を標準的SDS−PAGEゲ
ルで泳動し、ついで30V、16時間かけて25mMトリス−グ
リシンバッファpH8.3、20％（v/v）メタノール中PVDFメ
ンブレン（イムノビロン、ミリポア社）に電気泳動的に
移行させた。

つづいてこのメンブレンをリン酸緩衝液中１％（w/
v）ウシ血清アルブミンとインキュベートし、さらにコ
ンカナバリンＡ−パーオキシダーゼ（シグマ、リン酸緩
衝液中10μg/ml）とインキュベートした。このパーオキ
シダーゼを４−クロロ−１−ナフトール（シグマ）で染
色した。

この高感度法でも脱グリコシル化フィターゼに結合す
る炭化水素は検出されなかった。

脱グリコシル化後フィターゼは活性を完全に失ってお
り、これはおそらく酵素の凝集によるものであろう。

（例３） フィターゼのアミノ酸配列の決定およびオリゴヌクレ
オチドプローブの設計 A.N末端アミノ酸配列の決定 フィターゼをSDS−PAGEまたはIEF−PAGEからPVDFブロ
ッティングメンブレン（イムノビロン、ミリポア社）へ
電気泳動的に移す。エレクトロブロッティングは10％
（v/v）メタノールを含む10mM CAPS（３−シクロヘキ
シルアミノ−プロパンスルホン酸）バッファ（pH11.0）
中30V、４℃で16時間かけて行った。たんぱく質の位置
はコマージブリリアントブル染色で検出した。目的のバ
ンドを切り出し、メタノールで脱色してから気相シーケ
ンシングを行った。この操作は数個の調製物を用い数回
繰り返した。この結果を第1A図に示す（配列Ａおよび
Ｂ）。

また粗調製物中に存在する100kDaのたんぱく質につい
てもアミノ酸配列を決定した。このたんぱく質のデータ
を第1C図に示す。この配列はアスペルギラス ニガー
（Aspergillus niger）から単離した酸ホスファターゼ
と（マクレー（MacRae）等、（1988）Gene 71、339−34
8）かなりのホモロジーを示している。

B.内部のアミノ酸配列の決定 （臭化シアンによるたんぱく質の断片化） 均一に精製したフィターゼを限外濾過（マイクロコン
セントレーターセントリコン30、アミコン社）を用いて
100mM NaHCO₃に移す。つづいてこのたんぱく質を凍結乾
燥後70％（v/v）トリフルオロ酢酸に溶かし約300倍モル
過剰量のCNBrと６時間インキュベートする。反応は混合
物を水で希釈することにより停止させる。生成したフラ
グメントを再び凍結乾燥する。ついでこの試料をDTT
（ジチオスレイトール）を含むSDS−PAGEサンプルバッ
ファにとかし、断片化の度合いをPAGEで測定した。分析
PAGEは20％SDS−PAGEゲルを用いファルマシアファース
ト−システムユニットで行った。ゲルは予備運転して連
続的バッファシステムを作り、小さいペプチドの分離を
良くした（マニュアル参照）。コマージブリリアントブ
ルーでは小さいペプチドは検出できないのでペプチドの
染色には銀染色を用いた。その操作の結果はフィターゼ
の2.5kDa、36kDa、57kDaおよび80kDaの分子量をもつペ
プチドへの完全な分解を示した。このペプチドを気相シ
ーケンジングするためジガール（Schagger）およびジャ
ゴー（Jagow）（1987、Anal.Biochem.166、368−379）
によって報告されているSDS−トリシン−PAGEとそれに
つづく上述のエレクトロブロッティングにより単離し
た。

57kDaフラグメントのＮ末端は最初の４個のアミノ酸
が欠けていること以外ウラー（Ullah）（1988b、上述）
によって決定されたフィターゼのＮ−末端と同じであっ
た（第1A図、配列Ｂ）。2.5kDaおよび36kDaペプチドの
Ｎ末端配列を第1B図配列ＡおよびＢに示す。

C.オリゴヌクレオチドプローブ 第1A図および第1B図に示したアミノ酸配列に基づいて
オリゴヌクレオチドプローブを設計し、アプライドバイ
オシステムズABI・380B DNA合成機を用いて合成した。
これらのオリゴヌクレオチドを第2A図および第2B図に示
す。

（例４） （ゲノムブロットおよびゲノムライブリーの第１組オリ
ゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーショ
ン） 標準法（たとえばイエルトン（Yelton）等、（1984）
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、1470−1474）を用い液体
窒素中菌糸体をグラインドすることによりA.フィカム
（ficuum）のゲノムDNAを単離した。ゲノムライブリー
は標準法（たとえばマニアチス（Maniaris）等（1982）
モレキュラークローニング、ラボラトリーマニュアル、
コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨー
ク）に従がいA.フィカム（ficuum）NRRL 3135染色体DNA
をSau3Aで部分消化したものを用いてバクテリオファー
ジラムダEMBL3に構築した。このようにして作成したゲ
ノムライブラリーには60〜70倍のA.フィカム（ficuum）
ゲノムを含んでいる。このライブラリーをラムダEMBL3
スタッファフラグメントとのハイブリダイゼーションに
より挿入のないプラークの出現をチェックした。このラ
ムダEMBL3プローブにハイブリダイズするのはプラーク
の１％以下であった。挿入物の大きさは13〜17kbであっ
た。

ゲノムライブラリーのスクリーニングに適した条件や
プローブを見つけるためゲノムDNAをいくつかの制限酵
素で切断し、アガロースゲルで分離後、業者の説明に従
がいジェネスクリーンプラス上にブロッティングした。
このブロットに全てのオリゴヌクレオチドプローブをハ
イブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは種々の
ストリンジェンシー条件で行った（ハイブリダイゼーシ
ョンは６×SSC、40〜60℃、洗浄は0.2×SSCまで、65
℃）。プローブ1068および1024（第2A図）をゲノムライ
ブラリーのスクリーニング用に選んだ。もっともこの２
つのプローブを特異的にハイブリダイズする共通のDNA
フラグメントは同定されなかった。酸ホスファターゼプ
ローブ1025（第３図）は特異的かつ分離のよいハイブリ
ダイゼーションシクナルを与える。したがって酸ホスフ
ァターゼのゲノムライブラリーのスクリーニングにはこ
のプローブを選択した。

