JP3100974B2 - 体外循環全血液からｌｄｌおよび内毒素のような生物巨大分子を除去するための吸着剤 - Google Patents

体外循環全血液からｌｄｌおよび内毒素のような生物巨大分子を除去するための吸着剤

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は全血液から毒素を除去するための吸着剤に関
する。
（従来の技術） 体外循環において血漿ではなく全血液を浄化すること
が好ましいことは広く知られている。その理由は、その
ような操作が実質的により少ない装置を必要とし、さら
に、常時全病院に存在するとは限らない特別に訓練を受
けた専門家による監視の必要性を低減させるからであ
る。全血液の浄化においては、常時監視を要する。例え
ばフィルターを用いた、細胞（即ち白血球、赤血球およ
び血小板）の初期除去にまで実質的な作業が及ぶ必然性
はない。
従来、ex vivoの全血液浄化には、活性炭または特定
のコーティングを担持した活性炭の吸着剤、例えばポリ
アクリル酸またはポリアクリル酸ポリエチレンイミンの
溶液を用いたもの等が利用されていた（USSR SU 732.20
7号参照）。
しかしながら、このような活性炭吸着剤は、基材が活
性炭であることから、特に高圧における機械的安定性が
低く、除去するべき生物巨大分子に対する選択性が低い
という難点を有していた。
上記した事実の結果として、チャコールを基材とする
吸着剤（並びに、別の理由から他の無機物質を基材とす
るもの）を、例えば、より高い機械的安定性、および、
血液、血漿または血清のような体液中に発生する特定の
物体、とりわけ病原性生物巨大分子の除去のためのより
高い選択性を有するような、変性された天然または合成
の重合体で代替するために多くの研究がなされてきた。
懸濁重合法を用いることにより、ビニル含有モノマ
ー、例えばアクリル酸の、特定の多孔性ホモポリマー並
びにコポリマーまたはターポリマーが担体物質として特
に注目されている。
このようなアクリル酸重合体は、現在市販されてお
り、例えば“TSK−Gel ToyopearlR（Toyo soda Kogyou
Co.,Ltd.日本およびToso Haas,Philadelpha.PA,米国）
および、FractogelR（Merck GmbH,Darmstadt,***）な
どから市販されている。このような物質はハードゲルと
呼ばれており、化学的意味において、実質的に同一であ
り、OH基の存在からやはり親水性である。
これらの物質はその本来の形態においてのみならず、
特に、先ずオキシラン含有化合物、例えばエピクロロヒ
ドリンと反応させ、次にアンモニア、アミノ基またはカ
ルボキシル基含有化合物、または塩化シアヌールと反応
させることにより変性（活性化）させた後にも担体物質
として使用される（例えばJ.Chromalogr,238、747−754
（1982）および）Toyo Soda Kenkyuhokoku,25（２）、8
1−88（1981）参照）。吸着剤または吸着剤用の担体物
質として使用できるこのような変性された製品の別の例
として、グルタルアルデヒドで活性化され、次に例え
ば、ナトリウムボロハイドライドで還元された物質も挙
げられる（Shin−Jikkenkagaku−Koza,ed.S.Ishii,Maru
zen,Tokyo,141（1978）参照）。
このような活性化物体は特異的作用様式を有する可能
性がある。種々の化学構造および長さを有する有機架橋
材（一般的にはスペーサーとして知られる）を使用する
ことにより、特異的共有結合有機リガンドを導入するこ
とができる。即ち、系より除去することが望まれる生物
巨大分子に対して高い選択性を有するいわゆる特異的吸
着剤を製造することができる。
即ち、欧州特許出願83 112 042号では、VLDL（超低密
度リポ蛋白）および／またはLDL（低密度リポ蛋白）を
体外循環の血液または血漿のような体液から選択的に除
去するのに特に適するものとして特定の吸着剤が提案さ
れている。このような物質は担体物質としてToyopearlR
TSKのHW75、65、60および55型［粒径約50〜100μｍを有
する（比較実施例１および２〜４を参照）］を使用して
おり、これらは異なる除去限界を有しており、これらに
は、エピクロロヒドリンとの反応の後に、ヘパリンまた
はコンドロイチン−ポリサルフェートのようなリガンド
が共有結合する。
