JP3017591B2 - 抗ヒトｔｉｍｐ−２モノクローナル抗体の製法およびその利用 - Google Patents
抗ヒトｔｉｍｐ−２モノクローナル抗体の製法およびその利用Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】本発明は、ヒト・ティッシュ・インヒビタ
ー・オブ・メタロプロテイナーゼ−２（ＴＩＭＰ−２）
に対するモノクローナル抗体に関するものであり、該モ
ノクローナル抗体の製造ならびにそれにより得られたモ
ノクローナル抗体およびそれらモノクローナル抗体を用
いて、ヒトの血液・体液・組織およびヒト由来組織培養
液などに存在するＴＩＭＰ−２を分析測定する方法に関
する。更に詳しくは、本発明は、抗ヒトＴＩＭＰ−２モ
ノクローナル抗体ならびにその製造方法およびそのモノ
クローナル抗体を用いるサンドイッチ測定法に基づく酵
素免疫学的測定法によるヒトＴＩＭＰ−２の高感度に定
量する方法に関するものであって、固相担体に結合させ
る抗体および酵素標識を付与する抗体の２種類の抗ヒト
ＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体を用いることを特徴と
するヒトＴＩＭＰ−２の測定方法に関するものである。
ー・オブ・メタロプロテイナーゼ−２（ＴＩＭＰ−２）
に対するモノクローナル抗体に関するものであり、該モ
ノクローナル抗体の製造ならびにそれにより得られたモ
ノクローナル抗体およびそれらモノクローナル抗体を用
いて、ヒトの血液・体液・組織およびヒト由来組織培養
液などに存在するＴＩＭＰ−２を分析測定する方法に関
する。更に詳しくは、本発明は、抗ヒトＴＩＭＰ−２モ
ノクローナル抗体ならびにその製造方法およびそのモノ
クローナル抗体を用いるサンドイッチ測定法に基づく酵
素免疫学的測定法によるヒトＴＩＭＰ−２の高感度に定
量する方法に関するものであって、固相担体に結合させ
る抗体および酵素標識を付与する抗体の２種類の抗ヒト
ＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体を用いることを特徴と
するヒトＴＩＭＰ−２の測定方法に関するものである。
【０００２】
【背景技術】ティッシュ・インヒビター・オブ・メタロ
プロテイナーゼ（ＴＩＭＰ−１）はヒトおよびその他動
物の培養細胞（線維芽細胞、腫瘍細胞、軟骨細胞、平滑
筋細胞、内皮細胞など）や血小板、単球、マクロファー
ジ、歯髄などが産生する分子量約３０ｋＤａの糖蛋白質
である。従来、ＴＩＭＰ−１は間質コラゲナーゼ活性を
阻害する事からコラゲナーゼ・インヒビターと呼ばれて
いたが、間質コラゲナーゼ以外に種々のメタロプロテイ
ナーゼ（７２ｋＤａゼラチナーゼ、９２ｋＤａゼラチナ
ーゼ、ストロムライシン）を阻害する事が明らかにな
り、ＴＩＭＰ−１（ティッシュ・インヒビター・オブ・
メタロプロテイナーゼ）と改名された。（Ｄｏｃｈｅｒ
ｔｙ，Ａ．Ｊ．Ｐ．ら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．
４９．４６９〜４７９、（１９９０）；Ｔ．Ｅ．Ｃａｗ
ｓｔｏｎ：ｉｎ “Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒｓ”、ｅｄ．ｂｙ Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ
ら、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，（１９８
６）ｐ５８９．参照）。
プロテイナーゼ（ＴＩＭＰ−１）はヒトおよびその他動
物の培養細胞（線維芽細胞、腫瘍細胞、軟骨細胞、平滑
筋細胞、内皮細胞など）や血小板、単球、マクロファー
ジ、歯髄などが産生する分子量約３０ｋＤａの糖蛋白質
である。従来、ＴＩＭＰ−１は間質コラゲナーゼ活性を
阻害する事からコラゲナーゼ・インヒビターと呼ばれて
いたが、間質コラゲナーゼ以外に種々のメタロプロテイ
ナーゼ（７２ｋＤａゼラチナーゼ、９２ｋＤａゼラチナ
ーゼ、ストロムライシン）を阻害する事が明らかにな
り、ＴＩＭＰ−１（ティッシュ・インヒビター・オブ・
メタロプロテイナーゼ）と改名された。（Ｄｏｃｈｅｒ
ｔｙ，Ａ．Ｊ．Ｐ．ら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．
４９．４６９〜４７９、（１９９０）；Ｔ．Ｅ．Ｃａｗ
ｓｔｏｎ：ｉｎ “Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒｓ”、ｅｄ．ｂｙ Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ
ら、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，（１９８
６）ｐ５８９．参照）。
【０００３】最近、上述のＴＩＭＰ−１とは分子量の異
なるティッシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイ
ナーゼ−２（ＴＩＭＰ−２）と呼ばれるメタロプロテイ
ナーゼ・インヒビターが発見された（Ｓｔｅｔｌｅｒ−
Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２４６、１７３７４〜１７３７８、１９８９；Ｇ
ｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６、８２０７〜８２１
１、１９８９；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｒ．Ａ．ら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６８、２６７〜２７４、１９９０
参照）。
なるティッシュ・インヒビター・オブ・メタロプロテイ
ナーゼ−２（ＴＩＭＰ−２）と呼ばれるメタロプロテイ
ナーゼ・インヒビターが発見された（Ｓｔｅｔｌｅｒ−
Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２４６、１７３７４〜１７３７８、１９８９；Ｇ
ｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６、８２０７〜８２１
１、１９８９；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｒ．Ａ．ら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６８、２６７〜２７４、１９９０
参照）。
【０００４】ＴＩＭＰ−２と従来のＴＩＭＰ−１との違
いは、分子量の他に、Ｃｏｎ−Ａ−セファロースカラム
に結合しないということにより区別される。ヒトＴＩＭ
Ｐ−２はｃＤＮＡクローニングによりその一次構造が明
らかにされている（Ｂｏｏｎｅ，Ｔ．Ｃ．ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７、
２８００〜２８０４、１９９０参照）。それによると、
ヒトＴＩＭＰ−２は、１９４個のアミノ酸残基からな
り、ヒトＴＩＭＰ−１と３８％の相同性を有している。
いは、分子量の他に、Ｃｏｎ−Ａ−セファロースカラム
に結合しないということにより区別される。ヒトＴＩＭ
Ｐ−２はｃＤＮＡクローニングによりその一次構造が明
らかにされている（Ｂｏｏｎｅ，Ｔ．Ｃ．ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７、
２８００〜２８０４、１９９０参照）。それによると、
ヒトＴＩＭＰ−２は、１９４個のアミノ酸残基からな
り、ヒトＴＩＭＰ−１と３８％の相同性を有している。
【０００５】また、ヒトＴＩＭＰ−２は、ヒトＴＩＭＰ
−１と同じ１２個のシステイン残基を持ち、その位置も
よく保存されている。
−１と同じ１２個のシステイン残基を持ち、その位置も
よく保存されている。
【０００６】一方、ＴＩＭＰ−１はプロ９２ｋＤａゼラ
チナーゼおよび９２ｋＤａゼラチナーゼと複合体を形成
し、また、ＴＩＭＰ−２はプロ７２ｋＤａゼラチナーゼ
と複合体を形成していることは認められているが、現時
点では、それ以上の詳細については明らかにされていな
い（Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６４、１７２１３〜１７２２１、１９８９；Ｗ
ａｒｄ，Ｒ．Ｖ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７８、１
７９〜１８７、１９９１参照）。
チナーゼおよび９２ｋＤａゼラチナーゼと複合体を形成
し、また、ＴＩＭＰ−２はプロ７２ｋＤａゼラチナーゼ
と複合体を形成していることは認められているが、現時
点では、それ以上の詳細については明らかにされていな
い（Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６４、１７２１３〜１７２２１、１９８９；Ｗ
ａｒｄ，Ｒ．Ｖ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７８、１
７９〜１８７、１９９１参照）。
【０００７】
【発明の開示】本発明者らは、抗ヒトＴＩＭＰ−２モノ
クローナル抗体を製造することに成功した。また、この
抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体を用いれば、サ
ンドイッチ法により酵素免疫学的に生体試料中に存在す
るヒトＴＩＭＰ−２を分析測定することができる。従っ
て、本発明は、ヒトＴＩＭＰ−２に特異性を有するモノ
クローナル抗体であって、ＤＳＧＮＤＩＹＧＮＰＩＫＲ
ＩＱ、ＤＴＬＳＴＴＱＫＫＳＬＮＨＲＹＱまたはＹＲＧ