これら３つ全てのプローブを用いてゲノムライブラリ
ー中のハイブリダイジングプラークを同定し得た。プロ
ーブ1025（酸ホスファターゼ）に対応するハイブリダイ
ゼーションシグナルは強くかつ再現性に秀れていた。プ
ローブ1024および1068（フィターゼ）を用いて得られる
ハイブリダイゼーションシグナルの強度は様々であっ
た。２つのシリーズ間にクロスハイブリダイゼーション
は見られなかった。３つの全てのシリーズのプラークを
再スクリーニングし、８個の単一のハイブリダイゼーシ
ョンポジティブプラークからDNAを単離した（マニアチ
ス（Maniaris）等、上述）。各シリーズにおいて、同一
のハイブリダイジングフラグメントを含むクローンが同
定された。このことはこのクローンの挿入物が関連して
おり、おそらく、同じゲノムDNA領域に重複しているこ
とを示している。ここでも２つのフィターゼ特異的シリ
ーズ（プローブ1024および1068）を用いたときクロスハ
イブリダイゼーションは見られなかった。このことは２
つのシリーズのクローンの単離に用いた両プローブがこ
のたんぱく質のＮ−末端アミノ酸配列から得たものであ
るにもかかわらず異なるゲノムDNAフラグメントが同定
され、かつクローン化されたことを示している。

これら３つのシリーズ全てのクローンを誘導および非
誘導菌糸体から単離したmRNAを含むノーザンブロットと
ハイブリダイズさせた（例６）。酸ホスファターゼ特異
的クローン、並びにこのクローン由来の3.1kb Sal I内
部フラグメントは誘導mRNAサンプルに優先的にハイブリ
ダイズした。酸ホスファターゼ特異的プローブによって
同定されたmRNAは約1800b長であり、これはこのたんぱ
く質の大きさと一致している（68kDa、ウラー（Ullah）
およびカミンス（Cummins）（1987）Prep.Biochem.17、
397−422）。フィターゼ特異的クローンに対する特異的
mRNAのハイブリダイゼーションは示されなかった。した
がって我々は上述の方法がフィターゼをコードする遺伝
子のクローニングには適さないと結論した。さらにこの
方法が酸ホスファターゼをコードする遺伝子の同定には
うまく使用できることからこの失敗がこの方法を行うに
当っての失敗によるものではないと結論できる。酸ホス
ファターゼ遺伝子を含むラムダクローンは1980年４月24
日、オランダ、バーン、セントラル ブリュー ボア・
シメルカルチャー（the Centraal Burean voor Schimme
lcnltures）に、受理番号CBS・214.89で寄託した。10kb
BamH IフラグメントをファージZ1から単離しpCU19にサ
ブクローンした。このサブクローンには酸ホスファター
ゼをコードする全遺伝子が含まれている。このサブクロ
ーン、pAF1−１（第５図）は1989年４月24日、CBS 213.
89として寄託された。

（例５） ２組のオリゴヌクレオチドプローブを用いたフィターゼ
コード遺伝子の単離 CNBrで生成したフラグメントのＮ−末端アミノ酸配列
を用いてプローブを設計し（第2B図、プローブ1295、12
96および1297）、これらを上述のゲノムDNAにハイブリ
ダイズした。フィターゼ遺伝子の単離へのこれらのプロ
ーブの使用可能性を試すためにこれらのプローブを用い
たゲノムブロットのサウザーンハイブリダイゼーション
を行った。これらのプローブは非重複領域に由来するに
もかかわらず、これら３つ全てのプローブを用いて対応
する長さのハイブリダイジングフラグメントを同定でき
た。新しい組のプローブと、第１組のプローブを用いて
単離したクローンとの間にはハイブリダイゼーションは
起こらなかった（例４）。それゆえ、別個の実験で３つ
全てのプローブを用いてゲノムライブラリーを再スクリ
ーニングした。また各プローブで単離したクローン群
（ラムダAF201、219、241および243）も両方の別のプロ
ーブにハイブリダイズした。このことは３種類のプロー
ブを用いた場合単一のゲノム領域からクローンが単離さ
れたことを示している。新しく単離したクローンをプロ
ーブ1024および1068とハイブリダイズする計画を立て
た。両方の場合、これらのプローブを用いて単離したク
ローンに両プローブがうまくハイブリダイスする条件で
は新しく単離したクローンへのハイブリダイゼーション
は起こらなかった（例４参照）。このことは新しく単離
したクローンは精製フィターゼのＮ末端から誘導したプ
ローブとホモロジーを有していないことを示している。

３つの全てのプローブ（1295〜1297）とハイブリダイ
ズするランダムEMBL3−クローンはラムダAF201（第４
図）と命名し、1989年３月９日CBS155.89として寄託し
た。

３つの全てのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリ
ダイズするラムダAF201の5.1kb BamH Iフラグメント
（pUC19にサブクローンし、pAF2−３と命名した。第４
図参照）をノーザンブロットの検出に用いた。この場
合、1800塩基長のmRNAが同定された。このmRNAは誘導菌
糸体でのみ発見された。このオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いたとき同じ結果が得られた。それゆえ、
新しい組のプローブを用い誘導されたmRNAに特異的にハ
イブリダイズする共通のDNAフラグメントが同定され
た。このmRNAの長さ（1800b）はおよそ非グリコシル化
たんぱく質の大きさで約約60kDaのたんぱく質をコード
するのに十分である。この単離されたフラグメントがフ
ィターゼ遺伝子の少なくとも一部を含むことは明白であ
る。

（例６） “誘導”および“非誘導"mRNAの単離 A.フィカム（ficuum）によるフィターゼの合成はスト
リンジェントなリン酸依存調節によることが文献で知ら
れている（ハン（Han）およびキャラガー（Callaghe
r），（1987）J.Indust.Microbiol.1.295−301）。それ
ゆえ、単離した遺伝子が同様の調節を受けていることは
目的の遺伝子がクローン化されているという証拠を支持
していると考え得る。

産生および非産生条件下で合成されるmRNAを単離する
ため、以下のようにA.フィカム（ficuum）NRRL3135を増
殖した。まず非誘導培地で一晩胞子を培養した。次の
日、その菌糸体を収穫し、滅菌水で洗浄して誘導または
非誘導培地に接種した。用いた培地には１リットル当り
20gのコーンスターチ;7.5gのグルコース、0.5g MgSO₄・
7H₂O、0.2g FeSO₄・7H₂Oおよび7.2g KNO₃が含まれる。
フィターゼの誘導には、2g/までのコーンスチープリ
カーを培地に加え、一方非誘導培地には2g/のK₂HPO₄
を含める。この菌糸体をさらに少なくとも100時間生育
させる。これから一定間隔でサンプルを採取する。フィ
ターゼ生産は例2Aで説明したフィターゼ検定で追跡し
た。変性したmRNAを電気泳動で分離し、ついでジエネス
クリーンプラスにブロッティングした。このブロットに
³²P−標識pAF2−３または例４のpFA1−１（酸ホスファ
ターゼ）由来の3.1kb Sal Iフラグメント単離物をハイ
ブリダイズした。この結果を第２表に示す。細胞をフィ
ターゼおよび酸ホスファターゼの合成を誘導すると知ら
れている条件下で生育したときだけフィターゼ特異的5.
1kb BamH Iフラグメントおよび酸ホスファターゼ特異
的3.1kb Sal IフラグメントとmRNA単離物のハイブリダ
イゼーションが見られる。この結果から単離した遺伝子
は、フィターゼおよび酸ホスファターゼに期待されるよ
うに調節されると結論される。

