JP3491938B2 - Ｄｎａの回収方法 - Google Patents
Ｄｎａの回収方法Info
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- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、土壌より土壌微生物由
来のＤＮＡを回収する方法に関するものである。
来のＤＮＡを回収する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】土壌には非常に多種、多様な微生物が存
在し、しかも、そのほとんどのものが分離培養条件すら
知られていない。このような微生物の同定、ポピュレー
ションの把握は、多くの困難がともない、このことが微
生物生態学の研究を阻んでいる。これまでにも、微生物
の分離培養法に改良を加えることにより、微生物生態学
上の研究が行われてきているが、生態学的に重要な微生
物が数多く存在しているといわれる土壌中においては、
その土壌中の微生物でこれまでの方法で分離培養が可能
なものは、現状ではたかだか０．１％であるといわれて
いる。このような分離培養の困難な微生物の生態を把握
することは、基礎科学のみならず廃水処理、環境浄化な
どの応用技術分野においてもとりわけ重要な研究課題で
ある。
在し、しかも、そのほとんどのものが分離培養条件すら
知られていない。このような微生物の同定、ポピュレー
ションの把握は、多くの困難がともない、このことが微
生物生態学の研究を阻んでいる。これまでにも、微生物
の分離培養法に改良を加えることにより、微生物生態学
上の研究が行われてきているが、生態学的に重要な微生
物が数多く存在しているといわれる土壌中においては、
その土壌中の微生物でこれまでの方法で分離培養が可能
なものは、現状ではたかだか０．１％であるといわれて
いる。このような分離培養の困難な微生物の生態を把握
することは、基礎科学のみならず廃水処理、環境浄化な
どの応用技術分野においてもとりわけ重要な研究課題で
ある。
【０００３】近年、芳香族炭化水素、パラフィン、ナフ
テンなどの炭化水素、あるいはトリクロロエチレン、パ
ークロロエチレンなどの有機塩素系化合物などによる環
境汚染が問題となってきている。これらの深刻な環境汚
染の拡大を防止するとともに、すでに汚染されてしまっ
た環境を浄化し、もとの状態に戻していく技術の確立が
強く望まれている。この環境修復技術の例としては、曝
気処理、天日処理、真空釜、真空抽出などの物理化学的
手段が行われてはいるが、コスト、操作性、投下エネル
ギー量、処理範囲、難分解性物質の分解という根本的な
解決手段ではない、などの点を考慮すると微生物による
環境修復技術が強く望まれるものである。
テンなどの炭化水素、あるいはトリクロロエチレン、パ
ークロロエチレンなどの有機塩素系化合物などによる環
境汚染が問題となってきている。これらの深刻な環境汚
染の拡大を防止するとともに、すでに汚染されてしまっ
た環境を浄化し、もとの状態に戻していく技術の確立が
強く望まれている。この環境修復技術の例としては、曝
気処理、天日処理、真空釜、真空抽出などの物理化学的
手段が行われてはいるが、コスト、操作性、投下エネル
ギー量、処理範囲、難分解性物質の分解という根本的な
解決手段ではない、などの点を考慮すると微生物による
環境修復技術が強く望まれるものである。
【０００４】ここで、土壌汚染を引き起こしている難分
解性化合物、例えば芳香族炭化水素や有機塩素系化合物
を分解する微生物は数多く知られており、実際、これら
の微生物を汚染土壌に撒くことにより、土壌中の汚染物
質の分解が図られている。さらには、分解活性を向上さ
せたＤＮＡ組み換え微生物の野外放出も検討されてきて
いる。このように、微生物を利用した環境浄化事業、あ
るいは農業生産活動などの応用分野も考えられるが、こ
れを普及させ、社会的に有用な技術として定着していく
ためには、さまざまな有用微生物の開発とともに、それ
らの導入環境における増殖、生残性の把握がとりわけ重
要である。
解性化合物、例えば芳香族炭化水素や有機塩素系化合物
を分解する微生物は数多く知られており、実際、これら
の微生物を汚染土壌に撒くことにより、土壌中の汚染物
質の分解が図られている。さらには、分解活性を向上さ
せたＤＮＡ組み換え微生物の野外放出も検討されてきて
いる。このように、微生物を利用した環境浄化事業、あ
るいは農業生産活動などの応用分野も考えられるが、こ
れを普及させ、社会的に有用な技術として定着していく
ためには、さまざまな有用微生物の開発とともに、それ
らの導入環境における増殖、生残性の把握がとりわけ重
要である。
【０００５】さて、ＤＮＡ組み換え微生物の導入環境に
おける増殖、生残性の把握については、従来より抗生物
質耐性や色素産生性などのマーカー遺伝子を組み込み生
菌数を把握する手法が利用されてきた。しかし、マーカ
ー遺伝子の脱落、突然変異、あるいは生菌数測定の限
界、さらには、抗生物質耐性微生物の野外放出には疫学
上問題があること、などの欠点が指摘されている。ま
た、分離培養の困難な微生物の生態系の把握には、ほと
んど手段が講じられてきていなかったが、近年、分子生
物学の進展とともに、このようなＤＮＡ組み換え微生物
あるいは分離培養の困難な微生物の検出手段として係る
微生物のＤＮＡを検出する手法が用いられるようになっ
てきた。
おける増殖、生残性の把握については、従来より抗生物
質耐性や色素産生性などのマーカー遺伝子を組み込み生
菌数を把握する手法が利用されてきた。しかし、マーカ
ー遺伝子の脱落、突然変異、あるいは生菌数測定の限
界、さらには、抗生物質耐性微生物の野外放出には疫学
上問題があること、などの欠点が指摘されている。ま
た、分離培養の困難な微生物の生態系の把握には、ほと
んど手段が講じられてきていなかったが、近年、分子生
物学の進展とともに、このようなＤＮＡ組み換え微生物
あるいは分離培養の困難な微生物の検出手段として係る
微生物のＤＮＡを検出する手法が用いられるようになっ
てきた。
【０００６】さて、ＤＮＡを検出手段として利用してい
くためには、まず環境試料から目的微生物由来のＤＮＡ
を含む全ＤＮＡの回収を行う必要がある。土壌からの菌
体由来のＤＮＡの回収には、２種類の方法が知られてい
る。それは菌体回収法と直接溶菌法である。
くためには、まず環境試料から目的微生物由来のＤＮＡ
を含む全ＤＮＡの回収を行う必要がある。土壌からの菌
体由来のＤＮＡの回収には、２種類の方法が知られてい
る。それは菌体回収法と直接溶菌法である。
【０００７】菌体回収法では、土壌より細菌画分を分離
した後、集菌した菌体よりＤＮＡを回収するというもの
である。これに対して、直接溶菌法は、土壌中で直接、
菌体を溶菌した後、ＤＮＡを回収するという手法であ
る。
した後、集菌した菌体よりＤＮＡを回収するというもの
である。これに対して、直接溶菌法は、土壌中で直接、
菌体を溶菌した後、ＤＮＡを回収するという手法であ
る。
【０００８】
【発明が解決しようとしている課題】ここで、菌体回収
法では、土壌細菌の回収率が、４０％以上の土壌もあれ
