JP3085709B2 - 磁気分離機、磁気分離方法、リガンド測定方法ならびに分離方法 - Google Patents

磁気分離機、磁気分離方法、リガンド測定方法ならびに分離方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は、高勾配磁気分離（HGMS）によって、非磁
性試験媒体から、問題となる物質を分離するのに磁気粒
子（磁粉）を用いる磁気分離装置および方法に関するも
のである。
発明の背景 本発明は、生体特異的親和反応に関する各種の実験室
および臨床手順でとくに有用な、非磁性媒体から磁気粒
子を分離する磁気分離機および方法の改良に関するもの
である。このような反応は、一般に、広範囲の目標物
質、とくに細胞、タンパク質、核酸配列などの生体物質
の測定のために、血液、尿などの生体サンプルの試験に
用いられる。
ここで使用される用語「目標物質」とは、特異的結合
ペアの物質、すなわち相互作用親和性を示す一対の物
質、または一つの物質および構造を意味し、細胞成分、
生体特異的リガンド（配位子）および受容体を含む。こ
こで言う「リガンド」とは少なくとも１個の特性決定基
またはエピトープを有し、受容体により生体特異的に認
知され、それに結合されるような抗原、ハプテンおよび
各種の細胞関連構造などの物質を言う。ここで言う「受
容体」は、他の物質を実質的に排除して、特定のリガン
ドについて生体特異的結合親和性を有する物質、または
物質のグループを言う。生体特異的親和反応によって決
定される受容体には、抗原（ポリクローナルおよびモノ
クローナル）、抗体フラグメント、酵素、核酸、Clqな
どがある。生体特異的結合ペアの一部分の決定は、ペア
の他の部分との選択的相互作用によって左右される。
問題となる物質と、その特異的結合パートナーの間の
複合形成にもとづいて上記の目標物質を決定するには、
様々な方法がある。それぞれの場合に、手段が用いら
れ、それによって目標物質／結合パートナー複合形成の
発生や度合が決定できる。
たとえば、抗原を測定する競合的イムノアッセイ（免
疫測定法）の場合、試験サンプル中の、問題となる抗原
は、限られた量の特異的抗体結合部位について、既知の
量の標識抗原と競合する。従って、適当な反応期間のあ
と、特異的抗体に結合した標識抗原の量は、試験サンプ
ル中の抗原の量に反比例する。標識抗原ではなく標識抗
体（典型的なものはモノクローナル抗体）を用いた抗体
の競合的アッセイは、同じように機能する。その結果得
られる免疫複合体は、たとえば複合体または非結合抗原
の免疫吸収、物理化学的吸着または沈殿によって分離さ
れる。次に抗体に結合した標識抗原を定量し、既知の抗
原濃度から標準曲線を作成し、これから抗体の未知の濃
度を決定することができる。
これに対して、一般に「サンドイッチ」アッセイとし
て知られている抗原決定のための免疫測定アッセイは標
識つき分析物の代わりに標識抗体を使用する。免疫測定
アッセイを実施する場合、サンドイッチを形成するが、
その「層」は、抗体／多価（最少限二価）抗原／抗体と
なっている。
完全なサンドイッチ複合体（抗体／抗原／抗体）のそ
れぞれに結合している標識抗体の量は、試験サンプル中
に存在する目標抗原性物質の量に直接比例する。サンド
イッチ・アッセイは、ポリクローナル抗体では多段階
で、また独立した抗原決定基に向けられたモノクローナ
ルを用いるときはもっと少ない段階で行うことができ
る。
従来の競合的イムノアッセイでも、また上記の免疫測
定アッセイでも目標物質の定量には、自由標識リガンド
または標識受容体から結合（したリガンドまたは受容
体）を物理的に分離する必要がある。
結合／自由（物質）の分離は重力により、たとえば沈
殿によって、あるいは目標物質に結合させた細分化した
粒子またはビーズを遠心分離することによって行うこと
ができる。望むときには、結合／自由（物質）の分離を
しやすくするために、このような粒子またはビーズを磁
性にしてもよい。磁気粒子は技術上既知であり、また免
疫あるいはその他の生体特異的親和反応に用いられてい
る。たとえば、米国特許4,554,088、および「臨床化学
のためのイムノアッセイ」（pp.147−162,Hunter et
al.eds.,Churchill Livingston,Edinborough〔1983〕
を参照）。一般に、この目的のために磁気または重力分
離をしやすくする材料を用いることができる。
小さい磁気粒子は、生体機能性ポリマー、たとえばタ
ンパク質で有利なように被覆され、表面積がきわめて大
きく、適切な反応速度を示すので、生体特異的親和反応
に関連した分析で、非常に有用であることがわかった。
0.7〜1.5ミクロンの大きさの磁気粒子が特許文献に記載
されている。たとえば、米国特許3,970,518、4,018,88
6、4,230,685、4,267,234、4,452,773、4,554,088およ
び4,659,678である。これらの粒子のうちのあるもの
は、軽度に攪拌すると適切な懸濁特性を有し、免疫試験
のための有用な固相支持体であることが開示されてい
る。しかし、知られている限りでは、ある程度攪拌しな
いと現在市販されている磁気粒子は時間がたつと沈降
し、使用前に再浮遊させなくてはならない。これは、こ
のような試薬を使用するプロセスに、もう一つ段階を加
えることになる。
上記のような小さい磁気粒子は、一般に二つの広いカ
テゴリーに分けられる。第一のカテゴリーは永久的に磁
化された粒子を含む。第二のカテゴリーは磁場におかさ
れたときにのみ磁性となる粒子を含む。本書では後者を
磁気反応性粒子と呼ぶ。磁気反応性を示す物質は、時に
より超常磁性と呼ばれる。しかし、一部の強磁性材料、
たとえば磁性酸化鉄は、結晶の大きさが直径約300Aまた
はそれ以下では、磁気反応性として特徴づけられる。こ
れに対して、強磁性材料を大きい結晶は、磁場に露出さ
れたあと永久磁石特性を保持し、そのあと凝集する傾向
がある。P.Robinson et al:Biotech.Bioeng. XV:603−06（1973）を参照。
磁気反応性コロイド状磁鉄鉱が知られている。Owen
et alの米国特許4,795,698を参照。この特許は、真の
コロイドと同様の特性を示すポリマー被覆、サブミクロ
ンサイズの磁鉄鉱粒子に関するものである。
試験媒体からの磁気粒子を含む目標物質の結合・自由
分離のために用いられる磁気分離装置／方法は、磁気粒
子の性質と粒度に依存する。ミクロンサイズ強磁性の、
つまり永久的に磁化された粒子は、市販の磁気分離装置
によって溶液から容易に分離される。このような装置
は、試験媒体を保持する容器の外側に、１個の比較的廉
価な永久磁石を使用している。このような磁気分離機の
例は、Serono Diagnostics社（Norwell,MA）製造のMAI
A磁気分離機、DANAL社（Great Neck,N.Y.）製造のDYNA
L MPC−１、Advanced Magnetics社（Cambridge,MA）
製造のBioMag分離機がある。磁気固相ラジオイムノアッ
セイを行うこの種の装置の特殊適用が、L.Hersh et a
l.Clinica Chemica Acta 63:69−72（1975）に記載
されている。Ciba−Corning Medical Diagnostics社
（Wampole,MA）製造の同じような磁気分離機には平行に
配置された棒磁石の列が分離機の基部に取付けられる。
この装置には60本の試験管が収納され、各管の閉じた端
部は２本の棒磁石の間の凹部にはめられている。
セルローズ被覆磁気粒子を用いた自動連続流ラジオイ
ムノアッセイ装置が米国特許4,141,687に述べられてい
る。'687特許に挙げられた自動装置は、サンプル検出器
の制御下にプログラマ装置により所定の順序で操作され
る精巧な電磁トラップを含んでいる。
上記の磁気分離機には、磁石の方へ引きつけられる磁
気粒子がサンプル容器の内面に多層をなして形成される
傾向があり、磁気粒子が不純物といっしょに捕捉され、
激しく洗浄しても除去するのが難しいという短所があ
る。
コロイド状磁性材料は、強力な電磁石を用いても液体
から容易に分離できず、その変わりに高勾配界磁分離法
を必要とする。R.R.Oder:IEEE Trans.Magnetics,12:42
8−35（1976）、C.OwenおよびP.Liberti「細胞分離：方
法と選択的用途」第５巻、Pretlow and Pretlow ed
s.,Academic Press,NY（1986）,J.T.KemsheadおよびJ.
