JP2018508239A - 核酸の単離 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)(i)少なくとも1Mの濃度(はるかに高い濃度(最大10M)が好ましい)のリチウム塩、例えば塩化リチウム、(ii)0.05%〜0.2%の濃度のSDSであり得る表面活性剤、好ましくははるかに高い濃度(例えば少なくとも5%)で存在する非イオン表面活性剤、及び(iii)任意のキレート剤を含有する緩衝化溶解組成物を用いて生体物質を溶解させる工程と、
(b)(a)の組成物を、(i)純(neat)アルコール(例えばメタノール、エタノール、又は最も好ましくはイソプロパノール)、又は(ii)10M〜15Mの濃度のリチウム塩の溶液のいずれかであり得る「DNAスパイク溶液(DNA Spiking Solution)」と混合する工程と、
(c)得られた混合物を固体支持体と接触させ、溶解物質からDNAを固定化する工程と、
(d)アルコールを含有する洗浄液で支持体を洗浄する工程と、
(e)DNAを溶出させる工程と、
を含む。
(i)0.05M〜1.0Mの濃度のリチウム、キレート剤及び界面活性剤を含む水溶液による前記生体物質の溶解を行い、水性溶解組成物を生成する工程と、
(ii)前記溶解組成物を、0.05M〜2Mの濃度の溶解カオトロピック剤及び液体中25容量%〜60容量%の溶解C1〜3アルカノールの存在下で固体支持体を用いて処理する工程であって、該固体支持体がDNAを固定化することが可能なものである工程と、
(iii)前記固体支持体を液体から分離する工程と、
(iv)前記固体支持体を、0.05M〜1Mの濃度のリチウム塩を含有する第1の洗浄液で処理する工程であって、該第1の洗浄液が20容量%〜90容量%の溶解C1〜3アルカノールを含有する工程と、
(v)前記固体支持体を前記第1の洗浄液から分離する工程と、
(vi)前記固体支持体を、少なくとも80容量%のC1〜3アルカノールを含み、その残りがある場合は水である第2の洗浄液で処理する工程と、
(vii)前記固体支持体を前記第2の洗浄液から分離する工程と、
(viii)DNAを含む核酸を前記固体支持体から溶出させる工程と、
を含む、方法が提供される。
(i)水、0.7モル毎リットル〜0.9モル毎リットルの濃度の塩化リチウム、5mM〜15mMの濃度のEDTA又はそのナトリウム塩、及び0.9重量%〜1.1重量%のSDSを含む、それらから本質的になる又はそれらからなる水溶液と、
(ii)グアニジニウム塩の水溶液(好ましくは約2Mのストック濃度;そのうち350μlを最終容量1050μlで使用することができる)と、
(iii)任意であるが、好ましくはエタノール又は他のC1〜3アルカノール(例えばイソプロパノール)と、
(iv)任意であるが、好ましくは0.3M〜0.6Mの濃度の塩化リチウムを含有する第1の洗浄液であって、エタノール又は他のC1〜3アルカノール(例えばイソプロパノール)を45容量%〜55容量%の量で含有する、第1の洗浄液と、
(v)任意であるが、好ましくは少なくとも80重量%のエタノール又は他のC1〜3アルカノール(例えばイソプロパノール)を含み、その残りがある場合は水である第2の洗浄液と、
(vi)任意であるが、好ましくは溶出バッファーと、
(vii)DNAを含む核酸を固定化するフィルターを有するスピンカラムと、
を組合せで含む、キットが提供される。
(i)0.2モル毎リットル〜0.3モル毎リットルの濃度の塩化リチウム、1ミリモル毎リットル〜5ミリモル毎リットルの濃度のEDTA又はそのナトリウム塩、0.2重量%〜0.4重量%の量のSDS、0.6M〜0.7Mの濃度を有するグアニジニウム塩、及び35容量%〜45容量%の量のエタノール又は他のC1〜3アルカノール(例えばイソプロパノール)を含む、それらから本質的になる又はそれらからなる水溶液と、
(ii)任意であるが、好ましくは0.3M〜0.6Mの濃度の塩化リチウムを含有する第1の洗浄液であって、エタノールを45容量%〜55容量%の量で含有する、第1の洗浄液と、
(iii)任意であるが、好ましくは少なくとも80重量%のエタノール又は他のC1〜3アルカノール(例えばイソプロパノール)を含み、その残りがある場合は水である第2の洗浄液と、
(iv)任意であるが、好ましくは溶出バッファーと、
(v)DNAを含む核酸を固定化するフィルターを有するスピンカラムと、
を組合せで含む、キットが提供される。
(a)細胞を遠心分離によりペレット化し、上清を捨てる