ば１０％強の土壌もあるというように、土壌細菌の回収
率が土壌により大きくばらつく点が問題である。また、
回収されたＤＮＡ量については、１００ｇの土壌より最
高で１００μｇ、少ない場合では１〜２μｇと非常に収
量の少ない点が問題となっている。しかしながら、回収
されたＤＮＡの起源が明らかであり、純度の高いものが
得られるという利点がある。
法では、土壌細菌の回収率が、４０％以上の土壌もあれ
ば１０％強の土壌もあるというように、土壌細菌の回収
率が土壌により大きくばらつく点が問題である。また、
回収されたＤＮＡ量については、１００ｇの土壌より最
高で１００μｇ、少ない場合では１〜２μｇと非常に収
量の少ない点が問題となっている。しかしながら、回収
されたＤＮＡの起源が明らかであり、純度の高いものが
得られるという利点がある。
【０００９】これに対して、直接溶菌法ではＤＮＡ回収
量が１００ｇ土壌あたり１〜２ｍｇと、菌体抽出法に比
べ１０〜１００倍も高収量であるという、きわめて優れ
た特徴を持つが、この回収されてきたＤＮＡの起源に問
題がある、つまり、過去に死滅した細菌、糸状菌、原生
動物などのありとあらゆる微生物由来、あるいは植物由
来などのＤＮＡで、いまだ分解されていないものが回収
されてきたＤＮＡに混入してくる、という不都合な問題
がある。
量が１００ｇ土壌あたり１〜２ｍｇと、菌体抽出法に比
べ１０〜１００倍も高収量であるという、きわめて優れ
た特徴を持つが、この回収されてきたＤＮＡの起源に問
題がある、つまり、過去に死滅した細菌、糸状菌、原生
動物などのありとあらゆる微生物由来、あるいは植物由
来などのＤＮＡで、いまだ分解されていないものが回収
されてきたＤＮＡに混入してくる、という不都合な問題
がある。
【００１０】しかしながら、両手法に共通するさらに大
きな課題は、菌体由来のＤＮＡが回収途中で土壌粒子、
あるいは土壌有機物に吸着してしまうことであり、特に
土壌中の菌体の密度が低い場合、係る土壌からはＤＮＡ
がまったく回収できないということがある。
きな課題は、菌体由来のＤＮＡが回収途中で土壌粒子、
あるいは土壌有機物に吸着してしまうことであり、特に
土壌中の菌体の密度が低い場合、係る土壌からはＤＮＡ
がまったく回収できないということがある。
【００１１】一般に堆積物、腐葉土などの栄養物に富む
環境においては、そこに生息する菌数も非常に多く、両
手法ともに十分量のＤＮＡが回収可能であり、その後の
回収ＤＮＡの精製処理、精製ＤＮＡを用いた検出処理な
どを工夫することにより特定菌の検出が可能である。し
かしながら、その定量性については土壌粒子や有機物に
吸着してしまった分の見積もりはなされておらず、ある
程度のバイアスが存在すると考えられる。また検出限界
にも影響を与えると考えられる。さらに、１ｇ土壌あた
りたかだか１０6程度の菌数しか生息していないような
環境においては、もともと回収可能なＤＮＡ量が非常に
わずか（１０6菌体の染色体ＤＮＡ量は約５ｎｇ）であ
り、しかもこれらのＤＮＡは土壌粒子、あるいは土壌有
機物などに吸着されてしまい、土壌からＤＮＡをまった
く回収することができない、という大きな問題が生じ
る。
環境においては、そこに生息する菌数も非常に多く、両
手法ともに十分量のＤＮＡが回収可能であり、その後の
回収ＤＮＡの精製処理、精製ＤＮＡを用いた検出処理な
どを工夫することにより特定菌の検出が可能である。し
かしながら、その定量性については土壌粒子や有機物に
吸着してしまった分の見積もりはなされておらず、ある
程度のバイアスが存在すると考えられる。また検出限界
にも影響を与えると考えられる。さらに、１ｇ土壌あた
りたかだか１０6程度の菌数しか生息していないような
環境においては、もともと回収可能なＤＮＡ量が非常に
わずか（１０6菌体の染色体ＤＮＡ量は約５ｎｇ）であ
り、しかもこれらのＤＮＡは土壌粒子、あるいは土壌有
機物などに吸着されてしまい、土壌からＤＮＡをまった
く回収することができない、という大きな問題が生じ
る。
【００１２】このように、ＤＮＡを土壌微生物の検出方
法として利用していくためには、土壌から菌体由来のＤ
ＮＡを回収していく手法が不可欠であるが、従来用いら
れてきた手法には上述のような欠点があった。従って、
本発明の目的は、土壌粒子、土壌有機物などへ回収ＤＮ
Ａを吸着させず優れた回収率でＤＮＡを回収する方法を
提供することである。
法として利用していくためには、土壌から菌体由来のＤ
ＮＡを回収していく手法が不可欠であるが、従来用いら
れてきた手法には上述のような欠点があった。従って、
本発明の目的は、土壌粒子、土壌有機物などへ回収ＤＮ
Ａを吸着させず優れた回収率でＤＮＡを回収する方法を
提供することである。
【００１３】係る目的は以下の本発明によって達成され
る。即ち、本発明は、土壌中の微生物由来のＤＮＡを回
収する方法であって、土壌、及び該微生物を含む溶液に
アニオン性物質を加えることを特徴とするＤＮＡの回収
方法である。
る。即ち、本発明は、土壌中の微生物由来のＤＮＡを回
収する方法であって、土壌、及び該微生物を含む溶液に
アニオン性物質を加えることを特徴とするＤＮＡの回収
方法である。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記観点
より土壌中の微生物由来のＤＮＡを回収する方法を種々
探索した結果、土壌粒子及び微生物等を含むサンプル溶
液に核酸を加えると、サンプル中の微生物のＤＮＡが土
壌等へ吸着するのを防ぐことができることを見出し、本
発明を完成するに至った。
より土壌中の微生物由来のＤＮＡを回収する方法を種々
探索した結果、土壌粒子及び微生物等を含むサンプル溶
液に核酸を加えると、サンプル中の微生物のＤＮＡが土
壌等へ吸着するのを防ぐことができることを見出し、本
発明を完成するに至った。
【００１５】以下、本発明をより具体的に詳述する。
【００１６】 本発明の主な特徴は土壌や微生物等を含
む懸濁液（サンプル溶液）に、核酸を加えることであ
る。
む懸濁液（サンプル溶液）に、核酸を加えることであ
る。
【００１７】本発明に供することのできるアニオン性物
質は、塩酸、硫酸、リン酸、ヒ酸、硝酸、セレン酸など
の無機イオン、核酸などの有機イオンがあるが、物理
的、化学的性状が微生物由来ＤＮＡと同じである核酸を
用いることがより望ましい。即ち、核酸に代表される有
機イオンの土壌粒子、有機物への吸着は、有機イオンが
無機イオンよりも大きく、また構造が複雑であるため、
静電的な結合のほかに、水素結合、ファンデルワールス
結合、立体化学的性質などが関与する。そのため、微生
物由来のＤＮＡが土壌等へ吸着するのを効率よくブロッ
クするためには、ＤＮＡにより性状が近いＲＮＡあるい
はＤＮＡそのものなどの核酸を用いることが好ましい。
質は、塩酸、硫酸、リン酸、ヒ酸、硝酸、セレン酸など
の無機イオン、核酸などの有機イオンがあるが、物理
的、化学的性状が微生物由来ＤＮＡと同じである核酸を
用いることがより望ましい。即ち、核酸に代表される有
機イオンの土壌粒子、有機物への吸着は、有機イオンが
無機イオンよりも大きく、また構造が複雑であるため、
静電的な結合のほかに、水素結合、ファンデルワールス