Ugelstad「磁気分子および細胞生化学」67,11−18（198
5）を参照。このような物質を濾過するのに通常用いら
れる勾配磁場はきわめて大きい磁力を発生する。このよ
うな粒子を様々に操作して、たとえば凝集剤を加えて、
試験媒体からコロイド状磁気粒子の磁気分離を行うため
のもう一つの有用な方法は、1989年８月４日に出願され
た同時系属出願、共同所有の米国特許出願389,697の主
題である。
高勾配磁気分離（HGMS）は、代表的には分離室を備え
た装置を用いて達成され、分離室内には従来型電磁石ま
たは超伝導磁石の棒の間に磁性ステンレス鋼ワイアの塊
が配置され、ワイアのまわりに大きい界磁勾配を発生さ
せ、これが磁気粒子を含む目標物質に強い引力を加え
る。
上記のような種類の市販の高勾配磁気分離機は、Milt
enyi Biotec GmbH（西ドイツ,Gladback）製造のMACS
装置であり、これは、永久磁石とともに非剛性スチール
ウール・マトリックスを詰めたカラム（柱）を使用して
いる。操作時には、スチールウール・マトリックスの近
くに発生する高い磁場勾配が磁気粒子を引きつけて保持
し、一方、非磁性試験媒体がカラムを貫流し、これによ
り除去される。コロイド状磁性成分を含むスラリーか
ら、磁性成分を分離するためスチールウール・マトリッ
クスを用いた同じような磁気分離機が、米国特許3,567,
026、3,676,337および3,902,994に開示されている。こ
の最後に述べた特許では、分離機は、連続移動素子とし
て磁場の影響下はいったり出たりできる磁性ウール・マ
トリックスを備えている。
このような先行技術の高勾配磁気分離装置のスチール
ウール・マトリックスは目標物質以外の生体物質を非特
異的に捕捉することが多く、これらの生体物質は充分に
洗浄し、目標物質を保持する粒子を再浮遊させないと完
全除去できない。さらに、多くの先行技術の高勾配磁気
分離装置のカラムの大きさは、かなりの量の実験物質を
必要とし、これによって様々な重要な実験室規模の分離
での使用が限定される。その上、スチールウール・マト
リックスは一部の感受性の高い細胞にとっては有害であ
る。
上記の問題を解決する有用な磁気分離機が、1990年９
月26日に出願された、同時系属出願、共同所有の米国特
許出願588,662の主題である。この同時系属出願の分離
機は、容器の外側に対向する一対の磁石を備えた磁気手
段と、試験媒体を保持する容器内に配置した磁気勾配強
化手段とにより構成される。磁気粒子は試験媒体から粒
子を分離し、または除去する役をする容器内の磁気手段
に付着する。
米国特許4,663,029は、磁場勾配強化部として磁性ウ
ール・マトリックスを用いる装置の改良である高勾配磁
気分離装置に関するものであり、また流体内の粒子の磁
化率（磁気感受率）の差によって分離を行う装置に関す
るものである。'029特許は、非磁性容器とこの容器に隣
接して伸びる磁化ワイアまたはロッドによって構成され
る分離機内にスラリーを通すことにより、その磁気モー
メントによってスラリーから粒子を連続磁気分離するた
めの装置について述べている。ワイアは、ワイヤの縦軸
に対して横方向の磁化成分をつくり出す磁場によって磁
化され、容器空間のあらゆる箇所に界磁勾配を伸ばし、
容器内を通る粒子に放射方向の力を加える。容器に対す
る磁場の方向に応じて、スラリー内の反磁性粒子はワイ
アに向かって引きつけられ、常磁性粒子ははねつけら
れ、磁場を容器の平面に対して通常90度回転すると、そ
の逆となる。
先行技術についての上記の考察によって、コロイド状
磁気粒子に関連した生体特異的親和反応にもとづく医学
的または生物学的分析を行う場合に、高勾配磁気分離が
ある程度の利点を有することは明らかである。しかし、
構造と操作が比較的簡単であり、分離室の外側に配置し
た勾配強化手段だけに依拠し、しかも磁場勾配を最大限
に大きくし、非目標物質の捕捉を少なくし、剪断力や他
の生体物質との衝突によって固定化された目標物質の喪
失をなくし標準マイクロタイタープレートウェルが使用
できるような、高勾配磁気分離装置および方法を提供す
ることが望ましい。このような開発は各種の実験室規模
の分離、とくにイムノアッセイや細胞選別を行う上で、
明らかに実用性がある。
発明の概要 本発明の目的は、試験媒体から磁気反応的コロイド状
粒子を分離するため、非磁性試験媒体内に高勾配磁場を
発生できる磁気分離装置および方法を提供することであ
る。比較的大きい磁気粒子は水性媒体から沈降する傾向
があるが、これとは異なり、磁気反応性コロイド状粒子
は、不特定の期間のあいだ、水性媒体に懸濁状態のまま
とどまり、こうして目標物質に容易に接近できるように
なる。
本発明の磁気分離機は、少なくとも１個の容器と、こ
の容器内で試験媒体内に高勾配磁場を発生することので
きる磁気手段とによって構成される。容器は内部表面部
を有する周壁を備え、その中に磁気反応性コロイド状粒
子を含む試験媒体を収納する（以下、「分離する試験媒
体」と呼ぶ。）下記にさらにくわしく述べるように、磁
場勾配発生手段が、容器の外側に配置され、容器の内側
に「開いた」界磁勾配をつくり出し、この場合、磁場
は、壁から最も遠くにある試験媒体よりも、容器の内側
壁面に沿った試験媒体での方が強い。
分離する試験媒体が定常状態にあるとき、たとえばバ
ッチ式操作のときは適切な容器は、マイクロタイターウ
ェル、試験管、一端が閉じた毛細管、望みの分離を行う
ため一つの小室を区切る非磁性壁つき円筒容器を含んで
いる。さらに、１個をこえるサンプル容器を保持できる
キャリア（保持体）を使用することによって、複数の試
験サンプルを同時に処理できる。一つの好ましい形態で
は、キャリアはキャリアの周辺部のまわりに複数の容器
を保持する手段を含む。
試験媒体が連続的に分離機を通過するときは、適切な
容器は両端が開いた導管または管である。このような容
器はできれば非磁性、たとえばガラスまたはプラスチッ
クであり、円筒形であることが望ましい。できれば容器
は一端に試験媒体を受けるための入口があり、試験媒体
が容器の中央部分で高い磁場勾配に露出されることが望
ましい。この特定の実施例では、容器はまた、両端間で
容器内に間隔をおいて配置した１個またはそれ以上の非
磁性バッフル（じゃま板）を備えることができる。この
バッフルは、試験媒体が容器を通って軸のまわりの部分
へ流れる通路の断面積を制限するような寸法となってい
る。できればバッフルは流れ方向に沿って、放射方向下
方へ傾斜し、それと接触する磁気反応コロイド状粒子を
壁の方へ導くようにすることが望ましい。できれば、導
管は入口と反対側の端部に横方向に間隔をおいて配置さ
れた出口手段を備えることが望ましい。磁気粒子を収集
するため、容器の出口端の周辺部に、一つの出口手段を
設けるとよい。試験媒体を排出するために出口端に、も
う一つの出口手段を中央に設ける。
とくに好ましい実施例では、磁場発生手段は、４個ま
たは６個の永久磁石または電磁石を備える。磁石は容器
を収納する中空部を区切るように配置される。この実施
例では、中空部の反対側にある磁石の極性と位置付け
は、容器内の試薬媒体内部に高勾配磁場を発生させる磁
束線をつくり出すようなものとする。磁石はできれば円
筒形の強磁性ヨーク（枠）内に収納し、このヨークは装
置によってつくり出される磁界強さを高める役目を果た
す。この「多極」配置によってつくり出される磁場勾配
の特徴は中空部の縁部近くで磁場がきわめて強く、中空
部の中央では実質上磁場がないことにある。従って、中
空部の縁部近くの、容器の壁に隣接する試験媒体内の磁
気粒子は、磁界強さがゼロにまで落ちる中空部の中心
の、容器の壁から最も遠くにある試験媒体内の粒子に比
べて、かなり大きい磁力を受ける。
とくに、磁石によって区切られる中空部が、容器また
はキャリア（保持体）の断面よりもずっと大きいときに
は、磁束集中手段を含めると有利である。誘導磁場によ
って磁化される、または磁化可能な様々な幾何学的形状
のポールがこの目的に適している。各磁石を互いに対し
て固定位置に保持するため、磁気手段を含む磁石を磁気
的に、あるいはたとえばエポキシ樹脂で接着して、ヨー
クに結合してもよい。
本発明の実施にあたって好んで用いられる、とくに比
較的粒度の小さい磁気粒子の物理的性質によって、知ら
れている限り従来達成できなかったような効率が得られ
る。さらに、試験媒体と接触する容器の壁の露出表面積
に対して、試験媒体に加える磁気粒子の量を調節するこ
とによって、また磁場の磁束線と実質上同じ広がりをも