***国特許公開36 17 672号では、種々の多孔性吸着
剤が例示されており、血液、血漿または血清などの体液
のような水性の液体から病原性の生物重合体を除去する
のに適する物質が包含されている。この物質は担体物質
としての有機固相を有しており、これは、メルカプト
基、アミノ基および／またはカルボキシ基を有するモノ
マ−、オリゴマ−またはポリマ−であってよい共有結合
架橋剤（スペーサー）を介して、あるリガンド、適切に
はポリカルボン酸または遊離酸形態に変換できる誘導体
に共有結合している。担体物質は結合剤、好ましくはエ
ポキシ化合物、例えばジグリシダル化合物で前処理し、
これを次にアンモニアのようなアミノ化合物と反応（誘
導）させて架橋剤を形成する。このように変性された担
体物質は、例えば、ポリカルボン酸またはその誘導体と
反応してカルバミン酸エステル、例えば、Ｎ−エトキシ
−カルボニル−２−エトキシ−1,2−ジヒドロ−キノリ
ンで活性化されることによりリガンドを形成する。
その他の多くの物質もまたリガンドとして使用してよ
い。しかしながら特に好ましいものは、アクリル酸のポ
リマーまたはコポリマーであり、そして、担体物質とし
ては市販のFractogelRが挙げられる。
GIT Fachz,Lab.27、380−389（1983）には、全種類の
Fractogel RTSK、即ちHW40、50、55および65型が球形で
完全に多孔性の粒子を有しており、その粒径はサブタイ
プＳでは25〜40μｍ、サブタイプＦでは32〜63μｍであ
ることが記載されている。サブタイプＣの形態のHW40型
には例外があり、これは粒径50〜100μｍを有してい
る。
上記文献の第４図からHW40型は僅か102〜104ダルトン
の分子量範囲で存在することが明らかである。即ち、孔
径がこのように比較的小さいため、より大きい生物巨大
分子、例えば分子量106を超えるLDLの分離には使用でき
ない。
「除去限界」という用語は、ゲル透過クロマトグラフ
ィーで、もはや吸着剤の細孔に侵入できないような分子
の最小分子量と理解されたい。
前記した文献、とくに385ページの第１のコラムの最
終パラグラフから、より小さい粒径の吸着剤を使用する
ことにより除去するべき生物重合体の間の（一定の選択
性での）分離の効率において実質的な進歩が得られるこ
とが推論できる。この理由から、吸着特性、特に分離効
率に対して高度な要求がなされるこのようなクロマトグ
ラフィーにおいては、可能な限り微細な、即ち粒径が20
〜50μｍの「超微細」物質が使用される。
スペーサーおよびリガンド、例えばポリカルボン酸、
好ましくはポリアクリル酸、またはポリミキシ、例えば
ポリミキシンＢを、（メタ）アクリル酸エステルまたは
（メタ）アクリルアミドのホモー、コーまたはターポリ
マー、例えば上記した市販の物質から形成された知られ
た担体物質と組合せて基材とし、これを、血漿から、例
えばLDLや内毒性のような生物巨大分子を除去するため
に使用できる。これは多孔性を鑑みて、即ち分離効率に
関して最小の粒径を求めるような除去限界を鑑みて担体
物質を選択する場合に特に言えることである。
一方全血液の体外循環で用いる場合は、少なくとも50
μｍの粒径を使用しなければならない。この条件は、全
血液中に存在する最大の血球粒子が約20μｍの直径を有
しており、そのため、吸着した物質を保持回収するため
のふるいは、血球を通過させるためには少なくとも40μ
ｍの孔径を有していなければならないという事実に基づ
いている。50μｍの粒径の吸着剤粒子を充填したカラム
を用いた場合、これらの粒子の間には十分な余地が存在
するため、血球を通過させることが可能であることが解
っている。
しかしながら、意外にも、一見、全血液に対して使用
できると見られる50μｍを超える粒径を有する、共有結
合スペーサーおよびそれに共有結合したリガンド、例え
ばポリカルボン酸、例えばポリアクリル酸またはポリミ
キシンＢを有する前記した担体物質は、例えば少なくと
も５×106ダルトン（リボ蛋白で測定）の除去限界を要
するLDLや内毒素の分離を目的として用いられた場合に
は、全く望ましくない血小板の凝集が起こることから、
このような生物巨大分子の除去の為には適さないという
ことが判明したのである。
血球非適合性のこの現象を第１図に示すが（打点
面）、ここには、全血液からLDLおよび内毒素を除去す
るのに適する吸着剤であると考えられたものを試験し、
それが不適当であることが示されている。ここでは、担