第２表 ファターゼ特異的5.1kb BamH Iフラグメント（Ａ）ま
たは酸ホスファターゼ特異的3.1kb Sal Iフラグメント
（Ｂ）をプローブとして用いたノーザンブロットのハイ
ブリダイゼーション；＋は1880bフィターゼmRNAまたは1
800b酸ホスファターゼmRNAの存在を示す。24時間相対的
フィターゼ活性を測定した。誘導培養物は非誘導培養物
よりも10培のフィターゼ活性を有している。接種後の時間 誘導 非誘導 Ａ 24時間 ＋ − Ｂ 24時間 ＋ − （例７） フィターゼ遺伝子のクローニングの証明 フィターゼ遺伝子の単離が成功したことを示すため
に、およびクローン化した遺伝子発現の増加を研究する
ために、このフィターゼ遺伝子を適当なベクターにサブ
クローン化し、ついでA.ニガー（niger）402（ATCC909
2）にトランスホームした。終りに、ラムダクローンAF2
01から10kb Nru Iフラグメントとしてフィターゼ遺伝
子を単離し、ベクターpAN8−１（マターン（Matter
n）、I.E.およびパント（Punt）、P.J.（1988）Fungal
Gevetics Newsletter 35、25）のStu I部位にクローン
化した。このベクターには選択マーカーとしてble遺伝
子（フレオマイシン耐性を与える）含んでいる。この構
築物をpAF28−１と命名し（第４図）、プロトプラスト
を30μｇフレオマイシン/mlを補ない、0.75％、寒天で
固形化したアスペルギラス最小培地にプレーティングす
ること以外は例９に示した操作に従がいA.ニガー（nige
r）402にこれをトランスホームした。単一のトランスホ
ーマントを精製単離し、例１および２で述べた方法で振
とうフラスコ内の産生を調べた。コントロールとして、
ベクターのみを含むトランスホーマントおよび非トラン
スホーム宿主をテストした（第３表）。pAF28−１を含
むA.ニガー（niger）402のみがA.フィカム（ficuum）フ
ィターゼに対する特異的モノクローナル抗体と反応する
フィターゼを産生していると思われる。このモノクロー
ナル抗体と反応するフィターゼはpH2.5でイムノアフィ
ニティカラムから溶出でき、分子量、グリコシル化度、
等電点および比活性がA.フィカム（ficuum）フィターゼ
と同じであることが示された。この知見はpAF28−１で
トランスホームしたA.ニガー（niger）402細胞が事実
上、A.フィカム（ficuum）フィターゼと同一のフィター
ゼを発現している明瞭な証拠を提供する。コントロール
細胞では同様の発現は見られなかった。

株は誘導条件で増殖させた（例６）。サンプルは96時
間の増殖後採取した。

（例８） フィターゼ遺伝子の特性 フィターゼ遺伝子を有するラムダベクターを種々の制
限酵素による消化で解析した。フィターゼ遺伝子を含む
ゲノム領域の地図を第４図に示す。第４図に示したよう
に特定の制限断片をクローニングベクターpUC19にサブ
クローンした。

先にpAF2−３中に存在する5.1kb BamH Iフラグメン
トにはフィターゼ遺伝子の少なくとも一部が含まれるこ
とが示されている（例５）。さらにオリゴヌクレオチド
プローブ1295および1297（第2B図）はpAF2−７由来のSa
l I挿入物（pAF2クローンの位置は第４図に示されてい
る）にハイブリダイズすることが示されたが、一方プロ
ーブ1296はおそらくpAF2−６およびpAF2−７中のフラグ
メント間のSal I部位を含んでいるのであろう。この実
験結果はフィターゼコード配列はpAF2−３のBamH I挿入
物の左側部分に位置することを示している。

つづいてプラスミドpAF2−３、pAF2−６、およびpAF2
−７の挿入物のヌクレオチド配列をダイデオキシチェー
ンターミネーション法（サンガー（Sanger）等（1977）
Proc.Natl.Acad.Sai.USA.74、5463−5467）およびメシ
ング（Messing）等により報告されたショットガン法（1
981、Nucl.Acids Res.９、309−321）を用いて完全に決
定した。さらにシーケンシング操作で得た情報に基づき
特異的オリゴヌクレオチドを合成した。

染色体フィターゼ遺伝子を含むクローンpAF2−３、pA
F2−６およびpAF2−７の完全なヌクレオチド配列を第６
図で編集し、第７図にグラフで示した。

この完全な配列のたんぱく質コード容量分析で、その
成熟たんぱく質のＮ−アミノ産配列のコードはヌクレオ
チド381番から開始していることが明らかになった（ウ
ラー（Ullah）により報告されたＮ末端は369番であ
る）。さらに36kDaおよび2.5kDa内部ペプチドフラグメ
ントのＮ末端アミノ酸配列は（第1B図、配列ＢおよびＡ
参照）、各々ヌクレオチド1101番および1548番にコード
されていることが分った。この読み枠はヌクレオチド17
13番で終っている。

これらの知見でフィターゼコードDNA配列を含むこと
を特徴とする染色体部位が明らかになった。

この成熟フィターゼたんぱく質をコードする染色体配
列のすぐ上流に成熟たんぱく質読み枠に連続する読み枠
でATG開始コドンは存在しない。しかし、イントロン−
エクソン境界特性を用いて、ヌクレオチド354および355
の間に成熟フィターゼコード読み枠と同じ読枠でヌクレ
オチド210にATGコドンを持つイントロンの存在が推定さ
れる。このＮ末端伸長のアミノ酸配列はヴォンハイン
（1983、Eur.J.Biochem.133、17−21）によって発表さ
れた分泌シグナル配列の規則とうまく一致している。

この仮説を確認するために以下に述べる操作法に従が
い特異的フィターゼプライマーおよびテンプレートとし
て全mRNA/cDNA集団を用いたPCR増巾によりフィターゼcD
NAを単離した。

