JP3102569B2 - 核酸の抽出に有用な非腐食性組成物および方法 - Google Patents
核酸の抽出に有用な非腐食性組成物および方法Info
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 この出願は1990年７月13日に出願の米国出願第07/55
2,745号の一部継続出願である。
2,745号の一部継続出願である。
発明の分野 本発明は、核酸の抽出およびハイブリッド形成のため
の組成物およびアッセイ方法に関する。本発明は特に、
毒性化合物、例えばフェノールおよび／またはクロロホ
ルムを使用せずに、主としてベンジルアルコールまたは
ベンジルアルコール誘導体の使用を通して、複雑な生物
学的試料または検体中の細胞から核酸を抽出する方法に
関する。本明細書中に記載される新規組成物および方法
は、核酸の抽出と精製に非常に有効である。
の組成物およびアッセイ方法に関する。本発明は特に、
毒性化合物、例えばフェノールおよび／またはクロロホ
ルムを使用せずに、主としてベンジルアルコールまたは
ベンジルアルコール誘導体の使用を通して、複雑な生物
学的試料または検体中の細胞から核酸を抽出する方法に
関する。本明細書中に記載される新規組成物および方法
は、核酸の抽出と精製に非常に有効である。
関連技術の簡単な説明 原核もしくは真核細胞からまたは複雑な生物学的試料
から核酸を単離するために用いる技術において、フェノ
ールやクロロホルムといった有機溶媒が伝統的に使われ
ている。核酸の単離は、典型的には、プロテアーゼを使
って行われる酵素消化で始まり、イオン性洗剤を使った
細胞溶解、次いでフェノールまたはフェノール／クロロ
ホルム混合物による抽出と続く。有機相と水相を分離
し、水相中に分配された核酸をアルコールでの沈殿によ
って回収する。しかしながら、フェノールまたはフェノ
ール／クロロホルム混合物はヒトの皮膚に対して腐食性
であり、危険廃棄物と見なされるため、注意深く取扱い
適切に捨てなければならない。更に、この抽出法は時間
がかかり面倒である。Marmur,J.Mol.Biol.３:208−218
（1961）は、酵素処理、洗剤の添加、およびフェノール
またはフェノール／クロロホルムといった有機溶媒の使
用による、原核生物からの完全な高分子量DNAの抽出お
よび精製を記載している。Chirgwinら、Biochemistry 1
8:5294−5299（1979）は、グアニジニウムチオシアネー
トと２−メルカプトエタノール中でのホモジナイズ後の
エタノール沈澱または塩化セシウムを通した沈降によ
る、リボヌクレアーゼが豊富な組織からの完全なRNAの
単離を記載している。
から核酸を単離するために用いる技術において、フェノ
ールやクロロホルムといった有機溶媒が伝統的に使われ
ている。核酸の単離は、典型的には、プロテアーゼを使
って行われる酵素消化で始まり、イオン性洗剤を使った
細胞溶解、次いでフェノールまたはフェノール／クロロ
ホルム混合物による抽出と続く。有機相と水相を分離
し、水相中に分配された核酸をアルコールでの沈殿によ
って回収する。しかしながら、フェノールまたはフェノ
ール／クロロホルム混合物はヒトの皮膚に対して腐食性
であり、危険廃棄物と見なされるため、注意深く取扱い
適切に捨てなければならない。更に、この抽出法は時間
がかかり面倒である。Marmur,J.Mol.Biol.３:208−218
（1961）は、酵素処理、洗剤の添加、およびフェノール
またはフェノール／クロロホルムといった有機溶媒の使
用による、原核生物からの完全な高分子量DNAの抽出お
よび精製を記載している。Chirgwinら、Biochemistry 1
8:5294−5299（1979）は、グアニジニウムチオシアネー
トと２−メルカプトエタノール中でのホモジナイズ後の
エタノール沈澱または塩化セシウムを通した沈降によ
る、リボヌクレアーゼが豊富な組織からの完全なRNAの
単離を記載している。
更に、主としてカオトロピック塩がヌクレアーゼとプ
ロテアーゼを阻害するという事実のため、カオトロピッ
ク剤、例えばグアニジニウムチオシアネート（GnSCN）
が細胞から溶液中に核酸を溶解しそして遊離させるため
に広範に使われている。しかしながら、そのように高い
モル濃度の塩を使用するとすれば、それらのカオトロピ
ック剤とイオン性洗剤とが不相溶でありそして水相中へ
の核酸の容易な分配が不可能であるため、それらのカオ
トロピック塩溶液から核酸を単離するのは困難であると
判明した。
ロテアーゼを阻害するという事実のため、カオトロピッ
ク剤、例えばグアニジニウムチオシアネート（GnSCN）
が細胞から溶液中に核酸を溶解しそして遊離させるため
に広範に使われている。しかしながら、そのように高い
モル濃度の塩を使用するとすれば、それらのカオトロピ
ック剤とイオン性洗剤とが不相溶でありそして水相中へ
の核酸の容易な分配が不可能であるため、それらのカオ
トロピック塩溶液から核酸を単離するのは困難であると
判明した。
核酸単離作業の間ヌクレアーゼを効果的に阻害できる
ことが最高であり、特に出発材料が複雑なもの、例えば
***物または血液である時は特にそうである。1959年に
Brownhillらはベントナイトがヌクレアーゼの阻害剤で
あると報告した〔Brownhillら、Biochem.J.73:434（195
9）〕。Fraenkel−Conratらは後に、タバコモザイクウ
イルスを精製する作業中リボヌクレアーゼを阻害するた
めのベントナイトの使用方法を開発した〔Fraenkel−Co
nratら、Virology 14:54−58（1961）〕。その後の研究
者らは、RNAの単離の間にリボヌクレアーゼ活性を低下
させる際のフェノールおよびクロロホルムと組み合わせ
たベントナイトの使用を報告した〔Jacoliら、Can.J.Bi
ochem.51:1558−1565（1973）;Griffinら、Anal.Bioche
m.87:506−520（1978）;Gradyら、Anal.Biochem.101:11
8−122（1980）〕。DNアーゼＩとα−アミラーゼはベン
トナイトでの処理によりRNアーゼ不含有にすることがで
きることも報告されている〔Garrettら、Anal.Biochem.
52:342−348（1973）〕。
ことが最高であり、特に出発材料が複雑なもの、例えば
***物または血液である時は特にそうである。1959年に
Brownhillらはベントナイトがヌクレアーゼの阻害剤で
あると報告した〔Brownhillら、Biochem.J.73:434（195
9）〕。Fraenkel−Conratらは後に、タバコモザイクウ
イルスを精製する作業中リボヌクレアーゼを阻害するた
めのベントナイトの使用方法を開発した〔Fraenkel−Co
nratら、Virology 14:54−58（1961）〕。その後の研究
者らは、RNAの単離の間にリボヌクレアーゼ活性を低下
させる際のフェノールおよびクロロホルムと組み合わせ
たベントナイトの使用を報告した〔Jacoliら、Can.J.Bi
ochem.51:1558−1565（1973）;Griffinら、Anal.Bioche
m.87:506−520（1978）;Gradyら、Anal.Biochem.101:11
8−122（1980）〕。DNアーゼＩとα−アミラーゼはベン
トナイトでの処理によりRNアーゼ不含有にすることがで
きることも報告されている〔Garrettら、Anal.Biochem.
52:342−348（1973）〕。
上記の伝統的な核酸抽出法は全て、フェノールおよび
／またはクロロホルムといった毒性化合物の使用を必要
とする。研究者らは長期に渡り安全で且つ効率的な抽出
法を捜し求めている。
／またはクロロホルムといった毒性化合物の使用を必要
とする。研究者らは長期に渡り安全で且つ効率的な抽出
法を捜し求めている。
発明の要約 本発明は、核酸の抽出のための安全で且つ効率的な方
法に関する。特に、核酸と他の生物学的化合物との混合
物を含有する試料から核酸を単離する方法が記載され
る。該方法では、少なくとも１種の有機化合物、例えば
ベンジルアルコールまたはベンジルアルコール誘導体を
含む抽出溶液と試料とを混合し、水相と非水相を形成さ
せる。核酸は水相から単離される。好ましくは、生じた
混合溶液は、下記に定義されるように、ベントナイトま
たはマカロイド（Macaloid）も含有する。典型的には、
試料は抽出前にまず溶解剤と混合されるだろう。好まし
い溶解剤はカオトロピック塩、例えばグアニジニウム塩
酸塩（GuHCl）およびグアニジニウムイソチオシアネー
ト（GuSCN）である。
法に関する。特に、核酸と他の生物学的化合物との混合
物を含有する試料から核酸を単離する方法が記載され
る。該方法では、少なくとも１種の有機化合物、例えば
ベンジルアルコールまたはベンジルアルコール誘導体を
含む抽出溶液と試料とを混合し、水相と非水相を形成さ
せる。核酸は水相から単離される。好ましくは、生じた
混合溶液は、下記に定義されるように、ベントナイトま
たはマカロイド（Macaloid）も含有する。典型的には、
試料は抽出前にまず溶解剤と混合されるだろう。好まし
い溶解剤はカオトロピック塩、例えばグアニジニウム塩
酸塩（GuHCl）およびグアニジニウムイソチオシアネー
ト（GuSCN）である。
上記の抽出溶液は、有利にはラクタム、例えばシクロ
ヘキシルピロリドン、ドデシルピロリドン、ヒドロキシ
エチルピロリドン、オクチルピロリドン、１−フェニル
−２−ピロリドン、および1,3−ジメチル−3,4,5,6−テ
トラヒドロ−２−（Ｈ）−ピロリドンとも組み合わせる
ことができる。
ヘキシルピロリドン、ドデシルピロリドン、ヒドロキシ
エチルピロリドン、オクチルピロリドン、１−フェニル
−２−ピロリドン、および1,3−ジメチル−3,4,5,6−テ
トラヒドロ−２−（Ｈ）−ピロリドンとも組み合わせる
ことができる。
一旦核酸が水相中に分離されれば、それをアルコール
で、好ましくはエタノールもしくはイソプロパノールで
沈澱させるか、またはブタノールで濃縮することができ
る。水相をハイブリッド形成アッセイに直接用いること
もでき、またはその後の探査のため固体支持体上に固定
化することもできる。
で、好ましくはエタノールもしくはイソプロパノールで
沈澱させるか、またはブタノールで濃縮することができ
る。水相をハイブリッド形成アッセイに直接用いること
もでき、またはその後の探査のため固体支持体上に固定
化することもできる。
本発明で使われる有機化合物は非常に低度の毒性のも
のであり、ヒト組織に対して非腐食性である。それらは
フェノールまたはフェノール／クロロホルムの溶媒性質
の大部分を保持し、そして独特には核酸の単離および／
または生物学的高分子複合体の分画の用途に適する。そ
の上、それらは一般に使われる有機溶媒よりも実質的に
低価格である。本発明の方法の使用を通して、塩化セシ
ウムによる抽出、遠心分離およびアルコール沈澱を回避
し、かくして毒性である塩化セシウムへの暴露を排除す
ることもできる。本発明の抽出方法は、核酸の抽出にお
いて従来使われている方法よりも一層迅速で、単純で、
安全で且つ敏感である。よって、それらは当該分野にお
いて有意な進歩を示し、所望の核酸の抽出をスケールア
ップする一層安全な手段を提供する。
のであり、ヒト組織に対して非腐食性である。それらは
フェノールまたはフェノール／クロロホルムの溶媒性質
の大部分を保持し、そして独特には核酸の単離および／
または生物学的高分子複合体の分画の用途に適する。そ
の上、それらは一般に使われる有機溶媒よりも実質的に
低価格である。本発明の方法の使用を通して、塩化セシ
ウムによる抽出、遠心分離およびアルコール沈澱を回避
し、かくして毒性である塩化セシウムへの暴露を排除す
ることもできる。本発明の抽出方法は、核酸の抽出にお
いて従来使われている方法よりも一層迅速で、単純で、