体物質、即ち、実施例１のスペーサーおよびリガンドを
有する市販のToyopearlR（HW 75 SC）を使用した（この
物質は、前記の通り、グリシジルメタクリレートとエリ
スロジメタクリレートの共重合体をエチレングリコール
で架橋反応させて作られる）。しかしながら、この物質
は適切な粒径と除去限界を有するものの、球状ではな
く、不規則な形態の凝集塊として存在する。
（発明が解決しようとする課題） 本発明の課題は、許容できる血球との適合性を有する
一方で、特にLDLや内毒素のような生物巨大分子の除去
に関して、好ましくは高い選択性を有するような、全血
の体外循環で用いることのできる吸着剤物質を提供する
ことである。
（課題を解決するための手段） 上記課題は、粒径範囲が50〜250μｍであり、除去限
界が少なくとも５×106ダルトンである（メタ）アクリ
ル酸／または（メタ）アクリルアミドのホモー、コー、
またはターポリマーの多孔性担体物質、並びにスペーサ
ーを介して担体物質に共有結合した有機リガンドからな
り、上記担体物質が凝集しない球形であることを特徴と
する、全血液から生物巨大分子を除去するための吸着剤
により達成される。
本発明により解決される別の問題点は、特に、血小板
の保持を最低限に留められるような、全血液からの内毒
素の除去に適する吸着剤を調製する点である。これは、
スペーサーが二重結合を有さないことにより解決され
る。
多くの手段において全血液から内毒素を除去するのに
適するような吸着剤を調整するためには、例えば、14原
子を有する比較的長い共有結合スペーサーを有する担体
物質を得ることが望ましいことが判った。さらに、製造
時の条件の結果としてスペーサー内に生じる二重結合の
存在が、望ましくない水準で血小板を保持する原因とな
ることも解っている（第２図参照）。２つの二重結合を
有するスペーサーの１例は、エチレンジアミンおよびグ
ルタルアルデヒドと、FractogelRおよびToyopearlRのよ
うなOH含有担体物質との反応において導入される14原子
スペーサーである。意外にも、例えば従来の方法により
ナトリウムボロンハイドライドを用いて二重結合を水素
化することにより、血小板の保持量の低減された吸着剤
が得られることが判った。（第２図右参照）。
（実施例） 本発明を以下に示す実施例により、更に説明する。
実施例１ 本実施例では、全血液からLDLを除去するのに適する
吸着剤の調整について論じるが、ここでは、出発担体物
質としてToyopearl（登録商標：内部特性化、HW 70 SC
（56H）Toyo Haas社、フィラデルフィア.PA,米国）を用
いた。この物質は球形であり（第4b図参照）、粒径は70
〜150μｍである。この製品はエチレングリコール、グ
リシジルメタクリレートおよびエリスリトールジメタク
リレートの共重合体である。
以下に示す血球適合性に関する比較試験において用い
た吸着剤は、担体物質として市販のToyopearlR76 SCを
用いており、これは球状でない点が上記の製品とは異な
っている。更に、同じ粒径で不整状態（第4a図参照）の
場合（粒子凝集の結果として）も示した。
上記した担体物質は、常法に従って、 ａ）５％エピクロロヒドリン、次いで濃アンモニア水と
反応させること、それにより５原子スペーサーが担体に
導入される； ｂ）エピクロロヒドリン、次いでエチレンジアミンと反
応させることにより、８原子スペーサーが導入される； ｃ）1,4−ブタンジオールジグリシドキシエーテルと反
応させ、次いでアンモニア処理することにより、14原子
スペーサーが導入される。
アミン誘導担体ｂ）は、次のように調製した； トーヨーパールゲルは、ガラスフィルター（G4）上
で、蒸留水を用いて洗浄され、60℃で真空乾燥された。
乾燥ゲル50g、苛性ソーダ１規定溶液200ml、エピクロ
ールヒドリン11mlを500mlのセパラブルフラスコに入
れ、30℃で３時間撹拌した。
それをガラスフィルター（G4）上で濾過し、冷却した
蒸留水で洗浄した。このゲルを500mlのセパラブルフラ
スコに入れ、それにエチレンジアミン63ml、蒸留水35ml
を加え、それから混合物を80℃で1.5時間撹拌した。反
応後、混合物をガラスフィルター（G4）上で濾過し、そ
のゲルから未反応のエチレンジアミンを除去するため
に、アセトンで数回洗浄し、それから60℃で一晩中真空
乾燥した。
この方法において、次の構造を有する８原子スペーサ
ーの担体が得られた。