ＡＡＰＰＫＱＥＦＬＤＩＥＤの配列を有するポリペプチ
ドと反応性を有し、かつヒトＴＩＭＰ−１と交差反応性
を有しないモノクローナル抗体ならびにそれらモノクロ
ーナル抗体の製造法を提供するものであり、さらに、こ
れらいずれか２種のモノクローナル抗体の組合せを使用
して、ヒト由来の生体試料の少量を用いて、精度よく、
簡便、迅速に試料中に存在するＴＩＭＰ−２を特異的に
定量する方法を提供するものである。この方法は、固相
担体に結合させる抗体ならびに酵素標識を付与する抗体
として各々抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体を用
い、酵素免疫学的測定法によりヒトＴＩＭＰ−２を定量
することからなる。本発明に係る酵素免疫学的測定法と
しては後掲の実施例として一つの例示的な方法が示され
ているが、例えば固相担体としては、ポリスチレン製ビ
ーズ、ポリカーボネート製マイクロプレート、ポリプロ
ピレン製マイクロプレート、スティック、試験管など任
意適当に選ばれたものを使用することができる。
クローナル抗体を製造することに成功した。また、この
抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体を用いれば、サ
ンドイッチ法により酵素免疫学的に生体試料中に存在す
るヒトＴＩＭＰ−２を分析測定することができる。従っ
て、本発明は、ヒトＴＩＭＰ−２に特異性を有するモノ
クローナル抗体であって、ＤＳＧＮＤＩＹＧＮＰＩＫＲ
ＩＱ、ＤＴＬＳＴＴＱＫＫＳＬＮＨＲＹＱまたはＹＲＧ
ＡＡＰＰＫＱＥＦＬＤＩＥＤの配列を有するポリペプチ
ドと反応性を有し、かつヒトＴＩＭＰ−１と交差反応性
を有しないモノクローナル抗体ならびにそれらモノクロ
ーナル抗体の製造法を提供するものであり、さらに、こ
れらいずれか２種のモノクローナル抗体の組合せを使用
して、ヒト由来の生体試料の少量を用いて、精度よく、
簡便、迅速に試料中に存在するＴＩＭＰ−２を特異的に
定量する方法を提供するものである。この方法は、固相
担体に結合させる抗体ならびに酵素標識を付与する抗体
として各々抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体を用
い、酵素免疫学的測定法によりヒトＴＩＭＰ−２を定量
することからなる。本発明に係る酵素免疫学的測定法と
しては後掲の実施例として一つの例示的な方法が示され
ているが、例えば固相担体としては、ポリスチレン製ビ
ーズ、ポリカーボネート製マイクロプレート、ポリプロ
ピレン製マイクロプレート、スティック、試験管など任
意適当に選ばれたものを使用することができる。
【０００８】一方、標識物を付与する抗ヒトＴＩＭＰ−
２モノクローナル抗体としては、抗体含有物を硫酸アン
モニウムを加えることにより分画した後、ＤＥＡＥ−セ
ファセルの如き陰イオン交換ゲルによりあるいはＰｒｏ
ｔｅｉｎ Ａカラムクロマトグラフィーにより精製した
ＩｇＧ画分、さらにはペプシン消化後得られるＦ（ａ
ｂ′）２およびそれを還元して得られる特異的結合部分
Ｆａｂ′を用いることもできる。
２モノクローナル抗体としては、抗体含有物を硫酸アン
モニウムを加えることにより分画した後、ＤＥＡＥ−セ
ファセルの如き陰イオン交換ゲルによりあるいはＰｒｏ
ｔｅｉｎ Ａカラムクロマトグラフィーにより精製した
ＩｇＧ画分、さらにはペプシン消化後得られるＦ（ａ
ｂ′）２およびそれを還元して得られる特異的結合部分
Ｆａｂ′を用いることもできる。
【０００９】さらに使用し得る標識物の例としては酵素
（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グル
コースオキシダーゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
など）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素な
どをあげることができる。
（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グル
コースオキシダーゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
など）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素な
どをあげることができる。
【００１０】以上の如く、固相担体に結合させる抗体お
よび酵素標識を付与する抗体としての２種のモノクロー
ナル抗体の組み合わせを用いて、固相法酵素免疫学的測
定法によりヒトＴＩＭＰ−２を分析測定することができ
る。以下に、実施例を掲げ、本発明を具体的に説明す
る。ただし本発明はこれら実施例により限定されるもの
ではない。
よび酵素標識を付与する抗体としての２種のモノクロー
ナル抗体の組み合わせを用いて、固相法酵素免疫学的測
定法によりヒトＴＩＭＰ−２を分析測定することができ
る。以下に、実施例を掲げ、本発明を具体的に説明す
る。ただし本発明はこれら実施例により限定されるもの
ではない。
【００１１】実施例１ 抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体の作製 （ａ） ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチドの調製 Ｂｏｏｎｅ，Ｔ．Ｃ．らは、ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプ
チドの配列を、ｃＤＮＡの配列から予測している（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，
８７；２８００〜２８０４、１９９０）。その予測され
たアミノ酸配列構造中より、表１に示した３種のポリペ
プチド（Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３）をそれぞれペプチド
シンセサイザー９６００（ミリジェン／バイオサーチ）
を用いて合成し、続いて、それらの各ポリペプチドのＣ
末端にシステイン残基を導入した。得られた３種の粗ポ
リペプチドは、それぞれ、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ
（Ｗａｔｅｒｓ，５μ、Ｃ１８−１００Å、３．９×１
５０ｍｍ）カラムを用いて高速液体クロマトグラフィー
により精製した。
チドの配列を、ｃＤＮＡの配列から予測している（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，
８７；２８００〜２８０４、１９９０）。その予測され
たアミノ酸配列構造中より、表１に示した３種のポリペ
プチド（Ｐ−１、Ｐ−２、Ｐ−３）をそれぞれペプチド
シンセサイザー９６００（ミリジェン／バイオサーチ）
を用いて合成し、続いて、それらの各ポリペプチドのＣ
末端にシステイン残基を導入した。得られた３種の粗ポ
リペプチドは、それぞれ、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ
（Ｗａｔｅｒｓ，５μ、Ｃ１８−１００Å、３．９×１
５０ｍｍ）カラムを用いて高速液体クロマトグラフィー
により精製した。
【００１２】（ｂ） ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチドと
キーホールリンペットヘモシアニン複合体の調製 （ａ）で得られた３種のポリペプチドについて、それぞ
れ下記のとおりにして複合体を調製した。２ｍｇキーホ
ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ．）を１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解したものと１．８５ｍｇＮ−（ε−ｍａｌｅ
ｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉ
ｄｅを２００μｌのジメチルホルムアミドに溶解したも
のとを混合し、３０℃、３０分間インキュベーションし
た。次に上記の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したＰＤ−１０（ファルマシア）でゲ
ル濾過した。マレイミドが結合されたＫＬＨを分取し、
１．５ｍｌ以下に濃縮した。マレイミドが結合されたＫ
ＬＨに対し５０倍モル量の前記（ａ）で合成した各ポリ
ペプチドを１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解したものと混合した。４℃、２０時間インキ
ュベーションし、３種のポリペプチド−ＫＬＨ複合体を
調製した。
キーホールリンペットヘモシアニン複合体の調製 （ａ）で得られた３種のポリペプチドについて、それぞ
れ下記のとおりにして複合体を調製した。２ｍｇキーホ
ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ．）を１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解したものと１．８５ｍｇＮ−（ε−ｍａｌｅ
ｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉ
ｄｅを２００μｌのジメチルホルムアミドに溶解したも
のとを混合し、３０℃、３０分間インキュベーションし
た。次に上記の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したＰＤ−１０（ファルマシア）でゲ
ル濾過した。マレイミドが結合されたＫＬＨを分取し、
１．５ｍｌ以下に濃縮した。マレイミドが結合されたＫ
ＬＨに対し５０倍モル量の前記（ａ）で合成した各ポリ