つこのような露出表面の方向を調節することによって、
磁気粒子を容器壁の露出表面に沿って、実質的に一つの
層に付着させ、また磁気粒子およびこれによって保持さ
れる物質または材料の大きさにほぼ対応する厚さの層に
することができる。このようにすることにより、固定化
された磁気粒子内の非特異的結合物質の吸収は実質上無
視できる。
本発明の方法によって、非磁性試験媒体から磁気反応
性コロイド状粒子を分離する場合、粒子はまず非磁性試
験媒体内に分散され、その中で安定した懸濁液を形成す
る。通常は、磁気粒子は試験媒体内の目標物質に特異的
に結合できる受容体を含んでいる。定常状態で試験媒体
から目標物質を分離したいときは、試験媒体と、受容体
・磁気粒子抱合体を入れた適当な容器をバッチ処理のた
め磁気分離機内に入れる。容器のまわりに配置された外
部磁気手段は、試験媒体内に磁場勾配をつくり出し、こ
れによって磁気粒子は壁の方へ移動し、これに付着す
る。
キャリア内に保持した複数の容器を使用する本発明の
方法では、磁場勾配によって、試験媒体内の磁気反応性
コロイド粒子は、磁気手段に最も近い各容器の壁の方へ
移動し、これに付着する。この方法によれば、キャリア
内の各容器の壁の方向は、磁気手段に対して調節するこ
とができ、これによって磁気粒子を各容器の壁のまわり
にさらに均等に付着させることができる。
本発明による方法のもう一つの実施例では、分離され
る試験媒体は分離機を貫流させることができる。磁場勾
配強化手段は、充分な強さの「開かれた」磁場勾配をつ
くり出して、所定の速さで動く試験媒体から磁気粒子を
引きつけ、それを壁部に付着させる。非磁性試験媒体は
出口端で容器から排出される。この方法の一つの関連実
施例では、容器が１個またはそれ以上のバッフル（じゃ
ま板）を含み、分離される試験媒体は、導管の一端にあ
る入口へ注入される。試験媒体が導管内を移動するにつ
れて、試験媒体内の磁気粒子は磁気手段によって導管の
壁の方へと引きつけられ、バッフルと接触する。バッフ
ルは粒子を分離容器の壁の方へ移動するよう配置されて
いる。磁気手段は、粒子を分離容器の内壁に付着させる
よう、また粒子が壁に沿って下降し入口の反対端で壁の
周辺に沿って設けられた１個またはそれ以上の出口で収
集されるよう操作できる。試験媒体は、入口端の反対端
部の、導管中央部にある粒子出口（１個または複数）か
ら横方向に間隔をおいて配置された出口で除去できる。
本発明の方法を実施する場合、非磁性試験媒体は分離
機から除去でき、一方で磁気粒子は容器の壁に保持さ
れ、希望するようにその後の処理を行うことができる。
このように生体特異性親和反応に関連した分析を行うこ
とによって、目標物質を含む磁気粒子の再懸濁を効果的
に回避することができる。従って、この方法は生体分析
試験に要する処理時間と費用を実質的に削減する。
また、本発明によれば、ここに述べた分離方法を実施
するに当たって、コロイド状磁性ギヤ抗マウスFc粒子な
どの磁性捕捉剤を加える前に、試験媒体内に過剰に存在
するいくつかの試薬を除去する必要がないことが発見さ
れた。
このような発見は、非結合標識モノクローナル抗体の
除去を回避することによって、たとえば分離手順を一般
に簡略化できるだけでなく、細胞に対して行う生体分析
手段、たとえば臨床的に興味のある細胞分離における細
胞存在率を高めることができる。そこで、本発明はま
た、特性決定基を有する膜含有生体成分を、次の各段階
によって試験サンプルから分離する方法を提供する。す
なわち、決定基に対する結合特異性を有する受容体を、
受容体を決定基に結合させるに充分な量だけ、また余分
な受容体を試験サンプル内に提供するに充分な量だけ、
試験サンプル内に導入する段階と、余分な受容体の存在
下で、決定基結合受容体に結合する多価の捕捉剤を試験
サンプル内に導入する〔ここで決定基結合受容体の少く
とも１つで、生体成分・受容体・捕捉剤複合体を形成
し、捕捉剤はコロイド状磁気粒子と結合している〕段階
と、高勾配磁場の影響下で試験サンプルからこの複合体
を分離する段階、である。
上記の説明から、構造と操作が比較的簡単であり、試
験媒体から、目標物質を含む（保持する）磁気粒子を効
率的、また効果的に分離できる分離装置および方法を本
発明が提供することが理解されるであろう。
図面の簡単な説明 図１は、説明のため装置の一部を切裂図とした本発明
による磁気分離装置の透視図である。
図２は、図１に示した装置の平面図である。
図３は、６個の磁石を有する磁気手段を備えた本発明
の関連実施例の平面図である。
図４は、数個の容器がキャリア（保持体）内に保持さ
れた本発明の関連実施例の断片的透視図である。
図５は、貫流試験容器が内部バッフル（じゃま板）を
備えた本発明のもう一つの実施例の透視図である。
図６は、図５の装置の垂直断面図である。
同じ参照符号は、図面内の同じ部品を示す。
好適な実施例の説明 図面を参照して本発明の好適な実施例および方法につ
いて詳細に説明する。
本発明の磁気分離装置および方法は、生体特異的親和
反応に関連した各種の実験室手順および臨床手順でとく
に有用である。このような手順では、磁気反応性でコロ
イドの粒子（すなわち、超常磁性であり、また非磁性試
験媒体内で懸濁状態にとどまることのできる粒子）が用
いられ、またこの粒子は試験サンプル内の、問題となる
物質を結合することのできる受容体を含んでいる。この
方法では、受容体が目標物質を結合したあと、磁気分離
機が高勾配磁気分離によって試験媒体から磁気粒子を除
去する。
このような生体特異性親和反応は、広範囲の目標物質
を測定するため、生体サンプルの試験に用いられ、目標
物質の代表的なものとしては細胞、細胞成分、細胞亜集
団（真核および原核）、細菌、寄生虫、抗原、特異性抗
体、ビタミンなどの特異的生体因子、ウイルスや遺伝子
プローブ分析の場合の特異的核酸配列がある。従って本
発明による磁気分離装置および方法は、細胞の分析また
は分離のための細胞分離を実施するのに使用することが
でき、これには、たとえば、Ｔ細胞リンパ腫細胞株から
Ｔ細胞を、Ｂ細胞リンパ腫細胞株からＢ細胞を、白血球
からCD4陽性細胞を、白血球からリンパ球を、正常細胞
から腫瘍細胞を、また骨髄細胞から幹細胞を分離するの
に使用できる。
また、本発明の方法は、単球、顆粒球、その他の細胞
の免疫特異的分離、希有細胞の除去、ナチュラルキラー
細胞の除去、網状赤血球の測定、たとえば膜電位の変化
を測定するための好中球機能のアッセイ、酸化バースト
分析、食作用、アッセイおよびオプソニン化研究などに
用いることができる。
同様に、この磁気分離装置および方法は、細菌または
寄生虫の分離あるいは分析に使用することができ、これ
には、糞便、尿、スラッジ、スラリーおよび水（たとえ
ば、地下水または河川）からの各種細菌および寄生虫の
分離が含まれる。また本発明は、食品（液体、固体）、
痰および尿中の各種細菌を分離するのに使用することが
できる。
この発明の実施に使用するに適した磁気粒子は、真の
コロイドと同じ特性を示す粒子である。このような粒子
の特徴はサブミクロン級の粒度を有することであり、こ
れは一般に約200ナノメートル（nm）（0.20ミクロン）
未満であり、また長時間にわたって溶液からの重力分離
に対して安定していることを特徴としている。（磁気粒
子の）適切な物質は超常磁性物質と結晶コアと、それを
取囲む分子によって構成され、各分子は磁性コアに物理
的に吸収され、あるいは共有結合によって付着し、安定
したコロイド特性を示す。コロイド粒子の大きさは、完
全な磁区を含まないほど充分に小さいものであり、その
ブラウンエネルギーは、その磁気モーメントを超えるも
のである。その結果、これらのコロイド状磁気粒子の北
極、南極、整列、およびそのあとの相互吸引／反撥は、
かなり強力な磁場でも起こるとは考えられず、これがそ
の溶液安定性に貢献している。従って、コロイド状磁気
粒子は、強力な電磁石によっても溶液から容易に分離で
きないが、その代わりに、離散粒子を分離できるために
は、粒子が懸濁状態にある試験媒体内に、比較的高勾配
の磁場が発生することを必要とする。
上記のような性質をそなえた磁気粒子は米国特許4,79
5,698に述べられたように調製することができ、その開
示内容は本明細書で完全に述べられたかのように、ここ
に引照され組込まれている。
細胞分離のためには、試験媒体は通常は、血液、尿、
痰、または分泌物などの適切に準備された体液から調製
される。コロイド状磁気粒子は緩衝液中の試験媒体に加