結合、立体化学的性質などが関与する。そのため、微生
物由来のＤＮＡが土壌等へ吸着するのを効率よくブロッ
クするためには、ＤＮＡにより性状が近いＲＮＡあるい
はＤＮＡそのものなどの核酸を用いることが好ましい。
【００１８】アニオン性物質として用いるＤＮＡとして
はＣａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ、Ｓａｌｍｏｎ Ｔｅｓｔｅ
ｓ、Ｈｅｒｒｉｎｇ Ｓｐｅｒｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来な
ど、常用されているＤＮＡを用いれば良く、特にこれら
に限定されない。また、ＲＮＡとしては各種のリボソー
マルＲＮＡ、トランスファー等を用いることができる。
具体的にはＢａｋｅｒｓ Ｙｅａｓｔ、Ｃａｌｆ Ｌｉ
ｖｅｒ、ＴｏｒｕｌａＹｅａｓｔ、Ｆｅｔａｌ Ｃａｌ
ｆ Ｔｈｙｍｕｓ、Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ、Ｂｏｖｉｎ
ｅ Ｌｉｖｅｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｒａｂｂｉｔ Ｌｉｖ
ｅｒ、Ｂｒｅｗｅｒｓ Ｙｅａｓｔ由来などの汎用され
る各種ＲＮＡが利用でき、特にこれらに限定されない。
はＣａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ、Ｓａｌｍｏｎ Ｔｅｓｔｅ
ｓ、Ｈｅｒｒｉｎｇ Ｓｐｅｒｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ由来な
ど、常用されているＤＮＡを用いれば良く、特にこれら
に限定されない。また、ＲＮＡとしては各種のリボソー
マルＲＮＡ、トランスファー等を用いることができる。
具体的にはＢａｋｅｒｓ Ｙｅａｓｔ、Ｃａｌｆ Ｌｉ
ｖｅｒ、ＴｏｒｕｌａＹｅａｓｔ、Ｆｅｔａｌ Ｃａｌ
ｆ Ｔｈｙｍｕｓ、Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ、Ｂｏｖｉｎ
ｅ Ｌｉｖｅｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｒａｂｂｉｔ Ｌｉｖ
ｅｒ、Ｂｒｅｗｅｒｓ Ｙｅａｓｔ由来などの汎用され
る各種ＲＮＡが利用でき、特にこれらに限定されない。
【００１９】また、その後の検出手段に、一般的なＤＮ
Ａ検出方法を用いる場合には、アニオン性物質としてＲ
ＮＡを用いることがより好ましい。
Ａ検出方法を用いる場合には、アニオン性物質としてＲ
ＮＡを用いることがより好ましい。
【００２０】上記アニオン性物質の添加量は、サンプル
土壌の（ＤＮＡ等の）アニオン性物質吸着能を予め調べ
ておき、その吸着能に見合った量を加えることが望まし
い。この量は、用いるサンプル土壌の土質、及び用いる
アニオン性物質等により異なるので、それぞれの最適値
を予め調べておくことが好ましい。
土壌の（ＤＮＡ等の）アニオン性物質吸着能を予め調べ
ておき、その吸着能に見合った量を加えることが望まし
い。この量は、用いるサンプル土壌の土質、及び用いる
アニオン性物質等により異なるので、それぞれの最適値
を予め調べておくことが好ましい。
【００２１】また、用いるアニオン性物質が、回収した
ＤＮＡの検出に影響を与えないものであれば、予め吸着
能を調べておかず、アニオン性物質を過剰量加えても特
に問題はない。
ＤＮＡの検出に影響を与えないものであれば、予め吸着
能を調べておかず、アニオン性物質を過剰量加えても特
に問題はない。
【００２２】本発明のアニオン性物質は、微生物を破砕
処理する前に、係る微生物及び、土壌を含む懸濁液に加
えることがより好ましく、顕著な効果が得られる。
処理する前に、係る微生物及び、土壌を含む懸濁液に加
えることがより好ましく、顕著な効果が得られる。
【００２３】これは、微生物を破砕処理する前に、アニ
オン性物質をサンプル溶液中に加えて、予め土壌粒子等
にアニオン性物質を吸着させてしまうことにより、その
後の破砕処理により微生物からでてくるＤＮＡの土壌等
への吸着を防止することができるからと思われる。
オン性物質をサンプル溶液中に加えて、予め土壌粒子等
にアニオン性物質を吸着させてしまうことにより、その
後の破砕処理により微生物からでてくるＤＮＡの土壌等
への吸着を防止することができるからと思われる。
【００２４】係る微生物の破砕処理方法は、物理的方法
（フレンチプレス、超音波、ボルテックス等々）、界面
活性剤を加える等の化学的方法、及び酵素反応を用いる
方法等公知の方法であれば何れの方法でも用いることが
でき、直接溶菌法、菌体回収法等の公知の回収法と併用
することにより、ＤＮＡを回収することができる。直接
溶菌法、及び菌体回収法に関してはＳｔｅｆｆａｎらの
報告に詳しい（Ｓｔｅｆｆａｎ．Ｒ．Ｊ．，Ｊ．Ｇｏｋ
ｓｏｙｒ、Ａ．Ｋ．Ｂｅｊ，ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ａｔｌａ
ｓ．Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｓｏ
ｉｌｓ ａｎｄＳｅｄｉｍｅｎｔｓ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ
ｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：２９０８−２９
１５（１９８８））。
（フレンチプレス、超音波、ボルテックス等々）、界面
活性剤を加える等の化学的方法、及び酵素反応を用いる
方法等公知の方法であれば何れの方法でも用いることが
でき、直接溶菌法、菌体回収法等の公知の回収法と併用
することにより、ＤＮＡを回収することができる。直接
溶菌法、及び菌体回収法に関してはＳｔｅｆｆａｎらの
報告に詳しい（Ｓｔｅｆｆａｎ．Ｒ．Ｊ．，Ｊ．Ｇｏｋ
ｓｏｙｒ、Ａ．Ｋ．Ｂｅｊ，ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ａｔｌａ
ｓ．Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｓｏ
ｉｌｓ ａｎｄＳｅｄｉｍｅｎｔｓ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ
ｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：２９０８−２９
１５（１９８８））。
【００２５】以下、実施例をもって本発明を詳細に説明
するが、これらは本発明の範囲をなんら限定するもので
はない。
するが、これらは本発明の範囲をなんら限定するもので
はない。
【００２６】
実施例１
（１）サンプル土壌のアニオン性物質吸着能の測定
オートクレープした減菌ローム土を、０．５ｇずつ２ｍ
ｌ容のエッペンドルフチューブに分取した。これに１ｍ
ｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解したＤＮＡ（ｆｒ
ｏｍ Ｓａｌｍｏｎ Ｔｅｓｔｅｓ：シグマ社製）を所