ペプチドを１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解したものと混合した。４℃、２０時間インキ
ュベーションし、３種のポリペプチド−ＫＬＨ複合体を
調製した。
【００１３】
【表１】
【００１４】（ｃ） 抗体産生細胞の調製 前記（ｂ）の方法により調製した各複合体２５０μｇを
完全フロイントアジュバントと共に８週令Ｂａｌｂ／ｃ
雌マウスにそれぞれ腹腔内投与し、初回免疫した。１５
日後に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した
各複合体２００μｇを初回免疫したそれぞれのマウスに
腹腔内投与し追加免疫した。さらに、３８日後に追加免
疫時と同様に各複合体７０μｇを静脈内および１３０μ
ｇを腹腔内投与し、最終免疫とした。その３日後に脾臓
を摘出し、脾細胞懸濁液を調製した。
完全フロイントアジュバントと共に８週令Ｂａｌｂ／ｃ
雌マウスにそれぞれ腹腔内投与し、初回免疫した。１５
日後に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した
各複合体２００μｇを初回免疫したそれぞれのマウスに
腹腔内投与し追加免疫した。さらに、３８日後に追加免
疫時と同様に各複合体７０μｇを静脈内および１３０μ
ｇを腹腔内投与し、最終免疫とした。その３日後に脾臓
を摘出し、脾細胞懸濁液を調製した。
【００１５】（ｄ） 細胞融合 （１） 以下の材料および方法を用いた。
【００１６】ＲＰＭＩ １６４０培地：ＲＰＭＩ １６
４０ （Ｆｌｏｗ Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２
４ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリ
ンＧカリウム（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシ
ン（５０μｇ／ｍｌ）および硫酸アミカシン（１００μ
ｇ／ｍｌ）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、
０．２μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌濾過した。
４０ （Ｆｌｏｗ Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２
４ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリ
ンＧカリウム（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシ
ン（５０μｇ／ｍｌ）および硫酸アミカシン（１００μ
ｇ／ｍｌ）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、
０．２μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌濾過した。
【００１７】ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ １６４０培
地に除菌濾過した仔牛胎児血清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加
えた。
地に除菌濾過した仔牛胎児血清（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加
えた。
【００１８】ＰＥＧ ４，０００溶液：ＲＰＭＩ １６
４０培地にポリエチレングリコール４，０００ （ＰＥ
Ｇ ４，０００、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．）を５０％
（ｗ／ｗ）になるように加え、無血清溶液を調製した。
４０培地にポリエチレングリコール４，０００ （ＰＥ
Ｇ ４，０００、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．）を５０％
（ｗ／ｗ）になるように加え、無血清溶液を調製した。
【００１９】８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ
２（ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ １４）との融合は、Ｓｅｌｅｃ
ｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｍｉｓｈｅｌｌ，Ｂ．Ｂ．
ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ，Ｓ．Ｍ．）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ３５１〜３７２、１
９８０に記載のＯｉらの方法を若干改変して行った。
２（ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ １４）との融合は、Ｓｅｌｅｃ
ｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｍｉｓｈｅｌｌ，Ｂ．Ｂ．
ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ，Ｓ．Ｍ．）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ３５１〜３７２、１
９８０に記載のＯｉらの方法を若干改変して行った。
【００２０】（２） 前記（ｃ）で調製した各有核脾臓
細胞（生細胞率１００％）について、それぞれ、ミエロ
ーマ細胞（生細胞率１００％）と５：１の割合で融合し
た。なお、この場合、脾臓細胞とミエローマ細胞とは別
々に前記のＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄しておき、次
に両者を同じＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、上記の
割合で混合した。混合した各培地に対し、新たにＲＰＭ
Ｉ １６４０培地を前記のペプチドＰ−１，Ｐ−２，Ｐ
−３の各複合体の場合につき、各２５．８ｍｌ、２８．
５ｍｌ，３４．５ｍｌ加え、容量５０ｍｌのポリプロピ
レン製遠沈管（岩城硝子）を用いて、４００×ｇで１０
分間遠心し、上清を完全に吸引除去した。得られた各沈
殿細胞に３７℃加温ＰＥＧ４０００溶液を、ペプチドＰ
−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の場合につき、それぞ
れ、２．３ｍｌ、４．８ｍｌ、５．０ｍｌの量をもっ
て、穏やかに撹拌しながら、１分間で滴下し、さらに１
分間撹拌し各細胞を再懸濁、分散させた。得られた各懸
濁液に対し、３７℃加温ＲＰＭＩ １６４０培地を、ペ
プチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の場合につい
て、それぞれ、４．６ｍｌ、９．６ｍｌ，１０．０ｍｌ
の量を用いて、２分間、滴下した後、さらに、新たな同
じ培地をペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の
場合につき、それぞれ、１６．０ｍｌ、３３．６ｍｌ、
３５．０ｍｌを用いて、２〜３分間において、常に撹拌
しながら滴下し細胞を分散させた。得られた各懸濁液
を、４００×ｇで７分間遠心分離し、上清を完全に吸引
除去した。次に得られた各沈殿細胞に対し、３７℃加温
ＮＳ−１培地をペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複
合体の各場合につき、それぞれ、２２．７ｍｌ、４０．
０ｍｌ、４０．０ｍｌ速やかに加え、細胞の大きい塊を
１０ｍｌのピペットを用いて注意深くピペッティングし
て分散した。得られた各分散液に対し、さらに新たに、
３７℃加温ＮＳ−１培地をペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ
−３の各複合体の各場合につき、それぞれ、４５．３ｍ
ｌ、１０４ｍｌ、１１０ｍｌ加えて希釈し、ポリスチレ
ン製９６穴マイクロウエル（岩城硝子）にウエル当り
６．０×１０５個／０．１ｍｌの細胞を加えた。次い
で、これを７％炭酸ガス／９３％空気中で温度３７℃、
湿度１００％下に培養に付した。
細胞（生細胞率１００％）について、それぞれ、ミエロ
ーマ細胞（生細胞率１００％）と５：１の割合で融合し
た。なお、この場合、脾臓細胞とミエローマ細胞とは別
々に前記のＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄しておき、次
に両者を同じＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、上記の
割合で混合した。混合した各培地に対し、新たにＲＰＭ
Ｉ １６４０培地を前記のペプチドＰ−１，Ｐ−２，Ｐ
−３の各複合体の場合につき、各２５．８ｍｌ、２８．
５ｍｌ，３４．５ｍｌ加え、容量５０ｍｌのポリプロピ
レン製遠沈管（岩城硝子）を用いて、４００×ｇで１０
分間遠心し、上清を完全に吸引除去した。得られた各沈
殿細胞に３７℃加温ＰＥＧ４０００溶液を、ペプチドＰ
−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の場合につき、それぞ
れ、２．３ｍｌ、４．８ｍｌ、５．０ｍｌの量をもっ
て、穏やかに撹拌しながら、１分間で滴下し、さらに１
分間撹拌し各細胞を再懸濁、分散させた。得られた各懸
濁液に対し、３７℃加温ＲＰＭＩ １６４０培地を、ペ
プチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の場合につい
て、それぞれ、４．６ｍｌ、９．６ｍｌ，１０．０ｍｌ
の量を用いて、２分間、滴下した後、さらに、新たな同
じ培地をペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複合体の
場合につき、それぞれ、１６．０ｍｌ、３３．６ｍｌ、
３５．０ｍｌを用いて、２〜３分間において、常に撹拌
しながら滴下し細胞を分散させた。得られた各懸濁液
を、４００×ｇで７分間遠心分離し、上清を完全に吸引
除去した。次に得られた各沈殿細胞に対し、３７℃加温
ＮＳ−１培地をペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ−３の各複
合体の各場合につき、それぞれ、２２．７ｍｌ、４０．
０ｍｌ、４０．０ｍｌ速やかに加え、細胞の大きい塊を
１０ｍｌのピペットを用いて注意深くピペッティングし
て分散した。得られた各分散液に対し、さらに新たに、
３７℃加温ＮＳ−１培地をペプチドＰ−１、Ｐ−２、Ｐ
−３の各複合体の各場合につき、それぞれ、４５．３ｍ
ｌ、１０４ｍｌ、１１０ｍｌ加えて希釈し、ポリスチレ
ン製９６穴マイクロウエル（岩城硝子）にウエル当り
６．０×１０５個／０．１ｍｌの細胞を加えた。次い
で、これを７％炭酸ガス／９３％空気中で温度３７℃、
湿度１００％下に培養に付した。
【００２１】（ｅ） 選択培地によるハイブリドーマの
選択的増殖 （１） 使用する培地は以下のとおりである。 ＨＡＴ 培地：前記（ｄ）で述べたＮＳ−１培地にさら
にヒポキサンチン（１００μＭ）アミノプテリン（０．
４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。
選択的増殖 （１） 使用する培地は以下のとおりである。 ＨＡＴ 培地：前記（ｄ）で述べたＮＳ−１培地にさら
にヒポキサンチン（１００μＭ）アミノプテリン（０．
４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。
【００２２】（２） 前記（ｄ）の培養開始後翌日（１
日目）、細胞に１０ｍｌピペットでＨＡＴ 培地２滴
（約０．１ｍｌ）を加えた。２、３、５、８、１１日目
に培地の半分（０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ 培地で置
き換え、１１日目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き
換えた。通常約２週間で充分なハイブリドーマの生育が
観察される。ハイブリドーマ生育全ウエルについて次項
（ｆ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）に
より陽性ウエルをチェックした。次にフィーダーとして
１０７個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌをポリ
スチレン製２４穴セルウエル（岩城硝子）に加えたもの
を用い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマの全内
容物を移した。これを前記（ｄ）におけると同様に７％
炭酸ガス存在下、３７℃で約２〜３日培養に付した。ハ
イブリドーマの充分生育した時点でＥＬＩＳＡ法により
陽性を再確認し、それぞれについて次項（ｇ）記載の限
界希釈法によるクローニングを行った。なお、クローニ
ングに使用後の残液をポリスチレン製２５ｃｍ２組織培
養フラスコ（岩城硝子）に移し、凍結保存用試料を調製
した。
日目）、細胞に１０ｍｌピペットでＨＡＴ 培地２滴
（約０．１ｍｌ）を加えた。２、３、５、８、１１日目
に培地の半分（０．１ｍｌ）を新しいＨＡＴ 培地で置
き換え、１１日目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き
換えた。通常約２週間で充分なハイブリドーマの生育が
観察される。ハイブリドーマ生育全ウエルについて次項
（ｆ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）に
より陽性ウエルをチェックした。次にフィーダーとして
１０７個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌをポリ
スチレン製２４穴セルウエル（岩城硝子）に加えたもの
を用い、上記で検出された各陽性ハイブリドーマの全内
容物を移した。これを前記（ｄ）におけると同様に７％
炭酸ガス存在下、３７℃で約２〜３日培養に付した。ハ
イブリドーマの充分生育した時点でＥＬＩＳＡ法により
陽性を再確認し、それぞれについて次項（ｇ）記載の限
界希釈法によるクローニングを行った。なお、クローニ
ングに使用後の残液をポリスチレン製２５ｃｍ２組織培
養フラスコ（岩城硝子）に移し、凍結保存用試料を調製
した。
【００２３】（ｆ） ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＴＩＭ
Ｐ−２抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２０５〜２１４、
１９８０に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干改変し
た方法を用いた。この方法は、ハイブリドーマ抗体の検
出に適している。９６穴ミクロタイトレーションプレー
ト（ＦｌｏｗＬａｂ．）を実施例１（ａ）で得られた各
ポリペプチド５０ｎｇでコートした。これに前記（ｅ）
で得られたハイブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加
えて室温で約１時間インキュベートした。２次抗体とし
て西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グ
ロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．）を加え、さらに室
温で約１時間インキュベートした。次に基質である過酸
化水素とｏ−フェニレンジアミンを加え生成した褐色の
程度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東洋
ソーダ）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定し判定し
た。
Ｐ−２抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２０５〜２１４、
１９８０に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干改変し
た方法を用いた。この方法は、ハイブリドーマ抗体の検
出に適している。９６穴ミクロタイトレーションプレー
ト（ＦｌｏｗＬａｂ．）を実施例１（ａ）で得られた各
ポリペプチド５０ｎｇでコートした。これに前記（ｅ）
で得られたハイブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加
えて室温で約１時間インキュベートした。２次抗体とし
て西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グ
ロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．）を加え、さらに室
温で約１時間インキュベートした。次に基質である過酸
化水素とｏ−フェニレンジアミンを加え生成した褐色の
程度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東洋
ソーダ）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定し判定し
た。
【００２４】（ｇ） クローニング 前記（ｅ）の操作後、各ウエル中には、２種以上のハイ
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当りフ
ィーダーとして１０７個のマウス胸腺細胞を含むクロー
ニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエ
ル、３６ウエルおよび２４ウエルにウエル当り５個、１
個および０．５個のハイブリドーマを加えた。５日目に
全ウエルに各約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加した。
クローニング開始後１１〜１４日で充分なハイブリドー
マの生育が認められ、コロニーを形成しているウエルを
１２個選びＥＬＩＳＡ法を行った。テストした全ウエル
が陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数を確
認し、ウエル中に１コロニーが確認されたウエルを２個
選びその内１ウエルを再クローニングする。最終的に表
２に示したようにＰ１−ペプチド、Ｐ２−ペプチド、Ｐ
３−ペプチドのそれぞれに対するモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ計５１クローンを得た。
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当りフ
ィーダーとして１０７個のマウス胸腺細胞を含むクロー
ニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエ
ル、３６ウエルおよび２４ウエルにウエル当り５個、１
個および０．５個のハイブリドーマを加えた。５日目に
全ウエルに各約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加した。