えることが望ましい。この目的に達した緩衝液はウシ血
清アルブミン（BSA）５％と、生体親和性のリン酸塩溶
液95％からなり、場合によって比較的少量のデキストロ
ース、塩化ナトリウムおよび塩化カリを含む。緩衝液は
等張性でpH値は約７とする。タンパク質は分析を妨げる
相互作用を低下させる役目を果たす。目標物質は磁気粒
子を導入する前、後あるいは導入と同時に試験媒体に添
加することができる。本発明による方法は、コロイド状
磁気粒子の拡散制御溶液運動を利用しており、これは試
験媒体に熱を加えることによりさらに促進される。試験
媒体はその中にある受容体と問題となるリガンドの間の
結合を高めるため通常、インキュベートされる。インキ
ュベーションは普通、室温か、または試験媒体の凍結点
（すなわち４℃）のやや上の温度で行う。時によりイン
キュベーションは37℃で行うことができる。インキュベ
ーション時間は通常は、比較的短時間（すなわち、約２
〜15分）である。受容体とリガンドの接触を容易にする
ために、試験媒体をインキュベーションの間攪拌した
り、かき立てたりする。
緩衝液のごく一部を適当な陰イオン多価電解質で置換
えると試験媒体内の目標物質以外の物質への受容体の結
合（つまり、非特異的結合）はずっと押さえられる。Ro
hm and Haas社（Philadelphia,P.A）から入手可能なT
amol 850の商品で販売されている市販のスケール防止
剤を用いると、満足な結果が得られた。Tamol 850はポ
リメタクリル酸の水性溶液として販売されており、分子
量は12,000（重量平均）、全固形分29〜31％、密度9.9
lbs/gal（25℃）、ブルックフィールド粘度125〜325
（25℃）、スピンドル／速度は＃２＠60である。本発明
の実施時に非特異的結合を低下させるには一般に、リン
酸緩衝液に（活性ベースで）約0.1〜３％のTamol 850
を添加するとよい。
本発明による方法を実施して、様々な生体物質を余分
な受容体を含む試験媒体から磁気分離する場合、問題と
なる生体物質に選択的に結合する抗体が通常、受容体と
して用いられる。この目的のためにはモノクローナル抗
体を用いることが好ましい。しかし望むときは抗体産生
細胞または抗原処理細胞のための抗原、コンカナバリン
Ａ、大豆アグルチニン、小麦胚芽アグルチニンなどのレ
クチン類、ビオチン標識試薬またはハプテン標識試薬な
どを含む非抗体受容体を用いることができる。
捕捉物質は、生体物質・受容体・捕捉物質複合体を形
成するため、受容体に選択的に結合することのできる物
質である。適当な捕捉物質としては、Igが受容体として
用いられるプロテインＡまたはプロテインＧ、ビオチン
標識試薬が受容体として用いられるアビジン、およびハ
プテン標識試薬が受容体として用いられる抗ハプテンが
ある。炭水化物または糖タンパク質成分を含む膜含有生
体物質に選択的に結合するレクチン受容体（たとえば、
コンカナバリンＡ、大豆アグルチニンまたは小麦胚芽ア
グルチニン）の捕捉を容易にするため、ビオチンまたは
ハプテンを用いてもよい。この目的に適したハプテン／
抗ハプテンのペアとしては、DNP（ジニトロフェノー
ル）／抗DNP、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ま
たはアルサニル酸／抗アルサニル酸がある。捕捉物質
は、高勾配磁場によって分離が可能なコロイド状磁気粒
子を含むことが好ましいが、望むときは受容体はコロイ
ド状磁気粒子を含んでよい。
問題となる物質に受容体が結合したあと、試験媒体か
らのコロイド状磁気粒子の磁気分離を、本発明の装置お
よび方法を用いて実施する。試験媒体を、希望に応じて
バッチ式処理または連続処理のための適切な分離容器に
入れ、これを貫流させる。容器の外周のまわりに配置さ
れた磁気手段が、容器の壁に対して横方向に、試験媒体
内に高勾配磁場または磁束を発生させる。磁気手段は、
容器のまわりに交互に位置する複数の北磁極と複数の南
磁束を含んでいる。本発明のいくつかの好ましい実施例
によれば、４個または６個の磁石が等間隔で容器を取り
込み、磁場が容器の壁に沿って実質的に均等となるよう
にする。このようにして発生した高勾配（磁場）によっ
て、磁気粒子は容器の壁面に向かって移動し、粒子は壁
面に付着して容易に試験媒体から分離できるようにな
る。
図１と図２は、本発明にもとづく磁気分離機の一つの
実施例を示す。分離機21は、周壁25を有する容器23と、
試験媒体を受けるための開放上部によって構成される。
また、磁気分離機は４個の磁石27を含み、これら磁石の
内方に容器を収容するための中空部33が形成される。磁
石27は、たとえばそれらが接着によって取付けられてい
る円筒形強磁性ハウジングまたはヨーク31の内面に沿っ
て等間隔で配置されている。希望するときは、磁石には
異なる寸法の容器を収納するために中空部33の横方向寸
法を変えることのできる極片29など磁束集中手段を備え
ることができる。また磁場をもっと均等に放射状にする
極片などの磁束集中手段を備えることができる。
図１と図２に示したように、試験媒体を保持するのに
用いる容器はマイクロタイターウェルである。この容器
は磁石の各面によって区切られた中空部33と実質的に同
軸上に配置される。この位置で、壁部に隣接する試験媒
体35内の磁場は、磁石によって発生する磁場に近づく。
これと対照的に、中空部33の軸37に沿って配置された容
器の部分、つまり、壁から最も遠くにある試験媒体内に
は実質上、磁場はない。
試験媒体に露出されたマイクロタイターウェルの壁部
には、コロイド状磁気粒子を付着させるための充分な表
面積がある。上記のような条件下で使用した場合、本発
明による磁気分離機の利点として、磁気コロイドの量を
適切に調節することによって、粒子は磁気勾配の高い媒
体と接する表面にほぼ均等に沈着するようになる。その
結果、粒子は壁の内側表面の広い部分に、効果的に単一
の層となって沈着し、これは先行技術の磁気分離機で見
られるような、もっと小さい表面に形成されるときのよ
うに潜在的干渉物質を捕捉しやすい多重層または粒子凝
集物とは異なる。たとえば、IgG保持磁気コロイドを用
いた実験では酵素を混合したコロイドを分離容器の側で
収集するとき、コロイドが層になって蓄積し始めるにつ
れて酵素が捕捉されることがわかった。これに対して、
本発明ではコロイド状磁気粒子は容器表面上に充分に薄
く沈着し、潜在的干渉物質は実際上捕捉されない。この
目的のためには、ほぼ連続的な単一層に沈着するとき
に、試験媒体内のすべての磁気粒子によって占められる
と思われる表面積よりも壁部の凝集物収集表面積が約２
倍大きくなるように、試験媒体と接触する容器壁面の部
分を選ぶことが好ましい。
永久磁石装置では、極表面での外部磁気手段（図２の
磁石27）の磁界強さは、４〜10KGaussの範囲にあるべき
であり、より好ましくは約６〜8KGaussであるべきであ
る。各磁石と、図１と図２に示す容器の間の距離は一般
に約0.1〜2.0cmであることが好ましく、約0.5cmである
ことが最も好ましい。外部磁石の磁界強さは充分に大き
くあるべきであり、磁石と、試験媒体のための容器23の
間の距離は、磁気粒子の効率的分離を行うに充分な短い
ものとすべきである。電磁石を用いると、表面積で約15
〜30KGaussのかなり高い磁界強さを達成することができ
る。このようにして、きわめて高勾配の磁場が得られ
る。
中空部33は、容器23の操作のため充分な余分の空間を
もって磁石により形成すべきである。たとえば、図に示
した位置に容器23を上昇させ保持するため昇降装置（図
示せず）を配置してもよい。
図１と図２に示した極片29は、磁化可能な材料ならど
のようなものででも作ることができる。極片は台形断面
の磁化体の形のものが図に示されているが、その他の
形、たとえば３角形断面に作ってもよい。このような形
態は、各磁石27から発せられる磁束の集中を助ける。極
片29は磁気吸引によって磁石27の表面上の定位置に保持
してもよい。あるいは極片が磁石本体と一体となるよう
に磁石27を作ってもよい。
図３は、図１と図２に示した磁気分離機に類似した本
発明による磁気分離機のもう一つの実施例を示してい
る。図３の分離機121は円筒形または類似の形をした容
器123により構成されている。容器はバッチ式処理のた
めの試験管のように一端が閉じられたものでもよく、ま
た連続処理のための毛細管または大径管のように両端が
開いたものでもよい。容器には壁部125と、分離する試