(b)300μlの溶解溶液(800mM LiCl、10mM EDTA二ナトリウム塩二水和物、1%SDS)を添加し、ピペッティングにより十分に混ぜる
(c)室温で20分間インキュベートする
(d)350μlの2M塩酸グアニジンを添加し、チューブの反転又はピペッティングにより混ぜる
(e)400μlのEtOHを添加し、チューブの反転又はピペッティングにより混ぜる
(f)600μlをスピンカラム(4つのPOREX Fフィルターを有する)に入れ、8000rpmで1分間回転させる
(g)残留溶解物をスピンカラムに入れ、8000rpmで1分間回転させる
(h)500μlの第1の洗浄液(400mM LiCl、50%EtOH)を添加し、8000rpmで1分間回転させる
(i)500μlの第2の洗浄液(400mM LiCl、90%EtOH)を添加し、14000rpmで3分間回転させる
(j)14000rpmで1分間回転させる
(k)200μlの溶出バッファー(10mM Tris−HCl、0.5mM EDTA二ナトリウム塩二水和物、pH9.0)を添加し、8000rpmで1分間溶出させる
IVD用途
方法Aは、ナイセリア・ゴノレー(Neisseria gonorrhoeae)(NG)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)(CT)等のSTIを主に標的とするが、STI又はNG及びCTのみに限定されない体外診断(IVD)用途のために開発した。
抽出DNAの回収率
およそ108個のナイセリア・ゴノレー(NG)研究室培養細胞を方法Aに従って処理し、DNAを含む核酸を2回の独立実験において三連で抽出した。各反復試験の濃度及び純度をNanodrop定量化によって評価した。次いで、各実験の平均濃度及びA260/A280比の値を用いて、両方の実験の平均及びStDevを算出した。方法AのDNA回収能の評価においてインプットとして使用されるDNAの純度は、十分に許容標準内であることが見出された(第2表)。
DNeasyに対する抽出DNAの表現型、収率及び純度の比較
およそ0.5×108個のNG研究室培養細胞を方法Aに従って処理して、DNAを含む核酸を四連で抽出し、プロトコルのグラム陰性抽出部を用いて方法A(20分間の溶解)とDNeasy(1時間の溶解)とを比較した。市販される最良収率のDNA抽出キットの1つとみなされることから、DNeasyを比較標準として選んだ。両方の方法を用いて抽出されたDNAは、アガロースゲル電気泳動によって判断されるように非常によく似た表現型をもたらす(図2)。加えて、方法Aにより、より低分子量のDNA種がDNeasyよりも高収率で得られる。純度(A260/A280)及び収率をNanodrop定量化によって評価した(第4表)。方法Aのより大きな読取り値は、主としてより低分子量のバンドの量の違いによって説明され得る。ゲルの下2つのバンドは、株の供給業者:NCTC(Public Health England)によると、NGの潜在プラスミド及びその超らせん誘導体である。したがって、方法Aのシステムは細菌プラスミドの単離に特に有効である。細菌プラスミドは非常に重要な診断標的、すなわちNG抗生物質耐性であり、クラミジア・トラコマチス(CT)潜在プラスミドは血清型において保存されている。加えて、プラスミドにコードされる抗菌耐性は多くの細菌種に広範に見られる現象である。例えば、P.M. Bennettが著した「抗生物質耐性をコードするプラスミド及び細菌における抗生物質耐性遺伝子の導入(Plasmid Encoding Antibiotic Resistance: and Transfer of Antibiotic Resistance Genes in Bacteria)」という表題の論文(British Journal of Pharmacology (2008) 153, S347-S357)を参照されたい。
感度