安全で且つ敏感である。よって、それらは当該分野にお
いて有意な進歩を示し、所望の核酸の抽出をスケールア
ップする一層安全な手段を提供する。
カオトロピック剤は抽出工程において溶解剤として一
般に使われている。カオトロピック剤とイオン性洗剤と
の不相溶性のため、カオトロピック塩溶液から核酸を単
離するのは困難であることがわかっている。更に、その
ように高いモル濃度の塩を使用するとすれば、水相中に
核酸を分配させることは従来困難であった。カオトロピ
ック塩を必要とする抽出技術において本発明の抽出溶液
と組み合わせてベントナイトを使用することにより、特
に複雑な生物学的試料からの完全なRNA、DNAまたは全核
酸の迅速で且つ単純な回収が可能になる。
般に使われている。カオトロピック剤とイオン性洗剤と
の不相溶性のため、カオトロピック塩溶液から核酸を単
離するのは困難であることがわかっている。更に、その
ように高いモル濃度の塩を使用するとすれば、水相中に
核酸を分配させることは従来困難であった。カオトロピ
ック塩を必要とする抽出技術において本発明の抽出溶液
と組み合わせてベントナイトを使用することにより、特
に複雑な生物学的試料からの完全なRNA、DNAまたは全核
酸の迅速で且つ単純な回収が可能になる。
図面の説明 図１は、有機相として次のものを使って抽出した全核
酸（染色体DNAおよびRNA）の電気泳動図を示す:2−メチ
ルベンジルアルコール（レーン１）;4−メトキシベンジ
ルアルコール（レーン２）;3−エトキシベンジルアルコ
ール（レーン３）;4−フェノキシベンジルアルコール
（レーン４）；ベンジルアルコール（レーン５）；およ
びフェノール（レーン６）。
酸（染色体DNAおよびRNA）の電気泳動図を示す:2−メチ
ルベンジルアルコール（レーン１）;4−メトキシベンジ
ルアルコール（レーン２）;3−エトキシベンジルアルコ
ール（レーン３）;4−フェノキシベンジルアルコール
（レーン４）；ベンジルアルコール（レーン５）；およ
びフェノール（レーン６）。
図２は、ベンジルアルコールとベントナイトを使って
抽出した糞便試料からの全核酸の電気泳動図を示す。レ
ーン１は、抽出溶液がベンジルアルコールと１％（W/
V）ベントナイトとから成る時の、細菌バクテロイデス
・ギンギバリス（Bacteroides gingivalis）でスパイク
した糞便試料から単離された全核酸の電気泳動図を示
す。比較として、レーン２は、抽出溶液がフェノールか
ら成る時の泳動図を示す。両抽出とも全核酸の回収は同
等であり、そして完全な形で16Sおよび23S rRNAが単離
される。
抽出した糞便試料からの全核酸の電気泳動図を示す。レ
ーン１は、抽出溶液がベンジルアルコールと１％（W/
V）ベントナイトとから成る時の、細菌バクテロイデス
・ギンギバリス（Bacteroides gingivalis）でスパイク
した糞便試料から単離された全核酸の電気泳動図を示
す。比較として、レーン２は、抽出溶液がフェノールか
ら成る時の泳動図を示す。両抽出とも全核酸の回収は同
等であり、そして完全な形で16Sおよび23S rRNAが単離
される。
詳細な説明 本発明は、核酸と他の生物学的化合物との生物学的混
合物を含有する試料から核酸を単離するための新規組成
物および方法に関する。本発明の方法は、毒性または腐
食性化学物質を使用せずに核酸を抽出することにより、
核酸を含有する生物学的試料を容易に処理できるように
する。本発明の方法は更に、ハイブリッド形成アッセイ
用の核酸試料を調製することを可能にする。
合物を含有する試料から核酸を単離するための新規組成
物および方法に関する。本発明の方法は、毒性または腐
食性化学物質を使用せずに核酸を抽出することにより、
核酸を含有する生物学的試料を容易に処理できるように
する。本発明の方法は更に、ハイブリッド形成アッセイ
用の核酸試料を調製することを可能にする。
この抽出方法は、下記に指定するような少なくとも１
種の有機化合物を含有する抽出溶液と試料を混合して水
相と非水相を形成せしめ、そして非水相から水相を分離
することを含んで成る。抽出溶液によって試料が二相に
なる。次いで水相中に核酸が単離される。
種の有機化合物を含有する抽出溶液と試料を混合して水
相と非水相を形成せしめ、そして非水相から水相を分離
することを含んで成る。抽出溶液によって試料が二相に
なる。次いで水相中に核酸が単離される。
本発明の抽出方法は、核酸〔リボ核酸（RNA）および
／またはデオキシリボ核酸（DNA）〕と核酸以外の他の
生物学的化合物との生物学的混合物を含有する試料に適
用することができる。そのような試料としては、核酸を
含有する生物学的材料、例えば任意の真核および／また
は原核細胞（プロトプラストを含む）の複雑な生物学的
混合物、または核酸を含有し得る他の生物学的材料、の
任意の水性混合物を挙げることができる。従って該方法
は組織培養動物細胞、動物組織（例えば、溶解緩衝液中
でホモジナイズされた心臓、肝臓または脳）、糞便、血
液細胞、網状赤血球、リンパ球、植物細胞または浸透圧
ショックに敏感な他の細胞、並びに細菌、酵母、ウイル
ス、マイコプラズマ、原生動物、リケッチア、真菌の細
胞および他の小微生物の細胞等に適用できる。
／またはデオキシリボ核酸（DNA）〕と核酸以外の他の
生物学的化合物との生物学的混合物を含有する試料に適
用することができる。そのような試料としては、核酸を
含有する生物学的材料、例えば任意の真核および／また
は原核細胞（プロトプラストを含む）の複雑な生物学的
混合物、または核酸を含有し得る他の生物学的材料、の
任意の水性混合物を挙げることができる。従って該方法
は組織培養動物細胞、動物組織（例えば、溶解緩衝液中
でホモジナイズされた心臓、肝臓または脳）、糞便、血
液細胞、網状赤血球、リンパ球、植物細胞または浸透圧
ショックに敏感な他の細胞、並びに細菌、酵母、ウイル
ス、マイコプラズマ、原生動物、リケッチア、真菌の細
胞および他の小微生物の細胞等に適用できる。
アッセイしようとする核酸試料または核酸の抽出の源
として働く核酸試料は、該試料中に内在する他の生物学
的成分からの該試料中の核酸の分離を考慮した抽出溶液
と混合される。この抽出溶液はベンジルアルコール、ベ
ンジルアルコールの誘導体または類似の性質を有する他
の溶媒を含んで成る。該溶媒は、抽出溶液を水性試料と
混合した時に核酸を水相中に分配せしめることによって
他の生物学的成分から核酸を効果的に単離させなければ
ならない。抽出溶液は、典型的には、次の性質を有する
有機化合物を含有する有機組成物を含んで成るだろう： （ａ） 約9.0〜約15.5の誘電率； （ｂ） 約1.35〜約1.70クーロンメートルの双極子モー
メント；および （ｃ） 有機化合物１部に対して水約0.001〜約0.3部の
分配係数。好ましくは、そのような有機化合物は約0.7
〜約1.9g/ml、好ましくは約1.01〜約1.9g/ml、最も好ま
しくは約1.09〜約1.9g/mlの比重も有し、そしてヒト皮
膚に対して非腐食性であろう。抽出溶液に適当な有機化
合物の例は、４−ヘキシルレゾルシノールおよびレゾル
シノール並びに下記に列挙されるものである。
として働く核酸試料は、該試料中に内在する他の生物学
的成分からの該試料中の核酸の分離を考慮した抽出溶液
と混合される。この抽出溶液はベンジルアルコール、ベ
ンジルアルコールの誘導体または類似の性質を有する他
の溶媒を含んで成る。該溶媒は、抽出溶液を水性試料と
混合した時に核酸を水相中に分配せしめることによって
他の生物学的成分から核酸を効果的に単離させなければ
ならない。抽出溶液は、典型的には、次の性質を有する
有機化合物を含有する有機組成物を含んで成るだろう： （ａ） 約9.0〜約15.5の誘電率； （ｂ） 約1.35〜約1.70クーロンメートルの双極子モー
メント；および （ｃ） 有機化合物１部に対して水約0.001〜約0.3部の
分配係数。好ましくは、そのような有機化合物は約0.7
〜約1.9g/ml、好ましくは約1.01〜約1.9g/ml、最も好ま
しくは約1.09〜約1.9g/mlの比重も有し、そしてヒト皮
膚に対して非腐食性であろう。抽出溶液に適当な有機化
合物の例は、４−ヘキシルレゾルシノールおよびレゾル
シノール並びに下記に列挙されるものである。
「誘電率」（Ｄ）は、クーロンの法則の関係において
大きさのない数である： 式中、Ｆは引力または析力であり、q1およびq2は距離ｄ
により隔てられた２つの電荷の大きさである。真空では
Ｄが1.0の値を有する。他のＤ値の例は、１気圧で０℃
の空気が1.00059、25℃のアルコールが24.3、そして20
℃の水が80.37である。
大きさのない数である： 式中、Ｆは引力または析力であり、q1およびq2は距離ｄ
により隔てられた２つの電荷の大きさである。真空では
Ｄが1.0の値を有する。他のＤ値の例は、１気圧で０℃
の空気が1.00059、25℃のアルコールが24.3、そして20
℃の水が80.37である。
「双極子モーメント」なる用語は、中性分子中の電荷
の分布または＋もしくは−電荷の量×電荷中心間の距離
の大きさを指摘する分子定数（ρまたはμ）を言う。１
クーロンメートル＝2.99793×1020デバイ。例えば、そ
れらが対称に分布すれば双極子モーメントは０である。
の分布または＋もしくは−電荷の量×電荷中心間の距離
の大きさを指摘する分子定数（ρまたはμ）を言う。１
クーロンメートル＝2.99793×1020デバイ。例えば、そ
れらが対称に分布すれば双極子モーメントは０である。
「分配係数」なる用語は、同量の有機溶媒と水との相
分離時の有機相中の水の濃度を意味する。
分離時の有機相中の水の濃度を意味する。
あるいは、抽出溶液は好ましくは少なくとも１種の式
Ｉの有機化合物を含んで成り、ここで式Ｉは、式C6H5CH
2OHまたは下式： 〔上式中、 R1は−（CH2）nOH（ｎは１〜６である）；−CH（OH）
CH2OH;−CH2CH（OH）CH2OHおよび−CH（OH）COOR5（R5
は−（CH2）pCH3であり、ｐは０〜３である）から成る
群から選択された基であり； R2は−H;−F;−Cl;−Br;−I;−OH;−Ｓ（CH2）rCH
3（ｒは０〜３である）；−Ｏ（CH2）qCH3（ｑは０〜６
である）；−COOR6（R6は−（CH2）sCH3であり、ｓは０
〜３である）；−C6H5;−CH2C6H5;−OC6H5;−OCH2C6H5;
−CH2OH;−CF3および−（CH2）tCH3（ｔは０〜６であ
る）から成る群から選択された基であり； R3は−H;−F;−Cl;−Br;−I;−OH;−CH3;−（CH2）xC
H3（ｘは０〜３である）；−Ｏ（CH2）vCH3（ｖは０〜
３である）から成る群から選択された基であり；そして R4は−H;−F;−Cl;−Br;−I;−（CH2）yCH3（ｙは０
〜３である）；−Ｏ（CH2）wCH3（ｗは０〜３である）
から成る群から選択された基であり；そして更に、 R2,R3およびR4はR1に関して任意の位置に存在してもよ
く、ただし、 （ａ） R1が−CH（OH）CH2OH,−CH2CH（OH）CH2OHまた
は−CH（OH）COOR5である時、R2,R3およびR4は−Ｈでな
ければならず； （ｂ） R1が−CH2OHでありそしてR2が−C6H5;−OCH2C6
H5または−CH2C6H5である時、R3は−CH3,−OH,−Cl,−B
r,−F,−I,−H,−OCH3または−OCH2CH3でなければなら
ず、R4は−Ｈでなければならず；そして （ｃ） R1が−（CH2）nOHでありｎが２〜６である時、
R3およびR4は両方とも−Ｈでなければならない ことを前提とする〕 を有する化合物の群から選択される。
Ｉの有機化合物を含んで成り、ここで式Ｉは、式C6H5CH
2OHまたは下式： 〔上式中、 R1は−（CH2）nOH（ｎは１〜６である）；−CH（OH）
CH2OH;−CH2CH（OH）CH2OHおよび−CH（OH）COOR5（R5