定量（表１）加えた。ボルテックスにより混合の後、１
０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を０．１ｍｌ加
え、ボルテックスにより混合し、７０℃で１時間保温し
た。微量遠心機で１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間
遠心し、上清を分取した。これに０．２５ｍ１の７．５
Ｍ酢酸アンモニウムを加え、５分間室温放置の後、上記
条件で遠心を行った。上清を分取し０．８ｍｌのイソプ
ロパノールを加え、良く混合し１０分間室温放置した。
これを微量遠心機で１５，０００ｒｐｍ、１５℃、１０
分間遠心し、ペレットを回収し、風乾した。これに５０
μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、ＤＮＡを溶解
した。
ｌ容のエッペンドルフチューブに分取した。これに１ｍ
ｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解したＤＮＡ（ｆｒ
ｏｍ Ｓａｌｍｏｎ Ｔｅｓｔｅｓ：シグマ社製）を所
定量（表１）加えた。ボルテックスにより混合の後、１
０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を０．１ｍｌ加
え、ボルテックスにより混合し、７０℃で１時間保温し
た。微量遠心機で１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間
遠心し、上清を分取した。これに０．２５ｍ１の７．５
Ｍ酢酸アンモニウムを加え、５分間室温放置の後、上記
条件で遠心を行った。上清を分取し０．８ｍｌのイソプ
ロパノールを加え、良く混合し１０分間室温放置した。
これを微量遠心機で１５，０００ｒｐｍ、１５℃、１０
分間遠心し、ペレットを回収し、風乾した。これに５０
μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、ＤＮＡを溶解
した。
【００２７】上記のようにして調製したＤＮＡ溶液の１
０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、λ−ＤＮＡ／
ＨｉｎｄＩＩＩ消化物のアガロースゲル電気泳動展開パ
ターンを標準として比較し、回収量を求めた。結果を表
１に示す。
０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、λ−ＤＮＡ／
ＨｉｎｄＩＩＩ消化物のアガロースゲル電気泳動展開パ
ターンを標準として比較し、回収量を求めた。結果を表
１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】係る結果より、該サンプル土壌には、アニ
オン性物質としてＤＮＡなら少なくとも１５μｇ程度加
えれば十分その吸着箇所がブロックされることがわかっ
た。
オン性物質としてＤＮＡなら少なくとも１５μｇ程度加
えれば十分その吸着箇所がブロックされることがわかっ
た。
【００３０】 上記のようにして調整したＤＮＡ溶液の
１０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、（１）同様
に回収量を測定した。結果を表２に示す。
１０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、（１）同様
に回収量を測定した。結果を表２に示す。
【００３１】 係る結果から各Ｅ．ｃｏｌｉの菌数中に
含まれているＤＮＡ量がわかる。
含まれているＤＮＡ量がわかる。
【００３２】 （２）サンプル土壌中に加えたＥ．ｃｏ
ｌｉ由来ＤＮＡの回収及び検出１オートクレープした滅
菌ローム土を、０．５ｇずつ２ｍｌ容のエッペンドルフ
チューブに分取した。これに１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０
１株（宝酒造）を所定量（表２）加えた。さらに本発明
のアニオン性物質として５００ｍｇ／ｍｌのＲＮＡ溶液
（ｆｒｏｍ Ｂａｋｅｒｓ Ｙｅａｓｔ：シグマ社製）
を５０μｌ（ＲＮＡ２５ｍｇ）加え、ボルテックスによ
り混合した。これに、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナト
リウム）を０．１ｍｌ加え、ボルテックスにより混合
し、７０℃で１時間保温した。微量遠心機で１５，００
０ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心し、上清を分取した。こ
れに０．２５ｍｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、
５分間室温放置の後、上記条件で遠心を行った。上清を
分取し０．８ｍｌのイソプロパノールを加え、良く混合
し１０分間室温放置した。これを微量遠心機で１５，０
００ｒｐｍ、１５℃、１０分間遠心し、ペレットを回収
し、風乾した。これに５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．
０）を加え、ＤＮＡを溶解した。
ｌｉ由来ＤＮＡの回収及び検出１オートクレープした滅
菌ローム土を、０．５ｇずつ２ｍｌ容のエッペンドルフ
チューブに分取した。これに１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０
１株（宝酒造）を所定量（表２）加えた。さらに本発明
のアニオン性物質として５００ｍｇ／ｍｌのＲＮＡ溶液
（ｆｒｏｍ Ｂａｋｅｒｓ Ｙｅａｓｔ：シグマ社製）
を５０μｌ（ＲＮＡ２５ｍｇ）加え、ボルテックスによ
り混合した。これに、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナト
リウム）を０．１ｍｌ加え、ボルテックスにより混合
し、７０℃で１時間保温した。微量遠心機で１５，００
０ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心し、上清を分取した。こ
れに０．２５ｍｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、
５分間室温放置の後、上記条件で遠心を行った。上清を
分取し０．８ｍｌのイソプロパノールを加え、良く混合
し１０分間室温放置した。これを微量遠心機で１５，０
００ｒｐｍ、１５℃、１０分間遠心し、ペレットを回収
し、風乾した。これに５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．
０）を加え、ＤＮＡを溶解した。
【００３３】 上記のようにして調製したＤＮＡ溶液の
１０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、（１）同様
に回収量を測定した。結果を表２に示す。
１０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、（１）同様