クローニング開始後１１〜１４日で充分なハイブリドー
マの生育が認められ、コロニーを形成しているウエルを
１２個選びＥＬＩＳＡ法を行った。テストした全ウエル
が陽性でない場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数を確
認し、ウエル中に１コロニーが確認されたウエルを２個
選びその内１ウエルを再クローニングする。最終的に表
２に示したようにＰ１−ペプチド、Ｐ２−ペプチド、Ｐ
３−ペプチドのそれぞれに対するモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマ計５１クローンを得た。
【００２５】（ｈ） モノクローナル抗体の生体外増殖
および生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、得
られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な培
養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から１０〜
１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得るこ
とができた。一方、大量に抗体を得るためには脾細胞と
ミエローマ細胞の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃ
マウス）にマウス１匹当り０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を腹腔内
投与した。１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×１０
７個を同じく腹腔内投与し、さらにその１〜２週間後に
生体内で産生された４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル
抗体を含む腹水を得ることができた。
および生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、得
られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な培
養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から１０〜
１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得るこ
とができた。一方、大量に抗体を得るためには脾細胞と
ミエローマ細胞の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃ
マウス）にマウス１匹当り０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を腹腔内
投与した。１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×１０
７個を同じく腹腔内投与し、さらにその１〜２週間後に
生体内で産生された４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル
抗体を含む腹水を得ることができた。
【００２６】（ｉ） モノクローナル抗体の重鎖および
軽鎖 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、前述のＰ１−ペプチ
ド、Ｐ２−ペプチド、Ｐ３−ペプチドそれぞれをコート
したミクロタイトレーションプレートに、前記（ｇ）で
得られた各モノクローンの培養上清を加えた。次にＰＢ
Ｓにより洗浄した後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウ
スＩｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．）を加えた。ＰＢＳ
による洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質として過酸化
水素および２，２′−アジノ−ジ（３−エチルベンゾチ
アゾリン硫酸）を用いてそれぞれの重鎖および軽鎖を判
定した。その結果をまとめて後掲の表２に示した。
軽鎖 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、前述のＰ１−ペプチ
ド、Ｐ２−ペプチド、Ｐ３−ペプチドそれぞれをコート
したミクロタイトレーションプレートに、前記（ｇ）で
得られた各モノクローンの培養上清を加えた。次にＰＢ
Ｓにより洗浄した後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウ
スＩｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．）を加えた。ＰＢＳ
による洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質として過酸化
水素および２，２′−アジノ−ジ（３−エチルベンゾチ
アゾリン硫酸）を用いてそれぞれの重鎖および軽鎖を判
定した。その結果をまとめて後掲の表２に示した。
【００２７】（ｊ） モノクローナル抗体の精製 前記（ｈ）で得られた各腹水を４０％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画した後、ＩｇＧクラスの抗体について０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝
液（ｐＨ８．９）で平衡化したプロテインＡアフィゲル
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．）カラムに吸着させ、上記
洗浄液で洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．
０）で溶出することにより精製した。
ウムで分画した後、ＩｇＧクラスの抗体について０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝
液（ｐＨ８．９）で平衡化したプロテインＡアフィゲル
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．）カラムに吸着させ、上記
洗浄液で洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．
０）で溶出することにより精製した。
【００２８】
【表２】
【００２９】実施例２ イムノブロッティング （ａ） 材料の調製 ＴＩＭＰおよびＴＩＭＰ−２を産生するヒト皮膚線維芽
細胞培養液を材料とした。細胞の培養にはＭＥＭＥ粉末
培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ ＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕ
ｍ Ｅａｇｌｅ，Ｆｌｏｗ ｌａｂ．）を蒸留水に溶解
し、２６．２ｍＭ重炭酸ナトリウムを加えドライアイス
でｐＨを７．２に調整し、０．２μｍ東洋メンブレンフ
ィルターで除菌濾過したものを用いた。Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
から購入したヒト皮膚線維芽細胞ＣＣＤ−４１Ｓｋを１
５％仔牛胎児血清およびＮＥＡＡメディウム（ＮｏｎＥ
ｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｆｌｏｗ
ｌａｂ．）を含むＭＥＭＥ培地で５％炭酸ガス／９５
％空気中、温度３７℃、湿度１００％下で５〜８日間培
養した。８００ｒｐｍ、５分間で遠心して集めた細胞
を、０．２％ラクトアルブミン水解物、ＮＥＡＡメディ
ウム、１．７ｍＭ炭酸水素ナトリウムおよび１０Ｕ／ｍ
ｌ遺伝子組換えヒトインターロイキン１−αを含むＭＥ
ＭＥ培地中で、５〜７日間同様にして培養した。８００
ｒｐｍ、５分間の遠心後の上清を限外濾過により約１０
０倍に濃縮し、イムノブロッティング用試料とした。
細胞培養液を材料とした。細胞の培養にはＭＥＭＥ粉末
培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ ＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕ
ｍ Ｅａｇｌｅ，Ｆｌｏｗ ｌａｂ．）を蒸留水に溶解
し、２６．２ｍＭ重炭酸ナトリウムを加えドライアイス
でｐＨを７．２に調整し、０．２μｍ東洋メンブレンフ
ィルターで除菌濾過したものを用いた。Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
から購入したヒト皮膚線維芽細胞ＣＣＤ−４１Ｓｋを１
５％仔牛胎児血清およびＮＥＡＡメディウム（ＮｏｎＥ
ｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｆｌｏｗ
ｌａｂ．）を含むＭＥＭＥ培地で５％炭酸ガス／９５
％空気中、温度３７℃、湿度１００％下で５〜８日間培
養した。８００ｒｐｍ、５分間で遠心して集めた細胞
を、０．２％ラクトアルブミン水解物、ＮＥＡＡメディ
ウム、１．７ｍＭ炭酸水素ナトリウムおよび１０Ｕ／ｍ
ｌ遺伝子組換えヒトインターロイキン１−αを含むＭＥ
ＭＥ培地中で、５〜７日間同様にして培養した。８００
ｒｐｍ、５分間の遠心後の上清を限外濾過により約１０
０倍に濃縮し、イムノブロッティング用試料とした。
【００３０】（ｂ） 免疫染色 実施例２−（ａ）で調製した試料をドデシル硫酸ナトリ
ウムを含むポリアクリルアミド電気泳動に供した後、細