担体−Ｏ−CH2−CH（OH）−CH2−NH−（CH2）２−NH2 アミン誘導担体ａ）とｃ）は、同称の方法で調製され
た。
この操作において、担体物質40グラムを8.25mlのエピ
クロロヒドリンまたはブタンジグリシドキシエーテルと
ともに１モル水酸化ナトリウム水溶液125mlに溶解し、
次いで、エチレンジアミン47mlを添加した。
リガンドとしてポリアクリル酸を導入するために、ポ
リアクリル酸200mgを0.15Mの塩化ナトリウム水溶液12ml
に溶解し、これにＮ・エトキシカルボニル−２・エトキ
シ−1.2−ジヒドロキノリンを活性剤として添加した。3
0分後、上記したアミノ誘導担体物質をポリアクリル酸
溶液に添加した。混合物を室温で12時間反応させた。球
状担体物質上の複合吸着剤を以下に示す一連の試験に付
した。
Ａ）全血液測定／特異的結合能 健康なボランティアから採取した新鮮な血液のLDLの
結合能を測定する為に実施例１の吸着剤を用いてこの実
験を行なった。
実施例１の吸着剤2mlを直径10mmのカラムに充填し、A
CDA［クエン酸塩凝血抑止剤］（1:1）処理した新鮮な血
液20mlを1m1/分の速度で吸着剤に送り込んだ。血球をこ
の処理の前後で測定した。
一方、実施例２で調整した吸着剤は生理食塩水内の内
毒素結合能の測定に用いた（標準:b.coli055:B5）。実
施例１（ａ）で調整した吸着剤については、LDL結合能
力8mg/ml吸着剤が得られた。LDL許容量に関して実施例1
a、2bおよび1cの吸着剤におけるスペーサーの長さの影
響を測定するために行なった人の血液を用いたin vitro
の試験結果を第５図に示す。
血球適合性 非球形吸着剤（ToyopearlR（HW 75 SC））を用いたほ
かは実施例と同様にして吸着剤を調製した。試験は血球
20ml/吸着剤2mlで行なった。結果を第１図に示す。これ
によれば、白血球および血小板との適合性に関しては、
非球形より球形の吸着剤のほうが実質的に優れているこ
とが解る。
毒性学的実験 以下の毒性学的支援をLDL吸着剤について実施した。
1.物理化学的試験（USP XX1） 2.マウス系統的許容性試験（USP XX1） 3.ウサギ皮内試験（USP XX1） 4.モルモット感作試験（OECD指針No.406） 5.ウサギ溶血試験 6.寒天培養試験（血液透析膜の比較評価、米国厚生省、
1077.官報NIH−77/1234） 7.エームス試験（OECD指針No.471）これらの試験の何れ
においても毒性作用は認められなかった。従って吸着剤
は生物学的適合性を有していた。
圧力安定性 実施例１で調整した吸着剤400mlを直径48mmの吸着カ
ラムに充填した。
15分かけて種々の流量で全血液を吸着カラムに送り込
んだ。フィルター排出口の圧力を測定した。圧力は15分
間に渡り一定であることが解った。圧力−流量グラフを
第３図に示す。圧力安定性および圧力−流量グラフの直
線性から、吸着剤がこれらの圧力で安定であることが解
る。
同様の円筒を用い、実施例１で調整した吸着剤400ml
を同様に用いて粒径測定をDLN Schedule58 362に従って
行なった（粒子不純度の測定）。
これらの実験の全では予め121℃で30分間オートクレ
ープした減菌吸着剤を用いて行なった。
実施例２ ここでは、実施例１と同様に、球状担体物質を、エピ
クロロヒドリン、次いでエチレンジアミンまたは1,4−
ブタンジオールジグリシドキシエーテルの何れか、そし
てその後エチレンジアミンを用いて、知られた方法で処
理することにより、活性化された担体物質を調製した。
この操作において、担体物質40グラムを8.25mlのエピ
クロロヒドリンまたはブタンジグリシドキシエーテルと
ともに１モル水酸化ナトリウム水溶液125mlに溶解し、
次いで、エチレンジアミン47mlを添加した。
このようにして活性化された担体物質をグルタルアル
デヒド５％水溶液とともに12時間インキュベートした。
これらの操作により、それぞれ、２つの二重結合を含む
14原子スペーサーおよび20原子スペーサーを担体物質に
導入した。14原子スペーサーの（水素添加の前後の）構
造を第７図に示すが、ここでは「POL」という用語はそ
れに結合するポリミキシンリガンドを示している。
次に、ポリミキシンＢを常法に従いリガンド共有結合
させたが、その際、硫酸ポリミキシンB0.5gを含有する1
0mM塩化マグネシウム溶液250ml中で結合反応を行なって
吸着剤（Ｉ）を得た。
14原子スペーサーの吸着剤の一部を５％水性ナトリウ