は−（CH2）pCH3であり、ｐは０〜３である）から成る
群から選択された基であり； R2は−H;−F;−Cl;−Br;−I;−OH;−Ｓ（CH2）rCH
3（ｒは０〜３である）；−Ｏ（CH2）qCH3（ｑは０〜６
である）；−COOR6（R6は−（CH2）sCH3であり、ｓは０
〜３である）；−C6H5;−CH2C6H5;−OC6H5;−OCH2C6H5;
−CH2OH;−CF3および−（CH2）tCH3（ｔは０〜６であ
る）から成る群から選択された基であり； R3は−H;−F;−Cl;−Br;−I;−OH;−CH3;−（CH2）xC
H3（ｘは０〜３である）；−Ｏ（CH2）vCH3（ｖは０〜
３である）から成る群から選択された基であり；そして R4は−H;−F;−Cl;−Br;−I;−（CH2）yCH3（ｙは０
〜３である）；−Ｏ（CH2）wCH3（ｗは０〜３である）
から成る群から選択された基であり；そして更に、 R2,R3およびR4はR1に関して任意の位置に存在してもよ
く、ただし、 （ａ） R1が−CH（OH）CH2OH,−CH2CH（OH）CH2OHまた
は−CH（OH）COOR5である時、R2,R3およびR4は−Ｈでな
ければならず； （ｂ） R1が−CH2OHでありそしてR2が−C6H5;−OCH2C6
H5または−CH2C6H5である時、R3は−CH3,−OH,−Cl,−B
r,−F,−I,−H,−OCH3または−OCH2CH3でなければなら
ず、R4は−Ｈでなければならず；そして （ｃ） R1が−（CH2）nOHでありｎが２〜６である時、
R3およびR4は両方とも−Ｈでなければならない ことを前提とする〕 を有する化合物の群から選択される。
式Ｉは分枝鎖と直鎖の両方のアルキルの全異性体形を
包含する。特記しない限り、どの数字の範囲も指摘した
範囲の上限と下限を包含し、０はその要素が無いことを
意味する。例えば、−（CH2）nCH3（ｎは０〜２であ
る）とは、３つの成分−CH3,−CH2CH3および−CH2CH2CH
3を言う。HC6H5はベンゼン環である。
包含する。特記しない限り、どの数字の範囲も指摘した
範囲の上限と下限を包含し、０はその要素が無いことを
意味する。例えば、−（CH2）nCH3（ｎは０〜２であ
る）とは、３つの成分−CH3,−CH2CH3および−CH2CH2CH
3を言う。HC6H5はベンゼン環である。
次の式Ｉの化合物が特に好ましい： R1が−（CH2）nOH（ｎは１〜４である）であり、そし
てR2,R3およびR4が全て−Ｈであるもの； R1が−（CH2）nOH（ｎは１〜４である）であり、R2が
−（CH2）tCH3（ｔは０〜４である）であり、そしてR3
とR4が両方とも−Ｈであるもの；または R1が−（CH2）nOH（ｎは１〜４である）であり、R2が
−Ｏ（CH2）qCH3（ｑは０〜４である）であり、そしてR
3とR4が両方とも−Ｈであるもの。
てR2,R3およびR4が全て−Ｈであるもの； R1が−（CH2）nOH（ｎは１〜４である）であり、R2が
−（CH2）tCH3（ｔは０〜４である）であり、そしてR3
とR4が両方とも−Ｈであるもの；または R1が−（CH2）nOH（ｎは１〜４である）であり、R2が
−Ｏ（CH2）qCH3（ｑは０〜４である）であり、そしてR
3とR4が両方とも−Ｈであるもの。
上記化合物は全て市販されている。代表的化合物はア
ルドリッチケミカル社（Aldrich Chemical Company,In
c.,Milwaukee,Wisconsin）またはフルカケミカル社（Fl
uka Chemical Company,New York,New York）から購入す
ることができる。
ルドリッチケミカル社（Aldrich Chemical Company,In
c.,Milwaukee,Wisconsin）またはフルカケミカル社（Fl
uka Chemical Company,New York,New York）から購入す
ることができる。
上記に指摘した有機化合物またはその混合物は、約0.
7〜1.9g/ml、好ましくは約1.01g/ml以上、最も好ましく
は約1.09g/ml以上の比重を有するものである。それらは
また37℃以下の融点も有するだろう。
7〜1.9g/ml、好ましくは約1.01g/ml以上、最も好ましく
は約1.09g/ml以上の比重を有するものである。それらは
また37℃以下の融点も有するだろう。
抽出溶液の最も好ましい有機化合物はベンジルアルコ
ール、２−メチルベンジルアルコール、４−メトキシベ
ンジルアルコール、３−エトキシベンジルアルコールお
よび４−フェノキシベンジルアルコールである。
ール、２−メチルベンジルアルコール、４−メトキシベ
ンジルアルコール、３−エトキシベンジルアルコールお
よび４−フェノキシベンジルアルコールである。
上記有機化合物の幾つかは液体形でないが、抽出溶液
に使われるベンジルアルコールのような適当な溶媒中に
溶解させることができる。
に使われるベンジルアルコールのような適当な溶媒中に
溶解させることができる。
従来、相分離を使って核酸を抽出するためには、有機
溶媒、例えばフェノールまたはフェノール−クロロホル
ム混合物が使われている。本発明の抽出溶液を用いてそ
れらの方法を有効に利用することができる。しかしなが
ら、本発明の方法の利点は、そのような毒性化合物や長
くて面倒な抽出方法が不要なことである。
溶媒、例えばフェノールまたはフェノール−クロロホル
ム混合物が使われている。本発明の抽出溶液を用いてそ
れらの方法を有効に利用することができる。しかしなが
ら、本発明の方法の利点は、そのような毒性化合物や長
くて面倒な抽出方法が不要なことである。
抽出溶液を生物学的混合物を含む試料と混合すると、
混合した溶液が二相になり、非核酸材料が有機相に存在
しそして核酸材料は水相に存在する。有機相を適当な緩
衝液、典型的には該試料を希釈または懸濁するのに使わ
れる緩衝液で飽和することが有用である。典型的には合
わせた溶液を混合し、低速遠心に１回または複数回かけ
る。遠心は相分離には必要でないが、一層迅速な分離に
備える。
混合した溶液が二相になり、非核酸材料が有機相に存在
しそして核酸材料は水相に存在する。有機相を適当な緩
衝液、典型的には該試料を希釈または懸濁するのに使わ
れる緩衝液で飽和することが有用である。典型的には合
わせた溶液を混合し、低速遠心に１回または複数回かけ
る。遠心は相分離には必要でないが、一層迅速な分離に
備える。
水相中の核酸は、当業者に既知の方法で、アルコー
ル、例えばエタノールまたはイソプロパノールで沈澱さ
せる。例えば、ハイブリッド形成法に使用するために
は、核酸を水相中に残してもよい。新たな抽出溶液を添
加することによって水相を再抽出してもよい。
ル、例えばエタノールまたはイソプロパノールで沈澱さ
せる。例えば、ハイブリッド形成法に使用するために
は、核酸を水相中に残してもよい。新たな抽出溶液を添
加することによって水相を再抽出してもよい。
抽出溶液は、混合した溶液が典型的には約10〜約80
％、好ましくは約40〜約60％、最も好ましくは約50％
（容量：容量に基づく）の上記有機組成物を含有するよ
うに試料と混合されるだろう。次いで好ましくは、抽出
溶液は標準緩衝液および細胞の溶解を促進する洗剤も含
有するだろう。クエン酸ナトリウム、Tris−HCl、PIPES
またはHEPES、好ましくはTris−HCl、といった緩衝液を
約0.01〜0.1Mの濃度で使用することができる。緩衝液は
典型的には約0.05〜５％のイオン性または非イオン性洗
剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）またはサル
コシル（Sigma Chemical Co.,St.Louis,Missouri）、１
〜20mMのEDTA、および約０〜250mMの塩、例えばNaClも
含有するだろう。
％、好ましくは約40〜約60％、最も好ましくは約50％
（容量：容量に基づく）の上記有機組成物を含有するよ
うに試料と混合されるだろう。次いで好ましくは、抽出
溶液は標準緩衝液および細胞の溶解を促進する洗剤も含
有するだろう。クエン酸ナトリウム、Tris−HCl、PIPES
またはHEPES、好ましくはTris−HCl、といった緩衝液を
約0.01〜0.1Mの濃度で使用することができる。緩衝液は
典型的には約0.05〜５％のイオン性または非イオン性洗
剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）またはサル
コシル（Sigma Chemical Co.,St.Louis,Missouri）、１
〜20mMのEDTA、および約０〜250mMの塩、例えばNaClも
含有するだろう。
同様に好ましく抽出溶液中に内在するものは、約0.1
〜約10％、好ましくは約１〜約５％（重量：容量に基づ
く）の濃度のヌクレアーゼ阻害剤、好ましくは有機粘土
等、より好ましくはベントナイト、Macaloid 、Benton
e （２面に長鎖有機化合物が結合しているベントナイ
トまたはヘクトライト有機粘土血小板）等、並びにそれ
らの混合物、誘導体または類似体である。ベントナイト
は、ここでは任意の粘土もしくはシリケート、例えば珪
藻土、または主としてモンモリロナイト（Al2O3・4 SiO
2・H2O）から成る任意の物質、典型的には珪酸アルミニ
ウム等を包含する。使用時、ベントナイトをまず水で飽
和し、抽出溶液に添加する。Macaloid （粘土）とBent
one はN.L.Chemicals,Hightstown,N.J.から入手でき
る。Bentone は本発明の範囲内の利用に特に適当であ
る。というのは、ベントナイトやMacaloidRに比べて長
期間に渡り粒状物を比較的均一な懸濁液に保持するから
である。Sambrookら、Molecular Cloning−A Laborator
y Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,New York（1989）（これは参考として本明細書
中に組み込まれる）に記載されたようにして、ヌクレア
ーゼ阻害剤、例えばベントナイトまたはMacaloid を最
初に精製することが必要かもしれない。効率的な抽出の
ために、均一な小粒子を使用することが好ましい。その
ようなヌクレアーゼ阻害剤は、RNAの抽出を所望する時
に特に望ましい。リボヌクレアーゼが実質的に抽出を妨
害しないか、またはDNAのみを抽出しようとする試料で
は、そのようなヌクレアーゼ阻害剤を使わずに核酸を抽
出することができる。
〜約10％、好ましくは約１〜約５％（重量：容量に基づ
く）の濃度のヌクレアーゼ阻害剤、好ましくは有機粘土
等、より好ましくはベントナイト、Macaloid 、Benton
e （２面に長鎖有機化合物が結合しているベントナイ
トまたはヘクトライト有機粘土血小板）等、並びにそれ
らの混合物、誘導体または類似体である。ベントナイト
は、ここでは任意の粘土もしくはシリケート、例えば珪
藻土、または主としてモンモリロナイト（Al2O3・4 SiO
2・H2O）から成る任意の物質、典型的には珪酸アルミニ
ウム等を包含する。使用時、ベントナイトをまず水で飽
和し、抽出溶液に添加する。Macaloid （粘土）とBent
one はN.L.Chemicals,Hightstown,N.J.から入手でき
る。Bentone は本発明の範囲内の利用に特に適当であ
る。というのは、ベントナイトやMacaloidRに比べて長
期間に渡り粒状物を比較的均一な懸濁液に保持するから
である。Sambrookら、Molecular Cloning−A Laborator
y Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,New York（1989）（これは参考として本明細書
中に組み込まれる）に記載されたようにして、ヌクレア