胞工学１＆２、１０６１〜１０６８、１９８３に記載の
田部の方法に従ってウェスタンブロッティングを行い、
各モノクローン培養上清と反応後、ペルオキシダーゼ標
識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａ
ｂ．）を用い間接法により免疫染色を行った。
ウムを含むポリアクリルアミド電気泳動に供した後、細
胞工学１＆２、１０６１〜１０６８、１９８３に記載の
田部の方法に従ってウェスタンブロッティングを行い、
各モノクローン培養上清と反応後、ペルオキシダーゼ標
識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａ
ｂ．）を用い間接法により免疫染色を行った。
【００３１】実施例１（ｊ）で得られたモノクローナル
抗体のうち、インターロイキン１−α刺激したＣＣＤ−
４１Ｓｋ細胞培養液から調製した試料を用いた場合、ク
ローン番号６８−６Ｈ４、６９−８Ｆ１、６９−９Ｅ
６、６９−１０Ｂ１１、６９−２４Ｈ６および６７−４
Ｈ１１の６クローンの抗体で陽性バンドが確認された。
なお、ＣＣＤ−４１Ｓｋ細胞培養液中には特開昭６３−
２１９３９２号公報に記載の早川らが発明した抗ヒトＴ
ＩＭＰモノクローナル抗体（クローン番号７−６Ｃ１）
に反応する分子量約３０ｋＤａのＴＩＭＰ−１が存在す
る。しかし、前記の実施例１（ｊ）で得たモノクローナ
ル抗体のうちクローン番号６８−６Ｈ４、６９−８Ｆ
１、６９−９Ｅ６、６９−１０Ｂ１１、６９−２４Ｈ６
および６７−４Ｈ１１から得られたものは分子量約２４
ｋＤａのＴＩＭＰ−２に特異的に反応し、分子量約３０
ｋＤａのＴＩＭＰ−１には反応しなかった。以上、イム
ノブロッティングによる結果を図１に示した。
抗体のうち、インターロイキン１−α刺激したＣＣＤ−
４１Ｓｋ細胞培養液から調製した試料を用いた場合、ク
ローン番号６８−６Ｈ４、６９−８Ｆ１、６９−９Ｅ
６、６９−１０Ｂ１１、６９−２４Ｈ６および６７−４
Ｈ１１の６クローンの抗体で陽性バンドが確認された。
なお、ＣＣＤ−４１Ｓｋ細胞培養液中には特開昭６３−
２１９３９２号公報に記載の早川らが発明した抗ヒトＴ
ＩＭＰモノクローナル抗体（クローン番号７−６Ｃ１）
に反応する分子量約３０ｋＤａのＴＩＭＰ−１が存在す
る。しかし、前記の実施例１（ｊ）で得たモノクローナ
ル抗体のうちクローン番号６８−６Ｈ４、６９−８Ｆ
１、６９−９Ｅ６、６９−１０Ｂ１１、６９−２４Ｈ６
および６７−４Ｈ１１から得られたものは分子量約２４
ｋＤａのＴＩＭＰ−２に特異的に反応し、分子量約３０
ｋＤａのＴＩＭＰ−１には反応しなかった。以上、イム
ノブロッティングによる結果を図１に示した。
【００３２】実施例３ サンドイッチ酵素免疫測定法 （ａ） モノクローナル抗体の固相プレート化方法 実施例１−（ｊ）で得られたＩｇＧ画分のうち実施例２
（ｂ）において陽性と認められた６つの画分よりクロー
ン番号６７−４Ｈ１１、６８−６Ｈ４および６９−２４
Ｈ６のものを選び、それぞれ、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解し、それを１００μｇ／ｍｌ（Ａ
２８０＝０．１５０）の濃度に調製後、マイクロプレー
ト（モジュールプレートＦ−８Ｈ、Ｎｕｎｃ）に１００
μｌずつ分注し、４℃、２４時間静置した。次にモノク
ローナル抗体を吸引除去し、０．１％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００
５％チメロサール含有１０ｍＭリン酸緩衝液を２００μ
ｌ分注し、４℃で保存した。
（ｂ）において陽性と認められた６つの画分よりクロー
ン番号６７−４Ｈ１１、６８−６Ｈ４および６９−２４
Ｈ６のものを選び、それぞれ、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解し、それを１００μｇ／ｍｌ（Ａ
２８０＝０．１５０）の濃度に調製後、マイクロプレー
ト（モジュールプレートＦ−８Ｈ、Ｎｕｎｃ）に１００
μｌずつ分注し、４℃、２４時間静置した。次にモノク
ローナル抗体を吸引除去し、０．１％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００
５％チメロサール含有１０ｍＭリン酸緩衝液を２００μ
ｌ分注し、４℃で保存した。
【００３３】（ｂ） 酵素標識モノクローナル抗体（Ｉ
ｇＧ−ＰＯＤ複合体）の調製法 （１） ＩｇＧ画分のＳＨ基の導入 前記の３つのＩｇＧ画分を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）に溶解し、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク
酸を各ＩｇＧ画分の１００倍モル量加え、３０℃で３０
分間反応させた。次に０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）（ｐＨ６．０）および１Ｍヒドロキシルアミン（ｐ
Ｈ７．０）を各々ＩｇＧ溶液量の１／５、１／１０、１
／５倍量加え反応を停止させ、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ５０カラム（ファルマシア）を用いたゲル
濾過によりＳＨ基導入ＩｇＧ画分を分取した。
ｇＧ−ＰＯＤ複合体）の調製法 （１） ＩｇＧ画分のＳＨ基の導入 前記の３つのＩｇＧ画分を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）に溶解し、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク
酸を各ＩｇＧ画分の１００倍モル量加え、３０℃で３０
分間反応させた。次に０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）（ｐＨ６．０）および１Ｍヒドロキシルアミン（ｐ
Ｈ７．０）を各々ＩｇＧ溶液量の１／５、１／１０、１
／５倍量加え反応を停止させ、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ５０カラム（ファルマシア）を用いたゲル
濾過によりＳＨ基導入ＩｇＧ画分を分取した。
【００３４】（２） ペルオキシダーゼのマレイミド基
の導入 上記（１）の操作とは別に、以下述べるようにして西洋
わさびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ、ベーリンガー・マン
ハイム）にマレイミド基を導入した。すなわち、ＰＯＤ
を１０ｍｇ／ｍｌの量で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に溶解し、そのＰＯＤに対して、２５倍モル量
のＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イ
ミド（ＥＭＣＳ、同仁化学）をジメチルホルムアミド溶
液として加え、３０℃、３０分間反応させた。これを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−５０カラム（ファルマシア）を用いたゲ
ル濾過によりマレイミド基導入ＰＯＤ画分を分取した。
の導入 上記（１）の操作とは別に、以下述べるようにして西洋
わさびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ、ベーリンガー・マン
ハイム）にマレイミド基を導入した。すなわち、ＰＯＤ
を１０ｍｇ／ｍｌの量で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に溶解し、そのＰＯＤに対して、２５倍モル量
のＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イ
ミド（ＥＭＣＳ、同仁化学）をジメチルホルムアミド溶
液として加え、３０℃、３０分間反応させた。これを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ−５０カラム（ファルマシア）を用いたゲ
ル濾過によりマレイミド基導入ＰＯＤ画分を分取した。
【００３５】（３） ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体の調製 上記（１）の如くして調製したＳＨ基導入ＩｇＧ画分に
対して上記（２）の如くして調製したマレイミド基導入
ＰＯＤ画分をＩｇＧ １：ＰＯＤ ３のモル比で加え、
この混合液を４℃、２０時間反応後、ＩｇＧの１０倍モ
ル量のＮ−エチルマレイミドを加えて未反応のＳＨ基を
ブロックした。これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ３４カラム（ファ
ルマシア）を用いたゲル濾過によりＩｇＧ−ＰＯＤ複合
体画分を分取後、０．１％ＢＳＡおよび０．００５％チ
メロサールを添加し、４℃保存した。
対して上記（２）の如くして調製したマレイミド基導入
ＰＯＤ画分をＩｇＧ １：ＰＯＤ ３のモル比で加え、
この混合液を４℃、２０時間反応後、ＩｇＧの１０倍モ
ル量のＮ−エチルマレイミドを加えて未反応のＳＨ基を
ブロックした。これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ３４カラム（ファ
ルマシア）を用いたゲル濾過によりＩｇＧ−ＰＯＤ複合
体画分を分取後、０．１％ＢＳＡおよび０．００５％チ
メロサールを添加し、４℃保存した。
【００３６】（ｃ） ２ステップサンドイッチ測定法 実施例２−（ａ）で調製したＴＩＭＰ−２を含有するヒ
ト皮膚線維芽細胞（ＣＣＤ−４１Ｓｋ細胞）培養液を限
外濾過により約１００倍に濃縮した後、１％ＢＳＡと