ムボロハイドライドを用いて常法により水素添加し、ス
ペーサーの二重結合を水素化して吸着剤（II）を得た。
血小板の保持に関しては、14原子スペーサーならびに
20原子スペーサーに対し、吸着剤（Ｉ）（非還元スペー
サー）ならびに（II）（還元スペーサー）の2mlにつき
血液20mlを用い調べた。意外にも、第２図に示されると
おり、（II）は実質的により少ない数の血小板を保持し
ていた。
実施例３ 前記した詳細な説明に従って、メタクリルアミド系タ
ーポリマーを基材とする球状担体物質を、実施例１に従
ってアミノ誘導し、８原子スペーサーを導入し、実施例
１に記載の通りポリアクリル酸と共有結合させ、全血液
からLDLを分離するのに有用な吸着剤を得た。
出発担体物質はメタクリルアミド、Ｎ−メチレン−ビ
ス−メチルアクリルアミドおよびアクリルグリシジルエ
ーテルのターポリマーであり、球状粒子の粒径分布は50
〜200μｍであり、除去限界は＞5x103ダルトンであっ
た。これらの粒子は、溝、開口部おより凹部を含む多孔
性の構造を有している。孔容量（水銀法で測定）は1.74
cm2/gであり、平均孔径は35nmであった。BET比表面積
（等温窒素吸着）は183m2/gであった。
毒性学的測定（USP XX1）によれば、担体物質および
それにより調整した吸着剤は毒性学的には無害であっ
た。更に生物学的適合性があることも解った。
実施例１で用いた方法によれば、吸着剤が全血液から
LDLを結合する能力は3.6mg/mlであった。
この値は、実施例１（ａ）に従って調整した物質を測
定した際に得られた値より小さく、これは、実施例１の
吸着剤よりも実施例３の吸着剤のほうが、より小さい除
去限界を有するという事実により説明できる。
吸着剤の血球適合性を実施例１の方法に従って調べ
た。結果を第６図に示す。即ち、吸着剤による白血球、
赤血球および血小板の保持は意外にも少ないことが解っ
た。
【図面の簡単な説明】
第１図は、LDL−コレステロール吸着剤の形状（球形と
非球形）と血球成分（白血球，赤血球，血小板）の吸着
回収率の関係を示す血球適合性の棒グラフである。第２
図は、スペーサーの共有結合原子数と二重結合の有無に
よる血小板の回収率の関係を示す棒グラフである。第３
図は、LDL吸着剤についての血液の流量と圧力の関係を
示すグラフである、第４図の図ａ）および図ｂ）はそれ
ぞれ担持物質の非球形および球形の粒子構造を示す図で
ある。第５図は、各種原子鎖のスペーサーとLDLの容量
との関係を示す棒グラフである。第６図は、実施例３で
調製された担体物質吸着剤による血球回収率の棒グラフ
である。また、第７図は、二重結合を有する担持［図
（ａ）］とその水素添加後の担体［図（ｂ）］の化学構
造を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−10055（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−54959（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−258674（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−283748（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−286173（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】粒径範囲が50〜250μｍであり、除去限界
    が少なくとも５×106ダルトンであるアクリル酸および
    ／またはメタクリル酸のエステルあるいは（メタ）アク
    リルアミドのホモー，コーまたはターポリマーで形成さ
    れた実質的に球形の非凝縮性多孔性担体物質に、スペー
    サーを介して有機リガンドを共有結合してなることを特
    徴とする全血液から生物巨大分子を除去するための吸着
    剤。
  2. 【請求項２】スペーサーが、二重結合を含まないことを
    特徴とする請求項１に記載の吸着剤。
JP02266144A 1989-10-03 1990-10-03 体外循環全血液からｌｄｌおよび内毒素のような生物巨大分子を除去するための吸着剤 Expired - Lifetime JP3100974B2 (ja)

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