に回収量を測定した。結果を表２に示す。
【００３４】 得られた結果は下記参考例で得られた結
果とほぼ同じであり、少ない菌数のＥ．ｃｏｌｉからも
本方法によればほぼＤＮＡが回収できることがわかっ
た。
果とほぼ同じであり、少ない菌数のＥ．ｃｏｌｉからも
本方法によればほぼＤＮＡが回収できることがわかっ
た。
【００３５】 参考例１
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株由来ＤＮＡ量の測定
２ｍｌ容のエッペンドルフチューブに、１ｍｌの０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したＥ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１株（宝酒造）を所定量（表２）加えた。ボ
ルテックスにより混合の後、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫
酸ナトリウム）を０．１ｍｌ加え、ボルテックスにより
混合し、７０℃で１時間保温した。微量遠心機で１５，
０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心し、上清を分取し
た。これに０．２５ｍｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムを
加え、５分間室温放置の後、上記条件で遠心を行った。
上清を分取し０．８ｍｌのイソプロパノールを加え、良
く混合し１０分間室温放置した。これを微量遠心機で１
５，０００ｒｐｍ、１５℃、１０分間遠心し、ペレット
を回収し、風乾した。これに５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）を加え、ＤＮＡを溶解した。
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したＥ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１株（宝酒造）を所定量（表２）加えた。ボ
ルテックスにより混合の後、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫
酸ナトリウム）を０．１ｍｌ加え、ボルテックスにより
混合し、７０℃で１時間保温した。微量遠心機で１５，
０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心し、上清を分取し
た。これに０．２５ｍｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムを
加え、５分間室温放置の後、上記条件で遠心を行った。
上清を分取し０．８ｍｌのイソプロパノールを加え、良
く混合し１０分間室温放置した。これを微量遠心機で１
５，０００ｒｐｍ、１５℃、１０分間遠心し、ペレット
を回収し、風乾した。これに５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）を加え、ＤＮＡを溶解した。
【００３６】比較例１
サンプル土壌中に加えたＥ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡの回収
及び検出 オートクレープした滅菌ローム土を、０．５ｇずつ２ｍ
ｌ容のエッペンドルフチューブに分取した。これに１ｍ
ｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株（宝酒造）を所定量（表
２）加えた。ボルテックスにより混合の後、１０％ＳＤ
Ｓ（ドデシル硫酸ナトリウム）を０．１ｍｌ加え、ボル
テックスにより混合し、７０℃で１時間保温した。微量
遠心機で１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心し、
上清を分取した。これに０．２５ｍｌの７．５Ｍ酢酸ア
ンモニウムを加え、５分間室温放置の後、上記条件で遠
心を行った。上清を分取し０．８ｍｌのイソプロパノー
ルを加え、良く混合し１０分間室温放置した。これを微
量遠心機で１５，０００ｒｐｍ、１５℃、１０分間遠心
し、ペレットを回収し、風乾した。これに５０μｌのＴ
Ｅ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、ＤＮＡを溶解した。
及び検出 オートクレープした滅菌ローム土を、０．５ｇずつ２ｍ
ｌ容のエッペンドルフチューブに分取した。これに１ｍ
ｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株（宝酒造）を所定量（表
２）加えた。ボルテックスにより混合の後、１０％ＳＤ
Ｓ（ドデシル硫酸ナトリウム）を０．１ｍｌ加え、ボル
テックスにより混合し、７０℃で１時間保温した。微量
遠心機で１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心し、
上清を分取した。これに０．２５ｍｌの７．５Ｍ酢酸ア
ンモニウムを加え、５分間室温放置の後、上記条件で遠
心を行った。上清を分取し０．８ｍｌのイソプロパノー
ルを加え、良く混合し１０分間室温放置した。これを微
量遠心機で１５，０００ｒｐｍ、１５℃、１０分間遠心
し、ペレットを回収し、風乾した。これに５０μｌのＴ
Ｅ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、ＤＮＡを溶解した。
【００３７】上記のようにして調製したＤＮＡ溶液の１
０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、実施例１の
（１）同様に回収量を測定した。結果を表２に示す。
０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、実施例１の
（１）同様に回収量を測定した。結果を表２に示す。
【００３８】サンプル土壌中に多量のＥ．ｃｏｌｉ（菌
数１０9ｃｅｌｌ／ｍｌ）が存在しないとＥ．ｃｏｌｉ
由来ＤＮＡは回収できなかった。
数１０9ｃｅｌｌ／ｍｌ）が存在しないとＥ．ｃｏｌｉ
由来ＤＮＡは回収できなかった。
【００３９】 実施例２及び比較例２
サンプル土壌中に加えたＥ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡのＰＣ
Ｒによる検出参考例１、及び実施例１の（２） 、ならびに比較例１で
調製したＤＮＡ溶液、及び、加える菌数を１０３、１０
４、及び１０５（ｃｅｌｌ／ｍｌ）とした他は参考例
１、実施例１の（２）、ならびに比較例１で調製したも
のと同様に調製したＤＮＡ溶液、各々に、Ｅ．ｃｏｌｉ
由来のＤＮＡが含まれているかを、Ｅ．ｃｏｌｉの１６
Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡをコードする遺伝子を
利用してＰＣＲ法を用い検出した。設定したプライマー
は、以下の２つである。
Ｒによる検出参考例１、及び実施例１の（２） 、ならびに比較例１で