（アスペルギラス フィカム（Aspergillus ficuum）
からのポリA⁺RNAの単離）例６で示した誘導条件下で生
育したA.フィカム（ficuum）NRRL3135から全RNAを単離
した。液体窒素を用いて乾燥菌糸体を凍らせグラインデ
ィングした。つづいてこの粉を０℃で3M LiCl、6M尿素
中ウルトラ−タラックス（１分間フルスピード）をもち
いて均一とし４℃で一晩放置した（オーフリー（Auffre
y）およびロージャン（Rougeon）、Eur.J.Biochem.10
7、303−314、1980）、1600g 30分間の遠心と２回のフ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（50:4
8:2）での抽出により全細胞RNAが得られた。このRNAを
エタノール沈澱後1mlの10mMトリス−HCl（pH7.4）、0.5
％SDS溶液に添加した。ポリA⁺選択のためこの全RNAサン
プルを60℃で５分間加熱し、0.5M NaClに調整した後オ
リゴ（dT）−セルロースカラムにかけた。10mMトリス−
HCl pH7.4、0.5％SDSおよび0.1M NaClを含む溶液で数回
洗浄後、10mMトリス−HCl pH7.4、0.5％SDSによる溶出
でポリA⁺RNAを採取した。

（mRNA/cDNA複合体の調製） 第1cDNA鎖合成のため、ポリA⁺RNA5μｇを16.5μの
水に溶かし、つづいて以下の成分を加えた;2.5μ RN
asin（30U/μ）;10μのバッファ（50mMトリス−HCl
pH7.6、6mM MgCl₂および40mM KCl）;2μ1M KCl;5
μ0.1M DTT;0.5μオリゴ（dT）_12-18（2.5mg/m
l）;5μ 8mM dNTP−ミックス;5μBSA（1mg/ml）
および2.5μモロニーMLV逆転写酵素（200U/ml）。こ
の混合物を37℃で30分間インキュベートした後、10μ
0.2M EDTAおよび50μｇ水を添加することで反応を停止
した。クロロホルムで抽出を行ない、遠心後上清に110
μ5M NH₄Acおよび440μエタノールをつづけて添加
した。ドライアイス／エタノール溶液中、30分間かけて
mRNA/cDNA複合体の沈澱を形成させた。遠心でこのmRNA/
cDNAを集め、70％氷冷エタノールで洗浄してから20μ
の水にとかした。

（フィターゼcDNAフラグメントのクローニング） フィターゼ配列を含むcDNAの単離は２つのフラグメン
トを用いたポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）
を用いて行った。４つの合成オリゴヌクレオチドプライ
マーは、第６図に示したゲノムフィターゼ配列に基づき
設計した。

オリゴ１はEcoR I部位の５′側境界に隣接するフィタ
ーゼATG開始コドン（210〜231番）の下流のヌクレオチ
ド配列を含んでいる；オリゴ２は付加的EcoR I部位に隣
接するSal I部位のすぐ上流にあるヌクレオチド配列を
含んでいる；オリゴ３はBamH I部位付近のヌクレオチド
配列を含んでいる（845〜865番）；オリゴ４は付加的Ps
t I部位に隣接するフィターゼ終止コドンの下流に位置
するヌクレオチド配列を含んでいる（1890〜1867番）。

ポリメラーゼチェーンリアクションはTaqポリメラー
ゼ（シータス）の説明書に従がい行った。テンプレート
としてmRNA/cDNAハイブリッド（上述）を含む溶液（1.5
μ）を使用し、フィターゼcDNAのＮ末端部分の増巾に
はプライマーとしてそれぞれ0.3μｇのオリゴ１および
２を用い、またフィターゼcDNA Ｃ末端部分の増巾には
オリゴ３およびオリゴ４を用いた（第８図参照）。変性
（100℃７分間）およびTaqポリメラーゼ2Uの添加後この
反応液をパーキンエルマー／シータスのDNA増巾器で25
サイクル増巾した（各サイクル;55℃、２分、72℃、３
分、94℃、（分）。最後のサイクルの変性ステップは省
いた。消化後（cDNA Ｎ末端部分についてはEcoR I、cD
NA Ｃ末端部分はBamH IとPst I）両方のcDNAフラグメ
ントをpTZ18R（プロメガ）の適当な部位にクローニング
した。

得られた２つのPCRフラグメントのヌクレオチド配列
はプライマーとして染色体フィターゼ遺伝子配列の後に
設計した合成オリゴヌクレオチドおよびテンプレートと
して全増巾DNAおよびクローン化cDNAフラグメントを用
いたダイデオキシチェーンターミネーション法（サンガ
ー（Sangor）、上述）で決定した。フィターゼたんぱく
質をコードするcDNA領域の配列およびこのフィターゼた
んぱく質の誘導されたアミノ酸配列を第８図に示す。

このcDNA配列は先に推定したイントロンの位置を確認
すると同時に、染色体遺伝子配列内には他のイントロン
が存在しないことを示した。

フィターゼ遺伝子は647個のアミノ酸（MW51091）から
なる一次翻訳産物をコードしている。シグナルペプチド
の切除による一次翻訳産物のプロセシングで444個（MW4
8851）または448個（ウラー（Ullah）によって報告され
ているように最初の４個のＮ末端アミノ酸を含む、MW49
232）のアミノ酸からなる成熟フィターゼたんぱく質が
生成する。

（例９） 付加的フィターゼゲノムDNAコピーの導入によるアスペ
ルギラスにおけるフィターゼの過剰発現 （発現ベクターpAF2−2Sの構築） 全ての構築物はマニアチス（Maniatis）等（（198
2）、モレキュラークローニング、ラボラトリーマニュ
アル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、N.
Y.）によって報告されている標準的分子生物学的手法で
作成した。

発現ベクターpAF2−2Sはフィターゼゲノムクローンラ
ムダAF201の6kb Pvu II DNAフラグメントをpUC19のSma
I部位にサブクローニングすることにより作成した。こ
のプラスミドをpAF2−２と命名した（第４図）。アスペ
ルギラス（Aspergillus）のトランスホーメーションを
選択マーカーとして異種アスペルギラス ニズランス
（Aspergillus nidulans）amdS遺伝子を含むプラスミド
pGW325（ワーナース（Wernars）K.（1986）、Thesis,Ag
riculture University,ワゲニンゲン、オランダ）のEoo
R I/Kpn I DNAフラグメントをpAF2−２のEcoR I/Kpn I
部位に挿入した。この発現ベクターをpAF2−2Sと命名
し、第９図に示した。