０．１Ｍ塩化ナトリウムとを含有した１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、前記（ａ）項で調製した
モノクローナル抗体結合マイクロプレートに１００μｌ
ずつ加えた。室温で１時間反応後、反応液を除去し、
０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）３００μｌで３回洗浄後、前記（ｂ）（３）
項で調製したＩｇＧ−ＰＯＤ複合体を１μｇ／ｍｌとな
る様に前記ＢＳＡ含有緩衝液で希釈し、反応を完了した
マイクロプレートに１００μｌずつ分注した。室温で１
時間静置後、反応液を除去し０．１Ｍ塩化ナトリウム含
有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００μｌで３
回洗浄した。更に、０．０２％過酸化水素含有クエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ４．６）に２ｍｇ／ｍｌとなる様
に溶解したＰＯＤ基質であるｏ−フェニレンジアミン
（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）をマイクロプレート
に１００μｌずつ分注した。
ト皮膚線維芽細胞（ＣＣＤ−４１Ｓｋ細胞）培養液を限
外濾過により約１００倍に濃縮した後、１％ＢＳＡと
０．１Ｍ塩化ナトリウムとを含有した１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、前記（ａ）項で調製した
モノクローナル抗体結合マイクロプレートに１００μｌ
ずつ加えた。室温で１時間反応後、反応液を除去し、
０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）３００μｌで３回洗浄後、前記（ｂ）（３）
項で調製したＩｇＧ−ＰＯＤ複合体を１μｇ／ｍｌとな
る様に前記ＢＳＡ含有緩衝液で希釈し、反応を完了した
マイクロプレートに１００μｌずつ分注した。室温で１
時間静置後、反応液を除去し０．１Ｍ塩化ナトリウム含
有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３００μｌで３
回洗浄した。更に、０．０２％過酸化水素含有クエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ４．６）に２ｍｇ／ｍｌとなる様
に溶解したＰＯＤ基質であるｏ−フェニレンジアミン
（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）をマイクロプレート
に１００μｌずつ分注した。
【００３７】室温で１５分間静置反応後、２Ｎ硫酸１０
０μｌずつを分注し反応を停止させた。その反応停止液
をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東洋ソー
ダ）でＡ４９２値を測定した。表３に示した如くクロー
ン番号６７−４Ｈ１１からの抗体をＩｇＧ−ＰＯＤ複合
体として、クローン番号６８−６Ｈ４、６９−９Ｅ６お
よび６９−１０Ｂ１１からの抗体を固相として用いた場
合、Ａ４９２値が１．０以上の高値を示す事が確認され
た。
０μｌずつを分注し反応を停止させた。その反応停止液
をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東洋ソー
ダ）でＡ４９２値を測定した。表３に示した如くクロー
ン番号６７−４Ｈ１１からの抗体をＩｇＧ−ＰＯＤ複合
体として、クローン番号６８−６Ｈ４、６９−９Ｅ６お
よび６９−１０Ｂ１１からの抗体を固相として用いた場
合、Ａ４９２値が１．０以上の高値を示す事が確認され
た。
【００３８】
【表３】
【００３９】実施例４ ヒトＴＩＭＰ−２の定量 （ａ） 抗体の選択 表３に記載した如くに固相プレート用抗体：酵素標識用
抗体の組み合わせとして、クローン番号６８−６Ｈ４：
６７−４Ｈ１１、６９−９Ｅ６：６７−４Ｈ１１、６９
−１０Ｂ１１：６７−４Ｈ１１、６８−６Ｈ４：６９−
２４Ｂ６の４種類を候補とした。これら４種類の組み合
わせの内いずれの組み合わせが１ステップサンドイッチ
測定法に適しているかを決定する為に、前記実施例２−
（ａ）項のＴＩＭＰ−２を含むヒト線維芽細胞培養上清
を試料に用いて表４に示す方法で１ステップサンドイッ
チ測定を行った。その結果、クローン番号６８−６Ｈ４
からの抗体を固相として用い、クローン番号６７−４Ｈ
１１からの抗体をＩｇＧ−ＰＯＤ複合体として用いた場
合にＡ４９２値は最高値を示した。
抗体の組み合わせとして、クローン番号６８−６Ｈ４：
６７−４Ｈ１１、６９−９Ｅ６：６７−４Ｈ１１、６９
−１０Ｂ１１：６７−４Ｈ１１、６８−６Ｈ４：６９−
２４Ｂ６の４種類を候補とした。これら４種類の組み合
わせの内いずれの組み合わせが１ステップサンドイッチ
測定法に適しているかを決定する為に、前記実施例２−
（ａ）項のＴＩＭＰ−２を含むヒト線維芽細胞培養上清
を試料に用いて表４に示す方法で１ステップサンドイッ
チ測定を行った。その結果、クローン番号６８−６Ｈ４
からの抗体を固相として用い、クローン番号６７−４Ｈ
１１からの抗体をＩｇＧ−ＰＯＤ複合体として用いた場
合にＡ４９２値は最高値を示した。
【００４０】上記のクローン番号６７−４Ｈ１１のハイ
ブリドーマは、微工研菌寄第１２６９０号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２６９０）の受託番号をもって、微生物工業技術
研究所に寄託されており、また、同クローン番号６８−
６Ｈ４のハイブリドーマは、微工研菌寄第１２６９１号
（ＦＥＲＭＰ−１２６９１）の受託番号をもって、同研
究所に寄託されている。
ブリドーマは、微工研菌寄第１２６９０号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２６９０）の受託番号をもって、微生物工業技術
研究所に寄託されており、また、同クローン番号６８−
６Ｈ４のハイブリドーマは、微工研菌寄第１２６９１号
（ＦＥＲＭＰ−１２６９１）の受託番号をもって、同研
究所に寄託されている。
【００４１】
【表４】
【００４２】１） １μｇ／ｍｌ ＩｇＧ−ＰＯＤ複合
体溶液（溶解緩衝液：１％ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリ
ウムおよび１０ｍＭＥＤＴＡ含有３０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）） ２） 生理食塩液 ３）２ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン溶液（溶解
緩衝液：０．０２％過酸化水素含有クエン酸−リン酸緩
衝液（ｐＨ４．６）） ４） ２Ｎ硫酸
体溶液（溶解緩衝液：１％ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリ
ウムおよび１０ｍＭＥＤＴＡ含有３０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）） ２） 生理食塩液 ３）２ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン溶液（溶解
緩衝液：０．０２％過酸化水素含有クエン酸−リン酸緩
衝液（ｐＨ４．６）） ４） ２Ｎ硫酸
【００４３】（ｂ） ヒトＴＩＭＰ−２の分離、精製 ヒト胎盤を材料とした。胎盤５個を細切し、１ｍＭ塩化
カルシウム、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００５
％ Ｂｒｉｊ３５含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に懸濁し、スパチュラで十分に混合し、遠心
分離（１０，０００ｒｐｍ，４０分，４℃）して得られ
た上清を８０％飽和硫安塩析、ウルトロゲルＡｃＡ５４
カム（ファルマシア）、レッド・アガロースカラム（Ｓ
ｉｇｍａＣｈｅｍ．Ｃｏ．）、Ｃｕ２＋飽和キレーティ
ングセファロースカラム（ファルマシア）、抗ヒトＴＩ
ＭＰ−１モノクローナル抗体結合セファロース４Ｂカラ
ム（クローン番号７−２１Ｂ１２使用、特開昭６３−２
１９３９２号公報記載参照）による各クロマトグラフィ
ーおよび高速液体クロマトグラフィー（逆相カラム、Ｓ
ｙｎｃｈｒｏｐａｋ ＲＰ−４，Ｓｙｎｃｈｒｏｍ）に
付し、ヒトＴＩＭＰ−２を得た。なお、各分離精製工程
時において固相プレートに前述のクローン番号６８−６
Ｈ４からの抗体を用い、ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体に前記の
クローン番号６７−４Ｈ１１からの抗体を用いて１ステ
ップサンドイッチ測定法によるＡ４９２値を測定し、そ
れを指標とした。
カルシウム、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００５
％ Ｂｒｉｊ３５含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に懸濁し、スパチュラで十分に混合し、遠心
分離（１０，０００ｒｐｍ，４０分，４℃）して得られ
た上清を８０％飽和硫安塩析、ウルトロゲルＡｃＡ５４
カム（ファルマシア）、レッド・アガロースカラム（Ｓ
ｉｇｍａＣｈｅｍ．Ｃｏ．）、Ｃｕ２＋飽和キレーティ
ングセファロースカラム（ファルマシア）、抗ヒトＴＩ
ＭＰ−１モノクローナル抗体結合セファロース４Ｂカラ
ム（クローン番号７−２１Ｂ１２使用、特開昭６３−２
１９３９２号公報記載参照）による各クロマトグラフィ
ーおよび高速液体クロマトグラフィー（逆相カラム、Ｓ
ｙｎｃｈｒｏｐａｋ ＲＰ−４，Ｓｙｎｃｈｒｏｍ）に
付し、ヒトＴＩＭＰ−２を得た。なお、各分離精製工程