ーゼ阻害剤、例えばベントナイトまたはMacaloid を最
初に精製することが必要かもしれない。効率的な抽出の
ために、均一な小粒子を使用することが好ましい。その
ようなヌクレアーゼ阻害剤は、RNAの抽出を所望する時
に特に望ましい。リボヌクレアーゼが実質的に抽出を妨
害しないか、またはDNAのみを抽出しようとする試料で
は、そのようなヌクレアーゼ阻害剤を使わずに核酸を抽
出することができる。
抽出溶液は、場合により、アミノトリアリールメタン
染料、例えばR.D.Lillie,H.J.Conn's Biological Stain
s,Williams ＆ Wilkins,Baltimore,MD（1977）において
記載されたもの、を含むことがある。適当な染料の性質
としては、有機溶媒中への溶解性、水中への分配が最少
または全くないこと、および核酸への結合が最少または
全くないことが挙げられる。好ましい染料はメチルバイ
オレットであり、メチルバイオレット6Bが特に好まし
い。抽出溶液中への染料の配合は、着色した有機相と無
色の水相をもたらし、それによって抽出工程の間の二相
の一層鮮明な境界線を提供する。染料濃度は水相と有機
相との間の視覚対比を提供するのに十分であり、典型的
には約0.0005〜0.01％（w/v）の範囲内である。染料は
有機相中に存在するので、好ましい有機化合物は染料の
選択によって異なり得る。
染料、例えばR.D.Lillie,H.J.Conn's Biological Stain
s,Williams ＆ Wilkins,Baltimore,MD（1977）において
記載されたもの、を含むことがある。適当な染料の性質
としては、有機溶媒中への溶解性、水中への分配が最少
または全くないこと、および核酸への結合が最少または
全くないことが挙げられる。好ましい染料はメチルバイ
オレットであり、メチルバイオレット6Bが特に好まし
い。抽出溶液中への染料の配合は、着色した有機相と無
色の水相をもたらし、それによって抽出工程の間の二相
の一層鮮明な境界線を提供する。染料濃度は水相と有機
相との間の視覚対比を提供するのに十分であり、典型的
には約0.0005〜0.01％（w/v）の範囲内である。染料は
有機相中に存在するので、好ましい有機化合物は染料の
選択によって異なり得る。
タンパク質構造を破壊しそして核酸を遊離せしめるた
めに、抽出の前または最中に、生物学的試料は典型的に
は溶解剤の使用を通して溶解される。好ましくは、試料
は抽出溶液の添加前に溶解にかけられるだろう。核酸抽
出法に典型的に使われる溶解剤はいずれも適当であり、
例えばSDS、リゾチーム、カオトロピック剤と様々に組
み合せたプロテイナーゼＫ、または細胞膜の完全状態を
弱化もしくは破壊するであろう他の剤が適当である。
めに、抽出の前または最中に、生物学的試料は典型的に
は溶解剤の使用を通して溶解される。好ましくは、試料
は抽出溶液の添加前に溶解にかけられるだろう。核酸抽
出法に典型的に使われる溶解剤はいずれも適当であり、
例えばSDS、リゾチーム、カオトロピック剤と様々に組
み合せたプロテイナーゼＫ、または細胞膜の完全状態を
弱化もしくは破壊するであろう他の剤が適当である。
核酸を解離せしめそしてヌクレアーゼを阻害するため
に、タンパク質の二次および三次構造を破壊するカオト
ロピック剤〔例えば、グアニジニウム塩、例えばグアニ
ジニウム塩酸塩（GuHCl）、グアニジニウムイソチオシ
アネート（GuSCN）、尿素または他のイソチオシアネー
ト〕を抽出溶液と組み合わせてまたは抽出溶液の添加前
に溶解剤として使用することができる。核酸の抽出およ
びハイブリッド形成におけるカオトロピック剤の使用は
欧州特許公報第0 127 327号（これは参考として本明細
書中に組み込まれる）に記載されている。カオトロピッ
ク剤は、標的細胞から核酸を遊離せしめ且つ遊離された
核酸をヌクレアーゼから保護するのに十分な濃度で存在
する。典型的には、カオトロピック剤は約1M〜約5Mの濃
度で存在し、より好ましくは約2M〜約3Mで存在する。溶
解および抽出を促進するためにラクタムを抽出溶液と組
み合わせて用いることもできる。ラクタムの例および抽
出操作におけるそれらの利用法は、1989年７月24日に出
願の一般譲渡されたU.S.S.N.07/384,235において十分に
記載されている。これは参考として本明細書中に組み込
まれる。好ましいラクタムはシクロヘキシルピロリド
ン、１−フェニル−２−ピロリドンおよび1,3−ジメチ
ル−3,4,5,6−テトラヒドロ−２−（Ｈ）−ピロリドン
である。
に、タンパク質の二次および三次構造を破壊するカオト
ロピック剤〔例えば、グアニジニウム塩、例えばグアニ
ジニウム塩酸塩（GuHCl）、グアニジニウムイソチオシ
アネート（GuSCN）、尿素または他のイソチオシアネー
ト〕を抽出溶液と組み合わせてまたは抽出溶液の添加前
に溶解剤として使用することができる。核酸の抽出およ
びハイブリッド形成におけるカオトロピック剤の使用は
欧州特許公報第0 127 327号（これは参考として本明細
書中に組み込まれる）に記載されている。カオトロピッ
ク剤は、標的細胞から核酸を遊離せしめ且つ遊離された
核酸をヌクレアーゼから保護するのに十分な濃度で存在
する。典型的には、カオトロピック剤は約1M〜約5Mの濃
度で存在し、より好ましくは約2M〜約3Mで存在する。溶
解および抽出を促進するためにラクタムを抽出溶液と組
み合わせて用いることもできる。ラクタムの例および抽
出操作におけるそれらの利用法は、1989年７月24日に出
願の一般譲渡されたU.S.S.N.07/384,235において十分に
記載されている。これは参考として本明細書中に組み込
まれる。好ましいラクタムはシクロヘキシルピロリド
ン、１−フェニル−２−ピロリドンおよび1,3−ジメチ
ル−3,4,5,6−テトラヒドロ−２−（Ｈ）−ピロリドン
である。
全核酸（DNAとRNA）の抽出のためには、抽出は典型的
には約37℃〜約65℃にて約１〜10分間行われる。この抽
出操作は、好ましくは試料を抽出溶液と混合した後、水
相中に存在する核酸の量が1mg/mlを越えないような核酸
の濃度を有する水性試料を与えるだろう。有用な経験法
は、生物学的材料の合計が与えられた試料中50mg/mlを
越えないようにすることである。試料容量対抽出溶液容
量の比は典型的には0.5:1〜3:1、より典型的には0.75:1
〜2:1、最も典型的には約1:1である。
には約37℃〜約65℃にて約１〜10分間行われる。この抽
出操作は、好ましくは試料を抽出溶液と混合した後、水
相中に存在する核酸の量が1mg/mlを越えないような核酸
の濃度を有する水性試料を与えるだろう。有用な経験法
は、生物学的材料の合計が与えられた試料中50mg/mlを
越えないようにすることである。試料容量対抽出溶液容
量の比は典型的には0.5:1〜3:1、より典型的には0.75:1
〜2:1、最も典型的には約1:1である。
リボソームRNAの抽出 本発明の抽出溶液はリボソームRNA（rRNA）の選択的
抽出も可能にする。核酸を含む試料を溶解させた後、試
料を抽出液と混合する前または後に、試料を加熱する。
抽出溶液の添加の前または後で試料を約65℃で約10分間
加熱することにより、rRNAの収量は５〜50倍増加する。
加熱を使わなければ、主としてDNAが抽出される。
抽出も可能にする。核酸を含む試料を溶解させた後、試
料を抽出液と混合する前または後に、試料を加熱する。
抽出溶液の添加の前または後で試料を約65℃で約10分間
加熱することにより、rRNAの収量は５〜50倍増加する。
加熱を使わなければ、主としてDNAが抽出される。
従って、最初に試料を溶解させることによりrRNAとDN
Aの連続抽出を行うことができる。例えば、本明細書に
記載の如く抽出溶液を使って室温で抽出を行い、最初の
水相からDNAを単離し、最初の有機相中にrRNAを残す。
次いで標準緩衝液（例えば１％SDS,50mM Tris,25mM EDT
Aおよび0.05mM NaCl）を添加した後、最初の有機相から
rRNAを抽出する。この溶液を典型的には約65℃に加熱
し、第二の有機相と第二の水相を作る。
Aの連続抽出を行うことができる。例えば、本明細書に
記載の如く抽出溶液を使って室温で抽出を行い、最初の
水相からDNAを単離し、最初の有機相中にrRNAを残す。
次いで標準緩衝液（例えば１％SDS,50mM Tris,25mM EDT
Aおよび0.05mM NaCl）を添加した後、最初の有機相から
rRNAを抽出する。この溶液を典型的には約65℃に加熱
し、第二の有機相と第二の水相を作る。
最も好ましく且つキット形態において提供してもよい
抽出溶液は、ベントナイトまたはBentone 、溶解剤、
および抽出溶液に関連して上記に記載したものから選択
された有機化合物を含んで成る抽出組成物である。新規
抽出組成物は、上述の要素（これは様々に記載した抽出
溶液中に含まれてもよい）の任意の組み合わせを含有す
ることができる。
抽出溶液は、ベントナイトまたはBentone 、溶解剤、
および抽出溶液に関連して上記に記載したものから選択
された有機化合物を含んで成る抽出組成物である。新規
抽出組成物は、上述の要素（これは様々に記載した抽出
溶液中に含まれてもよい）の任意の組み合わせを含有す
ることができる。
ハイブリッド形成を改善する抽出 複雑な生成学的試料、例えば糞便または血液において
ハイブリッド形成アッセイを行う前に、本発明の抽出方
法および組成物を使うことも有利である。バックグラウ
ンド干渉を招く汚染物を除去するために抽出操作が必要
となる場合がある。抽出の後で核酸を濃縮する操作は、
ハイブリッド形成アッセイにおける感度とシグナル対ノ
イズ比を改善することができる。
ハイブリッド形成アッセイを行う前に、本発明の抽出方
法および組成物を使うことも有利である。バックグラウ
ンド干渉を招く汚染物を除去するために抽出操作が必要
となる場合がある。抽出の後で核酸を濃縮する操作は、
ハイブリッド形成アッセイにおける感度とシグナル対ノ
イズ比を改善することができる。
本発明に係るハイブリッド形成アッセイは、本明細書
に与えられる指針を前提にして、当業者に既知であるか
またはイムノアッセイ方法論に類似している任意の方法
により実施することができる。好ましいアッセイ方法は
サンドイッチアッセイとその変形、競合または置換アッ
セイである。ハイブリッド形成技術は“Nucleic Acid H
ybridization,A Practical Approach,"Hames,B.D.およ
びHiggins,S.J.編,IRL Press,1985;GallおよびPardue
（1969）,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.63:378−383:並び
にJohn,BurnsteilおよびJones（1969）Nature 223:582
−587に概括的に記載されている。ハイブリッド形成技
術に改良が行われると、それらを容易に適用することが
できる。
に与えられる指針を前提にして、当業者に既知であるか
またはイムノアッセイ方法論に類似している任意の方法
により実施することができる。好ましいアッセイ方法は
サンドイッチアッセイとその変形、競合または置換アッ
セイである。ハイブリッド形成技術は“Nucleic Acid H
ybridization,A Practical Approach,"Hames,B.D.およ
びHiggins,S.J.編,IRL Press,1985;GallおよびPardue
（1969）,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.63:378−383:並び
にJohn,BurnsteilおよびJones（1969）Nature 223:582
−587に概括的に記載されている。ハイブリッド形成技
術に改良が行われると、それらを容易に適用することが