A.A.フィカム（ficuum）NRRL3135におけるフィターゼの
過剰発現 以下に示す修正を加えたチルバーン（Tilburn）、J.
等（（1983）Gene 26、205−221）およびケリー（Kell
y）、J.およびハイネス（Hyres）、M.（（1985）EMBO
J.４、475−479）のトランスホーメーション操作に従が
いプラスミドpAF2−2SをA.フィカム（ficuum）NRRL3135
に導入した。

−菌糸体は300rpmのロータリー振とう器中30℃で16時間
10mMアルギニンと10mMプロリンを補ったアスペルギラス
最小培地（コーブ（Cove）、D.（1966）Biochem.Biopby
s.Acta,113、51−56）で増殖した。

−プロトプラスト形成にはノボザイム234（ノボインダ
ストリー製）だけを用いヘリカーゼは使わなかった。

−プロトプラスト形成から90分後このプロトプラスト懸
濁液に等容量のSTCバッファ（1.2Mソルビトール、10mM
トリス・HCl pH7.5、10mM CaCl₂）を加え、スウィング
ローター中2500g、４℃で10分間遠心した。このプロト
プラストを洗浄し、STCバッファで10⁸細胞/mlの濃度と
なるように懸濁した。

−10μのTEバッファ（10mMトリス−HCl pH7.5、0.1m
M EDTA）中のプラスミドDNAを100μのプロトプラスト
サスペンジョンに加えた。

−このDNA−プロトプラストサスペンジョンを０℃で25
分間インキュベーションした後、200μのPEG溶液（25
％PEG4000（メルク）、10mMトリス−HCl pH7.5、50mM
CaCl₂）を滴下した。つづいて、容器を振り混ぜながら1
mlのPEG溶液（60％PEG4000、10mMトリス−HCl pH7.5、
50mM CaCl₂）をゆっくり加えた。室温放置後、このサス
ペンジョンをSTCバッファで希釈し、逆さにして混ぜた
後2000g、４℃で10分間の遠心を行った。このプロトプ
ラストを緩やかに200μ℃のSTCバッファに懸濁し、単一
窒素源として10mMアセトアミド、15mM CsCl、1Mスクロ
ース、0.75％細菌学用寒天＃１（オクソイド製）を含む
アスペルギラス最小培地にプレーティングした。増殖は
33℃で６〜10日間行った。

SP4、SP7およびSP8と命名した単一トランスホーマン
トを単離し、精製後例１および２で述べた方法を用い振
とうフラスコ内でフィターゼ産生をテストした。コント
ロールとしてベクターのみ（pUC19中amdS遺伝子のみ）
を有するトランスホーマントおよび非トランスホーム宿
主をテストした。

誘導条件下（例６参照）で株を増殖させ96時間にサン
プルを採取した。分析はフィターゼ活性測定（第４表）
および等電点フォーカシングポリアクリルアミドゲル電
気泳動（IEF−PAGE）で行った。

同様の条件下で増殖したA.フィカム（ficuum）および
A.フィカム（ficuum）pAF2−2S SP7の発酵物から等容
量のサンプルを採取し、IEF−PAGゲルで分析した（pH範
囲4.5〜６、ファーストシステム、ファルマシア）。電
気泳動は業者の指示に従って行った。つづいてたのゲル
を一般的たんぱく質染色色素コマージブリリアントブル
ー（第10B図）または例２で述べた一般的ホスファター
ゼ活性染色法（第10A図）で染色した。

均一にまで精製したA.フィカム（ficuum）フィターゼ
のサンプル（例７で述べたイノムアフィニティークロマ
トグラフィーによる）は単独または培養上清と混ぜて分
析した。

本発明で述べられているようにフィターゼは種々のサ
ンプルにおいて多くのイソ型（アステリスクで示す）と
して存在している。２つの主要なイソ酵素は両染色法に
よりレーン３および４の精製フィターゼ中に明確に確認
される。A.フィカム親株ではこのフィターゼバンドはほ
とんど見えず、一方、pAF2−2S SP7トランスホーマン
ト株では有意に増加している。

B.A.ニガー（niger）CBS 513.88におけるフィターゼの
過剰発現 A.フィカム（ficuum）について述べたトランスホーメ
ーション操作により発現ベクターpAF2−2SをA.ニガー
（niger）CBS513.88に導入した。単一のトランスホーマ
ントを単離精製し、例６で述べた誘導増殖条件下振とう
フラスコ中でフィターゼ産生をテストした。

あるトランスホーマント（A.ニガー（niger）pAF2−2
S＃８、＃20および＃33と命名した）およびコントロー
ル株のフィターゼ発現検定は例9Aに示した方法で行ない
第５表に示した。

A.ニガー（niger）トランスホーマントのフィターゼ
発現レベルはA.フィカム（ficuum）トランスホーマント
と同じレベルであった。さらにこの結果はA.フィカム
（ficuum）フィターゼプロモーターがA.ニガー（nige
r）中でも活性であることを示している。

さらに先に述べたファーストシステム（ファルマシ
ア）を用いたpH4.5〜６の範囲のIEF−PAGEゲル電気泳動
でトランスホーマントpAF2−2S＃８の培養培地の分析を
行った。同条件下で培養したA.ニガー（niger）親株お
よびトランスホーマントpAF2−2S＃８の培養上清を等容
量づつゲルにロードし、泳動後上述のように染色した。

A.ニガー（niger）親株は非常に微量のフィターゼし
か産生せずゲル電気泳動では検出できなかった。pAF2−
2S＃８株は約90倍のフィターゼを生産し、この差は第11
図で明白に見ることができる。

フィターゼ酵素のいくつかのイソ型が検出された（ア
ステリスクで示す）。一般的たんぱく質染色ではフィタ
ーゼたんぱく質のバンド強度は著しく大きいが、他の主
要たんぱく質のバンドは見えない。