方法Aの感度を試験するために、NG研究室培養細胞を、実際の尿サンプル(1mlの尿当たり約7000個のヒト有核細胞が予想される)に対して非常に多くの有核細胞である300000個のHeLa上皮細胞のバックグラウンドで滴定した。NG細胞をチョコレート寒天プレート(一晩NG培養物)からこすり取り、細菌を1×PBSに懸濁することによって滴定を行った。細菌ストックの100倍、1000倍、10000倍、100000倍及び1000000倍の滴定物を四連で調製し、HeLa細胞とともに遠沈し、したがって300000個のHeLa細胞を異なる数のNG細胞でスパイクした。2つの反復試験物はDNAの抽出に用い、別の2つは総生菌数(TVC)のためにチョコレート寒天プレート上で一晩成長させた。5μlの各抽出物(200μlの溶出液の全抽出物)をPCR反応における鋳型として使用した(NG特異的プライマー)。3μlのアンプリコンを2%アガロースゲル上で泳動した(図3)。アガロースゲル電気泳動は信頼性の高いPCR増幅アウトプットの定量化に用いることができず、したがってTVC値とλ−エキソヌクレアーゼアッセイとの組合せ(PCT特許出願PCT/GB2015/052561号に開示される)を用いて、各希釈倍数で溶解した生存NG細胞の数を算出し、定量可能なアッセイアウトプットと関連付けた。チョコレート寒天プレートは殆どの希釈倍数でNG細胞のローン(lawn)により覆われているため、1000000倍プレート及び100000倍希釈プレートのみを計数し、残りの希釈倍数についての細胞数はこれらの数に基づいて外挿した。1000000倍及び100000倍の希釈はそれぞれ平均約30個及び300個のNG細胞をもたらし、したがって、これらの値を用いて残りの希釈倍数について細胞数を外挿した。
本実施例は、DNAを含む核酸をペレット化細胞から抽出するために以下の手順(「方法B」)を用いる。
1. 300μLの溶解溶液(0.8M LiCl、10mM EDTA、1%SDS)をペレットに添加し、十分にピペッティングする。
2. 20μLのプロテイナーゼK(20mg/mLストック溶液)を添加し、5秒間ボルテックスする。
3. 56℃で20分間インキュベートする。
4. 350μLの2M塩酸グアニジンを添加し、5秒間ボルテックスする。
5. 400μLのエタノールを添加し、5秒間ボルテックスする。
6. 得られる600μLの溶液をスピンカラムに添加する。
7. 8000rpm〜11000rpmで1分間遠心分離する。
8. フロースルー(flow-through)を捨てる。
9. 残りのサンプルをスピンカラムに添加する。
10. 8000rpm〜11000rpmで1分間遠心分離する。
11. フロースルーを捨てる。
12. 500μLの第1の洗浄液(50%エタノール中0.8M LiCl)をスピンカラムに添加する。
13. 8000rpmで1分間遠心分離する。
14. フロースルーを捨てる。
15. 500μLの第2の洗浄液(90%エタノール)をスピンカラムに添加する。
16. 14000rpmで3分間遠心分離する。
17. フロースルーを捨てる。
18. スピンカラムを14000rpmで1分間遠心分離する。
19. フロースルーを捨てる。
20. 100μL〜200μLの溶出バッファー(10mM Tris−HCl、0.5mM EDTA、pH9.0)をスピンカラムに添加する。
21. 室温で1分間インキュベートする。
22. 8000rpmで1分間、1.5mL容エッペンチューブへと溶出させる。
本発明の実施形態を以下の段落に規定する。
1. DNAを含む核酸を生体物質から単離する方法であって、
(i)0.05M〜1.0Mの濃度のリチウム、キレート剤及び界面活性剤を含む水溶液による生体物質の溶解を行い、水性溶解組成物を生成する工程と、
(ii)溶解組成物を、0.05M〜2Mの濃度の溶解カオトロピック剤及び液体中25容量%〜60容量%の溶解C1〜3アルカノールの存在下で固体支持体を用いて処理する工程であって、該固体支持体がDNAを固定化することが可能なものである工程と、
(iii)固体支持体を液体から分離する工程と、
(iv)固体支持体を0.05M〜1Mの濃度のリチウムを含有する第1の洗浄液で処理する工程であって、該第1の洗浄液が20容量%〜90容量%の溶解C1〜3アルカノールを含有する工程と、
(v)固体支持体を第1の洗浄液から分離する工程と、
(vi)固体支持体を、少なくとも80容量%のC1〜3アルカノールを含み、その残りがある場合は水である第2の洗浄液で処理する工程と、
(vii)固体支持体を第2の洗浄液から分離する工程と、
(viii)DNAを含む核酸を固体支持体から溶出させる工程と、
を含む、方法。
2. 溶解溶液が0.1M〜0.9Mの濃度のリチウムを含む、実施形態1に規定の方法。
3. 溶解溶液が0.2M〜0.9Mの濃度のリチウムを含む、実施形態2に規定の方法。
4. 溶解溶液が1mM〜20mMの濃度のキレート剤を含む、実施形態1〜3のいずれか1つに規定の方法。
5. 界面活性剤が陰イオン界面活性剤である、実施形態1〜4のいずれか1つに規定の方法。
6. 陰イオン界面活性剤が0.05重量%〜2.5重量%の量で溶解溶液中に存在する、実施形態5に規定の方法。