験媒体を受けるための開口部がある。また分離機は、容
器のまわりに等間隔で配置された６個の磁石127によっ
て代表される磁気手段を含んでいる。
図４は、図１と図２に示した本発明による磁気分離機
の一つの変形例である。図４では、分離機221は、キャ
リア241によって保持された複数の容器223と、キャリア
の外部にある磁気手段を含んでいる。各容器には周壁22
5と開放上部がある。磁気手段はキャリアのまわりに同
心状に配置された曲面をそなえた４個の磁石227により
構成されている。
キャリア241は非磁性基部243と、基部に取付けた個別
の非磁性小室253により構成されている。各小室は容器2
23のうちの１個を直立位置に保持するような寸法に作ら
れている。
図５と図６は、本発明による磁気分離機のもう一つの
実施例を示している。磁気分離機321は円筒形容器323を
含み、このいずれの端部には分離する試験媒体を容器を
通して貫流させるための開口部がある。また分離機は容
器のまわりにほぼ等間隔に配置された４個の磁石327を
含んでいる。
図５と図６に示した容器には、容器内部の内部断面空
間362を区切る周壁325がある。容器の一端には入口363
があり、これは壁部と中央部の間の内部断面空間の中央
部分365へ試験媒体を入れることのできるような寸法に
作られている。また壁部325への流れの方向に、バッフ
ル下方へ傾斜している。従って、容器内を通るとき、磁
気反応性コロイド粒子は磁石327によってバッフルへま
た壁部へと引きつけられる。バッフルは、磁場勾配が粒
子と壁部に付着させるに充分強力となる点へと磁気粒子
を誘導する。容器にはまた少なくとも２個の出口があ
る。一つの出口369は粒子を収集するため壁の周辺に沿
ったところにある。第二の出口371は非磁性試験媒体の
排出のため容器の軸と整列している。
試験媒体が磁気粒子を容器壁部へ移動させ、それに付
着させるに充分な時間にわたって磁場を受けたあと、上
記のような磁気分離機を用いて試験媒体から磁気粒子を
分離することができる。試験媒体の非磁性成分は、容器
をまだ分離機に入れたまま傾瀉または吸引によって除去
できる。容器が分離機内に残っている間に緩衝液、洗浄
液などを加えて壁に接触させ、実質上、残留非磁性成分
がなくなるように付着している磁気粒子を洗浄する。希
望するときは洗浄液を除去し、このプロセスをくり返
す。磁気粒子を再懸濁させることが有利なときは、容器
を磁場から取り去り、操作して、磁気粒子が壁部から外
れ、適当な液状媒体内に再懸濁して分析をしやすくする
ことができる。
本発明による磁気分離装置および方法によって、一次
インキュベーション混合物の拡散制御溶液運動を有利に
利用することができる。さらに、磁気的に固定化された
コロイドに対して定量を含む各種の分析方法を実施する
ことができる。このような段階には非特異的結合物質を
除去するための洗浄、二次免疫化学反応または検出反応
（たとえば、酵素、蛍光または化学発光反応）が含まれ
る。
試験媒体を除去したあと容器壁部に付着した磁気粒子
を保持する能力は、かなりの実用性がある。いくつかの
作業をこのようにしてさらに効率よう行うことができ
る。たとえば個別の再懸濁段階を回避しながら行う目標
物質（たとえば、細胞、反応混合物の標識成分）の洗浄
やすすぎなどである。さらに磁気粒子によって行われる
標識免疫反応性物質と目標物質の相互作用に関する反応
のような二次反応を、壁部に付着した粒子でもっと効率
的に行うことができる。この場合にもコロイド状磁気粒
子の再懸濁を回避できる。さらに、本発明にもとづく酵
素標識イムノアッセイを実施するに当たっては、分離装
置内に固定化したコロイド状磁気粒子に直接、基質イン
キュベーションを行うことが望ましい。
本発明の磁気分離方法をバッチ方式で、つまり上記の
ように貫流方式でなく定常システムで行うと有利であ
る。目標物質を保持する固定化された磁気粒子が、他の
粒子との衝突によって移動することがない。さらにバッ
チ方式では、流れる試験媒体により発生する剪断力によ
る固定化磁気粒子の移動がなくなる。言い換えれば、壁
部に対する磁気粒子の付着が充分に強力なので、磁気粒
子を壁部から移動させずに、洗浄や二次反応や他の試薬
との相互作用を行うことができる。さらに、粒子が反応
や処理を受ける前に容器が磁場から外されても、容器壁
部に対する磁気粒子の付着はある程度維持される。
しかし、用途によっては、貫流プロセスでの使用に適
した磁気分離機を使用できることが、きわめて望まし
い。たとえば、貫流プロセスは均一な種類の物質を大量
に分離する場合に、きわめて望ましい。驚くべきこと
に、本発明にもとづく分離機は、貫通プロセスを用いた
場合に通常発生する上記のような粒子移動の問題を防止
できる。
一般に、磁場から取り出したあと、磁気粒子は容器壁
から比較的容易に分離できる。改良緩衝剤または浴槽音
波処理器で壁部に接触することにより、粒子を移動でき
る。あるいは粒子をプローブ音波処理器で壁部から取り
外して収集することができる。
上記の多極磁気分離装置では近接する隣同士の極面が
逆の極性になっているが、これによって高勾配磁場が形
成され、勾配の大きさは極面での磁界密度および反対極
の分離距離によって制限される。
外部に置いた強磁性材料（細いワイア、棒、球体な
ど）に磁場を誘導することによって形成される勾配磁場
に比べて、本発明による多極装置は、対抗する各極の中
心における磁界強さがゼロであるため、実質的に有利で
ある。従って、発生する勾配はゼロを超える磁場をつく
り出す能力によってのみ制限される。
以下に示す例は、本発明を構成し、またこれに用いら
れる方法やプロセスを詳細に記述し、また本発明を実施
するため発明者が考える最良の形態を定めるものである
が、本発明を限定するものと解釈すべきではない。各例
で示した温度は、別に指示しない限りすべて℃である。
実施例１ 本発明にもとづく磁気分離を実施する場合に、多極装
置によってつくり出される高勾配磁場の有用性を立証す
るために、４極および６極装置を製作し、試験した。こ
の目的のために希土類永久磁石を使用した（Crumax 35
5,Crucible Magnetics社;Elizabethtown,KY）が、望む
ときには電磁石を使用することもできる。図１〜３に示
したものに似た４極および６極装置を、内径2.5イン
チ、長さ5cmの円筒形鋼管（水道設備業者から入手でき
る）の形をしたヨークと、この円筒の内壁に配置した棒
磁石とで構成した。Crumax 355棒磁石（1.27×1.27×5
cm）（1.27cmの辺のうちの一方の方向に磁化）を円筒の
内面に取付け、棒磁石の長い方の辺を円筒の軸に平行に
した。４極装置では、円筒の軸に直角方向の面に対して
90゜、180゜、270゜、360゜に４個の棒磁石を配置し
た。６極装置も同じように製作したが、６個の棒磁石は
円筒形ヨークのまわりに、60゜、120゜、180゜、240
゜、300゜、360゜で配置した。４極および６極の両装置
とも、磁石の極性はヨークのまわりで交互に変えた。こ
のように構成した４極および６極の装置で、対抗する磁
石の各面の間隔は3.4cm（極面ギャップ半径＝1.7cm）で
あり、各極面での磁束密度はガウスメータ（Applied M
agnetics Laboratory,Baltimore,MD）で測定して5.5KG
aussであった。中央での磁場は０であり、平均磁場勾配
は3.2KGauss/cmであった。
小さい磁気粒子、または磁気粒子が結合している細胞
を放射方向に分離するための４極および６極装置の有効
性をしらべるために、次のような実験を行った。すなわ
ち、ウシ血清アルブミンを塗布した磁性コロイド（粒子
の直径60nm）を、Owen et alの米国特許4,795,698の
実施例１に述べられた方法によって作成した。この磁性
コロイドの小さい凝集体（200〜300nm）をNaClを添加す
ることによって形成した。NaClを加えると、1989年８月
４日出願の同時系属米国特許出願389,699に述べられて
いるようにコロイドの部分的塩析が起こる。このような
凝集体は、特異的細胞表面抗体を保持する磁性コロイド
が結合する細胞に似た磁気分離特性を示す。従って、こ
の調製品は、多極高勾配磁場装置で細胞がどのように分
離するかを評価するのに有用である。この凝集体はま
た、実際のコロイドの分離と比べて、もっと長時間にわ
たってコロイドの分離性をしらべるのに有用である。単
一のマイクロタイターウェル（内径0.7cm）内に上記凝