調製したＤＮＡ溶液、及び、加える菌数を１０３、１０
４、及び１０５（ｃｅｌｌ／ｍｌ）とした他は参考例
１、実施例１の（２）、ならびに比較例１で調製したも
のと同様に調製したＤＮＡ溶液、各々に、Ｅ．ｃｏｌｉ
由来のＤＮＡが含まれているかを、Ｅ．ｃｏｌｉの１６
Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡをコードする遺伝子を
利用してＰＣＲ法を用い検出した。設定したプライマー
は、以下の２つである。
【００４０】プライマー♯１
５′−ＡＡＧＧＧＡＧＴＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＣＣＴＴ
ＴＧ−３′ プライマー♯２ ５′−ＧＧＣＡＣＡＴＴＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡ−
３′ これら２つのプライマーにより、約０．６Ｋｂの増幅産
物が得られる。
ＴＧ−３′ プライマー♯２ ５′−ＧＧＣＡＣＡＴＴＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡ−
３′ これら２つのプライマーにより、約０．６Ｋｂの増幅産
物が得られる。
【００４１】 ＰＣＲは０．５ｍｌのエッペンドルフチ
ューブを用い、反応液の全量は５０μｌとした。この反
応液の上層にはミネラルオイルを加えてある。サーマル
サイクラーはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社
のＭｏｄｅｌ ＰＪ−１０００を用い、Ｔａｑ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは宝酒造のＡｍｐｌｉＴａｑＤ
ＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた。反応緩衝液は酵
素に添付のものを説明書記載の濃度で用いた。ｄＮＴＰ
は、それぞれ２００μＭの濃度で使用し、上記２プライ
マーはそれぞれ０．１μＭ濃度とした。これに、上記の
ように調製したＤＮＡ溶液をそれぞれ１μｌずつ反応液
に加え、さらに、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅを１．０ｕｎｉｔ加えた後、９０℃を１分間、５５℃
を１分間、７２℃を１分間のサイクルを３０サイクル行
った。ＰＣＲ後のサンプルをアガロースゲル電気泳動に
かけ、ＰＣＲ増幅産物の有無を確認した。結果を表２に
示す（参考例１で調製したＤＮＡ溶液を用いた結果を参
考例２とする）。
ューブを用い、反応液の全量は５０μｌとした。この反
応液の上層にはミネラルオイルを加えてある。サーマル
サイクラーはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社
のＭｏｄｅｌ ＰＪ−１０００を用い、Ｔａｑ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは宝酒造のＡｍｐｌｉＴａｑＤ
ＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた。反応緩衝液は酵
素に添付のものを説明書記載の濃度で用いた。ｄＮＴＰ
は、それぞれ２００μＭの濃度で使用し、上記２プライ
マーはそれぞれ０．１μＭ濃度とした。これに、上記の
ように調製したＤＮＡ溶液をそれぞれ１μｌずつ反応液
に加え、さらに、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅを１．０ｕｎｉｔ加えた後、９０℃を１分間、５５℃
を１分間、７２℃を１分間のサイクルを３０サイクル行
った。ＰＣＲ後のサンプルをアガロースゲル電気泳動に
かけ、ＰＣＲ増幅産物の有無を確認した。結果を表２に
示す（参考例１で調製したＤＮＡ溶液を用いた結果を参
考例２とする）。
【００４２】 （３）も参考例１と同様に１０３（ｃｅ
ｌｌ／ｍｌ）レベルの菌数のＤＮＡが検出できた。一
方、比較例のサンプルは１０７（ｃｅｌｌ／ｍｌ）レベ
ルまでいかないと検出できなかった。
ｌｌ／ｍｌ）レベルの菌数のＤＮＡが検出できた。一
方、比較例のサンプルは１０７（ｃｅｌｌ／ｍｌ）レベ
ルまでいかないと検出できなかった。
【００４３】係る結果より、ＰＣＲ増幅法と組み合わせ
れば、１０3（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）レベルという少ない
菌数でも十分に確認できることがわかった。
れば、１０3（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）レベルという少ない
菌数でも十分に確認できることがわかった。
【００４４】
【表２】
【００４５】実施例３
サンプル土壌中に加えたＥ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡの回収
及び検出 オートクレープした滅菌ローム土を、０．５ｇずつ２ｍ
ｌ容のエッペンドルフチューブに分取した。これに１ｍ
ｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株（宝酒造）を所定量（表
３）加えた（比較のため加えないものも用意した）。さ
らに３００μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液（ｆｒｏｍ Ｓａｌ
ｍｏｎ Ｔｅｓｔｅｓ：シグマ社製）を５０μｌ（ＤＮ
Ａ１５μｇ）加え、ボルテックスにより混合した。これ
に、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を０．１
ｍｌ加え、ボルテックスにより混合し、７０℃で１時間
保温した。微量遠心機で１５，０００ｒｐｍ、４℃、１
０分間遠心し、上清を分取した。これに０．２５ｍｌの
７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、５分間室温放置の
後、上記条件で遠心を行った。上清を分取し０．８ｍｌ
のイソプロパノールを加え、良く混合し１０分間室温放
置した。これを微量遠心機で１５，０００ｒｐｍ、１５
℃、１０分間遠心し、ペレットを回収し、風乾した。こ
れに５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、ＤＮ
Ａを溶解した。
及び検出 オートクレープした滅菌ローム土を、０．５ｇずつ２ｍ
ｌ容のエッペンドルフチューブに分取した。これに１ｍ
ｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株（宝酒造）を所定量（表
３）加えた（比較のため加えないものも用意した）。さ
らに３００μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液（ｆｒｏｍ Ｓａｌ
ｍｏｎ Ｔｅｓｔｅｓ：シグマ社製）を５０μｌ（ＤＮ
Ａ１５μｇ）加え、ボルテックスにより混合した。これ