（例10） A.ニガーアミログルコシダーゼ（AG）遺伝子のプロモ
ーターおよび、またはシグナル配列に融合したA.フィカ
ムフィターゼ遺伝子を含む発現ベクターでトランスホー
ムしたA.ニガーにおけるフィターゼ発現 （発現ベクターの構築） A.ニガー（niger）においてフィターゼを過剰発現させ
るためにA.フィカム（ficuum）フィターゼ遺伝子が種々
のシグナル配列と組合せたA.ニガー（niger）アミログ
ルコシダーゼ（AG）プロモーターのコントロール下にあ
る発現カセットを誘導した。p18FYT3およびp24FYT3にお
いて、A.ニガー（niger）由来のAG遺伝子の各々18およ
び24個のアミノ酸（aa）からなるリーダー配列を成熟た
んぱく質をコードするフィターゼ遺伝子フラグメントに
融合する。発現カセットpFYT3においてはAGプロモータ
ー配列がフィターゼリーダー配列を含むフィターゼコー
ド配列に融合している。（p18FYT3の構築） AGプロモーターおよび18aaAGリーダー配列の成熟たん
ぱく質をコードするフィターゼ配列への融合はポリメレ
ースチェーンリアクションを用いて行った。PCR反応に
おいては２つの異なるテンプレート、上述の全フィター
ゼ遺伝子を含むpAF2−2S、およびpUC19中の13〜15kb H
ind IIIフラグメントを含むA.ニガー（niger）プラスミ
ドライブラリーから単離したA.ニガー（niger）由来の
全AG−部位を含むプラスミドpAB6−１を使用した。単離
のために２つのAG特異的オリゴマー を使用した。これらの配列はいずれもA.ニガー（nige
r）に関して発表されたヌクレオチド配列に基づいてい
る（ボール（Boel）等、（1984）、EMBO J.３、1097−
1102;ボール（Boel）等、（1984）、Mol,and Cell.Bio
l.４、2306−2315）。オリゴヌクレオチドプローブはイ
ントロン２の周りの配列から導びいた。オリゴAG−１は
このイントロンの３′側に位置し、AG mRNAと同じ方向
を有している。オリゴAG−２はイントロン２の上流に位
置し、AG mRNAと逆平行のものを選んだ。プラスミドpAB
6−１は14.5kb Hind IIIフラグメント上にAG遺伝子を含
んでいる（第12図参照）。

PCR用プライマーとして４つの合成オリゴヌクレオチ
ドを設計した。

PCRはサイキ（Saiki）等（（1988）、Science.239、4
87−491）の方法を若干修正して行った（例８参照）。

AG配列をフィターゼコード配列に融合するため、２回
のPCRを行った。第１の反応はテンプレートとしてpAB6
−１およびプライマーとしてオリゴ１および18−２を用
いてAGプロモーターの３′側部分および３″側境界でフ
ィターゼ遺伝子のヌクレオチドに隣接する18aaAG−リー
ダー配列を含む300bpのDNAフラグメントを増巾し、また
第２の反応はテンプレートとしてpAF2−2Sおよびプライ
マーとしてオリゴ18−３および４を用いて５′側境界で
AGシグナルペプチドの18個のヌクレオチドに隣接するフ
ィターゼ遺伝子の５′側部分を含む600bpのDNAフラグメ
ントを増巾する。これらの増巾については第13図に示し
た。

生成する２つのDNAフラグメントをゲル電気泳動とエ
タノール沈澱で精製し、これをテンプレートとし、オリ
ゴ１および４をプライマーとした第３のPCRを行ってAG
−フィターゼ融合物を生成した。生じたDNAフラグメン
トをEcoR IおよびBamH Iで消化し、pTZ18Rにサブクロー
ンした。この融合物をシーケンシングし、p18FYT1と命
名した。

このAG−プロモーターの残りの上流領域（3.5kb）はp
AB6−１のKpn1による消化およびEcoR Iによる部分消化
により作りp18FYT1の1.1kb EcoR I/BamH Iフラグメン
トにライゲーションしてpTZ18RのKpn1/BamH I部位にク
ローン化した。

このようにして得られるプラスミドp18FYT2を第15図
に示す。付加的Hind III制限部位は合成フラグメント のpAF−２−2SのEcoR I部位（amdS−遺伝子に隣接す
る）への挿入により導入した。このプラスミドはpAF2−
2SHと命名し（第14図）、フィターゼプロモーター配列
をPCR AGフィターゼ融合DNAフラグメントと交換するた
めの原料プラスミドとして使用する。

最終的構築としてp18FYT2およびpAF2−2SHをKpn Iで
消化し、ついでBamH Iで部分消化する。p18FYT2の4.6kb
DNAフラグメントおよびpAF2−2SHの11kb DNAフラグ
メントを単離し、ゲル電気泳動で精製後ライゲーション
してから大腸菌に導入した。この誘導された発現力セッ
トをp18FYT3と命名した（第15図）。

（p24FYT3の構築） AGプロモーターおよび24aaAGリーダー配列の成熟フィ
ターゼコード配列の融合は用いたプライマー以外のp18F
YT3の構築に関して上述した方法と同様にしてPCR−増巾
で行った。２つの新しいプライマーを合成した。

２つの別個のPCRを行った。第１の反応はテンプレー
トとしてpAB・ｂ−１、およびプライマーとしてオリゴ
１および24−２を用いてAGプロモーターの３′側部分お
よび３′側境界でフィターゼ遺伝子の18個のヌクレオチ
ドに隣接する24aaAGリーダー配列を含む318bpのDNAフラ
グメントを増巾し、また第２の反応は、テンプレートと
してpAF2−2Sおよびプライマーとしてオリゴ24−３およ
び４を用いて５′側境界で24aaAGリーダーの18ヌクレオ
チドに隣接するフィターゼ遺伝子の５′側部分を含むDN
Aフラグメントを増巾する。これらの増巾の説明を第13
図に示す。

中間体プラスミドp24FYT1およびp24FYT2を介する最終
的発現カセットp24FYT3の構築のためp18FYT1およびp18F
YT2について述べたものと同様のクローニング経由／操
作を用い発現カセットp18FYT3を誘発した（第15図）。

（pFYT3の構築） フィターゼ遺伝子（フィターゼリーダーも含む）配列
へのAG−プローモーターの融合は、用いたプライマー以
外、p18FYT3の構築について述べたようにPCR増巾により
行った。以下の配列を有するプライマーを作った。

２回のPCRを行った。最初の反応はテンプレートとし
てpAB6−１およびプライマーとしてオリゴ１およびfyt
−２を用いて３′側境界でフィターゼリーダーの18個の
ヌクレオチドに隣接するAG−プロモーターの３′側部分
を含む282bpのDNAフラグメントを増巾し、また第２の反
応はテンプレートとしてpAF2−2Sおよびプライマーとし
てオリゴfyt−３および４を用いて５′側境界でAG−プ
ロモーターの18ヌクレオチドる隣接するフィターゼ遺伝
子（フィターゼリーダーも含む）の５′側部分を含むDN
Aフラグメントを増巾する。これらの増巾については第1
3図に図で示してある。

中間体プラスミドpFYT1およびpFYT2を介する最終発現
カセットpFYT3の構築のためp18FYT1およびp18FYT2につ
いて述べたものと同じクローニング経路／操作を用いて
発現カセットp18FYT3を誘導した（第15図）。