できる。
サンドイッチアッセイは、核酸配列を検出または単離
するための商業的に有用なハイブリッド形成アッセイで
ある。そのようなアッセイは固体支持体上に共有結合的
に固定化された「捕捉」核酸と溶液中の標識された「シ
グナル」核酸を使用する。臨床試料が標的核酸を提供す
るだろう。「捕捉」核酸と「シグナル」核酸プローブが
標的核酸とハイブリッド形成して「サンドイッチ」ハイ
ブリッド形成複合体を形成する。有効であるためには、
シグナル核酸は捕捉核酸とハイブリッド形成することが
できない。
するための商業的に有用なハイブリッド形成アッセイで
ある。そのようなアッセイは固体支持体上に共有結合的
に固定化された「捕捉」核酸と溶液中の標識された「シ
グナル」核酸を使用する。臨床試料が標的核酸を提供す
るだろう。「捕捉」核酸と「シグナル」核酸プローブが
標的核酸とハイブリッド形成して「サンドイッチ」ハイ
ブリッド形成複合体を形成する。有効であるためには、
シグナル核酸は捕捉核酸とハイブリッド形成することが
できない。
ハイブリッド形成アッセイでは、標的核酸は、その存
在が興味あるものでありそしてその存在または不在を検
出しようとするデオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（R
NA）またはリボソームリボ核酸（rRNA）のヌクレオチド
配列である。標的核酸は核酸（RNA,DNAおよび／またはr
RNA）と非核酸との複雑な生物学的混合物において提供
され得る。
在が興味あるものでありそしてその存在または不在を検
出しようとするデオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（R
NA）またはリボソームリボ核酸（rRNA）のヌクレオチド
配列である。標的核酸は核酸（RNA,DNAおよび／またはr
RNA）と非核酸との複雑な生物学的混合物において提供
され得る。
ハイブリッド形成媒質は、ハイブリッド形成に必要な
成分を全て含むように商業的にまたは研究室で予備調製
しておくことができる。例えば、サンドイッチアッセイ
では、媒質は、ラクタム、所望の緩衝剤および洗剤、固
体支持体（例えばミクロビーズ）上に結合させた捕捉核
酸、並びにシグナル核酸を含んで成ることができる。こ
の媒質は、アッセイを実施する時点で標的核酸を含む溶
液と混合することのみを必要とする。一度ハイブリッド
形成が起これば、固体支持体に結合したハイブリッド形
成複合体を洗浄し、そしてハイブリッド形成の程度を測
定することができる。
成分を全て含むように商業的にまたは研究室で予備調製
しておくことができる。例えば、サンドイッチアッセイ
では、媒質は、ラクタム、所望の緩衝剤および洗剤、固
体支持体（例えばミクロビーズ）上に結合させた捕捉核
酸、並びにシグナル核酸を含んで成ることができる。こ
の媒質は、アッセイを実施する時点で標的核酸を含む溶
液と混合することのみを必要とする。一度ハイブリッド
形成が起これば、固体支持体に結合したハイブリッド形
成複合体を洗浄し、そしてハイブリッド形成の程度を測
定することができる。
適当な配列が決定されれば、好ましくは商業的に利用
可能な方法および装置を使ってDNAプローブを化学合成
する。固相ホスホルアミダイト法を使って、15〜50塩基
から成り16,000ダルトン未満の分子量を有する短いプロ
ーブを製造することができる〔Caruthersら、Cold Spri
ng Harbor Symp.Quant.Biol.47:411−418（1982）；お
よびAdamsら、J.Am.Chem.Soc.105:661（1983）〕。特定
の標的のためのプローブを合成する時、ヌクレオチド配
列の選択が該標的の特異性を決定するだろう。例えば、
幾つかのウイルス単離物からのDNA配列を比較すること
により、型特異性かまたは属特異性のいずれかであるウ
イルス検出用配列を選択することができる。DNA領域お
よび配列の比較は市販のコンピュータープログラムを使
って行うことができる。
可能な方法および装置を使ってDNAプローブを化学合成
する。固相ホスホルアミダイト法を使って、15〜50塩基
から成り16,000ダルトン未満の分子量を有する短いプロ
ーブを製造することができる〔Caruthersら、Cold Spri
ng Harbor Symp.Quant.Biol.47:411−418（1982）；お
よびAdamsら、J.Am.Chem.Soc.105:661（1983）〕。特定
の標的のためのプローブを合成する時、ヌクレオチド配
列の選択が該標的の特異性を決定するだろう。例えば、
幾つかのウイルス単離物からのDNA配列を比較すること
により、型特異性かまたは属特異性のいずれかであるウ
イルス検出用配列を選択することができる。DNA領域お
よび配列の比較は市販のコンピュータープログラムを使
って行うことができる。
ハイブリッド形成の程度の測定は、当業界で公知の方
法のいずれかを使って行うことができる。検出可能なハ
イブリッド形成が全くない場合は、ハイブリッド形成の
程度は０である。典型的には、標識されたシグナル核酸
を使ってハイブリッド形成を検出する。ハイブリダイズ
したポリヌクレオチドの存在を検出するのに典型的に使
われる幾つかの方法のいずれか１つにより、相補的核酸
またはシグナル核酸を標識することができる。最も一般
的な検出方法は、3H,125I,35S,14Cまたは32P標識プロー
ブ等を用いるオートラジオグラフィーの使用である。放
射性同位体の選択は、選択した同位体の合成の容易さ、
多様な安定性および半減期による研究優先権に依存す
る。他の標識としては、標識抗体に結合するリガンド、
蛍光団、化学発光物質、酵素、および標識リガンドに対
する特異的結合ペアメンバーとして働くことができる抗
体が挙げられる。標識の選択は、必要な感度、プローブ
との接合の容易さ、安定性要件、および利用可能な装置
に依存する。
法のいずれかを使って行うことができる。検出可能なハ
イブリッド形成が全くない場合は、ハイブリッド形成の
程度は０である。典型的には、標識されたシグナル核酸
を使ってハイブリッド形成を検出する。ハイブリダイズ
したポリヌクレオチドの存在を検出するのに典型的に使
われる幾つかの方法のいずれか１つにより、相補的核酸
またはシグナル核酸を標識することができる。最も一般
的な検出方法は、3H,125I,35S,14Cまたは32P標識プロー
ブ等を用いるオートラジオグラフィーの使用である。放
射性同位体の選択は、選択した同位体の合成の容易さ、
多様な安定性および半減期による研究優先権に依存す
る。他の標識としては、標識抗体に結合するリガンド、
蛍光団、化学発光物質、酵素、および標識リガンドに対
する特異的結合ペアメンバーとして働くことができる抗
体が挙げられる。標識の選択は、必要な感度、プローブ
との接合の容易さ、安定性要件、および利用可能な装置
に依存する。
核酸の抽出およびハイブリッド形成のためのキットも
期待される。該キットは、様々な所望の組合せで上記溶
液と組成物を含んで成る。
期待される。該キットは、様々な所望の組合せで上記溶
液と組成物を含んで成る。
典型的には、生物学的試料中に存在する化合物は、標
的増幅方法、例えばPCRおよびLCRに対して阻害作用を及
ぼす。この観察される阻害は、血液試料から抽出された
核酸の増幅の場合に特に問題となる。本発明の方法は、
一般に生物学的試料、特に血液からの標的増幅の阻害剤
を全部ではないにしろ大部分除去する。よって、本発明
の方法は、標的増幅方法と組み合わせて有利に利用する
ことができる。本発明は、低コピー数の標的核酸を含有
する生物学的試料から得られた核酸の標的増幅に特に適
当である。
的増幅方法、例えばPCRおよびLCRに対して阻害作用を及
ぼす。この観察される阻害は、血液試料から抽出された
核酸の増幅の場合に特に問題となる。本発明の方法は、
一般に生物学的試料、特に血液からの標的増幅の阻害剤
を全部ではないにしろ大部分除去する。よって、本発明
の方法は、標的増幅方法と組み合わせて有利に利用する
ことができる。本発明は、低コピー数の標的核酸を含有
する生物学的試料から得られた核酸の標的増幅に特に適
当である。
下記の実施例は例示のつもりで与えられ、けっして本
発明を限定するものと解釈してはならない。
発明を限定するものと解釈してはならない。
実施例 実施例１ ベンジルアルコールおよびベンジルアルコール誘導体を
使った全核酸の抽出 この抽出プロトコールは、フェノールまたはフェノー
ル／クロロホルムを使用しないでグアニジニウムイソチ
オシアネートで溶解された試料からの核酸の単離を可能
にする。有機相はベンジルアルコールまたはベンジルア
ルコールの誘導体から成る。
使った全核酸の抽出 この抽出プロトコールは、フェノールまたはフェノー
ル／クロロホルムを使用しないでグアニジニウムイソチ
オシアネートで溶解された試料からの核酸の単離を可能
にする。有機相はベンジルアルコールまたはベンジルア
ルコールの誘導体から成る。
約５×109個のバクテロイデス・ギンギバリス（Bacte
roides gingivalis）細胞を、２％サルコシル（Sigma C
hemical Company,St.Louis,MO）、50mM Tris（pH7.6）
および25mM EDTAを含む3M GuSCN（Kodak,Rochester,New
York）溶解溶液750μ中で溶解せしめた。次いで溶解
物を６本の1.5ml超遠心管に100μずつアリコートに分
けた。各試験管に、0.05M Tris−HCl,5mM EDTA（pH7.
2）で飽和された有機相500μ〔ここで、 試験管１の有機相は２−メチルベンジルアルコール
（Aldrich Chemical Company,Milwaukee,Wisconsin）で
あり； 試験管２の有機相は４−メトキシベンジルアルコール
（Aldrich）であり； 試験管３の有機相は３−エトキシベンジルアルコール
（Aldrich）であり； 試験管４の有機相は４−フェノキシベンジルアルコー
ル（Aldrich）であり； 試験管５の有機相はベンジルアルコール（Aldrich）
であり； 試験管６の有機相はフェノール（Bethesda Research
Laboratories（BRL）,Gaithersburg,Maryland）であっ
た〕 および抽出緩衝液250μ〔0.05M NaCl,50mM Tris−HCl
（pH7.2）,5mM EDTAおよび0.5％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（Sigma Chemical Company,St.Louis,Missouri;SD
S）〕をそれぞれ添加した。生じた溶液を15秒間激しく
混合し、65℃で10分間加熱した。次いで試験管を再び15
秒間激しく混合した。次いで超遠心機中で10,000rpmで
の遠心により相を分離した。上の水相を取り出し（通常
400μの容量）、水相に二倍の容量の100％エタノール
を添加した。19℃で５分間核酸の沈澱を生じさせた。次
いで10,000rpmでの10分間の遠心により溶液から核酸を
ペレット化した。液相をデカンテーションし、捨てた。
核酸ペレットを100μの蒸留水に溶かし、次いでアガ
ロースゲル電気泳動にかけた。結果を図１に与える。該
結果は、どの抽出も収量および純度においてフェノール
を使った抽出と同等であったことを指摘する。
roides gingivalis）細胞を、２％サルコシル（Sigma C
hemical Company,St.Louis,MO）、50mM Tris（pH7.6）
および25mM EDTAを含む3M GuSCN（Kodak,Rochester,New
York）溶解溶液750μ中で溶解せしめた。次いで溶解
物を６本の1.5ml超遠心管に100μずつアリコートに分
けた。各試験管に、0.05M Tris−HCl,5mM EDTA（pH7.