に、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を０．１
ｍｌ加え、ボルテックスにより混合し、７０℃で１時間
保温した。微量遠心機で１５，０００ｒｐｍ、４℃、１
０分間遠心し、上清を分取した。これに０．２５ｍｌの
７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、５分間室温放置の
後、上記条件で遠心を行った。上清を分取し０．８ｍｌ
のイソプロパノールを加え、良く混合し１０分間室温放
置した。これを微量遠心機で１５，０００ｒｐｍ、１５
℃、１０分間遠心し、ペレットを回収し、風乾した。こ
れに５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、ＤＮ
Ａを溶解した。
【００４６】（１）上記のようにして調製したＤＮＡ溶
液の１０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、実施例
１の（１）同様に回収量を測定した。結果を表３に示
す。
液の１０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、実施例
１の（１）同様に回収量を測定した。結果を表３に示
す。
【００４７】ここではアニオン性物質としてＤＮＡを用
いたので、過剰量に加えたＤＮＡもあわせて回収され回
収量が多くなってしまった。
いたので、過剰量に加えたＤＮＡもあわせて回収され回
収量が多くなってしまった。
【００４８】（２）上記のようにして回収、調製したＤ
ＮＡ溶液に、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡが含まれている
かを、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｒ
ＮＡをコードする遺伝子を利用してＰＣＲ法を用い検出
した。設定したプライマーは、以下の２つである。
ＮＡ溶液に、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡが含まれている
かを、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｒ
ＮＡをコードする遺伝子を利用してＰＣＲ法を用い検出
した。設定したプライマーは、以下の２つである。
【００４９】プライマー♯１
５′−ＡＡＧＧＧＡＧＴＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＣＣＴＴ
ＴＧ−３′ プライマー♯２ ５′−ＧＧＣＡＣＡＴＴＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡ−
３′ これら２つのプライマーにより、約０．６Ｋｂの増幅産
物が得られる。
ＴＧ−３′ プライマー♯２ ５′−ＧＧＣＡＣＡＴＴＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡ−
３′ これら２つのプライマーにより、約０．６Ｋｂの増幅産
物が得られる。
【００５０】ＰＣＲは０．５ｍｌのエッペンドルフチュ
ーブを用い、反応液の全量は５０μｌとした。この反応
液の上層にはミネラルオイルを加えてある。サーマルサ
イクラーはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社の
Ｍｏｄｅｌ ＰＪ−１０００を用い、Ｔａｑ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは宝酒造のＡｍｐｌｉＴａｑＤＮ
Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた。反応緩衝液は酵素
に添付のものを説明書記載の濃度で用いた。ｄＮＴＰ
は、それぞれ２００μＭの濃度で使用し、上記２プライ
マーはそれぞれ０．１μＭ濃度とした。これに、調製し
たＤＮＡ溶液をそれぞれ１μｌずつ反応液に加え、さら
に、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．０ｕ
ｎｉｔ加えた後、９０℃を１分間、５５℃を１分間、７
２℃を１分間のサイクルを３０サイクル行った。ＰＣＲ
後のサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけ、ＰＣＲ
増幅産物の有無を確認した。結果を表３に示す。
ーブを用い、反応液の全量は５０μｌとした。この反応
液の上層にはミネラルオイルを加えてある。サーマルサ
イクラーはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社の
Ｍｏｄｅｌ ＰＪ−１０００を用い、Ｔａｑ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは宝酒造のＡｍｐｌｉＴａｑＤＮ
Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた。反応緩衝液は酵素
に添付のものを説明書記載の濃度で用いた。ｄＮＴＰ
は、それぞれ２００μＭの濃度で使用し、上記２プライ
マーはそれぞれ０．１μＭ濃度とした。これに、調製し
たＤＮＡ溶液をそれぞれ１μｌずつ反応液に加え、さら
に、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．０ｕ
ｎｉｔ加えた後、９０℃を１分間、５５℃を１分間、７
２℃を１分間のサイクルを３０サイクル行った。ＰＣＲ
後のサンプルをアガロースゲル電気泳動にかけ、ＰＣＲ
増幅産物の有無を確認した。結果を表３に示す。
【００５１】得られた結果より、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮ
Ａだけを特異的に検出する方法を用いれば、アニオン性
物質としてＤＮＡを用いてもＥ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡ
の存在を少ない菌数からでも確認できることがわかっ
た。
Ａだけを特異的に検出する方法を用いれば、アニオン性
物質としてＤＮＡを用いてもＥ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡ
の存在を少ない菌数からでも確認できることがわかっ
た。
【００５２】
【表３】
【００５３】実施例４
実土壌サンプルからのＤＮＡの回収
各種の実土壌サンプルを、０．５ｇずつ２ｍｌ容のエッ
ペンドルフチューブに分取した。これに１ｍｌの０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、さらに５００ｍ
ｇ／ｍｌのＲＮＡ溶液（ｆｒｏｍ Ｂａｋｅｒｓ Ｙｅ
ａｓｔ：シグマ社製）を５０μｌ加え、ボルテックスに
より混合した。これに、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナ
トリウム）を０．１ｍｌ加え、ボルテックスにより混合
し、７０℃で１時間保温した。微量遠心機で１５，００
０ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心し、上清を分取した。こ
れに０．２５ｍｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、
５分間室温放置の後、上記条件で遠心を行った。上清を
分取し０．８ｍｌのイソプロパノールを加え、良く混合
し１０分間室温放置した。これを微量遠心機で１５，０
００ｒｐｍ、１５℃、１０分間遠心し、ペレットを回収
し、風乾した。これに５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．
０）を加え、ＤＮＡを溶解した。
ペンドルフチューブに分取した。これに１ｍｌの０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、さらに５００ｍ
ｇ／ｍｌのＲＮＡ溶液（ｆｒｏｍ Ｂａｋｅｒｓ Ｙｅ
ａｓｔ：シグマ社製）を５０μｌ加え、ボルテックスに
より混合した。これに、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナ
トリウム）を０．１ｍｌ加え、ボルテックスにより混合
し、７０℃で１時間保温した。微量遠心機で１５，００
０ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心し、上清を分取した。こ
れに０．２５ｍｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、
５分間室温放置の後、上記条件で遠心を行った。上清を
分取し０．８ｍｌのイソプロパノールを加え、良く混合
し１０分間室温放置した。これを微量遠心機で１５，０
００ｒｐｍ、１５℃、１０分間遠心し、ペレットを回収
し、風乾した。これに５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．
０）を加え、ＤＮＡを溶解した。
【００５４】上記のようにして調整したＤＮＡ溶液の１
０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、実施例１の
（１）同様に回収量を測定した。表４に示したように各
サンプルからＤＮＡが回収された。
０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、実施例１の
（１）同様に回収量を測定した。表４に示したように各
サンプルからＤＮＡが回収された。
【００５５】比較例３
実土壌サンプルからのＤＮＡの回収
各種の実土壌サンプルを、０．５ｇずつ２ｍｌ容のエッ
ペンドルフチューブに分取した。これに１ｍｌの０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、ボルテックスに
より混合した。これに、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナ
トリウム）を０．１ｍｌ加え、ボルテックスにより混合
し、７０℃で１時間保温した。微量遠心機で１５，００
０ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心し、上清を分取した。こ
れに０．２５ｍｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、
５分間室温放置の後、上記条件で遠心を行った。上清を
分取し、０．８ｍｌのイソプロパノールを加え、良く混
合し１０分間室温放置した。これを微量遠心機で１５，
０００ｒｐｍ、１５℃、１０分間遠心し、ペレットを回
収し、風乾した。これに５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ
８．０）を加え、ＤＮＡを溶解した。
ペンドルフチューブに分取した。これに１ｍｌの０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、ボルテックスに
より混合した。これに、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナ
トリウム）を０．１ｍｌ加え、ボルテックスにより混合
し、７０℃で１時間保温した。微量遠心機で１５，００
０ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心し、上清を分取した。こ
れに０．２５ｍｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、
５分間室温放置の後、上記条件で遠心を行った。上清を
分取し、０．８ｍｌのイソプロパノールを加え、良く混
合し１０分間室温放置した。これを微量遠心機で１５，
０００ｒｐｍ、１５℃、１０分間遠心し、ペレットを回
収し、風乾した。これに５０μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ
８．０）を加え、ＤＮＡを溶解した。
【００５６】上記のようにして調製したＤＮＡ溶液の１
０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、実施例１の
（１）同様に回収量を測定した。表３に示したように何
れのサンプルからもＤＮＡは回収できなかった。
０μｌを、アガロースゲル電気泳動させ、実施例１の
（１）同様に回収量を測定した。表３に示したように何
れのサンプルからもＤＮＡは回収できなかった。
【００５７】
【表４】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｎａｎｎｉｐｉｅｒｉ Ｐ． ｅｔ
ａｌ．， Ｓｏｉｌ．Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ．18（３）， ｐ
ｐ．275−281 （1986)
Ａｒｌｅｎｅ Ｌ． ｅｔ ａｌ．,
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ， ｖｏｌ．22， ｐｐ．345−
348 （1991)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09
ＪＳＴＰｌｕｓファイル（ＪＯＩＳ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ
Ｓ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】 土壌中の微生物由来のＤＮＡを回収する
方法であって、 土壌、及び前記微生物を含む溶液に核酸を加える工程
と、 前記微生物を破砕する工程とを有する ことを特徴とする
ＤＮＡの回収方法。 - 【請求項２】 前記核酸がＲＮＡである請求項１記載の
ＤＮＡの回収方法。 - 【請求項３】 前記微生物が細菌である請求項１記載の
ＤＮＡの回収方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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