集体の部分標本250ulを入れて、磁場内の異なる箇所に
ウェルを置き、試験媒体から分離したあと（通常３〜５
分）マイクロタイターウェルの壁部に凝集体が集まるの
を観察して、多極装置内の局所磁場を測定した。これら
の実験から、４極および６極装置については、磁気力は
放射方向であり、極面ギャップ半径の約60〜70％の半径
にわたってほぼ軸対称性であることがわかった。
もっと大きい半径で分離を行った場合、マイクロタイ
ターウェルの外側半径では磁性凝集体は収集されない
が、より小さい半径ではきわめて均等な放射方向収集が
認められた。
上記のような放射方向部分内での収集の軸対称性を実
証するために、上記の磁性凝集体を含む内径2cmの上部
の開いた円筒形ガラス容器を４極または６極装置の中央
に配置し、分離を観察した。これを凝集体をいくつかの
希釈液について実施し容器壁への磁気粒子の沈着がいく
つかの密度（濃さ）で観察できるようにした。いずれの
場合にも、容器壁上の沈着物は実質上均等であることが
わかった。装置内に容器を中央からはずれた位置におい
て分離を行うと、極面に最も近い円筒壁に不均等な収集
が認められた。
非凝集コロイドが同じように分離することを立証する
ために、Moldayの米国特許4,452,773に述べられたよう
に調製したデキストラン被覆コロイド（直径80nm）を、
上記のガラス容器中に入れて10分間分離させると、均等
な沈着物が容器壁上で得られた。従って、勾配磁場がこ
の実験の場合よりも高い上記装置では、コロイド状磁気
粒子が急速に分離できることが当然期待される。
装置中央での磁場は測定でゼロであったが、容器の中
央から磁気粒子が回収された。従って、小さい磁気粒子
の熱エネルギーが溶媒中の熱の影響による混合と組合わ
されて、容器の高勾配部分への拡散を起こすと思われ
る。磁場の均等性と軸対称性は理論的には多極装置の製
作に用いる極面と磁石を適当な曲面にすることによって
達成できる。隣接磁石間のギャップを最小限に押さえる
ことによって、これらの部分の近くの磁場の不規則性を
さらに減少させることができる。
実施例２ 上記の実施例１の多極装置を用いて、哺乳類の細胞を
分離した。この実験における目標物質は、ATCCから得ら
れる条件下での細胞培養で維持されるヒトＴ細胞（ATCC
受入番号CCL119,CCRF−CEM）であった。細胞は、GGV K
rausの方法〔「リンパ球、実際的アプローチ」（IRL P
ress Ltd.,p.144（1987））〕によりクローム51〔Cr5
1〕で標識するか、または技術上既知の方法によってア
クリジンオレンジで蛍光標識した。いずれかの方法で標
識したあと、細胞を通常のやり方で洗浄した。細胞は、
0.1％アジ化ナトリウムを含む細胞親和性等張性のリン
酸緩衝液（pH7.2）に１％（w/v）BSAを加えた液の中で
約３×106cells/mlに再懸濁させた。米国特許4,452,773
に述べられたMoldayの方法により作られ、細胞に対して
きわめて高い非特異的結合を示すデキストラン被覆コロ
イド（直径80nm）を磁気標識細胞に対して用いた。この
コロイドの最終濃度は細胞懸濁液の17ug iron/mlであ
った。
蛍光標識した細胞を、内径がそれぞれ、1.76、2.38お
よび3.17cmの上部の開いたガラス円筒容器に入れた。こ
れらの容器を４極または６極分離装置の中央に入れ、装
置を倒立顕微鏡（Zeiss Axiovert 35M;Thornwood,N
Y）のステージ上に取付け、容器のすべての部分におけ
る分離が細胞の蛍光顕微鏡検査によって観察できるよう
にした。２個の小径容器の場合には、容器の周壁への、
磁気による細胞の移動は完全に均等であった。直径3.17
cmの容器を用いたときは、隣接磁石間のギャップに対応
する位置で周辺部上に不規則な収集が認められた。従っ
て、４極装置では細胞が余分に収集される部分が４つあ
った（90゜、180゜、270゜、360゜）。６極装置ではそ
のような部分が６つあった。そこで特定の分離装置につ
いて適切な分離容器をえらぶことによって、容器壁に磁
気粒子をほぼ均等に沈着させることができる。
実施例３ （磁場がゼロの）多極装置の中心から細胞がいかに効
率よく放射方向に動かされるかをしらべるために放射能
標識した細胞を内径2.38cmの円筒容器内に入れ、次にこ
の容器を上記に述べるように製作した６極装置の中央部
に置いた。試験媒体の部分標本を容器中央から定期的
に、慎重に取り出し、Cr51をカウントし、これからこの
部分における細胞の減少量を計算した。３分で細胞の30
％が中央部分から除去され、７分で細胞の77％が除去さ
れ、12分で86％が除去された。従って、本質的に熱によ
る運動を示さない細胞の場合でも、細胞は充分に混合さ
れ、装置の中心部から引きつけられる。この実験は多極
装置内に配置された円筒形容器を貫流する細胞を効率よ
く除去できることを立証するものである。適切な流れパ
ラメータと適当なバッフル（じゃま板）を用いて、多極
装置を細胞の連続的除去に使用することができる。
実施例４ 内径と外径がそれぞれ5.78cmと8.32cm、高さが5.10cm
の円筒形鋼製ヨークと、寸法が0.635×2.54×5.10cm
で、2.54cmの寸法の側を通して磁化した４個のCrumax
355永久棒磁石から４極分離装置を製作した。４個の磁
石を円筒の内面上に90゜、180゜、270゜、360゜で配置
し、各棒磁石の5.10cmの辺がヨークの軸に平行となり、
2.54cmの辺が放射方向となるように揃えた。上記の４極
（装置）で、対向する磁石面は極性が同じであり、隣接
する磁石は表面での極性が逆であった。各棒磁石を適切
に、つまり互いに対して90゜に配置するために、アルミ
ニウム製のアーチ形スペーサーを製作し、各棒磁石の間
の空間に適合させた。このような構成によって、対向す
る極面間の間隙が0.70cmの４極（装置）ができた。ガウ
スメータを用いて、磁場が極面で5.95KGaussであり、中
央でゼロであることを測定した。従って、この組立品の
平均磁場勾配は17KGauss/cmである。この分離装置が溶
液からコロイドサイズの磁気粒子をどのようにうまく除
去するかをしらべるために長さ6cm、内径0.30cmのガラ
ス管を４極内にその軸にそって挿入した。この管をシリ
ンジポンプ（Harvard Apparatus,Dedham,MA）に接続
し、試験媒体を４極の磁場内に直立位置に配置したガラ
ス管内に導入し、そのあと検査のために取り出した。Ow
en et alの米国特許4,795,698の実施例１によって調
製した直径80nmのウシ血清アルブミン塗布コロイド磁気
粒子を、20mMリン酸緩衝液（pH7.5）中に懸濁し、これ
を磁場内にあるガラス管内に吸い上げ、分離させた。鉄
分20〜100uG/mlを含むこのコロイド状物質の懸濁液を磁
場勾配露出すると、分離管からポンプで汲み出した溶液
の分光光度計による測定では、完全分離が約６分で起こ
ったことがわかった。
分離管の内面上でのコロイド状物質の分布をしらべる
ため、上記と同様のコロイド状物質を分離し、そのあと
母体となる液体を管からシリンジポンプによって汲み上
げ、磁気的に沈着した物質を管の内面上で乾燥させた。
このように乾燥させた沈着物質はそのあと磁気勾配の影
響を受けなかった。これらの管を検査したところ、物質
は分離管の内面に均等に沈着していることがわかった。
実施例５ 細胞を、細胞特異的モノクローナル抗体（MAb）で標
識することによって免疫特異的に検索するときは、通常
は細胞をMAbといっしょにインキュベートし、余分なMAb
をウォッシュアウトし、次に多価共通捕捉物質、たとえ
ば磁気粒子のような適当な固体支持体にのせた二次抗体
またはアビジンといっしょにインキュベートする。余分
なMAbを除去する目的は、非細胞結合MAbと多価共通捕捉
物質の間の凝集を防止するためであり、また共通捕捉物
質上の結合部位を保持するためでもある。同時に共通捕
捉磁気コロイドを加える前に余分のMAbの除去を回避し
ながら、免疫特異的細胞分離を実施するための外部勾配
磁場装置の効率をしらべ、次のような実験を行った。共
通捕捉物質として使用するために、米国特許4,795,698
に述べられたように、コロイド磁気粒子にウシ血清アル
ブミン（BSA）といっしょに親和精製ヤギ抗マウスFc（G
AMFc）（Jackson Immunoresearch Lab,West Grove,P
A）を塗布した。コロイド上のGAMFcおよびBSAの最終濃