2）で飽和された有機相500μ〔ここで、 試験管１の有機相は２−メチルベンジルアルコール
（Aldrich Chemical Company,Milwaukee,Wisconsin）で
あり； 試験管２の有機相は４−メトキシベンジルアルコール
（Aldrich）であり； 試験管３の有機相は３−エトキシベンジルアルコール
（Aldrich）であり； 試験管４の有機相は４−フェノキシベンジルアルコー
ル（Aldrich）であり； 試験管５の有機相はベンジルアルコール（Aldrich）
であり； 試験管６の有機相はフェノール（Bethesda Research
Laboratories（BRL）,Gaithersburg,Maryland）であっ
た〕 および抽出緩衝液250μ〔0.05M NaCl,50mM Tris−HCl
（pH7.2）,5mM EDTAおよび0.5％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（Sigma Chemical Company,St.Louis,Missouri;SD
S）〕をそれぞれ添加した。生じた溶液を15秒間激しく
混合し、65℃で10分間加熱した。次いで試験管を再び15
秒間激しく混合した。次いで超遠心機中で10,000rpmで
の遠心により相を分離した。上の水相を取り出し（通常
400μの容量）、水相に二倍の容量の100％エタノール
を添加した。19℃で５分間核酸の沈澱を生じさせた。次
いで10,000rpmでの10分間の遠心により溶液から核酸を
ペレット化した。液相をデカンテーションし、捨てた。
核酸ペレットを100μの蒸留水に溶かし、次いでアガ
ロースゲル電気泳動にかけた。結果を図１に与える。該
結果は、どの抽出も収量および純度においてフェノール
を使った抽出と同等であったことを指摘する。
実施例２ ベンジルアルコールとベントナイトを使った糞便試料か
らの全核酸の抽出 この抽出プロトコールは、フェノールまたはフェノー
ル／クロロホルムを使用せずにグアニジニウムイソチオ
シアネートで溶解された特に複雑な試料からの核酸の単
離を可能にする。
らの全核酸の抽出 この抽出プロトコールは、フェノールまたはフェノー
ル／クロロホルムを使用せずにグアニジニウムイソチオ
シアネートで溶解された特に複雑な試料からの核酸の単
離を可能にする。
輸送媒体（Trend FekalTMEnteric Plus Transport Sy
stem,Trend Scientific Inc.,St.Paul,Minnesota）中の
糞便試料を100μずつのアリコートに分けた。各アリ
コートを300μのGuSCN溶解溶液（実施例１と同じ）で
溶解せしめ、そして５×108個のバクテロイデス・ギン
ギバリス（Bacteroides gingivalis）細胞でスパイクし
た。スパイク後、試料を２セットに等分した。１セット
はフェノールを使って抽出し、もう１セットは、１％W/
V水飽和ベントナイト（Sigma）を含有するベンジルアル
コールから成るベンジルアルコール／ベントナイト溶液
500μ、および抽出緩衝液（0.05M NaCl,50mM Tris−H
Cl,pH7.2,5mM EDTAおよび0.5％ドデシル硫酸ナトリウ
ム）250μを添加することによって抽出した。生じた
溶液を15秒間激しく混合し、65℃で10分間加熱した。次
いで試験管を再び15秒間激しく混合した。次いで超遠心
機中で10,000rpmでの２分間の遠心により相を分離し
た。上の水相を取り出し（通常400μの容量）、水相
に２倍の容量の100％エタノールを添加した。19℃で５
分間核酸の沈澱を生じさせた。次いで10,000rpmでの10
分間の遠心により溶液から核酸をペレット化した。液相
をデカンテーションし、捨てた。核酸ペレットを100μ
の蒸留水に溶かし、次いでアガロースゲル電気泳動に
かけた。
stem,Trend Scientific Inc.,St.Paul,Minnesota）中の
糞便試料を100μずつのアリコートに分けた。各アリ
コートを300μのGuSCN溶解溶液（実施例１と同じ）で
溶解せしめ、そして５×108個のバクテロイデス・ギン
ギバリス（Bacteroides gingivalis）細胞でスパイクし
た。スパイク後、試料を２セットに等分した。１セット
はフェノールを使って抽出し、もう１セットは、１％W/
V水飽和ベントナイト（Sigma）を含有するベンジルアル
コールから成るベンジルアルコール／ベントナイト溶液
500μ、および抽出緩衝液（0.05M NaCl,50mM Tris−H
Cl,pH7.2,5mM EDTAおよび0.5％ドデシル硫酸ナトリウ
ム）250μを添加することによって抽出した。生じた
溶液を15秒間激しく混合し、65℃で10分間加熱した。次
いで試験管を再び15秒間激しく混合した。次いで超遠心
機中で10,000rpmでの２分間の遠心により相を分離し
た。上の水相を取り出し（通常400μの容量）、水相
に２倍の容量の100％エタノールを添加した。19℃で５
分間核酸の沈澱を生じさせた。次いで10,000rpmでの10
分間の遠心により溶液から核酸をペレット化した。液相
をデカンテーションし、捨てた。核酸ペレットを100μ
の蒸留水に溶かし、次いでアガロースゲル電気泳動に
かけた。
フェノール抽出には、上記と同様に試料を溶解せし
め、そしてベンジルアルコール法について記載したもの
と全く同様に抽出した。上記と同様な遠心により相を分
離し、追加の量のフェノールを使って65℃にて水相を再
抽出した。単離された核酸を上記と同様にして70％エタ
ノールで沈澱させた。液相をデカンテーションし、捨て
た。核酸ペレットを100μの蒸留水に溶かし、次いで
アガロースゲル電気泳動にかけた。結果を図２に与え
る。この結果は、ベンジルアルコール抽出を使って、高
いヌクレアーゼレベルを有する源から全核酸を単離する
ことができることを示す。
め、そしてベンジルアルコール法について記載したもの
と全く同様に抽出した。上記と同様な遠心により相を分
離し、追加の量のフェノールを使って65℃にて水相を再
抽出した。単離された核酸を上記と同様にして70％エタ
ノールで沈澱させた。液相をデカンテーションし、捨て
た。核酸ペレットを100μの蒸留水に溶かし、次いで
アガロースゲル電気泳動にかけた。結果を図２に与え
る。この結果は、ベンジルアルコール抽出を使って、高
いヌクレアーゼレベルを有する源から全核酸を単離する
ことができることを示す。
実施例３ 複雑な生物学的試料の予備抽出による改良ハイブリッド
形成法 アッセイはサントイッチアッセイ形式においてナイロ
ン固体支持体を使用し、このアッセイにおいて標的核酸
配列を配列決定し、次いで蛍光アッセイ形式を使って検
出する。
形成法 アッセイはサントイッチアッセイ形式においてナイロ
ン固体支持体を使用し、このアッセイにおいて標的核酸
配列を配列決定し、次いで蛍光アッセイ形式を使って検
出する。
輸送媒体（Trend FekalTMEnteric Plus Transport Sy
stem,Trend Scientific Inc.）中の糞便試料を100μ
ずつのアリコートに分けた。各アリコートを300μのG
uSCN溶解溶液（実施例１と同じ）で溶解せしめ、そして
５×108個のバクテロイデス・ギンギバリス細胞でスパ
イクした。スパイク後、試料を２つの等しいアリコート
に分けた。一方のアリコートは実施例２に記載したよう
なベンジルアルコール／ベントナイト法を使って抽出
し、もう一方のアリコートは抽出を行わなかった。抽出
試料からの核酸ペレットを100μの3M GuSCN溶解溶液
〔２％サルコシル、50mM Tris（pH7.6）および25mM EDT
A中〕に溶かした。未抽出の溶解物と3M GuSCN中に単離
された核酸の両者を65℃で５分間加熱した。そして該溶
解物および単離された核酸1mlに対して100ナノグラムの
最終濃度になるように、細菌の16S rRNAの保存領域に相
補的なビオチニル化24マーオリゴヌクレオチド（シグナ
ルプローブ）を添加した。
stem,Trend Scientific Inc.）中の糞便試料を100μ
ずつのアリコートに分けた。各アリコートを300μのG
uSCN溶解溶液（実施例１と同じ）で溶解せしめ、そして
５×108個のバクテロイデス・ギンギバリス細胞でスパ
イクした。スパイク後、試料を２つの等しいアリコート
に分けた。一方のアリコートは実施例２に記載したよう
なベンジルアルコール／ベントナイト法を使って抽出
し、もう一方のアリコートは抽出を行わなかった。抽出
試料からの核酸ペレットを100μの3M GuSCN溶解溶液
〔２％サルコシル、50mM Tris（pH7.6）および25mM EDT
A中〕に溶かした。未抽出の溶解物と3M GuSCN中に単離
された核酸の両者を65℃で５分間加熱した。そして該溶
解物および単離された核酸1mlに対して100ナノグラムの
最終濃度になるように、細菌の16S rRNAの保存領域に相
補的なビオチニル化24マーオリゴヌクレオチド（シグナ
ルプローブ）を添加した。
下記のビオチニル化シグナルオリゴヌクレオチド 並びに抽出試料の場合には１×108個のアクチノバシラ
ス・アクチノミセテコミタンス（Actinobacillus actin
omycetecomitans）、バクテロイデス・インターメジウ
ス（Bacteroides intermedius）、エイケネラ・コロデ
ンス（Eikenella corrodens）、ウォリネラ・レクタ（W
olinella recta）およびフソバクテリウム・ヌクレータ
ム（Fusobacterium nucleatum）の全細胞、そして未抽
出試料の場合には糞便溶解物を含有する3M GuSCN溶解溶
液中の希釈剤を使って、該溶解物の５倍連続希釈液を作
製した。該希釈剤は、上記のビオチニル化シグナルオリ
ゴヌクレオチドを100mg/ml含んだ。次いで生じた溶液
を、0.1μｇのBgl−特異的オリゴヌクレオチドプローブ
（捕捉プローブ）を共有結合的に固定化させたThe Hoov
er Group（Sault St.Marie,MI）により製造された２個
のナイロンビーズと共に周囲温度で30分間インキュベー
トした。固体支持体を周囲温度においてSDS/FW（0.09M
NaCl,50mM Tris,pH7.6,25mM EDTAおよび0.1％SDS）で洗
浄し、次いで0.5％Tween20 （Pierce,Rockford,Illino
is）,1mM MgCl2,0.01M Tris−HCl pH8.0（APB）で洗浄
し、そしてAPB中0.4μg/mlのストレプトアビジン／アル
カリホスファターゼ（SA/AP）接合体と共に周囲温度に
て５分間インキュベートした。次いで固体支持体をAP
B、TMNZ（0.05M Tris pH9.5,1mM MgCl2,0.5mM ZnCl2）
で５回洗浄し、次に黒色ミクロタイターウエルストリッ
プ（Dynatek Laboratories,Chantilly,VA）中でナイロ
ンビーズを150μの0.5mM 4−メチルウンベリフェリル
ホスフェート（４−ヒドロキシメチルクマリン）と共に
インキュベートすることにより、アルカリホスファター
ゼの存在を測定した。インキュベーションは37℃で30分
間であった。次いで溶液をデカンテーションし、96ウエ
ルのミクロタイタープレート中に入れた。Fluoroskan I
I蛍光計（Flow Laboratories,McLean,VA）を使って360n
mの励起波長と456nmの発光波長を用いて該プレートを直
接読んだ。その結果を下記の表Ｉに示す。
ス・アクチノミセテコミタンス（Actinobacillus actin
omycetecomitans）、バクテロイデス・インターメジウ
ス（Bacteroides intermedius）、エイケネラ・コロデ
ンス（Eikenella corrodens）、ウォリネラ・レクタ（W
olinella recta）およびフソバクテリウム・ヌクレータ
ム（Fusobacterium nucleatum）の全細胞、そして未抽
出試料の場合には糞便溶解物を含有する3M GuSCN溶解溶
液中の希釈剤を使って、該溶解物の５倍連続希釈液を作
製した。該希釈剤は、上記のビオチニル化シグナルオリ
ゴヌクレオチドを100mg/ml含んだ。次いで生じた溶液
を、0.1μｇのBgl−特異的オリゴヌクレオチドプローブ
（捕捉プローブ）を共有結合的に固定化させたThe Hoov
er Group（Sault St.Marie,MI）により製造された２個
のナイロンビーズと共に周囲温度で30分間インキュベー
トした。固体支持体を周囲温度においてSDS/FW（0.09M
NaCl,50mM Tris,pH7.6,25mM EDTAおよび0.1％SDS）で洗
浄し、次いで0.5％Tween20 （Pierce,Rockford,Illino
is）,1mM MgCl2,0.01M Tris−HCl pH8.0（APB）で洗浄
し、そしてAPB中0.4μg/mlのストレプトアビジン／アル
カリホスファターゼ（SA/AP）接合体と共に周囲温度に
て５分間インキュベートした。次いで固体支持体をAP
B、TMNZ（0.05M Tris pH9.5,1mM MgCl2,0.5mM ZnCl2）
で５回洗浄し、次に黒色ミクロタイターウエルストリッ
プ（Dynatek Laboratories,Chantilly,VA）中でナイロ
ンビーズを150μの0.5mM 4−メチルウンベリフェリル
ホスフェート（４−ヒドロキシメチルクマリン）と共に
インキュベートすることにより、アルカリホスファター
ゼの存在を測定した。インキュベーションは37℃で30分
間であった。次いで溶液をデカンテーションし、96ウエ
ルのミクロタイタープレート中に入れた。Fluoroskan I
I蛍光計（Flow Laboratories,McLean,VA）を使って360n
mの励起波長と456nmの発光波長を用いて該プレートを直
接読んだ。その結果を下記の表Ｉに示す。