（A.ニガー（niger）におけるAGプロモーター制御下の
フィターゼ遺伝子の発現） Hind III消化により大腸菌の配列を上述のフィターゼ
発現カセットから除去した。その後例９で述べた操作を
用いた10μｇのDNAでA.ニガー（niger）CBS513.88株（1
988年10月10日寄託）のトランスホームした。各発現カ
セットから１個のA.ニガー（niger）トランスホーマン
トを単離し、その胞子を選択的アセトアミド寒天培地に
ストリークする。各トランスホーマントの胞子を0.4％
ポテトデキストロース（オクソイド、イギリス）寒天プ
レート上37℃、３日間生育させた細胞から回収した。フ
ィターゼ生産は以下の生育条件下振とうフラスコ中でテ
ストした。

１リットル中、1g KH₂PO₄;30gマルトース、5gイース
ト抽出物、10gカゼイン−加水分解物、0.5g MgSO₄・7H₂
Oおよび3gトゥイーン80を含む100mlの前培養培地に約１
×10⁸個の胞子を接種する。ロータリーシェーカー中34
℃で一晩増殖させた後、その培養培地1mlを、100mlの培
養培地（１リットル中、2g KH₂PO₄、70gマルトデキスト
リン（マルデックスMDO₃、アミラム）、12.5gイースト
抽出物、25gカゼイン加水分解物、2g K₂SO₄、0.5g MgSO
₄・7H₂O、0.03g ZnCl₂、0.02g CaCl₂、0.05g MnSO₄・4H
₂OおよびFeSO₄を含む、pHは5.6に調整）に接種した。

少なくとも140時間菌糸体を増殖させた。フィターゼ
生産は例２に示した方法で行った。各発現カセットから
得たいくつかのランダムなトランスホーマントの産生結
果を第６表に示す。

これらのデータはA.ニガー（niger）AGプロモーター
の制御下のフィターゼ遺伝子を含むA.ニガー（niger）
トランスホーマントにおける高い発現レベルを示してい
る。また、もっとも高いフィターゼ生産は、フィターゼ
リーダー配列を含むpFYT3発現ベクターで得られること
も示している。A.ニガー（niger）へのトランスホーメ
ーション後、イントロンを含まないフィターゼ遺伝子を
含む同様の発現ベクターはA.ニガー（niger）のpFYT3ト
ランスホーマントと同程度のフィターゼ発現レベルを示
した。

さらに、pH範囲4.5〜６のIEF−PAGEゲルでの電気泳動
をトランスホーマントpFYT3＃205および＃282の培養上
清について行った。同一条件下で培養したA.ニガー（ni
ger）親株と両トランスホーマントの培養上清各々容量
をゲルにロードし、泳動させた後、例９で述べた方法で
染色した。A.ニガー（niger）親株は非常に低レベルの
フィターゼしか生産せずこの実験では検出されなかっ
た。pFYT3＃205および＃282株は各々約250および1400倍
のフィターゼを生産した（第４表および第５表のフィタ
ーゼレベルと比較して）。この差は第11図からも明らか
である。いくつかのフィターゼイソ酵素が検出された
（アステリスクで印されている。一般的たんぱく質染色
でフィターゼたんぱく質バントの強度が著しく増加して
いる一方、他の主要たんぱく質バンドは出現していない
ことを示している。

例11 A.フィカムおよびA.ニガーにおけるフィターゼの工業的
規模の過剰生産 A.フィカム（ficuum） 例１で述べた方法でA.フィカム（ficuum）pAF2−2S＃
４およびA.フィカム（ficuum）NRRL3135株を培養した。
これらのトランスホーマントは野生株に比べ約50倍のフ
ィターゼを生産した。

B.A.ニガー（niger） A.ニガー（niger）pAF2−2S＃８、A.ニガー（niger）
CBS513.88株およびA.ニガー（niger）親株を例１の方法
に従って培養した。このトランスホーマントは元のA.ニ
ガー（niger）親株と比較して約1000倍のフィターゼを
生産した（第８表）。

例12 フィターゼ発現とAG遺伝子置換を同時に起こすベクタ
ーpREPFTT3を構築するため、pFYT3をKpn Iで消化する。
生成したKn I DNAフラグメントを用いて２つのライゲ
ーションを行った。

Kpn I−Hind III^＊アダプターとのライゲーション
２、このライゲーションではHind III制御部位は保存さ
れない。

つづいて、ライゲーション１をHind IIIで部分消化す
る。amdS含有フラグメントを電気泳動で除去後、残りの
DNAフラグメントをライゲーションで閉環し、大腸菌に
導入した。このプラスミドはpFYT3Δamd Sと命名した
（第16図）。

またライゲーション２もHind IIIで消化し、amd S遺
伝子を含4kbのHind III/Hind III^＊DNAフラグメントを
ゲル電気泳動で単離し、つづいてpFYT3ΔamdSのHind II
I部分消化物にライゲーションして大腸菌に導入した。
フィターゼ遺伝子の３′末端にamdS遺伝子を含むこのプ
ラスミドをpFYT3INTと命名した（第17図）。

３′隣接AG配列を含むpAB6−１の6kb Sal I/Hind III
DNAフラグメントを導入するためpFYT3INTをHind IIIで
部分的に消化し、またアダプター： にライゲーション後（Hind III^＊制限部位は保存されな
い）、pAB6−１のSal I/Hind IIIとライゲーションさせ
た。大腸菌へのトランスホーメーション後、正しい位置
に３′AG隣接配列を含む目的のプラスミドpREPFYT3を得
る（第18図）。

（AG遺伝子置換によるA.ニガーにおけるフィターゼ発
現） pREPFYT3によるA.ニガー（niger）のトランスホーメ
ーション前、このプラスミド中の大腸菌の配列をHind I
II消化および電気泳動で除去した。A.ニガー（niger）C
BS513.88株を例９に述べた操作により10μｇのDNAフラ
グメントでトランスホームした。このトランスホーマン
トの選択および培養は例９で述べた方法で行った。選択
したトランスホーマントの１部はAG活性を失っていた
（約20％）。染色体DNAのサウザーン分析をAGネガティ
ブでかつ、フィターゼポジティブなトランスホーマント
について行ないAG遺伝子がフィターゼ遺伝子と置してい
ることを確認した。