度は、最終コロイドのmlあたりそれぞれ0.7mgおよび0.0
5mgであった。（EM細胞はCr51標識し、上記の実施例２
に述べたように、PBS中に最終濃度が2.5×10 6/mLとな
るよう再懸濁した。細胞懸濁1.35mLに対して、抗CD ４
MAb（Gen−Trac,Plymouth Meeting,PA）85uLを、濃
度0.1mg/mL（MAb総量8.5mg）で加え、混合し、５分間イ
ンキュベートした。次に1.35mLのGAMFc磁気コロイドを
加え（Fe67.5mg）、混合し、５分間インキュベートし
た。この混合物2.6mLをただちにポリスチレン分離器
（内側寸法10mm×8mm×51mm（高））内に入れた。最後
にこの分離器の細胞を４極装置内に入れた。
寸法が5.0cm（長さ）、1.6cm（幅）、1.9cm（奥行）
の４個の棒磁石から４極装置を製作し、磁石の1.9cmの
辺に沿って磁化した。極面での磁束密度は6.6KGaussで
あり、４極の半径は1.1cmであった。従って、このよう
に製作した装置の勾配は6KGauss/cmであった。分離器の
10×51mmの面を直接、極面のうちの一つに当て、分離を
分離器の8mmの辺に沿って放射方向に行った。
磁気分離を各識別サンプルについて、それぞれ５分、
10分、15分行った。すべての作業は室温で行った。
さらに、GAMFcコロイド緩衝液（５％BSAを含むPBS）
には、細胞へのコロイド非特異的結合を防止するために
１％Tamol−850（Rohm−Haas,Philadelphia,PA）を含め
た。分離器の背後に（４極の中央に最も近く）配置した
20ゲージの針を用いて分離器から細胞上澄液を除去し、
部分標本でCr51をカウントし、また血球計数器で肉眼で
計数した。これらの実験によって、細胞の48、83および
90％が、それぞれ５、10および15分で極片に面する容器
の表面へ引きつけられることがわかった。MAbがないと
き、あるいは非特異的MAbのときには、細胞の減少は起
こらなかった。MAbインキュベーションのあと余分のMAb
を細胞から洗浄し除去し、そのあとGAMFcコロイドを加
える実験では、磁気分離時間５、10、15分の場合の細胞
減少はかなり低かった。
溶液内に残されたMAbが細胞上のものよりもずっと多
いことは興味深い。（１個の）細胞が50,000個の受容体
を有し、これが同数の（それだけ多くの）MAbと結合で
きると仮定すると0.05mg未満のMAbが消費され、8.45mg
が溶液内に残ることになる。溶液にこれだけの量のMAb
があっても、また溶液中に余分のコロイドがあっても、
分離は容易に行われる。細胞分離のために使用するGAMF
cコロイドを希釈すると、溶液中に残留するMAbと余分の
磁性捕捉物質の間の凝集反応は、肉眼では明らかでな
く、また小さい複合体が存在したとしても分離の妨げに
はならない。
余分なMAbを除去せずにこのような分離を行えること
は、手順が簡単になる上、細胞分析にとってきわめて有
益である。操作を簡略化することによって細胞生存率の
改善が期待されるだけでなく、余分なMAbの除去を回避
することによって、低親和性抗体を使用し利用すること
ができ、この種の抗体は余分に加えられると受容体に
「強制的に加え」られるが、余分なものが除去されると
容易に分離する。さらにこの方法によれば、適当な共通
捕捉磁性コロイドを選択することによって、レクチン
（たとえば、コンカナバリンＡ、大豆アグルチニン、小
麦胚芽アグルチニン）を含む比較的低親和性、非抗体受
容体を、細胞標識のために使用することができる。
上記の実験から、たとえば分析目的のために、小さい
磁気粒子を含む流体からこの磁気粒子を分離するのに多
極構成が有用であることは明らかである。またバイオ処
理などの特定の用途のため望まれるときは、移動する流
体からコロイド磁気粒子を除去するために、本質的に同
じ設計の連続流装置を製作することができる。
いくつかの好ましい実施例を用いて、本発明の様々な
態様について上記に説明したが、技術精通者にとっては
その他の様々な実施例が考えられるであろう。たとえ
ば、本発明の方法は、各種工業的処理の用途、とくにバ
イオ処理のための大量の物質を受け入れるため規模を大
きくすることができる。従って、本発明は上記に説明
し、また例を挙げた実施例に限定されることなく、付属
の特許請求の範囲に述べた本発明の趣旨から逸脱するこ
となしに、変更し改良することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゴーエル、ダーネッシュ・アイ アメリカ合衆国、ペンシルベニア州 19144、フィラデルフィア、ウエスト・ ハーヴェイ・ストリート 600 (56)参考文献 特表 昭63−501978（ＪＰ，Ａ) 米国特許4498987（ＵＳ，Ａ) 米国特許4795698（ＵＳ，Ａ) 国際公開89／6280（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) B01D 35/06 B03C 1/00 - 1/32 G01N 33/00 C12N 5/00

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】磁気粒子が懸濁状態にある比磁性試験媒体
    から前記磁気粒子を分離するための磁気分離機であっ
    て、 ａ） 前記試験媒体を収容するための周壁を有する非磁
    性容器と、 ｂ） 前記容器内に磁場勾配を発生させる磁気手段であ
    って、前記容器の前記周壁の外面のまわりに交互に配置
    されたそれぞれ複数の北磁極と南磁極とからなる少なく
    とも４個の磁石によって構成され、対向する位置には同
    じ極性の磁極が配されており、前記周壁から離れた位置
    にある試験媒体よりも前記周壁の内面に沿って位置する
    試験媒体の方により強い磁場を発生させ、該磁場を前記
    試験媒体内の前記磁気粒子に作用させて前記磁気粒子を
    前記周壁の内面に引きつけて付着させ、前記それぞれ複
    数の北磁極と南磁極とで前記容器を着脱可能に収容する
    ための収容部を形成しているところの前記磁気手段と、
    を有してなることを特徴とする磁気分離機。
  2. 【請求項２】前記磁極が前記容器のまわりに配置された
    円筒形強磁性ヨークに取り付けられ、前記磁極が前記容
    器と前記ヨークの間に配置されていることを特徴とする
    請求項１記載の磁気分離機。
  3. 【請求項３】前記磁気手段が５〜30キロガウスの磁場を
    発生させることを特徴とする請求項２記載の磁気分離
    機。
  4. 【請求項４】前記容器が円筒形であり、前記磁石のそれ
    ぞれが曲がった極面を備え、前記極面が前記容器と略同
    心円内に配置されることを特徴とする請求項１記載の磁
    気分離機。
  5. 【請求項５】前記磁気手段が、前記磁石のうちの少なく
    とも１個に関連した磁束集中手段をさらに有することを
    特徴とする請求項１記載の磁気分離機。
  6. 【請求項６】前記磁気手段が、前記容器のまわりに略等
    間隔で配置された６個の磁石からなることを特徴とする
    請求項１記載の磁気分離機。
  7. 【請求項７】磁気粒子が懸濁状態にある非磁性試験媒体
    から前記磁気粒子を分離するための磁気分離機であっ
    て、 ａ） 前記試験媒体を収容するための周壁を有する複数
    の非磁性容器と、 ｂ） 前記複数の容器を収容する非磁性キャリア（保持
    体）であって前記キャリアが概して平面状である基部を
    有しており、その外縁部の近くでに前記容器を各々保持
    するための手段を有するところの前記非磁性キャリア
    と、 ｃ） 前記キャリアを取り囲んで配置され、各容器内の
    前記試験媒体内の磁気粒子に作用する磁場勾配を発生さ
    せる磁気手段であって、前記磁気粒子を該磁気手段に最
    も近い前記周壁の内面に引き寄せ、干渉物質を実質上捕
    捉せずに該磁気粒子を前記周壁内面に付着させるところ
    の前記磁気手段と、を有してなることを特徴とする磁気
    分離機。
  8. 【請求項８】磁気粒子が懸濁状態にある非磁性試験媒体
    から前記磁気粒子を分離するための磁気分離機であっ
    て、 ａ） 内部空間を規定する周壁を有し、一端には試験媒
    体を前記内部空間に流入させるための入口を備えるとと
    もに他端には試験媒体を排出するための出口を備える非