7. 陰イオン界面活性剤が0.1重量%〜1.5重量%の量で溶解溶液中に存在する、実施形態6に規定の方法。
8. 溶解溶液が水、リチウム塩、上記カオトロピック剤及び上記キレート剤から本質的になる、実施形態1〜7のいずれか1つに規定の方法。
9. 溶解溶液が水、リチウム塩、上記カオトロピック剤及び上記キレート剤からなる、実施形態1〜8のいずれか1つに規定の方法。
10. 溶解溶液が0.7M〜0.9Mの濃度のリチウムを含有する、実施形態8又は9に規定の方法。
11. 溶解溶液が1mM〜20mMの濃度のキレート剤を含有する、実施形態8〜10のいずれか1つに規定の方法。
12. 溶解溶液が0.8重量%〜1.2重量%、好ましくは約0.9重量%〜1.1重量%、最も好ましくは約1重量%の量の界面活性剤を含有する、実施形態8〜11のいずれか1つに規定の方法。
13. カオトロピック剤が0.1M〜1M、好ましくは0.5M〜0.9M、より好ましくは0.6M〜0.7Mの濃度で存在する、実施形態1〜12のいずれか1つに規定の方法。
14. アルカノールが、(ii)において30容量%〜50容量%、好ましくは35容量%〜45容量%、より好ましくは35容量%〜40容量%の量で存在する、実施形態1〜13のいずれか1つに規定の方法。
15. 溶解溶液が水、リチウム塩、上記キレート剤、上記界面活性剤、上記カオトロピック剤及び上記アルカノールから本質的になる、実施形態1〜7のいずれか1つに規定の方法。
16. 溶解溶液が水、リチウム塩、上記キレート剤、上記界面活性剤、上記カオトロピック剤及び上記アルカノールからなる、実施形態1〜7のいずれか1つに規定の方法。
17. リチウムが0.1M〜0.4M、好ましくは0.2M〜0.3Mの濃度で溶解溶液中に存在する、実施形態15又は16に規定の方法。
18. 界面活性剤が陰イオン界面活性剤であり、0.1重量%〜0.5重量%、好ましくは0.2重量%〜0.4重量%の量で溶解溶液中に存在する、実施形態15〜17のいずれか1つに規定の方法。
19. キレート剤が1mM〜5mMの濃度で溶解溶液中に存在する、実施形態15〜18のいずれか1つに規定の方法。
20. カオトロピック剤が0.1M〜1M、好ましくは0.5M〜0.9M、より好ましくは0.6M〜0.7Mの濃度で存在する、実施形態15〜19のいずれか1つに規定の方法。
21. アルカノールが、(ii)において30容量%〜50容量%、好ましくは35容量%〜45容量%、より好ましくは35容量%〜40容量%の量で存在する、実施形態15〜20のいずれか1つに規定の方法。
22. 溶解溶液中のリチウムがハロゲン化リチウムによって供給される、実施形態1〜21のいずれか1つに規定の方法。
23. 溶解溶液中のハロゲン化リチウムが塩化リチウムである、実施形態22に規定の方法。
24. カオトロピック剤がグアニジニウム塩によって供給される、実施形態1〜23のいずれか1つに規定の方法。
25. グアニジニウム塩が塩化グアニジニウムである、実施形態24に規定の方法。
26. 溶解溶液中のキレート剤がEDTA又はそのアルカリ金属塩である、実施形態1〜25のいずれか1つに規定の方法。
27. (ii)のアルカノールがエタノールである、実施形態1〜26のいずれか1つに規定の方法。
28. 界面活性剤がSDSである、実施形態1〜28のいずれか1つに規定の方法。
29. 第1の洗浄液が水、並びに第1の洗浄液のリチウム及びアルカノールから本質的になる、実施形態1〜28のいずれか1つに規定の方法。
30. 第1の洗浄液が水、並びに第1の洗浄液のリチウム及びアルカノールからなる、実施形態29に規定の方法。
31. リチウムが第1の洗浄液中に0.1M〜0.8Mの濃度で存在する、実施形態29又は30に規定の方法。
32. リチウムが第1の洗浄液中に0.3M〜0.6M、好ましくは約0.4M、又は0.6M〜1M、好ましくは約0.4M〜0.8Mの濃度で存在する、実施形態31に規定の方法。
33. アルカノールが第1の洗浄液中に40容量%〜60容量%、好ましくは45容量%〜55容量%、より好ましくは約50容量%の量で存在する、実施形態29〜32のいずれか1つに規定の方法。
34. 第1の洗浄液中のリチウムがハロゲン化リチウムによって供給される、実施形態29〜33のいずれか1つに規定の方法。
35. 第1の洗浄液中のハロゲン化リチウムが塩化リチウムである、実施形態34に規定の方法。
36. 第1の洗浄液中のアルカノールがエタノールである、実施形態29〜35のいずれか1つに規定の方法。