上記結果は、30分間のハイブリッド形成において、抽
出試料を使った時には６×103細胞のレベルが検出され
たが、未抽出試料では４×106細胞のレベルしか検出さ
れなかったことを指摘する。
出試料を使った時には６×103細胞のレベルが検出され
たが、未抽出試料では４×106細胞のレベルしか検出さ
れなかったことを指摘する。
実施例４ ベンジルアルコールとBentone を使った生物学的試料
からのDNAの抽出 大腸菌（E.coli）の懸濁液を遠心により収集し、その
ペレットを、10mM EDTAと10％（w/v）ショ糖を含む50mM
Tris緩衝液（pH7.6）中に108〜1010細胞/mlに再懸濁し
た。次いでこの懸濁液を周囲温度で５〜15分間インキュ
ベートした。あるいは、EDTAナトリウムを含む採集管中
に血液を採集した。
からのDNAの抽出 大腸菌（E.coli）の懸濁液を遠心により収集し、その
ペレットを、10mM EDTAと10％（w/v）ショ糖を含む50mM
Tris緩衝液（pH7.6）中に108〜1010細胞/mlに再懸濁し
た。次いでこの懸濁液を周囲温度で５〜15分間インキュ
ベートした。あるいは、EDTAナトリウムを含む採集管中
に血液を採集した。
生物学的試料（細菌懸濁液または血液試料）を同容量
の溶解緩衝液〔5M GuSCN,83mM Tris−HCl,pH7.6,17mM E
DTAおよび3.3％（w/v）サルコシル〕を使って溶解せし
めた。
の溶解緩衝液〔5M GuSCN,83mM Tris−HCl,pH7.6,17mM E
DTAおよび3.3％（w/v）サルコシル〕を使って溶解せし
めた。
溶解物（200μ）を2mlの超遠心管に移した。激しい
振盪の後、700μの抽出溶液〔99％純度のベンジルア
ルコール中1.1％（w/v）Bentone 〕を溶解物に添加し
た。この混合物に400μの緩衝液〔50mM Tris−HCl,pH
7.6,10mM EDTA,100mM NaCl,0.5％（w/v）SDS〕を添加し
た。生じた混合物を10秒間渦動攪拌し、次いで12,000×
ｇで５分間遠心した。上の水相を新たな2mlの超遠心管
に移し、それに0.1容の3M酢酸ナトリウムを加えた。同
容量のイソプロパノールを添加し、溶液を穏やかに混合
してDNAを沈澱させた。12,000×ｇで10分間の遠心の
後、上清を捨て、ペレット化したDNAに1mlの70％エタノ
ールを添加した。穏やかな攪拌の後、この調製物を12,0
00×ｇで５分間遠心した。上清を捨て、ペレットを風乾
し、次いでDNAペレットをRNアーゼ不含有の水または適
当な緩衝液中に所望の濃度に再懸濁した。
振盪の後、700μの抽出溶液〔99％純度のベンジルア
ルコール中1.1％（w/v）Bentone 〕を溶解物に添加し
た。この混合物に400μの緩衝液〔50mM Tris−HCl,pH
7.6,10mM EDTA,100mM NaCl,0.5％（w/v）SDS〕を添加し
た。生じた混合物を10秒間渦動攪拌し、次いで12,000×
ｇで５分間遠心した。上の水相を新たな2mlの超遠心管
に移し、それに0.1容の3M酢酸ナトリウムを加えた。同
容量のイソプロパノールを添加し、溶液を穏やかに混合
してDNAを沈澱させた。12,000×ｇで10分間の遠心の
後、上清を捨て、ペレット化したDNAに1mlの70％エタノ
ールを添加した。穏やかな攪拌の後、この調製物を12,0
00×ｇで５分間遠心した。上清を捨て、ペレットを風乾
し、次いでDNAペレットをRNアーゼ不含有の水または適
当な緩衝液中に所望の濃度に再懸濁した。
本実施例の上記プロトコールに従って抽出されたDNA
は、標的増幅方法、例えばPCR（ポリメラーゼ連鎖反
応）における使用に適当である。様々な標的増幅方法が
当業界で公知である。下の表２は、本実施例のDNA抽出
法が低コピー数の標的核酸の増幅および検出を可能にす
ることを示す。簡単に言えば、既知濃度のHIV−１プラ
スミドをヒト全血に添加し、PCR反応１回あたり０〜250
のpHIV−１コピーを与えた。二重複製の血液試料100μ
を抽出し、抽出した核酸を100μの水に再懸濁し、
この核酸懸濁液50μを増幅反応毎に使った。増幅され
た標的は、相補的32P標識オリゴヌクレオチドプローブ
のハイブリッド形成により検出した。
は、標的増幅方法、例えばPCR（ポリメラーゼ連鎖反
応）における使用に適当である。様々な標的増幅方法が
当業界で公知である。下の表２は、本実施例のDNA抽出
法が低コピー数の標的核酸の増幅および検出を可能にす
ることを示す。簡単に言えば、既知濃度のHIV−１プラ
スミドをヒト全血に添加し、PCR反応１回あたり０〜250
のpHIV−１コピーを与えた。二重複製の血液試料100μ
を抽出し、抽出した核酸を100μの水に再懸濁し、
この核酸懸濁液50μを増幅反応毎に使った。増幅され
た標的は、相補的32P標識オリゴヌクレオチドプローブ
のハイブリッド形成により検出した。
下の表３は、プロテイナーゼK/フェノール抽出法を使
った全血からのDNAの抽出と本実施例の抽出法を使った
ものとを比較する。簡単に言えば、３つのPCR陽性HTLV
−Ｉ血液試料と５つの対照血液試料（PCRによりHTLV−
Ｉ陰性）を、EDTAナトリウムを含む試験管中に採血し
た。対照血液を使って各陽性試料を５倍間隔において連
続希釈した。二重複製の血液試料100μを、プロテイ
ナーゼK/フェノール法（例えば、Sambrookら、“Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual",Cold Spring Harbo
r Laboratory Press,New York,1989;R.Higuchi,“Ampli
fications:A Forum for PCR Users",Perkin−Elmer Cor
p.,Norwalk,CT,1989を参照のこと）または本実施例の方
法を使って抽出した。抽出された核酸を100μの水に
再懸濁し、そしてこの核酸懸濁液50μをPCR反応毎に
使った。増幅された標的は、相補的32P標識オリゴヌク
レオチドプローブのハイブリッド形成により検出した。
表３は、プロテイナーゼK/フェノール法と記載の方法が
同等な抽出限界および検出限界を与えることを証明す
る。
った全血からのDNAの抽出と本実施例の抽出法を使った
ものとを比較する。簡単に言えば、３つのPCR陽性HTLV
−Ｉ血液試料と５つの対照血液試料（PCRによりHTLV−
Ｉ陰性）を、EDTAナトリウムを含む試験管中に採血し
た。対照血液を使って各陽性試料を５倍間隔において連
続希釈した。二重複製の血液試料100μを、プロテイ
ナーゼK/フェノール法（例えば、Sambrookら、“Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual",Cold Spring Harbo
r Laboratory Press,New York,1989;R.Higuchi,“Ampli
fications:A Forum for PCR Users",Perkin−Elmer Cor
p.,Norwalk,CT,1989を参照のこと）または本実施例の方
法を使って抽出した。抽出された核酸を100μの水に
再懸濁し、そしてこの核酸懸濁液50μをPCR反応毎に
使った。増幅された標的は、相補的32P標識オリゴヌク
レオチドプローブのハイブリッド形成により検出した。
表３は、プロテイナーゼK/フェノール法と記載の方法が
同等な抽出限界および検出限界を与えることを証明す
る。
実施例５ ベンジルアルコールとBentone を使った生物学的試料
からの全核酸の抽出 大腸菌（E.coli）の懸濁液を遠心により収集し、その
ペレットを、10mM EDTAと10％（w/v）ショ糖を含む50mM
Tris緩衝液（pH7.6）中に108〜1010細胞/mlに再懸濁し
た。次いでこの懸濁液を周囲温度で５〜15分間インキュ
ベートした。あるいは、EDTAナトリウムを含む採集管中
に血液試料を採集した。
からの全核酸の抽出 大腸菌（E.coli）の懸濁液を遠心により収集し、その
ペレットを、10mM EDTAと10％（w/v）ショ糖を含む50mM
Tris緩衝液（pH7.6）中に108〜1010細胞/mlに再懸濁し
た。次いでこの懸濁液を周囲温度で５〜15分間インキュ
ベートした。あるいは、EDTAナトリウムを含む採集管中
に血液試料を採集した。
生物学的試料（細菌懸濁液または血液試料）を同容量
の溶解緩衝液〔5M GuSCN,83mM Tris−HCl,pH7.6,17mM E
DTAおよび3.3％（w/v）サルコシル〕を使って溶解せし
めた。
の溶解緩衝液〔5M GuSCN,83mM Tris−HCl,pH7.6,17mM E
DTAおよび3.3％（w/v）サルコシル〕を使って溶解せし
めた。
溶解物（200μ）を2mlの超遠心管に移した。激しい
振盪の後、700μの抽出溶液〔99％純度のベンジルア
ルコール中1.1％（w/v）Bentone 〕を溶解物に添加し
た。この混合物に400μの緩衝液〔50mM Tris−HCl,pH
7.6,10mM EDTA,100mM NaCl,0.5％（w/v）SDS〕を添加し
た。生じた混合物を10秒間渦動攪拌し、時折混合しなが
ら65℃で10分間加熱し、次いで12,000×ｇで５分間遠心
した。上の水相を新しい2mlの超遠心管に移し、それに5
00μの抽出溶液（上記のベンジルアルコールとBenton
e ）を添加した。この混合物を10秒間渦動攪拌し、次
いで12,000×ｇで５分間遠心した。上の水相を再び新た
な2mlの超遠心管に移し、それに0.1容の3M酢酸ナトリウ
ムを加えた。同容量のイソプロパノールを添加し、溶液
を穏やかに混合して全核酸を沈澱させた。12,000×ｇで
10分間遠心した後、上清を捨て、ペレット化した核酸に
1mlの70％エタノールを添加した。穏やかな攪拌の後、
この調製物を12,000×ｇで５分間遠心した。上清を捨
て、ペレットを風乾し、次いで核酸ペレットをRNアーゼ
不含有の水または適当な緩衝液中に所望の濃度に再懸濁
した。
振盪の後、700μの抽出溶液〔99％純度のベンジルア
ルコール中1.1％（w/v）Bentone 〕を溶解物に添加し
た。この混合物に400μの緩衝液〔50mM Tris−HCl,pH
7.6,10mM EDTA,100mM NaCl,0.5％（w/v）SDS〕を添加し
た。生じた混合物を10秒間渦動攪拌し、時折混合しなが
ら65℃で10分間加熱し、次いで12,000×ｇで５分間遠心
した。上の水相を新しい2mlの超遠心管に移し、それに5
00μの抽出溶液（上記のベンジルアルコールとBenton
e ）を添加した。この混合物を10秒間渦動攪拌し、次
いで12,000×ｇで５分間遠心した。上の水相を再び新た
な2mlの超遠心管に移し、それに0.1容の3M酢酸ナトリウ
ムを加えた。同容量のイソプロパノールを添加し、溶液
を穏やかに混合して全核酸を沈澱させた。12,000×ｇで
10分間遠心した後、上清を捨て、ペレット化した核酸に
1mlの70％エタノールを添加した。穏やかな攪拌の後、
この調製物を12,000×ｇで５分間遠心した。上清を捨
て、ペレットを風乾し、次いで核酸ペレットをRNアーゼ
不含有の水または適当な緩衝液中に所望の濃度に再懸濁
した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シムラー，ビー．メリナ アメリカ合衆国，オレゴン 97229，ポ ートランド，ノース ウエスト カント リー ドライブ 17469 (72)発明者 メイヤー，リッチ ビー．，ジュニア アメリカ合衆国，ワシントン 98072, ウッディンビル，ノース イースト ワ ンハンドレットセブンティシックスス プレイス 15411 (72)発明者 バーミュレン，ニコラース マーティナ ス ヨハネス アメリカ合衆国，ワシントン 98072, ウッディンビル，ワンハンドレットナイ ンティシックスス アベニュ ノース イースト 19334 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ．66 （1957）ｐ．495−504 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ．64 （1956）ｐ．405−408 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 21/00 C07H 1/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (14)
- 【請求項１】核酸と他の生物学的化合物との混合物を含
有する試料から核酸を単離する方法であって、 該試料を、少なくとも１種の式Ｉの有機化合物を含有す
る抽出溶液と混合し； 水性相と非水性相を形成せしめ；そして 非水性相から水性相を分離することを含んで成り、 ここで、式Ｉは、式C6H5CH2OHまたは下式： 〔上式中、 R1は−CH2OHであり； R2は−H;−F;−Cl;−Br;−I;−OH;−Ｓ（CH2）rCH3（ｒ
は０〜３である）；−Ｏ（CH2）qCH3（ｑは０〜６であ
る）；−COOR6（R6は−（CH2）sCH3であり、ｓは０〜３
である）；−C6H5;−CH2C6H5;− OC6H5;−OCH2C6H5;−CH2OH;−CF3;および−（CH2）tCH3
（ｔは０〜６である）から成る群より選ばれた基であ
り； R3は−H;−F;−Cl;−Br;−I;−OH;−CH3;−（CH2）xCH3
（ｘは０〜３である）；および−Ｏ（CH2）vCH3（ｖは
０〜３である）から成る群より選ばれた基であり；そし
て R4は−H;−F;−Cl;−Br;−I;−（CH2）yCH3（ｙは０〜
３である）；および−Ｏ（CH2）wCH3（ｗは０〜３であ
る）から成る群より選ばれた基であり；そして更に、 R2,R3およびR4はR1に関して任意の位置に存在してよ
く、ただし、 R1が−CH2OHであり且つR2が−C6H5,−OCH2C6H5または−