    磁性容器と、 ｂ） 前記容器の前記周壁の外面のまわりに交互に配置
    されたそれぞれの複数の北磁極と南磁極とによって構成
    され、前記周壁を横切って磁場を作用させて前記容器内
    の試験媒体内に磁場勾配を発生させ、前記内部空間の中
    央部にある試験媒体よりも前記周壁の内面に沿った位置
    にある試験媒体により強い磁場を与えることにより前記
    磁気粒子を前記周壁の内面に引き寄せて付着させる磁気
    手段と、を有してなり、 ｃ） 前記容器は前記磁気手段に対して着脱可能とさ
    れ、前記磁場および前記磁場勾配を取り除いたときに重
    力により前記磁気粒子を前記周壁の内面から除去するこ
    とを可能にしていることを特徴とする磁気分離機。
  9. 【請求項９】前記容器内において前記入口および出口の
    間で前記内部空間を横切って少なくとも１個のバッフル
    が設けられ、該バッフルは前記周壁に向けて下方に傾斜
    する傾斜周面部と最も高い位置にある中央開口部とを有
    しており、前記内部空間内の磁気粒子を傾斜周面部に沿
    って前記周壁に向けて誘導することを特徴とする請求項
    ８記載の磁気分離機。
  10. 【請求項１０】周壁と開放上部を有する容器と、前記容
    器の外側に配置された磁気手段とによって構成される磁
    気分離機において、非磁性試験媒体から目標物質を磁気
    的に分離する方法であって、 ａ） 前記目標物質に特異的に結合することのできる受
    容体を含む磁気粒子を、前記目標物質への前記受容体の
    結合を可能にする条件下において前記試験媒体に接触さ
    せて、前記磁気粒子に目標物質を保持させ、 ｂ） 得られた目標物保持磁気粒子を有する前記試験媒
    体を前記容器内に導入し、 ｃ） 前記磁気手段からの磁場が前記容器の周壁を横切
    って作用するように前記容器を位置決めした状態で前記
    試験媒体内に磁場勾配を発生させ、前記容器の周壁から
    離れた位置にある試験媒体よりも周壁に隣接する試験媒
    体で磁場が強くなるようにし、該磁場を試験媒体内の磁
    気粒子に作用させることにより前記磁気粒子を前記容器
    の周壁に引き寄せて付着させ、 ｄ） 前記周壁内面の表面積に応じて前記容器内に導入
    される磁気粒子の量を調節して、前記目標物質保持磁気
    粒子の大きさに略相当する厚さの実質的に単一層として
    前記磁気粒子を前記周壁内面に付着させる、ことを特徴
    とする磁気分離方法。
  11. 【請求項１１】前記容器から非磁性試験媒体を除去しな
    がら前記周壁に付着した磁気粒子を維持することを特徴
    とする請求項10記載の磁気分離方法。
  12. 【請求項１２】磁気粒子を含む流体から該磁気粒子を分
    離する方法であって、 ａ） 周壁と開放上部を有し且つ磁気手段に隣接して配
    置された非磁性容器内に前記流体を導入し、前記磁気手
    段は前記容器の前記周壁の外面のまわりに交互に配置さ
    れたそれぞれ複数の北磁極と南磁極とからなる少なくと
    も４個の磁石によって構成され、対向する位置には同じ
    極性の磁極が配されており、前記周壁を横切って磁場を
    作用させることにより、前記流体内において前記周壁か
    ら離れた位置にある流体よりも前記周壁の内面に近い位
    置にある流体により強い磁場が与えられるような磁場勾
    配を前記流体内に発生させて前記磁気粒子を前記周壁に
    付着させるものであり、 ｂ） 前記周壁に付着した磁気粒子を残して、前記流体
    を前記容器から除去する、ことを特徴とする磁気分離方
    法。
  13. 【請求項１３】前記周壁内面の表面積に応じて前記容器
    内に導入される磁気粒子の量を調節して、前記磁気粒子
    の大きさに略相当する厚さの実質的に単一層として前記
    磁気粒子を前記周壁内面に付着させることを特徴とする
    請求項12記載の磁気分離方法。
  14. 【請求項１４】免疫反応リガンドを含む疑いのある試験
    媒体における該リガンドの存在または量を測定するため
    の方法であって、 ａ） 前記試験媒体を、前記リガンドに対する第一の受
    容体を含むコロイド磁気粒子と、前記リガンドに対する
    第二の受容体であって酵素と結合されているものとに、
    これら第一および第２の受容体が前記リガンドに結合可
    能な条件下で接触させることにより、前記磁気粒子に酵
    素とリガンドの両方を保持させ、 ｂ） 周壁を有し且つ磁気手段に隣接して配置された非
    磁性容器内に前記試験媒体を導入し、前記磁気手段は前
    記容器の前記周壁の外面のまわりに交互に配置されたそ
    れぞれ複数の北磁極と南磁極とによって構成され、前記
    周壁を横切って磁場を作用させることにより、前記試験
    媒体内において前記周壁から離れた位置にある試験媒体
    よりも前記周壁の内面に近い位置にある試験媒体により
    強い磁場が与えられるような磁場勾配を前記試験媒体内
    に発生させて前記磁気粒子に作用させることにより該磁
    気粒子を前記周壁に付着させるものであり、 ｃ） 前記磁気粒子を前記容器の周壁に付着させたま
    ま、前記試験媒体を前記容器から除去し、 ｄ） 前記磁気粒子を前記周壁に付着させたまま前記磁
    気粒子を洗浄して未結合物質を除去し、 ｅ） 当初の試験媒体中の前記リガンドの存在と量の目
    安として、前記磁気粒子に結合した前記酵素の活性を検
    出する、ことを特徴とするリガンド測定方法。
  15. 【請求項１５】前記リガンドが抗原であり、前記第一お
    よび第二の受容体が前記抗原と特異的相互作用を行うこ
    とができる抗体であることを特徴とする請求項14記載の
    リガンド測定方法。
  16. 【請求項１６】前記酵素を検出可能な色彩を発生する発
    色物質と接触させ、該発色物質の発色の外見または相対
    的強さから前記酵素の活性を検出することを特徴とする
    請求項14記載のリガンド測定方法。
  17. 【請求項１７】前記磁気粒子を前記容器周壁に付着させ
    たままの状態で前記酵素の活性を検出することを特徴と
    する請求項14記載のリガンド測定方法。
  18. 【請求項１８】前記磁気粒子を前記容器周壁に固定化し
    たまま、前記リガンドに関連した二次免疫反応または検
    出反応を行うことにより前記酵素の活性を検出すること
    を特徴とする請求項14記載のリガンド測定方法。
  19. 【請求項１９】特性決定基を有する膜含有生体成分を試
    験媒体から分離する方法であって、 ａ） 前記特性決定基に対して結合特異性を有する受容
    体を、前記特性決定基に前記受容体を結合させるに充分
    な量だけ、また前記試験媒体に余分な受容体を供給する
    に充分な量だけ、試験媒体中に導入し、 ｂ） 前記余分な受容体の存在下において、前記特性決
    定基を結合した前記受容体に選択的に結合する多価捕捉
    物質を前記試験媒体中に導入し、前記特性決定基結合受
    容体と前記多価捕捉物質のうち少なくとも一つがコロイ
    ド磁気粒子と関連を持つものであって、生体成分・受容
    体・捕捉物質の複合体を形成し、 ｃ） 高勾配磁場の影響下で前記試験媒体から前記複合
    体を分離する、ことを特徴とする分離方法。
  20. 【請求項２０】特性決定基を有する生体細胞を試験媒体
    から分離する方法であって、 ａ） 前記特性決定基に対して結合特異性を有するモノ
    クローナル抗体を、前記決定基に前記モノクローナル抗
    体を結合させるに充分な量だけ、また前記試験媒体に余
    分なモノクローナル抗体を供給するに充分な量だけ、前
    記試験媒体中に導入し、 ｂ） 前記余分のモノクローナル抗体の存在下におい
    て、前記特性決定基を結合したモノクローナル抗体に免
    疫特異的に結合する抗Fcを含むコロイド磁気粒子を前記
    試験媒体中に導入して、生体細胞・モノクローナル抗体
    ・抗Fc磁気粒子の複合体を形成し、 ｃ） 高勾配磁場の影響下で前記試験媒体から前記複合
    体を分離する、ことを特徴とする分離方法。
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