37. 第2の洗浄液が水及び第2の洗浄液の上記アルカノールから本質的になる、実施形態1〜36のいずれか1つに規定の方法。
38. 第2の洗浄液が水及び第2の洗浄液の上記アルカノールからなる、実施形態1〜36のいずれか1つに規定の方法。
39. 第2の洗浄液が80容量%〜95容量%の第2の洗浄液のアルカノールを含有する、実施形態37又は38に規定の方法。
40. 第2の洗浄液中のアルカノールがエタノールである、実施形態1〜39のいずれか1つに規定の方法。
41. 溶解溶液が水、0.7M〜0.9Mの濃度の塩化リチウム、5mM〜15mMの濃度のEDTA又はそのナトリウム塩、及び0.9重量%〜1.1重量%のSDSから本質的になる、実施形態1に規定の方法。
42. 工程(ii)において、カオトロピック剤が0.6M〜0.7Mの濃度の塩化グアニジニウムであり、アルカノールが液体の35容量%〜40容量%の量で存在するエタノールである、実施形態41に規定の方法。
43. 溶解溶液が水、0.2M〜0.3Mの濃度の塩化リチウム、1mM〜5mMの濃度のEDTA又はそのナトリウム塩、0.6M〜0.7Mの濃度の塩化グアニジニウム、0.2重量%〜0.4重量%の量のSDS及び35容量%〜40容量%のエタノールから本質的になる、実施形態1に規定の方法。
44. 第1の洗浄液が水、0.3M〜0.6Mの濃度の塩化リチウム及び45容量%〜55容量%のエタノールから本質的になる、実施形態41〜43のいずれか1つに規定の方法。
45. 第2の洗浄液が80容量%〜95容量%のエタノール及び水から本質的になる、実施形態41〜44のいずれか1つに規定の方法。
46. 固体支持体がシリカを含む、実施形態1〜45のいずれか1つに規定の方法。
47. 上記固体支持体がフィルターであるスピンチューブ内で工程(iii)が行われ、工程(iii)、(v)、(vii)及び(viii)が遠心分離により行われる、実施形態1〜46のいずれか1つに規定の方法。
48. フィルターがホウケイ酸ガラス繊維を含む、実施形態47に規定の方法。
49. 複数の上記フィルターをスピンチューブ内に設ける、実施形態48に規定の方法。
50. 4つのフィルターを設ける、実施形態49に規定の方法。
51. 全体を通して周囲温度で行われる、実施形態1〜50のいずれか1つに規定の方法。
52. ボルテックスせずに行われる、実施形態1〜51のいずれか1つに規定の方法。
53. DNAを含む核酸が単離される生体物質が細胞を含む、実施形態1〜52のいずれか1つに規定の方法。
54. 細胞がペレットの形態である、実施形態53に規定の方法。
55. DNAを含む核酸を細胞から抽出するキットであって、
(i)水、0.05M〜1.0Mの濃度のリチウム、キレート剤及び界面活性剤を含む、それらから本質的になる又はそれらからなる水溶液と、
(ii)カオトロピック剤(好ましくはグアニジニウム塩)の溶液と、
(iii)任意であるが、好ましくはC1〜3アルカノール、例えばエタノールと、
(iv)任意であるが、好ましくは0.05M〜1Mの濃度のリチウム及び20容量%〜90容量%の溶解C1〜3アルカノールを含有する第1の洗浄液と、
(v)任意であるが、好ましくは少なくとも80容量%のC1〜3アルカノール、好ましくはエタノールを含み、その残りがある場合は水である第2の洗浄液と、
(vi)任意であるが、好ましくは溶出バッファーと、
(vii)DNAを固定化するフィルターを有するスピンカラムと、
を組合せで含む、キット。
56. DNAを含む核酸を細胞から抽出するキットであって、
(i)0.05M〜1.0Mの濃度のリチウム、キレート剤、界面活性剤、カオトロピック剤(例えばグアニジニウム塩)及び溶解C1〜3アルカノール(好ましくはエタノール)を含む、それらから本質的になる又はそれらからなる水溶液と、
(ii)任意であるが、好ましくは0.05M〜1Mの濃度のリチウム及び20容量%〜90容量%の溶解C1〜3アルカノールを含有する第1の洗浄液と、
(iii)任意であるが、好ましくは少なくとも80容量%のC1〜3アルカノール、好ましくはエタノールを含み、その残りがある場合は水である第2の洗浄液と、
(iv)任意であるが、好ましくは溶出バッファーと、
(v)DNAを固定化するフィルターを有するスピンカラムと、
を組合せで含む、キット。
57. フィルターが少なくとも1つのホウケイ酸塩繊維のシートを備える、実施形態55又は56に規定に記載のキット。
58. フィルターが4つのホウケイ酸塩繊維のシートを備える、実施形態57に規定のキット。