（例13） （種におけるフィターゼ遺伝子の保存） 微生物種にフィターゼ遺伝子が保存されているかどう
かを知るために、10個の種に由来する染色体DNAのサウ
ザン分析をプローブとしてA.フィカム（ficuum）フィタ
ーゼcDNAを用いて行った。この染色体DNA分析は繊維状
菌類、イーストおよびバクテリアについて行った。例と
して、各グループから限定数選出した。繊維状菌類につ
ていはペニシリウム クリソゲナム（Penicillium chry
sogenum）およびアスペルギラス ニガー（Aspergillus
niger）、イーストについてはサッカロミセス セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）およびクルイベロミ
セスラクチス（Kluyveromyces lactis）、および原核生
物についてはグラム陽性菌：枯草菌（Bacillus subtili
s）、クロストリジウムサーモセラム（Clostridium the
rmo cellum）およびストレプトミセス リビダンス（St
reptomyces lividans）およびグラム陰性菌：シュード
モナス エルジノサ（Pseudomonas aeruginosa）を用い
た。これらの種由来の高分子量染色体DNAをPvu IIおよ
びBamH Iで別個に消化し、つづいて0.7％アガロースゲ
ルで電気泳動した。ニトロセルロースフィルターに移し
た後、低ストリンジェンシー（６×SSC、50℃）で一
晩、³²P標識化５′フィターゼcDNAフラグメント（例８
で述べたもの）を用いてハイブリダイゼーションを行っ
た。ブロットを室温で６×SSCを用いて洗浄し、これを
用いてＸ線フィルムを18時間露光させた。第19図ａおよ
びｂに示されているように、ほとんどすべてのレーンに
明確なバンドが観察される。このことは微生物種間でフ
ィターゼ遺伝子のホモロジーが高いことを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:66） 1:685） (72)発明者 ファン ハルティングスヴェルト ウィ ーレム オランダ国 エヌエル―2613デーエル デルフト ラーン ファン アルテナ 43 (72)発明者 ファン パリドン ペトルス アンドレ アス オランダ国 エヌエル―2201ベーヘー ノールトウェイク ベークラーン 120 (72)発明者 ヴェーンストラ アンネマリー エヴェ リン オランダ国 エヌエル―2151イックスハ ー ニウ ヴェネップ ニーロップ 27 (72)発明者 ライテン ルドルフ ヘイスベルテュス マリー オランダ国 エヌエル―2317カーエル レイデン アッケルホールンブルーム 26 (72)発明者 セルテン ヘラルデュス コルネリス マリア オランダ国 エヌエル―2651ハーゼット ベルケル エン ローデンレイス ス テーレンウェッヒ 81 (56)参考文献 Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．18，Ｎｏ．４ （1988），ｐ．459−471 赤堀四郎監修「酵素ハンドブック」 （株）朝倉書店（昭45．７．15，第５ 版）ｐ．433−434

Claims (17)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ミオイノシトールリン酸塩から少なくとも
   一種の無機リン酸塩への変換を触媒する菌類フィターゼ
   をコードするDNA配列であって、該DNA配列が、 （ａ）図８に示されているアミノ酸配列の位置−23から
   444又は位置＋１から444に示されるポリペプチドをコー
   ドするヌクレオチド配列を含むDNA配列、 （ｂ）図６に示されている位置210から1715のヌクレオ
   チド配列、図６に示されている位置381から1715のヌク
   レオチド配列、図８に示されている位置１から1404のヌ
   クレオチド配列又は図８に示されている位置70から1404
   のヌクレオチド配列を含むDNA配列、及び （ｃ）微生物ゲノム由来の配列であって、図６に示され
   ている位置210から1129のヌクレオチド配列のcDNAに相
   当するフラグメントと、低ストリンジェンシー条件（６
   ×SSC;50℃；一晩；及び室温での６×SSCによる洗浄）
   の下でハイブリダイズするDNA配列、 からなる群から選ばれることを特徴とするDNA配列。
2. 【請求項２】請求項１のDNA配列と遺伝子コードの縮重
   関係にあるDNA配列。
3. 【請求項３】アスペルギラス由来のものであることを特
   徴とする請求項１又は２記載のDNA配列。
4. 【請求項４】アルペルギラス フィカム又はアスペルギ
   ラス ニガー由来のものであることを特徴とする請求項
   ３記載のDNA配列。
5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれか１つのDNA配列
   が、適当な発現宿主においてフィターゼを発現させ得る
   調節領域に機能的に結合していることを特徴とする発現
   構築物。
6. 【請求項６】該DNA配列がフィターゼ分泌を提供する分
   泌リーダー配列を含むことを特徴とする請求項５記載の
   発現構築物。
7. 【請求項７】該分泌リーダー配列をコードする配列が該
   DNA配列と同種である請求項６記載の発現構築物。
8. 【請求項８】該分泌リーダー配列をコードする配列が、
   18アミノ酸又は24アミノ酸グルコアミラーゼシグナル配
   列をコードするDNA配列であることを特徴とする請求項
   ６記載の発現構築物。
9. 【請求項９】該分泌リーダー配列をコードする配列が、
   短い架橋によってフィターゼをコードするDNA配列と結
   合していることを特徴とする請求項５〜８のいずれか１
   項に記載の発現構築物。
10. 【請求項１０】調節領域が、グルコアミラーゼ、フィタ
    ーゼ、アミラーゼ及びGAPDHをコードする遺伝子からな
    る群から選択された遺伝子に由来するものであることを
    特徴とする請求項５〜９のいずれか１項に記載の発現構
    築物。
11. 【請求項１１】宿主細胞を形質転換することができるベ
    クターであって、請求項５〜10のいずれか１項に記載の
    発現構築物を含むベクター。
12. 【請求項１２】プラスミドであることを特徴とする請求
    項11記載のベクター。
13. 【請求項１３】請求項11又は12のベクターで形質転換さ
    れたことを特徴とする形質転換宿主細胞。
14. 【請求項１４】細菌、イースト類及びカビ類からなる群
    から選ばれる請求項13記載の形質転換宿主細胞。
15. 【請求項１５】アスペルギラス属、トリコデルマ属、ペ
    ニシリウム属、、バチルス属、クルイベロミセス属、又
    はサッカロミセス属である請求項14記載の形質転換宿主
    細胞。
16. 【請求項１６】アスペルギラス ニガー、アスペルギラ
    ス フィカム、アスペルギラス アワモリ、アスペルギ
    ラス オリザエ、トリコデルマ リーセイ、クルイベロ
    ミセス ラクチス、サッカロミセス セレビシエ、バチ
    ルス サブチリス又はバチルス リチェルホルミス種で
    ある請求項15記載の形質転換宿主細胞。
17. 【請求項１７】請求項13〜16のいずれか１項記載の形質
    転換宿主細胞をフィターゼの産生に適した条件下で培養
    することを特徴とするフィターゼの産生方法。