CH2C6H5である時、R3は−CH3,−OH,−Cl,−Br,−F,−I,
−H,−OCH3または−OCH2CH3でなければならず且つR4は
−Ｈでなければならない〕 を有する化合物の群から選ばれることを特徴とする方
法。 - 【請求項２】前記抽出溶液が有機粘土を更に含んで成
る、請求項１の方法。 - 【請求項３】前記有機粘土が0.1％〜10％の濃度で存在
する、請求項２の方法。 - 【請求項４】前記試料が抽出前に溶解剤と混合される、
請求項１の方法。 - 【請求項５】前記溶解剤がカオトロピック剤である、請
求項４の方法。 - 【請求項６】前記溶解剤がGuHCl、GuSCN、尿素およびそ
れらの混合物から成る群より選ばれる、請求項４の方
法。 - 【請求項７】前記有機化合物またはその混合物が、0.7g
/ml以上の比重を有するものである、請求項１の方法。 - 【請求項８】アルコールを使って前記水性相から核酸が
沈澱される、請求項１の方法。 - 【請求項９】前記アルコールがエタノールまたはイソプ
ロパノールである、請求項８の方法。 - 【請求項１０】式Ｉの有機化合物が、ベンジルアルコー
ル、２−メチルベンジルアルコール、４−メトキシベン
ジルアルコール、３−エトキシベンジルアルコールおよ
び４−フェノキシベンジルアルコールから成る群より選
ばれる、請求項１の方法。 - 【請求項１１】前記試料を抽出溶液と混合する段階の
後、37〜65℃で１〜10分間加熱する段階を更に含んで成
る、請求項１の方法。 - 【請求項１２】遊離された核酸を単離するための抽出組
成物であって、式 C6H5CH2OHまたは下式： 〔上式中、 R1は−CH2OHであり； R2は−H;−F;−Cl;−Br;−I;−OH;−Ｓ（CH2）rCH3（ｒ
は０〜３である）；−Ｏ（CH2）qCH3（ｑは０〜６であ
る）；−COOR6（R6は−（CH2）sCH3であり、ｓは０〜３
である）；−C6H5;−CH2C6H5;−OC6H5;−OCH2C6H5;−CH
2OH;−CF3;および−（CH2）tCH3（ｔは０〜６である）
から成る群より選ばれた基であり； R3は−H;−F;−Cl;−Br;−I;−OH;−CH3;−（CH2）xCH3
（ｘは０〜３である）；および−Ｏ（CH2）vCH3（ｖは
０〜３である）から成る群より選ばれた基であり；そし
て R4は−H;−F;−Cl;−Br;−I;−（CH2）yCH3（ｙは０〜
３である）；および−Ｏ（CH2）wCH3（ｗは０〜３であ
る）から成る群より選ばれた基であり；そして更に、 R2,R3およびR4はR1に関して任意の位置に存在してよ
く、ただし、 R1が−CH2OHであり且つR2が−C6H5,−OCH2C6H5または−
CH2C6H5である時、R3は−CH3,−OH,−Cl,−Br,−F,−I,
−H,−OCH3または−OCH2CH3でなければならず且つR4は
−Ｈでなければならない〕 を有する化合物の群より選ばれた少なくとも１種の有機
化合物および有機粘土を含んで成る抽出組成物。 - 【請求項１３】前記有機粘土が0.1％〜10％の濃度で存
在する、請求項12の組成物。 - 【請求項１４】前記式Ｉの有機化合物が、ベンジルアル
コール、２−メチルベンジルアルコール、４−メトキシ
ベンジルアルコール、３−エトキシベンジルアルコール
および４−フェノキシベンジルアルコールから成る群よ
り選ばれる、請求項12の組成物。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55274590A | 1990-07-13 | 1990-07-13 | |
| US552,745 | 1990-07-13 | ||
| US649,389 | 1991-02-01 | ||
| US07/649,389 US5130423A (en) | 1990-07-13 | 1991-02-01 | Non-corrosive compositions and methods useful for the extraction of nucleic acids |
| PCT/US1991/004932 WO1992000983A1 (en) | 1990-07-13 | 1991-07-12 | Non-corrosive composition and methods useful for the extraction of nucleic acids |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05508658A JPH05508658A (ja) | 1993-12-02 |
| JP3102569B2 true JP3102569B2 (ja) | 2000-10-23 |
Family
ID=27070123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03513632A Expired - Lifetime JP3102569B2 (ja) | 1990-07-13 | 1991-07-12 | 核酸の抽出に有用な非腐食性組成物および方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0539515B1 (ja) |
| JP (1) | JP3102569B2 (ja) |
| AT (1) | ATE172466T1 (ja) |
| CA (1) | CA2087105C (ja) |
| DE (1) | DE69130394T2 (ja) |
| ES (1) | ES2125869T3 (ja) |
| WO (1) | WO1992000983A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101750179B1 (ko) * | 2015-12-03 | 2017-07-03 | 최영옥 | 케이크 장식용 꽃꽂이 틀 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5346994A (en) * | 1992-01-28 | 1994-09-13 | Piotr Chomczynski | Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins |
| ATE151816T1 (de) * | 1993-01-08 | 1997-05-15 | Hybridon Inc | Nachweis synthetischer oligonucleotide extrahiert aus körperflüssigkeiten oder geweben: |
| US5558992A (en) * | 1993-01-08 | 1996-09-24 | Hybridon, Inc. | Detection of synthetic oligonucleotides extracted from body fluids or tissues |
| WO1996000228A1 (en) * | 1994-06-23 | 1996-01-04 | Dade International Inc. | Method for the rapid isolation of nucleic acid |
| CA2153215A1 (en) * | 1994-07-06 | 1996-01-07 | Lu Wang | Treatment of paraffin embedded tissue for gene analysis |
| US5945515A (en) * | 1995-07-31 | 1999-08-31 | Chomczynski; Piotr | Product and process for isolating DNA, RNA and proteins |
| EP0792932B1 (en) * | 1995-08-21 | 2004-07-14 | Palma Bee'z Research Institute Co., Ltd. | Coprecipitant and method of extracting nucleic acids |
| EP0853680B1 (en) * | 1995-10-02 | 2004-03-31 | EMD Biosciences, Inc. | Method for precipitating nucleic acid with visible carrier |
| US6242188B1 (en) | 1999-07-30 | 2001-06-05 | Applied Gene Technologies, Inc. | Sample processing to release nucleic acids for direct detection |
| WO2002014548A1 (en) * | 2000-08-10 | 2002-02-21 | Applied Gene Technologies, Inc. | Compositions and methods for nucleic acids sample processing and amplification |
| DE10222133A1 (de) * | 2002-05-17 | 2003-12-04 | Gl Biotech Gmbh | Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion und Nukleinsäure-Reinigung |
| WO2003097831A1 (en) * | 2002-05-17 | 2003-11-27 | Gl Bio Tech Gmbh | Method for nucleic acid extraction and nucleic acid purification |
| EP1633869A1 (en) * | 2003-06-04 | 2006-03-15 | Qiagen AS | Method for sequentially isolating dna and rna from the same nucleic acid-containing sample |
| AU2005217124A1 (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-09 | Stichting Laboratorium Voor Infectieziekten | Method for detecting a microorganism in a fecal specimen |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57140711A (en) * | 1981-02-26 | 1982-08-31 | Teika Seiyaku Kk | Poultice for anti-inflammatory and analgesic use and its preparation |
-
1991
- 1991-07-12 JP JP03513632A patent/JP3102569B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-12 ES ES91914813T patent/ES2125869T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-12 EP EP91914813A patent/EP0539515B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-12 CA CA002087105A patent/CA2087105C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-12 WO PCT/US1991/004932 patent/WO1992000983A1/en active IP Right Grant
- 1991-07-12 AT AT91914813T patent/ATE172466T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-07-12 DE DE69130394T patent/DE69130394T2/de not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ．６４（１９５６）ｐ．４０５−４０８ |
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ．６６（１９５７）ｐ．４９５−５０４ |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101750179B1 (ko) * | 2015-12-03 | 2017-07-03 | 최영옥 | 케이크 장식용 꽃꽂이 틀 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0539515A1 (en) | 1993-05-05 |
| CA2087105A1 (en) | 1992-01-14 |
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| ES2125869T3 (es) | 1999-03-16 |
| EP0539515A4 (ja) | 1995-04-26 |
| WO1992000983A1 (en) | 1992-01-23 |
| DE69130394T2 (de) | 1999-04-08 |
| CA2087105C (en) | 2000-09-12 |
| JPH05508658A (ja) | 1993-12-02 |
| EP0539515B1 (en) | 1998-10-21 |
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