時において固相プレートに前述のクローン番号６８−６
Ｈ４からの抗体を用い、ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体に前記の
クローン番号６７−４Ｈ１１からの抗体を用いて１ステ
ップサンドイッチ測定法によるＡ４９２値を測定し、そ
れを指標とした。
【００４４】精製により得られたＴＩＭＰ−２は、Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０，５７９〜５９９；１９７３記
載のＬａｅｍｍｌｉらの方法に従いドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミド電気泳動で調べたところ分子
量約２４ｋＤａの単一バンドを示した。
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０，５７９〜５９９；１９７３記
載のＬａｅｍｍｌｉらの方法に従いドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミド電気泳動で調べたところ分子
量約２４ｋＤａの単一バンドを示した。
【００４５】（ｃ） 標準曲線の作成 標準曲線は前記（ｂ）で得られたヒトＴＩＭＰ−２を用
いて作成した。図２に示したように６．３−５０ｎｇ／
ｍｌ（６３−５００ｐｇ／ウエル）の範囲で直線性が認
められた。また、定量感度は約１６ｐｇであった。
いて作成した。図２に示したように６．３−５０ｎｇ／
ｍｌ（６３−５００ｐｇ／ウエル）の範囲で直線性が認
められた。また、定量感度は約１６ｐｇであった。
【００４６】（ｄ） 血清および関節液中のＴＩＭＰ−
２の定量 健常人血清２検体、肝疾患患者血清１検体、半月板損傷
患者関節液１検体、慢性関節リウマチ患者関節液１検
体、および変形性膝関節症患者関節液１検体中のＴＩＭ
Ｐ−２を定量した。その結果を表５に示したが、血清、
関節液ともに定量感度以上のところで測定可能であっ
た。しかし、検体としてはこれらに限定されるものでは
ない。
２の定量 健常人血清２検体、肝疾患患者血清１検体、半月板損傷
患者関節液１検体、慢性関節リウマチ患者関節液１検
体、および変形性膝関節症患者関節液１検体中のＴＩＭ
Ｐ−２を定量した。その結果を表５に示したが、血清、
関節液ともに定量感度以上のところで測定可能であっ
た。しかし、検体としてはこれらに限定されるものでは
ない。
【００４７】
【表５】
【図１】ヒト皮膚線維芽細胞ＣＣＤ−４１Ｓｋ培養液の
ウェスタンブロット図であり、抗ヒトＴＩＭＰ−１モノ
クローナル抗体（クローン番号７−６Ｃ１、レーン
１）、抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体（クロー
ン番号６８−６Ｈ４、レーン２）、 抗ヒトＴＩＭＰ−
２モノクローナル抗体（クローン番号６９−８Ｆ１、レ
ーン３）、抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体（ク
ローン番号６９−９Ｅ６、レーン４）、抗ヒトＴＩＭＰ
−２モノクローナル抗体（クローン番号６９−１０Ｂ１
１、レーン５）、 抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル
抗体（クローン番号６９−２４Ｈ６、レーン６）、およ
び抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル（クローン番号６
７−４Ｈ１１、レーン７）を用いて、各レーンをそれぞ
れ染色したものを表わす図面に代る写真である。
ウェスタンブロット図であり、抗ヒトＴＩＭＰ−１モノ
クローナル抗体（クローン番号７−６Ｃ１、レーン
１）、抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体（クロー
ン番号６８−６Ｈ４、レーン２）、 抗ヒトＴＩＭＰ−
２モノクローナル抗体（クローン番号６９−８Ｆ１、レ
ーン３）、抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体（ク
ローン番号６９−９Ｅ６、レーン４）、抗ヒトＴＩＭＰ
−２モノクローナル抗体（クローン番号６９−１０Ｂ１
１、レーン５）、 抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル
抗体（クローン番号６９−２４Ｈ６、レーン６）、およ
び抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル（クローン番号６
７−４Ｈ１１、レーン７）を用いて、各レーンをそれぞ
れ染色したものを表わす図面に代る写真である。
【図２】クローン番号６８−６Ｈ４からの抗体を固相に
用い、クローン番号６７−４Ｈ１１からの抗体をＩｇＧ
−ＰＯＤ複合体に用いて１ステップサンドイッチ測定法
を行ったヒトＴＩＭＰ−２の標準曲線を示したものであ
る。
用い、クローン番号６７−４Ｈ１１からの抗体をＩｇＧ
−ＰＯＤ複合体に用いて１ステップサンドイッチ測定法
を行ったヒトＴＩＭＰ−２の標準曲線を示したものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 藤本 昇 富山県砺波市東幸町４番地18号 (72)発明者 張 建 富山県高岡市波岡555番地４号 (72)発明者 米沢 佳代子 富山県西砺波郡福岡町一歩二歩405番地 (72)発明者 酒井 智恵 富山県射水郡小杉町戸破3799番地６号 (72)発明者 大内 栄子 富山県高岡市野村335−１番地 (72)発明者 吉田 真一 富山県富山市中島４丁目13番地16号 (72)発明者 島崎 長一郎 富山県富山市大町１区南部23番地14号 (56)参考文献 国際公開90／14363（ＷＯ，Ａ１) 国際公開90／11287（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 マウスの抗体産生細胞とマウスミエロー
マ細胞との融合により得られたハイブリドーマを培養
し、培養液またはマウス腹水中からのモノクローナル抗
体を精製して得られたヒトＴＩＭＰ−２に特異性を有す
るモノクローナル抗体であって、ＤＳＧＮＤＩＹＧＮＰ
ＩＫＲＩＱ、ＤＴＬＳＴＴＱＫＫＳＬＮＨＲＹＱまたは
ＹＲＧＡＡＰＰＫＱＥＦＬＤＩＥＤの配列を有するポリ
ペプチドと反応性を有し、かつヒトＴＩＭＰ−１と交差
反応性を有しないモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 サンドイッチ法により酵素免疫学的にヒ
トＴＩＭＰ−２を定量する方法において、請求項１記載
のいずれか２種のモノクローナル抗体の組合せを用いる
ことを特徴とするヒトＴＩＭＰ−２の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4044312A JP3017591B2 (ja) | 1992-01-17 | 1992-01-17 | 抗ヒトｔｉｍｐ−２モノクローナル抗体の製法およびその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4044312A JP3017591B2 (ja) | 1992-01-17 | 1992-01-17 | 抗ヒトｔｉｍｐ−２モノクローナル抗体の製法およびその利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05244985A JPH05244985A (ja) | 1993-09-24 |
| JP3017591B2 true JP3017591B2 (ja) | 2000-03-13 |
Family
ID=12687971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4044312A Expired - Lifetime JP3017591B2 (ja) | 1992-01-17 | 1992-01-17 | 抗ヒトｔｉｍｐ−２モノクローナル抗体の製法およびその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3017591B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2864219B2 (ja) * | 1995-02-20 | 1999-03-03 | 富士薬品工業株式会社 | 遊離の活性型マトリックスメタロプロテアーゼ類の分別定量法 |
| US7041787B2 (en) | 2000-12-29 | 2006-05-09 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Design and use of advanced zinc chelating peptides to regulate matrix metalloproteinases |
| WO2018187453A1 (en) * | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Astute Medical, Inc. | Assays for timp2 having improved performance in biological samples |
-
1992
- 1992-01-17 JP JP4044312A patent/JP3017591B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05244985A (ja) | 1993-09-24 |
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