59. 0.5M〜1.0Mの濃度のリチウム塩、キレート剤及び界面活性剤を含有する水溶液を含む、それからなる又はそれから本質的になる水性溶解組成物。
60. 実施形態2〜28のいずれか1つにおいて規定される、実施形態59に規定の溶解。
Claims (24)
- DNAを含む核酸を生体物質から単離する方法であって、
(i)0.05M〜1.0Mの濃度のリチウム、キレート剤及び界面活性剤を含む水溶液による前記生体物質の溶解を行い、水性溶解組成物を生成する工程と、
(ii)前記溶解組成物を、0.05M〜2Mの濃度の溶解カオトロピック剤及び液体中25容量%〜60容量%の溶解C1〜3アルカノールの存在下で固体支持体を用いて処理する工程であって、該固体支持体がDNAを固定化することが可能なものである工程と、
(iii)前記固体支持体を液体から分離する工程と、
(iv)前記固体支持体を、0.05M〜1Mの濃度のリチウムを含有する第1の洗浄液で処理する工程であって、該第1の洗浄液が20容量%〜90容量%の溶解C1〜3アルカノールを含有する工程と、
(v)前記固体支持体を前記第1の洗浄液から分離する工程と、
(vi)前記固体支持体を、少なくとも80容量%のC1〜3アルカノールを含み、その残りがある場合は水である第2の洗浄液で処理する工程と、
(vii)前記固体支持体を前記第2の洗浄液から分離する工程と、
(viii)DNAを前記固体支持体から溶出させる工程と、
を含む、方法。 - 溶解溶液が水、0.7M〜0.9Mの濃度の塩化リチウム、5mM〜15mMの濃度のEDTA又はそのナトリウム塩、及び0.9重量%〜1.1重量%のSDSから本質的になる、請求項1に記載の方法。
- 工程(ii)において、前記カオトロピック剤が0.6M〜0.7Mの濃度の塩化グアニジニウムであり、前記アルカノールが前記液体の35容量%〜40容量%の量で存在するエタノールである、請求項2に記載の方法。
- 溶解溶液が水、0.2M〜0.3Mの濃度の塩化リチウム、1mM〜5mMの濃度のEDTA又はそのナトリウム塩、0.6M〜0.7Mの濃度の塩化グアニジニウム、0.2重量%〜0.4重量%の量のSDS及び35容量%〜40容量%のエタノールから本質的になる、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の洗浄液が水、0.3M〜0.6Mの濃度の塩化リチウム及び45容量%〜55容量%のエタノールから本質的になる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の洗浄液が水、0.6M〜1Mの濃度の塩化リチウム及び45容量%〜55容量%のエタノールから本質的になる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の洗浄液が80容量%〜95容量%のエタノール及び水から本質的になる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体がシリカを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体がフィルターであるスピンチューブ内で工程(iii)が行われ、工程(iii)、(v)、(vii)及び(viii)が遠心分離により行われる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィルターがホウケイ酸ガラス繊維を含む、請求項9に記載の方法。
- 複数の前記フィルターを前記スピンチューブ内に設ける、請求項10に記載の方法。
- 4つのフィルターを設ける、請求項11に記載の方法。
- 全体を通して周囲温度で行われる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- ボルテックスせずに行われる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- DNAを含む核酸が単離される前記生体物質が細胞を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞がペレットの形態である、請求項15に記載の方法。
- DNAを含む核酸を細胞から抽出するキットであって、
(i)水、0.7モル毎リットル〜0.9モル毎リットルの濃度の塩化リチウム、5mM〜15mMの濃度のEDTA又はそのナトリウム塩、及び0.9重量%〜1.1重量%のSDSを含む、それらから本質的になる又はそれらからなる水溶液と、
(ii)グアニジニウム塩の水溶液(好ましくは約2M)と、
(iii)エタノールと、
(iv)0.3M〜0.6Mの濃度の塩化リチウムを含有する第1の洗浄液であって、45容量%〜55容量%の量のエタノールを含有する、第1の洗浄液と、
(v)少なくとも80容量%のエタノールを含み、その残りがある場合は水である第2の洗浄液と、
(vi)溶出バッファーと、
(vii)DNAを固定化するフィルターを有するスピンカラムと、
を組合せで含む、キット。 - DNAを含む核酸を細胞から抽出するキットであって、
(i)0.2モル毎リットル〜0.3モル毎リットルの濃度の塩化リチウム、1ミリモル毎リットル〜5ミリモル毎リットルの濃度のEDTA又はそのナトリウム塩、0.2重量%〜0.4重量%の量のSDS、0.6M〜0.7Mの濃度を有するグアニジニウム塩、及び35容量%〜45容量%の量のエタノールを含む、それらから本質的になる又はそれらからなる水溶液と、
(ii)0.3M〜0.6Mの濃度の塩化リチウムを含有する第1の洗浄液であって、45容量%〜55容量%の量のエタノールを含有する、第1の洗浄液と、
(iii)少なくとも80容量%のエタノールを含み、その残りがある場合は水である第2の洗浄液と、
(iv)溶出バッファーと、
(v)DNAを固定化するフィルターを有するスピンカラムと、
を組合せで含む、キット。 - 前記フィルターが少なくとも1つのホウケイ酸塩繊維のシートを備える、請求項17又は18に記載のキット。
- 前記フィルターが4つのホウケイ酸塩繊維のシートを備える、請求項19に記載のキット。
- 0.5M〜1.0Mの濃度のリチウム塩、キレート剤及び界面活性剤を含有する水溶液を含む、それからなる又はそれから本質的になる水性溶解組成物。
- 請求項2〜4のいずれか一項において規定される、請求項21に記載の溶解組成物。
- 生体物質を溶解させる方法であって、該生体物質を請求項21又は22に記載の水性溶解組成物で処理することを含む、方法。
- 前記生体物質が細胞を含む、請求項23に記載の方法。
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11501504A (ja) * | 1994-12-12 | 1999-02-09 | ダイナル エイ/エス | 核酸の単離方法 |
JP2002187897A (ja) * | 1994-02-11 | 2002-07-05 | Diagen Gmbh | 二本鎖/単鎖核酸構造物の分離方法 |
JP2007509620A (ja) * | 2003-11-04 | 2007-04-19 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 迅速かつ低コストな核酸の単離方法 |
JP2008507994A (ja) * | 2004-08-02 | 2008-03-21 | キアゲン ノース アメリカン ホールディングス, インコーポレイテッド | Dnaを精製するための固相担体を使用するための組成物および方法 |
JP2012080853A (ja) * | 2010-10-15 | 2012-04-26 | National Agriculture & Food Research Organization | 抗酸菌dnaの抽出精製法 |
JP2013520187A (ja) * | 2010-02-26 | 2013-06-06 | キアゲン ゲーエムベーハー | Rnaおよびdnaの並行単離および/または並行精製のためのプロセス |
Family Cites Families (8)
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JPH11501504A (ja) * | 1994-12-12 | 1999-02-09 | ダイナル エイ/エス | 核酸の単離方法 |
JP2007509620A (ja) * | 2003-11-04 | 2007-04-19 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 迅速かつ低コストな核酸の単離方法 |
JP2008507994A (ja) * | 2004-08-02 | 2008-03-21 | キアゲン ノース アメリカン ホールディングス, インコーポレイテッド | Dnaを精製するための固相担体を使用するための組成物および方法 |
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